ES2328737T3 - Procedimiento para el marcaje y el analisis de acidos nucleicos. - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para la detección de hebras de ácido nucleico por marcaje con marcadores redox y detección electroquímica de los eventos de hibridación, caracterizado porque a) se hibridizan hebras de ácido nucleico (hebras diana) con una o más hebras de ácido nucleico (hebras protectoras A) que son más cortas que las hebras diana, con el fin de formar secciones parciales de doble hebra, b) se marcan las secciones de monohebra restantes de las hebras diana por reacción con marcadores redox que reaccionan selectivamente con el doble enlace de los anillos de pirimidina de las hebras de ácido nucleico y permiten una reacción redox (reversible) electroanalíticamente utilizable en electrodos de trabajo, siendo el marcador redox [OsO4(bipy)] o [OsO4(py)2], c) se hibridizan las hebras de ácido nucleico así marcadas en la superficie de un electrodo con las hebras de sondas allí inmovilizadas, desplazando las hebras protectoras A, y d) se detectan las hebras de ácido nucleico hibridizadas en las hebras de sondas de manera electroanalítica.

Description

Procedimiento para el marcaje y el análisis de ácidos nucleicos.
Con el fin de permitir una detección electroquímica de los eventos de hibridación de ácidos nucleicos, se utilizan a menudo moléculas redox activas, que se unen de forma covalente o bien a la hebra diana o bien a una hebra reporter, se unen electrostáticamente a los grupos fosfato de los ácidos nucleicos o se incorporan en la doble hebra como intercaladores. La unión de los denominados marcadores redox fijados de forma covalente se produce durante la preparación de las hebras diana o reporter.
Alternativamente, puede utilizarse el óxido de osmio (VIII) en forma de complejos con 2,2-bipiridina, [OsO_{4}(bipy)]. Dichos compuestos complejos reaccionan específicamente con las bases pirimidínicas timina, uracil y, en mucho menor grado, con citosina, atacando al enlace doble del anillo de pirimidina. En una doble hebra intacta, no tendrá lugar dicha reacción. Por otro lado, monohebras cuyas bases pirimidínicas han reaccionado con los complejos de osmio, ya no son capaces de formar dobles hebras. Dichas relaciones fueron investigadas al principio de los años 80 por Palecek, Jelen y Foita y utilizadas en forma de muchos ejemplos para la detección de la hibridación. Se hace referencia a las siguientes publicaciones, las cuales se incorporan expresamente en la presente solicitud de patente: M. Foita et al. J. Am. Chem. Soc. 126 (2004) 6532; P. Kostecka et al. Bioelectrochemistry 63 (2004) 245; M. Foita et al. Electroanalysis 15 (2003) 431.
La modificación de ADN por medio de complejos de osmio (VIII) puede realizarse muy fácilmente adicionando el reactivo de osmio a la solución analítica. Tras la modificación, se procede a separar el reactivo excedente por diálisis en recipientes de diálisis simples disponibles en el mercado. A tal fin, el mejor procedimiento consiste en realizar la hibridación de la molécula diana y de la sonda en superficies distintas.
Particularmente aptos son los denominados "Magnetic Beads", que llevan unas hebras de sondas inmovilizadas en la superficie y pueden separarse de la solución analítica (y por tanto de las hebras no complementarias y de los reactivos analíticos) por medio de un campo magnético. Según este principio, sería posible separar cualquier hebra de ácidos nucleicos. Sin embargo, este principio adolece del inconveniente de que deben utilizarse áreas de reacción distintas para realizar tanto la hibridación como la detección electroquímica. El problema de que las monohebras de ácidos nucleicos modificadas con osmio ya no sean capaces de formar dobles hebras y por otro lado las dobles hebras intactas no reaccionan con [OsO_{4}(bipy)] todavía no ha sido resuelto de forma satisfactoria. Sería deseable conseguir el marcaje de los productos PCR o de muestras de ácidos nucleicos nativos con compuestos de osmio sin perder la capacidad de hibridación. El gran número de unidades de osmio unidas a las hebras diana provocaría una sensibilidad muy alta en el análisis electroquímico subsiguiente. Otro inconveniente es la toxicidad de los compuestos de osmio, con lo cual sería deseable sustituirlos por sustancias menos tóxicas que reaccionan con los ácidos nucleicos de forma análoga.
Por tanto, el objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento que permita un marcaje rápido y sencillo de las hebras de ácidos nucleicos de cualquier tipo y directamente a continuación su detección electroquímica en un electrodo de trabajo.
Descripción de la invención
Dicho objetivo se alcanza por medio de un procedimiento en el que el ácido nucleico a detectar se hace contactar en forma de hebras de ácido nucleico monohebra, hibridizadas parcialmente (es decir, sobre una parte de la longitud total de las hebras de ácido nucleico) con hebras protectoras, con sustancias que reaccionan específicamente con nucelobases (anillos de pirimidina) de las secciones de ácido nucleico monohebra y a continuación pueden hacerse reaccionar en una reacción redox reversible en procedimientos electroanalíticos conocidos por los expertos en la materia.
Los marcadores redox utilizados en dicha reacción son los compuestos de osmio (VIII) [OsO_{4}(bipy)] o [OsO_{4}
(py)_{2}]. Según la invención, se prefiere el complejo de tetraóxido de osmio con 2,2'-bipiridina, [OsO_{4}(bipy)].
1
El procedimiento según la invención se ha ilustrado esquemáticamente en la Figura 1, utilizando un ejemplo concreto.
En particular, la invención se refiere a un procedimiento para la detección de hebras de ácido nucleico por marcaje con marcadores redox y la detección electroquímica de los eventos de hibridación, en el que
a)
se hibridizan hebras de ácido nucleico monohebra (hebras diana) con una o más hebras de ácido nucleico (hebras protectoras A) que son más cortas que las hebras diana, con el fin de formar secciones parciales de doble hebra,
b)
se marcan las secciones monohebra restantes de las hebras diana por reacción con los marcadores redox [OsO_{4}(bipy)] o [OsO_{4}(py)_{2}] que permiten una reacción redox (reversible) electroanalíticamente utilizable en electrodos de trabajo (en particular en electrodos de trabajo de metal, de carbono, de polímero, de semiconductor, de óxido de indio-estaño), sobre las cuales las hebras de sondas se encuentran inmovilizadas,
c)
se hibridizan las hebras de ácido nucleico así marcadas sobre la superficie de un electrodo con las hebras de sondas allí inmovilizadas, desplazando las hebras protectoras A, y
d)
se detectan las hebras de ácido nucleico hibridizadas en las hebras de sondas por procedimientos electroanalíticos.
En la presente invención, se entienden por "secciones parciales de doble hebra" que las hebras diana monohebra se hibridizan sólo sobre una parte de su longitud total con las hebras protectoras A), formando secciones de doble hebra, es decir, la longitud de las hebras protectoras A) se selecciona de tal manera que quedan disponibles para la reacción subsiguiente con los marcadores redox secciones de monohebra de longitud suficiente de la secuencia diana. Dichas secciones restantes de monohebra de la secuencia diana deben contener por lo menos una base de timina. Cuanto más bases de timina están presentes en la sección de monhebra, tanto más pueden ser marcadas en la etapa siguiente con el marcador redox y tanto más altas serán al final las señales electroanalíticas y por ello la sensibilidad del procedimiento global.
La hibridación se lleva a cabo con las hebras protectoras A), que son más cortas que las hebras diana. La longitud de las hebras protectoras A) debe ser suficiente como para permitir una formación de doble hebra lo suficientemente estable. Por otro lado, en la etapa c) tiene lugar una hibridación con hebras de sondas, que están inmovilizadas en las superficie de un electrodo. Puesto que dicha hibridación se realiza desplazando las hebras protectoras A, los siguientes puntos deben tenerse en cuenta: Las hebras de sonda deberían ser tan largas como las hebras protectoras o sólo ligeramente más largas. Es ventajoso si en el dúplex de hebra diana/hebra protectora ocurran emparejamientos falsos. Esto resulta particularmente eficaz cuando las hebras de sonda son un poco más cortas que las hebras protectoras. Los emparejamientos falsos no deben ocurrir en los sitios de la hebra diana en los que se encuentran bases de timina, puesto que las mismas podrían resultar marcadas, lo cual afectaría a la hibridación ulterior con las hebras de
sonda.
Esto garantiza que el dúplex de hebra diana/hebra protectora no es más estable que el dúplex de hebra diana/hebra de sonda y que tendrá lugar un cambio de las hebras protectoras por las hebras de sonda.
Según una forma de realización particular, en el procedimiento citado anteriormente, se realiza la etapa c), es decir, el desplazamiento de las hebras protectoras por las hebras de sondas, a una temperatura que es la óptima para la hibridación térmicamente estricta de las hebras de sonda y las hebras diana. Dicho procedimiento acelera por un lado el intercambio de hebras en la superficie del electrodo y dificulta por otro lado la unión de las hebras que no son complementarias cien por cien a las hebras de sonda. La temperatura óptima se sitúa por debajo de la denominada temperatura de fusión. A esta última, las dos hebras complementarias están presentes en un 50% como doble hebra. Para determinar la temperatura óptima de cada hebra de sonda, sirve el análisis de la curva de fusión. Una señal analítica que depende del estado de hibridación se traza en función de la temperatura. A tal fin, se mide normalmente la absorción por UV o la fluorescencia del ADN en solución homogénea.
La detección electroanalítica de las hebras diana unidas a las hebras de sonda inmovilizadas se realiza dentro del procedimiento según la invención, preferentemente por medio de cronopotenciometría, coulometría, amperometría o voltametría, preferentemente por medio de voltametría con onda cuadrada (SWV), voltametría de corriente alterna (ACV) o voltametría cíclica (CV). Los electrodos utilizados pueden ser electrodos metálicos, de carbono, de polímero o de semiconductor, preferentemente electrodos de alambre o estratificados, constituidos por oro, cobre, bismuto, mercurio, plata, plomo, estaño o sus aleaciones. Preferentemente, se utilizarán electrodos calentables directamente por medio de corriente eléctrico o indirectamente por medio de calentamiento por resistencia eléctrica.
La inmovilización de las hebras de sonda sobre la superficie de los electrodos se efectúa según los procedimientos conocidos por los expertos en la materia.
Es preferido, según la invención, fijar las hebras de sonda, preferentemente en electrodos metálicos con grupos tiol, por quimiosorción (ver, por ejemplo, Steel, B.A.; Herne, T.M.; Tarlov, M.J. Anal. Chem. 1998, 70, 4670-4677).
En una forma de realización particular del procedimiento según la invención, las secciones de doble hebra constituidas por las hebras protectoras A y las hebras diana presentan uno o más emparejamientos falsos, con el fin de desplazar las mismas más fácilmente por las hebras de sonda que encajan mejor, es decir, que presentan menos emparejamientos falsos.
El marcador redox utilizado preferentemente en el procedimiento es [OsO_{4}(bipy)].
Según una forma de realización de la invención, el procedimiento se lleva a cabo eliminando las moléculas del marcador redox excedentes de la solución analítica por diálisis, antes de realizar la etapa c), es decir, después de la reacción de marcaje entre las hebras diana parcialmente protegidas y los marcadores redox.
Según otra forma de realización, las hebras de sonda están presentes en la etapa c) en forma hibridizada, es decir, las mismas se han hibridizado con una o más hebras de ácido nucleico (hebras protectoras B). En este caso, en la etapa c) se hibridizan las hebras de ácido nucleico marcadas en la superficie de un electrodo con las hebras de sonda inmovilizadas allí, desplazando las hebras protectoras A y hebras protectoras B.
La variante del procedimiento según la invención descrita anteriormente se ha representada esquemáticamente en la Figura 2 utilizando un ejemplo concreto.
Según otra variante del procedimiento, los marcadores redox excedentes permanecen en la solución analítica después de la etapa b), y se separan las señales electroquímicas de los marcadores unidos a la superficie del electrodo de las señales del marcador redox que se encuentra en solución durante la detección utilizando procedimientos analíticos electroquímicos adecuados. En dicha variante del procedimiento, el procedimiento analítico electroquímico preferido es la cronocoulometría. La cronocoulometría permite distinguir entre las corrientes de difusión electroquímicas que proceden de la reacción de las sustancias disueltas y las corrientes electroquímicas causadas por las sustancias fijadas en la superficie. De esta forma, se puede determinar, por ejemplo, la cantidad de ADN inmovilizado sobre los electrodos de oro adicionando a la solución cloruro de hexaaminrutenio. Este último se une a los grupos fosfato de las hebras de ADN (ver, por ejemplo, Steel, B.A.; Herne, T.M.; Tarlov, M.J. Anal. Chem. 1998, 70, 4670-4677).
El procedimiento según la invención presenta la ventaja de ser fácil de realizar y de permitir un marcaje rápido y sencillo de cualesquiera de las hebras de ácido nucleico, que pueden detectarse a continuación directamente por procedimientos electroquímicos.
La ventaja de un marcaje de los ácidos nucleicos por medio de complejos de tetraóxido de osmio radica en su fácil realización. Solamente hay que adicionar el complejo, por ejemplo [OsO_{4}(bipy)], a la solución que contiene el ADN y a continuación dicho compuesto reaccionará espontáneamente con todas las bases de timina en la solución que no estén presentes en las dobles hebras de ADN, es decir, que estén presentes en monohebras de ADN en secciones de ADN de monohebra. También serán atacadas otras bases pirimidínicas. Sin embargo, citosina reaccionará a una velocidad unas 10 veces más lenta que timina. En el ARN, la base pirimidínica uracil toma el lugar de timina. Se diferencia de timina solamente en un grupo metilo que falta.
La segunda ventaja es la alta sensibilidad obtenida cuando la hebra diana contiene muchas bases de timina o uracil. Resulta que la mayor parte de dichas bases estará siempre localizada en una sección monohebra y por tanto será atacada por [OsO_{4}(bipy)]. Se supone que en el promedio un producto PCR contiene de 50 a 200 bases de timina por hebra. El ARNm puede contener más de 500 bases de uracil. Esto conduce a una señal amplificada en más de cien veces en comparación con los marcadores redox unidos de forma covalente, tales como por ejemplo ferroceno, puesto que por cada hebra diana se hacen reaccionar más de 100 electrones. Una determinación de ARNm selectiva, directa y de alta sensibilidad de este tipo puede prescindir de una etapa de PCR que normalmente la precede, permitiendo de esta manera un análisis rápido y sencillo de la expresión genética de células.
La medida del procedimiento según la invención de hibridizar una o más secciones de las hebras diana con una hebra protectora que encaja con las mismas presenta la ventaja de que la sección o las secciones de doble hebra así formada(s) son resistentes a [OsO_{4}(bipy)]. En la etapa de hibridación con la sonda inmovilizada, la hebra protectora en la hebra diana se sustituye por la hebra de sonda. Como resultado se obtiene una hebra diana que está unida en la superficie de electrodo y contiene un gran número de bases pirimidínicas marcadas con osmio. Un aspecto expuesto en la presente memoria, pero que no forma parte de la invención, es que moléculas orgánicas pueden imitar el comportamiento de [OsO_{4}(bipy)].
A tal fin, dichas moléculas contienen un componente de 1,3-dieno, para que puedan reaccionar con el doble enlace de las bases pirimidínicas en una reacción según Diels-Alder, formando un nuevo anillo. Además, dichas moléculas contienen un componente que es capaz de reaccionar reversiblemente en una reacción electroquímica. Entre éstas, se incluyen quinonas, naftaquinonas, 1,4-diaminonaftalinas, diaminobencenos, antraquinonas, fenotiazinas, tetratiafulvaleno. Los dos componentes están unidos entre sí de tal forma que no se perjudica su función por medio de efectos mesoméricos. La configuración estérica de dichas moléculas es tal que se parecen a los complejos de osmio y, reaccionan, de forma análoga a los compuestos de osmio [OsO_{4}(bipy)] y [OsO_{4}(py)_{2}], sólo con los ácidos nucleicos de monohebra, pero no con los ácidos nucleicos doble hebra, con lo cual las secciones de monohebra marcadas ya no formarán dobles hebras con una hebra complementaria.
Otra gran ventaja es que todas los ácidos nucleicos de monohebra no protegidos son atacadas por [OsO_{4}(bipy)] y, a continuación, ya no formarán dobles hebras. Esto dificulta la formación de productos de adición no específica de hebras de ácido nucleico no complementarias con las hebras de sonda. Esto facilita la detección de hebras diana en un exceso de hebras de ácido nucleico no complementarias.
En caso de la detección de ARNm, todas estas ventajas juntas pueden hacer innecesaria la amplificación por PCR, puesto que la sensibilidad de detección del procedimiento según la invención es suficiente incluso para cantidades de ARNm muy pequeñas.
En el promedio, se supone que un producto PCR contiene de 50 a 200 bases de timina por hebra. El ARNm puede contener más de 500 bases de uracil. Esto produce una señal amplificada en más de cien veces en comparación con los marcadores redox convencionales unidos de forma covalente, tal como por ejemplo ferroceno, puesto que se hacen reaccionar más de 100 electrones por cada hebra diana.
Una determinación de ARNm selectiva, directa y de alta sensibilidad de este tipo puede prescindir de una etapa de PCR que normalmente la precede, permitiendo de esta manera un análisis rápido y sencillo de la expresión genética de células.
Además de esto, el procedimiento según la invención es de gran utilidad económica, puesto que facilita considerablemente los procedimientos analíticos de ADN y ARN. Se utilizan chips de ADN electroquímicos que en el transcurso de los procedimientos electroanalíticos (cronopotenciometría, amperometría, coulometría, voltametría) producen datos analíticos digitales que pueden leerse directamente, y no se necesitan oligonucleótidos caros, especialmente marcados. En caso de los análisis de la expresión de genes, en el mejor de los casos se puede prescindir de la amplificación por PCR cara y laboriosa.
En particular, esto abre el camino a tres aplicaciones de interés económico del principio según la invención:
\bullet
\vtcortauna Preparación a costes bajos de hebras de ácido nucleico marcadas para ser utilizadas como sondas reporter electroquímicamente activas, que contienen secciones complementarias a secciones en las hebras diana y las reconocen molecularmente, seguidas de una secuencia de oligotimina que reacciona con [OsO_{4}(bipy)] o [OsO_{4}(py)_{2}].
\bullet
\vtcortauna Análisis rápido, sencillo, electroquímico, a bajos costes, de hebras de ARNm procedente de la expresión de genes sin PCR previa.
\bullet
\vtcortauna Detección rápida, sencilla, electroquímica, a bajos costes, de productos PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto, la presente invención se refiere también a procedimientos para el análisis de la expresión de genes y para la detección de productos PCR, es decir, la utilización de los procedimientos citados anteriormente para el análisis de la expresión de genes y para la detección de productos PCR.
La invención se refiere asimismo a kits para llevar a cabo un procedimiento para el análisis de la expresión de genes y para la detección de productos PCR, que comprende uno o más ácidos nucleicos (hebras protectoras A), marcadores redox [OsO_{4}(bipy)] o [OsO_{4}(py)_{2}] y electrodos con sondas inmovilizadas en su superficie, en los que las secuencias de ácido nucleico de las hebras protectoras y hebras de sonda son complementarias a las hebras diana a detectar y más cortas que las mismas y las secuencias de ácido nucleico de las hebras protectoras pueden contener también uno o más emparejamientos falsos.
A continuación, la invención se ilustrará asimismo haciendo referencia a ejemplos, no estando limitada la invención de ningún modo a dichos ejemplos de formas de realización.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos Ejemplo 1 Marcaje de un producto PCR con [OsO_{4}(bipy)] y análisis electroquímico del producto resultante
Para la determinación de los productos PCR, se utilizó el procedimiento del Ejemplo 2, presentando los productos PCR la secuencia diana buscada.
Antes del marcaje, la PCR en la mezcla de reacción se paró por medio de proteasa. A continuación, para la desnaturalización de todas las dobles hebras, se calentó la mezcla otra vez a 95ºC. Luego la hebra protectora se adicionó en gran exceso (en comparación con los productos PCR). A continuación, la hebra protectora se fijó por adición en los productos PCR de forma térmicamente estricta, la mezcla resultante se enfrió a 35ºC, y se adicionó [OsO_{4}(bipy)] 1 mM.
Tras completar la reacción, el [OsO_{4}(bipy)] excedente se separó por diálisis. Por fin, se realizó la hibridación con las hebras de sonda inmovilizadas en oro, desplazando las hebras protectoras y realizando la detección electroquímica por medio de voltametría con onda cuadrada.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Marcaje de una hebra diana con [OsO_{4}(bipy)] y análisis electroquímico del producto resultante
Se mezclaron cantidades equimolares de tetraóxido de osmio (obtenible, por ejemplo, de la empresa Fluka en forma de una solución al 2% en agua) y de 2,2'-bipiridilo en una solución 10 mM del complejo [OsO_{4}(bipy)]. Esta mezcla puede almacenarse a -18ºC.
Después de mezclar 16,5 \mul (500 pmol) de la hebra protectora con la secuencia 5'-CGC GGA TAA CAC AGC CAC GC-3' (todos los oligonucleótidos eran de la empresa Operon, Colonia, Alemania) y la misma cantidad de la hebra diana con la secuencia 5'-TTT TTA GGT GAC TGT GTT ATC CGC A-3' a temperatura ambiente durante dos horas, se adicionaron 15 \mul del complejo y 12 \mul de tris(hidroximetil)aminometano (Tris) 10 mM + Na_{2}SO_{4} 0,5 M pH 7,5. La
mezcla entera se sacudió brevemente y a continuación se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 22 horas.
Para parar la reacción y separar el [OsO_{4}(bipy)] restante, se realizó un diálisis de 19 horas en aproximadamente 50 ml del tampón Tris 10 mM + Na_{2}SO_{4} 0,5 M pH 7,5 a 10ºC utilizando Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units de la empresa Rockford (IL, USA) con un MWCO (peso molecular límite) de 3500 kDa.
Para la preparación de la sonda, se sometieron los electrodos en primer lugar a un tratamiento previo. El electrodo con disco de oro se pulió con polvo de óxido de aluminio. El electrodo con alambre de oro se recoció al aire, pasando una corriente alterna de 0,65 A por el mismo. A continuación, se realizó un tratamiento previo electroquímico en ambos electrodos, en el que se recorrió 25 veces un ciclovoltagrama entre -0,2 y +1,85 V, relativo a un electrodo de referencia de Ag/AgCl (KCl 3 M) en ácido sulfúrico 0,5 M. A continuación, los electrodos se lavaron primero con agua y después con etanol. Después de secarlos, una gota (16,5 \mul) de la solución de hebra de sonda (contiene 500 pmol de la hebra de sonda) se colocó en la superficie de oro y el puente del electrodo con alambre, respectivamente. La hebra de sonda presenta la secuencia 5'-TGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' y está unida por el extremo 3' a un ligador de disulfuro CH_{3}-(CH_{2})_{2}-S-S-(CH_{2})_{3}, a través del cual se produce la unión a la superficie de oro. A continuación, el electrodo se dejó reposar durante la noche en una atmósfera de vapor de agua saturada a 5ºC. Entonces se lavó primero con un tampón de fosfato 0,25 M pH 7,0 y después con agua y se colocó, para un depósito adicional, en una solución acuosa de 6-mercapto-1-hexanol (MCH) 1 mM durante una hora (T.M. Herne, M.J. Tarlov, J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 8916-8920). Finalmente, se lavó con etanol y agua.
Para la hibridación de la hebra de sonda y de la hebra diana, la solución que contiene la doble hebra constituida por la hebra diana marcada y la hebra protectora se diluyó primero en un vaso de precipitado de 10 ml a una concentración de aproximadamente 160 nM con un tampón Tris 10 mM + Na_{2}SO_{4} 0,5 M pH 7,5. A continuación, esta solución se calentó en un baño maría a 80ºC durante 1 minuto, para abrir la doble hebra y facilitar la siguiente hibridación con la hebra de sonda.
A continuación, la solución se dejó enfriar a una temperatura de 35ºC. La misma se ajustó con la ayuda de un baño maría. En caso del electrodo con alambre, se utilizó una solución fría de 3ºC (en este caso, la temperatura se ajustó a través de la calefacción del alambre).
Por fin, se inició la hibridación, sumergiendo el electrodo con la hebra de sonda inmovilizada en la solución de la hebra diana. Tras transcurrir un tiempo determinado, preferentemente 15 minutos, el electrodo junto con la doble hebra se transfirió a la célula de medición.
Las mediciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente en una célula de medición que contiene 20 ml del tampón Tris 10 mM + Na_{2}SO_{4} 0,5 M pH 7,5.
Antes de cada medición adicional, se deshibridizó la doble hebra en agua caliente de 50ºC durante 30 segundos.
Para las mediciones voltamétricas (voltametría con onda cuadrada), se utilizó un AUTOLAB® de la empresa Eco Chemie (Utrecht, NL), que estaba equipado con un potenciostato del tipo PSTAT 10. Las mediciones se controlaron con el software GPES 3. La amplitud de pulso era de 40 mV, y la frecuencia era de 200 Hz a un nivel del potencial de 2 mV.
Se utilizó una disposición con 3 electrodos con un electrodo de Ag/AgCl (KCl 3 M) como electrodo de referencia y un electrodo de carbono vitrificado como contraelectrodo.
Como electrodo de trabajo, se utilizaron un electrodo con disco de oro (diámetro 3 mm) y un electrodo con alambre de oro calentable (longitud del alambre 4 mm a un diámetro de 25 \mum). Los electrodos de carbono vitrificado, con disco de oro y Ag/AgCl eran de la empresa Metrohm. El electrodo con alambre de oro era de construcción propia (G.-U. Flechsig, J. Peter, G. Hartwich, J. Wang, P. Gründler, Langmuir 2005, 21, 7848-7853).
Para calentar el electrodo con alambre, se necesitó corriente alterna de 100 kHz. El mismo se generó por medio de una fuente de corriente FPS 15A DC de VOLTCRAFT®, de un generador de funciones MXG-9802 de VOLTCRAFT® y de un amplificador CA2100 (Concord Car Audio, Woodbury, NY, USA). Al final de la disposición, se encontró un transformador de alta frecuencia. Las corrientes de caldeo se leyeron en un multímetro de VOLTCRAFT® M-4660A.
La relación entre la temperatura del electrodo con alambre de oro y la corriente de caldeo se determinó en otro experimento. En dicho experimento, el electrodo con alambre y una contraelectrodo, que en este caso era un electrodo constituido por carbono vitrificado, se colocaron en una célula de medición que contenía hexacianoferrato (II) de potasio 50 mM y hexacianoferrato (III) de potasio 50 mM en cloruro de potasio 0,1 M. La temperatura de esta solución era de 3ºC. A continuación, se calentó el electrodo con alambre y se midió la diferencia de potencial entre los dos electrodos (por potenciometría). Con el coeficiente de temperatura conocido (\beta = 1,6 mV/K), se podía derivar una curva de calibración, de la cual puede apreciarse a qué corriente se produce qué temperatura (T. Zerihun, P. Gründler, J. Electroanal. Chem. 1996, 415, 85-88; T. Zerihun, P. Gründler, J. Electroanal. Chem. 1996, 404, 243-248).
La altura de señal de la corriente de pico depende de la duración de hibridación, la temperatura de hibridación y la concentración de la hebra diana. Otro papel decisivo es desempeñando por el número de las bases pirimidínicas timina y citosina. En este caso, resultaron marcadas 5 bases de timina.
En la Figura 3, se han representando los voltamogramas de la hebra de sonda, hebra de sonda y hebra diana no complementaria marcada (diana NC) (t_{H} = 15 min, T = 23ºC, c_{diana} _{NC} = 163,4 nM), hebra de sonda y hebra protectora marcada (t_{H} = 20 min, T = 40ºC, c_{diana} = 163,4 nM) y hebra de sonda y hebra diana marcada (t_{H} = 15 min, T = 23ºC, c_{diana} = 163,4 nM). Las mediciones se llevaron a cabo en el tampón Tris 10 mM + Na_{2}SO_{4} 0,5 M (pH 7,5) con el electrodo con disco de oro (diámetro 3 mm). Durante la hibridación, se agitó la solución.
La Figura 4 muestra la altura del pico en función de la duración de hibridación a 23ºC. Las mediciones se llevaron acabo en un tampón Tris 10 mM + Na_{2}SO_{4} 0,5 M (pH 7,5). La concentración de la hebra diana c era de 163,4 nM. Durante la hibridación, se agitó la solución. Se han trazado los valores promedios de tres mediciones y las desviaciones máximas del valor promedio.
La Figura 5 describe la altura del pico en función de la temperatura. Las mediciones se llevaron acabo en el tampón Tris 10 mM + Na_{2}SO_{4} 0,5 M (pH 7,5). La concentración de la hebra diana era de 163,4 nM, y la duración de hibridación era de 15 min. Las mediciones se llevaron a cabo con el electrodo con disco de oro (diámetro 3 mm). Durante la hibridación, se agitó la solución. Se han trazado los valores promedios de 3 mediciones y las desviaciones máximas del valor promedio.
La Figura 6 muestra la altura del pico en función de la concentración de la hebra diana. Las mediciones se llevaron acabo en el tampón Tris 10 mM + Na_{2}SO_{4} 0,5 M (pH 7,5). La temperatura T era de 40ºC, y la duración de hibridación t_{H} era de 15 min. Las mediciones se llevaron a cabo con el electrodo con disco de oro (diámetro 3 mm). Durante la hibridación, se agitó la solución.
Hebra diana:
5'-TTT TTA GGT GAC TGT GTT ATC CGC A-3'
Hebra protectora:
5'-CGC GGA TAA CAC AGC CAC GC-3'
Hebra de sonda:
5'-TGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' con un ligador de disulfuro CH_{3}-(CH_{2})_{2}-S-S-(CH_{2})_{3} en el extremo 3'
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Ejemplo 3 Preparación y utilización de hebras reporter marcadas con [OsO_{4}(bipy)]
Se utilizó el procedimiento del Ejemplo 2, pero marcando la hebra reporter en lugar de la hebra diana e hibridizando las hebras diana con las hebras reporter marcadas y las hebras de sonda inmovilizados para la detección de la secuencia diana.
Las hebras reporter contenían además de la secuencia complementaria, un gran número de bases de timina por uno o ambos extremos. Las hebras reporter se hibridizaron con la hebra protectora, se adicionó [OsO_{4}(bipy)] 1 mM, y luego se purificó la solución, eliminando el exceso de [OsO_{4}(bipy)] por diálisis. La solución obtenida de este modo se adicionó a la solución diana y, a continuación, las hebras diana se hibridizaron con las hebras de sonda inmovilizadas en el electrodo de oro.
Por fin, se realizó el análisis electroquímico por medio de voltametría con onda cuadrada. Este procedimiento permitió obtener hebras reporter marcadas múltiplemente a bajos costes, las cuales producían muy largas señales electroquímicas reversibles.
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Marcaje de una hebra reporter con [OsO_{4}(bipy)] y análisis electroquímico del producto resultante
Se introdujeron cantidades equimolares de tetraóxido de osmio (obtenible, por ejemplo, de la empresa Fluka en forma de una solución al 2% en agua) y de 2,2'-bipiridilo en una solución 10 mM del complejo [OsO_{4}(bipy)]. Esta mezcla puede almacenarse a -18ºC.
Después de mezclar 16,5 \mul (500 pmol) de la hebra protectora con la secuencia 5'-CGG AGG TAC GGT AAC CGG-3' (todos los oligonucleótidos de la empresa Operon, Colonia, Alemania) y la misma cantidad de la hebra reporter con la secuencia 5'-TTT TTG CAG TTA CCG TAC CTC GA-3' a temperatura ambiente durante dos horas, se adicionaron 15 \mul del complejo y 12 \mul de tris(hidroximetil)aminometano (Tris) 10 mM + Na_{2}SO_{4} 0,5 M pH 7,5. La mezcla entera se sacudió brevemente y a continuación se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 22
horas.
Para parar la reacción y separar el [OsO_{4}(bipy)] restante, se realizó un diálisis de 19 horas en aproximadamente 50 ml del tampón Tris 10 mM + Na_{2}SO_{4} 0,5 M pH 7,5 utilizando Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units de la empresa Rockford (IL, USA) con un MWCO (peso molecular límite) de 3.500 kDa.
Para la preparación de la sonda, se sometieron los electrodos en primer lugar a un tratamiento previo. El electrodo con disco de oro se pulió con polvo de óxido de aluminio. El electrodo con alambre de oro se recoció al aire, pasando una corriente alterna de 0,65 A por el mismo. A continuación, se realizó un tratamiento previo electroquímico en ambos electrodos, en el que se recorrió 25 veces un ciclovoltagrama entre -0,2 y +1,85 V, relativo a un electrodo de referencia de Ag/AgCl (KCl 3 M) en ácido sulfúrico 0,5 M. A continuación, los electrodos se lavaron primero con agua y después con etanol. Después de secarlos, una gota (16,5 \mul) de la solución de hebra de sonda (contiene 500 pmol de la hebra de sonda) se colocó en la superficie de oro y el puente del electrodo con alambre, respectivamente. La hebra de sonda presentaba la secuencia 5'-TGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' y estaba unida por el extremo 3' a un ligador de disulfuro CH_{3}-(CH_{2})_{2}-S-S-(CH_{2})_{3}, a través del cual se produce la unión a la superficie de oro. A continuación, el electrodo se dejó reposar durante la noche en una atmósfera de vapor de agua saturada a 5ºC. A continuación, se lavó primero con el tampón de fosfato 0,25 M (pH 7,0) y después con agua y se colocó, para un depósito adicional, en una solución acuosa de 6-mercapto-1-hexanol (MCH) 1 mM durante una hora (T.M. Herne, M.J. Tarlov, J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 8916-8920). Finalmente, se lavó con etanol y agua.
Para la hibridación de la hebra reporter y de la hebra diana (secuencia: 5'-AGG TGA CTG TGT TAT CCG CAC CCC CCT CGA GGT ACG GTA ACT GC-3'), la solución que contenía la doble hebra constituida por la hebra reporter marcada y la hebra protectora se introdujo primero en un vaso de precipitado de 10 ml junto con una solución de la concentración deseada (por ejemplo 163,4 nM) de la hebra diana en el tampón Tris 10 mM + Na_{2}SO_{4} 0,5 M pH 7,5. A continuación, la solución se calentó en un baño maría a 80ºC durante 1 minuto, para abrir la doble hebra y facilitar la siguiente hibridación con la hebra diana.
Después de ajustar el baño maría a la temperatura deseada (en función de la temperatura de fusión de la doble hebra), el electrodo junto con la hebra de sonda inmovilizada (en caso de mediciones con el alambre calentado 3ºC, ajustándose la temperatura en este caso a través del calentamiento del alambre) se sumergió en la solución que contenía la hebra diana marcada a través de la hebra reporter. Tras transcurrir un tiempo de 15 minutos, el electrodo junto con la doble hebra se transfirió a la célula de medición.
Las mediciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente en una célula de medición que contenía 20 ml del tampón Tris 10 mM + Na_{2}SO_{4} 0,5 M pH 7,5.
Antes de cada medición adicional, se deshibridizó la doble hebra en agua caliente de 50ºC durante 30 segundos.
Para las mediciones voltamétricas (voltametría con onda cuadrada), se utilizó un AUTOLAB® de la empresa Eco Chemie (Utrecht, NL), que estaba equipado con un potenciostato del tipo PSTAT 10. Las mediciones se controlaron con el software GPES 3. la amplitud de pulso era de 40 mV, y la frecuencia era de 200 Hz a un nivel del potencial de 2 mV.
Se utilizó una disposición con 3 electrodos con un electrodo de Ag/AgCl (KCl 3 M) como electrodo de referencia y un electrodo de carbono vitrificado como contraelectrodo.
Como electrodo de trabajo, se utilizaron un electrodo con disco de oro (diámetro 3 mm) y un electrodo con alambre de oro calentable (longitud del alambre 4 mm a un diámetro de 25 \mum). Los electrodos de carbono vitrificado, con disco de oro y Ag/AgCl eran de la empresa Metrohm. El electrodo con alambre de oro era de construcción propia (G.-U. Flechsig, J. Peter, G. Hartwich, J. Wang, P. Gründler, Langmuir 2005, 21, 7848-7853).
Para calentar el electrodo con alambre, se necesitó corriente alterna de 100 kHz. El mismo se generó por medio de una fuente de corriente FPS 15A DC de VOLTCRAFT®, de un generador de funciones MXG-9802 de VOLTCRAFT® y de un amplificador CA2100 (Concord Car Audio, Woodbury, NY, USA). Al final de la disposición, se encontró un transformador de alta frecuencia. Las corrientes de calentamiento se leyeron en un multímetro de VOLTCRAFT®
N-4660A.
La relación entre la temperatura del electrodo con alambre de oro y la corriente de calentamiento se determinó en otro experimento. En dicho experimento, el electrodo con alambre y una contraelectrodo, que en este caso era un electrodo constituido por carbono vitrificado, se colocaron en una célula de medición que contenía hexacianoferrato (II) de potasio 50 mM y hexacianoferrato (III) de potasio 50 mM en cloruro de potasio 0,1 M. La temperatura de esta solución era de 3ºC. A continuación, se calentó el electrodo con alambre y se midió la diferencia de potencial entre los dos electrodos (por potenciometría). Con el coeficiente de temperatura conocido (\beta = 1,6 mV/K), se podía derivar una curva de calibración, de la cual puede apreciarse a qué corriente se produce qué temperatura (T. Zerihun, P. Gründler, J. Electroanal. Chem. 1996, 415, 85-88; T. Zerihun, P. Gründler, J. Electroanal. Chem. 1996, 404, 243-248).
Hebra reporter:
5'-TTT TTG CAG TTA CCG TAC CTC GA-3'
Hebra diana:
5'-AGG TGA CTG TGT TAT CCG CAC CCC CCT CGA GGT ACG GTA ACT GC-3'
Hebra protectora:
5'-CGG AGG TAC GGT AAC CGG-3'
Hebra de sonda:
5'-TGC GGA TAA CAC AGT CAC CT-3' con un ligador de disulfuro CH_{3}-(CH_{2})_{2}-S-S-(CH_{2})_{3} en el extremo 3'
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Ejemplo 4 Investigación de la expresión de genes por marcaje de las copias de ARNm con [OsO_{4}(bipy)]
El procedimiento discurrió de forma análoga al Ejemplo 2, en el que las hebras diana eran del ARNm.
Los extractos de ácido nucleico procedente de una muestra de células o tejidos se hibridizaron con las hebras protectoras, las cuales correspondían a una sección de la secuencia del gen exprimido buscado. A continuación, se adicionó [OsO_{4}(bipy)] 1 mM. Esto modificó la mayor parte de las hebras de ácido nucleico con osmio, que ya no eran capaces de formar dobles hebras. A continuación, sólo las secciones protegidas de las copias del ARNm podían hibridizarse en las hebras de sonda inmovilizadas en el oro, desplazando las hebras protectoras. De esta forma, se consiguió por un lado una alta selectividad y por otro lado una sensibilidad muy alta durante el análisis electroquímico subsiguiente por cronopotenciometría. Por tanto, no era necesaria una amplificación de las copias del ARNm por RT-PCR y PCR.
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Ejemplo 5 Análisis electroquímico de los ácidos nucleicos marcados con osmio directamente después de la reacción de marcaje sin eliminación previa del exceso del [OsO_{4}(bipy)] disuelto
El procedimiento discurrió de forma análoga al Ejemplo 2, pero sin realizar un diálisis después de la reacción de marcaje, con lo cual el exceso del reactivo de marcaje permanece en la solución de muestra. Para la hibridación, dicha solución se pone en contacto con el electrodo de trabajo modificado con la hebra de sonda.
Utilizando la cronocoulometría (A. B. Steel, T. M. Herne, M. J. Tarlov, Anal. Chem. 1998, 70, 4670-4677), era posible distinguir entre las señales electroquímicas de los compuestos de osmio inmovilizados y las de las moléculas de [OsO_{4}(bipy)] disueltas.
Con este fin, se realizó un experimento de salto de potencial. Se cambió el potencial de -0,2 a -0,4 V. Este momento se puso a cero y, a continuación, se trazó la carga medida en función de sqrt (t). Las intersecciones cronocoulométricos de las secciones lineales prolongadas con el eje y (a t=0) indican las cargas causadas por las corrientes capacitivas y las corrientes del tipo Faraday de las sustancias inmovilizadas, causadas, en este caso, por la reacción de los ácidos nucleicos inmovilizados y marcados.
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Ejemplo comparativo
(No según la invención)
Marcaje y detección de hebras de ácidos nucleicos marcadas por medio de un compuesto dieno/quinona
La modificación de las bases pirimidínicas se efectuó por una reacción del tipo Diels-Alder con el componente 1,3-dieno de este compuesto orgánico. La detección electroquímica de dicho marcador tuvo lugar a través del componente quinona reversiblemente redox activo.
El procedimiento discurrió de forma análoga al Ejemplo 2, pero utilizando para el marcaje de los ácidos nucleicos 7,8-bis(metileno)-6,9-dihidronaftoquinona en lugar del compuesto de osmio.
<110> Universidad de Rostock
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<120> Procedimiento para el marcaje y el análisis de ácidos nucleicos
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<130> P 72195
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<160> 7
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<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<400> 1
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tttttaggtg actgtgttat ccgca 
\hfill
25 
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<210> 2
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<400> 2
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cgcggataac acagccacgc 
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20 
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<210> 3
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<400> 3
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tgcggataac acagtcacct 
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20 
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<210> 4
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<211> 23
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<400> 4
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tttttgcagt taccgtacct cga 
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23 
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<210> 5
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<211> 44
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<400> 5
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aggtgactgt gttatccgca cccccctcga ggtacggtaa ctgc 
\hfill
44 
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<210> 6
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<400> 6
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cggaggtacg gtaaccgg 
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18 
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<210> 7
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<400> 7
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tgcggataac acagtcacct 
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20

Claims (12)

1. Procedimiento para la detección de hebras de ácido nucleico por marcaje con marcadores redox y detección electroquímica de los eventos de hibridación, caracterizado porque
a)
se hibridizan hebras de ácido nucleico (hebras diana) con una o más hebras de ácido nucleico (hebras protectoras A) que son más cortas que las hebras diana, con el fin de formar secciones parciales de doble hebra,
b)
se marcan las secciones de monohebra restantes de las hebras diana por reacción con marcadores redox que reaccionan selectivamente con el doble enlace de los anillos de pirimidina de las hebras de ácido nucleico y permiten una reacción redox (reversible) electroanalíticamente utilizable en electrodos de trabajo, siendo el marcador redox [OsO_{4}(bipy)] o [OsO_{4}(py)_{2}],
c)
se hibridizan las hebras de ácido nucleico así marcadas en la superficie de un electrodo con las hebras de sondas allí inmovilizadas, desplazando las hebras protectoras A, y
d)
se detectan las hebras de ácido nucleico hibridizadas en las hebras de sondas de manera electroanalítica.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el desplazamiento de las hebras protectoras por las hebras de sonda en la etapa c) se lleva a cabo a una temperatura que es óptima para la hibridación térmicamente estricta de las hebras de sonda y las hebras diana.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el electrodo es un electrodo calentado.
4. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las secciones de doble hebra constituidas por las hebras protectoras A y las hebras diana presentan uno o varios emparejamientos falsos.
5. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque antes de realizar la etapa c) se eliminan las moléculas del marcador redox excedentes de la solución analítica por diálisis.
6. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque en la etapa c) se han hibridizado las hebras de sonda con una o más hebras de ácido nucleico (hebras protectoras B) y en la etapa c) se hibridizan las hebras diana marcadas en la superficie de un electrodo con las hebras de sonda inmovilizadas allí, desplazando las hebras protectoras A y hebras protectoras B.
7. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque los marcadores redox excedentes permanecen en la solución analítica después de la etapa b), y durante la detección las señales electroquímicas de los marcadores redox unidos a la superficie del electrodo se separan de las señales de los marcadores redox que se encuentran en solución, utilizando procedimientos analíticos electroquímicos adecuados.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque el procedimiento analítico electroquímico es la cronocoulometría.
9. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque el procedimiento analítico electroquímico es la cronopotenciometría.
10. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 9 para el análisis de la expresión de genes.
11. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 10 para la detección de los productos PCR.
12. Kit para llevar a cabo un procedimiento según la reivindicación 10 u 11, que comprende uno o más ácidos nucleicos (hebras protectoras A), marcadores redox y electrodos con sondas inmovilizadas en su superficie, siendo las secuencias de ácido nucleico de las hebras protectoras y hebras de sonda complementarias a las hebras diana que se deben detectar y más cortas que las mismas y las secuencias de ácido nucleico de las hebras protectoras pueden presentar también uno o varios emparejamientos falsos, siendo el marcador redox [OsO_{4}(bipy)] o [OsO_{4}(py)_{2}].
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