ES2328651A1 - Cepa probiotica resistente a antibioticos, producto probiotico que la contiene y sus aplicaciones. - Google Patents
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Abstract
Cepa probiótica resistente a antibióticos, producto probiótico que la contiene y sus aplicaciones. La presente invención describe una cepa probiótica resistente a antibióticos aislada del tracto intestinal humano y que presenta una resistencia intrínseca y no transmisible a antibióticos del tipo macrólidos, lincosamidas y estreptoqraminas, (fenotipo MLS) porque presenta una mutación de transición de A a G en la posición 2058 (según la numeración del gen 23S de E. coli), en la secuencia del gen ARNr 23 S.
Description
Cepa probiótica resistente a antibióticos,
producto probiótico que la contiene y sus aplicaciones.
La presente invención está relacionada con el
sector de la industria agroalimentaria y de la biomedicina y, más
concretamente, con la utilización de microorganismos
probióticos.
Los alimentos funcionales son alimentos
modificados o ingredientes alimentarios que proveen un beneficio
para la salud además de satisfacer los requerimientos nutritivos
tradicionales, dentro de los cuales se encuentran los probióticos y
prebióticos.
Los probióticos son un preparado o producto que
contiene microorganismos definidos, viables y en número suficiente
para modificar la microbiota de un ecosistema del hospedador
ejerciendo como consecuencia efectos beneficiosos sobre la salud
(Schrezenmeir J, de Vrese M. 2001. Probiotics, prebiotics and
synbiotics; approaching a definition. Am J Clin Nutr 73 (2 Suppl):
361S-364S.). Son muchos los efectos beneficiosos
sobre la salud de los microorganismos probióticos que están bien
documentados científicamente (Marteau P, Seksik P, Jian R. 2002.
Probiotics and health: new facts and ideas. Curr Opin Biotechnol
13: 486-489; Ouwehand AC, Salminen S, Isolauri E.
2002. Probiotics: an overview of beneficial effects. Antonie Van
Leeuwenhoek 82: 279-289). Entre los principales
podemos citar su contribución metabólica, la inhibición de
patógenos y la inmunomodulación.
Los prebióticos son ingredientes alimenticios no
asimilables por nuestro organismo que promueven la proliferación
selectiva de bacterias intestinales beneficiosas entre los que
podemos destacar fructooligosacáridos, inulina, lactulosa y
galactooligosacáridos.
En la actualidad existe en el mercado una
importante y variada oferta de productos suplementados con
prebióticos y/o prebióticos. El principal vehículo de
administración de éstos son los productos lácteos, especialmente
las leches fermentadas, aunque se pueden encontrar en muchos otros
productos como helados, quesos, embutidos, zumos e incluso
bizcochos, chocolate o cereales.
El espectro de microorganismos utilizados como
probióticos en humanos es muy amplio e incluye especies de muchos
géneros diferentes como Lactobacillus, Bifidobacterium,
Propionibacterium, Bacillus, Escherichia, Enterococcus,
Streptococcus y algunas levaduras del género
Saccharomyces. En la Tabla 1 se muestran algunos de los
microorganismos empleados de forma habitual como probióticos. Los
más utilizados pertenecen al grupo de las Bacterias del Ácido
Láctico (BAL), incluyendo en un sentido amplio a las
bifidobacterias.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Las BAL, ya mencionadas en los postulados de
Metchnikoff (1907), son miembros habituales de la microbiota
intestinal normal del hombre y de otros muchos animales. Además,
forman parte de la dieta a través de diversos productos
fermentados, entre los que se incluyen muchos productos lácteos.
Por estas razones poseen un privilegiado status de microorganismos
saludables (GRAS, "Generally Regarded As Safe") y sus efectos
positivos sobre la salud se admiten de un modo generalizado. La
utilización de las BAL como probióticos se remonta a principios del
siglo XX. Desde entonces, ha aparecido un interés creciente por
productos probióticos elaborados con estos microorganismos, sobre
todo de los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium.
La utilización de especies seleccionadas de
lactobacilos como cultivo iniciador industrial en las
fermentaciones de alimentos para el hombre y otros animales tiene
una larga tradición (Bernardeau, M., M. Gueguen, and P. Vernoux.
2006. Beneficial lactobacilli in food and feed:
long-term use, biodiversity and proposals for
specific and realistic safety assessments. FEMS Microbiol. Rev.
30:487-513.). Además, aunque no son microorganismos
mayoritarios en el intestino humano, se cree que las
bifidobacterias y los lactobacilos tienen un papel importante en el
mantenimiento del equilibrio microbiano intestinal necesario para
la salud (Vaughan, E. E., M.-C. de Vries, E. G. Zoetendal, K.
Ben-Amor, A. D. L. Akkermans, and W. M. de Vos.
2002. The intestinal LABs. Antonie van Leeuwenhoek
82:341-352). De esta forma, bacterias seleccionadas
de estos tipos se incluyen en diversos alimentos y otros
preparados farmacéuticos para mantener este equilibrio, o para
restaurarlo cuando se rompe (infección intestinal, tratamiento
prolongado con antibióticos, etc.), ejercitando una serie de
acciones beneficiosas, incluyendo la inhibición de patógenos, la
mejora de la tolerancia a la lactosa, el disparo de la respuesta
inmune y la bajada de los niveles de colesterol. Otros beneficios
podrían derivarse de sus posibles efectos anticarcinogénicos y
antimutagénicos (Antonie van Leeuwenhoek 82:279-289;
Sanders, M. E. 2003. Probiotics: considerations for human health.
Nutr. Rev. 61:91-99).
Los lactobacilos es un género muy amplio en el
que se incluyen más de 100 especies con propiedades heterogéneas.
Desde el punto de vista fenotípico y atendiendo a sus
características metabólicas se pueden clasificar en tres grupos en
función de la presencia o ausencia de los enzimas
fructosa-1,6-difosfato aldolasa y
fosfocetolasa siendo homofermentadores estrictos,
heterofermentadores estrictos y facultativos.
Los lactobacilos se encuentran presentes en una
amplia variedad de nichos ecológicos, siempre que en ellos exista
abundante fuente de carbohidratos hidrosolubles, productos de
degradación de proteínas, vitaminas y una tensión de oxígeno
reducida. Se pueden encontrar en hábitats tan variados como la
leche y sus derivados, vegetales frescos y fermentados, carne y sus
derivados, pescados, panes ácidos, bebidas fermentadas y formando
parte de la microbiota gastrointestinal y genitourinaria del hombre
y los animales. En general, los lactobacilos son las Bacterias del
Ácido Láctico que mejor toleran la acidez y muchas de sus especies
se utilizan habitualmente en la industria alimen-
taria.
taria.
La capacidad de las bacterias para sobrevivir y
crecer en un nicho microbiológico depende de las condiciones
biológicas y físico-químicas del ecosistema en
particular. En el caso de las bacterias intestinales, y en concreto
de los probióticos, para mantener la viabilidad en el ambiente del
Tracto gastrointestinal (TGI) han de ser resistentes a la acidez
estomacal y a la presencia de sales biliares intestinales que
tienen una importante actividad antibacteriana. Además, han de ser
capaces de colonizar la mucosa intestinal, y competir por espacio y
nutrientes con otros muchos microorganismos. A esta competencia
contribuyen la capacidad de adhesión al epitelio intestinal y la
facultad para producir sustancias antimicrobianas. Además, es
deseable que las cepas a utilizar sean de origen humano y estén
libres de factores de patogenicidad.
Por otro lado, la hipótesis del reservorio de
genes de resistencia sugiere que las poblaciones comensales y
beneficiosas de los alimentos y el tracto gastrointestinal (TGI)
del hombre y los animales puede jugar un papel destacado en la
transferencia de las resistencias a antibióticos a los
microorganismos patógenos (Salyers, A. A., A. Gupta, and Y. Wang.
2004. Human intestinal bacteria as reservoirs for antibiotics
resistance genes. Trends Microbiol. 12:412-416).
Para reducir la diseminación de estas resistencias, es importante
una utilización racional de los antibióticos y también el análisis
de resistencia a antibióticos en bacterias que se utilizarán en
sistemas alimentarios (European Commission. 2005. Opinion of the
FEEDAP Panel on the updating of the criteria used in the assessment
of bacteria for resistance to antibiotics of human or veterinary
importance. EFSA J. 223:1-12). La distinción entre
resistencias intrínsecas y adquiridas es esencial y en el caso de
las resistencias adquiridas es muy importante distinguir entre las
debidas a mutaciones cromosómicas y aquellas causadas por la
adquisición horizontal de genes, puesto que sólo estas resistencias
tienen un algo riesgo de transmisión (Normark, B. H., Normark, S.
2002. Evolution and spread of antibiotic resistance. J. Intern.
Med. 252:91-106).
La eritromicina y otros antibióticos macrólidos
son la mejor alternativa para el tratamiento de las infecciones en
los pacientes alérgicos a la penicilina. Sin embargo, la eficacia
de estos antibióticos se ve frenada por la extendida diseminación
de resistencias. La resistencia a antibióticos del tipo macrólidos,
lincosamidas y estreptograminas (fenotipo MLS) se debe, de forma
frecuente, a la presencia de sistemas de bombeo del antibiótico
fuera de las células, a metilasas, enzimas inactivantes de los
antibióticos, etc., sistemas para los que se han caracterizado más
de 40 genes. Sin embargo, la resistencia puede deberse también a
mutaciones en proteínas ribosomales (como L4 y L22) o a mutaciones
en el gen que codifica la propia molécula del ARNr 23S (Leclercq,
R. 2002. Mechanisms of resistance to macrolides and lincosamides:
nature of the resistance elements and their clinical implications.
Clin. Infect. Dis. 34:482-492). De hecho,
mutaciones cromosomales que alteran la unión de la eritromicina a
su sitio de unión al ribosoma en el dominio V del ARNr 23S (en la
posición 2058, siguiendo la numeración de Escherichia coli,
o en sitios adyacentes) se han demostrado en una serie de aislados
clínicos, incluyendo cepas de Mycoplasma spp. (Meier et
al., 1994; Lucier et al., 1995), Helicobacter
pylori (Versalovic et al., 1996),
Propionibacterium spp. (Ross et al., 1997), y
Bordetella pertussis (Bartkus et al., 2003), entre
otras.
En este sentido, y para salvaguardar el efecto
de los antibióticos sobre las cepas probióticas que se usan en la
industria alimentaria se han planteado el desarrollo de
preparaciones farmacéuticas en forma de cápsulas
(Micro-encapsulated lactobacilli for medical
applications. WO 96/38159) que las protejan de dicho efecto o se ha
pretendido utilizar el uso de cepas bacterianas poco sensibles a
antibióticos escasamente caracterizadas (Strain of bacteria
Lactobacillus rhamnosus L2l for the preparation of the
biologically active additives, which regulate microflora of bowels
in the children of early age. RU20010135344, Korshunov VM) aunque
no se han conocido por el momento sus aplicaciones reales.
En este sentido, no se han identificado hasta la
fecha cepas probióticas, o más preferentemente lactobacilos, que
presenten determinadas resistencias a antibióticos bien
caracterizadas, no transmisibles, y que pudieran ser utilizadas
como alimentos funcionales, preferentemente en personas en
tratamiento con antibióticos.
Un objeto de la presente invención lo constituye
una cepa probiótica resistente a antibióticos, en adelante cepa
probiótica de la invención, aislada del tracto intestinal humano y
que presenta una resistencia intrínseca y no transmisible a
antibióticos del tipo macrólidos, lincosamidas y estreptograminas
(fenotipo MLS) porque presenta una mutación de transición de A a G
en la posición 2058 (según la numeración del gen 23S de E.
coli), en la secuencia del gen ARNr 23S.
Una realización particular de la invención lo
constituye la cepa probiótica de la invención constituida por la
cepa Lactobacillus rhamnosus E41, depositada en la colección
de cultivos DMSZ-Deutche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DMS) con el número de acceso
DSM 18791.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye el uso de la cepa probiótica de la invención, en
adelante uso de la invención, en la elaboración de un producto
probiótico.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye un producto probiótico que comprende la cepa probiótica
de la invención y que pertenece, a título ilustrativo y sin que
limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: una
composición alimentaria y alimento funcional.
La presente invención se basa en que los
inventores han aislado e identificado una nueva cepa probiótica de
Lactobacillus rhamnosus, cepa L. rhamnosus E41,
procedente de la flora intestinal normal de individuos sanos, que
es resistente a antibióticos del tipo macrólidos (eritromicina),
lincosamidas (clindamicina) y estreptograminas (fenotipo MLS) y, más
concretamente, han identificado la causa de dicha resistencia: una
mutación puntual de transición
(A-a-G) en la posición 2058
(referida a la numeración del gen de Escherichia coli) tras
el análisis de restricción y secuenciación de un amplicón de AND
obtenido por PCR del gen que codifica el ARNr 23S (Ejemplo 1, SEQ
ID NO3). Esta cepa constituye la primera descripción de una
mutación de ese tipo en bacterias del ácido láctico. Por otro lado,
la cepa se mostró heterocigótica, incluyendo copias del gen
original y mutado, constituyéndose como la primera descripción de
una mutación de este tipo en una bacteria del grupo de las
Bacterias de Ácido Láctico. Además, dado que este tipo de
resistencia adquirida no presenta riesgo de diseminación horizontal
a otras colonias de bacterias presentes en el tracto intestinal
humano convierte a la cepa aceptable para su utilización
tecnológica o para su uso como probiótico.
Los macrólidos, cetólidos y estreptograminas
(fenotipo MLS) son tres familias de antibióticos de estructura
química muy diferente que comparten el mismo mecanismo de acción.
Los tres se unen a distintas bases del centro peptidil transferasa
del ARNr 23S. Su espectro antibacteriano es prácticamente
superponible; sin embargo, desigualdades en la afinidad y/o el
número de lugares de unión determinan diferencias en la intensidad
del efecto antibacteriano (bacteriostático/bactericida) y en la
actividad frente a cepas con mecanismos de resistencia adquiridos.
Son activos frente a la mayoría de microorganismos grampositivos y
muchos microorganismos de crecimiento intracelular. En nuestro
país, durante los últimos 5 años, el porcentaje de cepas de
neumococo y Streptococcus pyogenes resistentes a los
macrólidos ha aumentado sensiblemente. Telitromicina (cetólido) y
Synercid (estreptogramina) mantienen la actividad frente a estas
cepas. Desde el surgimiento de la familia de los macrólidos
(compuestos constituidos por un anillo de lactosa macrocíclico
formado por muchos miembros, al que se van a unir uno o más
desoxiazúcares) con el descubrimiento de la eritromicina, se han
venido sumando a este grupo nuevos compuestos, hasta contar en la
actualidad con más de 10 productos en el mercado. No obstante, los
más representativos por su efectividad, costos y dosis lo
constituyen la claritromicina, la azitromicina y la roxitromicina.
Tal como se utiliza en la presente invención el término
"macrólido" se refiere, a título ilustrativo y sin que limite
el alcance de la invención, a los siguientes antibióticos:
eritromicina, oleandomicina, espiromicina, josamicina,
diritromicina, fluritromicina, claritromicina, midecamicina,
telitromicina y azitromicina; o futuros miembros de esta
familia.
Por otro lado, el grupo de antibióticos
"lincosamida" tal como se utiliza en la presente invención
incluye a la lincomicina (antibiótico aislado a partir de una cepa
de Streptomyces lincolnensis en 1962) y a la clindamicina
(de mejor biodisponibilidad y actividad antimicrobiana, por lo que
es en la actualidad la única lincosamida de que disponemos en la
práctica clínica). Finalmente, las estreptograminas, es un modelo
de antibiótico compuesta por la asociación de dos sustancias
químicamente no relacionadas, quinupristina (estreptogramina A) y
dalfopristina (estreptogramina B), que actúan de forma
sinérgica.
De esta forma la cepa L. rhamnosus E41
puede usarse como probiótico, preferentemente, en personas sujetas
a tratamiento, preferentemente continuado, con estos antibióticos,
puesto que dicha cepa presenta además las características de
probiosis "in vitro" más importantes (resistencia al
ácido, resistencia a sales biliares, inhibición de patógenos
intestinales, unión a células intestinales, etc.) y la ausencia de
características no deseables (ciertas actividades enzimáticas,
presencia de resistencias a antibióticos transmisibles, etc.)
(Ejemplo 1).
Por otro lado, el aislamiento de otras cepas BAL
merced a la información descrita en la presente invención puede
ser utilizada y llevada a cabo por un experto en la materia
fácilmente, ampliando de esa manera las cepas con estas mismas
características que pueden utilizarse comercialmente y que forman
parte de la presente invención.
Así, un objeto de la presente invención lo
constituye una cepa probiótica resistente a antibióticos, en
adelante cepa probiótica de la invención, aislada del tracto
intestinal humano y que presenta una resistencia intrínseca y no
transmisible a antibióticos del tipo macrólidos, lincosamidas y
estreptograminas (fenotipo MLS) porque presenta una mutación de
transición de A a G en la posición 2058 (según la numeración del
gen 23S de E. coli), en la secuencia del gen ARNr 23S.
Un objeto particular de la invención lo
constituye la cepa probiótica de la invención en el que dicha cepa
probiótica es una cepa tipo Bacteria del Acido Láctico (SAL),
preferentemente perteneciente a los géneros Bifidobacterium
y Lactobacillus, y más preferente a la especie
Lactobacillus rhamnosus.
Una realización particular de la invención lo
constituye la cepa probiótica de la invención constituida por la
cepa Lactobacillus rhamnosus E41, depositada en la colección
de cultivos DMSZ-Deutche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DMS) con el número de acceso
DSM 18791.
La cepa probiótica de la invención puede ser
utilizada para la elaboración de una composición alimentaria o
terapéutica útil, ya sea como forma liofilizada o en forma de
cápsulas, entre otros formatos.
Por otro lado, la cepa probiótica de la
invención puede ser utilizada como aditivo o agente alimentario
para la elaboración de diversos productos alimentarios: leches
fermentadas incluyendo las leches fermentadas tratadas
térmicamente, las leches fermentadas concentradas y los productos
lácteos compuestos basados en estos productos, para consumo directo
o procesamiento ulterior, distintos tipos de quesos: frescos,
duros, helados, productos de la industria de la bebida tales como
zumos o de la pastelería, alimentos para niños tales como papillas
productos promotores de la salud productos naturales, etc. En el
contexto de la presente invención se prefieren productos que
contengan la cepa de la invención, tales como productos lácteos
fermentados tales como yogur, kéfir y otros; quesos y extensiones,
alimentos para niños, zumos y sopas. En este sentido, pudiera
formar parte (sola o en combinación con otros microorganismos
incluyendo prebióticos) (Combination of probiotics EP1359816 Valio
Ltd.) del cultivo acidificador o de cultivos adjuntos de un
producto lácteo (leche acidificada, queso). Además puede incluirse
en preparaciones farmacéuticas en forma de cápsulas
(Micro-encapsulated lactobacilli for medical
applications WO 96/38159), en forma liofilizada, líquida, en
píldoras o geles.
Por lo tanto, otro objeto de la presente
invención lo constituye el uso de la cepa probiótica de la
invención, en adelante uso de la invención, en la elaboración de un
producto probiótico.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye el uso de la cepa probiótica de la invención en el que
el producto probiótico es una composición alimentaria que
comprende la cepa prebiótica de la invención.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye el uso de la cepa probiótica de la invención en el que
el producto probiótico es un alimento funcional que comprende la
cepa probiótica de la invención.
En este sentido, otro objeto de la presente
invención lo constituye un producto probiótico que comprende la
cepa probiótica de la invención y que pertenece, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al
siguiente grupo: una composición alimentaria y alimento
funcional.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye una composición alimentaria que comprende la cepa
probiótica de la invención en un formato, a título ilustrativo y
sin que limite la invención, al siguiente grupo: cepa liofilizada,
en cápsulas, píldoras, formato líquido o geles.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye un alimento funcional que comprende la cepa
probiótica de la invención perteneciente, a título ilustrativo y
sin que limite la invención, al siguiente grupo: leches fermentadas
incluyendo las leches fermentadas tratadas térmicamente, las leches
fermentadas concentradas y los productos lácteos compuestos basados
en estos productos, para consumo directo o procesamiento ulterior,
distintos tipos de quesos: frescos, duros, helados, productos de la
industria de la bebida tales como zumos o de la pastelería,
alimentos para niños tales como papillas y sopas.
Otra realización particular de la presente
invención lo constituye el producto probiótico, ya sea una
composición alimentaria o un alimento funcional, de la invención
que comprende la cepa Lactobacillus rhamnosus E41 (DSM
18791).
En el contexto de la presente invención se
prefieren productos que contengan la cepa de la invención, tales
como productos lácteos fermentados tales como yogur, kéfir y
otros; quesos y extensiones, alimentos para niños, zumos y
sopas.
En este sentido, pudiera formar parte (sola o en
combinación con otros microorganismos incluyendo prebióticos)
(Combination of probiotics EP1359816 Valio Ltd.) del cultivo
acidificador o de cultivos adjuntos de un producto lácteo (leche
acidificada, queso).
Hay que señalar, además, que la eritromicina,
como ejemplo de antibiótico MLS, se utiliza de forma frecuente
para tratar infecciones en edades tempranas de la vida; momento en
el que la microbiota intestinal no está asentada todavía, y su
perturbación por la utilización crónica de antibióticos podría
tener consecuencias para el resto de la vida, de tal forma que los
productos probióticos de la invención pueden ser de gran utilidad
en este sector de la población.
Para las correspondientes comparaciones puede
ser utilizada la cepa L. rhamnosus E41 depositada en Deutsch
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH (DSMS),
Braunschweig, Alemania el día 16 de Noviembre de 2006 (número de
acceso DSM 18791).
Figura 1. Análisis del polimorfismo de
restricción de los fragmentos amplificado por PCR de segmentos del
gen que codifica el ARNr 23S de la cepa resistente a macrólidos
Lactobacillus rhamnosus E41 (línea 1) y una serie de cepas
de L. rhamnosus sensibles a estos antibióticos (E41, G92,
G94, E52, E57, F46 y LMG 18243; líneas 2 a 8, respectivamente).
Digestión con los enzimas de restricción BbsI (izquierda) y
HindIII (derecha). M, marcador de pesos moleculares.
Figura 2. Cromatograma representativo de las
secuencias alrededor de la posición 2058 del gen que codifica el
ARNr 23 de cepas sensibles a macrólidos, L. rhamnosus LMG
18243, cepa GG,(izquierda) y aquella de la cepa resistente
Lactobacillus rhamnosus E41 (derecha). Las flechas indican
los nucleótidos de la posición 2058 (de la numeración de
Escherichia coli). Nótese la naturaleza heterocigótica (G/A)
de la cepa E41 en esta posición.
La identificación de cepa de la presente
invención se inició con la selección de una serie de donantes, 10
individuos sanos del Principado de Asturias (4 hombres y 6 mujeres)
con edades comprendidas entre los 34 y los 66 años, con hábitos
alimentarios normales y sin historial de tratamiento reciente con
antibióticos. Se recogieron muestras de heces y se procesaron en
las 2 horas siguientes a su deposición/extracción en una cabina de
anaerobiosis "Mac 500" (Don Whitley Scientific) con atmósfera
reductora controlada (10% H2, 10% CO2, 80% N2).
Los lactobacilos se aislaron en placas de agar
de Man, Rogosa y Sharpe (MRS), con 0,25% L-cisteína
(MRSC), y se cultivaron en cabina de anaerobiosis a 37°C durante
48-72 horas. Colonias aisladas se crecieron
nuevamente en placas de MRSC y a partir de colonias aisladas se
obtuvo biomasa que se lavó y resuspendió en 0,1 ml de Tampón TE (10
mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8) con 0,9% de NaCl. La
suspensión celular se calentó a 98ºC durante 10 min. en un
termociclador "Dualcycler LINUX" (Cultek) y posteriormente se
centrifugó 10 min a 14.000 rpm para eliminar los restos de material
celular. El ADN presente en los extractos de las cepas se utilizó
para amplificar por PCR un fragmento del gen que codifica el ARNr
16S mediante los oligonucleótidos universales Y1
(5'-TGGCTCAGGAC
GAACGCTGGCGGC-3'; SEQ ID NO1) e Y2 (5'-CCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'; SEQ ID NO2) (Young JPW, Downer HL, Eardly BD. 1991 Phylogeny of the prototrophic Rhizobium strain BTAil by polymerase chain reaction-based sequencing of a 16S rRNA segment. J Bacteriol 173: 2271-2277). Se identificaron 71 aislados de lactobacilos procedentes de siete individuos. Las especies encontradas fueron L. paracasei, L. rhamnosus, L. brevis, L. johnsonii, L. parabuchneri, L. plantarum, y L. acidipiscis, de ellas siete asilados pertenecían a la especie L. rhamnosus: E51, G92, G94, E52, E57, F46 y E41. La región que se amplifica, de unas 348 pares de bases (pb) aproximadamente, se extiende desde la base 50 a la 400 (según la numeración de Escherichia coli) y contiene las regiones variables V1 y V2 de la molécula del ARNr 16S. Finalmente, el amplicón se secuenció y las secuencias se compararon con las de las bases de datos de GenBank y RDP, La amplificación, secuenciación y comparación de secuencias de los genes ribosomales se utiliza frecuentemente para la identificación de los aislados; es una técnica más rápida, más barata y mucho más fiable que las técnicas bioquímicas y fenotípicas.
GAACGCTGGCGGC-3'; SEQ ID NO1) e Y2 (5'-CCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'; SEQ ID NO2) (Young JPW, Downer HL, Eardly BD. 1991 Phylogeny of the prototrophic Rhizobium strain BTAil by polymerase chain reaction-based sequencing of a 16S rRNA segment. J Bacteriol 173: 2271-2277). Se identificaron 71 aislados de lactobacilos procedentes de siete individuos. Las especies encontradas fueron L. paracasei, L. rhamnosus, L. brevis, L. johnsonii, L. parabuchneri, L. plantarum, y L. acidipiscis, de ellas siete asilados pertenecían a la especie L. rhamnosus: E51, G92, G94, E52, E57, F46 y E41. La región que se amplifica, de unas 348 pares de bases (pb) aproximadamente, se extiende desde la base 50 a la 400 (según la numeración de Escherichia coli) y contiene las regiones variables V1 y V2 de la molécula del ARNr 16S. Finalmente, el amplicón se secuenció y las secuencias se compararon con las de las bases de datos de GenBank y RDP, La amplificación, secuenciación y comparación de secuencias de los genes ribosomales se utiliza frecuentemente para la identificación de los aislados; es una técnica más rápida, más barata y mucho más fiable que las técnicas bioquímicas y fenotípicas.
La resistencia a antibióticos de estas cepas
(E51, G92, G94, E52, E57, F46 y E41 y la cepa probiótica comercial
L. rhamnosus LMG 18243 (cepa GG)) se estudió con el sistema
Sensititre Anaero3 (kit comercial "Sensititre Anaero3", Treck
Diagnostic Systems) determinando la Concentración Inhibitoria
Mínima (CIM). La CIM es la concentración más baja de antibiótico a
partir de la cual no se observa crecimiento. Este método sigue las
recomendaciones del NCCLS ("National Committee for Clinical
Laboratory Standards") que establece las referencias estándar
para la determinación de las CIMs de bacterias anaerobias (NCCLS,
1997). Los antibióticos analizados fueron: penicilina, amoxicilina,
amoxicilina+ácido clavulánico, piperacilina,
piperacilina+tazobactam, cefoxitina, imipenem, cloranfenicol,
eritromicina, clindamicina, metronidazol, moxifloxacino,
tetraciclina y vancomicina. Para la siembra de las microplacas se
siguieron las recomendaciones de la casa suministradora. La lectura
de los resultados se realizó tras 48 h de incubación a 37ºC en
cabina de anaerobiosis.
Dos aislados o cepas de la especie L.
rhamnosus analizadas se consideraron resistentes a eritromicina
porque presentaban una CIM de MIC 1024 \mug ml^{-1} a este
antibiótico y una CIM a clindamicina de 256 \mug ml^{-1}
mediante un ensayo de microdilución Sensititre Anaero3 (Delgado,S.,
A. B. Florez, and B. Mayo. 2005. Antibiotic susceptibility of
Lactobacillus and Bifidobacterium species from the
human gastrointestinal tract. Curr. Microbiol.
50:202-207). La resistencia a estos dos
antibióticos se confirmó en el presente trabajo mediante el uso del
sistema Etest (AB Biodisk, Solna, Sweden). En contraste con este
nivel de resistencia, la CIM a eritromicina y clindamicina de cepas
susceptibles analizadas en las mismas condiciones de esta especie
L. rhamnosus (aislados E51, G92, G94, E52, E57, F46) y la de
la cepa probiótica comercial L. rhamnosus LMG 18243 (cepa GG)
fueron de 1 y 0.5 \mug ml^{-1} respectivamente. La tipificación
fenotípica mediante el sistema API50 CHL (bioMérieux,
Montalieu-Vercieu, France) y el sistema comercial
Phene Plate (fermentación de 21 carbohidratos) y genética por medio
de RADP con el oligonucleótido OPA 18:
5'-AGGTGACCGT-3') (random
amplification of polymorphic DNA, RAPD; (Vincent D, Roy D, Mondou F,
Dery C. 1998. Characterization of bifidobacteria by random DNA
amplification. Int J Food Microbiol 43:185-193) de
los aislados indicó que ambos pertenecían a una única cepa, la cual
se definió como L. rhamnosus E41. Para las correspondientes
comparaciones puede ser utilizada la cepa L. rhamnosus E41
depositada en Deutsch Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen
GMBH (DSMS), Braunschweig, Alemania (número de acceso DSM
18791).
Genes como erm(A), erm(B),
erm(C), erm(F) o mef(A), confieren de forma
frecuente resistencia a macrólidos en microorganismos
Gram-positivos y Gram-negativos y
están muy extendidos (Jensen, L. B., N.
Frimodt-Moller, and F. M. Aarestrup. 1999. Presence
of erm gene classes in Gram-positive bacteria of
animal and human origin in Denmark. FEMS Microbiol. Lett.
170:151-158). Algunos de estos genes han sido
identificados en plásmidos (Gfeller, K. Y., M. Roth, L. Meile, and
M. Teuber. 2003. Sequence and genetic organization of the
19.3-kb erythromycin- and
dalfopristin-resistance plasmid pLME300 from
Lactobacillus fermentum ROT1. Plasmid.
50:190-201) y en el cromosoma (Flórez, A. B., M. S.
Ammor, S. Delgado, and B. Mayo. 2006. Molecular analysis of a
chromosomally-encoded erm(B) gene and its
flanking insertion points in Lactobacillus johnsonii G41.
Antimicrob. Agents Chemother. (In Press)) de cepas de lactobacilos
resistentes a estos antibióticos. En la presente invención, la
presencia de estos cinco genes de resistencia se analizó por medio
de PCR utilizando ADN total de la cepa L. rhamnosus E41 como
molde y cebadores (primers) específicos, siguiendo las
recomendaciones descritas por Roberts et al. (Roberts, M.
C., W. O. Chung, D. Roe, M. Xia, C. Marquez, G. Borthagaray, W. L.
Whittington, and K. K. Holmes. 1999b.
Erythromycin-resistant Neisseria gonorrhoeae
and oral commensal Neisseria spp. carry known rRNA methylase
genes. Antimicrob. Agents Chemother. 43:1367-1372).
Sin embargo, no se obtuvo amplificación con ninguna de las parejas.
De la misma forma, la hibridación en microarrays de más de 300
sondas oligonucleotídicas basadas en genes de resistencia a
antibióticos, de los que 42 correspondían a genes involucrados en
el fenotipo MLS no dio tampoco resultados positivos (Ammor, M. S.,
A. B. Flórez, A. H. A. M. Van Hoek, C. G. de los
Reyes-Gavilán, H. J. M. Aarts, A. Margolles, and B.
Mayo. 2006. Molecular characterization of intrinsic and acquired
antibiotic resistance in lactic acid bacteria and bifidobacteria.
J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (In Press)).
Después de descartar la presencia de genes
adquiridos por transferencia horizontal como responsables del
fenotipo MLS en la cepa L. rhamnosus E41, se llevó a cabo
una búsqueda de mutaciones en componentes ribosomales. Las
secuencias codificadoras de las proteínas L4 y L22 de los ribosomas
de L. rhamnosus no están disponibles, motivo por el que el
análisis se centró en la secuencia codificadora del ARNr 23S. Por
tanto, para amplificar segmentos del gen del ARNr 23S, incluyendo
el residuo crítico 2058 (según la numeración del gen 23S de E.
coli), cuya mutación se ha involucrado en numerosas ocasiones
en resistencia a macrólidos (ver Estado de la Técnica), se
utilizaron los cebadores universales 1104f y 2241r descritos
recientemente (Hunt, D. E., V. Mepac-Ceraj, S. G.
Acinas, C. Gautier, S. Bertilsson, and M. F. Polz. 2006. Evaluation
of 23S rRNA PCR primers for use in phylogenetic studies of
bacterial diversity. Appl. Environ. Microbiol.
72:2221-2225). Para la comparación, se amplificó en
las mismas condiciones el mismo segmento del gen del ARNr 23S rRNA
de seis cepas (aislados E51, G92, G94, E52, E57, F46) sensibles a
eritromicina y clindamicina, y de la cepa comercial L.
rhamnosus LMG 18243 (cepa GG, ATCC 53103). En estas concisiones
se logró amplificar un segmento de alrededor de 1200 pares de bases
(pb) de todas las cepas. Este segmento fue purificado por medio del
kit comercial Gen Elute PCR Clean Up kit (Sigma Chemical Co., St.
Louis, Mo., USA) y digerido con diversas enzimas de restricción,
para analizar el polimorfismo de longitud de los fragmentos de
restricción (restriction fragment length polymorphism, RFLP), y
posteriormente se secuenció.
La presencia de una mutación de transición de A
a G en la posición 2058 en la secuencia del gen ARNr 23S introduce
un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción T
BbsI (SEQ ID NO3). De esta forma, los amplicones fueron
digeridos con este enzima, lo que anticipaba, caso de existir, la
mutación antes de analizar la secuencia. Se encontraron fragmentos
del tamaño esperado para la presencia de la mutación sólo en la
cepa resistente a eritromicina (Figura 1, línea 1). Sin embargo,
parte del amplicón aparece sin digerir, lo que sugiere que o bien
la digestión fue parcial o la cepa presenta de forma simultánea la
secuencia original y la mutada. Como control, los amplicones se
digirieron también con el enzima HindIII, que corta en la
mitad del segmento amplificado del gen codificador del ARNr 23S en
muchas especies de lactobacilos. Con este enzima los amplicones se
digirieron de forma completa, lo que sugiere la presencia de
heterocigosis para los genes del ARNr 23S en la cepa L.
rhamnosus E41.
Para confirmar estos resultados, todos los
amplicones se secuenciaron en un secuenciador ABI PRISM 370
(Applied Biosystems, Foster City, Ca., USA) y las secuencias
obtenidas se compararon entre sí y con las de las bases de datos.
En la secuencia que correspondía a la cepa resistente (L.
rhamnosus E41), se observó de nuevo la mutación de transición A
a G .en la posición 2058; que no aparecía en las cepas sensibles a
eritromicina (Figura 2). Los cromatogramas mostraban sin ningún
género de duda una señal de fluorescencia de un residuo de adenina
(A) en la cepa E41, tal y como aparecen en las cepas sensibles;
indicando de nuevo un estado de heterocigosis (Figura 2). Aunque se
desconoce el número de operones ribosómicos en L. rhamnosus,
es esperable que el rango de éstos se sitúe entre cuatro y siete,
tal y como aparecen en otras especies del género
Lactobacillus (Klaenhammer, T., E. Alterman, F. Arigoni, A.
Bolotin, F. Breidt, J. Broadbent, R. Cano, S. Chaillou, J.
Deutscher, M. Gasson, M. van de Guchte, J. Guzzo, A. Haarte, T.
Hawkins, P. Hols, R. Hutkins, M. Klerebeezem, J. Kok, O. Kuipers,
M. Lubbers, M. Maguin, L. McKay, D. Mills, A. Nauta, R. Overbeek, H.
Pel, D. Pridmore, M. Saier, D. van Sinderen, A. Sorokin, J.
Steele, D. O'Sullivan, W. de Vos, M. Zagorec, and R. Siezen. 2002.
Discovering lactic acid bacteria by genomics. Antonie van
Leeuwenhoek 82:29-58). Las secuencias obtenidas en
el presente trabajo mostraron la máxima homología (97%) con
secuencias del gen codificador del ARNr 23S de L. casei
(Número de acceso en GenBank AF098107), así como homología
significativa (93%) con secuencias de la misma molécula de otras
especies de lactobacilos y enterococos. La comparación de la
intensidad de las señales de los fragmentos de restricción con
BbsI y las señales de fluorescencia de la secuenciación,
sugiere que más de una copia de los genes que codifican el ARNr 23S
contienen más de una copia de la secuencia mutada en la cepa L.
rhamnosus E41.
L. rhamnosus E41 muestra propiedades
probióticas prometedoras: capacidad de sobrevivir y crecer a pH 3,
resistencia a una concentración superior al 1% de sales biliares,
inhibición de patógenos intestinales, adhesión a células
intestinales de las líneas Caco2 y HT29. Esta capa L.
rhamnosus E41, puesto que la resistencia a antibióticos no es
fácilmente transmisible, podría utilizarse con este propósito en
aquellas personas que requieren un tratamiento prolongado a estos
antibióticos. Con el objeto de caracterizar de forma más completa
la cepa L. rhamnosus E41 se llevaron a cabo los siguientes
estudios:
- Resistencia a sales biliares en placa (CIM) se
determinó en placas de MRSC suplementadas con concentraciones
gradualmente crecientes de bilis bovina ("Oxgall", Sigma). El
rango de concentraciones utilizado fue entre un 0,06% y 2% de
"Oxgall". La siembra de las placas se realizó mediante un
inoculador de "Steers" utilizando cultivos activos de
24-36 h. Los resultados se evaluaron al cabo de 48
h de incubación a 37ºC en cabina de anaerobiosis.
- Resistencia a pH ácido en líquido (capacidad
de crecer a pH 2, 3, 3, 5, 4, y 5) se ensayó por duplicado en
placas "Microtiter" (Sterilin) con caldo MRSC acidificado con
HCl (12 N) a pH 2, 5, 3, 3, 5, 4 y 4, 5. Como control se utilizó
MRSC sin acidificar (pH 5,5). Las placas "Microtiter" se
inocularon al 2% con cultivos activos de las cepas de de
24-36 h y se incubaron durante 48 h a 37ºC en
cabina de anaerobiosis.
- Presencia de actividades enzimáticas del API
ZYM (bioMérieux) se utilizaron las tiras reactivas "API ZYM"
(bioMérieux). Cada pocillo de la galería se inoculó con 65 \mul
de una suspensión celular en agua destilada. Las tiras se incubaron
a 37ºC durante 4 horas en cabina de anaerobiosis. Las reacciones se
revelaron mediante la adición de los reactivos suministrados por la
casa comercial. La actividad enzimática se expresó en nanomoles de
sustrato hidrolizado. En esta prueba se busca que las cepas no
presenten actividades enzimáticas que se consideran implicadas en
el desarrollo de algunas enfermedades, incluso en cáncer; como la
betaglucuronidasa, actividad tripsinásica, quimiotripsinásica,
etc.
Como consecuencia de las pruebas anteriores se
observó que la cepa L. rhamnosus E41 no presenta ninguna de
estas actividades y, además, presenta otras actividades
consideradas positivas: actividad aminopeptidásica elevada
(maduración de productos lácteos), actividad betagalactosidasa, y
elevada actividad betaglucosidasa (utilización de lactosa y
polisacáridos).
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> CEPA PROBIÓTICA RESISTENTE A
ANTIBIÓTICOS, PRODUCTO PROBIÓTICO QUE LA CONTIENE Y SUS
APLICACIONES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Lacrha
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo YY1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggctcagga cgaacgctgg cggc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo Y2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctactgctg cctcccgtag gagt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1045
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus rhamnosus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mutation
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (893)..(893)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutación puntual de transición
(A-a-G) en la posición 2058 referida
a la numeración del gen de Escherichia coli
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (8)
1. Cepa probiótica aislada del tracto intestinal
humano caracterizada porque presenta una resistencia
intrínseca y no transmisible a antibióticos del tipo macrólidos,
lincosamidas y estreptograminas (fenotipo MLS) y porque presenta
una mutación de transición de A a G en la posición 2058 (según la
numeración del gen 23S de E. coli), en la secuencia del gen
ARNr 23S.
2. Cepa probiótica según la reivindicación 1
caracterizado porque es una cepa tipo Bacteria del Ácido
Láctico (BAL), preferentemente perteneciente a los géneros
Bifidobacterium y Lactobacillus, y más
preferentemente a la especie Lactobacillus rhamnosus.
3. Cepa probiótica según la reivindicación 2
caracterizado porque es la cepa Lactobacillus
rhamnosus E41 (DSM 18791).
4. Uso de la cepa probiótica según las
reivindicaciones 1 a la 3 en la elaboración de un producto
probiótico, ya sea una composición alimentaria o un alimento
funcional que comprende la cepa probiótica de la invención.
5. Producto probiótico caracterizado
porque comprende una cepa probiótica según las reivindicaciones 1 a
la 3 y que pertenece al siguiente grupo: una composición
alimentaria y alimento funcional.
6. Composición alimentaria según la
reivindicación 5 caracterizada porque presenta un formato de
administración perteneciente al siguiente grupo: cepa liofilizada,
en cápsulas, píldoras, formato líquido o geles.
7. Alimento funcional según la reivindicación 5
caracterizado porque pertenece al siguiente grupo: leches
fermentadas incluyendo las leches fermentadas tratadas
térmicamente, las leches fermentadas concentradas y los productos
lácteos compuestos basados en estos productos, para consumo directo
o procesamiento ulterior, distintos tipos de quesos: frescos,
duros, helados, productos de la industria de la bebida tales como
zumos o de la pastelería, alimentos para niños tales como papillas
y sopas.
8. Producto prebiótico según las
reivindicaciones 5 a la 7 caracterizado porque, ya sea una
composición alimentaria o un alimento funcional, comprende la cepa
Lactobacillus rhamnosus E41 (DSM 18791).
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| US20060099197A1 (en) * | 1998-08-24 | 2006-05-11 | Sean Farmer | Probiotic, lactic acid-producing bacteria and uses thereof |
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2006
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