ES2329276T3 - Un metodo para procesar un fluido biologico para la determinacion de un analito. - Google Patents

Un metodo para procesar un fluido biologico para la determinacion de un analito. Download PDF

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Abstract

Un método para procesar un fluido biológico que comprende componentes celulares, en el que el fluido biológico es sangre completa, en el que el fluido se somete a un tratamiento térmico en condiciones (i) para proporcionar una desintegración sustancialmente cuantitativa de dichos componentes celulares, y (ii) para no provocar sedimentación, precipitación, desnaturalización, aglutinamiento y gelificación sustanciales de los componentes del fluido, en el que el tratamiento térmico se lleva a cabo en una condición de temperatura y tiempo definida mediante un límite superior a una temperatura dada (indicada como valor t max) y mediante un límite de tiempo inferior a una temperatura dada (indicada como valor tmin), y en el que, si el tratamiento térmico se lleva a cabo durante un período de tiempo más prolongado que el valor tmax, se produce la gelificación, y en el que, si el tratamiento térmico se lleva a cabo durante un período de tiempo más corto que el valor tmin, se produce la desintegración incompleta, y en el que el recuento celular en el fluido biológico se reduce hasta 0,1% o menos.

Description

Método para procesar un fluido biológico para la determinación de un analito.
La presente invención se refiere a un método de procesamiento de sangre completa mediante tratamiento térmico. El método es particularmente útil para preparar muestras biológicas para la detección de analitos. Adicionalmente, la invención se refiere a sangre completa con células desintegradas, que comprende componentes celulares desintegrados sustancial y cuantitativamente.
La determinación de analitos en muestras procedentes de fluidos biológicos a menudo requiere procedimientos de pretratamiento complicados y tediosos a fin de eliminar los componentes celulares de la muestra fluida. Por ejemplo, la sangre completa contiene componentes, a saber, eritrocitos, leucocitos y trombocitos. A fin de determinar analitos en una muestra de sangre, estos componentes celulares a menudo tienen que ser eliminados mediante procedimientos de pretratamiento tales como centrifugación, filtración, sedimentación y/o lisis mediante reactivos químicos o tratamiento mecánico. Sin embargo, estos procedimientos a menudo son difíciles de integrar en un formato de ensayo automatizado. Esto también es aplicable para una situación en la que los analitos diana están presentes en los componentes celulares, por ejemplo inmunosupresiva en eritrocitos. En este caso, los componentes celulares se aíslan o se enriquecen mediante centrifugación y/o filtración antes de la adición de un reactivo de lisis, o se desnaturalizan mediante adición de un agente desnaturalizante a la muestra original, por ejemplo una mezcla de ZnSO_{4} y
acetonitrilo.
En Renner et al., J. Chromatography (2001), Vol. 916, páginas 247-25, se describe un método para analizar metabolitos de las rutas de la glucosa en eritrocitos humanos. Los eritrocitos se aíslan mediante centrifugación de muestras de sangre completa heparinizadas, y se resuspenden en tampón de PBS. Para la preparación de lisados eritrocíticos, los eritrocitos se transforman en peletes, se recogen en agua destilada y se hierven durante 2 min.
En el documento US 2001/051374 se describe un suero de control o de calibración que tiene una tendencia reducida a la formación de turbidez al reconstituirlo tras la liofilización previa.
El objeto de la presente invención fue proporcionar un método mejorado para procesar fluidos biológicos, que no tenga las desventajas asociadas con los procedimientos de la técnica anterior.
De este modo, un primer aspecto de la presente invención es un método para procesar un fluido biológico que comprende componentes celulares, en el que el fluido biológico es sangre completa, en el que el fluido se somete a tratamiento térmico en condiciones
(i)
para proporcionar una desintegración sustancialmente cuantitativa de dichos componentes celulares, y
(ii)
para no provocar sedimentación, precipitación, desnaturalización, aglutinamiento y gelificación sustanciales de los componentes del fluido,
\vskip1.000000\baselineskip
en el que el tratamiento térmico se lleva a cabo en una condición de temperatura y tiempo definida mediante un límite superior a una temperatura dada (indicada como valor t_{max}) y por un límite de tiempo inferior a una temperatura dada (indicada como valor t_{min}), y en el que, si el tratamiento térmico se lleva a cabo durante un período de tiempo mayor que el valor t_{max}, se produce la gelificación, y en el que, si el tratamiento térmico se lleva a cabo durante un período de tiempo más corto que el valor t_{min}, se produce la desintegración incompleta, y en el que el recuento celular en el fluido biológico se reduce a 0,1% o menos.
Un aspecto adicional de la presente invención es una sangre completa con células desintegradas obtenible mediante tratamiento térmico de sangre completa según el método como se describe anteriormente tratada con anticoagulante, que comprende eritrocitos, leucocitos y trombocitos sustancial y cuantitativamente desintegrados, que está libre sustancialmente de productos de sedimentación, precipitación, desnaturalización, aglutinamiento y gelificación, y que está
(i)
libre de cualesquiera componentes particulares al observarla al microscopio con un aumento de 100 x; y
(ii)
libre de sedimento tras la centrifugación durante 10 min. a una velocidad de hasta 3000 g.
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Aún un aspecto adicional de la presente invención es un método para determinar un analito en una muestra de sangre completa, en el que la sangre completa se procesa como se describe anteriormente, y el analito se determina en la sangre completa procesada.
Sorprendentemente, se ha encontrado que se puede lograr una desintegración completa de componentes celulares, preferiblemente células o agrupamientos de células de organismos superiores, más preferiblemente células de animales tales como células de mamífero, incluyendo células de seres humanos, y lo más preferible células de la sangre tales como eritrocitos, leucocitos y/o trombocitos, en muestras de sangre completa, mediante tratamiento térmico en condiciones predeterminadas de tiempo y temperatura. Por medio de este tratamiento térmico, los componentes celulares contenidos en sangre completa se desintegran sin precipitación, desnaturalización, aglutinamiento y/o gelificación sustancial de los componentes del fluido.
El tratamiento térmico se puede llevar a cabo a una temperatura de 60-90ºC, preferiblemente de 60-75ºC, y más preferiblemente de 65-70ºC. El tratamiento térmico se lleva a cabo durante un tiempo suficiente para lograr una desintegración deseada a la temperatura de tratamiento escogida. Preferiblemente, el tratamiento térmico se lleva a cabo durante un tiempo de 5 segundos a 1 minuto, más preferiblemente de 10 segundos a 40 segundos. Se prefiere especialmente una temperatura de 70ºC durante 30-40, por ejemplo 35 segundos.
En la Tabla 1 se muestran condiciones adecuadas para el tratamiento térmico de una muestra de sangre completa con un recuento eritrocítico dado, opcionalmente suplementada con disolventes orgánicos y/o plasma del grupo sanguíneo AB. Estas condiciones de temperatura/tiempo se definen mediante un límite de tiempo superior (indicado como valor tmax) a una temperatura dada, y mediante un límite de tiempo inferior (indicado como valor tmin) a una temperatura dada. Si el tratamiento térmico se lleva a cabo durante un período de tiempo más prolongado que el valor tmax, se produce gelificación. Si el período del tratamiento térmico es más corto que el valor tmin, solamente se produce la desintegración incompleta. Si se añaden otros fluidos, por ejemplo disolventes orgánicos y/o fluidos acuosos, por ejemplo plasma, a la muestra antes del tratamiento térmico, los valores de tmax y tmin pueden variar como se muestra en las Tablas 2-6.
La gelificación de la muestra se puede determinar por un incremento de la viscosidad. La terminación de la desintegración se puede determinar mediante el recuento de células, por ejemplo en una cámara de recuento de Neubauer, mediante inspección microscópica para componentes particulares y/o mediante la falta de formación de sedimentos tras la centrifugación. En este contexto, se debería de señalar que alrededor de 95% de los componentes celulares de la sangre están representados por eritrocitos. De este modo, el recuento celular en una muestra de sangre se determina preferiblemente contando los eritrocitos.
Por medio de la presente invención, el recuento celular en la muestra se reduce preferiblemente hasta 0,1% o menos, y más preferiblemente hasta 0,01% o menos del valor original. Por ejemplo, cuando se somete una muestra con 5 \cdot 10^{6} eritrocitos por \mul a tratamiento térmico, el recuento celular se reduce preferiblemente hasta 5 \cdot 10^{3} células o menos por \mul (véase el Ejemplo 1), más preferiblemente hasta 500 células o menos por \mul. Lo más preferible, la muestra está libre de células detectables. La ausencia de componentes particulares también se puede determinar mediante observación microscópica a la luz, por ejemplo con un aumento de hasta 100 x, y/o mediante centrifugación durante 10 minutos a una velocidad de hasta 3000 g, preferiblemente hasta 7400 g.
El tratamiento térmico se puede llevar a cabo cuando el fluido se mantiene estático, por ejemplo mientras que el fluido está en una vasija de reacción. En una realización preferida, sin embargo, particularmente para operaciones automatizadas, el tratamiento térmico se puede llevar a cabo mientras que el fluido está en circulación, por ejemplo mientras que el fluido se hace pasar a través de un conducto. El tratamiento térmico en un sistema que fluye se puede llevar a cabo mientras se hace pasar el fluido de la muestra a través de un conducto calentado, por ejemplo un conducto capilar, preferiblemente con un diámetro interno de alrededor de 0,1-0,8 mm, por ejemplo de alrededor de 0,5 mm, con un caudal predeterminado, en el que el conducto tiene una longitud predeterminada a fin de lograr el tiempo de permanencia deseado dentro del conducto calentado. El calentamiento se puede llevar a cabo por cualquier medio adecuado, y puede comprender, por ejemplo, calentamiento inductivo tal como tratamiento con microondas, por ejemplo como se describe en el documento US 6.605.454, calentamiento convectivo, calentamiento resistivo y/o calentamiento mediante excitación con láser.
El fluido biológico es sangre completa, tal como sangre venosa, arterial o capilar, particularmente sangre completa tratada con anticoagulantes, por ejemplo sangre completa tratada con EDTA, citrato, o heparina. Por ejemplo, se puede tomar una muestra con un dispositivo de extracción de sangre que contiene un anticoagulante, y se puede someter directamente a un procesamiento posterior como se describe más abajo.
El volumen de la muestra puede variar ampliamente, por ejemplo en el intervalo de 1 nl o más, preferiblemente 10 nl o más, y hasta 1 ml. De este modo, el método es adecuado para aplicaciones en miniatura, por ejemplo dispositivos microfluídicos en formato de chip, análisis nano LC-MS, etc.
El método de la presente invención no requiere etapas de sedimentación ni/o de precipitación, tales como centrifugación y/o la adición de lisis química y/o reactivos de desintegración. De este modo, el tratamiento térmico se lleva a cabo preferiblemente sin la eliminación y/o lisis previa de componentes celulares. El método se puede llevar a cabo en cualquier dispositivo adecuado, por ejemplo un dispositivo de un solo uso, o un dispositivo reutilizable. Preferiblemente, el método es un procedimiento automatizado que se puede llevar a cabo en un dispositivo integrado, es decir, un dispositivo en el que la muestra de fluido se transfiere sin pretratamiento, particularmente sin eliminación ni/o lisis de componentes celulares. Dentro del dispositivo, la muestra se somete preferiblemente de forma directa al tratamiento sin eliminación ni/o una lisis previa de los componentes celulares. Después del tratamiento, se pueden llevar a cabo etapas subsiguientes, por ejemplo una determinación de un analito. Lo más preferible, el tratamiento térmico se lleva a cabo con una muestra sustancialmente pura, por ejemplo una muestra que comprende componentes celulares sustancialmente intactos.
El método de la presente invención puede incluir la adición de otro fluido al fluido biológico antes y/o después del procesamiento. El fluido adicional puede ser un disolvente orgánico, preferiblemente en una cantidad de hasta 20% (vol/vol), más preferiblemente en una cantidad de hasta 10% (vol/vol), basada en el volumen del fluido biológico. El disolvente orgánico se selecciona preferiblemente de disolventes miscibles con agua, tales como metanol, etanol, acetonitrilo, dimetilsulfóxido, y sus combinaciones. La adición de disolventes orgánicos puede tener una influencia sobre las condiciones de temperatura/tiempo para el tratamiento térmico como se muestra en las Tablas
2 y 3.
Preferiblemente, el fluido adicional no efectúa sustancialmente la lisis de los componentes celulares. Más preferiblemente, el fluido adicional es un fluido acuoso, por ejemplo una disolución tampón acuosa o un fluido biológico adicional, que tiene preferiblemente una fuerza iónica que corresponde a 0,5-1,4% de NaCl, más preferiblemente 0,7-1,2% de NaCl, y lo más preferible alrededor de 0,9% de NaCl. Preferiblemente, el fluido acuoso es un fluido biológico sin componentes celulares, tal como plasma. Más preferiblemente, el plasma es plasma del grupo sanguíneo AB. El fluido acuoso adicional puede comprender un disolvente orgánico, por ejemplo en una cantidad de hasta 20% (vol/vol), preferiblemente hasta 10% (vol/vol), basada en el volumen del segundo fluido biológico, tal como metanol, etanol, acetonitrilo, dimetilsulfóxido y/o sus combinaciones. El segundo fluido biológico se añade preferiblemente en una relación en volumen de 5:1 a 1:10, basada en el volumen del primer fluido biológico. Preferiblemente, el segundo fluido se añade antes del tratamiento térmico. La adición del segundo fluido puede influir en las condiciones adecuadas de temperatura/tiempo para la etapa de tratamiento térmico como se muestra en las Tablas 4-6. Sorprendentemente, se encontró que la adición de plasma AB, opcionalmente con un disolvente orgánico, incrementa realmente el intervalo adecuado de tiempo de tratamiento a una temperatura dada.
El fluido adicional puede ser un fluido de estandarización y/o calibrador que comprende una cantidad predeterminada de al menos un compuesto de estandarización y/o calibrador. La adición de compuestos de estandarización y/o calibradores es particularmente adecuada si el fluido biológico tratado con calor se analiza posteriormente por medio de métodos cromatográficos, espectrométricos y/o espectroscópicos. Los compuestos de estandarización y/o calibradores pueden ser análogos de analitos que contienen isótopos estables tales como ^{2}H y/o ^{13}C, y de este modo se pueden detectar mediante espectrometría de masas.
El método también puede incluir la adición de un compuesto marcador/de tinción para lípidos, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos e hidratos de carbono al fluido biológico, antes y/o después del procesamiento.
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de una composición que comprende plasma AB, un disolvente orgánico en una cantidad de hasta 20% (vol/vol), preferiblemente hasta 10% (vol/vol) basada en el volumen del plasma, tal como metanol, etanol, acetonitrilo y/o dimetilsulfóxido, y una cantidad predeterminada de al menos un compuesto de estandarización y/o calibrador, en combinación con el procedimiento de tratamiento térmico como se describe anteriormente.
Aún un aspecto adicional de la presente invención se refiere a sangre completa con células desintegradas como se describe anteriormente. Este fluido representa una nueva matriz que es particularmente adecuada para el ensayo clínico. El fluido procesado es estable al menos 1 semana, preferiblemente al menos 2 semanas a 4ºC, y/o al menos 1 día, preferiblemente al menos 5 días, a 25ºC. De este modo, la manipulación del fluido procesado es mucho menos complicada en comparación con una muestra de sangre completa no tratada. El término "estable" significa particularmente que no se produce sedimentación.
La sangre completa con células desintegradas comprende células de la sangre sustancial y cuantitativamente desintegradas como se describe anteriormente. El fluido procesado está sustancialmente libre de productos de precipitación, desnaturalización, aglutinamiento y/o gelificación. La invención se refiere a una sangre completa procesada que
(i)
está libre de cualesquiera componentes particulares al observarla al microscopio con un aumento de 100 x; y
(ii)
está libre de sedimento tras la centrifugación durante 10 min. a una velocidad de hasta 3000 g, preferiblemente hasta 7400 g.
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El fluido procesado tiene preferiblemente una fuerza iónica que corresponde a 0,5-1,4% de NaCl, más preferiblemente 0,7-1,2% de NaCl, y lo más preferible una concentración salina sustancialmente fisiológica. El fluido procesado puede estar libre de reactivos de desintegración y/o de lisis y/o de detergentes añadidos. Por otro lado, el fluido procesado también puede comprender disolventes orgánicos y/o fluido acuoso añadido, tal como plasma del grupo sanguíneo AB como se describe anteriormente. El fluido procesado es sangre completa procesada.
La presente invención también se refiere a un método para determinar un analito en una muestra de sangre completa que se ha sometido a un tratamiento térmico como se describe anteriormente. El analito puede ser cualquier analito que se pueda detectar en sangre completa, por ejemplo un compuesto biológico tal como un ácido nucleico, un polipéptido, péptido, lípido, azúcar, hormona, metabolito, etc. Por otro lado, el analito puede ser un compuesto no biológico, por ejemplo un compuesto farmacéutico. En una realización preferida, el analito es un fármaco inmunosupresor, tal como ciclosporina, rapamicina o tacrolimus, o compuestos relacionados.
La determinación del analito en la sangre completa procesada se puede llevar a cabo según cualquier método conocido. Por ejemplo, la determinación del analito se puede llevar a cabo según métodos químicos, bioquímicos y/o fisicoquímicos, y puede comprender una reacción de hibridación, una reacción inmunológica, una reacción enzimática, por ejemplo una amplificación de ácidos nucleicos, un análisis cromatográfico, un análisis espectrométrico, tal como un análisis espectrométrico de masas o un análisis de RMN, y/o un análisis espectroscópico. En una realización especialmente preferida, la invención se refiere a un método para determinar un agente inmunosupresor en una muestra de sangre completa, en el que la sangre completa se procesa mediante un tratamiento térmico como se describe anteriormente, y el agente inmunosupresor se determina en la sangre completa procesada según métodos estándar, por ejemplo mediante métodos espectrométricos de masas.
En una realización adicional preferida, el analito es un parámetro clínico-químico, por ejemplo un parámetro clínico-químico asociado con un trastorno metabólico innato, por ejemplo fenilcetonuria. En esta realización, la muestra es preferiblemente una muestra de sangre capilar que se puede obtener de neonatos.
En aún una realización adicional preferida, el método es adecuado para procesar muestras de sangre procedentes de animales no humanos, preferiblemente ratones, cobayas y ratas. Por ejemplo, las muestras se pueden tomar mediante sistemas automatizados y se pueden procesar directamente como se describe anteriormente. Un sistema automatizado preferido es el Accu Sampler® de DiLab®.
Adicionalmente, la presente invención se explica con más detalle mediante los siguientes ejemplos.
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Ejemplo 1 Tratamiento térmico de muestras de sangre (sistema estático)
Se llenó un capilar de vidrio (55 mm de longitud x 0,5 mm de diámetro interno) con alrededor de 10 \mul de una muestra de sangre (eritrocitos: 5,18 x 10^{6}/\mul; hemoglobina: 17,5 g/dl; hematocrito 50,1%), se cerró en un extremo con plastilina y se calentó en un baño de agua termostatizado a una temperatura dada durante un tiempo dado. Al final del proceso de calentamiento, el capilar de vidrio se sumergió inmediatamente en un baño de hielo (4ºC). El cierre de plastilina se cortó, el capilar de vidrio se vació, y la muestra de sangre tratada se investigó adicionalmente en busca de gelificación y para determinar la plenitud de la desintegración de las células de la sangre. El parámetro t_{max} se define como el tiempo de calentamiento [segundos] en el cual se produce la gelificación de la muestra menos 1 segundo. El parámetro t_{min} se define como el tiempo de calentamiento mínimo en el cual no se detectan eritrocitos usando una cámara de recuento de Neubauer.
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Ejemplo 2 Recuento de eritrocitos
A 10 \mul de sangre completa o sangre tratada, se añadieron 990 \mul de disolución de Hayemsch (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania). La mezcla se sometió a vórtex, y una alícuota se introdujo en una cámara de recuento de Neubauer. Los eritrocitos presentes en 5 cuadrados definidos se contaron usando un microscopio y un aumento de 100.
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Cálculo:
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100 
\newpage
Los resultados se muestran en las siguientes Tablas 1-6.
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TABLA 1
Tratamiento térmico de sangre completa (eritrocitos: 5,18 x 10^{6}/\mul; hemoglobina: 17,5 g/dl; hematocrito 50,1%)
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1 
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TABLA 2 Tratamiento térmico de sangre completa que contiene 5% en volumen de metanol
2 
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TABLA 3 Tratamiento térmico de sangre completa que contiene 5% en volumen de acetonitrilo
3
TABLA 4 Tratamiento térmico de una mezcla 1:1 de sangre completa y plasma AB
4 
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TABLA 5 Tratamiento térmico de una mezcla 1:1 de sangre completa y plasma AB que contiene 5% en volumen de metanol
5 
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TABLA 6 Tratamiento térmico de una mezcla 1:1 de sangre completa y plasma AB que contiene 2,5, 5 ó 10% en volumen de acetonitrilo
6
Ejemplo 3 Tratamiento térmico de una muestra de sangre (sistema en circulación)
Para el tratamiento de una muestra de sangre (por ejemplo, 10 \mul) usando un capilar de acero inoxidable calentado, con la dimensión de 0,5 mm de diámetro interno y 300 mm de longitud, el tiempo de calentamiento a una temperatura dada se puede preajustar vía el caudal de un fluido de ensayo dado, tal como una disolución de NaCl al 0,9% en volumen.
Para una temperatura de 75ºC, el tiempo de retención capilar mínimo t_{min} de 9 segundos (véase el Ejemplo 1, Tabla 1) se alcanzó con un caudal de 466 \mul/min., y el tiempo de retención capilar máximo t_{max} de 23 segundos (véase el Ejemplo 1, Tabla 1) se alcanzó con un caudal de 183 \mul/min. De este modo, un caudal preferido para tal tamaño de muestra y configuración de capilar estaría dentro de estos márgenes, por ejemplo ascendiendo hasta aproximadamente 325 \mul/min. Este caudal también es óptimo para la ionización mediante electropulverización en espectrometría de masas.
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Cálculo:
101

Claims (25)

1. Un método para procesar un fluido biológico que comprende componentes celulares, en el que el fluido biológico es sangre completa, en el que el fluido se somete a un tratamiento térmico en condiciones
(i)
para proporcionar una desintegración sustancialmente cuantitativa de dichos componentes celulares, y
(ii)
para no provocar sedimentación, precipitación, desnaturalización, aglutinamiento y gelificación sustanciales de los componentes del fluido,
en el que el tratamiento térmico se lleva a cabo en una condición de temperatura y tiempo definida mediante un límite superior a una temperatura dada (indicada como valor t_{max}) y mediante un límite de tiempo inferior a una temperatura dada (indicada como valor t_{min}), y en el que, si el tratamiento térmico se lleva a cabo durante un período de tiempo más prolongado que el valor t_{max}, se produce la gelificación, y en el que, si el tratamiento térmico se lleva a cabo durante un período de tiempo más corto que el valor t_{min}, se produce la desintegración incompleta, y en el que el recuento celular en el fluido biológico se reduce hasta 0,1% o menos.
2. El método de la reivindicación 1, en el que el tratamiento térmico se lleva a cabo a una temperatura de 60-90ºC, preferiblemente de 60-75ºC.
3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el tratamiento térmico se lleva a cabo durante un tiempo de 5 segundos a 1 minuto.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el tratamiento térmico se lleva a cabo mientras que el fluido está estático.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el tratamiento térmico se lleva a cabo mientras que el fluido está en circulación.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el tratamiento térmico comprende calentamiento inductivo, calentamiento convectivo, calentamiento resistivo y/o calentamiento mediante excitación con láser.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el fluido biológico es sangre completa tratada con anticoagulantes.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que no incluye
(i)
una etapa de sedimentación ni/o precipitación, ni/o
(ii)
una adición de reactivos de desintegración.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que se lleva a cabo como un procedimiento automatizado, preferiblemente en un dispositivo integrado.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que se añade, antes y/o después del procesamiento, un fluido adicional.
11. El método de la reivindicación 10, en el que el fluido adicional es un disolvente orgánico en una cantidad de hasta 20% (vol/vol) basada en el volumen del fluido biológico, tal como metanol, etanol, acetonitrilo y/o dimetilsulfóxido.
12. El método de la reivindicación 10 u 11, en el que el fluido adicional es un fluido acuoso sin componentes celulares, que comprende opcionalmente un disolvente orgánico en una cantidad de hasta 20% (vol/vol) basada en el volumen del fluido acuoso.
13. El método de la reivindicación 12, en el que el fluido adicional es plasma, particularmente plasma del grupo sanguíneo AB.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en el que el fluido adicional es un fluido de estandarización y/o calibrador, que comprende una cantidad predeterminada de al menos un compuesto de estandarización y/o calibrador.
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10-14, en el que el fluido adicional es una composición que comprende un plasma del grupo sanguíneo AB, un disolvente orgánico miscible con agua en una cantidad de hasta 20% (vol/vol) basada en el volumen del plasma, tal como metanol, etanol, acetonitrilo, dimetilsulfóxido, y/o sus combinaciones, y una cantidad predeterminada de al menos un compuesto de estandarización y/o calibrador.
16. Sangre completa con células desintegradas obtenible mediante tratamiento térmico de sangre completa tratada con anticoagulantes según el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende eritrocitos, leucocitos y trombocitos sustancial y cuantitativamente desintegrados, que está sustancialmente libre de productos de sedimentación, precipitación, desnaturalización, aglutinamiento y gelificación, y que está
(i)
libre de cualesquiera componentes particulares al observarla al microscopio con un aumento de 100 x; y
(ii)
libre de sedimento tras la centrifugación durante 10 min. a una velocidad de hasta 3000 g.
17. La sangre completa con células desintegradas de la reivindicación 16, que tiene una concentración salina sustancialmente fisiológica.
18. Un método para determinar un analito en una muestra de sangre completa, en el que la sangre completa se procesa según el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, y el analito se determina en la sangre completa procesada.
19. El método de la reivindicación 18, en el que el analito se selecciona de compuestos biológicos tales como ácidos nucleicos, polipéptidos, péptidos, lípidos, azúcares, hormonas, metabolitos, etc., y compuestos farmacéuticos.
20. El método de la reivindicación 18 ó 19, en el que el analito es un fármaco inmunosupresor, tal como ciclosporina, rapamicina o tacrolimus.
21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 18-20, en el que la determinación comprende una reacción de hibridación, una reacción inmunológica, una reacción enzimática, un análisis cromatográfico, un análisis espectrométrico y/o un análisis espectroscópico.
22. Un método para determinar un agente inmunosupresor en una muestra de sangre completa, en el que la sangre completa se procesa según el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, y el agente inmunosupresor se determina en la sangre completa procesada.
23. Un método para determinar un parámetro clínico-químico en una muestra de sangre completa procedente de neonatos, en el que la sangre completa se procesa según el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, y el parámetro clínico-químico se determina en la sangre completa procesada.
24. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 18-23, en el que la muestra se procesa y se determina en un dispositivo integrado.
25. Uso de una composición que comprende un plasma de grupo sanguíneo AB, un disolvente orgánico miscible con agua en una cantidad de hasta 20% (vol/vol) basada en el volumen del plasma, tal como metanol, etanol, acetonitrilo, dimetilsulfóxido y/o sus combinaciones, y una cantidad predeterminada de al menos un compuesto de estandarización y/o calibrador, en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15 ó 18-24.
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