ES2328785T3 - Metodo para detectar microorganismos patogenos y agentes antimicrobianos, metodo para evaluar el efecto farmacologico de agentes antimicrobianos, y agentes antimicrobianos. - Google Patents

Metodo para detectar microorganismos patogenos y agentes antimicrobianos, metodo para evaluar el efecto farmacologico de agentes antimicrobianos, y agentes antimicrobianos. Download PDF

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Abstract

Un agente terapéutico para usar en el tratamiento de onicomicosis que comprende un compuesto agente antifúngico que tiene un grupo representado por la fórmula (I): **(Ver fórmula)** en donde R 1 y R 2 son iguales o diferentes y son átomo de hidrógeno, grupo alquilo (C1-C6), un grupo arilo no sustituido, un grupo arilo sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de un átomo de halógeno, grupo trifluorometilo, grupo nitro y grupo alquilo (C 1-C 6), grupo alquenilo (C 2-C 8), grupo alquinilo (C 2-C 6), o grupo arilalquilo (C 7-C 12), m es 2 ó 3, n es 1 ó 2, o una sal del mismo como un ingrediente activo, en donde el agente terapéutico se ha de administrar tópicamente.

Description

Método para detectar microorganismos patógenos y agentes antimicrobianos, método para evaluar el efecto farmacológico de agentes antimicrobianos, y agentes antimicrobianos.
La presente invención se refiere a un agente terapéutico para onicomicosis.
Se necesita un método para evaluar un efecto farmacológico con un modelo animal con el fin de explorar un nuevo agente antimicrobiano (de aquí en adelante mencionado "fármaco"). Además, se necesita un método que permita que un efecto farmacológico se evalúe con exactitud, por la gran importancia de predecir una eficacia terapéutica clínica del mismo.
Históricamente, se ha usado un modelo de dermatofitosis experimental en el que el lomo, planta y zona interdigital de una cobaya se han infectado con Trichophyton mentagrophytes con el fin de evaluar un efecto de un agente antifúngico en dermatofitosis. Tales modelos animales se han usado ya para desarrollar algunos agentes antifúngicos. La evaluación del efecto de tales agentes antifúngicos se realiza aplicando el agente antifúngico al animal infectado, extirpando la piel tras el periodo determinado de tiempo cortándola en varias porciones pequeñas, cultivando las porciones de piel en el medio, y contando el número de porciones en las que no se observa crecimiento de hongo o el número de animales o patas en los que no se observa crecimiento de hongo en todas las porciones de piel, como un indicador (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 36: 2523-2525, 1992, 39: 2353-2355, 1995). De aquí en adelante el método convencional para evaluar el efecto farmacológico se menciona como "el método convencional".
Aunque el fármaco que tiene una potente actividad frente a Trichophyton in vitro, tal como lanoconazol o amorolfina, se ha comercializado en estos días, apenas se observa una mejora en la tasa de curaciones en un uso clínico. Como una razón principal de ello se ha indicado una recaída porque, como el hongo en la piel no muere completamente tras un tratamiento, el hongo crece de nuevo.
También en experimentos animales, cuando se evaluó un efecto de lanoconazol en modelos de tiña del pie de cobaya usando el método convencional, aunque se observó "negativo en hongo" en todos las patas de cada 20 patas 2 días después del último tratamiento, se observó una recaída en 11 de cada 20 patas 30 días después del último tratamiento, y no se observó correlación alguna entre el efecto 2 días tras el último tratamiento y el efecto 30 días tras el último tratamiento (36ª Conferencia Internacional sobre Agentes Antimicrobianos y Quimoterapia, New Orleans, Louisiana, 1996, Abstr. F80).
Una razón de ello es la siguiente. Como el lanoconazol tiene actividad antitrichophyton in vitro muy potente, el lanoconazol persistía en la piel 2 días después del último tratamiento a la concentración en la que se mostraba el efecto de esterilización. Por tanto, cuando la piel se extirpa y cultiva en el medio para detectar el hongo, el lanoconazol que permanece en la piel se difunde en el medio y por tanto no se detectó ningún hongo debido a la prevención del crecimiento independientemente de la presencia de hongo viable en la piel extirpada. Por otra parte, como la concentración del fármaco que permanece en la piel se reduce 30 días después del último tratamiento, el hongo en la piel puede crecer nuevamente y se puede detectar por estudio de cultivo.
De acuerdo con esta hipótesis, se ha establecido que el fármaco permanecía en la piel durante la inhibición del crecimiento del hongo alrededor de los bloques de piel completamente, cuando los bloques de piel tratados con lanoconazol se colocaban y cultivaban en el medio que contiene dermatofitos.
Por tanto, resultó evidente que el método convencional tiene el problema de que el efecto farmacológico no se puede evaluar con exactitud, porque el efecto terapéutico aparente necesita ser evaluado después de separar el fármaco que permanece en la piel.
Mientras tanto una clase de micosis, la dermatofitosis, es la dermatosis superficial que está causada por dermatofitos que parasitan la queratina tal como piel (capa córnea), la uña y el pelo. En particular, la tiña ungueal formada en las uñas se conoce como la enfermedad intratable entre las dermatomicosis basadas en dermatofitosis, y está acompañada por síntomas tales como opacidad, tilosis, destrucción y deformación de lámina ungueal. Ahora se usa la presentación oral (tal como griseofulvina o terbinafina) para el tratamiento de tal tiña ungueal. Sin embargo, hay muchos casos en que el paciente para de tomar el fármaco o toma el fármaco irregularmente, porque tiene que tomar el fármaco durante un periodo largo, por ejemplo al menos medio año con el fin de curar completamente la tiña ungueal. Se cree que ésta es una causa principal de la dificultad de curar completamente la tiña ungueal. Además, tomando el fármaco durante un período largo, la griseofulvina tiene el problema de efectos secundarios sobre órganos internos (desorden gastrointestinal, hepatotoxicidad) y se ha descrito hepatotoxicidad como el efecto secundario de la terbinafina. Por tanto, con el fin de mejorar la conformidad del paciente se desea desarrollar una preparación tópica que cure la tiña ungueal en un periodo corto y tenga menos efectos secundarios sistémicos que la preparación oral.
Sin embargo, en caso de la aplicación simple sobre lámina ungueal con el agente antifúngico actual para uso tópico, no se observó efecto antifúngico sobre el hongo de la uña porque el fármaco no pudo impregnar suficientemente el espesor de queratina de la lámina ungueal (Markus Niewerth and Hans C. Korting, Management of Onychomycoses, Drugs, 58: 283-296, 1999).
Además, el efecto terapéutico de una preparación tópica de agente antifúngico sobre el modelo experimental de tricofitosis no se puede evaluar usando el método convencional, como se ha mencionado anteriormente. Esta puede ser una razón por la que el efecto farmacológico sobre el modelo de tiña ungueal de cobaya apenas se ha descrito.
Es deseable que se evalúe un efecto de agente antimicrobiano tal como, en particular, agente antifúngico, después de separar un fármaco que permanece en el sitio infectado después del tratamiento de un animal o una biomuestra tal como piel con el microorganismo patógeno. Se describe un método para evaluar el efecto del agente antimicrobiano y el agente antimicrobiano obtenido de acuerdo con el método para evaluar el efecto farmacológico. Se describe con detalle un método para detectar el microorganismo patógeno viable en el sitio del animal o biomuestra mencionados anteriormente, infectados con el microorganismo patógeno, tras separar el agente antimicrobiano que ha sido administrado al animal o biomuestra, y un método para evaluar el efecto del agente antimicrobiano que puede evaluar con exacitud el efecto del agente antimicrobiano sin la influencia del agente antimicrobiano que permanece en el sitio del animal o biomuestra infectados con un microorganismo patógeno. Además se describe el agente antimicrobiano obtenido de acuerdo con el método mencionado anteriormente para evaluar el efecto farmacológico, y el método de detección del agente antimicrobiano que comprende detectar el agente antimicrobiano existente en el sitio infectado del animal o biomuestra con el microorganismo patógeno a los que se administra el agente antimicrobiano.
Más concretamente, se puede realizar una detección de un microorganismo patógeno y una evaluación de un efecto de un agente antimicrobiano infectando un animal o una biomuestra con el microorganismo patógeno, administrando el agente antimicrobiano, que comprende un compuesto que tiene un efecto antimicrobiano o una composición del mismo, antes o después de la infección, separando después el agente antimicrobiano, y después de ello detectando el microorganismo patógeno viable en el sitio infectado con el microorganismo patógeno.
Se puede realizar una detección de un agente antimicrobiano existente infectando un animal o una biomuestra con un microorganismo patógeno, administrando el agente antimicrobiano, que comprende un compuesto que tiene un efecto antimicrobiano o una composición del mismo, antes o después de la infección, extirpando después el sitio infectado con el microorganismo patógeno, colocándolo y cultivándolo en un medio que contiene el microorganismo patógeno, y después de ello observar una inhibición del crecimiento del microorganismo patógeno alrededor del sitio infectado con el microorganismo patógeno.
Además, se proporciona un método de evaluación de un fármaco que permite evaluar con exactitud el efecto de un agente antifúngico en un modelo de tiña ungueal de cobaya. Un objetivo de la presente invención es proporcionar un agente terapéutico para usar en el tratamiento de onicomicosis, que muestra el efecto en la tiña ungueal por aplicación tópica y que es capaz de curar la tiña ungueal en un periodo más corto que el de la preparación oral comercializada debido a la buena permeabilidad, buena capacidad de retención y conservación de alta actividad en la lámina ungueal así como a la potente actividad antifúngica del mismo basadas en la presente invención. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar el agente terapéutico eficaz para onicomicosis que no muestra efectos secundarios incluso si suficientemente se administran cantidades terapéuticamente eficaces del mismo.
Más concretamente, la presente invención proporciona un agente terapéutico para usar en el tratamiento de onicomicosis que contiene un compuesto que tiene un grupo representado por la fórmula (I):
1
en donde
R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y son átomo de hidrógeno, grupo alquilo (C_{1}-C_{6}), un grupo arilo no sustituido, un grupo arilo sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de un átomo de halógeno, grupo trifluorometilo, grupo nitro y grupo alquilo (C_{1}-C_{6}), grupo alquenilo (C_{2}-C_{8}), grupo alquinilo (C_{2}-C_{6}), o grupo arilalquilo (C_{7}-C_{12}),
m es 2 ó 3,
n es 1 ó 2,
o una sal del mismo como ingrediente activo. El agente terapéutico se ha de administrar tópicamente.
Además, "presencia" incluye el significado de "restante".
La Figura 1 es una copia en color de una fotografía para identificar el agente que permanece en la piel que se evalúa previamente por el método convencional del método de detección del agente antimicrobiano cinco días después del último tratamiento. La nota (a) muestra el grupo control infectado, la (b) el grupo tratado con KP-103, la (c) el grupo tratado con lanoconazol.
La Figura 2 es una copia en color de una fotografía para identificar el agente que permanece en la piel que se evalúa previamente por el método de detección del agente antimicrobiano cinco días después del último tratamiento. La nota (a) muestra el grupo control infectado, la (b) el grupo tratado con KP-103, la (c) el grupo tratado con lanoconazol.
La Figura 3 es una gráfica que muestra una distribución del número de células fúngicas en la uña de un modelo de tiña ungueal de cobaya en cada grupo tratado de acuerdo con el método de evaluación del efecto farmacológico de la presente invención.
La Figura 4 es una gráfica que muestra una distribución del número de células fúngicas en la piel de un modelo de tiña del pie de cobaya en cada grupo tratado de acuerdo con el método de evaluación del efecto farmacológico.
Como animal utilizado se incluye mamífero tal como ratón, rata, cobaya o conejo. Como biomuestra se incluye una piel de lomo o planta de pata, o una uña, que se toma de dicho animal.
Un método para infectar tal animal o biomuestra con un microorganismo patógeno incluye una inoculación percutánea, oral, intravenosa, transbronquial, transnasal o intraperitoneal. Especialmente en el caso de la piel, se incluye un método para inocularlo en la piel, un método para inocular sobre la dermis expuesta, el método de parche cerrado, o inyección intracutánea. En el caso de uña, se incluye un método para inocular sobre uña, un método en el que se infecta una piel de la pata del animal por el método de infección de la piel mencionado anteriormente, y después de ello la infección se traslada a la uña dejándola durante varios meses.
El término "piel" significa un tejido que incluye las tres capas que son epidermis, dermis y tejido subcutáneo, acompañado por pilus (pelo), uña, glándulas sebáceas, glándulas sudoríparas y glándulas mamarias como aditamentos. La epidermis se separa en cinco capas, que son capa córnea, capa lúcida, epidermis granulosa, capa espinosa, y capa basal, en orden desde la superficie. La capa córnea, la capa lúcida y la capa granulosa epidérmica se mencionan como una capa córnea en sentido amplio. Aquí, sustancia queratinosa significa una parte de la capa córnea mencionada anteriormente.
El término "uña" incluye lámina ungueal, lecho ungueal, matriz ungueal, epidermis lateral cubridora de los bordes de la uña, epidermis posterior cubridora de los bordes de la uña, eponiquio e hiponiquio que constituyen un tejido a su alrededor.
El término "microorganismo patógeno" significa un microorganismo que causa enfermedad humana y animal de un modo u otro. Un ejemplo del microorganismo patógeno (de aquí en adelante mencionado como "microorganismo") es bacterias que incluyen bacilos gram-negativos aerobios y cocos tales como las especies Pseudomonas y Neisseriaceae; bacilos gram-negativos anaerobios facultativos tales como las especies Eschrichia, Salmonella y Enterobacter; cocos gram-positivos tales como las especies Staphylococcus y Streptococcus. Los otros ejemplos de microorganismo son hongos que incluyen hifomicetos tales como las especies Trichophyton, Microsporum y Epidermophyton; blastomicetos tales como Candida y Malassezia; ascomicetos tales como la especie Aspergillus; zigomicetos tales como la especie Mucor; y sus variantes. Ejemplos de tales variantes son cepas resistentes que obtienen naturalmente resistencia farmacológica; cepa de mutación auxotrófica que llega a tener dependencia nutritiva; cepa de mutación artificial que se muta artificialmente por tratamiento con agente mutagénico.
Micosis significa una enfermedad que está causada por invasión y proliferación en el tejido de humano o animal. Normalmente la micosis se divide en sentido amplio en micosis superficial y micosis profunda. Un foco de la enfermedad está situado en la piel o mucosa visible en el caso de la primera, en órganos viscerales, sistema nervioso central, tejido subcutáneo, músculo, hueso o articulación en el caso de la última. Ejemplo principal de micosis superficial es la dermatofitosis, que se produce infectando con dermatofitos tales como las especies Trichophyton, Microsporum y Epidermophyton, que incluye las tres enfermedades tiña, tiña favosa y tiña imbricada. Tiña se puede usar convencionalmente como un sinónimo de dermatofitosis. Además, el dermatofito perteneciente a la especie Trichophyton se menciona normalmente como tricofitosis.
Un agente antimicrobiano significa un compuesto que tiene un efecto antimicrobiano o una composición que contiene el compuesto. La composición incluye una forma de preparación que es una composición artificial y una composición natural tal como un producto natural.
Un método para la administración del agente antimicrobiano en los métodos de evaluación y de detección descritos depende de su clase e incluye aplicación tópica, administración subcutánea, administración oral, y administración intravenosa.
Cuando se realiza el método para detectar el microorganismo patógeno, el método para evaluar el efecto farmacológico y el método para detectar el agente antimicrobiano, se puede realizar en primer lugar una infección con microorganismo o una administración del agente antimicrobiano. Especialmente, en el método para evaluar el efecto farmacológico (de aquí en adelante mencionado como "el presente método de evaluación") se puede evaluar un efecto terapéutico del agente antimicrobiano en el caso en que el agente antimicrobiano se administra tras la infección con microorganismo, mientras que se puede evaluar un efecto del agente antimicrobiano protector frente a la infección y su capacidad de retención en el caso en que la infección con microorganismo se realiza tras la administración del agente antimicrobiano. Con el fin de evaluar la capacidad de retención del agente antimicrobiano, se puede realizar la evaluación variando el periodo hasta la infección con microorganismo desde la administración del agente antimicrobiano.
Es preferible usar diálisis o ultrafiltración para separar el agente antimicrobiano en vista de la utilidad, pero sin limitación a ello siempre que un microorganismo como diana de detección o un microorganismo usado en el presente método de evaluación no estén afectados por ello.
En diálisis es conveniente una membrana de diálisis comercializada fabricada de celulosa. Se puede usar sin problema otra membrana fabricada de otro material, siempre que el microorganismo a ser la diana de detección o el microorganismo a usar en el presente método de evaluación no se pueda hacerle pasar a través de ella pero sí el agente antimicrobiano. Como los tamaños de la mayor parte de los hongos y bacterias son de al menos 0,2 \mum, es preferible usar una membrana que tiene menos de 0,2 \mum de tamaño de poro, en particular es adecuado usar membrana de diálisis con peso molecular fraccionado de 1.000 a 50.000.
Como disoluciones exteriores usadas en diálisis se incluyen disolución salina fisiológica, agua destilada, disolución salina fisiológica tamponada con fosfato, y otros tampones.
Al separar el agente antimicrobiano, aunque el sitio infectado con el microorganismo es la uña, órgano además de la piel, se puede separar eficazmente el agente antimicrobiano. Como normalmente existe el caso en que la diálisis tarda más tiempo para separar el agente antimicrobiano desde la uña que desde la piel, se puede realizar el siguiente tratamiento con enzima digestiva antes de separarlo con el fin de aumentar el efecto separador.
Las condiciones de diálisis dependen de la variedad, concentración de dosis, periodo de la dosis y el periodo sin medicación (el periodo hasta la evaluación desde el último día de tratamiento) de un agente antimicrobiano. Por tanto, es preferible investigar previamente las condiciones de diálisis que permiten que el agente antimicrobiano sea separado de la piel tratada sobre casos individuales usando el siguiente método de detección del agente antimicrobiano existente en el sitio infectado con un microorganismo (de aquí en adelante mencionado como "el presente método para detectar un agente") para ajustar las condiciones apropiadamente.
Usando el método siguiente se puede determinar fácilmente si un agente antimicrobiano se ha separado.
El presente método para detectar un agente se realiza colocando y cultivando el sitio infectado con un microorganismo que se ha sometido al método de separación del agente antimicrobiano (por ejemplo, una porción de piel) o una suspensión obtenida de acuerdo con el siguiente procedimiento de extracción del microorganismo desde el mencionado trozo de piel en un medio de agar que contiene el microorganismo, y observando una inhibición del crecimiento del microorganismo encontrado a su alrededor. Cuando hay agente antimicrobiano restante, se observa la inhibición del crecimiento del microorganismo.
El presente método de evaluación se puede realizar colocando y cultivando, en un medio, la porción de piel en la que se ha determinado una separación de un agente antimicrobiano usando el presente método mencionado anteriormente para detectar el agente tras realizar la separación apropiada del agente antimicrobiano y observando si hay crecimiento de microorganismo o no, o untando y cultivando una suspensión obtenida de acuerdo con el procedimiento de extracción del microorganismo desde la porción de piel en un medio de agar, y observando si hay crecimiento de microorganismo o no o contando colonias emergentes en ese medio.
Se puede realizar un tratamiento con tripsina con el fin de extraer eficazmente un microorganismo de una biomuestra tal como piel o una uña. Otras enzimas digestivas aparte de tripsina tales como pronasa o queratinasa, o un disolvente de queratina tal como urea, se pueden usar también sin limitación a la tripsina siempre que tengan un efecto de extracción. Es necesario ajustar las concentraciones de la enzima digestiva tal como tripsina y disolvente de queratina en una disolución de tratamiento, y el tiempo de reacción para no afectar la extensión de un microorganismo. Se puede realizar el tratamiento con enzima digestiva tal como tripsina antes o después de la diálisis. Cuando el tratamiento con tripsina se realiza antes de la diálisis, es necesario separar suficientemente la enzima digestiva para que el microorganismo no se afecte por la diálisis.
Como un medio a usar para cultivo de un microorganismo, se puede usar cualquier medio siempre que se pueda usar convenientemente para el cultivo y una separación del microorganismo. Son ejemplos del medio, en el caso de hongos, medio Sabouraud, medio Sabouraud modificado, medio agar Czapek, y medio agar de dextrosa de patata. Por otra parte, son ejemplos del medio en el caso de bacterias medio Mueller Hinton, medio Mueller Hinton modificado, medio agar de infusión de corazón, medio agar de infusión de cerebro y corazón, y medio agar normal.
Una temperatura de reacción es 10 a 40ºC, preferentemente 20 a 40ºC. Se puede cultivar un microorganismo con permanencia durante un tiempo suficiente cuando el microorganismo se puede hacer crecer, por ejemplo, 1 a 20 días en caso de hongos, 1 a 5 días en bacterias.
El presente método de evaluación puede ser utilizable como un método de evaluación de un efecto farmacológico ex vivo, que comprende infectar una piel, una uña extirpada de un animal con un microorganismo, después de ello administrar un agente antimicrobiano como un compuesto de prueba, después separar el agente antimicrobiano y detectar y determinar cantidades de microorganismo en la muestra.
El presente método de evaluación se puede aplicar también a una evaluación de un agente antimicrobiano tal como un agente terapéutico para micosis profunda o un agente antibacteriano así como a una evaluación de un efecto de un agente terapéutico para micosis superficial. Es decir, es posible evaluar un efecto de un agente terapéutico para micosis profunda o un agente antibacteriano mediante administración de un agente antimicrobiano a un animal infectado con un microorganismo tal como un hongo o una bacteria por inoculación percutánea, oral, intravenosa, transbronquial, transnasal, intraperitoneal, obteniendo después una biomuestra tal como piel, riñón, pulmón o cerebro, y detectando el microorganismo viable en la biomuestra de la que se ha separado el agente antimicrobiano restante.
Además, el presente método de evaluación permite una comparación cuantitativa de efectos antimicrobianos mediante determinación del número de microorganismos viables en la biomuestra tratada.
Es decir, se realiza una prueba de diferencias significativas sobre el número de microorganismos en el sitio infectado con el microorganismo para el grupo tratado con fármaco y para el grupo infectado de referencia usando un método estadístico tal como la Prueba de Kruskal-Wallis, y con ello se puede hacer una comparación cuantitativa entre los grupos usando una prueba múltiple tal como el método de Tukey.
El método descrito es útil como un método para evaluar un efecto farmacológico o como un método para detectar los antimicóticos en sustancia queratinosa o uña, tras administrar el agente antifúngico al paciente infectado con hongo. Por ejemplo, se puede evaluar un efecto de un agente antifúngico administrándolo al paciente cuya piel o uña está infectada con hongo, obteniendo la sustancia queratinosa o uña, separando después el agente antifúngico mencionado anteriormente, y después de ello detectando el hongo viable en la sustancia queratinosa o uña. Además, se puede realizar una detección de un agente antifúngico administrándolo al paciente cuya piel o uña está infectada con hongo, obteniendo después la sustancia queratinosa o uña, cultivándolo en medio agar que contiene hongo, y detectando después el agente antifúngico existente en la sustancia queratinosa durante una inhibición de crecimiento de hongo observado alrededor de la sustancia queratinosa o uña. Se puede realizar tal evaluación de un agente antifúngico administrado a un paciente con hongo y la detección del agente antifúngico de la sustancia queratinosa o uña de la misma manera que en el método de evaluación de un efecto farmacológico y método de detección, mencionados anteriormente, del agente antimicrobiano administrado a un animal o una biomuestra.
Además, el presente método de evaluación proporciona diversos agentes antimicrobianos útiles. Como agente antimicrobiano obtenido por el presente método de evaluación hay un agente antimicrobiano que comprende un compuesto que tiene un efecto erradicador para microorganismos in vivo o una composición que contiene el compuesto para terapia de micosis superficial, micosis profunda o infección bacteriana; un agente antimicrobiano que tiene el verdadero efecto seleccionado mediante demostración de un efecto estadísticamente significativo; además, un agente antimicrobiano que tiene un excelente efecto erradicador para microorganismos in vivo, que se selecciona mediante la aparición de pura actividad antimicrobiana del mismo; o un agente antimicrobiano del tipo de curación completa sin recaída. Un ejemplo concreto es un agente terapéutico para usar en el tratamiento de onicomicosis de acuerdo con la presente invención, que comprende un compuesto que tiene un grupo representado por la fórmula (I) mencionada anteriormente, en donde el agente terapéutico se ha de administrar tópicamente. Entre ellos, un ejemplo preferible más concreto es un agente terapéutico para usar en el tratamiento de anicomicosis que comprende el compuesto representado por la fórmula (II):
2
en donde
Ar es un grupo fenilo no sustituido o un grupo fenilo sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de un átomo de halógeno y grupo trifluorometilo,
R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y son átomo de hidrógeno, grupo alquilo (C_{1}-C_{6}), un grupo arilo no sustituido, un grupo arilo sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de un átomo de halógeno, grupo trifluorometilo, grupo nitro y grupo alquilo (C_{1}-C_{6}), grupo alquenilo (C_{2}-C_{8}), grupo alquinilo (C_{2}-C_{6}), o grupo aralquilo (C_{7}-C_{12}),
m es 2 ó 3,
n es 1 ó 2,
X es átomo de nitrógeno o CH, y
*1 y *2 significan un átomo de carbono asimétrico, en donde el agente terapéutico se ha de administrar tópicamente.
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En las fórmulas (I) y (II) mencionadas anteriormente, el grupo fenilo sustituido es un grupo fenilo que tiene 1 a 3 sustituyentes seleccionados de un átomo de halógeno y trifluorometilo, e incluye, por ejemplo, 2,4-difluorofenilo, 2,4-diclorofenilo, 4-fluorofenilo, 4-clorofenilo, 2-clorofenilo, 4-trifluorometilfenilo, 2-cloro-4-fluorofenilo y 4-bromofenilo. El grupo alquilo (C_{1}-C_{6}) incluye, por ejemplo, una cadena lineal, cadena ramificada o grupo cicloalquilo que tiene 1 a 6 átomos de carbono, tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, terc-pentilo y ciclohexilo. El grupo arilo no sustituido incluye, por ejemplo, fenilo, naftilo y bifenilo. El grupo arilo sustituido incluye, por ejemplo, 2,4-difluorofenilo, 2,4-diclorofenilo, 4-fluorofenilo, 4-clorofenilo, 2-clorofenilo, 4-trifluorometilfenilo, 2-cloro-4-fluorofenilo, 4-bromofenilo, 4-terc-butilfenilo, 4-nitrofenilo o similares. El grupo alquenilo (C_{2}-C_{8}) incluye, por ejemplo, vinilo, 1-propenilo, y estirilo. El grupo alquinilo (C_{2}-C_{6}) incluye, por ejemplo, etinilo. El grupo aralquilo (C_{7}-C_{12}) incluye, por ejemplo, bencilo, naftilmetilo y 4-nitrobencilo.
Además, el compuesto más preferido entre los agentes antimicrobianos mencionados anteriormente incluye el compuesto que muestra la eficacia terapéutica como el siguiente KP-103.
El KP-103 mencionado anteriormente significa un antifúngico indicado por (2R,3R)-2-(2,4-difluorofenil)-3-(4-metilenpiperidin-1-il)-1-(1H-1,2,4-triazol-1-il)butan-2-ol. El compuesto se puede preparar dejando reaccionar (2R,3S)-2-(2,4-difluorofenil)-3-metil-2-[(1H-1,2,4-triazol-1-il)metil]oxirano con 4-metilenpiperidina sobre la base del Ejemplo 1 del documento WO94/26734.
La eficacia del KP-103 usado como un agente antifúngico en el presente agente terapéutico para usar en el tratamiento de onicomicosis no se ha confirmado, pero su actividad antifúngica se ha conocido ya (documento
WO94/26734).
El agente antimicrobiano obtenido de dicha manera se puede usar como una composición farmacológica, composición farmacológica para esterilizar un microorganismo. En otras palabras, resulta ser una composición farmacológica que cura una enfermedad tal como la micosis completamente, e impide una recaída.
Onicomicosis significa una clase de la micosis superficial mencionada anteriormente, en otras palabas, una enfermedad que está causada por invasión y proliferación en la uña de humano o un animal. Trichophyton rubrum y Trichophyton entagrophytes causan principalmente onicomicosis en humanos. En casos raros la ocasionan Microsporum, Epidermophyton, Candida, Aspergillus o Fusarium.
Como una enfermedad que es susceptible de tratamiento con un agente terapéutico para usar en el tratamiento de onicomicosis de la presente invención, se incluye tiña ungueal causada por la especie Trichophyton, onicocandidasis causada por la especie Candida u onicomicosis (en sentido estricto) causada por otro hongo.
Un agente terapéutico para usar en el tratamiento de onicomicosis se da como una preparación tópica. Son ejemplos una preparación líquida, crema, ungüento o preparación de manicura como una forma de dosificación. En este caso, se puede preparar usando vehículo oleoso, vehículo de emulsión o similares. La cantidad preferida de ingrediente activo es 0,1 a 10% en peso. Se puede ajustar apropiadamente una cantidad de dosis dependiendo de la anchura de área afectada y condición de la enfermedad.
En la presente invención, aunque la cantidad de dosificación de un agente terapéutico para onicomicosis depende de la edad, peso y condiciones individuales de un paciente, es aproximadamente 10 mg a aproximadamente 10 g por día, preferentemente alrededor de 50 mg a aproximadamente 5 g como cantidad de ingrediente activo. El agente se puede dar en la dosis diaria mencionada anteriormente en una vez o varias porciones divididas.
La presente invención se explica además con detalle sobre la base de los Ejemplos siguientes, pero no está limitada a ellos.
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Ejemplos
Pretratamiento del Ejemplo Comparativo 1 y Ejemplos 1 a 3 (Ejemplos de Referencia).
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[1] Preparación de disolución fúngica y producción de un modelo de cobaya de tipo interdigital de tiña del pie
Se colocó filtro Millipore (fabricado por Millipore Corporation, HA, diámetro 47 mm, 0,45 \mum) en medio agar de infusión de cerebro-corazón (disponible en Nissui Pharmaceutical Co., LTD.), y sobre ello se aplicaron 10^{6} células de microconidio de cepa de Trichophyton mentagrophytes KD-04. El cultivo se realizó a 30ºC bajo 17% de CO_{2} durante 7 días. Después del cultivo, se vertió a gotas sobre el filtro la justa cantidad de disolución salina fisiológica que contenía 0,05% de Tween 80 y se recogieron artroconidios usando un lazo de platino. Después de separar una masa hifal por una filtración con una gasa estéril, se calculó el número de artroconidios en el filtrado por un hemocitómetro para ajustar en concentración de 1 x 10^{8} artroconidios/ml para obtener un inóculo fúngico.
Se preparó un modelo de cobaya de tipo interdigital de tiña del pie de acuerdo con el método de Arika et al. (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 36: 2523-2525, 1992). Concretamente, la piel interdigital de dos patas posteriores de cobayas macho de la especie Hartley, de 7 semanas de edad, se frotó ligeramente con papel abrasivo. Un disco de papel (disco AA disponible en Whatmen International Ltd cortado en 8 x 4 mm) humedecido con la disolución mencionada anteriormente del organismo inoculado se aplicó sobre la región entre las pezuñas interdigitales de las patas posteriores y se fijó usando una Almohadilla de Espuma Autoadherente (Restone 1560M; disponible en 3M) y venda estirable adhesiva (ELASTPORE; disponible en Nichiban Co., Ltd). El disco de papel y la venda se separaron siete días después de la infección.
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[2] Preparación de disolución de fármaco y tratamiento tópico para el modelo de cobaya de tipo interdigital de tiña del pie
Se usó como una sustancia de prueba una disolución de lanoconazol al 1% comercializada (nombre comercial: disolución Astat (razón social)) y una disolución en la que se disolvió KP-103 en una concentración de 1% en mezcla de poli(etilenglicol) #400:etanol (75:25 v/v). Cada disolución, en una cantidad de 0,1 ml, se aplicó a la piel de la planta de pata una vez al día a partir de 10 días después de la infección y durante 10 días.
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Ejemplo comparativo 1
Método convencional para evaluar el efecto farmacológico
El método convencional se describió como sigue. Para el grupo control infectado sin una aplicación del fármaco, el grupo tratado con KP-103 y el grupo tratado con lanoconazol, se usaron respectivamente 10 cobayas (de aquí en adelante mencionadas como "animales"). Se sacrificaron animales de cada grupo dos días después y 30 días después del último tratamiento. Se extirparon sus dos patas posteriores y se frotaron con la torunda de algodón que contenía alcohol suficiente. La piel de la planta de pata entera se extirpó y cortó en 15 porciones de piel, incluyendo en total 12 porciones de piel de partes de la planta de pata y 3 piezas de piel de una parte interdigital. Todas las porciones de piel se colocaron en 20 ml de medio agar de dextrosa Sabouraud (disponible en Difco laboratories) que contenía 50 \mug de cloranfenicol (disponible en Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 100 \mug de gentamicina (disponible en Schering-Plough Corporation), 50 \mug de 5-fluorocitosina (disponible en Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) y 1 mg de cicloheximida (disponible en Nacalai Tesque, Inc.) por ml. Una sustancia antibiótica añadida al medio se puso en condiciones que no permite crecer a las bacterias y que permite a los hongos crecer sin problema. Después de 10 días de cultivo a 30ºC, el resultado se describe como "hongo-negativo" cuando no se observó crecimiento de hongo en todas las porciones de piel, y se determinó el número de patas de hongo-negativo. En la evaluación del efecto 30 días después del último tratamiento, dos días después del último tratamiento las patas tratadas se frotaron con una torunda de algodón que contenía alcohol y se fijaron con la venda con el fin de impedir una reinfección. La venda se cambió una vez por semana. Los efectos terapéuticos de KP-103 y lanoconazol dos días después y 30 días después del último tratamiento se muestran en la Tabla 1.
TABLA 1
3
Como se muestra en la Tabla 1, en el grupo tratado con KP-103 se observó hongo-negativo en todas las patas dos días después del último tratamiento, y también se observó hongo-negativo en 16 de 20 patas 30 días después del último tratamiento. Por otra parte, en el grupo tratado con lanoconazol se observó hongo-negativo en todas las patas dos días después del último tratamiento, pero se observó hongo-negativo en solamente 9 patas 30 días después del último tratamiento, y no hay correlación entre los efectos terapéuticos dos días después y 30 días después del último tratamiento. El número de patas de hongo-negativo disminuyó 30 días después del último tratamiento. Se pensó que el efecto terapéutico de lanoconazol observado dos días después del último tratamiento resultó de la inhibición del crecimiento de hongo causado por una difusión del fármaco restante en la piel tratada en sistema de cultivo, porque el lanoconazol tenía una potente actividad antifúngica in vitro frente a dermatofitos, fue ocho veces más activo que KP-103 frente a Trichophyton con una concentración inhibidora de crecimiento de 15,6 ng/ml. Se realizó la prueba de determinación del agente restante.
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Ejemplo 1
(Ejemplo de Referencia)
Determinación de fármaco restante en la piel que ya se ha evaluado cinco días después del último tratamiento de acuerdo con el método convencional
Se preparó un modelo de acuerdo con el Ejemplo Comparativo 1. Se usó lanoconazol que es un compuesto de prueba para un experimento terapéutico como una disolución al 1% con el mismo vehículo que KP-103. Para el grupo control infectado sin una aplicación de un fármaco, el grupo tratado con KP-103 y el grupo tratado con lanoconazol, se utilizaron respectivamente 20 animales. Se extirparon las dos patas posteriores de cada animal cinco días después del último tratamiento de la misma manera que en el Ejemplo Comparativo 1. Se usó un total de 20 patas adecuadas para una evaluación por el método convencional, y en el presente método de evaluación se usó un total de 20 patas adecuadas.
Las porciones de piel de pata adecuada se colocaron en 20 ml de medio agar de dextrosa Sabouraud que contenía cepa de Trichophyton mentagrophytes KD-04 (2 x 10^{4} células/ml) y la sustancia antibiótica descrita en el Ejemplo Comparativo 1. Tras el cultivo realizado a 30ºC durante 3 días se observó una zona inhibidora de crecimiento de hongo aparecida alrededor de la piel y se fotografió para 10 de 20 patas. La Figura 1 es una fecha electrónica de la fotografía de la piel tras el cultivo en la condición mencionada anteriormente. (a) indica el grupo control infectado sin la aplicación de fármaco, (b) el grupo tratado con KP-103 y (c) el grupo tratado con lanoconazol. Se explicó una placa como representativa de diez placas correspondientes a cada animal del grupo control infectado (a). En la Figura 1, S indica una de 15 porciones de piel de planta de pata derivada del animal y M el medio mencionado anteriormente. S y M descritos tanto en el grupo tratado con KP-103 (b) como el grupo tratado con lanoconazol (c) son también iguales. En el medio, la zona blanca muestra el crecimiento de hongo, por otra parte la zona negra muestra la inhibición del crecimiento de hongo.
Como muestra la Figura 1, se observó un buen crecimiento de hongo alrededor de la porción de piel del grupo control infectado sin fármaco alguno. En el grupo tratado con KP-103 se observó el crecimiento de hongo en todas las porciones de piel, aunque el crecimiento de hongo fue inhibido ligeramente alrededor de las porciones de piel en comparación con el grupo control infectado. Por otra parte, el crecimiento de hongo fue inhibido completamente alrededor de las porciones de piel tratadas con lanoconazol. Como resultado, el efecto terapéutico de lanoconazol en el método convencional mostrado en la Tabla 1 se consideró como un claro efecto terapéutico tal que el agente que permanecía en la piel llegó a mezclarse en el sistema de cultivo para inhibir el crecimiento de hongo.
Por tanto, parecía que el efecto farmacológico no se pudo evaluar por el método convencional de modo preciso.
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Ejemplo 2
(Ejemplo de Referencia)
Determinación de fármaco restante tras separar fármaco de la piel
Como en el Ejemplo 1, se extirparon 20 patas adecuadas de cada animal cinco días después del último tratamiento, y se frotaron suficientemente con la torunda de algodón que contenía alcohol. Se cortó la planta de cada pata. La piel picada con tijeras se puso en membrana de diálisis (peso molecular fraccionario: 12.000-14.000, fabricada de celulosa, disponible en VISKASE SALES Corporation) junto con 4 ml de agua destilada. La diálisis se realizó con 3 L de agua destilada a 4ºC durante 2 días. El agua de diálisis se cambió dos veces al día, 4 veces en total. El contenido se transfirió a un homogeneizador de vidrio. A ello se añadieron 4 ml de disolución salina, tamponada con fosfato a doble concentración, que contenía 4% de tripsina derivada de páncreas de cerdo (disponible en BIOZYME Laboratories Limited) y la mezcla resultante se homogeneizó. Se dejó a 37ºC durante una hora y se filtró con una gasa de dos capas. El filtrado resultante se centrifugó. A un precipitado obtenido separando el sobrenadante se añadieron 8 ml de disolución salina, tamponada con fosfato, que contenía 2% de tripsina y además se dejó reaccionar con agitación a 37ºC durante una hora. Después de una centrifugación, el precipitado obtenido separando el sobrenadante se lavó tres veces centrifugando con disolución salina tamponada con fosfato para separar la tripsina. Al precipitado se añadieron 2 ml de la misma disolución salina para preparar una suspensión del mismo.
Cuando se realizó la diálisis y el tratamiento con tripsina utilizando el mismo hongo usado en este Ejemplo, no se pudo observar un efecto de estos procedimientos sobre una tasa de supervivencia de hongo. Previamente se preparó un pocillo en el centro de medio agar de dextrosa Sabouraud (20 ml) que contenía cepa de Trichophyton mentagrophytes KD-04 (2 x 104 células/ml) y la sustancia antibiótica descrita en el Ejemplo Comparativo 1. Se añadieron al pocillo 100 \mul de la suspensión mencionada anteriormente para cultivar a 30ºC durante tres días. Tras el cultivo, se observó un círculo inhibidor de crecimiento de hongo y se fotografió para 10 de 20 patas. La Figura 2 es una fecha electrónica de la fotografía de la piel después del cultivo en la condición mencionada anteriormente. (a) indica el grupo control infectado sin la aplicación de fármaco, (b) el grupo tratado con KP-103 y (c) el grupo tratado con lanoconazol. Se explicó una placa como representativa de diez placas correspondientes a cada animal del grupo control infectado (a). En la Figura 2, E indica la suspensión de piel preparada de planta de pata del animal y M el medio mencionado anteriormente. E y M descritos tanto en el grupo tratado con KP-103 (b) como en el grupo tratado con lanoconazol (c) son también iguales. En el medio global, la zona blanca muestra el crecimiento de hongo, por otra parte la zona negra alrededor del pocillo muestra la inhibición del crecimiento de hongo.
En la Figura 1 que muestra el método convencional, no se observó crecimiento de hongo alrededor de la piel del grupo tratado con lanoconazol considerado cinco días después del último tratamiento y se determinó el fármaco permaneciente en la piel. En cambio, en la Figura 2, aunque se observó poco círculo inhibidor de crecimiento en 2 de 10 suspensiones de patas obtenidas separando el fármaco usando tratamiento de diálisis del presente método para la piel del grupo tratado con lanoconazol considerado cinco días después del último tratamiento, nunca se observó el círculo inhibidor de crecimiento en 8 patas residuales.
Como resultó evidente que el fármaco permaneciente en la piel tratada se pudo separar suficientemente usando diálisis de acuerdo con el presente método, se confirmó que la evaluación del efecto farmacológico no estuvo influida por el fármaco permaneciente.
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Ejemplo 3
(Ejemplo de Referencia)
Detección de hongo viable en la piel y evaluación del efecto farmacológico
A dos medios agar de dextrosa Sabouraud (20 ml) que contenían la sustancia antibiótica descrita en el Ejemplo Comparativo 1 se aplicaron 100 \mul de la suspensión de una pata adecuada de cada animal obtenida en el Ejemplo 2. Después de realizar el cultivo a 30ºC durante 10 días, el resultado se describe como "hongo-negativo" cuando no se observó colonia alguna de hongo en dos placas de agar (límite de detección: 10 CFU (unidades formadoras de colonias/pata). Se contó el número de patas de hongo-negativo. Por otra parte, se evaluaron 20 patas de la misma manera que en el Ejemplo Comparativo 1. La Tabla 2 muestra el resultado de comparar el efecto terapéutico evaluado por el método convencional con el evaluado por el presente método de evaluación.
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TABLA 2
4
En el caso del grupo tratado con KP-103, no se observó diferencia significativa en el número de patas de hongo-negativo, incluso si el número se evaluó por el método convencional o por el presente método de evaluación, como se muestra en la Tabla 2. La proporción de patas de hongo-negativo evaluada por el presente método de evaluación es 85% en el caso de KP-103. Por otra parte, en el grupo tratado con lanoconazol, aunque en todas las patas se observó "hongo-negativo" por el método convencional, "hongo-negativo" se observó solamente en tres patas por el presente método de evaluación.
Como se ha mencionado anteriormente, resultó evidente que usando el presente método de evaluación se puede evaluar sustancialmente un efecto farmacológico exacto sin influencia alguna del fármaco permaneciente tras el tratamiento con ello.
Además, un resultado del presente método de evaluación se correlaciona con un resultado obtenido por evaluación en el método convencional, descrito en el Ejemplo Comparativo 1, 30 días después del último tratamiento. Con ello, usando el presente método de evaluación, se puede valorar un efecto de un agente antimicrobiano para impedir una recaída por la evaluación en tiempo precoz tras un tratamiento. Por tanto, usando el presente método de evaluación se puede obtener un tipo de curación completa del agente antimicrobiano sin la recaída.
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Pretratamiento de Ejemplos 4 y 5 [1] Preparación de disolución fúngica y producción de modelo de cobaya de tiña ungueal (ejemplo de acuerdo con la presente invención) y tiña del pie (Ejemplo de Referencia)
Se preparó una disolución fúngica de la misma manera que en el pretratamiento del Ejemplo Comparativo 1, excepto cambiando de cepa de Trichophyton mentagrophytes KD-04 a cepa de Trichophyton mentagrophytes SM-110.
Se preparó un modelo de cobaya de tiña ungueal y tiña del pie de la misma manera que en la preparación mencionada anteriormente de modelo de cobaya en tiña del pie interdigital, excepto cambiando de cobayas macho de la especie Hartley de 7 semanas de edad a cobayas macho de la especie Hartley de 5 semanas de edad, y excepto que el disco de papel y la venda se separaron 21 días después de la infección cambiando desde siete días después de la infección. La invasión de dermatofitos en piel de planta de pata y lámina ungueal se observó 60 días después de la infección.
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[2] Preparación de disolución de fármaco y tratamiento de tiña ungueal y tiña de pata de cobaya
Como compuestos de prueba se prepararon disoluciones disolviendo polvos no purificados de KP-103 (ejemplo de acuerdo con la presente invención), amorolfina (Ejemplo de Referencia) y terbinafina (ejemplo de referencia) a una concentración de 1% en disolución mezcla de poli(etilenglicol) #400:etanol (75:25 v/v), respectivamente. Se preparó cápsula de terbinafina triturando el comprimido comercializado, suspendiendo a concentración de 100 mg/ml en Miglyol 812 (disponible en Mitsuba trade Co., Ltd) con uniformidad de homogeneizador de vidrio, e inyectando la suspensión resultante en cada cápsula a la concentración de 40 mg/kg dependiendo del peso corporal medido por día de administración. Se aplicó una disolución de KP-103, amorolfina o terbinafina en la cantidad de 0,1 ml a piel de planta de pata y uña de una pata una vez al día durante 30 días consecutivos. En caso de cápsula de terbinafina, se administró oralmente una cápsula (40 mg/kg).
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Ejemplo 4 Evaluación del efecto farmacológico sobre tiña ungueal
El efecto sobre tiña ungueal se evaluó por el método siguiente.
Se sacrificaron animales dos días después del último tratamiento. Se extirpó una pata posterior y se frotó suficientemente con la torunda de algodón que contenía alcohol. Se extirparon uñas (tres en total) de una pata posterior y se picaron con tijeras. Se transfirieron a un homogeneizador de vidrio y se homogeneizaron añadiendo 4 ml de disolución salina tamponada con fosfato a doble concentración (Sales Tamponadas con Fosfato, disponibles en Takara Shuzo Co., Ltd.) que contenía 4% de tripsina derivada de páncreas de cobaya (disponible en BIOZYME Laboratories Limited). La reacción se realizó con agitación a 37ºC durante una hora. Tras una centrifugación, el precipitado obtenido se lavó tres veces centrifugando con disolución salina tamponada con fosfato con el fin de separar la tripsina. El precipitado se suspendió con 4 ml de agua destilada y se puso en membrana de diálisis (peso molecular fraccionario: 12.000-14.000, fabricada de celulosa, disponible en VISKASE SALES Corporation). Se realizó diálisis en 3 L de agua destilada a 4ºC durante 14 días. El agua de diálisis se sustituyó dos veces al día, 28 veces en total. Tras una centrifugación se añadió 1 ml de disolución salina tamponada con fosfato al precipitado obtenido separando el sobrenadante para preparar una suspensión. Esta suspensión se definió como disolución madre y se diluyó por un factor de diez. Al medio agar de dextrosa Sabouraud (20 ml) que contenía la sustancia antibiótica descrita en el Ejemplo Comparativo 1 se añadieron 100 \mul de la disolución madre o la dilución. Después de realizar el cultivo durante 10 días, el resultado se describió como "hongo-negativo" cuando no se observó colonia alguna de hongo en todos los medios (límite de detección: 10 CFU/patas). Se contó el número de patas de hongo-negativo en la uña. Cuando aparecían colonias en el medio, se contó el número de colonias (CFU) para calcular el número de colonias en la uña de una pata por el grado de diolución. Se realizó la prueba de Kruskal-Wallis para el número de hongos en la uña, la comparación múltiple se realizó basada en el método de Tukey para analizar la diferencia significativa entre grupos. Esos resultados se muestran en la Figura 3 y de ellos se hizo la Tabla 3. En la Figura 3, se representó gráficamente el número de CFU en uñas de cada grupo tratado y el número medio de CFU se mostró por línea horizontal y valor numérico.
Usando la suspensión mencionada anteriormente se determinó una separación suficiente del fármaco restante por el presente método de evaluación de la misma manera que en el Ejemplo 2.
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Ejemplo 5
(Ejemplo de Referencia)
Evaluación del efecto farmacológico en tiña del pie
Se extirparon piezas de piel de patas posteriores de cada animal descrito en el Ejemplo 4. Se realizó una separación del fármaco y una determinación del fármaco permaneciente de la misma manera que en el Ejemplo 2, excepto que la diálisis para separar el fármaco se realizó durante 3 días y que el agua de diálisis se cambió seis veces en total. Se confirmó la suficiente separación del fármaco permaneciente.
Después se evaluó el efecto farmacológico de la misma manera que en el Ejemplo 4 (límite de detección: 20 CFU/patas). Esos resultados se muestran en la Figura 4 y de ellos se hizo la Tabla 4. En la Figura 4 se representó gráficamente el número de CFU en la piel de cada grupo tratado y el número medio de CFU se mostró por línea horizontal y valor numérico.
TABLA 3
5
Como se muestra en la Figura 3 y Tabla 3, no se observó pata alguna con uña de hongo-negativo en todos los grupos tratados con sustancia probada durante 30 días. Pero KP-103 redujo significativamente el número de células fúngicas en la uña en comparación con el vehículo para uso tópico. Su efecto terapéutico fue significativamente superior a la preparación oral de terbinafina. Por otra parte, no se vio efecto fungicida significativo en amorolfina y terbinafina (para uso externo, uso oral) en comparación con el vehículo. No se vio el efecto terapéutico del mismo. Como se ha mencionado anteriormente, se sugirió que KP-103 mostraba el efecto terapéutico en tiña ungueal por aplicación tópica y que KP-103 pudo curar tiña ungueal más precozmente que la preparación oral de terbinafina.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4
6
Como se muestra en la Figura 4 y Tabla 4, se vio excelente efecto terapéutico sobre tiña del pie en todos los fármacos, KP-103, terbinafina y amorolfina en uno u otro caso cuando se evaluó por la proporción de hongo-negativo o por el número de células fúngicas en la piel. Por otra parte, resultó evidente que KP-103 mostró el efecto fungicida excelente sobre tiña ungueal, aunque la terbinafina y amorolfina no mostraron el efecto terapéutico sobre tiña ungueal como se muestra en la Figura 3 y Tabla 3.
Como se ha mencionado anteriormente, fármacos desarrollados recientemente que tienen una actividad extremadamente potente frente a Trichophyton in vitro tal como lanoconazol ocasionan la valoración de hongo-negativo de acuerdo con el método convencional independientemente de la existencia del hongo no tratado en la piel, puesto que el fármaco permaneciente en la piel tratada inhibe un crecimiento del hongo en la piel.
Por el contrario, de acuerdo con el presente método, se puede evaluar con exactitud un efecto de un agente antimicrobiano puesto que un fármaco permaneciente se puede separar dializando el sitio infectado con un microorganismo de animal o biomuestra, tal como la piel tratada, usando una membrana de diálisis. Además, aunque es difícil comparar cuantitativamente un efecto antimicrobiano tal como un efecto antifúngico en el método convencional, el presente método de evaluación permite que los efectos antimicrobianos se comparen cuantitativamente, puesto que el número de hongos viables en el sitio infectado de un animal o una biomuestra tal como piel se puede determinar con precisión. Además, el efecto terapéutico basado en el presente método de evaluación refleja un resultado en cuanto a recaída en el método convencional, y por tanto se puede valorar un efecto para impedir recaída evaluando con más anterioridad después del tratamiento de acuerdo con el presente método de evaluación. Por tanto, en el presente método de evaluación se puede evaluar un efecto real de un agente antimicrobiano y es posible seleccionar un agente antimicrobiano que tiene un efecto esterilizador excelente frente a hongos in vivo o un agente antimicrobiano de tipo de curación completa que no ocasiona recaída. Como se ha mencionado anteriormente, el presente método de evaluación es muy útil como un método para evaluar el agente antimicrobiano.
Además, es la primera vez que en onicomicosis es posible evaluar, por el presente método de evaluación, un efecto terapéutico frente a onicomicosis en un modelo de tiña ungueal.
Como resultado de la evaluación del efecto terapéutico frente a onicomicosis de acuerdo con el presente método de evaluación, resulta evidente que KP-103 muestra el efecto terapéutico excelente frente a onicomicosis con una aplicación simple por la que el efecto no es visible usando el agente antifúngico tópico convencional. Por tanto, KP-103 es un agente beneficioso para tratar onicomicosis industrialmente.

Claims (4)

1. Un agente terapéutico para usar en el tratamiento de onicomicosis que comprende un compuesto agente antifúngico que tiene un grupo representado por la fórmula (I):
7
en donde
R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y son átomo de hidrógeno, grupo alquilo (C_{1}-C_{6}), un grupo arilo no sustituido, un grupo arilo sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de un átomo de halógeno, grupo trifluorometilo, grupo nitro y grupo alquilo (C_{1}-C_{6}), grupo alquenilo (C_{2}-C_{8}), grupo alquinilo (C_{2}-C_{6}), o grupo arilalquilo (C_{7}-C_{12}),
m es 2 ó 3,
n es 1 ó 2,
o una sal del mismo como un ingrediente activo,
en donde el agente terapéutico se ha de administrar tópicamente.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Uso de un compuesto agente antifúngico como se define en la reivindicación 1 o una sal del mismo para la preparación de un agente terapéutico para el tratamiento de onicomicosis, en donde el agente terapéutico se ha de administrar tópicamente.
3. El agente terapéutico de la reivindicación 1 o uso de la reivindicación 2, en el que el compuesto es el compuesto representado por la fórmula (II):
8
en donde
Ar es un grupo fenilo no sustituido o un grupo fenilo sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de un átomo de halógeno y grupo trifluorometilo,
R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y son átomo de hidrógeno, grupo alquilo (C_{1}-C_{6}), un grupo arilo no sustituido, un grupo arilo sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de un átomo de halógeno, grupo trifluorometilo, grupo nitro y grupo alquilo (C_{1}-C_{6}), grupo alquenilo (C_{2}-C_{8}), grupo alquinilo (C_{2}-C_{6}), o grupo aralquilo (C_{7}-C_{12}),
m es 2 ó 3,
n es 1 ó 2,
X es átomo de nitrógeno o CH, y
*1 y *2 significan un átomo de carbono asimétrico.
\vskip1.000000\baselineskip
4. El agente terapéutico o uso de la reivindicación 3, en el que el compuesto representado por la fórmula (II) es (2R,3R)-2-(2,4-difluorofenil)-3-(4-metilenpiperidin-1-il)-1-(1H-1,2,4-triazol-1-il)butan-2-ol.
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