ES2329153T3

ES2329153T3 - Compuesto de matriz osteogenico, procedimiento para su preparacion asi como implante y andamiaje bioactivo para la ingenieria tisular con un recubrimiento de un compuesto de matriz osteogenico.

Info

Publication number: ES2329153T3
Application number: ES05748181T
Authority: ES
Inventors: Dieter Scharnweber; Hartmut Worch; Susanne Bierbaum
Original assignee: Nexilis AG
Current assignee: Nexilis AG
Priority date: 2004-04-15
Filing date: 2005-04-15
Publication date: 2009-11-23
Anticipated expiration: 2025-04-15
Also published as: AU2005232363B2; EP1735022A1; CA2563545C; AU2005232363A1; AU2005232363A2; DE502005007658D1; WO2005099785A1; ATE435668T1; JP2007532211A; EP1735022B1; KR20070004844A; US8043627B2; US20070237799A1; CA2563545A1; US20100119575A1; KR101162191B1

Abstract

Procedimiento para la preparación de un implante o un andamiaje bioactivo para la ingeniería tisular con un recubrimiento de un compuesto de matriz osteogénico, caracterizado porque el compuesto de matriz osteogénico es un compuesto de matriz formado por colágeno y por lo menos un componente de la ECM no colagénico o sus derivados, en el que el componente de colágeno está compuesto por fibrillas de colágeno no reticuladas, generadas por medio de fibrilogénesis, y en donde en las mismas está integrado el por lo menos un componente de la ECM no colagénico o sus derivados, en donde antes de la fibrilogénesis se agrega el por lo menos un componente de la ECM no colagénico o sus derivados, y porque las fibrillas de colágeno así generadas se vuelven a suspender en agua o en un búfer y a continuación se inmovilizan sobre la superficie del implante o del andamiaje bioactivo en un procedimiento de recubrimiento por inmersión, o porque durante la preparación de un andamiaje bioactivo para la ingeniería tisular se provoca la formación de fibrillas en el andamiaje bioactivo, en donde las fibrillas generadas in situ quedan como gel o se secan.

Description

Compuesto de matriz osteogénico, procedimiento para su preparación así como implante y andamiaje bioactivo para la ingeniería tisular con un recubrimiento de un compuesto de matriz osteogénico.

La invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un implante o un andamiaje bioactivo (scaffold) para la ingeniería tisular con un recubrimiento de un compuesto de matriz osteogénico formado por colágeno y componentes no colagénicos de la matriz extracelular (componentes de la ECM), así como también implantes y andamiajes bioactivos para la ingeniería tisular con un recubrimiento de un compuesto de matriz osteogénico para la estimulación y la formación acelerada de tejido duro, como por ejemplo, en el campo de la integración ósea de implantes en huesos, así como también una solución de recubrimiento que contiene un compuesto de matriz osteogénico.

En el tejido, las células se encuentran incorporadas en la matriz extracelular natural (ECM), la que es un componente importante del entorno celular. La ECM natural representa una red específica del tejido, muy ordenada, que está compuesta por colágenos, glicoproteínas, proteoglicanos y glicosaminoglicanos (GAG). La composición para los diversos tejidos y para diversos estadios de desarrollo es muy diferente, de modo que cada matriz presenta propiedades específicas con respecto a la interacción con células y factores de crecimiento.

La proteína estructural principal de la matriz ósea natural es el colágeno tipo I, pero diversas otras proteínas de matriz, tales como los proteoglicanos y las glicoproteínas pueden interactuar con el colágeno e influir sobre la estructura y la función de la matriz. Estas proteínas de la ECM no colagénicas cumplen funciones específicas en la matriz. Así, la fibronectina además de las propiedades ligantes de células, presenta propiedades ligantes de colágeno y de GAG [Stamatoglou y Keller, 1984, Biochim. Biophys. Acta, Oct. 28], mientras que proteínas pequeñas ricas en leucina (SLRP) como la decorina, no sólo desempeñan un papel en la organización de la ECM natural (la decorina modula la formación de fibrillas in vivo), sino que también factores de crecimiento como TGF-\beta o la misma desempeñan un papel como moléculas-señales [Kresse y Schönherr, 2001, J. Cell Phys. 189: 266-274].

Los proteoglicanos y las glicoproteínas se diferencian por su grado de glicosilación, en donde la parte de azúcar de los proteoglicanos altamente glicosilados está formada por diversos glicosaminoglicanos. La distribución de estas cadenas puede ser específica de los tejidos, como por ejemplo, para la decorina (sulfato de condroitina en el hueso, sulfato de dermatano en la piel). Los glicosaminoglicanos son polisacáridos no ramificados, grandes, que están compuestos por disacáridos que se repiten, los cuales están compuestos, por ejemplo, por N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina, glucuronato o iduronato, los cuales están sulfatados en diversos grados. Las cadenas de azúcares están presentes ligados a los proteoglicanos in vivo y desempeñan un papel importante en la función de estas proteínas, es decir, en la ligadura y modulación del factor de crecimiento [Bernfield et al., 1999, Annu. Rev. Biochem., 68: 729-777].

Los componentes individuales de la ECM, especialmente el colágeno, se usan ya para la modificación biocompatible de andamiajes bioactivos e implantes, para mejorar la adhesión celular y el comportamiento curativo. La US 2003/141618 A1 describe un procedimiento para la preparación de una capa de orientación de material polimérico. Con el mismo, por medio de fibrilogénesis bajo flujo de corte, se puede lograr una estructura de una o más capas de fibras de colágeno orientadas, las que se pueden usar como tales para fines terapéuticos. Aparte de colágeno, se usan otros componentes de la ECM, como los polisacáridos, en diversas aplicaciones. Así, se reticuló tejido óseo con glicosaminoglicanos, para preparar un andamiaje bioactivo tridimensional para aplicaciones en el cultivo de tejidos (documento WO 01/02030A2).

Una mezcla que contiene sulfato de condroitina se usa para la reparación de los defectos de los huesos; ésta estimula la curación del tejido conectivo, principalmente en base a la parte de aminoazúcares y a una mayor producción de matriz provocada por la misma (documentos WO 98/27988, WO 99/39757). En combinación con colágeno se usan polisacáridos vegetales como apósitos sobre heridas (documento EP 0140569 A2), y una combinación de quitosano y GAGs se describe como agente para la estimulación de la regeneración de tejido duro (documento WO 96/02259). Las mezclas de colágeno-GAG son preparadas para ello por medio de coprecipitación con ácido, en donde se forma un precipitado no estructurado y no fibrillas de colágeno definidas comparables a la de la ECM natural (documentos US 4448718, US 5716411, US 6340369).

Con la creciente disponibilidad de factores de crecimiento recombinantes, los factores osteoinductivos, que influyen activamente sobre las interacciones entre el implante y el tejido circundante, despiertan cada vez más interés para aplicaciones en implantes [Anselme, K. (2000). Biomaterials 21, 667-68]. Con relación a la curación de los huesos son interesantes especialmente las proteínas morfogenéticas óseas ["bone morphogenetic proteins"] (BMP 2, 4-7), ya que las mismas inducen la diferenciación de las células madre mesenquimáticas en los condrocitos y los osteoblastos, y la nueva formación de huesos [Celeste, A. J., Taylor, R., Yamaji, N., Wang, J., Ross, J., Wozney, J. M. (1994), J. Cell Biochem. 16F, 100; Wozney, J. M., Rosen, V. (1993), Bone morphogenetic proteins en Mundy, G. R., Martin, T. J. (Ed.), Physiology and pharmacology of bone. Handbook of experimental pharmacology, vol. 107, Springer Verlag, Berlín, 725-748].

Debido a estos fuertes efectos de inducción ósea se usan BMP recombinantes en diversos materiales de soporte, para estimular y mejorar la regeneración de los huesos. Los soportes efectivos para las proteínas morfogenéticas tienen que ligar a las mismas, protegerlas contra hidrólisis, posibilitar una liberación controlada, subsiguiente, y estimular las reacciones celulares asociadas. Además, tales soportes tienen que ser biocompatibles y biodegradables. Los materiales de soporte preferidos para las BMP son, por ejemplo, la matriz ósea xenogénica (documento WO 99/39757) o el tejido natural reticulado posteriormente con GAGs (WO 01/02030 A2) o HAP, colágeno, TCP, metilcelulosa, PLA, PGA y diversos copolímeros (documentos EP 0309241 A2, DE 19890329, EP 0309241 A2, DE 19890906, WO 8904646 A1, DE 19890601). Otras aplicaciones comprenden un polímero sintético reticulado transversalmente, el cual puede contener componentes adicionales como GAG, colágeno o factores bioactivos (documento WO 97/22371), o colágeno reticulado transversalmente mezclado con glicosaminoglicanos y factores osteogénicos (documentos WO 91/18558, WO 97/21447). La mezcla de colágeno-GAG se prepara para ello igualmente por medio de coprecipitación con ácido.

El uso de factores de crecimiento recombinantes está relacionado con grandes desventajas. Como los factores recombinantes presentan mayormente menor actividad que los factores endógenos, que existen naturalmente en el tejido, para lograr un efecto in vivo son necesarias dosis altas, no fisiológicas. La administración de factores recombinantes puede simular sólo en forma muy incompleta la acción de los factores endógenos.

Mediante el uso de factores que estimulan la acción de las BMP (proteínas morfogenéticas óseas), o mediante el uso de células que pueden expresar los factores de crecimiento en el sitio, se trata de minimizar o evitar este problema (documentos WO 97/21447, WO 98/25460). Otros problemas pueden presentarse por el hecho de que los receptores para las BMP aparecen en muchos tejidos distintos, es decir que la función de estos factores de crecimiento no se limita sólo a los huesos.

El objeto de la presente invención es proveer un compuesto de matriz biocompatible y biodegradable, que estimule y acelere la fijación ósea y el crecimiento óseo en el entorno inmediato y sobre la superficie de los implantes recubiertos con el compuesto de matriz, y que se pueda usar especialmente para el recubrimiento de implantes sintéticos, metálicos o cerámicos. Otro objeto de la invención es un recubrimiento de materiales de soporte (scaffolds) para la ingeniería tisular, los cuales ayudan a la formación de tejido duro in vitro y en consecuencia in vivo.

La invención se basa en el conocimiento científico de que para los implantes en contacto con el hueso, en la mayoría de los casos, debido al tejido circundante y la irrigación, se encuentra presente una cantidad suficiente de factores osteogénicos endógenos. También el efecto de inducción ósea de las BMP, que se puede observar in vivo bajo condiciones fisiológicas, probablemente no sea producido por un sólo tipo de factor de crecimiento, sino el resultado de la acción sinérgica de una multiplicidad de factores endógenos.

Con estos antecedentes, resulta deseable lograr un recubrimiento de implantes que aproveche de manera ventajosa los factores osteogénicos endógenos que están presentes en el sitio del implante.

Este objeto se logra de acuerdo con la invención mediante la preparación de un implante o un andamiaje bioactivo para la ingeniería tisular con un recubrimiento de un compuesto de matriz osteogénico formado por colágeno y por lo menos un componente de la ECM no colagénico o sus derivados, en el cual el componente de colágeno está compuesto por fibrillas de colágeno no reticuladas, generadas por medio de fibrilogénesis, en el cual se encuentran integrados el por lo menos un componente de la ECM no colagénico o sus derivados.

Para el compuesto de matriz osteogénico se usaron de acuerdo con la invención componentes de la matriz extracelular, los cuales en cuanto a la composición y la morfología se asemejan lo más posible a los componentes de la matriz, como existen naturalmente en el hueso, los cuales son biocompatibles y biodegradables, y tienen funciones específicas del tejido óseo, tanto con respecto a la ligadura y la presentación de factores de crecimiento, así como también en la influencia directa sobre las reacciones de las células. De este modo, se ofrece a las células un microentorno lo más similar posible a las condiciones in vivo, las cuales influyen en forma positiva sobre las funciones celulares y la reacción sobre factores osteogénicos como los factores de crecimiento.

El concepto colágeno comprende todos los tipos de colágeno que forman fibrillas. Entran en consideración todas las fuentes de colágeno que suministren monómeros de colágeno solubles en ácido, no reticulados, recombinantes o purificados, con o sin telopéptidos.

El concepto de componentes de la ECM no colagénicos comprende tanto los glicosaminoglicanos como también las proteínas no colagénicas, las que son componentes conocidos de la ECM natural.

El concepto de proteínas no colagénicas comprende todas las proteínas de matriz con estructura no colagénica (proteoglicanos y glicoproteínas) o parcialmente colagénica (FACITs).

El componente principal del compuesto de matriz osteogénico es el colágeno de tipo I, II, III, V, IX, XI o sus combinaciones. En principio se puede usar cualquier tipo de colágeno formador de fibrillas, que suministre monómeros de colágeno solubles en ácido, no reticulados, prefiriéndose los colágenos I, III y V, ya que éstos son los colágenos representados principalmente en el hueso.

La composición de matriz osteogénica contiene como componentes GAG, sulfato de condroitina A, C, D, E; sulfato de dermatano, sulfato de queratano, sulfato de heparano, heparina, ácido hialurónico o sus derivados, tanto en forma individual como mezclados, prefiriéndose el sulfato de condroitina. Los azúcares usados son preparados sintéticamente o aislados de fuentes biológicas.

La composición de matriz osteogénica puede contener como otras proteínas de matriz no colagénicas, fibronectina, decorina, biglicano, laminina o versicano, tanto en forma individual como mezcladas, prefiriéndose decorina y biglicano. Las proteínas usadas son preparadas o bien en forma recombinante o aisladas naturalmente de fuentes biológicas.

Para generar una matriz lo más similar posible al hueso, se usan preferentemente colágeno tipo I, decorina así como también biglicano y/o sus cadenas de GAG como sulfato de condroitina. La decorina o el biglicano se usan aquí para aprovechar las ligaduras y/o sinergismos entre la matriz, el factor de crecimiento y la célula. Otra posibilidad, que se prefiere aquí, es el uso de cadenas de GAG que ligan factores de crecimiento propios del cuerpo y/o pueden potenciar su acción; especialmente el sulfato de condroitina que se encuentra en gran parte en el hueso. Mediante la combinación de colágeno con otros GAG o componentes de la matriz, se pueden utilizar también otros factores de crecimiento propios del cuerpo para una curación acelerada, como por ejemplo, VEGF por sulfato de heparano para la estimulación de la vascularización.

De acuerdo con la invención se prepara un compuesto de matriz osteogénico a partir de colágeno y por lo menos un componente de la ECM no colagénico o sus derivados de tal modo que se generan fibrillas de colágeno por medio de fibrilogénesis, agregando antes de la fibrilogénesis por lo menos un componente de la ECM no colagénico o sus derivados.

Las fibrillas de colágeno así generadas, después de la resuspensión en agua o en un sistema de búfer pueden ser usadas como solución de recubrimiento o liofilizadas.

La fibrilogénesis (es decir, la formación de fibrillas de colágeno) se realiza bajo las siguientes condiciones: intervalo de temperatura de 4ºC a 40ºC, preferentemente 25ºC a 37ºC, concentración de colágeno 50 a 5000 \mug/ml, preferentemente 250 a 1000 \mug/ml, pH 4 a pH 9, preferentemente pH 6 a pH 8, contenido de fosfatos hasta 500 mmoles/l, preferentemente 30 a 60 mmoles/l, contenido de NaCl hasta 1000 mmoles/l, preferentemente hasta 300 mmoles/l.

Mediante el procedimiento de preparación de acuerdo con la invención se produce un compuesto de matriz osteogénico con una estructura y composición definidas, comparable a la situación en la ECM natural.

Es característica para las fibrillas de colágeno in vivo una asociación de los monómeros de colágeno, lateral, desplazada entre sí, ordenada, formándose un patrón de bandas típico con una periodicidad de 64 a 67 nm. Esta asociación se debe, entre otros, al patrón de carga de los monómeros. La formación de fibrillas in vitro es provocada haciendo que el pH, la temperatura y la concentración iónica de una solución de colágeno ácida, fría, se lleven a valores cercanos a los parámetros fisiológicos.

Los glicosaminoglicanos u otros componentes de la matriz se agregan antes de la fibrilogénesis a la solución que contiene los monómeros de colágeno y de este modo son incluidos en el proceso subsiguiente de la fibrilogénesis. Mediante la presencia de los componentes de la ECM no colagénicos durante la fibrilogénesis los mismos son integrados en las fibrillas que se generan y se forma una matriz que, con respecto a los componentes usados, corresponde a la composición y la estructura de la ECM natural.

Durante la fibrilogénesis in vitro el colágeno forma las fibrillas de bandas transversales características análogamente a las estructuras in vivo, en donde la estructura de las fibrillas que se forman son influenciadas por los parámetros del proceso (pH, concentración de iones, concentración de fosfato) y por el tipo y la cantidad de los componentes no colagénicos presentes en la solución de reacción. Para los proteoglicanos que modifican la matriz in vivo, como decorina, se obtiene de esta manera la mayor aproximación posible a su función biológica natural, ya que los mismos también pueden tener influencia bajo condiciones in vitro sobre la estructura de las fibrillas que se forman.

Al contrario de la formación de estructura como consecuencia de agregación por fibrilogénesis, en un medio ácido se puede provocar la agregación de colágeno también por adición de un polianión, como los glicosaminoglicanos, en donde la causa de esto son las interacciones electrostáticas existentes entre el GAG y el monómero del colágeno. En un precipitado ácido como éste no se puede comparar la asociación de los monómeros de colágeno con aquella bajo condiciones fisiológicas similares. Se forma o bien un precipitado amorfo o, con relaciones cuantitativas correspondientes y una concordancia suficiente del patrón de carga, se forma un agregado polimorfo como cristalitos de separación de segmentos largos.

Para las glicoproteínas o los proteoglicanos como decorina, no existe una posibilidad de una precipitación desde el medio ácido.

Para mantenerse lo más próximo posible a las condiciones in vivo, las fibrillas de colágeno de acuerdo con la invención no se reticulan. Una reticulación aumentaría por un lado la estabilidad, pero por otro lado tendría un efecto desventajoso sobre aquellos dominios que pueden formar ligaduras específicas con factores osteogénicos endógenos. Esto tiene importancia especialmente para la función de los GAGs ya que sus propiedades ligantes del factor de crecimiento se basan en una movilidad libre de la cadena de azúcares, la que es limitada por la reticulación. Al mismo tiempo los azúcares pueden ser liberados así de la matriz, lo que es importante para la presentación de los factores de crecimiento en la superficie celular.

La invención comprende el uso del compuesto de matriz osteogénico de acuerdo con la invención para el recubrimiento de implantes o andamiajes bioactivos (scaffolds) para la ingeniería tisular.

Bajo implante en el sentido de la invención se entienden todos los implantes metálicos, cerámicos y poliméricos o compuestos por varios grupos de materiales, cuyas superficies se encuentran por lo menos parcialmente en contacto con el tejido óseo. Igualmente todas las estructuras metálicas, cerámicas y poliméricas o que están compuestas por diversos grupos de materiales, que sirven como andamiaje bioactivo para la ingeniería tisular del tejido duro.

El compuesto de matriz osteogénico descrito más arriba es adecuado especialmente para el recubrimiento de implantes no degradables en contacto con el hueso, como articulaciones de cadera artificiales, implantes de dientes u otras aplicaciones que soportan cargas, para las cuales es necesaria una integración rápida y firme del implante en el hueso.

La matriz osteogénica en combinación con un implante tridimensional, degradable, que se implanta como sustituto del hueso, puede acelerar ventajosamente la integración y la transformación del implante así como también la formación de nuevo hueso. Estos implantes pueden presentar, por ejemplo, como componentes básicos estructuras particulares o tridimensionales de fosfatos de calcio, pero también materiales poliméricos.

Para la ingeniería tisular, la composición de matriz osteogénica en combinación con un andamiaje bioactivo es ventajosa para la proliferación y la diferenciación de las células osteogénicas. Como andamiaje bioactivo entran en consideración todas las estructuras tridimensionales, porosas, de polímeros sintéticos o naturales (por ejemplo, colágeno), cerámica o metal, en forma individual o en combinación, prefiriéndose los andamiajes bioactivos biodegradables de polímero y/o cerámica.

Por medio del compuesto de matriz osteogénico se ligan factores osteogénicos como, por ejemplo, los factores de crecimiento que se encuentran presentes in vivo, después de la implantación, a la superficie del implante y se refuerza su actividad. Ventajosamente, por medio del implante recubierto con el compuesto de matriz osteogénico, se reclutan diversos factores endógenos, los que se encuentran presentes en el sitio de la implantación.

Para la preparación de un implante o un andamiaje bioactivo para la ingeniería tisular, se usa la solución de recubrimiento que contiene el compuesto de matriz osteogénico, para inmovilizar el compuesto de matriz osteogénico ventajosamente por medio de un procedimiento de recubrimiento por inmersión (dip-coating) sobre su superficie. La concentración de colágeno de la solución de recubrimiento puede estar en un intervalo de 0,5 mg/ml a 5 mg/ml, en donde 1 mg/ml a 2 mg/ml es el intervalo preferido. El compuesto de matriz osteogénico es inmovilizado por incubación del implante durante 5 a 20 minutos a temperatura ambiente, a continuación se seca y se lava con agua. El espesor de la capa generada puede ser influenciado por la concentración de la solución de recubrimiento y por la cantidad de repeticiones del procedimiento.

Para la generación de un andamiaje bioactivo tridimensional recubierto en combinación con el compuesto de matriz osteogénico descrito se incorpora la mezcla de componentes ventajosamente antes de comenzar la formación de fibrillas en el andamiaje bioactivo, el que puede ser de origen metálico, cerámico y/o polimérico. La fibrilogénesis se provoca a continuación por aumento de temperatura. Las fibrillas formadas in situ pueden quedar o bien como gel de colágeno, o ser secadas en forma similar al recubrimiento de la superficie.

El implante o andamiaje bioactivo así preparado puede ser esterilizado con los procedimientos no térmicos conocidos como óxido de etileno o radiación gamma y almacenado a temperatura ambiente.

El implante o andamiaje bioactivo recubierto con el compuesto de matriz osteogénico de acuerdo con la invención se diferencia de las soluciones conocidas del estado de la técnica por las siguientes ventajas:

\bullet: Buena compatibilidad biológica y funcionalidad de la matriz generada, por una composición y estructura ampliamente fisiológica en base a las condiciones durante la preparación y el uso de componentes, los cuales se corresponden con los del entorno celular natural.

\bullet: Alta variabilidad con respecto a los componentes que se pueden usar y sus proporciones en la mezcla de componentes.

\bullet: Condiciones de almacenamiento y esterilización sencillas.

\bullet: Alta especificidad y eficiencia por el aprovechamiento de los factores osteogénicos propios del cuerpo.

En base a los siguientes ejemplos de formas de realización, ensayos comparativos y figuras, se explicará con mayores detalles la invención.

Para ello se muestra en:

Fig. 1: Influencia de decorina y sulfato de condroitina (CS) sobre la formación de las fibrillas de colágeno, medida como aumento de la turbidez de una solución de fibrilogénesis en función del tiempo.

Fig. 2: Fotografías de AFM de la estructura de las fibrillas.

Fig. 3: Sulfato de condroitina y decorina presentes en los compuestos de matriz osteogénicos de acuerdo con la invención.

Fig. 4: Comportamiento de ligadura de los compuestos de matriz osteogénicos de acuerdo con la invención para los factores de crecimiento recombinantes BMP-4 y TGF-1\beta.

Fig. 5: Comportamiento de osteoblastos de calvarios de ratas sobre diversos compuestos de matriz osteogénicos de acuerdo con la invención - influencia sobre la adhesión y la expresión de osteopontina.

Fig. 6: Actividad de la fosfatasa alcalina en células de calvarios de ratas sobre diversos compuestos de matriz osteogénicos de acuerdo con la invención después de la adición de 4 pmoles/cm^{2} de BMP-4.

Fig. 7: Nueva formación de hueso en la superficie del implante en porcentaje después de 6 meses en el maxilar de un cerdo enano.

Ejemplo de forma de realización 1

Estructura de las fibrillas después de fibrilogénesis bajo diversas condiciones

Para la generación del compuesto de matriz osteogénico se prepara una solución de monómeros de colágeno en ácido acético 0,01 M por agitación durante 24 horas a 4ºC. Las fibrillas de colágeno se forman a continuación en presencia de los componentes no colagénicos mediante un proceso de autoagregación (fibrilogénesis) en soluciones acuosas de búfer fosfato a pH neutro y a una temperatura de 37ºC.

El intervalo para la formación de las fibrillas se encuentra entre 0,5 y 5 mg de colágeno/ml y 0,1 a 5 mg de glicosaminoglicano/ml, siendo las condiciones preferidas 1 mg/ml de colágeno y 0,2 mg/ml de GAG y 30 \mug/ml de proteoglicano. Los parámetros de fibrilogénesis preferidos eran 30 mmoles/l de búfer fosfato, pH 7,0, con agregado de 135 mmoles/l de NaCl o sin agregado de NaCl.

Los glicosaminoglicanos u otros componentes de la matriz son agregados antes de la fibrilogénesis a los monómeros de colágeno y de este modo se integran en el proceso de fibrilogénesis subsiguiente por lo menos parcialmente en las fibrillas generadas.

La Fig. 1 muestra en una medición de la turbidez de una solución provocada por la formación de fibrillas, en función del tiempo, que cantidades crecientes de decorina (indicadas en relaciones molares) producen un retardo de la cinética de formación y una reducción de los valores máximos de OD, lo que indica una reducción del diámetro de las fibrillas. Para el sulfato de condroitina se observa un efecto contrario. Condiciones de formación: 250 \mug/ml de colágeno, 37ºC, 30 mmoles/l de búfer fosfato pH 7,4 con 135 mmoles/l de NaCl.

En la Fig. 2 se documenta en las fotografías de AFM la influencia de las condiciones de formación sobre la estructura de las fibrillas generadas. La adición de decorina reduce bajo todas las condiciones el diámetro de las fibrillas (a y d). Para el sulfato de condroitina se puede observar especialmente bajo condiciones de baja concentración iónica una clara distribución más heterogénea de los diámetros de las fibrillas con aumento del diámetro promedio de las fibrillas (f), mientras que el efecto con concentraciones iónicas superiores no es evidente (c). b y e muestran la estructura de las fibrillas sin agregados no colágenicos. Condiciones de formación: 250 \mug/ml de colágeno, 37ºC, 30 mmoles/l de búfer fosfato pH 7,4 (Búfer A) o 30 mmoles/l de búfer fosfato pH 7,4 con 135 mmoles/l de NaCl (Búfer B).

Pero en todos los casos los monómeros de colágeno forman durante la fibrilogénesis in vitro las características fibrillas de bandas transversales análogas a las estructuras in vivo, en donde la estructura de las fibrillas generadas es influenciada tanto por los parámetros del proceso (pH, concentración iónica, concentración de fosfatos) como también por el tipo y la cantidad de los componentes no colagénicos agregados. Las fibrillas de colágeno con componentes no colagénicos como glicosaminoglicanos o decorina pueden ser generados por lo tanto en un intervalo comparativamente amplio de relaciones de masas, dentro de las cuales la integración del colágeno en las fibrillas no se ve influenciada o sólo en forma reducida.

Ejemplo de forma de realización 2

Incorporación de componentes no colagénicos en las fibrillas de colágeno

Para la generación del compuesto de matriz osteogénico se prepara una solución de monómeros de colágeno en ácido acético 0,01 M por agitación durante 24 horas a 4ºC. Las fibrillas de colágeno se forman a continuación en presencia de los componentes no colagénicos por medio de un proceso de autoagregación (fibrilogénesis) en soluciones acuosas de búfer fosfato a pH neutro. Condiciones de formación: 250 \mug/ml de colágeno, 37ºC, 30 mmoles/l de búfer fosfato pH 7,4 (Búfer A) o 30 mmoles/l de búfer fosfato pH 7,4 con 135 mmoles/l de NaCl (Búfer B) con diferentes concentraciones de sulfato de condroitina y decorina.

La decorina y el sulfato de condroitina integrados en las fibrillas se determinaron después del lavado e hidrolizado de las fibrillas en 500 \mul de HCl 6 M a 105ºC durante 6 horas según el método de Pieper et al. [Pieper, J. S., Hafmans, T., Veerkamp, J. H., van Kuppevelt, T. H. Development of tailor-made collagen-glycosaminoglycan matrices: EDC/NHS crosslinking, and ultrastructural aspects. Biomaterials 2000; 21 (6): 581-93].

Para el sulfato de condroitina, la medida de la integración depende de la concentración iónica del sistema de búfer usado. Para concentraciones iónicas reducidas (Búfer A), de los 20 \mug usados sobre 250 \mug de colágeno se incorporan aprox. 2,5 \mug de CS, para concentraciones iónicas altas (Búfer B) en cambio sólo un tercio de esta cantidad (Fig. 3).

También la incorporación de decorina depende del sistema de búfer usado. Para el búfer A se incorpora un tercio de la cantidad usada, mientras que los valores para el Búfer B eran nuevamente más bajos.

Ejemplo de forma de realización 3

Reclutamiento de factores de crecimiento mediante un implante recubierto con un compuesto de matriz osteogénico

Las matrices generadas y compuestas de acuerdo con la invención pueden acelerar y mejorar la formación de hueso por medio del reclutamiento de factores de crecimiento propios del cuerpo, sin el uso de factores de crecimiento recombinantes. En el experimento se puede demostrar un comportamiento de ligadura de este tipo sólo con factores de crecimiento recombinantes.

Una probeta cilíndrica, arenada, de TiAl6V4 con un diámetro de 10 mm se limpia con etanol, acetona y agua.

Se prepara una solución de 1 mg/ml de colágeno bovino tipo I en ácido acético 0,01 M por medio de agitación durante la noche a 4ºC. A esta solución se agregan componentes de la ECM no colagénicos (glicosaminoglicano 30 \mug/ml, proteoglicanos 15 \mug/ml). Las mezclas se mezclan sobre hielo con búfer de fibrilogénesis (60 mmoles/l de fosfato, 270 mmoles/l de NaCl, pH 7,4) y se incuban durante 18 hs a 37ºC. Las fibrillas generadas se centrifugan, se lavan, se homogeneizan y se vuelven a suspender a una concentración final de 1 mg/ml.

La probeta cilíndrica se recubre durante 15 min a temperatura ambiente con esta solución (recubrimiento por inmersión), se lava con agua y se seca.

A continuación se inmovilizan sobre estas superficies factores de crecimiento (BMP-4 y/o TGF-1\beta recombinantes) por medio de un procedimiento de adsorción (4ºC, 18 hs, de PBS) y a continuación se determinan mediante
ELISA.

Estos ensayos in vitro con factores de crecimiento recombinantes muestran que por medio del agregado de acuerdo con la invención de componentes no colagénicos, se aumenta la ligadura de los factores de crecimiento rhBMP-4 (especialmente por adición de sulfato de condroitina) o rhTGF-1\beta (especialmente por adición de decorina) a la matriz. Para la BMP no se observa un efecto con cantidades reducidas (2 - 20 ng/cm^{2}), con cantidades mayores (a partir de 50 ng/cm^{2}) se produce una ligadura aprox. un 10% mayor sobre la capa de colágeno que contiene condroitina en comparación con la capa de colágeno solo, representado en % de la cantidad usada (Fig. 4).

Para rhTGF-1\beta se puede determinar una ligadura aumentada tanto para 1 ng/cm^{2} como también para 10 ng/cm^{2} sobre superficies que contienen decorina.

Condiciones de formación de la matriz: 500 \mug/ml de colágeno, 30 \mug/ml de decorina y/o sulfato de condroitina, 37ºC, 30 mmoles/l de búfer fosfato pH 7,4 con 135 mmoles/l de NaCl.

Ejemplo de forma de realización 4

Ensayos con osteoblastos de calvarios de ratas sobre diversos compuestos de matriz

La Fig. 5 muestra el comportamiento de osteoblastos primarios de calvarios de ratas sobre diversas matrices. Se analizó la adhesión inicial de las células sobre diversas composiciones de matriz con respecto a la morfología celular, la organización citoesquelética (coloración de actina con faloidina) y formación del complejo de adhesión focal mediante receptores de integrina (inmunocoloración contra vinculina). La adhesión era más marcada después de 2 horas sobre matrices de colágeno-CS seguido por colágeno-decorina. También se estimuló y aceleró la formación de FACS (puntos verde-amarillo y rojo en los extremos de las fibrillas de actina) por la decorina y especialmente por el CS. Los controles con matrices con colágeno solamente mostraron sustancialmente menos FACS después de 2 horas.

La influencia de la composición de matriz sobre la diferenciación de los osteoblastos se examinó mediante la expresión de la proteína marcadora osteopontina por medio de exploración celular activada con fluorescencia. Los osteoblastos sobre superficies de colágeno-CS producen después de 8 días 5 veces más osteopontina (\approx2500 unidades de fluorescencia) que las células sobre superficies que sólo tienen colágeno (\approx500 unidades de fluorescencia). Condiciones de formación de la matriz: 500 \mug/ml de colágeno, 30 \mug/ml de decorina y/o sulfato de condroitina, 37ºC, 30 mmoles/l de búfer fosfato pH 7,4 con 135 mmoles/l de NaCl.

Otros ensayos con osteoblastos de calvarios de ratas muestran diferentes reacciones celulares sobre rhBMP-4 en función de la composición de la matriz de soporte.

La Fig. 6 muestra la actividad de la fosfatasa alcalina en unidades de actividad U por mg de proteína después de la adición de 4 pmoles/cm^{2} de rhBMP-4 a células de calvarios de ratas. Sobre matrices que contenían decorina se regula hacia abajo la actividad de BMP, mientras que se refuerza sobre matrices que contienen sulfato de condroitina. Condiciones de formación de la matriz: 500 \mug/ml de colágeno, 30 \mug/ml de decorina y/o sulfato de condroitina, 37ºC, 30 mmoles/l de búfer fosfato pH 7,4 con 135 mmoles/l de NaCl.

Ejemplo de forma de realización 5

Ensayos experimentales

En ensayos experimentales se determinó sorprendentemente que las matrices provistas de factores de crecimiento recombinantes tienen un resultado claramente peor con respecto a la formación de hueso inducida que los compuestos de matriz osteogénicos no reticulados de acuerdo con la invención en base a colágeno tipo I y sulfato de condroitina.

Implantes de Ti, que presentan cortes de forma anular transversalmente al eje y representan así un modelo defectuoso, se limpian con 1% de Tritón X-100, acetona y 96% de etanol, se enjuagan con agua destilada y se secan.

Los implantes usados son recubiertos en dos pasos consecutivos de recubrimiento por inmersión con:

A.: Fibrillas de colágeno tipo I

B.: Compuesto de matriz osteogénico de acuerdo con la invención en base a colágeno tipo I y sulfato de condroitina según el ejemplo de forma de realización 1

C.: Compuesto de matriz osteogénico de acuerdo con la invención en base a colágeno tipo I y sulfato de condroitina según el ejemplo de forma de realización 1

Los implantes se lavan con agua destilada, se secan al aire y se esterilizan durante 12 hs con óxido de etileno a 42ºC. Inmediatamente antes del implante se recubre el estado de superficie C con BMP-4 recombinante (400 ng/ml) a 4ºC durante la noche y a continuación se seca.

Los implantes se colocan en los maxilares inferiores de cerdos enanos. El contacto entre el implante y el hueso se determinó después de 6 meses en forma histomorfométrica.

El valor porcentual más alto para este contacto se obtiene para implantes recubiertos con la matriz osteogénica de acuerdo con la invención en base a colágeno y sulfato de condroitina (27,8%), mientras que para los implantes con el mismo recubrimiento y BMP-4 recombinante y la combinación se obtiene un valor de 15% y por lo tanto mucho menor. Los valores más bajos se obtienen para el recubrimiento de colágeno solo (12,8%) (Fig. 7).

En la descripción de la invención se utilizan las siguientes abreviaturas:

bFGF: Basic fibroblastic growth factor [Factor de crecimiento fibroblástico básico]

BMP: Bone morphogenetic protein [Proteína morfogenética ósea]

ECM: Matriz extracelular

EGF: Endotelial growth factor [Factor de crecimiento endotelial]

FACITs: Fibril associated collagen with interrupted triple helix [Colágeno asociado con fibrillas con triple hélice interrumpida]

FACS: Focal adhesion contacts [Contactos de adhesión focal]

FGF: Fibroblastic growth factor [Factor de crecimiento fibroblástico]

GAG: Glicosaminoglicano

HAP: Hidroxiapatita

IGF-I: Insuline-like growth factor [Factor de crecimiento tipo insulínico]

PGA: Acido poliglicólico

PLA: Acido poliláctico

SLRP: Small leucine rich protein [Proteína pequeña rica en leucina]

TCP: Fases de fosfato tricálcico

TES: (ácido N-[Tris(hidroximetil)metil]-2-aminoetano-sulfónico)

TGF-\beta: Transforming growth factor \beta [Factor de crecimiento transformante \beta]

VEGF: Vascular endotelial growth factor [Factor de crecimiento endotelial vascular]

WP: Factor de crecimiento

Claims

1. Procedimiento para la preparación de un implante o un andamiaje bioactivo para la ingeniería tisular con un recubrimiento de un compuesto de matriz osteogénico, caracterizado porque el compuesto de matriz osteogénico es un compuesto de matriz formado por colágeno y por lo menos un componente de la ECM no colagénico o sus derivados, en el que el componente de colágeno está compuesto por fibrillas de colágeno no reticuladas, generadas por medio de fibrilogénesis, y en donde en las mismas está integrado el por lo menos un componente de la ECM no colagénico o sus derivados, en donde antes de la fibrilogénesis se agrega el por lo menos un componente de la ECM no colagénico o sus derivados, y porque las fibrillas de colágeno así generadas se vuelven a suspender en agua o en un búfer y a continuación se inmovilizan sobre la superficie del implante o del andamiaje bioactivo en un procedimiento de recubrimiento por inmersión, o porque durante la preparación de un andamiaje bioactivo para la ingeniería tisular se provoca la
formación de fibrillas en el andamiaje bioactivo, en donde las fibrillas generadas in situ quedan como gel o se secan.

2. Procedimiento para la preparación de un implante o un andamiaje bioactivo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque los componentes de la ECM no colagénicos contienen glicosaminoglicanos.

3. Procedimiento para la preparación de un implante o un andamiaje bioactivo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el componente de la ECM no colagénico contiene en forma individual o mezclados, sulfato de condroitina del tipo A, C, D o E, sulfato de dermatano, sulfato de queratano, sulfato de heparano, heparina, ácido hialurónico y sus derivados.

4. Procedimiento para la preparación de un implante o un andamiaje bioactivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el componente de la ECM no colagénico contiene proteínas de matriz no colagénicas.

5. Procedimiento para la preparación de un implante o un andamiaje bioactivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el componente de la ECM no colagénico contiene como proteínas de matriz no colagénicas en forma individual o mezcladas, fibronectina, decorina, biglicano, laminina, versicano.

6. Procedimiento para la preparación de un implante o un andamiaje bioactivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el componente de colágeno está compuesto por uno de los colágenos I, II, III, V, IX, XI o sus combinaciones.

7. Procedimiento para la preparación de un implante o un andamiaje bioactivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la fibrilogénesis se realiza bajo las condiciones de intervalo de temperatura de 4ºC a 40ºC, preferentemente 25ºC a 37ºC, concentración de colágeno 50 a 5000 \mug/ml, preferentemente 250 a 1000 \mug/ml, pH 4 a pH 9, preferentemente pH 6 a pH 8, contenido de fosfato hasta 500 mmoles/l, preferentemente 30 a 60 mmoles/l, contenido de NaCl hasta 1000 mmoles/l, preferentemente hasta 300 mmoles/l.

8. Implante o andamiaje bioactivo para la ingeniería tisular con un recubrimiento de un compuesto de matriz osteogénico, preparado especialmente de acuerdo con un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el compuesto de matriz osteogénico es un compuesto de matriz formado por colágeno y por lo menos un componente de la ECM no colagénico o sus derivados, en donde el componente colagénico está compuesto por fibrillas de colágeno no reticuladas, generadas por medio de fibrilogénesis, y en donde en las mismas está integrado el por lo menos un componente de la ECM no colagénico o sus derivados.

9. Implante o andamiaje bioactivo de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque los componentes de la ECM no colagénicos contienen glicosaminoglicanos.

10. Implante o andamiaje bioactivo de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, caracterizado porque el componente de la ECM no colagénico contiene en forma individual o mezclados, sulfato de condroitina del tipo A, C, D o E, sulfato de dermatano, sulfato de queratano, sulfato de heparano, heparina, ácido hialurónico y sus derivados.

11. Implante o andamiaje bioactivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque el componente de la ECM no colagénico contiene proteínas de matriz no colagénicas.

12. Implante o andamiaje bioactivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque el componente de la ECM no colagénico contiene como proteínas de matriz no colagénicas, en forma individual o mezcladas, fibronectina, decorina, biglicano, laminina, versicano.

13. Implante o andamiaje bioactivo de acuerdo con una de las reivindicaciones 8 a 12, caracterizado porque el componente de colágeno está compuesto por uno de los colágenos I, II, III, V, IX, XI o sus combinaciones.

14. Solución de recubrimiento que contiene un compuesto de matriz osteogénico formado por colágeno y por lo menos un componente de la ECM no colagénico o sus derivados, caracterizado porque el componente de colágeno está compuesto por fibrillas de colágeno no reticuladas, generadas por fibrilogénesis, y porque en las mismas está integrado el por lo menos un componente de la ECM no colagénico o sus derivados.