ES2329131T3 - Compuestos oligomericos para modular la expresion de survivina. - Google Patents

Abstract

Un compuesto capaz de modular la expresión de survivina constituido por un total de 12-25 nucleótidos y/o análogos nucleotídicos, en el que dicho compuesto comprende una subsecuencia de al menos 8 nucleótidos o análogos nucleotídicos, estando dicha secuencia localizada dentro de la secuencia CTCAATCCATGGCAGC (SEC ID N.º: 130), en el que dicho compuesto comprende al menos un análogo nucleotídico.

Description

Compuestos oligoméricos para modular la expresión de survivina.

Campo de la invención

La presente invención proporciona composiciones y procedimientos para modular la expresión de survivina. En particular, esta invención se refiere a compuestos oligoméricos y los preferidos entre esos compuestos son oligonucleótidos, que pueden hibridarse específicamente con ácidos nucleicos que codifican survivina. Los compuestos oligonucleotídicos han demostrado que modulan la expresión de survivina y se describen sus preparaciones farmacéuticas y su uso como tratamiento de enfermedades cancerosas.

Antecedentes de la invención

El cáncer, una de las principales causas de muerte en todo el mundo, comprende un grupo de enfermedades, que son causadas por trastornos genéticos provocados por la inestabilidad genómica. Se ha formulado la hipótesis de que todas las células cancerosas albergan defectos en varias rutas reguladoras, que gobiernan la proliferación y la homeostasis celulares normales. Estos defectos provocan la adquisición de diversas capacidades que son el sello de identidad específico de diversas células cancerosas (Hanahan y Weinberg, 2000, Cell 100,57-70). Uno de estos sellos de identidad del cáncer es la evasión de la apoptosis o muerte celular programada, un programa de suicidio celular conservado evolutivamente (Hengartner, 2000, Nature 407, 770-776.). La apoptosis es esencial en el desarrollo fetal porque elimina las células que ya no son necesarias y mantiene la homeostasis de los tejidos adultos al equilibrar la producción de células y la eliminación de células. Además, las células que muestran características aberrantes como mutaciones o lesiones genómicas inducidas por agentes infecciosos o fármacos son eliminadas de este modo. Las células malignas carecen de esta supervisión celular debido a la inhibición de la apoptosis, lo que provoca una viabilidad celular prolongada que aumenta el riesgo de transformación celular, acelera la progresión de la enfermedad y provoca resistencia al tratamiento (Evan y Vousden, 2001, Nature 411, 342-348. Por lo tanto, la manipulación de la apoptosis ha surgido como estrategia terapéutica novedosa para el tratamiento del cáncer (Nicholson DW, 2000, Nature 407, 810-816).

Se conocen dos rutas de señalización que provocan la inducción de la apoptosis, la ruta intrínseca o mitocondrial, inducida por el estrés ambiental y las sustancias quimioterapéuticas, y la ruta extrínseca o de receptores de eliminación, inducida por las células efectoras del sistema inmunitario (Ashkenazi y Dixit, 1998 Science 281, 1305-1308; Green y Reed, 1998, Science 281, 1309-1312). Ambas rutas culminan con la activación de las caspasas, una familia de cisteína proteasas intracelulares, que en minutos desmantelan las estructuras celulares provocando una rápida eliminación de las células (Cohen, 1997, Biochem J 326, 1-16). Se conocen tanto proteínas que promueven como que inhiben la apoptosis. La familia de proteínas Bcl-2 comprende tanto proteínas proapoptóticas como antiapoptóticas. Entre los inhibidores de la apoptosis, la familia de proteínas inhibidoras de la apoptosis (IAP) muy conservada evolutivamente comprende ocho proteínas en los seres humanos. Una de ellas, la survivina, acaba de identificarse recientemente (Ambrosini et al., 1997, Nat. Med. 3, 917-921). La survivina inhibe la apoptosis aguas abajo de Bcl-2 al inhibir directa o indirectamente las proteasas intracelulares caspasa -3 y caspasa -7 efectoras responsables de la apoptosis (Shin et al., 2001, Biochemistry 40, 1117-1123). Los indicios recientes sugieren que la survivina controla directamente la activación de la caspasa 9 que actúa aguas arriba. Un mutante negativo dominante de survivina Thr^{39}-Ala no provoca la apoptosis en fibroblastos embrionarios murinos deficientes en los componentes de los apoptosomas Apaf-1 o caspasa 9 (Blanc-Brude et al., 2003, Clin. Cancer Res. 9, 2683-2692). La proteína X interactiva de la hepatitis B (HBXIP) funciona como cofactor para la survivina fosforilada, lo que permite que se una y suprima la activación de protaspasa 9 (Marusawa et al., 2003, EMBO J. 22, 2729-2740). También se describen otros modos de acción (Beltrami et al., 2004, J. Biol. Chem. 279, 2077-2084).

La survivina ha atraído una gran cantidad de invención como diana terapéutica novedosa porque se expresa de forma selectiva en las células cancerosas y es necesaria para su viabilidad. La survivina normalmente se expresa durante la embriogénesis. Excepto en el timo, en las células madre derivadas de la médula ósea CD34+, en la placenta y en el epitelio colónico basal, la survivina no puede detectarse en los tejidos adultos normales, pero está hiperexpresada prácticamente en todas las células transformadas por su estatus mitótico independiente. La expresión generalmente está regulada de forma dependiente del ciclo celular siendo máxima en la mitosis (U et al. 1998, Nature 396, 580-584). La regulación por aumento en la fase G2/M comparada con la interfase puede ser 40 veces superior. También, la mayor estabilidad de las proteínas debida a la fosforilación de Thr 34 por CDC2-ciclina-B1 puede ser la responsable de los elevados niveles de survivina en la mitosis. En la interfase, el nivel de la proteína disminuye debido a la proteolisis dependiente de ubiquitina (Zhao et al., 2000, J Cell Sci. 113, 4363-71) a niveles basales. Se ha sugerido que la hiperexpresión de la survivina en las células cancerosas contrarresta la inducción por defecto de la apoptosis, evita el control de G2/M y así impone la progresión de las células a la mitosis (Li et al., 1998, Nature 396, 580-584).

En los sistemas de cultivo celular, la inhibición de la muerte celular por la hiperexpresión de la survivina está bien establecida (Ambrosini et al. 1997, Nat. Med. 3, 917-921; Tamm et al. 1998, Cancer Res. 58, 5315-5320; Mahotka et al., 1999, Cancer Res. 59, 6097-6102). In vivo, se ha demostrado el papel de la survivina como inhibidor de la apoptosis en ratones transgénicos que expresaban la survivina en la piel, que inhibió la apoptosis inducida por UVB de los queratinocitos (Grossman et al., 2001, J. Clin. Invest. 108, 991-999). Además de su papel en la apoptosis celular, la survivina desempeña un papel fundamental en diversos aspectos de la mitosis. Por ejemplo, la inactivación de la survivina en ratones con genes de survivina inactivados homocigóticos provoca un 100% de capacidad letal (Uren et al. 2000, Curr. Biol. 10, 1319-1328; Conway et al., 2002, Gastroenterology 123, 619-631). Se ha encontrado que la survivina está asociada a diversos componentes del aparato mitótico, como por ejemplo los centrosomas, los microtúbulos y los restos del aparato del huso - los cuerpos medios. La asociación de los microtúbulos es esencial para la acción antiapoptótica de la survivina.

El doble papel de la survivina como inhibidor de la apoptosis y como factor esencial en la división celular se demostró por la regulación por disminución dirigida de la survivina al transfectar células Hela con ADNc de EPR-1, que es complementario a la survivina. La regulación por disminución de la survivina mediante Err-1 no codificante provocó una mayor apoptosis e inhibición de la proliferación celular (Ambrosini et al., 1998, J. Biol. Chem. 273, 11177-11182). Otros sellos de identidad de la castración de la survivina son la detención de la mitosis, poliploidía, replicación defectuosa de los centrosomas, nucleación de los microtúbulos y ensamblaje/estabilidad del huso mitótico e inhibición de la división celular. La mayoría de estos efectos se ven exacerbados en un entorno de mutación p53^{-/-} (Beltrami et al., 2004, J. Biol. Chem. 279, 2077-2084; Carvalho et al, 2003, J. Cell. Sci. 116, 2987-2998; Lens et al., 2003, EMBO J. 22, 2934-2947). El papel clave de la survivina en la mitosis se ve subrayado por su asociación con el aparato mitótico, que incluye los microtúbulos de la metafase y el huso de la anafase, y los cinetócoros de los cromosomas de la metafase (Beltrami et al., 2004, J. Biol. Chem. 279, 2077-2084). La survivina se localiza con otras proteínas pasajeras cromosómicas como por ejemplo INCENP y Aurora B (Carvalho et al, 2003, J. Cell. Sd. 116, 2987-2998; Lens et al., 2003, EMBO J. 22, 2934-2947). La actividad como cinasa de Aurora B depende de la interacción con survivina (Chen et al., 2003, J. Biol. Chem. 278, 486-490). Se ha sugerido que la actividad de cinasa de Aurora B es esencial para la citocinesis que proporciona un enlace mecanístico entre la survivina y la división celular (Chen et al., 2003, J. Biol. Chem. 278, 486-490). Dos artículos demuestran que la survivina es necesaria para la detención mantenida en el control A como respuesta a la falta de tensión de los cinetócoros de las cromátidas hermanas. La survivina parece ser esencial para el mantenimiento de la proteína de control BubR1 en los cinetócoros y detención de la mitosis en condiciones prolongadas de falta de tensión en los cinetócoros. El taxol, un agente que estabiliza los microtúbulos, permite que se unan los microtúbulos a los cinetócoros, pero previene la generación de tensión. Normalmente las células tratadas con taxol se detienen en la mitosis debido a la activación de un control mediada por BubR1 asociada a los cinetócoros. Las células sin survivina que se tratan con taxol sin embargo consiguen completar la mitosis después de un retraso durante el que se pierde BubR1 del cinetócoro. El nocodazol también previene la formación de tensión en los cinetócoros pero porque previene la unión de los microtúbulos. Sin embargo, la carencia de survivina no tiene ningún efecto sobre la activación de los controles y la detención de la mitosis inducida por Nocodazol. La survivina aparentemente no está implicada en el control de la ocupación de los cinetócoros por los microtúbulos sino que en vez de eso es necesaria para controlar la tensión del huso ejercida en el cinetócoro. (Carvalho et al, 2003, J. Cell. Sd. 116, 2987-2998; Lens et al., 2003, EMBO J. 22, 2934-2947). Además, se ha sugerido que la survivina sirve de proteína de control mitótico crucial dependiente de p53 necesaria para la integridad y citoprotección genómicas (Beltrami et al., 2004, J. Biol. Chem. 279, 2077-2084). La survivina por lo tanto puede ser un enlace importante entre la muerte celular y la regulación de la división celular. Debido a su doble papel como inhibidor de la apoptosis y promotor de la mitosis, survivina es un factor importante en el inicio y la progresión del cáncer así como en la resistencia contra los agentes quimioterapéuticos.

Su papel clínico en el cáncer ha sido enfatizado por la detección de niveles elevados de survivina en casi todos los tipos de tumores. La elevada expresión de survivina en los tumores está asociada a un mal pronóstico, mayor recidiva del cáncer y resistencia a la terapia (Kawasaki et al., 1998, Cancer Res. 58, 5071-5074; Adida et al., 1998, Lancet 351, 882-883). Es interesante observar que los tumores de pulmón y mama expresan los niveles más elevados de survivina. Estos tumores generalmente están asociados a un pronóstico desfavorable debido a la metástasis temprana y al desarrollo de resistencia a un número de agentes quimioterapéuticos sin relación en su mecánica de actuación. Se ha demostrado que la regulación por disminución de la survivina sensibiliza a las células tumorales a los agentes que dañan el ADN como por ejemplo a etopósida (Li et al., 1999, Nature Cell Biology 1, 461 -466; Olie et al., 2000, Cancer Res. 60, 2805-2809; Jiang et al., J. Cell. Biochem. 83, 342-354), a cisplatina (Pennati et al., 2004, Oncogene 23, 386-394), a doxorrubicina (Zhou et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 303, 124-131) y a la radioterapia (Pennati et al., 2003, J. Invest. Dermatol. 120,648-654; Asanuma et al., 2002, Jpn. J. Cancer Res. 93, 1057-1062). Las células que carecen de survivina son particularmente sensibles al texol, lo que también es cierto para el taxol (Zaffaroni et al., 2002, Cell. Mol. Life Sci. 59, 1406-1412; Ling et al., 2004, J. Biol. Chem. publicación en internet previa a la impresión). Se ha demostrado que la resistencia al taxol y a la radioterapia tienen una relación directa con el nivel de expresión de survivina (Zaffaroni et al., 2002, Cell. Mol. Life Sci. 59, 1406-1412; Rodel et al., 2003, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 55, 1341-1347) y se ha demostrado que concentraciones de taxol inferiores a las letales regulan por aumento la expresión de survivina en las células de cáncer de mama MCF-7 (Ling et al., 2004, J. Biol. Chem. publicación en internet previa a la impresión). Parece que la survivina es necesaria para la función del control del huso como respuesta al tratamiento con taxol (Carvalho et al, 2003, J. Cell. Sci. 116, 2987-2998; Lens et al., 2003, EMBO J. 22, 2934-2947). Por lo tanto, en ausencia de survivina las células se ven privadas de sus mecanismos de resistencia naturales que les permite reparar los efectos adversos del taxol en la mitosis.

Es interesante observar que la survivina también desempeña un papel fundamental en la angiogénesis. La survivina se encontró regulada por aumento en el endotelio estimulado angiógenamente in vitro y in vivo (O'Connor et al., 2000, Am. J. Pathol. 156,393-398; Tran et al., 1999, Biochem. Biophys. Res. Commun. 264, 781 -788). La dirección no codificante de survivina provocó apoptosis endotelial y rápida involución de los vasos de tipo capilar in vitro (Mesri et al., 2001a, Am. J. Pathol. 158, 1757-1765). La inyección en xenoinjertos de cáncer de mama humanos de un adenovirus que expresaba una versión dominante negativa de survivina inhibió el desarrollo de los tumores establecidos. Esto se asoció con la apoptosis tanto de células tumorales como de células endoteliales y a una reducción tumor de los vasos sanguíneos derivados del tumor (Blanc-Brude et al., 2003, Clin. Cancer Res. 9; 2683-2692). La quimioterapia y la radioterapia se dirigen contra células tumorales y contra las células endoteliales en proliferación de la vasculatura tumoral. Se ha demostrado que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) reducía significativamente la potencia proapoptótica de la quimioterapia en las células endoteliales vasculares. Esta citoprotección contra la toxicidad de los fármacos se ha ligado a la regulación por aumento mediada por VEGF de la expresión de survivina. La supresión de la actividad de la survivina anula el efecto citoprotector de VEGF contra fármacos que interfieren con la dinámica de los microtúbulos (Taxol) y dañan el ADN así como la protección contra el factor de necrosis tumoral \alpha (Tran et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 4349-4354; Mesri et al., 2001 a, Am. J. Pathol. 158,1757-1765).Además, la expresión de una proteína de survivina dominante negativa (T34A) en células endoteliales (HUVECC y DMVEC) provocó la inducción masiva de apoptosis (Blanc-Brude et al., 2003, Clin. Cancer Res. 9, 2683-2692).

El objetivo de la survivina se está mencionando cada vez más como que tiene una doble actividad anticancerosa al inducir la apoptosis de las células tumorales y la supresión de la angiogénesis asociada a tumores (Altieri DC, 2003, Oncogene 22, 8581-8591).

Se han iniciado diversas estrategias terapéuticas usando survivina como diana. Las más prometedoras comprenden estrategias de vacunación, el uso de survivina mutante como antagonistas dominantes negativos, y la aplicación de oligonucleótidos no codificantes específicos de survivina. La aplicación de un adenovirus sin replicación que expresa una proteína mutante de survivina dominante negativa (Thr34 - Ala) provocó la inhibición del crecimiento tumoral en tres modelos de xenoinjerto de cáncer de mama en ratones. Este adenovirus ha demostrado eficacia in vivo en un modelo de xenoinjerto de cáncer de mama y la expresión inducida de survivina (T34A) en células de melanoma inhibió el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto de melanoma (Blanc-Brude et al., 2003, Clin. Cancer Res. 9, 2683-2692; Grossman et al., 2001 Proc. Natl. Sci. USA 98; 635-640). En los cultivos celulares la apoptosis se aumentó al unir survivina mutante a CDC2-ciclina-B1 y prevenir así la fosforilación de survivina de tipo silvestre (Mesri et al., 2001b, J. Clin. Invest 108, 981-990). Actualmente se están analizando algunos antagonistas de CDC2 como purvalanol A y flavopiridol, que previenen la fosforilación de survivina, en ensayos clínicos combinados con taxol (Schwartz et al., 2002, J. Clin. Oncol. 20, 2157-2170).

Diversas estrategias usando oligonucleótidos no codificantes han demostrado que los oligonucleótidos no codificantes contra survivina regulan por disminución la survivina en cultivos celulares, inducen la apoptosis y sensibilizan las células cancerosas de pulmón y las células HeLa al agente quimioterapéutico etopósida (Li et al., 1999, Nature Cell Biology 1,461-466; Olie et al., 2000, Cancer Res. 60, 2805-2809; Jiang et al., 2001, J. Cell. Biochem. 83, 342-354). La inhibición de varias líneas celulares con oligo ISIS 28599 no codificante, un wingmero 2'-O- MOE, produjo células no codificante e inducción de apoptosis (Chen et al., 2000, Neoplasia 2, 235-241). En un modelo de regeneración de hígado murino, el ARNm se redujo un 90% mediante el oligonucleótido no codificante ISIS 114926 (Proceedings of the American Association for Cancer Research, vol. 42, 2001, resumen n.º 2468). La inyección no codificante de oligonucleótido no codificante ISIS 23722 reducido presentó un efecto limitado sobre la velocidad de crecimiento de los tumores xenoinjertados de linfoma no de Hodgkin agresivo en ratones (Ansell et al., 2004, Leukemia - publicación en internet previa a la impresión). Actualmente no hay agentes terapéuticos, que inhiban de forma eficaz la síntesis de la survivina. Por lo tanto, existe una necesidad desde hace mucho de agentes que inhiban el crecimiento de las células tumorales al reducir la expresión de survivina. En el documento WO9822589 se describen procedimientos de modular la apoptosis con agentes, que modulan la cantidad o actividad de survivina y procedimientos para reducir la gravedad de un estado patológico mediado por survivina con esos agentes. Uno de esos agentes es una construcción que codifica la hebra codificante de EPR-1, que es complementaria a survivina pero no se describen oligos no codificantes específicos. El documento WO0164741 describe un sistema promotor "tet-off" que regula un tránscrito de ARNm no codificante de survivina. Sin embargo, esta solicitud de patente no describe ningún oligonucleótido no codificante.

La mayoría de los oligonucleótidos que actualmente están en ensayo clínico se basan en la química del fosforotioato desde 1988, que fue la primera química no codificante útil en desarrollarse. Sin embargo, como ha quedado claro en los últimos años, esta química tiene serias defectos que limitan su uso clínico. Estos incluyen baja afinidad por su ARNm diana, lo que afecta de forma negativa a la potencia y plantea restricciones sobre cómo los oligonucleótidos pequeños activos pueden así complicar la fabricación y aumentar los costes del tratamiento. También, su baja afinidad se traduce en una deficiente accesibilidad al ARNm diana, complicando así la identificación de los compuestos activos. Finalmente, los oligonucleótidos de fosforotioato padecen un abanico de efectos secundarios que restringen su intervalo terapéutico.

Para solucionar estos y otros problemas, se ha invertido mucho esfuerzo en crear análogos novedosos con propiedades mejoradas. Tal como se representa en el esquema 1 siguiente, estos incluyen análogos completamente artificiales como por ejemplo PNA y Morfolino y análogos de ADN más convencionales como por ejemplo fosfatos de boro, N3'-P5'fosforoamidatos y varios análogos modificados en 2', como por ejemplo 2'-F, 2'-O-Me, 2'-O-metoxietilo (MOE) y 2'-O- (3-aminopropilo) (AP). Más recientemente se ha introducido ácido hexitol nucleico (HNA), ácido 2'-F-arabino nucleico (2'-F-ANA) y D-ciclohexenil nucleósido (CeNA).

Muchos de estos análogos muestran una unión mejorada a los ácidos nucleicos complementarios, mejoras en la bioestabilidad o mantienen la capacidad a reclutar una enzima celular, ARNasaH, que está implicada en el modo de acción de muchos compuestos no codificantes. Ninguno de ellos, sin embargo, combina todas estas ventajas y, en muchos casos, las mejoras en una de las propiedades ponen en jaque una o más de las otras propiedades. También, en muchos casos, se han observado nuevas complicaciones que limitan gravemente el valor comercial de algunos de los análogos. Estos incluyen baja solubilidad, reacciones de oligomerización complejas, muy baja captación celular, incompatibilidad con otras reacciones químicas, etc.

En los documentos WO0018781 y WO0157059 se describen oligonucleótidos no codificantes para la modulación de la expresión de survivina para el tratamiento de enfermedades. Estos oligonucleótidos todos tienen entre 18-20 pb de longitud y están diseñados con la química del fosforotioato o MOE.

El documento WO014655 describe un único oligonucleótido no codificante dirigido contra Survivina y es un fosforotioato totalmente modificado con algunos nucleósidos MOE. La química de MOE tiene varias limitaciones. Tiene una afinidad modesta, que sólo se manifiesta cuando se insertan varios MOE en bloque en el oligo. La MOE pertenece a la familia de modificaciones en 2' y es notorio, para este grupo de compuestos, que la actividad no codificante tiene una relación directa con la afinidad de unión del ARN in vitro. Se ha reseñado que un gapmero de MOE de 20 pb (5MOE/PO-10PS-5MOE/PO) dirigido contra c-raf tiene una CI_{50} de aproximadamente 20 nm en células T24 y se ha reseñado que un gapmero de MOE dirigido contra PKC-a tiene una CI_{50} de 25 nM en células A549. Por comparación, los compuestos de fosforotioato que se usan en los experimentos no codificantes habitualmente muestran una CI_{50} en el intervalo de

\hbox{150 nM. (Stein,
Kreig, Applied Antisense Oligonucleotide Technology, 
Wiley-Liss, 1988, p
87-90).}

El documento WO03027244, presentado posteriormente a la presente invención, describe un 20-mero de oligonucleótidos no codificantes de fosforotioato dirigido contra survivina que muestran regulación por disminución a concentraciones muy elevadas (por ejemplo, el compuesto 903 mostró una reducción de proteína de 51% a 200 nM).

El documento US 2002/137708 describe oligonucleótidos no codificantes dirigidos contra Survivina. Entre los oligonucleótidos que se describen están oligodesoxinucleótidos de fosforotioato y oligonucleótidos de fosforotioato quiméricos que tienen ala de 2'MOE y un hueco desoxi, así como conjugados que comprenden los oligonucleótidos y su aplicación terapéutica contra el cáncer.

Un objetivo principal de la presente invención es proporcionar compuestos oligoméricos novedosos, contra el ARNm de survivina. Se ha encontrado que los compuestos de la invención muestran una menor CI_{50} (por lo tanto una mayor actividad), facilitando así un tratamiento eficaz de una variedad de enfermedades cancerosas en las que la expresión de survivina está implicada con agente causante o relacionado. Tal como se explica a continuación, este objetivo se logra de la mejor manera a través de la utilización de un compuesto químico de afinidad muy elevada denominado LNA (por sus siglas en inglés Locked Nucleic Acid (Ácido nucleico bloqueado)).

La presente invención se refiere a compuestos oligoméricos, particularmente a oligonucleótidos no codificantes de LNA, que están dirigidos contra un ácido nucleico que codifica survivina y que modulan la expresión de la survivina. Esta modulación fue particularmente la regulación por disminución muy potente del ARNm de survivina así como la provocación de la respuesta apoptótica. Los compuestos oligoméricos que contienen ULNA pueden ser desde 8-meros y ciertamente muy activos como 16-meros, que es considerablemente más corto que los compuestos no codificantes reseñados dirigidos contra survivina. Estos compuestos oligoméricos 16-meros, tienen una CI_{50} en el intervalo inferior al nanomolar. La invención permite un acortamiento considerable de la longitud habitual de los oligómeros no codificantes habituales (de 20-25 meros a, por ejemplo, 8-16 meros) sin poner en peligro la afinidad necesaria para la actividad farmacológica. Dado que la especificidad intrínseca de un oligo es inversamente proporcional a su longitud, un acortamiento así aumentaría significativamente la especificidad del compuesto no codificante hacia su ARN diana. Además, se prevé que los compuestos oligoméricos más cortos tienen una mayor bioestabilidad y permeabilidad celular que los compuestos oligoméricos más largos. Al menos por estas razones, la presente invención es una contribución considerable a la técnica.

Sumario de la invención

La survivina es esencial para la proliferación celular y está implicada en múltiples fases de la mitosis. Está implicada en varios controles que relacionan la mitosis con la división celular y la apoptosis. La survivina es miembro de la familia génica de inhibidores de la apoptosis (IAP) que suprime la muerte celular programada (apoptosis) (véase la figura 6). En la mayoría de los neoplasmas humanos, que incluyen cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, carcinoma de pulmón, cáncer de mama, glioma maligno y cánceres hematológicos se observa una mayor expresión de survivina. La expresión de survivina es directamente proporcional a grado avanzado y a la capacidad invasiva de varios cánceres. La survivina no puede detectarse o está presente a niveles muy bajos en los tejidos diferenciados normales, lo que hace de la survivina una diana preferida en varios cánceres humanos. Un aspecto central de la invención es proporcionar un compuesto constituido por 12-25 nucleósidos, en el que dicho compuesto comprende una subsecuencia de al menos 8 nucleósidos, estando dicha subsecuencia situada en la secuencia SEC ID N.º: 130 en la que dicho compuesto comprende al menos un análogo nucleotídico.

Una realización de la invención es, dado que la secuencia del genoma humano está disponible y la anotación de sus genes está progresando rápidamente, identificar las secuencias únicas lo más cortas posibles en el ARNm diana. Los compuestos oligoméricos que contienen LNA de la invención también se han comparado a un número de 18-meros que contienen LNA y/o fosforotioatos que son isosecuenciales con el oligómero no codificante ISIS 23722. También se ha realizado una comparación del ISIS 23722 (que es un 18-mero con 4 MOE, 10 fosforotioatos seguidos de 4 MOE).

También se proporcionan composiciones farmacéuticas y otras que comprenden los compuestos oligoméricos de la invención. Además se proporcionan procedimientos para modular la expresión de survivina en células o tejidos que comprenden poner en contacto dichas células o tejidos con uno o más de los compuestos oligoméricos o composiciones de la invención. También se describen procedimientos de tratar a un animal o ser humano, que se sospecha que tiene o que tiene predisposición a una enfermedad o afección, asociada a la expresión de survivina mediante la administración una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más de los compuestos oligoméricos o composiciones de la invención. Además, se proporcionan procedimientos de usar compuestos oligoméricos para la inhibición de la expresión de survivina y para el tratamiento de enfermedades asociadas a la actividad de survivina. Los ejemplos de dichas enfermedades son diferentes tipos de cáncer, como por ejemplo cáncer de pulmón, mama, colon, próstata, páncreas, pulmón, hígado, tiroides, riñón, cerebro, testículos, estómago, intestino, intestino grueso, médula ósea, senos, vejiga, tracto urinario u ovarios.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Ilustración de los diferentes diseños de la invención: Gapmeros, Headmeros y Tailmeros y Mixmeros de diferente composición. Para el mixmero, los números indican el tramo contiguo alternativo de ADN, \beta-D-oxi-LNA o \alpha-L-LNA. En el dibujo, la línea es ADN, la sombra gris corresponde a restos de \alpha-L-LNA y el rectángulo es \beta-D-oxi-LNA.

Figura 2. Regulación por disminución del ARNm de survivina compuesto oligomérico no codificante de LNA. Transferencia Northern del ARN total de 15PC3 que ha sido tratado con 0,2, 1, 5, 25 nM de compuesto 2A, 6A, 9A, 15A respectivamente. Todos los compuestos fueron inhibidores eficaces a concentraciones bajas.

Figura 3A. Regulación por disminución del ARNm de survivina compuesto oligomérico no codificante de LNA. Transferencia Northern del ARN total de SW480 (figura superior) y A549 (figura inferior) que ha sido tratado con 0,2, 1, 5, 25 nM de compuesto 2A, y 15A respectivamente. Las células se transfectaron con oligonucleótido y se cultivaron durante 24 h.

Figura 4. Esquema general de la síntesis de tio-LNA.

Figura 5. SEC ID N.º: 1 número de acceso de GenBank NM_001168 secuencia del ARNm de survivina huma-
na.

Figura 6. Forma esquemática de survivina en la ruta apoptótica.

Figura 7. Regulación por disminución del ARNm de survivina mediante oligonucleótidos no codificantes de LNA. Las células se transfectaron con oligonucleótido y se cultivaron durante 24 h. Se extrajo el ARN total y se detectó la expresión de ARNm de survivina mediante PCR en tiempo real con 15PC3 y MCF-7. Se presenta la expresión de survivina normalizada con respecto al nivel estable del tránscrito de GAPDH.

Figura 8. Inducción de la apoptosis mediante oligonucleótidos no codificantes que contienen LNA. Células 15PC3 transfectadas con los oligos y concentraciones que se indican en los 96 pocillos. Veinticuatro horas después de la transfección, se añadieron los reactivos Caspase 3/7-Glo tal como se describe y se registró la inducción de luminescencia (actividad de la luciferasa) en un aparato Luminoskan Ascent de Thermo Labsystems. La actividad de la luciferasa se mide en términos de unidades lumínicas relativas por segundo (RLU/s).

La Figura 9 muestra que los compuestos que contienen LNA (145A y 145C) mejoran la inducción de la apoptosis comparados con el compuesto con MOE isosecuencial ISIS27322 (aquí 145F) y el compuesto de fosforotioato isosecuencial (145D). En el estudio también se incluyeron controles desemparejados de un compuesto de LNA (146C) y el compuesto con MOE (146F) así como el compuesto de LNA 158. La regulación por disminución del ARNm de survivina diana usando compuesto oligomérico no codificante de LNA provoca una mayor apoptosis en células 15PC3. La activación de apoptosis se mide mediante microchip en lecho para citometría. La inducción en veces se presenta relativa a las células con tratamiento simulado.

Figura 10. Usando la detección inmunohistioquímica, se detectó la Caspasa 3 activa en células 15PC3 tratadas con oligonucleótidos no codificantes de LNA 15A dirigidos contra Survivina.

Figura 11. Inhibición de Survivina con oligos no codificantes de LNA en células cancerosas en proliferación. Por ejemplo, el compuesto 6A es particularmente potente.

Figura 12. Regulación por disminución de Survivina en células 15PC3 transfectadas con el compuesto 15A analizadas por transferencia Western a 100 nM.

Descripción de la invención

La presente invención emplea compuestos oligoméricos, particularmente oligonucleótidos no codificantes, para usar en la modulación de la función de las moléculas de ácido nucleico que codifican survivina. La modulación finalmente es un cambio en la cantidad de survivina producida. En una realización, esto se logra proporcionando compuestos no codificantes, que se hibridan específicamente con ácidos nucleicos que codifican survivina. La modulación es preferiblemente una inhibición de la expresión de survivina, que provoca un descenso en el número de proteínas funcionales producidas.

Los compuestos oligoméricos no codificantes y otros de la invención, que modulan la expresión de la diana, se identifican a través de experimentación o a través del diseño racional basándose en información de la secuencia sobre la diana y los conocimientos sobre cómo diseñar mejor un compuesto oligomérico contra una diana deseada. Las secuencias de estos compuestos son realizaciones preferidas de la invención. Del mismo modo, los motivos de las secuencias de la diana a la que estos compuestos oligoméricos son complementarios (denominados "puntos calientes") son sitios diana preferidos.

La invención se refiere a un compuesto constituido por 12-25 nucleótidos y/o análogos nucleotídicos, en el que dicho compuesto comprende una subsecuencia de al menos 8 nucleótidos o análogos nucleotídicos, estando dicha subsecuencia localizada en la secuencia SEC ID N.º: 130 en la que dicho compuesto comprende al menos un análogo nucleotídico. Los análogos nucleotídicos son habitualmente análogos de los nucleótidos de la secuencia SEC ID N.º: 130. Así, la subsecuencia del compuesto de la invención habitualmente está localizada dentro de la secuencia SEC ID N.º: 130 o comprende análogos de los nucleótidos de la secuencia de la SEC ID N.º: 130. Un análogo nucleotídico preferido de la invención es LNA.

El total de 12-25 nucleótidos y/o análogos nucleotídicos se pretende que signifique 12-25 nucleótidos o 12-25 análogos nucleotídicos o una combinación de los mismos que no supere un total combinado de 25 unidades de nucleósidos.

En el presente contexto, el término "nucleósido" se usa con su significado normal, es decir contiene una unidad de 2-desoxirribosa o una unidad de ribosa que está unida a través de su átomo de carbono número uno a una de las bases nitrogenadas adenina (A), citosina (C), timina (T), uracilo (U) o guanina (G).

De forma similar, el término "nucleótido" quiere decir una unidad de 2-desoxirribosa o unidad de ARN que está unida a través de si átomo de carbono número uno a una de las bases nitrogenadas adenina (A), citosina (C), timina (T) o guanina (G), uracilo (U) y que está unida a través de su átomo de carbono número cinco a un grupo fosfato internucleósido, o a un grupo terminal.

Cuando se usa en el presente documento, el término "análogo nucleotídico" se refiere a un nucleótido no natural en el que o bien la unidad de ribosa es diferente de 2-desoxirribosa o ARN y/o la base nitrogenada es diferente de A, C, T y G y/o el grupo de enlace fosfato internucleósido es diferente. Los ejemplos específicos de análogos nucleosídicos se describen por ejemplo en Freier y Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 y Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213.

Los términos "análogo nucleosídico correspondiente" y "nucleósido correspondiente" se pretende que indiquen que la nucleobase del análogo nucleosídico y el nucleósido es idéntica. Por ejemplo, cuando la unidad de 2-desoxirribosa del nucleótido está unida a una adenina, el "análogo nucleosídico correspondiente" contiene una unidad de pentosa (diferente de 2-desoxirribosa) unida a una adenina.

El término "ácido nucleico" se define como una molécula formada mediante el enlace covalente de dos o más nucleótidos. Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan de forma intercambiable en el presente documento.

El término "análogo de ácido nucleico" se refiere a un compuesto no natural que se une a un ácido nucleico.

Los análogos nucleotídicos y análogos de ácido nucleico se describen por ejemplo en Freier y Altmann (Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443) y Uhlmann (Curr. Opinion in Drug & Development (2000, 3(2): 293-213). El Esquema 1 ilustra ejemplos seleccionados de análogos nucleotídicos adecuados para preparar ácidos nucleicos.

El término "LNA" se refiere a un nucleótido que contiene un análogo nucleosídico bicíclico, también denominado monómero de LNA, o un oligonucleótido que contiene uno o más análogos nucleosídicos bicíclicos. Los monómeros de LNA se describen en el documento WO 9914226 y solicitudes de patente posteriores, los documentos WO0056746, WO0056748, WO0066604, WO00125248, WO0228875, WO2002094250 y WO03/006475. Un ejemplo particular de un monómero de timidina de LNA es (1S,3R,4R,7S)-7-hidroxi-1-hidroximetil-5-metil-3-(timin-1-il)-2,5-dioxa-biciclo[2.2.1]heptano.

El término "oligonucleótido" se refiere, en el contexto de la presente invención, a un oligómero (también denominado oligo) o polímero de ácido nucleico (por ejemplo ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN)) o análogo de ácido nucleico de los conocidos en la técnica, preferiblemente un ácido nucleico bloqueado (LNA), o una mezcla de los mismos. Este término incluye oligonucleótidos compuestos por nucleobases, azúcares y enlaces internucleosídicos (esqueleto) naturales así como oligonucleótidos que tienen porciones no naturales que funcionan de forma similar o con funciones específicas mejoradas. A menudo se prefieren los oligonucleótidos total o parcialmente modificados o sustituidos a las formas nativas debido a varias propiedades deseables de dichos oligonucleótidos como por ejemplo, la capacidad a penetración de la membrana celular, buena resistencia a las nucleasas extracelulares e intracelulares, afinidad y especificidad elevadas por el ácido nucleico diana. El análogo de LNA es particularmente preferido muestra las propiedades preferidas que se mencionan
anteriormente.

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Esquema 1

1

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Con el término "unidad" es entiende un monómero.

El término "al menos uno" comprende los números enteros mayores o iguales a 1, como por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y etc.

El término "tio-LNA" comprende un nucleótido bloqueado en que al menos uno de X o Y en el Esquema 2 se selecciona a partir de S o -CH_{2}-S-. Tio-LNA puede estar tanto en configuración beta-D como alfa-L.

El término "amino-LNA" comprende un nucleótido bloqueado en que al menos uno de X o Y en el Esquema 2 es -N(H)-, N(R)-, CH_{2}-N(H)-, -CH_{2}-N(R)- donde R se selecciona a partir de hidrógeno y alquilo C_{1-4}. El amino-LNA puede estar tanto en configuración beta-D como alfa-L.

El término "oxi-LNA" comprende un nucleótido bloqueado en el que al menos uno de X o Y en el Esquema 2 representa -O- o -CH_{2}-O-. Oxi-LNA puede estar tanto en configuración beta-D como alfa-L.

El término "ena-LNA" comprende un nucleótido bloqueado en el que Y en el Esquema 2 es -CH_{2}-O-.

El término "alfa-L-LNA" comprende un nucleótido bloqueado que se representa como se muestra en el Esquema 3 (estructura de la derecha).

El término "derivados de LNA" comprende todos los nucleótidos bloqueados del Esquema 2 excepto beta-D-metileno LNA por ejemplo tio-LNA, amino-LNA, alfa-L-oxi-LNA y ena-LNA.

El término "grupo de enlace" se pretende que signifique un grupo capaz de acoplar covalentemente dos nucleósidos, dos análogos nucleosídicos, un nucleósido y un análogo nucleosídico, etc. los ejemplos específicos y preferidos incluyen grupos fosfato y grupos fosforotioato.

En el presente contexto el término "conjugado" se pretende que indique una molécula heterogénea formada por la unión covalente de un compuesto tal como se describe en el presente documento (es decir un compuesto que comprende una secuencia de nucleósidos o análogos nucleosídicos) a uno o más restos no nucleotídicos o no polinucleotídicos. Los ejemplos de restos no nucleotídicos o no polinucleotídicos incluyen agentes macromoleculares como por ejemplo proteínas, cadenas de ácidos grasos, restos de azúcares, glucoproteínas, polímeros, o sus combinaciones. Habitualmente las proteínas pueden ser anticuerpos para una proteína diana. Los polímeros habituales pueden ser
polietilenglicol.

El término "carcinoma" se pretende que indique un tumor maligno de origen epitelial. El tejido epitelial cubre o tapiza las superficies interiores y exteriores del cuerpo. Los ejemplos de tejido epitelial son la piel y la mucosa y serosa que tapizan las cavidades corporales y los órganos internos, como por ejemplo los intestinos, la vejiga urinaria, el útero, etc. el tejido epitelial también pueden extenderse a capas de tejido más profundas de las glándulas, como por ejemplo las glándulas que segregan moco.

El término "sarcoma" se pretende que indique un tumor maligno que crece a partir de tejido conjuntivo, como por ejemplo cartílago, grasa, músculos, tendones y huesos.

El término "glioma", cuando se usa en el presente documento, se pretende que cubra un tumor maligno que se origina en células gliales.

El término "un/una" como se usa respecto a un nucleósido, un análogo nucleosídico, una SEC ID N.º:, etc. se pretende que signifique uno o más. En particular, la expresión "un componente (como por ejemplo un nucleósido, un análogo nucleosídico, una SEC ID N.º: o similares) que se selecciona a partir del grupo constituido por..." se pretende que signifique que puede seleccionarse uno o más de los citados componentes. Así, las expresiones como "un componente que se selecciona a partir del grupo constituido por A, B y C" se pretende que incluya todas las combinaciones de A, B y C, es decir A, B, C, A+B, A+C, B+C y A+B+C.

En el presente contexto, el término "alquilo C_{1-4}" se pretende que signifique una cadena de hidrocarburo saturado lineal o ramificada en la que la cadena tiene de uno a cuatro átomos de carbono, como por ejemplo metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo y terc-butilo.

Tal como se usan en el presente documento, los términos "ácido nucleico diana" engloban ADN que codifica la survivina, ARN (que incluye pre-ARNm y ARNm) transcrito a partir de dicho ADN, y también ADNc derivado de dicho ARN.

Tal como se usa en el presente documento, el término "gen" quiere decir el gen que incluye exones, intrones, regiones 5' y 3' no codificantes y elementos reguladores y todas sus variantes actualmente conocidas y cualquier variante adicional que pueda ser descubierta.

Tal como se usan en el presente documento, los términos "compuesto oligomérico" se refieren a un oligonucleótido que puede inducir un efecto terapéutico deseado en los seres humanos por ejemplo uniéndose mediante enlaces de hidrógeno o bien a un gen diana "Chimeraplast" y "TFO", a los tránscrito(s) de ARN del gen diana "inhibidores no codificantes", "siARN", "ribozimas" y "oligozimas" o bien a la(s) proteína(s) que codifica el gen diana "aptámero", "spiegelmero" o "señuelo (decoy)".

Tal como se usa en el presente documento, el término "ARNm" quiere decir los tránscrito(s) de ARNm de un gen diana conocidos actualmente, y cualquier tránscritos adicional que pueda identificarse.

Tal como se usa en el presente documento, el término "modulación" quiere decir o bien un aumento (estimulación) o un descenso (inhibición) en la expresión de un gen. En la presente invención, la inhibición es la forma preferida de modulación de la expresión génica y el ARNm es una diana preferida.

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Tal como se usa en el presente documento, el término un compuesto no codificante "dirigido contra" un ácido nucleico diana particular quiere decir proporcionar el oligonucleótido no codificante a la célula, animal o ser humano de tal forma que el compuesto no codificante sea capaz de unirse y modular la función de su diana prevista.

Tal como se usa en el presente documento, "hibridación" quiere decir enlaces de hidrógeno, que pueden ser de Watson-Crick, Holstein, enlaces de hidrógeno de Holstein inverso, etc. entre bases nucleosídicas o nucleotídicas complementarias. Watson y Crick demostraron hace aproximadamente cincuenta años que el ácido desoxirribonucleico (ADN) está compuesto por dos hebras que se mantienen unidas en una configuración helicoidal mediante enlaces de hidrógeno que se forman entre nucleobases complementarias opuestas de las dos hebras. Las cuatro nucleobases, que se encuentran habitualmente en el ADN son guanina (G), adenina (A), timina (T) y citosina (C) de las cuales la nucleobase G se empareja con C, y la nucleobase A se empareja con T. En el ARN, la nucleobase timina es sustituida por la nucleobase uracilo (U), que de forma similar a la nucleobase T se empareja con A. Los grupos químicos de las nucleobases que participan en la formación de dúplex estándar constituyen la cara Watson-Crick. Hoogsteen demostró un par de años después que las nucleobases de purina (G y A) además de su cara Watson-Crick tienen una cara Hoogsteen que puede reconocerse desde el exterior de un dúplex, y se usa para unirse a los oligonucleótidos de pirimidina mediante enlaces de hidrógeno, formando así una estructura de triple hélice.

En el contexto de la presente invención "complementaria" se refiere a la capacidad de emparejamiento preciso entre dos secuencias de nucleótidos o nucleósidos entre sí. Por ejemplo, si un nucleótido en una cierta posición de un oligonucleótido puede formar enlaces de hidrógeno con un nucleótido a la posición correspondiente de una molécula de ADN o ARN, entonces se considera que el oligonucleótido y el ADN o ARN son complementarios entre sí en esa posición. El ADN o ARN y el oligonucleótido se consideran complementarios el uno al otro cuando un número suficiente de nucleótidos del oligonucleótido pueden formar enlaces de hidrógeno con los nucleótidos correspondientes del ADN o ARN diana para permitir la formación de un complejo estable. Para ser estable in vitro o in vivo, la secuencia de un compuesto no codificante no tiene que ser complementaria al 100% a su ácido nucleico diana. Los términos "complementario" y "específicamente hibridable" por lo tanto implican que el compuesto no codificante se une de una forma lo suficientemente fuerte y específica a la molécula diana para que proporcione la interferencia deseada con la función normal de la diana a la vez que no afecta a la función de las dianas distintas de ARNm.

Los compuestos oligoméricos de acuerdo con la invención son moduladores potentes de la diana. Por ejemplo, la inhibición in vitro de la diana se muestra en la Tabla 1 medida mediante PCR en tiempo real. La Figura 2 muestra la potencia in vitro de compuestos oligoméricos de acuerdo con la invención medida mediante transferencia Northern. En la Tabla 3 se muestran valores muy bajos de CI_{50} de los compuestos oligoméricos. Todas las observaciones experimentales que se mencionan anteriormente muestran que los compuestos de acuerdo con la invención pueden constituir el compuesto activo en una composición farmacéutica.

La subsecuencia del compuesto de la invención habitualmente está localizada en la secuencia SEC ID N.º: 130. Los análogos de los nucleótidos de forma adecuada son nucleótidos dentro de esta secuencia.

El compuesto de la invención comprende de 12-25 nucleótidos, de forma más adecuada 12-20 nucleótidos, como por ejemplo 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos. Una realización de la invención muy atractiva, el compuesto de la invención comprende 14-18 nucleótidos, como por ejemplo 14, 15,16, 17 ó 18 nucleótidos, preferiblemente 15-17 nucleótidos, como por ejemplo 15, 16 ó 17 nucleótidos, más habitualmente 15 nucleótidos, o 16 nucleótidos, o 17 nucleótidos.

En a realización adecuada de la invención, la subsecuencia dentro de la secuencia de la SEC ID N.º: 130 habitualmente tiene al menos 8 nucleótidos o análogos nucleotídicos, como por ejemplo al menos 9 nucleótidos de la secuencia o análogos nucleotídicos de los nucleótidos de dicha secuencia. Más habitualmente, la subsecuencia tiene al menos 12 nucleótidos o análogos nucleotídicos de dicha secuencia, como por ejemplo al menos 14 nucleótidos o análogos nucleotídicos, como por ejemplo 10, 11, 12, 13 14 15 ó 16 nucleótidos o análogos nucleotídicos.

Los nucleótidos habitualmente están enlazados entre sí por medio de un grupo de enlace que se selecciona a partir del grupo constituido por un grupo fosfato, un grupo fosforotioato y un grupo fosfato de boro. De forma adecuada, algunos o todos los nucleótidos están enlazados entre sí por medio de un grupo fosfato. De forma adecuada, todos nucleótidos están enlazados entre sí por medio de un grupo fosfato.

De forma similar, los nucleótidos de la invención habitualmente están enlazados entre sí por medio de un grupo de enlace que se selecciona a partir del grupo constituido por un grupo fosfato, un grupo fosforotioato y un grupo fosfato de boro.

Los compuestos oligoméricos preferidos de acuerdo con la invención son la SEC ID N.º: 130.

En otra realización de la invención, dichos nucleótidos están enlazados entre sí por medio de un grupo fosforotioato, como por ejemplo todos nucleótidos están unidos entre sí por medio de un grupo fosforotioato. Una realización interesante de la invención se refiere a compuestos de la SEC ID N.º: 130 en la que cada grupo de enlace dentro del compuesto es un grupo fosforotioato. Dichas modificaciones se indican mediante el subíndice S. Dicho de otro modo, un aspecto de la invención se refiere un compuesto de la SEC. ID. N.º: 130_{A}.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un compuesto de la SEC. ID. N.º: 130_{B}.

Un subconjunto preferido de realizaciones de la invención es un compuesto que comprende la secuencia de la fórmula 130_{B}.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un compuesto de la SEC. ID. N.º: 130_{C}.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un compuesto de la SEC. ID. N.º: 130_{D}.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un compuesto de la SEC. ID. N.º: 130_{E}.

En una realización preferida, el compuesto de la invención comprende de 12-25 nucleótidos, en el que dicho compuesto comprende una subsecuencia de al menos 8 nucleótidos, estando dicha localizada dentro de la secuencia SEC ID N.º: 130, en la que al menos un nucleótido es reemplazado por un análogo nucleotídico correspondiente. Habitualmente, el compuesto de la invención comprende 1-25 análogos nucleotídicos, como por ejemplo 2-25 análogos nucleotídicos, 3-25 análogos nucleotídicos, de forma adecuada 4-25 análogos nucleotídicos, 5-25 análogos nucleotídicos, 6-25 análogos nucleotídicos, habitualmente 6-20 análogos nucleotídicos, más habitualmente 6-14 análogos nucleotídicos, como por ejemplo 6-12 análogos nucleotídicos, como por ejemplo 6, 7, 8, 9, 10,11 ó 12 análogos nucleotídicos.

Los inventores han encontrado que los compuestos de la invención que comprenden de 6-16 análogos nucleotídicos con una unidad de ribosa diferente son suficiente para tener una afinidad mejor que los nucleótidos. Así, un aspecto interesante de la invención se refiere a un compuesto de la invención que comprende 6-10, como por ejemplo 6, 7, 8, 9 ó 10 análogos nucleotídicos con una unidad de ribosa diferente, preferiblemente 7, 8 o 9 análogos nucleotídicos con una unidad de ribosa diferente, lo más habitualmente 8 análogos nucleotídicos con una unidad de ribosa diferente. Preferiblemente, los análogos nucleotídicos con una unidad de ribosa diferente es LNA.

Los presentes inventores han encontrado además que los análogos nucleotídicos con una unidad de ribosa diferente y además con un enlace internucleosídico modificado tienen un efecto todavía mejor para los fines de modificaciones no codificantes. Así, los 6-16 análogos nucleotídicos pueden tener una unidad de ribosa modificada, un grupo de enlace diferente o ambos.

De forma adecuada, todos nucleótidos son reemplazados por análogos nucleotídicos correspondientes.

Un análogo nucleotídico preferido de la invención es LNA.

Un análogo nucleotídico más preferido de la invención es aquel en el que el enlace fosfato internucleosídico es un fosforotioato.

Un análogo nucleotídico todavía más preferido es aquel en el que el nucleótido es LNA con un enlace fosforotioato internucleosídico.

En una realización interesante, el compuesto de la invención comprende de 12-25 nucleótidos, en el que dicho compuesto comprende una subsecuencia de al menos 8 nucleótidos, estando dicha localizada dentro de la secuencia SEC ID N.º: 130, en la que al menos un nucleótido es reemplazado por un análogo nucleotídico correspondiente y en el que el extremo 3' comprende un nucleótido, en lugar de un análogo nucleotídico.

En una realización particularmente interesante, el compuesto comprende al menos un análogo nucleotídico, en el que dicho análogo nucleotídico es un ácido nucleico bloqueado (LNA) de la fórmula

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en la que Z y Z* de forma independiente están ausentes, se seleccionan de entre un enlace internucleosídico, un grupo terminal o un grupo protector; en la que X e Y se seleccionan de forma independiente a partir del grupo constituido por O, S, NR, CH_{2}, CH, (si es parte de un enlace doble), CH_{2}-O, CH_{2}-S, CH_{2}-NR, CH_{2}CH_{2}, CH_{2}-CH (si es parte de un enlace doble) y CH=CH, donde R es hidrógeno o alquilo C_{1-4}. Los enlaces representan la conexión al grupo de enlace. Habitualmente, X es O e Y se seleccionan de forma independiente a partir del grupo constituido por O, S y NR, donde R es hidrógeno o alquilo C_{1-4}. Más habitualmente, X es O e Y se selecciona a partir del grupo constituido por O, S y NH. Lo más habitualmente, X es O e Y es O. En realizaciones en las que al menos uno de los nucleótidos de LNA está en el extremo 3', en dicha posición Z es un grupo terminal y Z* es un enlace internucleosídico. En realizaciones en las que al menos uno de los nucleótidos de LNA está en el extremo 5', en dicha posición Z está ausente y Z* es un grupo terminal. Dentro de la secuencia de nucleótidos, Z está ausente y Z* es un enlace internu-
cleosídico.

En una realización de la invención adecuada que comprende LNA como análogos nucleotídicos, dicho LNA está en la forma \beta-D o alfa-L, preferiblemente en la forma \beta-D.

En realizaciones de la invención que comprenden al menos un LNA como análogos nucleotídicos, como por ejemplo 1 -25 análogos nucleotídicos de LNA, como por ejemplo 2-25 análogos nucleotídicos de LNA, 3-25 análogos nucleotídicos de LNA, de forma adecuada 4-25 análogos nucleotídicos de LNA, 5-25 análogos nucleotídicos de LNA, 6-25 análogos nucleotídicos de LNA, habitualmente 6-20 análogos nucleotídicos de LNA, más habitualmente 6-14 análogos nucleotídicos de LNA, como por ejemplo 6-12 análogos nucleotídicos de LNA, como por ejemplo 6, 7, 8, 9, 10,11 ó 12 análogos nucleotídicos de LNA dichos nucleótidos y/o análogos nucleotídicos están enlazados entre sí por medio de un grupo de enlace que se selecciona a partir del grupo constituido por un grupo fosfato, un grupo fosforotioato y un grupo fosfato de boro.. En una realización adecuada de la invención que comprende análogos nucleotídicos de LNA, dichos nucleótidos y/o análogos nucleotídicos están enlazados entre sí por medio de un grupo fosfato. En una realización preferida de la invención que comprende análogos nucleotídicos de LNA dichos nucleótidos y/o análogos nucleotídicos están enlazados entre sí por medio de un grupo fosforotioato.

En una combinación de realizaciones interesantes, en realizaciones de la invención que comprenden análogos nucleotídicos de LNA dichos nucleótidos y/o análogos nucleotídicos están enlazados entre sí por medio de un grupo fosforotioato, en el que X es O e Y es O, y dicho LNA está en forma \beta-D.

En realizaciones del compuesto de la invención que comprende de 12-25 nucleótidos, en las que dicho compuesto comprende una subsecuencia de al menos 8 nucleótidos, estando dicha subsecuencia localizada dentro de la secuencia SEC ID N.º: 130 y comprendiendo dichos nucleótidos análogos nucleotídicos de LNA, la subsecuencia habitualmente puede comprender un tramo de 2-6 LNA, tal como se definen en el presente documento, seguido de un tramo de 4-12 nucleótidos, que viene seguido de un tramo de 2-6 LNA, tal como se definen en el presente documento.

Las subsecuencias que comprenden un tramo de LNA, seguido de un tramo de nucleótidos, seguido de un tramo de LNA se conocen como gapmeros.

De forma adecuada, dicha subsecuencia comprende un tramo de 4 LNA, tal como se definen en el presente documento, seguido de un tramo de 8 nucleótidos, que viene seguido de un tramo de 4 LNA tal como se definen en el presente documento.

En realizaciones del compuesto de la invención que comprende de 12-25 nucleótidos, en las que dicho compuesto comprende una subsecuencia de al menos 8 nucleótidos, estando dicha secuencia localizada dentro de la secuencia SEC ID N.º: 130 y comprendiendo dichos 12-25 nucleótidos análogos nucleotídicos de LNA, dicha subsecuencia puede comprender un tramo de 2-6 LNA tal como se definen en el presente documento, seguido de un tramo de 4-12 nucleótidos, que viene seguido de un tramo de 2-5 LNA tal como se definen en el presente documento, que viene seguido de 1 -4 nucleótidos, como por ejemplo 1 ó 2 nucleótidos, más habitualmente un único nucleósido. Los 1 -4 nucleótidos, 1 ó 2 nucleótidos o el nucleótido único habitualmente está localizado en el extremo 3' de la subsecuencia y más habitualmente en el extremo 3' del oligómero.

En realizaciones del compuesto de la invención que comprende de 12-25 nucleótidos, en las que dicho compuesto comprende una subsecuencia de al menos 8 nucleótidos, estando dicha secuencia localizada dentro de la secuencia SEC ID N.º: 130 y comprendiendo dichos nucleótidos análogos nucleotídicos de LNA, dicha subsecuencia habitualmente puede comprender un tramo de 4 LNA tal como se definen en el presente documento, seguido de un tramo de 8 nucleótidos, que viene seguido de un tramo de 3 LNA tal como se definen en el presente documento, que viene seguido de un único nucleótido natural. El nucleótido único habitualmente está localizado en el extremo 3' de la subsecuencia y más habitualmente en el extremo 3' del oligómero.

En realizaciones del compuesto de la invención que comprende de 12-25 nucleótidos, en las que dicho compuesto comprende una subsecuencia de al menos 8 nucleótidos, estando dicha secuencia localizada dentro de la secuencia SEC ID N.º: 130 y comprendiendo dichos nucleótidos análogos nucleotídicos de LNA, dicha subsecuencia que comprende un tramo de LNA, seguido de un tramo de nucleótidos, que viene seguido de un tramo de LNA que se definen en el presente documento como gapmeros, dichos nucleótidos y/o LNA están enlazados entre sí por medio de un grupo de enlace que se selecciona a partir del grupo constituido por un grupo fosfato, un grupo fosforotioato y un grupo fosfato de boro.

De forma adecuada, dichos nucleótidos y/o dichos LNA están enlazados por medio de grupo fosfatos. Habitualmente, dichos nucleótidos y/o dichos LNA están enlazados por medio de grupos fosforotioato.

En realizaciones del compuesto de la invención que comprende un total de 12-25 nucleótidos y/o análogos nucleotídicos, en las que dicho compuesto comprende una subsecuencia de al menos 8 nucleótidos, estando dicha secuencia localizada dentro de la secuencia SEC ID N.º: 130 y en el que dicha subsecuencia puede estar constituida por un tramo de 4 LNA, tal como se definen en el presente documento, un tramo de 8 nucleótidos, y un tramo de 4 LNA, tal como se definen en el presente documento, de forma que se obtenga un total de 16 nucleótidos y análogos nucleotídicos en dicha subsecuencia, dichos nucleótidos y dichos LNA están enlazados por medio de grupos fosforo-
tioato.

En una realización adecuada, la subsecuencia es la SEC ID N.º: 130a.

En una realización adecuada adicional, el compuesto de la invención tiene una secuencia de la SEC ID N.º: 130 y en la que dicha secuencia está constituida por un tramo de 4 LNA, tal como se definen en el presente documento, un tramo de 8 nucleótidos, y un tramo de 4 LNA, tal como se definen en el presente documento, de forma que el total es de 16 nucleótidos y análogos nucleotídicos en dicho compuesto, dichos nucleótidos y dicho LNA están unidos por medio de grupos fosforotioato.

En una realización adecuada, el compuesto está constituido por la SEC ID N.º: 130a. En las realizaciones adecuadas individuales que acaban de mencionarse en las que el compuesto es la SEC ID N.º: 130a, el LNA del extremo 3' del compuesto de forma adecuada puede reemplazarse por el nucleótido correspondiente.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un conjugado que comprende el compuesto tal como se define en el presente documento, al menos un resto no nucleotídico o no nucleosídico unido covalentemente a dicho compuesto.

En un aspecto relacionado de la invención, el compuesto de la invención está unido a ligandos de forma que forme un conjugado. Se pretende que dichos ligandos aumenten la captación celular del conjugado con respecto a los oligonucleótidos no codificantes. Esta conjugación puede tener lugar en las posiciones de los extremos 5'/3'-OH pero los ligandos también pueden conjugarse con los azúcares y/o las bases. De forma particular, el factor de crecimiento con el que puede conjugarse el oligonucleótido no codificante puede comprender transferrina o folato. Pueden prepararse complejos de transferrina-polilisina-oligonucleótido o los complejos de folato-polilisina-oligonucleótido para la captación por las células que expresan niveles elevados de receptor de transferrina o folato. Otros ejemplos de conjugados/ligandos son restos de colesterol, intercaladores dúplex como por ejemplo acridina, poli-L-lisina, "careruza terminal" con uno o más grupos de enlaces resistentes a nucleasas como por ejemplo fosforomonotioato, y
similares.

La preparación de complejos de transferrina como vehículos de los oligonucleótidos en las células es descrita por Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1390). La administración celular de conjugados de folato y macromoléculas mediante endocitosis de los receptores de folato, que incluye la administración de un oligonucleótido no codificante, es descrita por Low et al., Patente de Estados Unidos 5.108.921. Véase también, Leamon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5572 (1991).

Los compuestos o conjugados de la invención también pueden conjugarse o conjugarse además con una sustancia farmacológica activa, por ejemplo, aspirina, ibuprofeno, una sulfamida, un antidiabético, un agente antibacteriano, un agente quimioterapéutico o un antibiótico.

Un aspecto particularmente interesante de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto tal como se define en el presente documento o un conjugado tal como se define en el presente documento, y un diluyente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

Debería entenderse que la presente invención también es particularmente relevante para una composición farmacéutica, que comprende al menos una construcción de oligonucleótido no codificante de la invención como un principio activo. Debería entenderse que la composición farmacéutica de acuerdo con la invención opcionalmente comprende un vehículo farmacéutico, y que la composición farmacéutica opcionalmente comprende otros compuestos no codificantes, agentes quimioterapéuticos, compuestos antiinflamatorios, compuestos antivirales y/o compuestos inmunomoduladores.

Tal como se ha indicado, la composición farmacéutica de la invención además puede comprende al menos un agente quimioterapéutico. El compuesto quimioterapéutico habitualmente que se selecciona a partir del grupo constituido por adrenocorticosteroides, como por ejemplo prednisona, dexametasona o decadron; altretamina (hexalen, hexametilmelamina (HMM)); amifostina (etiol); aminoglutetimida (cytadren); amsacrina (M-AMSA); anastrozol (arimidax); andrógenos, como por ejemplo testosterona; asparraginasa (elspar); calmete-gurina de bacilo; bicalutamida (casodex); bleomicina (blenoxano); busulfán (mileran); carboplatina (paraplatina); carmustina (BCNU, BICNU); clorambucilo (leukeran); clorodesoxiadenosina (2-CDA, cladribina, leustatina); cisplatina (platinol); citosina arabinosida (citarabina); dacarbazina (DTIC); dactinomicina (actinomicina-D, cosmegen); daunorrubicina (cerubidina); docetaxel (taxotere); doxorrubicina (adriomicina); epirrubicina; estramustina (emcyt); estrógenos, como por ejemplo dietilstilbestrol (DES); etopósida (VP-16, VePesid, etopofos); fludarabina (fludara); flutamida (eulexin); 5-FUDR (floxuridina); 5-fluorouracilo (5-FU); gemcitabina (gemzar); goserelina (zodalex); herceptina (trastuzumab); hidroxiurea (hidrea); idarrubicina (idamicina); ifosfamida; IL-2 (proleucina, aldesleucina); interferón alfa (intrón A, roferón A); irinotecán (camptosar); leuprolida (lupron); levamisol (ergamisol); lomustina (CCNU); mecloratamina (mustargen, mostaza nitrogenada); melfalán (alkeran); mercaptopurina (purinetol, 6-MP); metotrexato (mexato); mitomicina-C (mutamucina); mitoxantrona (novantrona); octreótida (sandostatina); pentostatina (2-desoxicoformicina, nipent); plicamicina (mitramicina, mitracina); prorocarbazina (matulano); estreptozocina; tamoxifina (nolvadex); taxol (paclitaxel); tenipósida (vumon, VM-26); tiotepa; topotecán (hicamtina); tretinoina (vesanoid, ácido holo-trans retinoico); vinblastina (valban); vincristina (Oncovina) y vinorelbina (navelbina).

El compuesto oligomérico o conjugado comprendido en esta invención puede emplearse en una variedad de sales farmacéuticamente aceptables. Tal como se usa en el presente documento, el término se refiere a sales que mantienen la actividad biológica deseada de los compuestos que se identifican en el presente documento y exhiben efectos toxicológicos indeseados mínimos. Los ejemplos no limitantes de dichas sales pueden formarse con sales de adición de aminoácidos orgánicos y de bases que se forman con cationes metálicos como por ejemplo cinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio, sodio, potasio, y similares, o con un catión formado por amoniaco, N,N-dibenciletilen-diamina, D-glucosamina, tetraetilamonio, o etilendiamina; o (c) combinaciones de (a) y (b); por ejemplo, una sal de estannato de cinc o similares.

En una realización de la invención el compuesto oligomérico o conjugado puede estar en forma de profármaco. Los oligonucleótidos son por su propia naturaleza iones con carga negativa. Debido a la naturaleza lipófila de las membranas celulares, la captación celular de oligonucleótidos es reducida comparada con los equivalente neutros o lipófilos. Este "impedimento" de la polaridad puede evitarse usando la estrategia de los profármacos (véase por ejemplo Crooke, R. M. (1998) en Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlín, Alemania, vol. 131, páginas 103-140). En esta estrategia, los oligonucleótidos se preparan de forma protegida de forma que el oligo sea neutro cuando se administra. Estos grupos de protección se diseñan de tal forma que puedan eliminarse cuando el oligo es captado por las células. Los ejemplos de dichos grupos de protección son S-acetiltioetil (SATE) o S-pivaloiltioetil (t-butil-SATE). Estos grupos de protección son resistentes a nucleasas y se eliminan de forma selectiva intracelularmente.

La invención también incluye la formulación de uno o más compuestos oligonucleotídicos o conjugados como se describen en el presente documento. Los agentes de enlace y adyuvantes farmacéuticamente aceptables pueden comprender parte del fármaco formulado. Las cápsulas, comprimidos y píldoras, etc. pueden contener por ejemplo los siguientes compuestos: celulosa microcristalina, goma o gelatina como aglutinantes; almidón o lactosa como excipientes; estearatos como lubricantes; diversos agentes edulcorantes o aromatizantes. Para las cápsulas, la monodosis puede contener un vehículo líquido como aceites grasos. Del mismo modo, los recubrimientos de azúcar o agentes entéricos pueden ser parte de la monodosis. Las formulaciones de oligonucleótidos también pueden ser emulsiones de los principios farmacéuticos activos y un lípido que forme una emulsión de micelas.

Un oligonucleótido de la invención puede mezclarse con cualquier material que no impida la acción deseada, o con un material que suplemente la acción deseada. Estos podrían incluir otros fármacos que incluyen otros compuestos nucleotídicos.

Para la administración parenteral, subcutánea, intradérmica o tópica, la formulación puede incluir un diluyente estéril, tampones reguladores de la tonicidad y antibacterianos. El compuesto activo puede prepararse con vehículos que protejan contra la degradación o la eliminación inmediata del cuerpo, que incluyen implantes o microcápsulas con propiedades de liberación controladas. Para la administración intravenosa los vehículos preferidos son solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato.

Preferiblemente, un compuesto oligomérico está incluido en una formulación unitaria como por ejemplo en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable en una cantidad suficiente para administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz sin provocar efectos secundarios graves al paciente tratado.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse de numerosas formas dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y del área a tratar. La administración puede ser (a) oral (b) pulmonar, por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, que incluyen nebulizador, intratraqueal, intranasal, (c) tópica que incluye epidérmica, transdérmica, oftálmica y a las membranas mucosas que incluyen administración vaginal y rectal; o (d) parenteral que incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intraventricular. En una realización, el oligo activo se administra por vía IV, IP, oral, tópica o en forma de inyección embolada o se administra directamente al órgano diana.

Las composiciones farmacéuticas y formulaciones para la administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, pulverizadores, supositorios, líquidos y polvos. Pueden ser deseables o necesario vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares. También pueden ser útiles condones, guantes recubiertos y similares. Las formulaciones incluyen aquellas en las que los oligonucleótidos de la invención están mezclados con un agente de administración tópica como por ejemplo lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Las composiciones y formulaciones para la administración oral incluyen, pero sin restricción, polvos o gránulos, micropartículas, nanopartículas, suspensiones o soluciones en agua o en medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, sobrecitos, comprimidos o minicomprimidos. Las composiciones y formulaciones para la administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados como por ejemplo, pero sin limitación, potenciadores de la penetración, compuestos transportadores y otros vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero sin limitación, soluciones, emulsiones, y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones pueden generarse a partir de una variedad de componentes que incluyen, pero sin limitación, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes. La administración de un fármaco al tejido tumoral puede potenciarse mediante la administración mediada por vehículo que incluye, pero sin limitación, liposomas catiónicos, ciclodextrinas, derivados de porfirina, dendrímeros de cadena ramificada, polímeros de polietilenimina, nanopartículas y microesferas (Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1):3-27).

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, que pueden presentarse convenientemente en forma monodosis, pueden prepararse de acuerdo con técnicas convencionales notorias en la industria farmacéutica. Dichas técnicas incluyen la etapa de asociar los principios activos con el vehículo(s) o excipiente(s) farmacéutico(s). En general las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima los principios activos con los vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente fraccionados o ambos; y después, si fuera necesario, dando forma al
producto.

Las composiciones de la presente invención pueden formularse en cualquiera de las muchas formas farmacéuticas posibles como por ejemplo, pero sin limitación, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos y supositorios. Las composiciones de la presente invención también pueden formularse en forma de suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. Las suspensión también puede contener estabilizantes.

Los compuestos oligoméricos que contienen LNA son útiles para un número de aplicaciones terapéuticas como se indica anteriormente. En general, los procedimientos terapéuticos de la invención incluyen la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligonucleótido modificado con LNA a un mamífero, particularmente un ser humano.

En una cierta realización, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen (a) uno o más compuestos no codificantes y (b) otro u otros agentes quimioterapéuticos que funcionan mediante un mecanismo diferente al no codificante. Cuando se usan con los compuestos de la invención, dichos agentes quimioterapéuticos pueden usarse de forma individual (por ejemplo mitramicina y oligonucleótido), secuencial (por ejemplo mitramicina y oligonucleótido durante un periodo de tiempo seguido de otro agente y oligonucleótido), o combinados con otro u otros agentes quimioterapéuticos de ese tipo o combinados con radioterapia. Todos los agentes quimioterapéuticos conocidos por una persona experta en la técnica se incorporan aquí como tratamientos combinados con compuestos de acuerdo con la invención.

Los fármacos antiinflamatorios, que incluyen pero sin limitación fármacos antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, fármacos antivirales y fármacos inmunomoduladores también pueden combinarse en composiciones de la invención. Pueden usarse dos o más compuestos combinados juntos o de forma secuencial.

En otras realizaciones, las composiciones de la invención pueden contener uno o más compuestos no codificantes, particularmente oligonucleótidos, dirigidos contra un primer ácido nucleico y uno o más compuestos no codificantes adicionales dirigidos contra un segundo ácido nucleico diana. Pueden usarse dos o más compuestos combinados juntos o de forma secuencial.

La dosis depende de la gravedad y de la respuesta del estado de enfermedad a tratar, y el ciclo de tratamiento dura de varios días a varios meses, o hasta que se consigue la curación o una disminución del estado de enfermedad. Las pautas de administración óptimas pueden calcularse midiendo la acumulación del fármaco en el cuerpo del
paciente.

Las dosis óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los oligonucleótidos individuales. Generalmente puede estimarse basándose en las CE_{50} que se encuentre que son eficaces in vitro y en los modelos animales in vivo. En general, la dosis es de 0,01 \mug a 1 g por kg de peso corporal, y puede administrarse una o más veces al día, semanalmente, mensualmente o anualmente o incluso una vez cada 2 a 10 años o mediante infusión continua durante de horas hasta varios meses. Las tasas de repetición para la administración pueden estimarse basándose en los tiempos de permanencia y concentraciones del fármaco medidos en fluidos o tejidos corporales. Tras el tratamiento con éxito, puede ser deseable hacer que el paciente se someta a una terapia de mantenimiento para evitar la reaparición del estado de enfermedad.

Tal como se ha indicado, en una realización interesante de la invención, los compuestos oligoméricos contienen al menos una unidad del compuesto químico denominado LNA (ácido nucleico bloqueado).

Monómero de LNA habitualmente se refiere a un análogo nucleotídico bicíclico en el que el resto nucleosídico es un análogo tal como se describe en la solicitud de patente internacional WO 99/14226 y las solicitudes de patente posteriores WO0056746, WO0056748, WO0066604, WO00125248, WO0228875, WO2002094250 y WO3006475. Las estructuras de nucleótidos de LNA preferidas para formar un compuesto de la invención se ejemplifican en el Esquema 2

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Esquema 2

3

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en la que X e Y se seleccionan independientemente de entre los grupos -O-, -S-, -N(H)-, N(R)-, -CH_{2}- o -CH- (si es parte de un enlace doble), -CH_{2}-O-, -CH_{2}-S-, -CH_{2}-N(H)-, -CH_{2}-N(R)-, -CH_{2}-CH_{2}- o -CH_{2}-CH- (si es parte de un enlace doble), -CH=CH-, donde R se selecciona a partir de hidrógeno y alquilo C_{1-4}; en la que Z y Z* de forma independiente están ausentes, se seleccionan de entre un enlace internucleosídico, un grupo terminal o un grupo protector. En realizaciones en las que al menos uno de los nucleótidos de LNA está en el extremo 3', en dicha posición Z es un grupo terminal y Z* es un enlace internucleosídico. En realizaciones en las que al menos uno de los nucleótidos de LNA está en el extremo 5', en dicha posición Z está ausente y Z* es un grupo terminal. Dentro de la secuencia de nucleótidos, Z está ausente y Z* es un enlace internucleosídico. Los grupos asimétricos pueden encontrarse en cualquiera de las dos orientaciones. En el Esquema 2, los 4 centros quirales se muestran en una configuración fija. Sin embargo, las configuraciones del Esquema 2 no son necesariamente fijas. También están comprendidos en esta invención los compuestos del Esquema general 2 en el que los centros quirales se encuentran en configuraciones diferentes, como por ejemplo las que se representan en el Esquema 3 ó 4. Así, la intención en la ilustración del Esquema 2 no es limitar la configuración del centro quiral. Cada centro quiral del Esquema 2 puede existir en configuración R o S. La definición de R (rectus) y S (sinister) se describe en las recomendaciones de la IUPAC 1974, Sección E, Fundamental Stereochemistry. Las reglas pueden encontrarse en Pure Appl. Chem. 45, 13-30, (1976) y en "Nomenclature of Organic Chemistry" Pergamon, Nueva York, 1979.

Z y Z* sirven para formar un enlace internucleosídico, son un grupo terminal o un grupo protector, dependiendo de la posición de LNA dentro del compuesto, en concreto dentro de la subsecuencia o en el extremo 3' de la subsecuencia o compuesto.

El enlace internucleosídico puede ser -O-P(O)_{2}-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)_{2}-O-, -S-P(O)_{2}-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)_{2}-O-, -O-P(O)_{2}.S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)_{2}-S-, -O-PO(R^{H})-O-, O PO(OCH_{3})-O-, -O-PO(NR^{H})-O-, -O-PO (OCH_{2}
CH_{2}S-R^{H})-O-, -O-PO(BH_{3})-O-, -O-PO(NHR^{H})-O-; -O-P(O)_{2}-NR^{H}-,-NR^{H}-P(O)_{2}-O-, -NR^{H}-CO-O-, -NR^{H}-CO-NR^{H}-, -O-CO-O-, -O-CO-NRH-, -NR^{H}-CO-CH_{2}-, -O-CH_{2}-CO-NR^{H}-, -O-CH_{2}-CH_{2}-NR_{H}-, -CO-NR^{H}-CH_{2}-, -CH_{2}-NR^{H}-CO-, -O-CH_{2}-CH_{2}-S-, -S-CH_{2}-CH_{2}-O-, -S-CH_{2}-CH_{2}-S-, -CH_{2}-SO_{2}-CH_{2}-, -CH_{2}-CO-NR^{H}-, -O-CH_{2}-CH_{2}-NR^{H}-CO -, -CH_{2}-NCH_{3}-O-CH_{2}-, donde R^{H} se selecciona a partir de hidrógeno y alquilo C_{1-4},

Los grupos terminal se seleccionan de forma independiente de entre hidrógeno, azido, halógeno, ciano, nitro, hidroxi, Prot-O-, Act-O-, mercapto, Prot-S-, Act-S-, (alquil C_{1-6})tio, amino, Prot-N(R^{H})-, Act-N(R^{H})-, mono- o di(alquil C_{1-6})amino, alcoxi C_{1-6} opcionalmente sustituido, alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido, alquenilo C_{2-6} opcionalmente sustituido, alqueniloxi C_{2-6} opcionalmente sustituido, alquinilo C_{2-6} opcionalmente sustituido, alquiniloxi C_{2-6} opcionalmente sustituido, monofosfato, monotiofosfato, difosfato, ditiofosfato, trifosfato, tritiofosfato, intercaladores de ADN, grupos fotoquímicamente activos, grupos termoquímicamente activos, grupos quelantes, grupos testigo, ligandos, carboxi, sulfono, hidroximetilo, Prot-O-CH_{2}-, Act-O-CH_{2}-, aminometilo, Prot-N(R^{H}) -CH_{2}-, Act-N(R^{H})-CH_{2}-, carboximetilo, sulfonometilo, donde Prot es un grupo protector para -OH, -SH, y -NH(R^{H}), respectivamente, Act es un grupo activador para -OH, -SH, y -NH(R^{H}), respectivamente, y R^{H} se selecciona a partir de hidrógeno y alquilo C_{1-6};

Los grupos de protección de los sustituyentes hidroxi comprenden tritilo sustituido, como por ejemplo 4,4'-dimetoxitritiloxi (DMT), 4-monometoxitritiloxi (MMT), y tritiloxi, 9-(9-fenil)xantenpoxi (pixilo) opcionalmente sustituido, metoxitetrahidropiraniloxi (mthp) opcionalmente sustituido, sililoxi como por ejemplo trimetilsililoxi (TMS), triisopropilsililoxi (TIPS), terc-butildimetilsililoxi (TBDMS), trietilsililoxi, y fenildimetilsililoxi, terc-butiléteres, acetales, (que incluyen dos grupos hidroxi), aciloxi como por ejemplo acetilo o acetilos sustituidos con halógeno, por ejemplo cloroacetiloxi o fluoroacetiloxi, isobutiriloxi, pivaloiloxi, benzoiloxi y benzoílos sustituidos, metoximetiloxi (MOM), benciléteres o benciléteres sustituidos como por ejemplo 2,6-diclorobenciloxi (2,6-CI_{2}Bzl). De forma alternativa cuando Z o Z* es hidroxilo, pueden protegerse mediante la unión a un soporte sólido opcionalmente a través de un enlazador.

Cuando Z o Z* son grupos amino, los ejemplos ilustrativos del grupo protector de amino son fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), terc-butiloxicarbonilamino (BOC), trifluoroacetilamino, aliloxicarbonilamino (alloc, AOC), Z benciloxicarbonilamino (Cbz), benciloxicarbonilaminos sustituidos como por ejemplo 2-cloro benciloxicarbonilamino (2-CIZ), monometoxitritilamino (MMT), dimetoxitritilamino (DMT), ftaloilamino, y 9-(9-fenil)xantenilamino (pixilo).

En la realización anterior, Act designa un grupo de activación para -OH, -SH, y -NH(R^{H}), respectivamente. Dichos grupos de activación, por ejemplo, se seleccionan de O-fosforamidita opcionalmente sustituida, O-fosfotriéster opcionalmente sustituido, O-fosfodiéster opcionalmente sustituido, H-fosfonato opcionalmente sustituido, y O-fosfonato opcionalmente sustituido.

En el presente contexto, el término "fosforamidita" quiere decir un grupo de la fórmula -P(OR^{X})-N(R^{y})_{2}, en la que R^{x} designa un grupo alquilo opcionalmente sustituido, por ejemplo, metilo, 2-cianoetilo, o bencilo; y cada uno de R^{y} designa grupos alquilo opcionalmente sustituidos, por ejemplo etilo o isopropilo, o el grupo -N(R^{y})_{2} forma un grupo morfolino (-N(CH_{2}CH_{2})_{2}O). R^{X} preferiblemente designa 2-cianoetilo y los dos R^{y} son preferiblemente idénticos y designan isopropilo. Así, una fosforamidita especialmente relevante es N,N-diisopropil-O-(2-cianoetil)fosforamidita.

B constituye una nucleobase natural o no natural que se selecciona de entre adenina, citosina, 5-metilcitosina, isocitosina, pseudoisocitosina, guanina, timina, uracilo, 5-bromouracilo, 5-propiniluracilo, 5-propinil-6-fluoroluracilo, 5-metiltiazoluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, 2,6- diaminopurina, -7-propina-7-desazadenina, 7-propina-7-desazaguanina, 2-cloro-6-aminopurina.

Las estructuras bicíclicas particularmente preferidas se muestran en el Esquema 3 siguiente:

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Esquema 3

4

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en las que

Y es -O-, -S-, -NH-, o N(R^{H}),

Z y Z* de forma independiente están ausentes, se seleccionan entre un enlace internucleosídico, un grupo terminal o un grupo protector. En realizaciones en las que al menos uno de los nucleótidos de LNA está en el extremo 3', en dicha posición Z es un grupo terminal y Z* es un enlace internucleosídico. En realizaciones en las que al menos uno de los nucleótidos de LNA está en el extremo 5', en dicha posición Z está ausente y Z* es un grupo terminal. Dentro de la secuencia de nucleótidos, Z está ausente y Z* es un enlace internucleosídico.

El enlace internucleotídico puede ser -O-P(O)_{2}-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)_{2}-O-, -S-O(O)_{2}-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)_{2}-O-, -O-P(O)-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)_{2}-S-, -O-PO(R^{H})-O-, O-PO(OCH_{3})-O-, -O-PO(NR^{H})-O-, -O-PO (OCH_{2}
CH_{2}S-R)-O-, -O-PO(BH_{3})-O-, -O-PO(NHR^{H})-O-, -O-P(O)_{2}-NR^{H}-, -NR^{H}-P(O)_{2}-O-, -NR^{H}-CO-O-, donde R^{H} se selecciona a partir de hidrógeno y alquilo C_{1-4}.

Los grupos terminales se seleccionan de forma independiente de entre hidrógeno, azido, halógeno, ciano, nitro, hidroxi, Prot-O-, Act-O-, mercapto, Prot-S-, Act-S-, (alquil C_{1-6})tio, amino, Prot-N(R^{H})-, Act-N(R^{H})-, mono- o di(alquil C_{1-6})amino, alcoxi C_{1-6} opcionalmente sustituido, alquilo C_{1-6} opcionalmente sustituido, monofosfato opcionalmente sustituido, monotiofosfato, difosfato, ditiofosfato, trifosfato, tritiofosfato, donde Prot es un grupo protector para -OH, -SH, y -NH(R^{H}), respectivamente, Act es un grupo de activación para -OH, -SH, y -NH(R^{H}), respectivamente, y R^{H} se selecciona a partir de hidrógeno y alquilo C_{1-4}.

Los grupos de protección de los sustituyentes hidroxi comprenden tritilo sustituido, como por ejemplo 4,4'-dimetoxitritiloxi (DMT), 4-monometoxitritiloxi (MMT), 9-(9-fenil)xanteniloxi (pixilo) opcionalmente sustituido, metoxitetrahidropiraniloxi (mthp) opcionalmente sustituido, sililoxi como por ejemplo trimetilsililoxi (TMS), triisopropilsililoxi (TIPS), terc-butildimetilsililoxi (TBDMS), trietilsililoxi, y fenildimetilsililoxi, terc-butiléteres, acetales (que incluyen dos grupos hidroxi), aciloxi como por ejemplo acetilo. De forma alternativa cuando Z o Z* es hidroxilo, pueden protegerse uniéndolos a un soporte sólido opcionalmente a través de un enlazador.

Las unidades de LNA específicamente preferidas se muestran en el esquema 4.

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Esquema 4

5

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Cuando Z o Z* es un grupo amino, los ejemplos ilustrativos de la protección de amino son fluorenilmetoxicarbonilamino (Fmoc), terc-butiloxicarbonilamino (BOC), trifluoroacetilamino, aliloxicarbonilamino (alloc, AOC), monometoxitritilamino (MMT), dimetoxitritilamino (DMT), ftaloilamino.

En las realizaciones anteriores, Act designa un grupo de activación para -OH, -SH, y -NH(R^{H}), respectivamente. Dichos grupos de activación, por ejemplo, se seleccionan de O-fosforamidita opcionalmente sustituida, O-fosfotriéster opcionalmente sustituido, O-fosfodiéster opcionalmente sustituido, H-fosfonato opcionalmente sustituido, y O-fosfonato opcionalmente sustituido.

En el presente contexto, el término "fosforamidita" quiere decir un grupo de la fórmula -P(OR^{x})-N(Ry)_{2}, en el que R^{x} designa un grupo alquilo opcionalmente sustituido, por ejemplo metilo, 2-cianoetilo, y cada uno de R^{y} designa grupos alquilo opcionalmente sustituidos, R^{x} preferiblemente designa 2-cianoetilo y los dos R^{y} son preferiblemente idénticos y designan isopropilo. Así, una fosforamidita especialmente relevante es N,N-diisopropil-O-(2-cianoetil)fosforamidita.

B, en el contexto de los Esquemas 3 y 4, constituye una nucleobase natural o no natural y se selecciona de entre adenina, citosina, 5-metilcitosina, isocitosina, pseudoisocitosina, guanina, timina, uracilo, 5-bromouracilo, 5-propiniluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, diaminopurina, 2-cloro-6-aminopurina.

Una persona de experiencia en la técnica apreciará que los compuestos oligoméricos que contienen LNA pueden usarse para combatir las enfermedades relacionadas con survivina mediante muchos principios diferentes, que así entran dentro del espíritu de la presente invención.

Por ejemplo, los compuestos oligoméricos de LNA pueden diseñare en forma de inhibidores no codificantes, que son ácidos nucleicos monocatenarios que previenen la producción de una proteína que provoca una enfermedad, interviniendo a nivel del ARNm. También, pueden diseñarse en forma de Ribozimas u Oligozimas que son oligonucleótidos no codificantes que además de los dominio(s) que se une(n) a la diana comprenden una actividad catalítica que degrada el ARNm diana (ribozimas) o comprenden una secuencia de guía externa (EGS) que recluta una enzima endógena (ARNasa P) que degrada el ARNm diana (oligozimas)

Del mismo modo los compuestos oligoméricos de LNA pueden diseñarse como siARN que son moléculas de ARN bicatenarias pequeñas que usan las células para silenciar genes endógenos o exógenos específicos mediante un mecanismo "de tipo no codificante" que todavía no se comprende muy bien.

Los compuestos oligoméricos de LNA también pueden diseñarse en forma de aptámeros (y una variación de los mismos, denominada Spiegelmeros) que son ácidos nucleicos que a través de enlaces de hidrógeno intramoleculares adoptan estructuras tridimensionales que les permiten unirse y bloquear sus dianas biológicas con afinidad y especificidad elevadas. También, los compuestos oligoméricos de LNA pueden diseñarse como señuelos, que son ácidos nucleicos bicatenarios pequeños que evitan que los factores de transcripción celular transactiven sus genes dianas bloqueando de forma selectiva su sitio de unión del ADN.

Además, los compuestos oligoméricos de LNA pueden diseñarse como quimeraplastos, que son ácidos nucleicos monocatenarios pequeños que son capaces de emparejarse de forma específica y alterar una secuencia de un gen diana. Los compuestos oligoméricos que contienen LNA que explotan este principio por lo tanto pueden ser particularmente útiles para tratar enfermedades relacionadas con survivina que son provocadas por una mutación en el gen de
survivina.

Dictado en parte por el principio terapéutico por el que se pretende que funcione el oligonucleótido, los compuestos oligoméricos de LNA de acuerdo con esta invención preferiblemente comprenden de aproximadamente 8 a aproximadamente 60 nucleobases es decir de aproximadamente 8 a aproximadamente 60 nucleótidos unidos. Los compuestos particularmente preferidos son los oligonucleótidos no codificantes que comprenden de aproximadamente 12 a aproximadamente 30 nucleobases y lo más preferiblemente son compuestos no codificantes que comprenden aproximadamente 12-20 nucleobases. Los compuestos que se muestran en las Tablas 1 y 2 son todos 16-meros.

En referencia a los anteriores principios por los que un compuesto oligomérico de LNA puede provocar su acción terapéutica, la diana de la presente invención puede ser el gen, el ARNm o la proteína de la survivina. En la realización más preferida los compuestos oligoméricos de LNA se diseñan en forma de un inhibidor no codificante dirigido contra el pre-ARNm de survivina o el ARNm de survivina. Los oligonucleótidos pueden hibridarse en cualquier sitio a lo largo del pre-ARNm o ARNm de survivina como por ejemplo los sitios de la secuencia líder no traducida 5', exones, intrones y la cola no traducida 3'.

En una realización preferida, el oligonucleótido se hibrida con una porción del pre-ARNm o ARNm de survivina humana que comprende el sitio de iniciación de la traducción. Más preferiblemente, el oligonucleótido de survivina comprende una secuencia CAT, que es complementaria a la secuencia de iniciación AUG de del pre-ARNm o ARNm de survivina. En otra realización, el oligonucleótido de survivina se hibrida a una porción del sitio de ayuste del donante del pre-ARNm de survivina humana. Todavía en otra realización, el oligonucleótido de survivina se hibrida a una porción del sitio de ayuste del receptor del pre-ARNm de survivina humana. En otra realización, el oligonucleótido de survivina se hibrida a porciones del pre-ARNm o ARNm de survivina humana implicadas en la poliadenilación, el transporte o la degradación.

El experto apreciará que los oligonucleótidos preferidos son los que se hibridan a una porción del pre-ARNm o ARNm de survivina cuya secuencia no se encuentra habitualmente en los tránscritos de genes no relacionados, de forma que se mantenga la especificidad del tratamiento.

El compuesto oligomérico de la invención se diseña de forma que sea lo suficientemente complementario a la diana para proporcionar la respuesta clínica deseada, por ejemplo el compuesto oligomérico debe unirse con una potencia y especificidad suficientes a su diana para proporcionar el efecto deseado. En una realización, dicho compuesto que modula survivina se diseña de forma que también module otros ácidos nucleicos específicos que no codifican
survivina.

Se prefiere que el compuesto oligomérico de acuerdo con la invención se diseñe de forma que se evite la hibridación intra e intermolecular del oligonucleótido.

En muchos casos, la identificación de un compuesto oligomérico de LNA eficaz para modular la actividad de survivina in vivo o clínicamente se basa en la información de la secuencia del diana. Sin embargo, una persona de experiencia ordinaria en la técnica apreciará que dichos compuestos oligoméricos también pueden identificarse mediante pruebas empíricas. Por lo tanto, los compuestos oligoméricos contra survivina que tienen, por ejemplo, menor homología entre las secuencias, más o menos nucleótidos modificados, o longitudes mayores o menores, que los de las realizaciones preferidas, pero que sin embargo demuestran respuestas en los tratamientos clínicos, también están dentro del alcance de la invención.

En una realización de la invención, los compuestos oligoméricos son fármacos no codificantes adecuados. El diseño de un fármaco no codificante potente y seguro requiere el ajuste de diversos parámetros como por ejemplo la afinidad/especificidad, estabilidad en fluidos biológicos, captación celular, modo de acción, propiedades farmacocinéticas y toxicidad.

Afinidad & especificidad: LNA con un enlace oximetileno 2'-O, 4'-C (\beta-D-oxi-LNA), muestra unas propiedades de unión sin precedentes hacia secuencias de ADN y ARN diana. Del mismo modo, los derivados de LNA, como por ejemplo amino-, tio- y oc-L-oxi-LNA presentan afinidades sin precedentes hacia los ARN y ADN complementarios y en el caso de tio-LNA, la afinidad hacia ARN es todavía mejor que con el \beta-D-oxi-LNA.

Además de estas notables propiedades de hibridación, los monómeros de LNA pueden mezclarse y actuar de forma cooperativa con monómeros de ADN y ARN, y con otros análogos de ácido nucleico, como por ejemplo monómeros de ARN con modificación 2'-O-alquilo. Por lo tanto, los oligonucleótidos de la presente invención pueden estar compuestos en su totalidad por \beta-D-oxi-monómeros de LNA o pueden estar compuestos por \beta-D-oxi-LNA en cualquier combinación con ADN, ARN o análogos de ácidos nucleicos contemporáneos que incluyen derivados de LNA como por ejemplo amino-, tio- y \alpha-L-oxi-LNA. La afinidad de unión sin precedentes de LNA por las secuencias de ADN o ARN diana y su capacidad de mezclarse libremente con ADN, ARN y un abanico de análogos de ácidos nucleicos contemporáneos tiene un abanico de consecuencias importantes de acuerdo con la invención para el desarrollo de compuestos no codificantes eficaces y seguros.

Primeramente, una realización de la invención permite un acortamiento considerable de la longitud habitual de los oligos no codificantes habituales (de 20-25 meros a, por ejemplo, 12-16 meros) sin poner en peligro la afinidad necesaria para la actividad farmacológica. Dado que la especificidad intrínseca de un oligo es inversamente proporcional a su longitud, un acortamiento así aumentaría significativamente la especificidad del compuesto no codificante hacia su ARN diana. Una realización de la invención es, debido a que la secuencia del genoma humano está disponible y la anotación de sus genes está progresando rápidamente, identificar las secuencias únicas lo más cortas posibles en el ARNm diana.

En otra realización, el uso de LNA para reducir el tamaño de los oligos facilita significativamente el proceso y coste de la fabricación, proporcionando así la base para que la terapia no codificante pueda convertirse en una oferta de tratamiento comercialmente competitiva para una diversidad de enfermedades.

En otra realización, puede usarse la afinidad sin precedentes del LNA para potenciar sustancialmente la capacidad de un oligo no codificante de hibridarse a su ARNm diana in vivo, reduciendo así significativamente el tiempo y esfuerzo necesarios para identificar un compuesto activo comparado con la situación con otros compuestos químicos.

En otra realización, la afinidad de LNA sin precedentes se usa para mejorar la potencia de los oligonucleótidos no codificantes permitiendo así desarrollar compuestos con márgenes terapéuticos más favorables que los que se están probando en ensayos clínicos actualmente.

Cuando se diseñan en forma de inhibidor no codificante, los oligonucleótidos de la invención se unen al ácido nucleico diana y modulan la expresión de su proteína cognada. Preferiblemente, dicha modulación produce una inhibición de la expresión de al menos 10% o 20% comparada con el nivel de expresión normal, más preferiblemente al menos una inhibición de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% del nivel de expresión normal.

Habitualmente, los oligonucleótidos de LNA de la invención contendrán otros restos distintos de \beta-D-oxi-LNA como por ejemplo monómeros de ADN, monómeros de ARN nativos, N3'-P5' fosforoamidatos, 2'-F, 2'-O-Me, 2'-O-metoxietil (MOE), 2'-O-(3-aminopropil) (AP), ácido hexitolnucleico (HNA), ácido 2'-F-arabinonucleico (2'-F-ANA) y D-ciclohexenil nucleósido (CeNA). También, el oligonucleótido modificado con \beta-D-oxi-LNA puede contener también otras unidades de LNA además o en lugar de un grupo oxi-LNA. En particular, las unidades de LNA adicionales preferidas incluyen monómeros de tio-LNA o amino-LNA en las configuraciones D-p o L-\alpha o sus combinaciones o ena-LNA. En general, un oligonucleótido de LNA modificado contendrá al menos aproximadamente 5, 10, 15 ó 20 por ciento de unidades de LNA, basándose en los nucleótidos totales del oligonucleótido, más habitualmente al menos aproximadamente 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ó 90 por ciento de unidades de LNA, basándose en las bases totales del oligonucleótido.

Estabilidad en fluidos biológicos: Una realización de la invención incluye la incorporación de monómeros de LNA a un oligonucleótido de ADN o ARN estándar para aumentar la estabilidad del compuesto oligomérico resultante en los fluidos biológicos por ejemplo aumentando la resistencia contra las nucleasas (endonucleasas y exonucleasas). La magnitud de la estabilidad dependerá del número de monómeros de LNA que se use, de su posición en el oligonucleótido y del tipo de monómero de LNA que se use. Comparando con ADN y fosforotioatos, puede establecerse el siguiente orden de capacidad de estabilizar un oligonucleótido contra la degradación nucleolítica: ADN << fosforotioatos < oxi-LNA < \alpha-L-LNA < amino-LNA < tio-LNA.

Considerando el hecho de que el LNA es compatible con la síntesis de ADN estándar y se mezcla libremente con muchos análogos de ácidos nucleicos contemporáneos, la resistencia a las nucleasas de los compuestos oligoméricos de LNA puede mejorarse además de acuerdo con la invención o bien incorporando otros análogos que presenten una mayor estabilidad contra las nucleasas o explotando los enlaces internucleosídicos resistentes a nucleasas por ejemplo los enlaces de fosforomonotioato, fosforoditioato, y metilfosfonato, etc.

Modo de acción: Los compuestos no codificantes de acuerdo con la invención pueden desarrollar su acción terapéutica mediante una variedad de mecanismos y pueden ser capaces de combinar varios de estos en el mismo compuesto. En una situación, la unión del oligonucleótido a su diana (pre-ARNm o ARNm) actúa previniendo la unión de otros factores (proteínas, otros ácidos nucleicos, etc.) necesarios para el funcionamiento adecuado de la diana es decir funcionan por impedimento estérico. Por ejemplo, el oligonucleótido no codificante puede unirse a los motivos de una secuencia o bien en el pre-ARNm o bien en el ARNm que son importantes para el reconocimiento y la unión de factores que actúan en trans implicados en el ayuste,poliadenilación, transporte celular, modificaciones postranscripcionales de los nucleósidos del ARN, caperuza del extremo 5', traducción, etc. En el caso del ayuste de pre-ARNm, el resultado de la interacción entre el oligonucleótido y su diana puede ser la supresión de la expresión de una proteína no deseada, la generación de ARNm con ayustes alternativos que codifican una proteína deseada o ambos.

En otra realización, la unión del oligonucleótido a su diana inhabilita el proceso de traducción creando un bloqueo físico en la maquinaria ribosómica, es decir la terminación de la traducción.

Todavía en otra realización, la unión del oligonucleótido a su diana interfiere con la capacidad del ARN de adoptar estructuras secundarias y de mayor orden que son importantes para su funcionamiento adecuado, es decir interferencia estructural. Por ejemplo, el oligonucleótido pueden interferir con la formación de estructuras de horquilla que desempeñan papeles cruciales en diferentes funciones, como por ejemplo proporcionar una estabilidad adicional al ARN o adoptar motivos de reconocimiento esenciales para diferentes proteínas.

Todavía en otra realización, la unión del oligonucleótido inactiva la diana para que no pueda realizar más procesos metabólicos, reclutando las enzimas celulares que degradan el ARNm. Por ejemplo, el oligonucleótido puede comprender un segmento de nucleósidos que tienen la capacidad a reclutar la ribonucleasa H (RNasaH) que degrada la parte de ARN de un dúplex de ADN/ARN. Del mismo modo, el oligonucleótido puede comprender un segmento que recluta ARNsas bicatenarias, como por ejemplo ARNasalll o puede comprender una secuencia de guía externa (EGS) que recluta una enzima endógena (ARNasa P) que degrada el ARNm diana también. El oligonucleótido puede comprender un motivo de secuencia que muestre actividad catalítica de ARNsa o pueden unirse restos a los oligonucleótidos que cuando se aproximen a la diana mediante el evento de hibridación incapacite a la diana para realizar otras actividades metabólicas.

Se ha demostrado que \beta-D-oxi-LNA no realiza actividad de RNasaH. Sin embargo, esto puede cambiarse de acuerdo con la invención creando oligonucleótidos quiméricos compuestos por \beta-D-oxi-LNA y ADN, denominados gapmeros. Un gapmero se basa en un tramo central de 4-12 nt de ADN o monómeros modificados que pueden ser reconocidos y escindidos por la ARNasaH (el hueco o gap) habitualmente flanqueado por de 1 a 6 restos de \beta-D-oxi-LNA (los flancos). Los flancos también pueden construirse con derivados de LNA. Existen otras construcciones quiméricas de acuerdo con la invención que son capaces de actuar mediante un mecanismo mediado por ARNasaH. El encabezado se define por un tramo contiguo de \beta-D-oxi-LNA o derivados de LNA en el extremo 5' seguido de un tramo contiguo de ADN o monómeros modificados que pueden ser reconocidos y escindidos por la ARNasaH hacia el extremo 3', y un talimero se define por un tramo contiguo de ADN o monómeros modificados que pueden ser reconocidos y escindidos por la ARNasaH en el extremo 5' seguido de un tramo contiguo de \beta-D-oxi-LNA o derivados de LNA hacia el extremo 3'. Otras quimeras de acuerdo con la invención, denominadas mixmeros constituidos por una composición alternativa de ADN o monómeros modificados que pueden ser reconocidos y escindidos por ARNasaH y \beta-D-oxi-LNA y/o derivados de LNA también podrían ser capaces de mediar la unión de la ARNasaH y la escisión. Dado que \alpha-L-LNA recluta la actividad de la ARNasaH en cierto grado, pueden ser necesarios unos huecos de ADN menores o monómeros modificados que puedan ser reconocidos y escindidos por la ARNasaH para la construcción de gapmero, y podría introducirse una mayor flexibilidad en la construcción del mixmero. La Figura 1 muestra un esquema de diferentes diseños de acuerdo con la invención.

La eficacia clínica de los oligonucleótidos no codificantes depende en un grado significativo de su farmacocinética por ejemplo absorción, distribución, captación celular, metabolismo y excreción. A su vez, estos parámetros son guiados de forma significativa por los grupos químicos subyacentes y por el tamaño y estructura tridimensional del oligonucleótido.

Tal como se menciona anteriormente, el LNA de acuerdo con la invención no es un único tipo de grupo químico, sino varios relacionados, que aunque molecularmente diferentes todos muestran una afinidad impactante hacia ADN y ARN complementarios. Así, la familia de grupos químicos de LNA se adecua de forma única para el desarrollo de oligos de acuerdo con la invención con propiedades farmacocinéticas a medida que explotan o bien la elevada afinidad de LNA para modular el tamaño de los compuestos activos o que explota los diferentes grupos químicos de LNA para modular la composición molecular exacta de los compuestos activos. En este último caso, el uso por ejemplo de amino-LNA en lugar de oxi-LNA cambiará la carga global del oligo y afectará al comportamiento de captación y distribución. Del mismo modo, el uso tio-LNA en lugar de oxi-LNA aumentará la capacidad lipófila del oligonucleótido y así influirá sobre su

\hbox{capacidad de
pasar a través de barreras lipófilas como por ejemplo  la membrana
celular.}

La modulación de las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido de LNA de acuerdo con la invención puede lograrse además uniendo una variedad de restos diferentes. Por ejemplo, la capacidad de los oligonucleótidos de pasar la membrana celular puede mejorarse uniendo por ejemplo restos lipídicos como por ejemplo un resto de colesterol, un tioéter, una cadena alifática, un fosfolípido o una poliamina al oligonucleótido. Del mismo modo, la captación de oligonucleótidos de LNA a la células puede potenciarse conjugando restos al oligonucleótido que interactúa con las moléculas de la membrana, que actúa de mediadora del transporte al citoplasma.

Las propiedades farmacodinámicas pueden mejorarse de acuerdo con la invención con grupos que mejoren la captación de oligómeros, que potencien la bioestabilidad como por ejemplo que potencien la resistencia a la degradación de los oligómeros, y/o que aumente la especificidad y afinidad de las características de hibridación de los oligonucleótidos con una secuencia diana por ejemplo una secuencia de mRMA.

Existen básicamente dos tipos de toxicidad asociada a los oligos no codificantes: la toxicidad dependiente de la secuencia, que implica la secuencia base, e independiente de secuencia, toxicidad relacionada con la clase. A excepción de los temas relacionados con la inmunoestimulación por los motivos de las secuencias de CpG nativas, las toxicidades que han sido más destacadas en el desarrollo de los oligonucleótidos no codificantes son independientes de la secuencia, por ejemplo relacionados con la naturaleza química del oligonucleótido y la dosis, modo, frecuencia y duración de la administración. La clase de fosforotioatos de los oligonucleótidos se ha caracterizado particularmente bien y se ha encontrado que provocan un número de efectos adversos como por ejemplo activación de complemento, prolongación del PTT (tiempo a tromboplastina parcial), trombocitopenia, hepatotoxicidad (elevación de las enzimas hepáticas), cardiotoxicidad, esplenomegalia e hiperplasia de las células reticuloendoteliales.

Tal como se menciona anteriormente, la familia de grupos químicos de LNA proporciona una afinidad sin precedentes, una bioestabilidad muy elevada y la capacidad de modular la composición molecular exacta del oligonucleótido. En una realización de la invención, los compuestos que contienen LNA permiten desarrollar oligonucleótidos que combinan una potencia elevada con pocos - o ningún - enlace de fosforotioato y que son por lo tanto es posible que presenten una mejor eficacia y seguridad que los compuestos no codificantes contemporáneos.

Los oligo y polinucleótidos de la invención pueden producirse usando las técnicas de polimerización de la química de los ácidos nucleicos notoria para una persona de experiencia ordinaria en la técnica de la química orgánica. Generalmente, se usan ciclos de oligomerización de la la estrategia de fosforamidita (S. L. Beaucageand R. P. Iyer, Tetrahedron, 1993,49, 6123; S. L. Beaucage y R. P. Iyer, Tetrahedron, 1992, 48,2223) pero también puede usarse, por ejemplo, la química de H-fosfonato, la química de fosfotriéster.

Para algunos monómeros de la invención, se usó un tiempo de acoplamiento mayor y/o acoplamientos repetidos con reactivos nuevos y/o reactivos de acoplamiento más concentrados. Las fosforamiditas empleadas se acoplaron con rendimientos de acoplamiento por etapas satisfactorios >95%. La tiolación del fosfato se realiza intercambiando la oxidación normal, por ejemplo yodo/piridina/H_{2}O, que se usa para la síntesis de oligómeros de fosfodiéster por oxidación usando reactivo de Beaucage (disponible comercialmente). También se engloban otros reactivos de sulfuración. Los oligómeros de LNA de fosforotioato se sintetizaron de forma eficaz con rendimientos de acoplamiento por etapas >= 98%.

Los \beta-D-amino-LNA, los oligonucleótidos de \beta-D-tio-LNA, \alpha-L-LNA y oligonucleótidos de \beta-D-metilamino-LNA también se sintetizaron de forma eficaz con rendimientos de acoplamiento por etapas > 98% usando los procedimientos de fosforamidita.

La purificación de compuestos oligoméricos de LNA se realizó usando cartuchos de purificación de fase inversa desechables y/o HPLC de fase inversa y/o precipitación con etanol o butanol. Se usó electroforesis en gel en capilares, HPLC de fase inversa, EM por MALDI, y EM por IES para verificar la pureza de los oligonucleótidos sintetizados. Además, los materiales de soporte sólido que tienen inmovilizados sobre ellos un LNA opcionalmente con nucleobases protegidas y opcionalmente con 5'-OH protegido son especialmente interesantes como material para la síntesis de compuestos oligoméricos que contienen LNA, en los que un monómero de LNA está incluido en el extremo 3'. En este caso, el material de soporte sólido es preferiblemente CPG, por ejemplo un material de CPG o polistireno fácilmente (comercialmente) disponibles sobre los que se liga un LNA con funcionalidades en 3', opcionalmente con nucleobases protegidas y opcionalmente con 5'-OH usando las condiciones que indica el suministrador de ese material particular.

Como debe haber quedado claro ya, un aspecto interesante de la invención se refiere a un compuesto de la invención o un conjugado de la invención para usar como medicamento. Como tampoco debe ser ambiguo ya, el uso de un compuesto de la invención o un conjugado de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer es un aspecto particularmente interesante de la invención.

La composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede usarse para el tratamiento de muchas enfermedades diferentes. Por ejemplo se ha encontrado que la survivina está hiperexpresada en tumores de pulmón humanos (Monzo et al.,1999, J. Clin. Oncol 17, 2100-2104), mama (Tanaka et al., 2000, Clin. Cancer Res. 6, 127-134; Nasu et al., 2002, Anticancer Res. 22,1839-1844), colon/recto (Kawasaki et al., 1998, Cancer Res. 58, 5071 -5074; Rodel et al., 2002, Strahlenther. Onkol. 8,426-434), estómago (Lu et al., 1998, Cancer Res. 58,1808-1812; Tsuburaya et al., 2002, Hepatogastroenterology 49, 1150-1152), esófago (Kato et al., 2001, Int. J. Cancer 95, 92-95; Ikeguchi y Kaibara, 2002, Br. J. Cancer 87, 883-887), páncreas (Satoh et al., 2001, Cancer 92, 271-278; Sarela et al., 2002, Br. J. Cancer 86, 886-892), hígado (Ikeguchi et al., 2002, Clin. Cancer Res. 8,3131-3136), útero (Saitoh et al., 1999, Int. J. Oncol. 15, 137-141; Takai et al., 2002, Cancer Lett. 184, 105-116), ovarios (Yoshoda et al., 2001, Int. J. Oncol. 19, 537-542; Takai et al., 2002, Int. J. Mol. Med. 10,211-216), enfermedad de Hodgkin (Garcia et al., 2003, Blood 101, 681-689), linfoma no de Hodgkin (Adida et al., 2000, Blood 96, 1921-1925.; Kuttler et al., 2002, Leukemia 16, 726-735), leucemias (Adida et al., 2000, Br. J. Haematol. 111, 196-203.; Kamihira et al., 2001, Br. J. Haematol. 114, 63-69; Mori et al., 2001, Int. J. Haematol. 75, 161 -165), neuroblastoma (Islam et al., 2000, Oncogene 19,617-623; Adida et al., 1998, Lancet 351, 882-883), feocromocitoma (Koch et al., 2002, Eur. J. Endocrinol. 146, 381-388), sarcomas de tejidos blandos (WiJrl et al., 2002, Lancet 359, 943-945), gliomas (Chakravarti et al. 2002, J. Clin. Oncol. 20, 1063-1068), melanoma (Grossman et al., 1999, J. Invest. Dermatol. 113, 1076-1081), vejiga (Swana et al., 1999, New Engl. J. Med. 341, 452-453; Smith et al., 2001, JAMA285,324-328), cuello de útero (Kim et al., 2002, Anticancer Res. 22, 805-808; Yoshida et al., 2003, Oncol. Rep. 10,45-49), próstata (Ambrosini et al., 1997, Nat. Med. 3, 917-921). Al igual que las células cancerosas, las células endoteliales vasculares en proliferación son sensibles a la regulación por disminución de la expresión de survivina. La composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede usarse por lo tanto en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por enfermedad anormal que provoque angiogénesis. Los ejemplos de dichas enfermedades son cánceres en general y aterosclerosis, soriasis, retinopatía diabética, artritis reumatoide, asma, verrugas, dermatitis alérgica y sarcoma de Karposi. Además, la survivina puede estar implicada de forma activa en la regulación de la viabilidad celular durante la infección por HIV-1 (Zhu et al., 2003, Apoptosis 8, 71 -79). La survivina es esencial para la ejecución correcta de la mitosis y para completar la división celular. La regulación por disminución de la survivina debería por lo tanto ser relevante en el tratamiento de cualquier enfermedad caracterizada por el desarrollo incontrolado o anormal de las células.

Expresado de forma general, un aspecto del componente de la invención se usa en un procedimiento de tratar un mamífero que padece o que es susceptible de padecer una enfermedad provocada por la angiogénesis anormal, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligonucleótido dirigido contra survivina que comprende una o más unidades de LNA.

Un aspecto interesante de la invención se refiere al uso de un compuesto tal como se define en el presente documento o un conjugado tal como se define en el presente documento para la preparación de un medicamento para el tratamiento de aterosclerosis, soriasis, retinopatía diabética, artritis reumatoide, asma, verrugas y dermatitis alérgica.

Los compuestos de la invención preferiblemente se emplean para el tratamiento o la profilaxis contra enfermedades provocadas por el cáncer, particularmente para el tratamiento del cáncer que puede darse en tejidos como por ejemplo cáncer de pulmón, mama, colon, próstata, páncreas, hígado, cerebro, testículos, estómago, intestino, intestino grueso, médula espinal, senos, tracto urinario u ovarios.

Además, los compuestos de la invención que se describen en el presente documento pueden usarse en un procedimiento de prevenir o tratar el cáncer que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto oligomérico que modula la survivina, que incluye pero sin limitación dosis elevadas del oligómero, a un ser humano que necesite dicha terapia. Los compuestos de la invención puede usarse además durante un corto periodo de administración de un compuesto oligomérico que modula la survivina. Las células normales no cancerosas se dividen con una frecuencia característica para el tipo de célula particular. Cuando una célula se transforma a un estado canceroso, se produce una proliferación celular incontrolada y una menor muerte celular y, por lo tanto, una división celular o proliferación celular promiscuo en un sello de identidad de un tipo celular canceroso. Los ejemplos de tipos de cáncer, incluyen, pero sin limitación, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemia (por ejemplo, leucemia aguda como por ejemplo leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple), carcinoma de colon, carcinoma rectal, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de las vías biliares, coriocarcinoma, cáncer de cuello de útero, cáncer testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de vejiga, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cerebro, cánceres de foco primario desconocido, neoplasmas, cánceres del sistema nervioso periférico, cánceres del sistema nervioso central, tumores (por ejemplo, fibrosarcoma, miosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteógeno, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de las glándulas sudoríparas, carcinoma de las glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncógeno, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, carcinoma microcítico de pulmón, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, neuroblastoma, y retinoblastoma), enfermedad de cadenas pesadas, metástasis, o cualquier enfermedad o trastorno caracterizado por la proliferación celular incontrolado o anormal.

En el uso de un compuesto de la invención o un conjugado de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, dicho cáncer de forma adecuada puede estar en forma de un tumor sólido. Además, dicho cáncer de forma adecuada epitelial un carcinoma. El carcinoma habitualmente se selecciona a partir del grupo constituido por melanoma maligno, carcinoma de células basales, carcinoma de ovarios, carcinoma de mama, cáncer de pulmón amicrocítico, carcinoma de células renales, carcinoma de vejiga, carcinoma de vejiga superficial recurrente, carcinoma de estómago, carcinoma de próstata, carcinoma pancreático, carcinoma de pulmón, carcinoma de cuello de útero, displasia de cuello de útero, papilomatosis laríngea, carcinoma de colon, carcinoma colorectal y tumores carcinoides. Más habitualmente, dicho carcinoma se selecciona a partir del grupo constituido por melanoma maligno, cáncer de pulmón amicrocítico, carcinoma de mama, carcinoma de colon y carcinoma de células renales. El melanoma maligno habitualmente se selecciona a partir del grupo constituido por melanoma de extensión superficial, melanoma nodular, melanoma lentiginoso maligno, melagnoma acral, melanoma amelanótico y melanoma desmoplástico.

De forma alternativa, el cáncer de forma adecuada puede ser un sarcoma. El sarcoma habitualmente está en la forma que se selecciona a partir del grupo constituido por osteosarcoma, sarcoma de Ewing, condrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, fibrosarcoma y sarcoma de Kaposi.

De forma alternativa, el cáncer de forma adecuada puede ser un glioma.

Debería entenderse que la invención también se refiere a una composición farmacéutica, que comprende al menos una construcción de oligonucleótido no codificante de la invención como principio activo. Debería entenderse que la composición farmacéutica de acuerdo con la invención opcionalmente comprende un vehículo farmacéutico, y que la composición farmacéutica opcionalmente comprende otros compuestos no codificantes, compuestos quimioterapéuticos, compuestos antiinflamatorios, compuestos antivirales y/o compuestos inmunomoduladores.

El compuesto oligomérico comprendido en esta invención puede emplearse en una variedad de sales farmacéuticamente aceptables. Tal como se usa en el presente documento, el término se refiere a sales que mantienen la actividad biológica deseada de los compuestos que se identifican en el presente documento y exhiben efectos toxicológicos indeseados mínimos. Los ejemplos no limitantes de dichas sales pueden formarse con sales de adición de aminoácidos orgánicos y de bases que se forman con cationes metálicos como por ejemplo cinc, calcio, bismuto, bario, magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio, sodio, potasio, y similares, o con un catión formado por amoniaco, N,N-dibenciletilen-diamina, D-glucosamina, tetraetilamonio, oretilendiamina; o (c) combinaciones de (a) y (b); por ejemplo, una sal de estannato de cinc o similares.

En una realización de la invención el compuesto oligomérico o conjugado puede estar en forma de profármaco. Los oligonucleótidos son por su propia naturaleza iones con carga negativa. Debido a la naturaleza lipófila de las membranas celulares, la captación celular de oligonucleótidos es reducida comparada con los equivalentes neutros o lipófilos. Este "impedimento" de la polaridad puede evitarse usando la estrategia de los profármacos (véase por ejemplo Crooke, R. M. (1998) en Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlín, Alemania, vol. 131, páginas 103-140). En esta estrategia, los oligonucleótidos se preparan de forma protegida de forma que el oligo sea neutro cuando se administra. Estos grupos de protección se diseñan de tal forma que puedan eliminarse cuando el oligo es captado por las células. Los ejemplos de dichos grupos de protección son S-acetiltioetil (SATE) o S-pivaloiltioetil (t-butil-SATE). Estos grupos de protección son resistentes a nucleasas y se eliminan de forma selectiva intracelularmente.

En una realización de la invención el compuesto oligomérico está enlazado a ligandos/conjugados. Es la forma de aumentar la captación celular de los oligonucleótidos no codificantes. Esta conjugación puede tener lugar en las posiciones de los extremos 5'/3'-OH pero los ligandos también pueden conjugarse con los azúcares y/o las bases. Otros ejemplos de conjugados/ligandos son restos de colesterol, intercaladores dúplex como por ejemplo acridina, poli-L-lisina, "caperuza terminal" con uno o más grupos de enlaces resistentes a nucleasas.

La invención también incluye la formulación de uno o más compuestos oligonucleotídicos como se describen en el presente documento. Los agentes de enlace y adyuvantes farmacéuticamente aceptables pueden comprender parte del fármaco formulado. Las cápsulas, comprimidos y píldoras, etc. pueden contener por ejemplo los siguientes compuestos: celulosa microcristalina, goma o gelatina como aglutinantes; almidón o lactosa como excipientes; estearatos como lubricantes; diversos agentes edulcorantes o aromatizantes. Para las cápsulas, la monodosis puede contener un vehículo líquido como aceites grasos. Del mismo modo, los recubrimientos de azúcar o agentes entéricos pueden ser parte de la monodosis. Las formulaciones de oligonucleótidos también pueden ser emulsiones de los principios farmacéuticos activos y un lípido que forme una emulsión de micelas. Un oligonucleótido de la invención puede mezclarse con cualquier material que no impida la acción deseada, o con un material que suplemente la acción deseada. Estos podrían incluir otros fármacos que incluyen otros compuestos nucleotídicos. Para la administración parenteral, subcutánea, intradérmica o tópica, la formulación puede incluir un diluyente estéril, tampones reguladores de la tonicidad y antibacterianos. El compuesto activo puede prepararse con vehículos que protejan contra la degradación o la eliminación inmediata del cuerpo, que incluyen implantes o microcápsulas con propiedades de liberación controladas. Para la administración intravenosa los vehículos preferidos son solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato. Preferiblemente, un compuesto oligomérico está incluido en una formulación unitaria como por ejemplo en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable en una cantidad suficiente para administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz sin provocar efectos secundarios graves al paciente tratado.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse de numerosas formas dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y del área a tratar. La administración puede ser (a) oral (b) pulmonar, por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, que incluyen nebulizador, intratraqueal, intranasal, (c) tópica que incluye epidérmica, transdérmica, oftálmica y a las membranas mucosas que incluyen administración vaginal y rectal; o (d) parenteral que incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intraventricular. En una realización, el oligo activo se administra por vía IV, IP, oral, tópica o en forma de inyección embolada o se administra directamente al órgano diana. Las composiciones farmacéuticas y formulaciones para la administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, pulverizadores, supositorios, líquidos y polvos. Pueden ser deseables o necesario vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares. También pueden ser útiles condones, guantes recubiertos y similares. Las formulaciones incluyen aquellas en las que los oligonucleótidos de la invención están mezclados con un agente de administración tópica como por ejemplo lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Las composiciones y formulaciones para la administración oral incluyen, pero sin restricción, polvos o gránulos, micropartículas, nanopartículas, suspensiones o soluciones en agua o en medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, sobrecitos, comprimidos o minicomprimidos. Las composiciones y formulaciones para la administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados como por ejemplo, pero sin limitación, potenciadores de la penetración, compuestos transportadores y otros vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero sin limitación, soluciones, emulsiones, y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones pueden generarse a partir de una variedad de componentes que incluyen, pero sin limitación, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes. La administración de un fármaco al tejido tumoral puede potenciarse mediante la administración mediada por vehículo que incluye, pero sin limitación, liposomas catiónicos, ciclodextrinas, derivados de porfirina, dendrímeros de cadena ramificada, polímeros de polietilenimina, nanopartículas y microesferas (Dass CR. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1):3-27). Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, que pueden presentarse convenientemente en forma monodosis, pueden prepararse de acuerdo con técnicas convencionales notorias en la industria farmacéutica. Dichas técnicas incluyen la etapa de asociar los principios activos con el vehículo(s) o excipiente(s) farmacéutico(s).
En general las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima los principios activos con los vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente fraccionados o ambos; y después, si fuera necesario, dando forma al producto. Las composiciones de la presente invención pueden formularse en cualquiera de las muchas formas farmacéuticas posibles como por ejemplo, pero sin limitación, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos y supositorios. Las composiciones de la presente invención también pueden formularse en forma de suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. Las suspensión también puede contener estabilizantes. Los compuestos oligoméricos de la invención también pueden conjugarse con sustancias farmacológicas activas, por ejemplo, aspirina, ibuprofeno, una sulfamida, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico.

Los compuestos oligoméricos que contienen LNA son útiles para un número de aplicaciones terapéuticas como se indica anteriormente. En general, los procedimientos terapéuticos de la invención incluyen la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un oligonucleótido modificado con LNA a un mamífero, particularmente un ser humano. En una cierta realización, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen (a) uno o más compuestos no codificantes y (b) otro u otros agentes quimioterapéuticos que funcionan mediante un mecanismo diferente al no codificante. Cuando se usan con los compuestos de la invención, dichos agentes quimioterapéuticos pueden usarse de forma individual (por ejemplo mitramicina y oligonucleótido), secuencial (por ejemplo mitramicina y oligonucleótido durante un periodo de tiempo seguido de otro agente y oligonucleótido), o combinados con otro u otros agentes quimioterapéuticos de ese tipo o combinados con radioterapia. Todos los agentes quimioterapéuticos conocidos por una persona experta en la técnica se incorporan aquí como tratamientos combinados con compuestos de acuerdo con la invención. Los fármacos antiinflamatorios, que incluyen pero sin limitación fármacos antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, fármacos antivirales y fármacos inmunomoduladores también pueden combinarse en composiciones de la invención. Pueden usarse dos o más compuestos combinados juntos o de forma secuencial.

Por consiguiente, un aspecto adicional de la invención se refiere al uso de un compuesto tal como se define en el presente documento o un conjugado tal como se define en el presente documento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, en el que dicho medicamento además comprende un agente quimioterapéutico que se selecciona a partir del grupo constituido por adrenocorticosteroides, como por ejemplo prednisona, dexametasona o decadron; altretamina (hexalen, hexametilmelamina (HMM)); amifostina (etiol); aminoglutetimida (cytadren); amsacrina (M-AMSA); anastrozol (arimidax); andrógenos, como por ejemplo testosterona; asparraginasa (elspar); calmete-gurina de bacilo; bicalutamida (casodex); bleomicina (blenoxano); busulfán (mileran); carboplatina (paraplatina); carmustina (BCNU, BICNU); clorambucilo (leukeran); clorodesoxiadenosina (2-CDA, cladribina, leustatina); cisplatina (platinol); citosina arabinosida (citarabina); dacarbazina (DTIC); dactinomicina (actinomicina-D, cosmegen); daunorrubicina (cerubidina); docetaxel (taxotere); doxorrubicina (adriomicina); epirrubicina; estramustina (emcyt); estrógenos, como por ejemplo dietilstilbestrol (DES); etopósida (VP-16, VePesid, etopofos); fludarabina (fludara); flutamida (eulexin); 5-FUDR (floxuridina); 5-fluorouracilo (5-FU); gemcitabina (gemzar); goserelina (zodalex); herceptina (trastuzumab); hidroxiurea (hidrea); idarrubicina (idamicina); ifosfamida; IL-2 (proleucina, aldesleucina); interferón alfa (intrón A, roferón A); irinotecán (camptosar); leuprolida (lupron); levamisol (ergamisol); lomustina (CCNU); mecloratamina (mustargen, mostaza nitrogenada); melfalán (alkeran); mercaptopurina (purinetol, 6-MP); metotrexato (mexato); mitomicina-C (mutamucina); mitoxantrona (novantrona); octreótida (sandostatina); pentostatina (2-desoxicoformicina, nipent); plicamicina (mitramicina, mitracina); prorocarbazina (matulano); estreptozocina; tamoxifina (nolvadex); taxol (paclitaxel); tenipósida (vumon, VM-26); tiotepa; topotecán (hicamtina); tretinoina (vesanoid, ácido holo-trans retinoico); vinblastina (valban); vincristina (Oncovina) y vinorelbina (navelbina). De forma adecuada, el agente quimioterapéutico adicional se selecciona a partir de taxanos como por ejemplo Taxol, Paclitaxel o Docetaxel.

De forma similar, la invención se refiere además al uso de un compuesto tal como se define en el presente documento o un conjugado tal como se define en el presente documento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, en el que dicho tratamiento además comprende la administración de otro agente quimioterapéutico que se selecciona a partir del grupo constituido por adrenocorticosteroides, como por ejemplo prednisona, dexametasona o decadron; altretamina (hexalen, hexametilmelamina (HMM)); amifostina (etiol); aminoglutetimida (cytadren); amsacrina (M-AMSA); anastrozol (arimidax); andrógenos, como por ejemplo testosterona; asparraginasa (elspar); calmete-gurina de bacilo; bicalutamida (casodex); bleomicina (blenoxano); busulfán (mileran); carboplatina (paraplatina); carmustina (BCNU, BICNU); clorambucilo (leukeran); clorodesoxiadenosina (2-CDA, cladribina, leustatina); cisplatina (platinol); citosina arabinosida (citarabina); dacarbazina (DTIC); dactinomicina (actinomicina-D, cosmegen); daunorrubicina (cerubidina); docetaxel (taxotere); doxorrubicina (adriomicina); epirrubicina; estramustina (emcyt); estrógenos, como por ejemplo dietilstilbestrol (DES); etopósida (VP-16, VePesid, etopofos); fludarabina (fludara); flutamida (eulexin); 5-FUDR (floxuridina); 5-fluorouracilo (5-FU); gemcitabina (gemzar); goserelina (zodalex); herceptina (trastuzumab); hidroxiurea (hidrea); idarrubicina (idamicina); ifosfamida; IL-2 (proleucina, aldesleucina); interferón alfa (intrón A, roferón A); irinotecán (camptosar); leuprolida (lupron); levamisol (ergamisol); lomustina (CCNU); mecloratamina (mustargen, mostaza nitrogenada); melfalán (alkeran); mercaptopurina (purinetol, 6-MP); metotrexato (mexato); mitomicina-C (mutamucina); mitoxantrona (novantrona); octreótida (sandostatina); pentostatina (2-desoxicoformicina, nipent); plicamicina (mitramicina, mitracina); prorocarbazina (matulano); estreptozocina; tamoxifina (nolvadex); taxol (paclitaxel); tenipósida (vumon, VM-26); tiotepa; topotecán (hicamtina); tretinoina (vesanoid, ácido holo-trans retinoico); vinblastina (valban); vincristina (Oncovina) y vinorelbina (navelbina). De forma adecuada, dicho tratamiento comprende además la administración de un agente quimioterapéutico adicional que se selecciona a partir de taxanos, como por ejemplo Taxol, Paclitaxel o Docetaxel.

Explicado de forma alternativa, el compuesto de la invención puede usarse en un procedimiento para tratar el cáncer, dicho procedimiento comprende administrar un compuesto tal como se define en el presente documento, o un conjugado tal como se define en el presente documento o una composición farmacéutica tal como se define en el presente documento a un paciente que lo necesite y además comprende la administración de otro agente quimioterapéutico. Dicha administración adicional puede ser tal que el agente quimioterapéutico adicional está conjugado con el compuesto

\hbox{de la invención, esté presente en la
composición farmacéutica, o se administre  en una formulación
separada.}

En otra realización, las composiciones de la invención pueden contener uno o más compuestos no codificantes, particularmente oligonucleótidos, dirigidos contra un primer ácido nucleico y uno o más compuestos no codificantes adicionales dirigidos contra un segundo ácido nucleico diana. Pueden usarse dos o más compuestos combinados juntos o de forma secuencial.

En una realización preferida la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen (a) uno o más compuestos no codificantes y (b) otro u otros agentes quimioterapéuticos que estabilizan los microtúbulos o entorpecen la dinámica de los microtúbulos - y así evitan la tensión que se forma en los cinetócoros de las cromátidas hermanas. Dichos agentes quimioterapéuticos incluyen los taxanos, en particular Taxol, Paclitaxel y Docetaxel. Cuando se usan con los compuestos de la invención, dichos agentes quimioterapéuticos deberían usarse de forma secuencial empezando por el tratamiento con oligonucleótido durante un periodo de tiempo que sensibilice a las células diana al posterior cotratamiento con el agente quimioterapéutico al reducir el nivel de proteína survivina de las células tumorales y de las células endoteliales en proliferación de la vasculatura tumoral.

En otra realización preferida, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen (a) uno o más compuestos no codificantes y (b) radioterapia. Cuando se usa con los compuestos de la invención, la radioterapia debería usarse de forma secuencial empezando por el tratamiento con oligonucleótido durante un periodo de tiempo que sensibilice a las células diana a la posterior radioterapia adicional al reducir el nivel de proteína survivina de las células tumorales y de las células endoteliales en proliferación de la vasculatura tumoral.

La dosis depende de la gravedad y de la respuesta del estado de enfermedad a tratar, y el ciclo de tratamiento dura de varios días a varios meses, o hasta que se consigue la curación o una disminución del estado de enfermedad. Las pautas de administración óptimas pueden calcularse midiendo la acumulación del fármaco en el cuerpo del paciente. Las dosis óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los oligonucleótidos individuales.

Generalmente puede estimarse basándose en las CE_{50} que se encuentre que son eficaces in vitro y en los modelos animales in vivo. En general, la dosis es de 0,01 \mug a 1 g por kg de peso corporal, y puede administrarse una o más veces al día, semanalmente, mensualmente o anualmente o incluso una vez cada 2 a 10 años o mediante infusión continua durante de horas hasta varios meses. Las tasas de repetición para la administración pueden estimarse basándose en los tiempos de permanencia y concentraciones del fármaco medidos en fluidos o tejidos corporales. Tras el tratamiento con éxito, puede ser deseable hacer que el paciente se someta a una terapia de mantenimiento para evitar la reaparición del estado de enfermedad.

Los compuestos oligoméricos que contienen LNA de la presente invención también pueden utilizarse como reactivos de investigación para el diagnóstico, terapia y profilaxis. En la investigación, los oligonucleótidos no codificantes pueden usarse para inhibir específicamente la síntesis de los genes de survivina en las células y en los animales experimentales facilitando así el análisis funcional de la diana o la valoración de su utilidad como diana para la intervención terapéutica. En el diagnóstico, los oligonucleótidos no codificantes pueden usarse para detectar y cuantificar la expresión de survivina en la células y tejidos mediante transferencia Northern, hibridación in situ o técnicas similares. Para la terapia, un animal o un ser humano, que se sospeche que tiene una enfermedad o trastorno, que puede tratarse modulando la expresión de survivina se trata mediante la administración de compuestos no codificantes de acuerdo con esta invención. Además se proporcionan procedimientos de tratar a un animal en particular ratones y ratas y tratar a un ser humano, que se sospecha que tiene o que tiene predisposición a una enfermedad o afección, asociada a la expresión de survivina mediante la administración una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más de los compuestos no codificantes o composiciones de la invención.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un procedimiento de prevenir o limitar la apoptosis que comprende la administración de un compuesto como se define en el presente documento, un conjugado tal como se define en el presente documento o una composición farmacéutica tal como se define en el presente documento. La prevención de la apoptosis puede ser in vitro. La prevención puede realizarse en un ensayo celular o en una muestra de tejido.

Un aspecto relacionado de la invención se refiere a un procedimiento de prevenir la proliferación celular que comprende la administración de un compuesto como se define en el presente documento, un conjugado tal como se define en el presente documento o una composición farmacéutica tal como se define en el presente documento. La prevención de la proliferación puede ser in vitro. La prevención puede realizarse en un ensayo celular o en una muestra de tejido.

La invención se ilustra adicionalmente de forma no limitante mediante los siguientes ejemplos.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Síntesis de monómeros

Los bloques de construcción de los monómeros de LNA y sus derivados se prepararon siguiendo procedimientos publicados y las referencias que se citan en ellos, véase:

\bullet El documento WO 03/095467 A1

\bullet D. S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparation of LNA Phosphoramidites, Synthesis 6, 802-808.

\bullet M. D. Sorensen, L. Kvaernø, T. Brild, A. E. H\ring{a}kansson, B. Verbeure, G. Gaubert, P. Herdewijn, J. Wengel (2002) \alpha-L-ribo-configured Locked Nucleic Acid (\alpha-l-LNA): Synthesis and Properties, J. Am. Chem. Soc, 124,2164-2176.

\bullet S. K. Singh, R. Kumar, J. Wengel (1998) Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides, J. Org. Chem. 1998, 63, 6078-6079.

\bullet C. Rosenbohm, S. M. Christensen, M. D. Sorensen, D. S. Pedersen, L. E. Larsen, J. Wengel, T. Koch (2003) Synthesis of 2'-amino-LNA: a new strategy, Org. Biomol. Chem. 1, 655-663.

Síntesis de la 2'-tio-LNA ribotimidina fosforamidita. Reactivos y condiciones: i) Pd/C, H_{2}, acetona, MeOH; ii) BzCI, piridina, DMF; iii) H_{2}SO_{4} 0,25 M (ac), DMF, 80ºC (79% de 4; 3 etapas); iv) Tf_{2}O, DMAP, CH_{2}CI_{2}, 0ºC; v) Na_{2}S, DMF (72% de 7; 2 etapas); vi) NaOBz, DMF, 100ºC (81%); vii) NH_{3}, MeOH (76%); viii) DMT-CI, piridina (88%); ix) P(OCH_{2}CH_{2}CN)(N('Pr)_{2})_{2}, 4,5-dicianoimidazol, CH_{2}CI_{2} (99%). DMT= 4,4'-dimetoxitritilo, PN_{2}= 2-cianoetoxi (diisopropilamino)fosfinoílo.

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1-(3-O-Benzoil-5-O-metanosulfonil-4-C-metanosulfoniloximetil-\beta-D-treo-pentofuranosil)timina (7, Figura 4)

El anhidro-nucleósido 4 (C. Rosenbohm, S. M. Christensen, M. D. Sorensen, D. S. Pedersen, L. E. Larsen, J. Wengel, T. Koch (2003) Synthesis of 2'-amino-LNA: a new strategy, Org. Biomol. Chem. 1, 655-663) (30,0 g, 58,1 mmol) se calentó a 70ºC en una mezcla de metanol (1000 cm^{3}) y acetona (1000 cm^{3}) hasta que se obtuvo una solución transparente y la solución se dejó alcanzar temperatura ambiente. El matraz de reacción se purgó con argón y se añadió Pd/C (10% en peso de Pd sobre carbón, 6,2 g, 5,8 mmol). La mezcla se agitó vigorosamente en atmósfera de gas hidrógeno (balón). Después de 23 h, la suspensión se filtró a través de una capa de celite. El catalizador se recuperó del celite y se sometió a reflujo en DMF (1000 cm^{3}) durante 1 h. La suspensión de DMF caliente se filtró a través de una capa de celite y las fases orgánicas se combinaron y se evaporaron a vacío proporcionando el nucleósido 5 en forma de un polvo amarillo. Los disolventes residuales se eliminaron en una bomba de vacío alto toda la noche.

El nucleósido 5 (23 g) en bruto se calentó a 70ºC en DMF (300 cm^{3}) proporcionando una solución amarillo claro que se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se añadió cloruro de benzoílo (81,7 g, 581 mmol, 67,4 cm^{3}) seguido de piridina (70 cm^{3}). Después de 18 h, la reacción se inactivó con metanol (200 cm^{3}) y el exceso de metanol se eliminó a vacío. A la solución marrón oscuro del nucleósido 6 se añadió H_{2}SO_{4} acuoso (0,25 M, 400 cm^{3}). La solución se calentó a 80ºC en un baño de aceite (aprox. a 50ºC se produce precipitación. La solución vuelve a ser transparente de nuevo a 80ºC). Después de 22 h a 80ºC la solución se dejó enfriar a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se transfirió a un embudo separador con acetato de etilo (1000 cm^{3}). La fase orgánica se lavó con NaHCO_{3} ac. sat. (2 x 1000 cm^{3}). Las fases acuosas combinadas se extrajeron con acetato de etilo (1000 + 500 cm^{3}). Las fases orgánicas se combinaron y se lavaron con NaHCO_{3} ac. sat. (1000 cm^{3}), se secaron (Na_{2}SO_{4}), se filtraron y se evaporaron a vacío proporcionando un líquido amarillo. Los disolventes residuales se eliminaron en una bomba de vacío alto toda la noche proporcionando un jarabe amarillo. El producto se purificó mediante cromatografía a vacío en columna seca (di 10 cm; 100 fracciones de cm^{3}; 50-100% de EtOAc en n-heptano (v/v) - incrementos de 10%; 2-24% de MeOH en EtOAc (v/v) - incrementos de 2%). Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se evaporaron a vacío proporcionando el nucleósido 7 (25,1 g, 79%) en forma de una espuma blanca.

R_{f} = 0,54 (5% de MeOH en EtOAc, v/v);

EM-IES m/z hallada 549,0 ([MH]^{+}, calculada 549,1);

RMN de ^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 11,39 (brs, 1H, NH), 8,10-8,08 (m, 2H, Ph), 7,74-7,70 (m, 1H, Ph), 7,60-7,56 (m, 2H, Ph), 7,51 (d, J= 1,1 Hz, 1H, H6), 6,35 (d, J=4,9 Hz, 1H, H1'), 6,32 (d, J= 5,3 Hz, 1H, 2'-OH), 5,61 (d, J=4,0 Hz, 1H, H3'), 4,69 (d, J= 10,8 Hz, 1H), 4,59 (m, 1H, H2'), 4,55 (d, J= 10,8 Hz, 1H), 4,52 (d, J= 10,8 Hz, 1H), 4,46 (d, J= 10,6 Hz, 1H) (H5' y H1''), 3,28 (s, 3H, Ms), 3,23 (s, 3H, Ms), 1,81 (s, 3H, CH_{3});

RMN de ^{13}C (DMSO-d_{6}) \delta 164,5, 163,6 (C4, PhC(O)), 150,3 (C2), 137,7 (C6), 133,8, 129,6, 128,7, 128,6 (Ph), 108,1 (C5), 84,8 (C1'), 81,1 (C4'), 78,0 (C3'), 73,2 (C2'), 68,0, 67,1 (C5', C1''), 36,7, 36,6 (2 x Ms), 11,9 (CH_{3});

Anal. elemental, calculado para C_{20}H_{24}N_{2}O_{12}S_{2}-0,33 H_{2}O (%): C, 44,34; H, 4,65; N, 4,85. Hallado: C, 44,32; H, 4,58; N, 4,77.

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(1R,3R,4R,7R)-7-Benzoiloxi-1-metanosulfoniloximetil-3-(timin-1-il)-2-oxa-5-tiabiciclo[2.2.1]heptano (9)

1-(3-O-Benzoil-5-O-metanosulfonil-4-C-metanosulfoniloximetil-\beta-D-treopentofuranosil)timina (7) (10,00 g,
18,23 mmol) se disolvió en diclorometano (500 cm^{3}) y se enfrió a 0ºC. Se añadió piridina (15 cm^{3}) y DMAP (8,91 g, 72,9 mmol) seguido de la adición gota a gota de anhídrido trifluorometanosulfónico (10,30 g, 36,5 mmol, 6,0 cm^{3}). Después de 1 h, la reacción se inactivó con NaHCO_{3} ac. sat. (500 cm^{3}) y se transfirió a un embudo separador. La fase orgánica se lavó con HCI ac. 1 M (500 cm^{3}), NaHCO_{3} ac. sat. (500 cm^{3}) y salmuera (500 cm^{3}). La fase orgánica se evaporó a vacío con tolueno (100 cm^{3}) proporcionando 1-(3-O-benzoil-5-O-metanosulfonil-4-C-metanosulfoniloximetil-2-O-trifluorometanosulfonil-\beta-D-treopentofuranosil)timina (8) en forma de un polvo amarillo. El nucleósido 8 en bruto se disolvió en DMF (250 cm^{3}) y se añadió Na_{2}S (1,57 g, 20,1 mmol) proporcionando una suspensión verde oscura. Después de 3 h, la reacción se inactivó con NaHCO_{3} ac. semisaturado (500 cm^{3}) y se extrajo con diclorometano (500 + 2 x 250 cm^{3}). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (500 cm^{3}), se secaron (Na_{2}SO_{4}), se filtraron y se concentraron a vacío proporcionando un líquido amarillo. El disolvente residual se eliminó toda la noche en una bomba de vacío alto proporcionando una goma amarilla que se purificó mediante cromatografía a vacío en columna seca (di 6 cm: fracciones de 50 cm^{3}; 50-100% de EtOAc en n-heptano (v/v) -incrementos de 10%; 2-20% de MeOH en EtOAc (v/v) - incrementos

\hbox{de 2%) proporcionando el nucleósido 9 (6,15 g, 72%) en
forma de  una espuma amarilla.}

R_{f} = 0,27 (20% de n-heptano en EtOAc, v/v); EM-IES m/z hallada 469,0 ([MH]^{+}, calculada 469,1);

RMN de ^{1}H (CDCI_{3}) \delta 8,70 (br s, 1H, NH), 8,01-7,99 (m, 2H, Ph), 7,67 (d, J= 1,1 Hz, 1H, H6), 7,65-7,61 (m, 1H, Ph), 7,50-7,46 (m, 2H, Ph), 5,98 (s, 1H, H1'), 5,34 (d, J= 2,4 Hz, 1H, H3'), 4,66 (d, J= 11,7 Hz, 1H, H5'a), 4,53 (d, J = 11,5 Hz, 1H, H5'b), 4,12 (m (superpuesto al EtOAc residual), 1H, H2'), 3,15-3,13 (m, 4H, H1'' y Ms), 3,06 (d, J= 10,6 Hz, 1H, H1''b), 1,98 (d, J= 1,1 Hz, 3H, CH_{3});

CNMR(CDCI_{3}) \delta 165,2, 163,5(C4, PhC(O)), 149,9 (C2), 134,1, 133,9, 129,8,128,7, 128,3 (C6, Ph), 110,7 (C5), 91,1 (C1'), 86,8 (C4'), 72,6 (C3'), 65,8 (C5'), 50,5 (C2'), 37,9 (Ms), 35,1 (C1''), 12,5 (CH_{3});

Anal. elemental. calculado para C_{19}H_{20}N_{2}O_{8}S_{2}-0,33 EtOAc (%): C, 49,21; H, 4,72; N, 5,47. Hallado: C, 49,25; H, 4,64; N, 5,48.

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(1R,3R,4R,7R)-7-Benzoiloxi-1-benzoiloximetil-3-(timin-1-il)-2-oxa-5-tiabiciclo[2.2.1]heptano (10)

El nucleósido 9 (1,92 g, 4,1 mmol) se disolvió en DMF (110 cm^{3}). Se añadió benzoato sódico (1,2 g, 8,2 mmol) y la mezcla se calentó a 100ºC durante 24 h. La mezcla de reacción se transfirió a un embudo separador con salmuera semisaturada (200 cm^{3}) y se extrajo con acetato de etilo (3 X 100 cm^{3}). Las fases orgánicas combinadas se secaron (Na_{2}SO_{4}), se filtraron y se evaporaron a vacío proporcionando un líquido marrón. El producto se introdujo en una bomba de vacío alto para eliminar el disolvente residual. La goma marrón resultante se purificó mediante cromatografía a vacío en columna seca (di 4 cm; fracciones de 50 cm^{3}; 0-100% de EtOAc en n-heptano (v/v) - incrementos de 10%; 2-10% de MeOH en EtOAc (v/v) - incrementos de 2%) proporcionando el nucleósido 10 (1,64 g, 81%) en forma de una espuma ligeramente amarilla. R_{f} = 0,57 (20% de n-heptano en EtOAc, v/v); EM-IES m/z hallada 495,1 ([MH]^{+}, calculada 495,1);

RMN de ^{1}H (CDCI_{3}) \delta 9,02 (br s, 1H, NH), 8,07-7,99 (m, 4H, Ph), 7,62-7,58 (m, 2H, Ph), 7,47-7,42 (m, 5H, Ph y H6), 5,95 (s, 1H, H1'), 5,46 (d, J=2,2 Hz, 1H, H3'), 4,93 (d, J= 12,8 Hz, 1H, H5'a), 4,60 (d, J= 12,8 Hz, 1H, H5'b), 4,17 (d, J= 2,2 Hz, 1H, H2'), 3,27 (d, J= 10,6 Hz, 1H, H1''a), 3,16 (d, J= 10,6 Hz, 1H, H1''b), 1,55 (d, J= 1,1 Hz, 3H, CH_{3}); RMN de ^{13}C (CDCl_{3}) \delta 165,8, 165,1, 163,7 (C4, 2 x PhC(O)), 150,0 (C2), 133,9, 133,7, 133,6, 129,8, 129,6, 129,0, 128,8, 128,6, 128,5 (C6, 2x Ph), 110,3 (C5), 91,3 (C1'), 87,5 (C4'), 72,9 (C3'), 61,3 (C5'), 50,6 (C2'), 35,6 (C1''), 12,3 (CH_{3}); Anal. elemental, calculado para C_{25}H_{22}N_{2}O_{7}S (%): C, 60,72; H, 4,48; N, 5,66. Hallado: C, 60,34; H, 4,49; N, 5,35.

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(1R,3R,4R,7R)-7-Hidroxi-1-hidroximetil-3-(timin-1-il)-2-oxa-5-tiabiciclo[2.2.1]heptano (11)

El nucleósido 10 (1,50 g, 3,0 mmol) se disolvió en metanol saturado con amoniaco (50 cm^{3}). El matraz de reacción se selló y se agitó a temperatura ambiente durante 20 h. La mezcla de reacción se concentró a vacío proporcionando una goma amarilla que se purificó mediante cromatografía a vacío en columna seca (di 4 cm; fracciones de 50 cm^{3}; 0-16% de MeOH en EtOAc (v/v) - incrementos de 1%) proporcionando el nucleósido 11 (0,65 g, 76%) en forma de agujas transparentes.

R_{f} = 0,31 (10% de MeOH en EtOAc, v/v);

EM-IES m/z hallada 287,1 ([MH]^{+}, calculada 287,1);

RMN de ^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta 11,32 (br s, 1H, NH), 7,96 (d, J= 1,1 Hz, 1H, H6), 5,95 (s, 1H, H6), 5,70 (d, J= 4,2 Hz, 1H, 3'-OH), 5,62 (s, 1H, H1'), 4,49 (t, J= 5,3 Hz, 1H, 5'-OH), 4,20 (dd, J= 4,1 y 2,1 Hz, 1H, H3'), 3,77-3,67 (m, 2H, H5'), 3,42 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H2'), 2,83 (d, J= 10,1 Hz, 1H, H1''a), 2,64 (d, J= 10,1 Hz, 1H, H1''b), 1,75 (d, J= 1,1 Hz,3H,CH_{3});

RMN de ^{13}C (DMSO-d_{6}) \delta 163,8 (C4), 150,0 (C2), 135,3 (C6), 107,5 (C5), 90,2, 89,6 (C1' y C4'), 69,4 (C3'), 58,0 (C5'), 52,1 (C2'), 34,6 (C1''), 12,4 (CH_{3});

Anal. elemental, calculado para C_{11}H_{14}N_{2}O_{5}S (%): C, 46,15; H, 4,93; N, 9,78. Hallado: C, 46,35; H, 4,91; N, 9,54.

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(1R,3B,4R,7R)-1-(4,4'-Dimetoxitritiloximetil)-7-hidroxi-5-metil-3-(timin-1-il)-2-oxa-5-tiabiriclo[2.2.1]heptano (12)

El nucleósido 11 (0,60 g, 2,1 mmol) se disolvió en piridina (10 cm^{3}). Se añadió cloruro de 4,4'-dimetoxitritilo (0,88 g, 2,6 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. La mezcla de reacción se transfirió a un embudo separador con agua (100 cm^{3}) y se extrajo con acetato de etilo (100 + 2 x 50 cm^{3}). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con NaHCO_{3} ac. sat. (100 cm^{3}), salmuera (100 cm^{3}) y se evaporaron a sequedad a vacío proporcionando un líquido amarillo viscoso. El producto se volvió a disolver en tolueno (50 cm^{3}) y se concentró a vacío proporcionando una espuma amarilla. La espuma se secó en una bomba de vacío alto toda la noche y se purificó mediante cromatografía a vacío en columna seca (di 4 cm: fracciones de 50 cm^{3}; 10-100% de EtOAc en n-heptano (v/v) -incrementos de 10%) que proporcionó el nucleósido 12 (1,08 g, 88%) en forma de una espuma blanca. R_{f} = 0,24 (20% de n-heptano en EtOAc, v/v); EM-IES m/z hallada 587,1 ([M-H]^{+}, calculada 587,2);

RMN de ^{1}H (CDCI_{3}) \delta 8,96 (br s, 1H, NH), 7,74 (d, J= 1,1 Hz, 1H, H6), 7,46-7,44 (m, 2H, Ph), 7,35-7,22 (m; 9H, Ph), 7,19-7,15 (m, 2H, Ph), 6,86-6,80 (m, 2H, Ph), 5,82 (s, 1H, H1'), 4,55 (dd, J= 9,3 y 2,1 Hz, 1H, H3'), 3,79 (s, 6H, OCH_{3}), 3,71 (d, J= 2,0 Hz, 1H, H2'), 3,50 (s, 2H, H5'), 2,81 (d, J= 10,8 Hz, 1H, H1''a), 2,77 (d, J= 10,8 Hz, 1H, H1''b), 2,69 (d, J = 9,2 Hz, 1H, 3'-OH), 1,42 (s, 3H, CH_{3});

RMN de ^{13}C (CDCI_{3}) \delta 158,7 (C4), 150,1 (C2), 144,1, 135,2, 135,1, 130,1, 129,1, 128,1, 128,0, 127,1, 127,0, 113,3 (C6, 3 X Ph), 110,0 (C5), 90,2 (C(Ph)_{3}), 89,6 (C1'), 87,0 (C4'), 71,7 (C3'), 60,9 (C5'), 55,2 (C2'), 34,7 (C1''), 12,2 (CH_{3}); Anal. elemental, calculado para C_{32}H_{32}N_{2}O_{7}S-0,5 H_{2}O (%): C, 64,31; H, 5,57; N, 4,69. Hallado: C, 64,22; H, 5,67; N, 4,47.

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(1R,3R,4R,7R)-7-(2-cianoetoxi(diisopropilamino)fosfinoxi)-1-(4,4'-dimetoxitritiloximetil)-3-(timin-1-il)-2-oxa-5- tiabiciclo[2.2.1]heptano (13)

De acuerdo con el procedimiento publicado (D. S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparation of LNA Phosphoramidites, Synthesis, 6, 802-808) el nucleósido 12 (0,78 g, 1,33 mmol) se disolvió en diclorometano (5 cm^{3}) y se añadió una solución 1,0 M de 4,5-dicianoimidazol en acetonitrilo (0,93 cm^{3}, 0,93 mmol) seguido de la adición gota a gota de 2-cianoetil-N,N,N,N-tetraisopropilfosforodiamidita (0,44 cm^{3}, 1,33 mmol). Después de 2 h la reacción se transfirió a un embudo separador con diclorometano (40 cm^{3}) y se lavó con NaHCO_{3} ac. sat. (2 x 25 cm^{3}) y salmuera (25 cm^{3}). La fase orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}), se filtró y se evaporó a vacío proporcionando el nucleósido 13 (1,04 g, 99%) en forma de una espuma blanca. R_{f} = 0,29 y 0,37 - dos diastereoisomeros (20% de n-heptano en EtOAc, v/v); EM-IES m/z hallada 789,3 ([MH]^{+}, calculada 789,3); RMN de ^{31}P (DMSO-d_{6}) \delta 150,39, 150,26.

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Ejemplo 2

Síntesis de oligonucleótidos

Los oligonucleótidos se sintetizaron usando la estrategia de fosforamidita en un sintetizador Expedite 8900/MOSS (Multiple Oligonucleotide Synthesis System) a 1 o a 15 \mumol. Al final de la síntesis (DMT-on) los oligonucleótidos se escindieron del soporte sólido usando amoniaco acuoso durante 1 h a temperatura ambiente, y se desprotegieron adicionalmente durante 3 h a 65ºC. Los oligonucleótidos se purificaron por HPLC de fase inversa (RP-HPLC). Después de eliminar el grupo DMT, los oligonucleótidos se caracterizaron por IE-HPLC o RP-HPLC. La identidad de los oligonucleótidos se confirma por EM-IES. Véase más abajo para más detalles.

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Preparación del hemiéster succinílico de LNA

Se disolvió monómero de 5'-O-Dmt-3'-hidroxi-LNA (500 mg), anhídrido succínico (1,2 eq.) y DMAP (1,2 eq.) en DCM (35 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. Después de las extracciones con NaH_{2}PO_{4} 0,1 M pH 5,5 (2x) y salmuera (1 x). La fase orgánica se secó adicionalmente con Na_{2}SO_{4} se filtró y se evaporó. Se obtuvo el derivado hemiéster con un rendimiento del 95% y se usó sin purificación adicional.

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Preparación del LNA-soporte

El derivado hemiéster preparado anteriormente (90 (\mumol) se disolvió en una cantidad mínima de DMF, DIEA y pyBOP (se añadieron 90 (\mumol) y se mezclaron durante 1 min. Esta mezcla preactivada se combinó con LCAA-CPG (500 \ring{A}, tamaño de malla de 80-120, 300 mg) en un sintetizador manual y se agitó. Después de 1,5 h a temperatura ambiente, el soporte se eliminó por filtración y se lavó con DMF, DCM y MeOH. Después de secar, se determinó que la carga era de 57 \mumol/g (véase Tom Brown, Dorcas J.S.Brown, "Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis", en: F. Eckstein, editor. Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach. Oxford: IRL Press, 1991: 13-14).

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Elongación del oligonucleótido

El acoplamiento de las fosforamiditas (A(bz), G(ibu), 5-metil-C(bz)) o T-p-cianoetilfosforamidita) se realiza usando una solución 0,1 M de la amidita protegida con 5'-O-DMT en acetonitrilo y DCl (4,5-dicianoimidazol) en acetonitrilo (0,25 M) como activador. La tiolación se realiza usando cloruro de xantano (0,01 M en acetonitrilo:piridina 10%). El resto de los reactivos son los que se usan habitualmente para la síntesis de oligonucleótidos.

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Purificación por RP-HPLC:

Columna:

columna XTerra, RP18, 5 \mum, 7,8x50 mm.

\quad

Eluyente:

Eluyente A:

NH_{4}OAc 0,1 M, pH: 10.

Eluyente B:

Acetonitrilo

Caudal:

5 ml/min.

\quad

Gradiente:

6

Análisis por IE-HPLC:

Columna:

columna Dionex, DNAPac PA-100, 2x250 mm.

\quad

Eluyente:

Eluyente A:

Tris-HCI 20 mM, a pH 7,6; EDTA 1 mM; NaClO_{4} 10 mM.

Eluyente B:

Tris-HCI 20 mM, pH 7,6; EDTA 1 mM; NaClO_{4} 1 M.

Caudal:

0,25 ml/min.

\quad

Gradiente:

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7

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Abreviaturas

DMT:

Dimetoxitritilo

DCI:

4,5-Dicianoimidazol

DMAP:

4-Dimetilaminopiridina

DCM:

Diclorometano

DMF:

Dimetilformamida

THF:

Tetrahidrofurano

DIEA:

N,N-diisopropiletilamina

PyBOP:

Hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio

Bz:

Benzoílo

Ibu:

Isobutirilo

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Ejemplo 3

Prueba de diseño del compuesto oligomérico

Los presentes inventores tenían interés en evaluar la actividad no codificante de oligonucleótidos con diferentes diseños, para probar la importancia de elegir el mejor diseño para un oligonucleótido dirigido contra survivina. Con este fin, los presentes inventores diseñaron un ensayo in vitro que les permitiera tamizar muchos diseños diferentes de oligonucleótidos midiendo la actividad de la luciferasa de la luciérnaga (Photinus piralis) después de la regulación por disminución con los oligonucleótidos no codificantes. La Figura 1 contiene una ilustración de la mayoría de los diseños que se mencionan en el texto. En un primer tamizado, se evaluaron diseños que contenían \beta-D-oxi-LNA, que eran todos dirigidos contra el mismo motivo del ARNm. Se analizaron diseños constituidos por gapmeros con diferentes tamaños de hueco, una carga diferente de enlaces internucleosídicos de fosforotioato, y una carga diferente de LNA. Se prepararon headmeros y tailmeros con una carga diferente de \beta-D-oxi-LNA, una carga diferente de enlaces internucleosídicos de fosforotioato y una carga diferente de ADN. En el ensayo in vitro también se analizaron mixmeros de diversas composiciones, lo que quiere decir que portan un número alternativo de unidades de \beta-D-oxi-LNA, \alpha-L-LNA y ADN. Además, se incluyeron también derivados de LNA en diferentes diseños, y se evaluó su actividad no codificante. La importancia de un buen diseño queda reflejada en en los datos que pueden obtenerse en un ensayo con luciferasa. Los niveles de expresión de luciferasa se miden en %, y proporcionan una indicación de la actividad no codificante de los diferentes diseños que contienen \beta-D-oxi-LNA y derivados de LNA. Se puede observar fácilmente que algunos diseños son oligonucleótidos no codificantes potentes, mientras que otros proporcionan niveles de regulación por disminución de moderados a bajos. Por lo tanto, es muy evidente que existe una relación directa íntima entre una buena actividad no codificante y diseño óptimo de un oligonucleótido. Los presentes inventores apreciaron buenos niveles de de regulación por disminución con diversos diseños. Los gapmeros con huecos de 7-10 nt de ADN y tiolación por todo el esqueleto o con tiolación exclusivamente en el hueco y PO en los flancos dieron buenos resultados. Estos diseños contienen \beta-D-oxi-LNA o derivados de LNA. Los headmeros de 6 nt y 8 nt de \beta-D-oxi-LNA también presentaron buenos niveles de regulación por disminución, cuando los enlaces internucleosídicos de fosforotioato están por todo el esqueleto o sólo en el segmento de ADN. Los mixmeros diferentes proporcionaron una buena actividad no codificante en el ensayo de luciferasa. El número alternativo de unidades de cada composición de \alpha-L-oxi-LNA, \beta-D-oxi-LNA o ADN define los mixmeros, véase la figura 1. Un mixmero 3-9-3-1, que tiene un resto desoxinucleósido en el extremo 3' mostró niveles significativos de regulación por disminución. En un mixmero 4-1-1-5-1-1-3, los presentes inventores situaron dos restos \alpha-L-oxi-LNA interrumpiendo el hueco, siendo los flancos de \beta-D-oxi-LNA. Además, los presentes inventores interrumpieron el hueco con dos restos \alpha-L-oxi-LNA, y sustituyeron ambos flancos por \alpha-L-oxi-LNA. Ambos diseños presentaron niveles significativos de regulación por disminución. La presencia de \alpha-L-oxi-LNA podría introducir una transición flexible entre los flancos bloqueados (oxi-LNA) y el resto \alpha-L-oxi-LNA al aumentar la carga de restos desoxinucleotídicos. También es interesante estudiar un diseño 4-3-1-3-5 donde un resto \alpha-L-oxi-LNA interrumpe el tramo de ADN. Además del \alpha-L-oxi-LNA del hueco, los presentes inventores también sustituyeron dos restos de oxi-LNA en los bordes de los flancos por dos restos \alpha-L-oxi-LNA. La presencia de sólo un resto \beta-D-oxi-LNA (diseño 4-3-1-3-5) interrumpiendo el tramo de ADN en el hueco provoca una tremenda pérdida de regulación por disminución. Únicamente por el uso de \alpha-L-oxi-LNA en su lugar, el diseño muestra una significativa regulación por disminución a una concentración de oligonucleótido de 50 nM. La colocación de \alpha-L-oxi-LNA en las uniones y un \alpha-L-oxi-LNA en el medio del hueco también mostró regulación por disminución. \alpha-L-oxi-LNA ha resultado ser una herramienta potente que permite construir diferentes mixmeros, que son capaces de presentar niveles elevados de actividad no codificante. También pueden prepararse otros ther mixmeros como por ejemplo 4-1-5-1-5 y 3-3-3-3-3-1. Se puede observar fácilmente que algunos diseños son oligonucleótidos no codificantes potentes, mientras que otros proporcionan niveles de regulación por disminución de moderados a bajos. Por lo tanto, de nuevo es muy evidente que existe una relación directa íntima entre una buena actividad no codificante y diseño óptimo de un oligonucleótido. Otros diseños preferidos son (1-3-8-3-1) donde los restos de ADN están localizados en los flancos con 3 monómeros de \beta-D-oxi-LNA a cada lado del hueco. Un diseño preferidos adicional es (4-9-3-1) con flancos de D-oxi-LNA y un hueco de 9 con un ADN en el
extremo 3'.

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Ensayo

Se usó la línea celular X1/5 Hela (N.º de Ref. ECACC: 95051229), que estaba transfectada de forma estable con un sistema de luciferasa "Tet-off". En ausencia de tetraciclina, el gen de luciferasa se expresa de forma constitutiva. La expresión puede medirse en unidades de luz en un luminómetro, cuando se añade el sustrato de la luciferasa, luciferina. La línea celular X1/5 Hela se cultivó en medio mínimo esencial de Eagle (Sigma M2279) suplementado con 1x aminoácidos no esenciales (Sigma M7145), 1x Glutamax I (Invitrogen 35050-038), 10% de suero bovino FBS, 25 \mug/ml de gentamicina (Sigma G1397), 500 \mug/ml de G418 (Invitrogen 10131 -027) y 300 \mug/ml de higromicina B (Invitrogen 10687-010). Las células X1/5 Hela se sembraron a una densidad de 8000 células por pocillo en una placa blanca de 96 pocillos (Nunc 136101) el día anterior a la transfección. Antes de la transfección, las células se lavaron una vez con OptiMEM (Invitrogen) seguido de la adición de 40 \mul de OptiMEM con 2 \mu/ml de Lipofectamina 2000 (Invitrogen). Las células se incubaron durante 7 minutos antes de añadir los oligonucleótidos. Se añadieron 10 \mul de soluciones de oligonucleótido y las células se incubaron durante 4 h a 37ºC y 5% de CO_{2}. Después de las 4 h de incubación, las células se lavaron una vez en OptiMEM y se añadió medio de cultivo (100 \mul). La expresión de luciferasa se midió al día siguiente. La expresión de luciferasa se midió con el sistema de ensayo de luciferasa Steady-Glo de Promega. Se añadieron 100 \mul del reactivo Steady-Glo a cada pocillo y la placa se agitó durante 30 s a 700 rpm. La placa se leyó en un instrumento Luminoskan Ascent de ThermoLabsystems después de una incubación de 8 minutos para completar la lisis total de las células. La expresión de la luciferasa se mide en términos de unidades lumínicas relativas por segundo (RLU/s). Los datos se procesaron en el programa Ascent (v2.6) y se dibujaron gráficas en SigmaPlot2001.

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Ejemplo 4

Modelo in vitro: cultivo celular

El efecto de los compuestos no codificantes sobre la expresión del ácido nucleico diana puede analizarse en cualquiera de una variedad de tipos celulares, con la condición de que el ácido nucleico diana esté presente a niveles cuantificables. La diana puede expresarse de forma endógena o mediante transfección transitoria o estable de un ácido nucleico que codifica dicho ácido nucleico. El nivel de expresión del ácido nucleico diana puede determinarse rutinariamente usando, por ejemplo, análisis por transferencia Northern, PCR en tiempo real, ensayos de protección contra ribonucleasas. Los siguientes tipos celulares se proporcionan con fines ilustrativos, pero pueden usarse rutinariamente otros tipos celulares, con la condición de que la diana se exprese en el tipo celular elegi-
do.

Las células se cultivaron en el medio apropiado tal como se describe más adelante y se mantuvieron a 37ºC con una humedad de 95-98% y 5% de CO_{2}. Las células se pasaron de forma rutinaria 2-3 veces a la semana.

15PC3: La línea de células de cáncer de próstata humano 15PC3 fue donada gentilmente por el Dr. F. Baas, Neurozintuigen Laboratory, AMC, Holanda y se cultivó en DMEM (Sigma) + 10% de suero bovino fetal (FBS) + Glutamax I + gentamicina.

A549: La línea de células de cáncer de pulmón amicrocítico humano A549 se adquirió de ATCC, Manassas y se cultivó en DMEM (Sigma) + 10% de FBS + Glutamax I + gentamicina.

MCF7: La línea de células de cáncer de mama humano MCF7 se adquirió de ATCC y se cultivó en MEM Eagle (Sigma) + 10% de FBS + Glutamax I + gentamicina.

SW480: La línea de células de cáncer de colon humano SW480 se adquirió de ATCC y se cultivó en L-15 Leibovitz (Sigma) + 10% de FBS + Glutamax I + gentamicina.

SW620: La línea de células de cáncer de colon humano SW620 se adquirió de ATCC y se cultivó en L-15 Leibovitz (Sigma) + 10% de FBS + Glutamax I + gentamicina.

HT29: La línea de células de cáncer de próstata humano HT29 se adquirió de ATCC y se cultivó en MM de McCoy 5a (Sigma) + 10% de FBS + Glutamax I + gentamicina.

NCI H23: La línea de células de cáncer de pulmón amicrocítico humano se adquirió de ATCC y se cultivó en RPMI 1640 con Glutamax I (Gibco) + 10% de FBS + HEPES + gentamicina.

HCT-116: La línea de células de cáncer de colon humano HCT-116 se adquirió de ATCC y se cultivó en MM de McCoy 5a + 10% de FBS + Glutamax I + gentamicina.

MDA-MB-231: La línea de células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 se adquirió de ATCC y se cultivó en L-15 Leibovitz + 10% de FBS + Glutamax I + gentamicina.

MDA-MB-435s: La línea de células de cáncer de mama humano MDA-MB-435s se adquirió de ATCC y se cultivó en L-15 Leibovitz + 10% de FBS + Glutamax I + gentamicina.

DMS273: La línea de células de cáncer de pulmón microcítico humano DMS273 se adquirió de ATCC y se cultivó en + 10% de FBS + Glutamax +gentamicina.

PC3: La línea de células de cáncer de próstata humano PC3 se adquirió de ATCC y se cultivó en F12 Coon's con glutamina (Gibco) + 10% de FBS + gentamicina.

U373: La línea de células de cáncer de glioblastoma astrocitoma humano U373 se adquirió de ECACC y se cultivó en EMEM + 10% de FBS + glutamax + NEAA + sodiopirovate + gentamicina.

HeLaSur-GFP: Wheately, S.P. et al, Curr. Biol. 11 446-490, 2001.

HUVEC-C: células endoteliales de vena umbilical humana se compraron de ATCC y se propagaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

HMVEC-d: (DMVEC- células endoteliales microvasculares dérmicas humanas) se adquirieron de Clonetics y se cultivaron tal como describe el fabricante.

HMVEC: células endoteliales microvasculares humanas se adquirieron de Clonetics y se cultivaron tal como se indica el fabricante.

Fibroblastos pulmonares embrionarios humanos se adquirieron de ATCC y se cultivaron tal como describe el fabricante.

HMEC-1: Las células epiteliales de mama humana se adquirieron de Clonetics y se mantuvieron como recomendaba el fabricante.

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Ejemplo 5

Modelo in vitro: tratamiento con oligonucleótido no codificante

Las células se trataron con oligonucleótido usando la formulación de liposomas catiónicos Lipofectamina 2000 (Gibco) como vehículo de transfección.

Las células se sembraron en placas de cultivo celular de 12 pocillos (NUNC) y se trataron cuando estaban a una confluencia de 80-90%. Las concentraciones de oligos usadas variaban de 125 nM a 0,2 nM de concentración final. La formulación de complejos de oligos y lípidos se realizó esencialmente tal como se describe en Dean et al. (Journal of Biological Chemistry 1994, 269, 16416-16424) usando OptiMEM sin suero (Gibco) y una concentración final de lípido de 10 \mug/m/Lipofectamina 2000 en 500 \mul de volumen total.

Las células se incubaron a 37ºC durante 4 horas y el tratamiento se terminó eliminando el medio de cultivo que contenía los oligos.

Las células se lavaron y se añadió medio que contenía suero. Después del tratamiento con oligo, se dejó que las células se recuperaran durante 18 horas antes de recolectarlas para el análisis del ARN o proteína.

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Ejemplo 6

Modelo in vitro: Extracción de ARN y síntesis de ADNc Aislamiento del ARN total

El ARN total se aisló o bien usando RNeasy mini kit (Qiagen n.º de cat. 74104) o usando el reactivo Trizol (Life technologies n.º de cat. 15596). Para aislar el ARN de las líneas celulares, el RNeasy es el procedimiento preferido y para las muestras de tejidos el Trizol es el procedimiento preferido.

El ARN total se aisló de las líneas celulares usando el Qiagen RNA OPF Robot - BIO Robot 3000 de acuerdo con el protocolo que proporciona el fabricante.

Las muestras de tejido se homogeneizaron usando un homegenizador Ultra Turrax T8 (IKA Analysen Technik) y el ARN total se aisló usando el protocolo del reactivo Trizol que proporciona el fabricante.

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Síntesis de la primera hebra

La síntesis de la primera hebra se realizó usando el kit de transcriptasa inversa OmniScript (n.º de cat. 205113, Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para cada muestra 0,5 \mug de ARN total se ajustó a 12 \mul cada uno con H_{2}O sin ARNasas y se mezcló con 2 \mul de poli (dT)_{12}__{18} (2,5 \mug/ml) (Life Technologies, GibcoBRL, Roskilde, DK), 2 \mul de mezcla de dNTP (5 mM cada dNTP), 2 \mul de 10x tampón RT, 1 \mul de inhibidor de ARNasas RNAguard^{TM} (33,3 U/ml), (n.º de cat. 27-0816-01, Amersham Pharmacia Biotech, Htersholm, DK) y 1 \mul de transcriptasa inversa OmniScript (4 U/\mul) seguido de incubación a 37ºC durante 60 minutos e inactivación térmica de la enzima a 93ºC durante 5 minutos.

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Ejemplo 7

Modelo in vitro: Análisis de la inhibición de la expresión de survivina con oligonucleótidos mediante PCR en tiempo real

La modulación no codificante de la expresión de survivina puede ensayarse de varias formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, pueden cuantificarse los niveles de ARNm de survivina, por ejemplo, por análisis mediante transferencia Northern, reacción en cadena de la polimerasa competitiva (PCR), o PCR en tiempo real. Actualmente se prefiere la PCR cuantitativa en tiempo real. La análisis por ARN puede realizarse en ARN o ARNm celular
total.

Los procedimientos de aislamiento del ARN y de análisis del ARN como por ejemplo análisis por transferencia Northern son rutinarios en la técnica y se enseñan, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons.

La PCR cuantitativa en tiempo real puede realizarse convenientemente usando el sistema iQ Multi-Color Real Time PCR Detection System de BioRAD disponible comercialmente.

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Análisis por PCR cuantitativa en tiempo real de los niveles de ARNm de survivina

La cuantificación de los niveles de ARNm se determinó por PCR cuantitativa en tiempo real usando el iQ Multi-Color Real Time PCR Detection System (BioRAD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La PCR cuantitativa en tiempo real es una técnica notoria en la técnica y se enseña por ejemplo en Heid et al. Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6: 986-994.

La mezcla maestra Platinum Quantitative PCR SuperMix UDG 2x PCR se obtuvo de Invitrogen n.º de cat. 11730. Los cebadores y kas sondas TaqMan® se obtuvieron de MWG-Biotech AG, Ebersberg, Alemania

Las sondas y cebadores para survivina humana se diseñaron para que se hibridaran a una secuencia de survivina humana, usando información de secuencias publicada (número de acceso de GenBank NM 001168, que se incorpora al presente documento como la SEC ID N.º: 1).

Para la survivina humana los cebadores de PCR eran:

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Ensayo 1

cebador directo: 5' caggtccccgctttctttg 3' (concentración final en el ensayo; 0,6 \muM)

cebador inverso: 5' ggaggagggcgaatcaaa 3' (concentración final en el ensayo; 0,6 \muM) y

la sonda de la PCR era: 5'FAM-ccatcatcttacgccagacttcagcc-TAMRA3'(concentración final en el ensayo; 0,1
\muM).

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Ensayo 2

cebador directo: 5' aaggaccaccgcatctctaca 3' (concentración final en el ensayo; 0,9 \muM) cebador inverso: 5' ccaagtctggctcgttctcagt 3' (concentración final en el ensayo; 0,6 \muM) y

la sonda de la PCR era: 5' FAM- cgaggctggcttcatccactgcc -TAMRA 3' (concentración final en el ensayo; 0,1
\muM).

Se usó una cantidad de ARNm de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control endógeno para normalizar cualquier variación en la preparación de las muestras.

El contenido de ARNm de GAPDH humana de las muestras se cuantificó usando el reactivo de ensayo GAPDH ABI Prism Pre-Developed TaqMan (Applied Biosystems n.º de cat.4310884E) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Para la cuantificación del ARNm de GAPDH de ratón, se diseñaron los siguientes cebadores y sondas: cebador codificante 5'aaggctgtgggcaaggtcatc 3' (0,3 \muM de concentración final), cebador no codificante 5' gtcagatccacgacggacacatt (0,6 \muM de concentración final), sonda TaqMan 5' FAM-gaagctcactggcatggcatggccttccgtgttc-TAMRA 3'(concentración final 0,2 \muM).

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PCR en tiempo real

El ADNc de la síntesis de la primera hebra realizada tal como se describe en el ejemplo 6 se diluyó 2-20 veces, y se analizó por PCR cuantitativa en tiempo real. Los cebadores y la sonda se mezclaron con 2 x Platinum Quantitative PCR SuperMix UDG (n.º de cat. 11730, Invitrogen) y se añadieron a 3,3 \mul de ADNc a un volumen de final de 25 \mul. Cada muestra se analizó por triplicado. Al ensayar diluciones por un factor 2 de un ADNc que se había preparado en material purificado de una línea celular que expresaba el ARN de interés se generaron curvas de patrones para los ensayos. Se usó H_{2}O estéril en lugar de ADNc para el control sin plantilla. Programa de la PCR: 50ºC durante 2 minutos, 95ºC durante 10 minutos seguido de 40 ciclos de 95ºC, 15 segundos, 60ºC, 1 minuto. Las cantidades relativas de secuencia diana de ARNm se determinaron a partir del ciclo umbral usando el programa iCycler iQ Real-time Detection System.

Véase la Figura 7 y las Tablas 1, 2, 3, 4 y 5.

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Ejemplo 8

Análisis in vitro: análisis por transferencia Northern de los niveles de ARNm de survivina

Se realizó un análisis por transferencia Northern por procedimientos notorios en la técnica esencialmente tal como se describe en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons.

La sonda de hibridación se obtuvo por amplificación por PCR de un fragmento de 373 pb de 1 \mul de ADNc obtenido por PCR de transcripción inversa. La reacción se realizó usando los cebadores 5' agcacaaagccattctaagtcattg 3' (directo) y 5' tccatcatcttacgccagacttc 3' (inverso) a 0,5 \muM de concentración final cada uno, 200 nM de cada dNTP, MgCI_{2} 1,5 mM y ADN polimerasa Platinum Taq (Invitrogen n.º de cat.10966-018). El ADN se amplificó durante 40 ciclos en un termociclador Perkin Elmer 9700 usando el siguiente programa: 94ºC durante 2 min. después 40 ciclos de 94ºC durante 30 sec. y 72ºC durante 30 sec. con un descenso de 0,5ºC por ciclo seguido de 72ºC durante
7 min.

El producto amplificado por PCR se purificó usando columnas S-400 MicroSpin (Amersham Pharmacia Biotech n.º de cat. 27-5140-01) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se cuantificó por espectrofotome-
tría.

La sonda de hibridación se marcó usando Redivue^{TM} [\alpha-^{32}P]dATP 3000 Ci/mmol (Amersham Pharmacia Biotech n.º de cat. AA 0005) y el kit de marcado Prime-It RmT (Stratagene n.º de cat. 300392) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y la sonda marcada radioactivamente se purificó usando columnas S-300 MicroSpin (Amersham Pharmacia Biotech n.º de cat. 27-5130-01).

Antes de usarla, se desnaturalizó la sonda a 96ºC e inmediatamente se puso sobre hielo.

Se desnaturalizaron muestras de 2 \mug de ARN total purificadas tal como se describe en el ejemplo 6 y se separaron por tamaño en un gel de agarosa con formaldehído 2,2 M y MOPS. El ARN se transfirió a una membrana de nylon con carga positiva mediante transferencia capilar hacia abajo usando el TurboBlotter (Schleicher & Schuell) y el ARN se inmovilizó sobre la membrana mediante entrecruzamiento UV usando un reticulador Stratagene. La membrana se prehibridó en una solución de hibridación ExpressHyb (Clontech n.º de cat. 8015-1) a 60ºC y la sonda se añadió posteriormente para la hibridación. La hibridación se realizó a 60ºC y la transferencia se lavó con tampón de lavado poco restrictivo (2 x SSC, 0,1% de SDS) a temperatura ambiente y con tampón de lavado muy restrictivo (0,1 x SSC, 0,1% de SDS) a 50ºC.

La transferencia se expuso a pantallas de fósforo Kodak y se escaneó en un aparato BioRAD FX molecular imager. Los niveles de ARNm de survivina se cuantificaron mediante el programa Quantity One (BioRAD).

Se evaluó la uniformidad de la carga de las muestras de ARN limpiando la transferencia en 0,5% de SDS en H_{2}O a 85ºC y volviendo a sondar con una sonda de GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa) marcada obtenida esencialmente tal como se describe anteriormente usando los cebadores 5' aacggatttggtcgtatt 3' (directo) y 5' taagcagttggtggtgca 3' (inverso). Véanse las figuras 2 y 3. La intensidad se controló con el escaner para fosforescencia Biorad, FX (véase más adelante). Los compuestos oligoméricos analizados se presentan en el
ejemplo 10.

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Regulación por disminución porcentual de ARNm estimada mediante transferencia Northern de Survivina (los datos están normalizados respecto a GAPDH)

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Ejemplo 9

Análisis in vitro: análisis por Western blot de los niveles de proteína survivina

Los niveles de proteína survivina pueden cuantificarse por una variedad de medios notorios en la técnica, como por ejemplo immunoprecipitación, proteína por transferencia Western (inmunotransferencia), ELISA, RIA (Radioinmuno ensayo) o clasificación de células activada por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos contra survivina pueden identificarse y obtenerse de una variedad de fuentes, como por ejemplo Upstate Biotechnologies (Lake Placid, EE. UU.), Novus Biologicals (Littleton, Colorado), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California) o pueden prepararse mediante procedimientos convencionales de generación de anticuerpos.

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Transferencia Western

El efecto in vitro de los oligos contra survivina sobre los niveles de proteína survivina en células transfectadas se determinó mediante transferencia Western. Las células se transfectaron tal como se describe en el ejemplo 5. Aproximadamente 24 horas después de la transfección, las células se recolectaron, se lisaron en 2,5% de SDS, DTT 5 mM y urea 6 M suplementado con comprimidos de cóctel inhibidor de proteasas (Roche). Las concentraciones de proteína totales se midieron usando un reactivo Bradford. Se cargaron 150 \mug de proteínas totales en un gel de 12% de Bis-Tris, que se procesó con un tampón MOPS y se transfirió sobre una membrana de PVDF de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Invitrogen). Después de incubar toda la noche en tampón de bloqueo (Invitrogen), la membrana se incubó dos horas con anticuerpos de conejo contra survivina (AF886 de R&D o Novus 500-201 de Abeam) seguido de incubación durante una hora con anticuerpos secundarios. Se usó un kit de inmunodetección cromógeno (Invitrogen) para visualizar la survivina. De forma alternativa, la membrana se incubó con inmunoglobulinas de conejo conjugadas con HRP (DAKO) seguido de incubación con reactivo ECL+ Plus (Amersham) y se visualizó usando el sistema de detección de quimioluminiscencia VersaDoc (véase la figura 13). Los compuestos oligoméricos analizados se presentan en el ejemplo 10).

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Ejemplo 10

Análisis in vitro: inhibición no codificante de la expresión de survivina humana mediante un compuesto oligomérico

De acuerdo con la presente invención, se diseñó una serie de oligonucleótidos contra diferentes regiones del ARN de survivina humana, usando secuencias publicadas (número de acceso de GenBank NM_001168, que se incorpora en el presente documento como la SEC ID N.º: 1). Los oligonucleótidos de 16 nucleótidos de longitud se muestran en las Tablas 1 y 2. El "sitio diana" indica el primer número del nucleótido en la secuencia diana particular a la que se une el oligonucleótido. Los compuestos preferidos son los compuestos que contienen LNA. La Tabla 3 muestra la baja CI_{50} de cuatro compuestos.

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TABLA 1 Compuestos oligoméricos de la invención

Los compuestos oligoméricos se evaluaron para determinar su potencial para inactivar el ARNm de survivina en las células 15PC3. Los datos se presentan en términos de regulación por disminución porcentual con respecto a las células transfectadas de forma simulada. El tránscrito a nivel estable se controló por PCR en tiempo real y se normalizó con respecto al nivel estable del tránscrito de GAPDH. Obsérvese que todos los LNA C son 5'-Metil-
citosina.

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TABLA 2 Compuestos oligoméricos de la invención

Los compuestos oligoméricos se evaluaron para determinar su potencial para inactivar el ARNm de survivina en las células 15PC3. Los datos se presentan en términos de regulación por disminución porcentual con respecto a las células transfectadas de forma simulada. El tránscrito a nivel estable se controló por PCR en tiempo real y se normalizó con respecto al nivel estable del tránscrito de GAPDH. Obsérvese que todos los LNA C son 5'-Metil-
citosina.

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* relacionado con el compuesto subrayado indica emparejamiento erróneo con respecto al compuesto anterior. Los compuestos 145F y 146F contienen el grupo MOE en mayúsculas y cursiva que es el compuesto ISIS23722.

TABLA 3 CI_{50} (nM) de oligómeros que contienen LNA (\beta-D-oxi-LNA) en dos líneas celulares de origen diferente

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Como se muestra en las tablas 1 y 2, las SEC ID N.º: 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12,13,14, 15, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 125,126,128,129,130 y 131 demostraron una inhibición de al menos 30% de la expresión de survivina a 25 nM en estos experimentos y son por lo tanto preferidos.

Los compuestos de interés particular son 2A, 2B, 4A, 4B, 6A, 6B, 15A, 15B, 15E, 119A, 119B, 121 A, 121B, 128A, 128B, 130A, 130B, 131A y 131B.

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Ejemplo 11

Inhibición mejorada in vitro de la expresión de survivina usando compuestos oligoméricos no codificantes de LNA comparados con fosforotioatos y MOE

Se realizó una comparación de la inhibición de ARNm usando fosforotioatos y MOE (Calbiochem) frente a un compuesto oligomérico no codificante contenía LNA en células 15PC3. Se comparó una versión de ISIS23722 con LNA con el compuesto que contenía MOE, que es un 18-mero 4MOE/PS+10PS+4MOE/PS y se comparó con un fosforotioato isosecuencial. La transfección se realizó en 15PC3 con oligonucleótidos o medio (simulado) (véase el ejemplo 5). El ARNm de survivina se controló con PCR en tiempo real y se normalizó con respecto a GAPDH. El ARNm de survivina presentada relativa a la simulación (véase la Tabla 4).

TABLA 4 Regulación por disminución porcentual de ARNm

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En otro experimento, también se incluyeron los sobrenadantes de cada pocillo de cultivo en el análisis para que permitiera analizar las células que sufren apoptosis tardía. Los compuestos con LNA, PS y MOE 18-meros anteriores se compararon con los LNA 16-meros de la invención. Se transfectaron células 15PC3 con los oligos indicados a las concentraciones dadas (véase el Ejemplo 5). El ARN total se extrajo a 24 horas. Se incluyeron células del sobrenadante en el análisis. El ARNm de survivina se controló con PCR en tiempo real y se normalizó con respecto a GAPDH. El ARNm de survivina presentada relativa a la simulación (véase la Tabla 5).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 5 Regulación por disminución de ARNm (porcentual de la expresión simulada)

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Ejemplo 12

Inducción de apoptosis mediante compuestos oligoméricos no codificantes con LNA

Se sembraron las células a una densidad de 12000 células por pocillo en placas blancas de 96 pocillos (Nunc 136101) en DMEM el día anterior a la transfección. Al día siguiente, las células se lavaron una vez en OptiMEM precalentado seguido de la adición de 72 \mul de OptiM EM que contenía 5 \mug/ml de Lipofectamina 2000 (Invitrogen). Las células se incubaron durante 7 min antes de añadir 18 \mul de oligonucleótidos diluidos en OptiMEM. La concentración final de los oligonucleótidos variaba de 5 nM a 25 nM. Después de 4 h de tratamiento, las células se lavaron en OptiMEM y se añdieron 100 \mul de DMEM que contenía suero. Después del tratamiento con los oligos, se dejó que las células se recuperaran durante el periodo que se indica anteriormente antes de retirarlas del CO_{2}, incubar y equilibrar a temperatura ambiente durante 15 min. Se añadió el reactivo Caspase 3/7-Glo^{TM} (Promega) muy sensible directamente a las células en placas de 96 pocillos y las placas se incubaron durante 20 min. Antes de registrar la luminiscencia (actividad de la luciferasa) en un aparato Luminoskan Ascent de Thermo Labsystems después de 1 minuto adicional de periodo de 1 espera. La actividad de la luciferasa se mide en términos de unidades lumínicas relativas por segundo (RLU/s). Los datos se procesaron en el programa Ascent 2.4.2. y las gráficas se dibujaron en Excel, (véase la figura 8).

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Ejemplo 13

Inducción mejorada de la apoptosis in vitro usando compuestos oligoméricos no codificantes de LNA comparados con fosforotioatos y MOE

Medición de la apoptosis usando microchip de lecho para citometría (CBA) BD^{TM} (n.º cat. 557816). Las células se transfectaron usando lipofectamina 2000 tal como se describe (véase el Ejemplo 5). Veinticuatro horas después de la transfección, las células del sobrenadante se sedimentaron por centrifugación y las células adherentes se tripsinizaron y se sedimentaron por centrifugación. El sedimento celular se volvió a suspender, se lavó en PBS y se contó para llevar la concentración celular a 2 x 10^{6} células/ml de tampón de lisis que contenía inhibidores de proteasas. El procedimiento se realizó tal como describe el fabricante con las siguientes modificaciones. Cuando se lisaron las células, se lisaron durante 40 minutos y se lisaron durante 40 min y se agitaron en vórtice con un intervalo de 10 min. Se incubaron 1x 10^{5} células con Caspasa 3, Bcl-2 y microesferas de PARP, se mezclaron brevemente y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Se analizó la actividad de caspasa 3, la expresión de Bcl2 y la inducción de PARP en las células tratadas con oligos usando el programa BD TM CBA. Los datos se transfirieron a excel y se dibujaron las gráficas. Todos los datos se relacionaron con el tratamiento simulado (que es fija a uno). La Figura 9 muestra que los compuestos que contienen LNA (145A y 145C) mejoran la inducción de la apoptosis comparados con el compuesto con MOE isosecuencial ISIS27322 (aquí 145F) y el compuesto de fosforotioato isosecuencial (145D). En el estudio también se incluyeron controles desemparejados de un compuesto de LNA (146C) y el compuesto con MOE (146F) así como el compuesto de LNA 15A. Además, la activación de caspasa 3 por el compuesto 15A se detectó por análisis inmunohistioquímico de las células tratadas con compuesto oligomérico de LNA (Figura 10).

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Ejemplo 14

Inhibición de survivina mediante oligonucleótidos no codificantes en células cancerosas en proliferación

Se sembraron las células a una densidad de 12000 células por pocillo en placas blancas de 96 pocillos (Nunc 136101) en DMEM el día anterior a la transfección. Al día siguiente, las células se lavaron una vez en OptiMEM precalentado seguido de la adición de 72 \mul de OptiM EM que contenía 5 \mug/ml de Lipofectamina 2000 (Invitrogen). Las células se incubaron durante 7 min antes de añadir 18 \mul de oligonucleótidos diluidos en OptiMEM. La concentración final de los oligonucleótidos variaba de 5 nM a 100 nM. Después de 4 h de tratamiento, las células se lavaron en OptiMEM y se añdieron 100 \mul de DMEM que contenía suero. Tras el tratamiento con oligos, se dejó que las células se recuperaran durante el periodo indicado, las células viables se midieron añadiendo 20 \mul del compuesto de tetrazolio [3-(4,5-dimetil-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio, sal interna; MTS] y un reactivo de acoplamiento de electrones (etosulfato de fenazina; PES) (CellTiter 96® AQ_{ueous} One Solution Cell Proliferation Assay, Promega). Las células viables se midieron a 490 nm en un aparato Powerwave (Biotek Instruments). La tasa de proliferación (\DeltaOD/h) se representó en función de la concentración de oligos (véase la figura 11).

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Ejemplo 15

Medición de poliploidía (ciclo celular) y degradación de ADN (apoptosis) de células tras el tratamiento con compuestos oligoméricos dirigido contra survivina

La etapa tardía de la cascada apoptótica produce grandes números de pequeños fragmentos de ADN que pueden analizarse usando tinción de las células con yoduro de propidio, además, puede usarse la furthermore, tinción de las células con yoduro de propidio para evaluar la ploidía en las células tratadas. Para evaluar la ploidía/apoptosis de las células tratadas con compuesto oligomérico dirigido contra Survivina, las células se lavaron en PBA y se fijaron durante 1 h en 70% de EtOH a 4ºC. Después del tratamiento con 50 ng/ml de ARNsa (Sigma) durante 20 minutos a temperatura ambiente, las células se lavaron con PBS y se incubaron con 40 \mug/ml de yoduro de propidio (Sigma o BD) durante 30 min. Todas las muestras se analizaron usando el separador de células activado por fluorescencia (FACSCalibur, Becton Dickinson) y el programa Cell Quest. En el histograma de ADN, la hipodiploidía o el pico sub-G1 representaba las células apoptóticas.

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Ejemplo 16

Medición de los cambios en el potencial de la membrana mitocondrial de las células tras el tratamiento con compuestos oligoméricos dirigidos contra survivina

Para medir los cambios en el potencial de la membrana mitocondrial, se usó el procedimiento con el reactivo MitoSensor^{TM} (Becton Dickinson, Cat # K2017-1). El reactivo MitoSensor^{TM} es captado por las células sanas, en las que forma agregados que emiten fluorescencia roja. Tras la apoptosis, cambia el potencial de la membrana mitocondrial y no permite que el reactivo se agregue dentro de las mitocondrias y por lo tanto permanece en el citoplasma en su forma monomérica, en la que emite fluorescencia verde. Las células se trataron con compuestos oligoméricos dirigidos contra survivina, se lavaron y se incubaron en reactivo MitoSensor diluido en tampón de incubación tal como describe el fabricante. Los cambios en el potencial de la membrana después del tratamiento con oligos se detectaron mediante el separador de células activado por fluorescencia (FACSCalibur, Becton Dickinson) y usando el programa Cell Quest.

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Ejemplo 17

Inhibición de la formación de capilares con células endoteliales tras el tratamiento con oligos no codificantes

Se incubó una monocapa de células endoteliales (por ejemplo HUVEC) con oligos no codificantes dirigidos contra survivina. La formación de los tubos se analizó por cualquiera de los siguientes procedimientos. El primer procedimiento era el sistema de formación tubular de angiogénesis BD BioCoat. Las células se transfectaron con oligos tal como ha descrito (ejemplo 5). Las células se sembraron a 2 x 10^{4} células/96 pocillos sobre placas de angiogénesis BD Biocoat polimerizadas con matrigel. Las placas se incubaron durante las horas/días que se indica con o sin PMA (5-50 nM), VEGF (20-200 ng/ml), Suramina o vehículo. Las placas se tiñeron con Cacein AM tal como indicaba el fabricante y se tomaron imágenes. La longitud total de los tubos se midió usando MetaMorph. De forma alternativa, las células se sembraron en colágeno de tipo I caudal de rata (3 mg/ml, Becton Dickinson) en 0,1 volumen de 10 x DMEM, se neutralizaron con NaOH 1 M estéril y se mantuvieron sobre hielo o en matrigel. Las células se añadieron a la suspensión de colágeno a una concentración final de 1x 10^{6} células/ml de colágeno. La mezcla de células y colágeno se añadió a 6 pocillos o a placas de 35 mm y se introdujo en una incubadora humidificada a 37ºC. Cuando se formó el gel, se añadieron 3 ml de medio de cultivo más 10% más de FBS y se dejó que las células formaran tubos vasculares de tipo capilar durante el periodo que se indicaba en presencia o ausencia de PMA (16 nM), VEGF (50 ng/ml). La formación de tubos se cuantificó tras cortar los geles con un cryostat y examinar los cortes mediante microscopia de contraste de fases.

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Ejemplo 18

Medición de la citotoxicidad in vitro tras el tratamiento con compuestos oligoméricos dirigidos contra survivina

Se sembraron las células (0,3 - 1,2 x 10^{4}) y se trataron con oligos no codificantes tal como se ha descrito (por ejemplo para el ensayo de MTS del Ejemplo 12). En los tiempos indicados, se transfirieron 20 - 50 \mul de medio de las células tratadas con oligos no codificantes a placas de 96 pocillos para medir la liberación de LDH al medio. Se añadió un volumen igual de sustrato LHD tal como describe el fabricante. La LDH liberada se midió usando un ensayo de acoplamiento enzimático de 30 minutos, que provoca la conversión de una sal de tetrazolio (INT) en un producto de formazán rojo. La cantidad de color que se forma es proporcional al número de células lisadas. Se recogieron los datos de absorbancia a una longitud de onda visible (medida a 490 nm) usando un lector de placas de 96 pocillos estándar (Powerwave, Bio-Tek Instruments). Como control positivo se trataron las células durante aproximadamente 45 minutos con 0,9% de Triton X- 100 (=100% de lisis). La citotoxicidad se representó en una gráfica con el tratamiento simulado y las células tratadas con Triton-x 100 (100% de lisis = 100% de citotoxicidad).

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Ejemplo 19

Modelo in vivo: inhibición del crecimiento tumoral de células tumorales humanas cultivadas in vivo mediante tratamiento sistémico con oligonucleótidos no codificantes

Se adquirieron ratones NMRI hembra atímicos de 6 semanas de edad de M&B, Dinamarca y se dejaron aclimatar durante al menos una semana antes de empezar los experimentos. Se inyectaron células cancerosas humanas habitualmente 10^{6} células suspendidas en 300 \mul de matrigel (BD Bioscience), por vía subcutánea en los flancos de ratones NMRI hembra atímicos de 7-8 semanas de edad. Cuando se hubo establecido el crecimiento tumoral, habitualmente 7-12 días después de inyectar las células tumorales; se administraron diferentes oligonucleótidos no codificantes a 5 mg/kg/día durante hasta 28 días usando bombas osmóticas ALZET implantadas por vía subcutánea. Previo a la implantación dorsal, las bombas se incubaron toda la noche a temperatura ambiente en PBS estéril para iniciar las bombas. Los animales de control recibieron solución salina sola durante el mismo periodo. Cada grupo experimental incluyó al menos 5 ratones. La actividad antitumoral se estimó en términos de inhibición del volumen tumoral. El crecimiento tumoral se siguió regularmente midiendo 2 diámetros perpendiculares. Los volúmenes tumorales se calcularon de acuerdo con la fórmula (\pi x L x D^{2}/6), donde L representa el diámetro mayor y D diámetro tumoral perpendicular a L. Al final del tratamiento se sacrificó a los animales y se midió el peso de los tumores. Se compararon el volumen y peso de los tumores de los grupos usando la prueba de Mann-Whitney. Todos los análisis se realizaron en SPSS versión 11.0 para Windows. En condiciones óptimas también puede realizarse un análisis por Western blot para medir si los oligonucleótidos no codificantes tienen un efecto inhibidor sobre los niveles de proteínas. Al final del periodo de tratamiento, por lo tanto se anestesió a tratamiento y se extirparon los tumores e inmediatamente se congelaron en nitrógeno líquido. Los tumores se homogeneizaron en tampón de lisis (es decir Tris-CI 20 mM [pH 7,5]; 2% de Triton X-100; 1/100 vol. de cóctel inhibidor de proteasas Set III (Calbiochem); 1/100 vol. de cóctel inhibidor de proteasas Set II (Calbiochem)) a 4ºC usando un homogenizador motorizado. Se aplicaron 500 \mul de tampón de lisis por cada 100 mg de tejido tumoral. Los lisados tumorales de cada grupo de ratones se juntaron y se centrifugaron a 13.000 g durante 5 min a 4ºC para eliminar los residuos de tejidos. Las concentraciones de proteínas de los extractos tumorales se determinaron usando el kit de reactivos de ensayo para proteínas BCA (Pierce, Rockford). Los extractos de proteínas (50-100 \mug) se fraccionaron en un gel de SDS-PAGE en gradiente de 4-20% y se transfirieron a membranas de PVDF y se visualizaron mediante tinción con negro amido. La expresión de survivina se detectó con anticuerpo contra survivina humana seguido de IgG contra cabra conjugada con peroxidasa de rábano (DAKO). La inmunorreactividad se detectó mediante ECL Plus (Amersham Bio-tech) y se cuantifcó mediante un sistema Versadoc 5000 lite (Bio-Rad).

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Ejemplo 20

Modelo in vivo: inhibición del crecimiento tumoral de fragmentos tumorales humanos transplantados en ratones atímicos después del tratamiento intraperitoneal con oligos no codificantes de LNA

Se analizó la actividad de inhibición del crecimiento tumoral de oligonucleótidos no codificantes de LNA en ratones atímicos xenotransplantados, NMRI nu/nu, de la granja de cría Oncotest (Freiburg, Alemania). Se obtuvieron fragmentos de tumores humanos de mama (MDA MB 231), próstata (PC3) o pulmón (LXFE 397, Oncotest) de xenoinjertos en pases seriados en ratones atímicos. Después de extirpar los tumores de los ratones donante, se cortaron en fragmentos (1 -2 mm diámetro) y se introdujeron en medio de cultivo RPMI 1640 hasta el implante subcutáneo. Los ratones receptores se anestesiaron mediante inhalación de isoflurano. Se practicó una pequeña incisión en la piel dorsal. Los fragmentos de los tumores (2 fragmentos por ratón) se transplantaron con pinzas. Los tumores MDA MB 231 y LXFE 397 se transplantaron a ratones hembra, los tumores PC3 se transplantaron a ratones macho. Cuando se alcanzó un diámetro tumoral medio de 4-6 mm, se asignó a los animales de forma aleatoria y se trataron con oligonucleótidos a 20 mg/kg por vía intraperitoneal una vez al día durante tres semanas excluyendo los fines de semana. Se incluyó un grupo con vehículo (solución salina) y otro de control positivo (Taxol, 20 mg/kg/día) en todos los experimentos. Todos los grupos estaban formados por 6 ratones. El volumen tumoral se determinó por medición bidimensional con un calibre el día de la aleatorización (día 0) y después dos veces a la semana. Los volúmenes tumorales se calcularon de acuerdo con la fórmula: (a x b^{2}) x 0,5 donde a representa el diámetro tumoral mayor y b la perpendicular. Los ratones se observaron a diario durante 28 días después de la aleatorización hasta que el volumen tumoral se duplicó. Se sacrificó a los ratones cuando los diámetros tumorales superaban 1,6 cm. Para la evaluación de la significación estadística de la inhibición tumoral, se realizó la prueba U de Mann-Whitney-Wilcoxon. Por convención, los valores p < 0,05 indican significancia en la inhibición tumoral.

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Ejemplo 21

Biodistribución de oligonucleótidos en ratones

Se adquirieron ratones NMRI hembra atímicos de 6 semanas de edad de M&B, Dinamarca y se dejaron aclimatar durante al menos una semana antes de empezar los experimentos. Se inyectaron células cancerosas humanas habitualmente 10^{6} células suspendidas en 300 \mul de matrigel (BD Bioscience), por vía subcutánea en los flancos de ratones NMRI hembra atímicos de 7-8 semanas de edad. Cuando el crecimiento tumoral fue evidente, se administraron oligonucleótidos marcados con tritio a 5 mg/kg/día durante 14 días usando bombas osmóticas ALZET implantadas por vía subcutánea. Los oligonucleótidos se marcaron con tritio tal describen Graham MJ et al. (J Pharmacol Exp Ther 1998; 286(1): 447-458). Los oligonucleótidos se cuantificaron por recuento del centelleo de extractos de tejido de todos los órganos principales (hígado, riñón, bazo, corazón, estómago, pulmones, intestino delgado, intestino grueso, nódulos linfáticos, piel, músculo, grasa, hueso, médula ósea) y tejido tumoral humano transplantado por vía subcutánea.

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Ejemplo 22

Captación del compuesto oligomérico de LNA en xenoinjertos de tumores humanos

Se homogeneizaron tumores xenoinjertados humanos de 15PC3 de acuerdo con el Ejemplo 13 en 10 volúmenes de 0,5% de Igepal CA-630, Tris 25 mM a pH 8,0, EDTA 25 mM, NaCI 100 mM, 1 mg/ml de proteinasa K1 y se incubaron toda la noche a 37 grados centígrados seguido de extracción con fenolcloroformo. La concentración de oligonucleótido no codificante 2650 en la fase acuosa combinada se determinó usando un ensayo ELISA específico de secuencia. Dos sondas, una marcada con biotina y una marcada con digoxigenina (DIG) con secuencias complementarias al oligonucleótido no codificante se hibridaron al oligo no codificante. El complejo se capturó mediante estreptavidina inmovilizada y se cuantificó usando un anticuerpo contra digoxigenina conjugado con peroxidasa de rábano y por procedimientos de ELISA estándar. En resumen, se mezclaron sonda de captura de ADN 10 nM (5'-aactgtgc-Biotina-3') y sonda de detección de LNA 10 nM (5'-DIG-GATGTTTCgatgtttc-3') con muestra o patrones en reactivo de bloqueo al 1% (Roche n.º de cat. 1 096 176) en PBS. Las sondas se hibridaron al oligo calentando la mezcla a 70 grados centígrados y enfriando gradualmente a 20 grados centígrados. La mezcla se transfirió a pocillos recubiertos de estreptavidina. La cantidad de DIG-sonda capturada se cuantifica usando un fragmento de anticuerpo contra DIG conjugado con HRP (Roche) y procedimientos de ELISA estándar. Se detectaron al menos, 1,3 \mug/g del compuesto oligomérico 15A en el tejido tumoral (los datos no están ajustados a la recuperación).

La presente invención ha sido descrita con especificidad de acuerdo con algunas de sus realizaciones preferidas. Por lo tanto, los siguientes ejemplos sirven únicamente para ilustrar la invención y no se pretende que la limiten.

Claims (36)

1. Un compuesto capaz de modular la expresión de survivina constituido por un total de 12-25 nucleótidos y/o análogos nucleotídicos, en el que dicho compuesto comprende una subsecuencia de al menos 8 nucleótidos o análogos nucleotídicos, estando dicha secuencia localizada dentro de la secuencia CTCAATCCATGGCAGC (SEC ID N.º: 130), en el que dicho compuesto comprende al menos un análogo nucleotídico.

2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho al menos un análogo nucleotídico contiene una unidad de ribosa que es diferente de 2-desoxirribosa o ARN.

3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho al menos un análogo nucleotídico contiene una base nitrogenada que es diferente de A, C, T y G.

4. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho al menos un análogo nucleotídico contiene un grupo de enlace que es diferente de fosfato.

5. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho grupo de enlace es fosforotioato o fosfato de boro.

6. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que todos los grupos de enlace son fosforotioato.

7. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho compuesto comprende 4-25 análogos nucleotídicos que contienen una unidad de ribosa que es diferente de 2-desoxirribosa o ARN, o que contienen una base nitrogenada que es diferente de A, C, T y G.

8. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho compuesto comprende 6-20 análogos nucleotídicos que contienen una unidad de ribosa que es diferente de 2-desoxirribosa o ARN, o que contienen una base nitrogenada que es diferente de A, C, T y G.

9. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicho compuesto comprende 6-12 análogos nucleotídicos que contienen una unidad de ribosa que es diferente de 2-desoxirribosa o ARN, o que contienen una base nitrogenada que es diferente de A, C, T y G.

10. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho compuesto comprende una subsecuencia de al menos 12 nucleótidos o análogos nucleotídicos.

11. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho compuesto comprende 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 análogos nucleotídicos.

12. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que está constituido por un total de 12-20 nucleótidos y/o análogos nucleotídicos.

13. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que está constituido por 15, 16 ó 17 nucleótidos y/o análogos nucleotídicos.

14. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho compuesto comprende un nucleósido en el extremo 3'.

15. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho al menos un análogo nucleotídico se selecciona a partir del grupo constituido por 2'-O-metilribosa, 2'-fluoro-2'-desoxirribosa, 2'-O-metoxietilribosa, 2'-O-(3-hidroxi)propilribosa, 2'-O-(3-amino)propilribosa y un ácido nucleico bloqueado
(LNA).

16. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el al menos un análogo nucleotídico o los análogos nucleotídicos son ácidos nucleicos bloqueados (LNA).

17. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16, en el que dicho LNA está en la forma beta-D.

18. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16, en el que dicho LNA está en la forma alfa-L.

\newpage

19. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en el que dicho al menos un análogo nucleotídico es un ácido nucleico bloqueado (LNA) de la fórmula

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34

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en la que Z y Z* son de forma independiente un enlace internucleosídico, un grupo terminal o un grupo protector; y X e Y se seleccionan de forma independiente a partir del grupo constituido por O, S, NR, CH_{2}, CH (si es parte de un enlace doble), CH_{2}-O, CH_{2}-S, CH_{2}-NR, CH_{2}-CH_{2}, CH_{2}-CH (si es parte de un enlace doble) y CH=CH, donde R es hidrógeno o alquilo C_{1-4}.

20. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 19, en el que X es O e Y se selecciona a partir del grupo constituido por O, S y NR, donde R es hidrógeno o alquilo C_{1-4}.

21. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 20, en el que X es O e Y se selecciona a partir del grupo constituido por O, S y NH.

22. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 20, en el que X es O e Y es O.

23. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la subsecuencia comprende un tramo de 2-6 LNA, seguido de un tramo de 4-12 nucleótidos, que viene seguido por un tramo de 2-6 LNA, en el que los LNA son tal como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 17 - 22.

24. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho compuesto comprende la subsecuencia CTCAATCCATGGCAGC (SEC ID N.º: 130), en el que dicho compuesto comprende al menos un análogo nucleo-
tídico.

25. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 24, en el que dicho compuesto está constituido por la secuencia CTCAATCCATGGCAGC (SEC. ID. N.º:130), en el que dicho compuesto comprende al menos un análogo nucleotídico.

26. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho compuesto comprende una subsecuencia que se selecciona a partir del grupo constituido por

C_{S}T_{S}C_{S}A_{S}a_{s}t_{s}c_{3}c_{3}a_{s}t_{s}g_{s}g_{s}C_{S}A_{S}G_{S}C (SEC ID N.º: 130A),

C_{S}T_{S}C_{S}A_{S}a_{s}t_{s}c_{s}c_{s}a_{s}t_{s}g_{s}C_{S}A_{S}G_{S}c (SEC ID N.º: 130B),

C_{O}T_{O}C_{O}A_{O}a_{s}t_{s}c_{s}c_{s}a_{s}t_{s}g_{s}C_{O}A_{O}G_{O}C (SEC ID N.º: 130C) y

c_{s}t_{s}c_{s}a_{s}a_{s}t_{s}c_{s}c_{s}a_{s}t_{s}g_{s}g_{s}c_{s}a_{s}g_{s}c (SEC ID N.º: 130D),

en las que

las letras mayúsculas indican beta-D-oxi-LNA,

las letras minúsculas indican ADN,

el subíndice O indica un enlace fosfato, y

el subíndice S indica un enlace fosforotioato.

27. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dicho compuesto está constituido por una secuencia que se selecciona a partir del grupo constituido por

C_{S}T_{S}C_{S}A_{S}a_{s}t_{s}c_{s}a_{s}t_{s}g_{s}g_{s}C_{S}A_{S}G_{S}C (SEC ID N.º: 130A),

C_{S}T_{S}C_{S}A_{S}a_{s}t_{s}c_{s}c_{s}a_{s}g_{s}g_{s}C_{S}A_{S}G_{S}c (SEC ID N.º: 130B),

C_{O}T_{O}C_{O}A_{O}a_{s}t_{s}c_{s}c_{s}a_{s}t_{s}g_{s}g_{s}C_{O}A_{O}G_{O}C (SEC ID N.º: 130C) y

c_{s}t_{s}c_{s}a_{s}a_{s}t_{s}c_{s}c_{s}a_{s}t_{s}g_{s}g_{s}c_{s}a_{s}g_{s}c (SEC ID N.º: 130D),

en las que

las letras mayúsculas indican beta-D-oxi-LNA,

las letras minúsculas indican ADN,

el subíndice O indica un enlace fosfato, y

el subíndice S indica un enlace fosforotioato.

28. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 27, en el que dicho compuesto está constituido por C_{S}T_{S}C_{S}A_{S}a_{s}t_{s}
c_{s}c_{s}a_{s}t_{s}g_{s}g_{s}C_{S}A_{S}G_{S}c (SEC ID N.º: 130B).

29. Un conjugado que comprende el compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes y al menos un resto no nucleotídico o no polinucleotídico unido covalentemente a dicho compuesto.

30. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -27 o un conjugado de acuerdo con la reivindicación 29, y un diluyente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

31. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 30, que además comprende al menos un agente quimioterapéutico.

32. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 30 ó 31, en la que dicho vehículo es solución salina.

33. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 32, en la que dicho vehículo es solución salina tamponada con fosfato.

34. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -28 o un conjugado de acuerdo con la reivindicación 29 para usar como medicamento.

35. Uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -28 o un conjugado de acuerdo con la reivindicación 29 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

36. Uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -28 o un conjugado de acuerdo con la reivindicación 29 para la fabricación de un medicamento, combinado con un agente quimioterapéutico, para el tratamiento del cáncer.