ES2329205T3

ES2329205T3 - Identificacion de interacciones de compuestos-proteinas usando bibliotecas de moleculas de fusion de proteinas-acidos nucleicos.

Info

Publication number: ES2329205T3
Application number: ES99948042T
Authority: ES
Inventors: Peter Lohse
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1998-08-17
Filing date: 1999-08-16
Publication date: 2009-11-23
Anticipated expiration: 2019-08-16
Also published as: AU757955B2; EP1105360B1; AU6129699A; DE69941193D1; CA2337490A1; CY1110515T1; WO2000009464A9; PT1105360E; US6602685B1; JP4278872B2; WO2000009464A1; EP1105360A4; JP2002522057A; EP1105360A1; DK1105360T3; ATE437844T1; CA2337490C

Abstract

Un procedimiento para detectar una interacción de compuesto-proteína, comprendiendo dicho procedimiento: (a) proporcionar una biblioteca de compuestos codificada o accesible por direcciones que abarca una pluralidad de compuestos diferentes, en la que dichos compuestos están inmovilizados sobre un soporte sólido; (b) poner en contacto simultáneamente dichos compuestos inmovilizados diferentes en una cámara de reacción individual con cada miembro de una biblioteca de fusiones de proteínas-ácidos nucleicos bajo condiciones que permiten la formación de complejos de fusión de compuestos; (c) aislar dichos complejos de fusión de compuestos inmovilizados; y (d) detectar dicho complejo de fusión de compuestos como un indicio de que la proteína de dicha fusión interacciona con dicho compuesto.

Description

Identificación de interacciones de compuestos-proteínas usando bibliotecas de moléculas de fusión de proteínas-ácidos nucleicos.

Antecedentes de la invención

En general, la invención pone de relieve los procedimientos de rastreo que implican fusiones de ácidos nucleicos-proteínas.

El rastreo se considera que es una herramienta eficiente para identificar interacciones de unión entre proteínas y compuestos de moléculas pequeñas derivados de colecciones sustentadas farmacéuticamente grandes, aproximaciones de síntesis nuevas tales como química combinatoria, o fuentes naturales (TIBTECH, vol. 13, p. 115, 1995). Sin embargo, la naturaleza multidisciplinar de la mayoría de las técnicas de rastreo plantea retos significativos. El reto más importante de tales técnicas es mantener un suministro listo de materiales para la pantalla. El rastreo de bibliotecas de compuestos de moléculas pequeñas con objetivos proteicos diferentes requiere cantidades suficientes de compuestos. Alternativamente, el rastreo de bibliotecas de compuestos grandes (por ejemplo, que tienen 10^{6} miembros o mayores) requiere grandes cantidades de proteína recombinante. Otro reto es dirigir el rastreo rápidamente y de forma rentable. El rastreo de las bibliotecas de compuestos con diferentes objetivos proteicos es generalmente consumidor de tiempo si se lleva a cabo de una forma secuencial.

Últimamente, se ha descrito un procedimiento para el aislamiento de proteínas con propiedades deseadas fuera de una reserva de proteínas (Szostak y col., WO-A-9831700 y Roberts y Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1997) vol. 94, p. 12297-12302). Esta técnica se lleva a cabo por medio de moléculas de fusión de proteína-ARN donde cada proteína está unida covalentemente a su ARN codificante. La tecnología de fusión de proteína-ARN se puede usar para rastrear bibliotecas de cADN y para clonar genes nuevos sobre la base de interacciones proteína-proteína.

El documento WO 98/3170 describe el aislamiento de proteínas con propiedades deseadas a partir de grandes reservas de secuencias de aminoácidos parcialmente o completamente aleatorias usando fusiones de proteínas-ARN.

Sumario de la invención

El propósito de la presente invención es identificar eficientemente interacciones de unión proteína-compuesto (y, en particular, interacciones proteína-molécula pequeña) rastreando compuestos de moléculas pequeñas con bibliotecas de fusiones de proteínas-ácidos nucleicos (por ejemplo, fusiones de proteínas-ARN) en una forma paralela, proporcionando así un catálogo de pares molécula pequeña-proteína.

De acuerdo con ello, en un primer aspecto, la invención pone de relieve un procedimiento para detectar una interacción compuesto-proteína, implicando el procedimiento: (a) proporcionar una biblioteca de compuestos codificada o accesible por direcciones que abarca una pluralidad de compuestos diferentes, en la que los compuestos están inmovilizados sobre un soporte sólido; (b) poner en contacto simultáneamente los distintos compuestos inmovilizados en una cámara de reacción única con cada miembro de una biblioteca de fusiones de proteínas-ácidos nucleicos según las condiciones que permiten la formación de compuestos de fusión; (c) aislar los complejos de compuestos de fusión inmovilizados; y (d) detectar el complejo de fusión de compuesto como un indicio de que la proteína de fusión interacciona con el compuesto.

En las realizaciones preferidas, la fusión de proteína-ácido nucleico es bien una fusión de proteína-ARN, bien una fusión de proteína-ADN, o bien una proteína fusionada con una molécula híbrida ADN-ARN; el soporte sólido es una perla; cada perla está codificada con una etiqueta detectable única; el compuesto de la fusión de proteína-ácido nucleico compleja está identificado con la etiqueta detectable única asociada con la perla; la etiqueta detectable es una etiqueta peptídica, una etiqueta de ácido nucleico, una etiqueta química, una etiqueta fluorescente, o una señal de radiofrecuencia; el soporte sólido es una chip y la biblioteca de compuestos está inmovilizada en el chip en una disposición accesible por una dirección; cada miembro de la biblioteca de fusiones de proteínas-ácidos nucleicos está etiquetado de forma detectable; el complejo de fusión de compuestos, o los componentes del mismo, se recuperan por liberación a partir del soporte sólido; el procedimiento implica adicionalmente recuperar la fusión de proteína-ácido nucleico a partir del soporte sólido e identificar la proteína; la identidad de la proteína se determina a partir de la secuencia de la parte de ácido nucleico de la fusión de proteína-ácido nucleico; y el compuesto es una molécula pequeña.

En un aspecto relacionado, la invención presenta un procedimiento para detectar una interacción compuesto-proteína, el procedimiento implica: (a) proporcionar una biblioteca de compuestos codificada o accesible por una dirección que abarca una pluralidad de compuestos diferentes, en la que los compuestos están inmovilizados en un soporte sólido; (b) poner en contacto simultáneamente la biblioteca de compuestos inmovilizados diferentes con una biblioteca de fusiones de proteínas-ácidos nucleicos según las condiciones que permiten fusiones de la biblioteca de fusiones de proteínas-ácidos nucleicos para unir a los compuestos, y (c) detectar una fusión de proteína-ácido nucleico unida como un indicio de que la fusión de proteína-ácido nucleico interacciona con un compuesto de la biblioteca de compuestos.

En las realizaciones preferidas, la fusión de proteína-ácido nucleico es bien una fusión de proteína-ARN, bien una fusión de proteína-ADN, o bien una proteína fusionada con una molécula híbrida ADN-ARN; la fusión de proteína-ácido nucleico está etiquetada de forma detectable y la interacción está indicada mediante la asociación de la etiqueta detectable con el soporte sólido; la fusión de proteína-ácido nucleico unida se recupera mediante liberación a partir del soporte sólido; el procedimiento implica adicionalmente recuperar la fusión de proteína-ácido nucleico a partir del soporte sólido e identificar la proteína; la identidad de la proteína se determina a partir de la secuencia de la parte de ácido nucleico de la fusión de proteína-ácido nucleico; el soporte sólido es una columna, una plaquilla de vidrio, un chip, o una perla; y el compuesto es una molécula pequeña.

Como se usa en el presente documento, mediante una "biblioteca" se quiere decir una colección de al menos dos moléculas (por ejemplo, moléculas tales como compuestos o fusiones de proteínas-ácidos nucleicos). Una biblioteca de compuestos incluye preferiblemente al menos 10^{2} ó 10^{3} miembros, y, más preferiblemente, al menos 10^{4}, 10^{5}, o 10^{6} miembros. Una biblioteca de proteínas-ácidos nucleicos (por ejemplo, una biblioteca de proteínas-ARN) incluye preferiblemente al menos 10^{2} ó 10^{3} miembros, más preferiblemente, al menos 10^{4}, 10^{5}, o 10^{6} miembros, y, más preferiblemente, al menos 10^{10} ó 10^{12} miembros.

Mediante un "híbrido ADN-ARN" se quiere decir una hebra de ADN hibridada con una hebra complementaria de ARN. Típicamente, la hebra de ADN se genera mediante trascripción reversa de la molécula de ARN.

Mediante "disposición accesible por dirección" se quiere decir un patrón fijo de objetos inmovilizados en una superficie sólida en la que la identidad de los objetos se conoce o se puede determinar fácilmente.

Mediante una "molécula pequeña" se quiere decir un compuesto con un peso molecular de menos de o igual a 10.000 daltons, preferiblemente, menos de o igual a 1.000 daltons, y, lo más preferiblemente, menos de o igual a 500 daltons.

La presente invención proporciona un número de ventajas. Por ejemplo, los presentes procedimientos reducen la cantidad de material requerido para un rastreo. En rastreos estándar, se requieren cantidades considerables de compuestos de proteínas y de compuestos de moléculas pequeñas debido a que cada compuesto se somete a rastreo con una proteína única en una cámara separada espacialmente. Una biblioteca de moléculas de fusión de proteínas-ácidos nucleicos, sin embargo, se puede someter a rastreo para interacciones de unión con compuestos de moléculas pequeñas en la misma cámara de reacción en una forma paralela. Además, el objetivo proteico no necesita clonarse, sobreexpresarse, o aislarse, sino que más bien se rastrea en forma de una molécula de fusión de proteína-ácido nucleico y se identifica mediante su ácido nucleico codificante. Además, los costes materiales se pueden reducir adicionalmente mediante miniaturización, que se facilita por los presentes procedimientos y está limitada únicamente por la elección del procedimiento de detección para la identificación de complejos de fusión de moléculas pequeñas.

Además, la presente invención proporciona ventajas en términos del tiempo requerido para llevar a cabo un rastreo de compuesto. En particular, los compuestos descritos en el presente documento aceleran la identificación de ligandos (por ejemplo, los ligandos de moléculas pequeñas) rastreando una biblioteca de objetivos proteicos con una biblioteca de ligandos potenciales en una forma paralela. En contraste con rastreos estándar, donde una biblioteca de compuestos pequeños se rastrea para unir a diferentes proteínas de una manera secuencial, se pueden rastrear compuestos de moléculas pequeñas, en las presentes técnicas, con una biblioteca de fusiones de proteínas-ácidos nucleicos en un ensayo individual. Consecuentemente, la presente invención facilita el rastreo de miembros de una biblioteca de compuestos de moléculas pequeñas para unir a los miembros de una biblioteca de proteínas en una manera altamente
eficiente.

Otras características y ventajas de la invención serán patentes a partir de la siguiente descripción detallada, y a partir de las reivindicaciones.

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Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una ilustración esquemática de un enfoque ejemplar para rastrear un compuesto inmovilizado en un soporte sólido con una biblioteca de fusiones de proteínas-ácidos nucleicos.

La Figura 2 es una ilustración esquemática de un enfoque ejemplar para rastrear una biblioteca de compuestos inmovilizados a perlas con una biblioteca de fusiones de proteínas-ácidos nucleicos.

La Figura 3 es una ilustración esquemática de un enfoque ejemplar para rastrear una disposición accesible por una dirección de compuestos inmovilizados sobre un microchip con una biblioteca de fusiones de proteínas-ácidos nucleicos.

La Figura 4 es una gráfica que ilustra unión de compuestos a una fusión de ARN-proteína en un soporte sólido de perlas.

Descripción detallada

Los procedimientos de la presente invención facilitan la identificación eficiente de interacciones de uniones de proteínas-compuestos (y, preferiblemente, de moléculas pequeñas-proteínas) rastreando tales compuestos con bibliotecas de fusiones de proteínas-ácidos nucleicos (por ejemplo, fusiones de proteínas-ARN), proporcionando así un catálogo de pares compuesto-proteína. Las bibliotecas de compuestos se rastrean frente a bibliotecas de fusiones de proteínas-ácidos nucleicos en un rastreo individual. Los compuestos están inmovilizados sobre un soporte sólido (por ejemplo, una perla, un chip, una plaquilla de vidrio o una columna) para simplificar el rastreo y/o las lecturas resultantes. Además, para facilitar la identificación de pares compuesto-proteína, el compuesto (o el soporte sólido al que él está inmovilizado) pueden señalarse con una etiqueta característica de ese compuesto particular o de esa familia de compuestos.

Cualquier compuesto puede rastrearse por los procedimientos de la invención, aunque las moléculas pequeñas representan objetivos preferidos para rastrear.

Éstos y otros aspectos de la invención se describen ahora en más detalle a continuación. Estos ejemplos se proporcionan para el propósito de ilustrar la invención, y no deberían constituirse como limitantes.

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Ensayos de Rastreo

Como se discute anteriormente, el rastreo de los compuestos frente a fusiones de proteínas-ácidos nucleicos (por ejemplo, fusiones de proteínas-ARN) se puede llevar a cabo en un número de formatos diferentes. Un formato particular se ilustra en la Figura 1. Mediante esta aproximación, un compuesto individual está inmovilizado sobre una columna o cualquier otra superficie sólida usando uno cualquiera de una diversidad de procedimientos estándar. El compuesto de molécula pequeña unido a fase sólida se incuba después con tampón de rastreo que contiene BSA u otra proteína inerte para reducir la unión no específica. A continuación, la solución tampón se retira, y la fase sólida que presenta el compuesto se incuba con una solución de biblioteca de fusiones de proteínas-ácidos nucleicos, seguido por lavados con tampón de rastreo para retirar las moléculas de fusión unidas no específicamente. Las fusiones de proteínas-ácidos nucleicos unidas específicamente se eluyen después (por ejemplo, mediante elución de afinidad usando tampón que contiene compuesto de moléculas pequeñas libre). "Leer" la parte de ácido nucleico (por ejemplo, ARN) de las moléculas de fusión eluidas proporciona una identificación de la proteína que se unió al compuesto de moléculas pequeñas. Se puede llevar a cabo una "lectura" tal como se describe más adelante.

Alternativamente, se pueden rastrear simultáneamente múltiples compuestos frente a múltiples fusiones de pro-
teínas-ácidos nucleicos. Se muestran dos formatos ejemplares para llevar a cabo este tipo de rastreo en las Figuras 2 y 3. En estos formatos, se inmovilizó una biblioteca codificada (accesible por direcciones) de moléculas pequeñas en perlas o en cualquier otra superficie, tal como un chip. La biblioteca unida a fase sólida se incuba después con tampón de rastreo que contiene BSA u otra proteína inerte para reducir unión no específica. Subsiguientemente, se extrae la solución tampón, y la biblioteca de compuestos de moléculas pequeñas se incuba con una biblioteca de fusión, seguido por lavados con tampón de rastreo para eliminar moléculas unidas no específicamente. Las moléculas de fusión de proteínas-ácidos nucleicos que se unen específicamente a moléculas pequeñas se detectan después o, si se utiliza un formato de perla, se organizan y se recogen. Se usa un código (o señal o dirección) de lectura para identificar el compuesto de molécula pequeña, y la lectura de la parte de ácidos nucleicos de moléculas de fusión unidas se usa para identificar la proteína (como se describe más adelante).

Las moléculas de fusión de proteínas-ácidos nucleicos de diferentes genotipos y diferentes fenotipos pueden unirse algunas veces al mismo compuesto de moléculas pequeñas. Si se desea, por lo tanto, la fracción unida a moléculas de fusión se puede recoger, amplificar, y reincubar con un ligando identificado según condiciones más restrictivas (por ejemplo, una concentración menor de fusión de proteínas-ácidos nucleicos). Este procedimiento se puede repetir cualquier número de veces, teniendo en cuenta el aislamiento de un receptor con cualquier afinidad de ligando deseada (por ejemplo, selección de un receptor que tiene la afinidad más alta).

Además, una vez identificada, una interacción de unión entre un compuesto unido a fase sólida y una molécula de fusión se puede confirmar o analizar mediante adición de ligando libre o de proteína libre a un complejo de fusión de compuesto en un ensayo de unión estándar.

Los presentes rastreos se pueden usar para identificar interacciones desconocidas de compuestos-proteínas o pueden explotarse en circunstancias donde esté disponible algún conocimiento general de una interacción (por ejemplo, entre un ligando y un receptor). En el último caso, se pueden usar bibliotecas predispuestas para rastreo. Tales bibliotecas pueden contener clases particulares de compuestos (o proteínas) o modificaciones de un compuesto (o proteína) individual. En general, los elementos que predisponen tienden a incrementar la afinidad promedio de un ligando por un receptor objetivo y a orientar el ligando en una manera uniforme (véase, por ejemplo, Chen y col., JACS (1993) vol. 115, p. 12591-125929. Este tipo de aproximación facilita la identificación, por ejemplo, de ligandos que se unen a un receptor en un sitio etiquetado como objetivo.

Preparación de Fusiones de Proteínas-Ácidos Nucleicos

Como se discute anteriormente, las presentes técnicas se pueden aplicar a cualquier población de fusiones de proteínas-ácidos nucleicos, que incluyen fusiones de proteínas-ARN, fusiones de proteínas-ADN, y fusiones entre proteínas y moléculas de ADN-ARN híbridas.

Para usar en los procedimientos descritos en el presente documento, se pueden preparar bibliotecas aleatorias de moléculas de fusión de proteínas-ARN, por ejemplo, como se describe en Szostak y col., WO-A-983700; Roberts y Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1997) vol. 94, p. 12297-12302, o Kuimelis y col., Adressable Protein Arrays, EP-A-1547678). Alternativamente, las bibliotecas de moléculas de fusiones de ARN-proteínas celulares se pueden preparar a partir de mARN o cADN que carecen de regiones no traducidas en 3', por ejemplo, como se describe en Lipovsek y col. (Methods for Optimizing Cellular ARN-Protein Fusion Formation, WO-A-0009737) y Hammond y col. (Methods for Producing Nucleics Acids Lacking 3'-Untranslated Regions and Optimizing Cellular ARN-Protein Fusion Formation, US-B1-6312927).

Para marcar tales fusiones de proteínas-ARN, se puede utilizar cualquier procedimiento marcador estándar y cualquier etiqueta detectable (incluyendo, por ejemplo, etiquetas radiactivas, fluorescentes, y quimioluminiscentes). Si se desea, las fusiones pueden marcarse radiactivamente generando la fusión o los componentes de fusión en presencia de aminoácidos radioactivos (por ejemplo, aminoácidos etiquetados con ^{35}S o con ^{14}C) o de nucleótidos radiactivos (por ejemplo, nucleótidos etiquetados con ^{35}S o con ^{32}P). Alternativamente, las moléculas de fusión se pueden marcar fluorescentemente. En un ejemplo particular, el engarce de ADN (por ejemplo, el engarce dA_{27}dCdCP descrito en Roberts y Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1997) vol. 94, p. 12297-12302) puede estar modificado con un marcador de fosforamidita de fluoresceína (Glen Research, Sterling, VA), y este engarce se puede usar para la síntesis de fusiones de proteínas ARN fluorescentes. En aún otra alternativa, las fusiones de proteínas-ARN preparadas de acuerdo con el procedimiento de Roberts y Szostak (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1997) vol. 94, p. 12297-12302; y Selection of Proteins Using ARN-Protein Fusions, WO-A-983170) o las fusiones ARN-proteínas celulares preparadas de acuerdo con el procedimiento de Lipovsek y col. (Methods for Optimizing Cellular ARN-Protein Fusion Formation, WO-A-0009737) o Hammond y col. (Methods for Producing Nucleic Acids Lacking 3'-Untranslated Regions and Optimizing Cellular ARN-Protein Fusion Formation, US-B1-6312927) pueden marcarse emparejando las bases de la fusión con un oligonucleótido etiquetado fluorescentemente (por ejemplo, emparejando las bases de un oligonucleótido poli-dT al engarce dA_{27}dCdCP).

Alternativamente, las fusiones de proteínas-ADN pueden estar etiquetadas también usando técnicas similares. Tales fusiones de proteínas-ADN se pueden generar como se describe, por ejemplo, en Lohse y col., ADN-Protein Fusions and Uses Thereof, WO-A-032823. En aún otra alternativa, las técnicas de etiquetado anteriores se pueden usar para fusiones de proteínas a partes de ADN-ARN híbridas (es decir, una hebra de cada). Tales fusiones híbridas están generadas, por ejemplo, sometiendo a una fusión de ARN-proteína a una etapa de trascripción reversa usando técnicas estándar.

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Preparación de Compuestos

Para llevar a cabo los procedimientos de rastreo de la invención, se puede utilizar cualquier biblioteca de compuestos. Tales bibliotecas se pueden derivar de productos naturales, de extractos sintéticos (o semisintéticos) o de bibliotecas de productos químicos de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Aquellos expertos en el campo de descubrimiento y desarrollo de fármacos entenderán que la fuente precisa de compuestos no es crítica para el/los procedimiento(s) de rastreo de la invención. Ejemplos de fuentes de compuestos naturales incluyen, pero no se limitan a, fuentes de plantas, fúngicas, procarióticas, o de animales, así como modificación de los compuestos existentes. Están también disponibles numerosos procedimientos para generar síntesis aleatoria o dirigida (por ejemplo, semisíntesis o síntesis total) de cualquier cantidad de compuestos químicos, incluyendo, pero no limitados a, compuestos basados en sacáridos, en lípidos, en péptidos, y en ácidos nucleicos. Las bibliotecas de compuestos de síntesis se pueden obtener comercialmente o se pueden producir de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Adicionalmente, si se desea, cualquier biblioteca o compuesto se modifica fácilmente usando procedimientos químicos, físicos, o bioquímicos estándar.

En ciertos procedimientos de la invención, los compuestos que interactúan están identificados como resultado de una etiqueta detectable, o "señal" unida bien al compuesto o bien a su soporte sólido asociado (por ejemplo, perla). Se puede preparar en perlas una biblioteca codificada de compuestos de moléculas pequeñas como se describe, por ejemplo, en Combs y col., JACS (1996) vol. 118, p. 287-288. Además, están disponibles un número de esquemas codificantes, incluyendo códigos de péptidos y de ácidos nucleicos (Kerr y col. JACS (1993) vol. 115, p. 2529-2531; y Brenner y Lerner, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1992) vol. 89, p. 5381-5383); etiquetas químicas (Ohlmeyer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1993) vol. 90, p. 10922-10926; y Maclean y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1997) vol. 94, p. 2805-2810); etiquetas de fluoróforos (Yamashita y Weinsyock (SmithKline Beecham Corporation), WO95/32425 (1995), y Sebestyen y col., Pept. Proc. Eur. Pept. Symp. 22º 1992 (1993); p. 63-64); y señales de radiofrecuencia (Nicolau y col., Angew Chem. Int. Ed. Engl. (1995) vol. 34, p. 2289-2291, y Moran y col., JACS (1995) vol. 117, p. 10787-10788). Tales etiquetas se pueden leer como se describe en las referencias
anteriores.

Alternativamente, se puede preparar una biblioteca de compuestos accesible por una dirección (por ejemplo, compuestos de moléculas pequeñas) sobre una superficie sólida, tal como una superficie de chip. Está disponible una diversidad de técnicas para inmovilizar compuestos en una superficie de chip, y se puede utilizar cualquiera. Las técnicas preferibles incluyen fotolitografía (Affymetrix, Santa Clara, CA), microsalpicado mecánico (Schena y al., Science (1995) vol. 270, p. 467-470; Synteni, Fremont, CA) y chorro de tinta (Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA; y Protogene, Palo Alto, CA).

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Identificación de Interacciones de Fusión de Compuestos

Para identificar interacciones entre compuestos (por ejemplo, compuestos codificados) y fusiones de proteínas-ácidos nucleicos, se puede utilizar cualquier procedimiento que proporcione un medio para detectar una etiqueta asociada con el compuesto o fusión o, si es apropiado, para aislar y determinar la identidad o "dirección" del par de fusión de compuestos.

En un ejemplo particular, se pueden aislar e identificar los pares de compuestos-proteínas (por ejemplo, pares de proteínas-moléculas pequeñas) en perlas. Para detectar una etiqueta asociada con una perla, se plaquea aparte preferiblemente la resina de perla, seguida por exploración, por ejemplo, para una etiqueta fluorescente o radiactiva (usando, por ejemplo, un Phosphorimager para detectar una etiqueta radiactiva). La unión de moléculas de fusión de proteínas-ácidos nucleicos presentes en una perla se puede aislar clasificando físicamente las perlas. Alternativamente, las perlas unidas a moléculas de fusión etiquetadas fluorescentemente se pueden clasificar en un clasificador celular activado de fluorescencia (FACS). Las perlas seleccionadas pueden separarse individualmente o espacialmente (por ejemplo, dentro de los pocillos de una placa de microvaloración de 96 pocillos). Para las fusiones de ARN-proteína, las moléculas unidas a perlas individuales se pueden identificar después mediante trascripción reversa de la parte de ARN, seguida por secuenciación del ADN como se describe por Roberts y Szostak (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1997) vol. 94, p. 12297-12302) y Szostak y col. (Selection of Proteins Using ARN-Protein Fusions. U.S.S.N. 09/007.005, 14 de enero, 1998, y U.S.S.N. 09/247.190, 9 de febrero, 1999). Se puede leer la codificación de señal para el compuesto (por ejemplo, el compuesto de moléculas pequeñas) en cada perla individual como se describe anteriormente.

Alternativamente, se pueden detectar los pares ligando-receptor en una superficie de chip explorando la superficie de chip por radioactividad o fluorescencia. La dirección del par de interacción del chip revela la identidad del compuesto (por ejemplo, el compuesto de proteínas pequeñas). La molécula de fusión se puede seleccionar de la superficie de chip usando un microcolector accesible por dirección o cualquier otro procedimiento estándar (véase, por ejemplo, Kuimelis y col., Addressable Protein Arrays, U.S.S.N. 60/080.686, 3 de abril, 1998, y documento U.S.S.N. 09/282.734, 31 de marzo, 1999). La molécula de fusión recuperada se puede identificar caracterizando la parte de ácidos nucleicos de la fusión como se describe anteriormente.

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Rastreo de Compuestos Utilizando un Formato de Perlas

Como se describe anteriormente, los compuestos pueden inmovilizarse sobre un soporte sólido de perlas y pueden usarse para rastrear en busca de fusiones de proteínas-ácidos nucleicos, y específicamente en busca de fusiones de ARN-proteínas, que son capaces de interaccionar con el compuesto. En un ejemplo de trabajo particular de este enfoque, el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) se clonó aparte de una biblioteca de cADN hepático humana (Maxim Biotech, San Francisco Sur, CA). La construcción contenía el gen de DHFR completo con una señal peptídica DYDDDDK-ASA C-terminal añadida (SEC ID Nº: 1). Se prepararon fusiones de ARN-proteínas de DHFR mediante amplificación de PCR de la secuencia codificante de DHFR seguida por formación de fusión como se describe en Roberts y Szostak (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1997) vol. 94, p. 12297-12302) y Szostak y col. (Selection of Proteins Using ARN-Protein Fusions. U.S.S.N. 09/007.005, 14 de enero, 1998, y U.S.S.N. 09/247.190, 9 de febrero, 1999). Las fusiones se purificaron usando cromatografía de afinidad de oligo-dT-celulosa (Edmonds y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1971) vol. 68: 1336) y se transcribieron de forma reversa con transcriptasa reversa Superscript II de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se combinaron 100 fmol de fusión de DHFR en 10 \mul de tampón 1X (solución salina tamponada con fosfato, NaCl 1 M, 1 mg/ml de BSA, 0,1 mg/ml de ADN cizallado, Tritón X-100 al 1% v/v) con 10 \mul de metotrexato-agarosa preequilibrada (como se describe en Kaufman, Methods Enzymol. (1974) vol. 34: 271-81) en un tubo eppendorf de 500 \mul. La suspensión se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente con mezcla cada 5 minutos. La suspensión se centrifugó después durante 1 minuto a 3000 rpm en una micrófuga de eppendorf. El líquido se retiró, y la metotrexato-agarosa se lavó 3 veces con 500 \mul de tampón 1X. Las fusiones se eluyeron después mediante incubación de la metotrexato-agarosa en 50 \mul de metotrexato 30 \muM durante 30 minutos a 37ºC.

Los resultados de este ensayo de interacción se muestran en la figura 4. En esta figura, el porcentaje de moléculas de fusión totales se sometió a seguimiento midiendo etiqueta de ^{35}S-metionina incorporada en las fusiones durante la etapa de traducción. Como se indica, el tercer lavado no contuvo ninguna cantidad significativa de moléculas de fusión. Además, de la cantidad total de fusión incluida dentro de la matriz, el 86% fluyó a través de la columna de perlas, y el otro 14% se eluyó eficientemente con metotrexato.

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Uso

Los presentes procedimientos proporcionan un medio eficiente para rastrear bien bibliotecas pequeñas o bien bibliotecas grandes para interacciones de unión compuesto-proteína. Además, estos procedimientos se pueden utilizar para rastrear fusiones de proteínas-ácidos nucleicos frente a una biblioteca de compuestos.

Los usos para rastrear una biblioteca de moléculas de fusión frente a una biblioteca de compuestos codificada (accesible por direcciones) incluyen, sin limitación, rastrear una biblioteca de compuestos de moléculas pequeñas con una biblioteca de moléculas de fusión de proteínas-ácidos nucleicos (por ejemplo mARN-proteínas celulares) para compuestos guía nuevos potenciales (por ejemplo, ligandos o inhibidores de enzimas), rastrear una biblioteca de moléculas de fusión de proteínas-ácidos nucleicos (por ejemplo mARN-proteínas celulares) con una biblioteca de compuestos de moléculas pequeñas para objetivos potenciales (por ejemplo, receptores o enzimas), y mapeo de interacciones de unión ente los miembros de una biblioteca de proteínas y los miembros de una biblioteca de compuestos de moléculas pequeñas, proporcionando así un catálogo de pares de ligandos-proteínas.

Otras realizaciones están dentro de las reivindicaciones.

<110> Phylos, Inc.

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<120> IDENTIFICACIÓN DE INTERACCIONES DE COMPUESTOS-PROTEÍNAS USANDO BIBLIOTECAS DE MOLÉCULAS DE FUSIÓN DE PROTEÍNAS-ÁCIDOS NUCLEICOS

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<130> 50036/17WO2

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<150> 60/096.820

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<151> 17-8-1998

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<160> 1

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<170> FastSEQ for Windows Version 3.0

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<210> 1

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Señal de afinidad de síntesis

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<400> 1

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Claims

1. Un procedimiento para detectar una interacción de compuesto-proteína, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) proporcionar una biblioteca de compuestos codificada o accesible por direcciones que abarca una pluralidad de compuestos diferentes, en la que dichos compuestos están inmovilizados sobre un soporte sólido;

(b) poner en contacto simultáneamente dichos compuestos inmovilizados diferentes en una cámara de reacción individual con cada miembro de una biblioteca de fusiones de proteínas-ácidos nucleicos bajo condiciones que permiten la formación de complejos de fusión de compuestos;

(c) aislar dichos complejos de fusión de compuestos inmovilizados; y

(d) detectar dicho complejo de fusión de compuestos como un indicio de que la proteína de dicha fusión interacciona con dicho compuesto.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha fusión de proteína-ácido nucleico es una fusión de proteína-ARN, una fusión de proteína-ADN, o una proteína fusionada con una molécula híbrida ADN-ARN.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho soporte sólido es una perla.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que cada una de dichas perlas está codificada con una etiqueta detectable única.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el compuesto de dicha fusión de proteína-ácido nucleico complexada se identifica por dicha etiqueta detectable única asociada con dicha perla.

6. El procedimiento de la reivindicación 4 ó 5, en el que dicha etiqueta detectable es una etiqueta peptídica, una etiqueta de ácidos nucleicos, una etiqueta química, una etiqueta fluorescente o una señal de radiofrecuencia.

7. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho soporte sólido es un chip y dicha biblioteca de compuestos está inmovilizada sobre dicho chip en una disposición accesible por dirección.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que cada miembro de dicha biblioteca de fusiones de proteínas-ácidos nucleicos está etiquetada de forma detectable.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho complejo de fusión de compuestos, o los componentes del mismo, se recuperan por liberación a partir de dicho soporte sólido.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho procedimiento comprende adicionalmente recuperar dicha fusión de proteína-ácido nucleico a partir de dicho soporte sólido e identificar dicha proteína.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la identidad de dicha proteína se determina a partir de la secuencia de la parte de ácido nucleico de dicha fusión de proteína-ácido nucleico.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho compuesto tiene una masa molecular inferior o igual a 10.000 daltons.

13. Un procedimiento para detectar una interacción compuesto-proteína, comprendiendo dicho procedimiento:

(b) poner en contacto simultáneamente dicha biblioteca de compuestos inmovilizados diferentes con una biblioteca de fusiones de proteínas-ácidos nucleicos bajo las condiciones que permiten fusiones de dicha biblioteca de fusiones de proteínas-ácidos nucleicos para unir a dichos compuestos; y

(c) detectar una fusión de proteína-ácido nucleico unida como una indicación de que la proteína de dicha fusión de proteína-ácido nucleico interacciona con un compuesto de dicha biblioteca de compuestos.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicha fusión de proteína-ácido nucleico es una fusión de proteína-ARN, una fusión de proteína-ADN o una proteína fusionada a una molécula híbrida ADN-ARN.

15. El procedimiento de la reivindicación 13 ó 14, en el que dicha fusión de proteína-ácido nucleico está etiquetada de forma detectable y dicha interacción está indicada por la asociación de dicha etiqueta detectable con dicho soporte sólido.

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que dicha fusión de proteína-ácido nucleico unida se recupera mediante liberación a partir de dicho soporte sólido.

17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que dicho procedimiento comprende adicionalmente recuperar dicha fusión de proteína-ácido nucleico a partir de dicho soporte sólido e identificar dicha proteína.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que la identidad de dicha proteína se determina a partir de la secuencia de la parte de ácido nucleico de dicha fusión de proteína-ácido nucleico.

19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, en el que dicho soporte sólido es una columna, plaquita de vidrio, chip o perla.

20. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, en el que dicho compuesto tiene un peso molecular inferior o igual a 10.000 daltons.