ES2329334T3 - Formas multimericas de ligandos de la superfamilia de tnf. - Google Patents
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Abstract
Una proteína de fusión SFTNF-SPD multimérica que comprende: una pluralidad de trímeros polipeptídicos, i) un primer trímero constituido por hebras peptídicas de dominios extracelulares de un miembro de la superfamilia de TNF (SFTNF) de ligandos, siendo el resto de SFTNF uno seleccionado del grupo constituido por ligandos LTA, TNF, LTB y SFTNF4 a SFTNF18 como en tabla I; y ii) una segunda hebra de trímero de una molécula de proteína D tensioactiva pulmonar (SPD) comprendiendo cada primer trímero unido con dicha segunda hebra de trímero polipeptídica de molécula SPD la región del nodo, del cuerpo y del cuello, estando sustituidos dominios de reconocimiento de carbohidratos nativos (CRD) de las moléculas SPD por dicha hebra de ligando, y dichas hebras de SPD están unidas covalentemente en paralelo unas a otras, formando así una proteína de fusión multimérica que comprende una pluralidad de hebras polipeptídicas híbridas triméricas que irradian de un nodo de centro unido covalentemente de la molécula, teniendo el extremo libre de cada hebra trimérica que irradia unido dicho resto de SFTNF.
Description
Formas multiméricas de ligandos de la
superfamilia de TNF.
La presente invención se refiere a una forma de
procedimiento que prepara proteínas multiméricas solubles
constituidas por más de tres iteraciones de la misma molécula
bioactiva usando tecnología de ADN recombinante.
El presente Pound John y col. describe
requerimientos de reticulación y de epítopos mínimos para supresión
dependiente de CD40 de contraste de apoptosis con aquellos para
promoción del ciclo celular y de adhesiones homotípicas en
linfocitos B humanos (INTERNATIONAL IMMUNOLOGY, vol. 11, n.º 1,
enero de 1999 (1999-01), páginas
11-20). SCHNEIDER P. Y COL. describe que la
conversión de ligando FasCD95 unido a membrana a su forma soluble
está asociada con regulación a la baja de su actividad proapoptótica
y con la pérdida de toxicidad hepática (JOURNAL OF EXPERIMENTAL
MEDICINE, TOKIO, JP, vol. 187, n.º 8, 20 de abril de 1998
(20-4-1998), páginas
1205-1213). Hoppe H.-J. y col. da a conocer un haz
alfahelicoidal de tres hebras paralelo en el sitio de nucleación de
formación de triple hélice de colágeno (FEBS LETTERS, ELSEVIER
SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL, vol. 344, n.º 2/3, 1994, páginas
191-195). El documento WO95/31540 describe
polipéptidos trimerizadores, su fabricación y su uso. Se refiere
particularmente a un procedimiento nuevo de producir proteínas de
fusión multiméricas que implica a los miembros de la superfamilia
TNF (SFTNF) como proteínas de fusión con SPD y más específicamente,
proteínas de fusión CD40L-SPD y modificaciones
útiles de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
Numerosas proteínas se pueden fabricar usando
técnicas de biología molecular modernas y se pueden usar en
aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Usando técnicas de ADN
recombinantes, se construye el ADN que codifica una cadena de
aminoácidos individual y después se introduce dentro de una célula
que elabora la proteína final.
Algunas células, especialmente bacterias como
E. coli, carecen de la capacidad para plegar apropiadamente
las cadenas de aminoácidos en la estructura cuaternaria apropiada y
fallan a menudo en aplicar las modificaciones necesarias (por
ejemplo, glicosilación y formación de puentes disulfuro) que se
necesitan para que la proteína sea bioactiva y resistente a la
degradación in vivo.
Aunque que se puede cumplir con la mayoría de
estos retos expresando la cadena de aminoácidos en células
eucariotas como células de levaduras o células de mamíferos in
vitro, no siempre es sencillo expresar proteínas que constan de
dos o más cadenas de aminoácidos.
En general, para proteínas multicadena, las
cadenas de aminoácidos individuales deben asociarse conjuntamente
en algún modo bien dentro de la célula productora o bien
subsiguientemente después de que los monómeros se segreguen desde
la célula productora. Para moléculas construidas artificialmente, la
introducción dentro de una cadena de aminoácidos individual de una
secuencia de aminoácidos que causa esta asociación cadena a cadena
puede ser una etapa importante en producir proteínas
multicadena.
Uno de los procedimientos más ampliamente usados
de causar que dos cadenas de aminoácidos se asocien es unir, al
nivel de codificación de ADN, segmentos de la proteína de interés y
un segmento de una proteína de dimerización espontánea. El mejor
ejemplo es unir o fusionar una proteína con la parte Fc de
inmunoglobulina, creando una proteína de fusión de Fc dimérica
(Fanslow y col., J. Immunol. 136: 4099, 1986). Una proteína de este
tipo se puede formar a partir del dominio extracelular de un
receptor de factor de necrosis tumoral fusionado a Fc (llamado
etanercept y comercializado como ENBREL®), que es efectivo en el
tratamiento de artritis reumatoide. Un segundo ejemplo es la
construcción de una proteína de fusión entre la parte extracelular
formadora de dímeros de CD8 con la parte extracelular de CD40L
(Hollenbaug y col., EMBO J. 11:4313, 1992). Aquí, la parte de CD8
formadora de dímeros de la proteína de fusión ayuda a mantener la
parte de CD40L en la forma trimérica necesitada para esta
bioactividad. Un ejemplo más reciente es la adición de un resto de
cremallera de leucina a CD40L, que permite la producción de
moléculas de CD40L solubles triméricas (Morris y col., J. Biol.
Chem. 274: 418,
1999).
1999).
La superfamilia de TNF (SFTNF) consta de un
número en expansión de proteínas (véase Tabla I) que son cruciales
para el desarrollo y funcionamiento de los sistemas inmune,
hematológico y esquelético. Las proteínas de la SFTNF son ligandos
para un juego de receptores correspondiente de la superfamilia de
receptores de TNF (SFRTNF). Todos los miembros de la SFTNF se
expresan como proteínas de membrana de tipo II, con la excepción de
la linfotoxina-alfa que se produce como una
proteína segregada. Sin embargo, las formas solubles de varias
proteínas de SFTNF se pueden liberar desde la superficie celular
por escisión proteolítica, usualmente mediante
metaloproteasas
específicas.
específicas.
\newpage
La producción de formas solubles de proteínas de
la SFTNF ha sido una etapa importante en el estudio de estas
proteínas. Los ligandos de SFTNF solubles se pueden usar para
estudiar las actividades de estas proteínas in vitro sin las
complejidades en interpretación que resultan cuando se añaden las
células o las membranas celulares que expresan proteínas de la
SFTNF. Además, las formas solubles de varias proteínas de la SFTNF
tienen potencial como agentes terapéuticos para enfermedades
humanas. En particular, se ha estudiado extensivamente
TNF-\alpha para el tratamiento de cáncer y CD40L
soluble está sufriendo actualmente ensayos clínicos para evaluar
sus efectos antitumorales.
Para producir formas solubles de proteínas de la
SFTNF, bien se expresa la proteína de membrana en una línea celular
que posee una proteasa capaz de separar el dominio extracelular de
la SFTNF del dominio transmembrana o bien se produce una forma
truncada de la proteína de la SFTNF que consta únicamente del
dominio extracelular más una secuencia señal. En cualquier caso,
ciertas formas solubles de las proteínas de la SFTNF son inestables
en solución como simples homotrímeros compuestos únicamente del
dominio extracelular. Por ejemplo, el TNF-\alpha
solubilizado de forma natural es lábil en condiciones fisiológicas
[Schuchmann, 1995 n.º 129]. Para resolver este problema de
estabilidad, se han construido proteínas quiméricas de acuerdo con
uno de cuatro principios de diseño diferentes: (1) la parte
extracelular de la proteína de la SFTNF se ha expresado fusionada a
la parte dimérica del fragmento Fc de inmunoglobulinas patente de
los EE.UU. 5.155.027, 13 de octubre, 1992, concedida a Andrzej Z.
Sledziewski y col. En el caso de CD40L y OX40L, esto proporciona una
molécula soluble que es significativamente menos activa que la
forma de membrana nativa de esta proteína. (2) La parte extracelular
de la proteína SFTNF se ha expresado con una marca antigénica
(usualmente el resto FLAG) fusionada a su extremo
N-terminal [Mariani, 1996]. La adición de un
anticuerpo a la marca (por ejemplo, anticuerpo
anti-FLAG) agrega estas proteínas en una forma
multimérica. La reticulación potencia actividad en linfocitos B. (3)
La parte extracelular de la proteína de la SFTNF se ha expresado
fusionada a la parte extracelular que dimeriza espontáneamente de
la molécula CD8 [Hollenbaugh, 1992]. En el caso de la CD40L, ésta
crea una molécula hexamérica [Pullen, 1999] que está probablemente
formada por dos trímeros de CD40L unidos a tres tallos diméricos de
CD8. A pesar de esto, la adición de un anticuerpo
anti-CD8 para reticular la proteína de fusión
CD40L-CD8 proporciona una potenciación adicional de
actividad CD40L en linfocitos B. (4) La parte extracelular de la
proteína SFTNF se ha expresado fusionada a una cremallera de
isoleucina formadora de trímeros que mantiene la estructura
trimérica general de la proteína [patente de los estados Unidos
5.716.805, 10 de febrero, 1998, concedida a Subashini Srinivasan y
col.]. Este trímero de CD40L soluble o "sCD40LT" es la forma de
que la proteína está probándose clínicamente ahora en seres humanos
por sus efectos
antitumorales.
antitumorales.
Liquidar las dificultades en producir formas
estables de proteínas de SFTNF solubles son arreglos en
bioactividad. Como se ejemplifica por FasL, TNF y CD40L, muchas de
las formas solubles de estas proteínas carecen del intervalo
completo de actividades estimulantes exhibido por las formas de
membrana de estas moléculas. Para FasL, varios grupos han
comunicado que FasL producido de forma natural (generado por
escisión proteolítica a partir de la forma de membrana) tiene un
espectro de actividades que es distintivamente diferente de la forma
de membrana. FasL soluble induce apoptosis en células CD4+
activadas pero no en linfocitos T CD4+ en reposo, recientes.
En contraste, ambos tipos de linfocitos T CD4+
se destruyen por FasL de membrana o por una forma soluble
recombinante de FasL (WX1) que se agrega espontáneamente en
oligómeros mayores que un decámero. Para TNF, la activación de
linfocitos T por estimulación de TNFR II, el receptor de 80 KDa para
TNF, es mucho mayor con TNF de membrana que con TNF soluble. Sin
embargo, si el TNF soluble se produce como una proteína marcada y se
reticula con un anticuerpo contra la marca, después ello imita
completamente las actividades de TNF de membrana [Scheider, 1998].
Finalmente, para CD40L, los efectos estimuladores de una forma
soluble de esta proteína de SFTNF se potencian por reticulación
[Kehry, 1994] y proporcionan una actividad simular a CD40L de
membrana. Por ejemplo, la proteína de fusión
CD40L-CD8 soluble requiere reticulación con un
anticuerpo de CD8 con el fin de conducir a los linfocitos B en
reposo a proliferar hasta un grado similar a CD40L unido a
membrana). Incluso más notablemente, aunque el CD40L unido a
membrana expresado en células de insecto transducidas con
baculovirus SF9 es un estímulo de linfocitos B fuerte, las
vesículas pequeñas (10-1.500 nm) preparadas a partir
de las membranas de estas células son menos estimuladoras. Sin
embargo, la ultracentrifugación de estas vesículas creó agregados
que tienen la actividad total de la proteína CD40L de la membrana
original. Esto indica que los linfocitos B se estimulan más
altamente por una superficie grande de CD40L de lo que lo son por
una superficie más pequeña que exprese este ligando de
membrana.
Tomadas conjuntamente, las comunicaciones
anteriores sugieren que, para algunos pares ligando/receptor
SFTNF/
SFTNFR al menos, es esencial agrupar receptores conjuntamente para actividad de señales completa. Por esta interpretación, la eficacia de las formas de membrana de FasL, TNF y CD40L tiene lugar porque estos ligandos pueden moverse en el plano de la membrana hacia la zona de contacto con una célula que responde portadora de receptores, agrupando de este modo receptores ligados para formar una región densa en receptores de la membrana. Esta interpretación está respaldada adicionalmente por experimentos donde la reticulación de una proteína de la SFTNF soluble imita de forma efectiva la actividad de la forma de membrana de la proteína [Scheider, 1998].
SFTNFR al menos, es esencial agrupar receptores conjuntamente para actividad de señales completa. Por esta interpretación, la eficacia de las formas de membrana de FasL, TNF y CD40L tiene lugar porque estos ligandos pueden moverse en el plano de la membrana hacia la zona de contacto con una célula que responde portadora de receptores, agrupando de este modo receptores ligados para formar una región densa en receptores de la membrana. Esta interpretación está respaldada adicionalmente por experimentos donde la reticulación de una proteína de la SFTNF soluble imita de forma efectiva la actividad de la forma de membrana de la proteína [Scheider, 1998].
En todos los ejemplos anteriores, no se ha
causado que se asocien entre sí más de tres cadenas de aminoácidos.
Hay una necesidad para producir moléculas de proteínas multiméricas
donde se cause que más de tres cadenas de aminoácidos se asocien en
un complejo molecular soluble individual. Un ejemplo importante
viene de estudios de CD40L (también llamada CD 154 o SFTNF5), que es
un miembro de la familia de moléculas TNF que se expresan
normalmente como proteínas de membrana celular, insolubles. Se ha
mostrado que homotrímeros solubles compuestos de las regiones
extracelulares de CD40L, TNF y FasL no están potentemente activos
en células en reposo que llevan receptores para estas proteínas. Sin
embargo, si estas proteínas se expresan con una marca en sus
extremos (por ejemplo, la secuencia peptídica de FLAG) y después los
trímeros están extensivamente reticulados usando un anticuerpo para
FLAG, aparece la actividad total (Schneider y col., J. Exp. Med.
187: 1205, 1998). A partir de esto, se puede inferir que las formas
individual-trímero solubles de estas moléculas no
duplican las interacciones multivalentes que ocurren normalmente
cuando una célula que lleva receptores entra en contacto con la
membrana de una célula que expresa numerosos trímeros de ligandos
en su superficie. Esta distinción puede deberse a una necesidad de
agrupar receptores para señalización plena (Bazzoni y Beutler, N.
Eng. J. Med. 334: 1717, 1996), que en cambio sólo es posible con un
ligando multimérico que capta muchos receptores al mismo tiempo en
una región localizada de la membrana celular. Pound John y col.
describen requerimientos de reticulación y epítopos mínimos para
supresión dependiente de CD40 de contraste de apoptosis con
aquellos para promoción del ciclo celular y de adhesiones
homotípicas en linfocitos B humanos (INTERNATIONAL IMMUNOLOGY, vol.
11, n.º 1, enero de 1999 (1-1999), páginas
11-20. SCHNEIDER P. Y COL. describen que la
conversión de ligando FasCD95 unido a membrana a su forma soluble
está asociada con regulación a la baja de su actividad
proapoptótica y con la pérdida de toxicidad hepática (JOURNAL OF
EXPERIMENTAL MEDICINE, TOKIO, JP, vol. 187, n.º 8, 20 de abril de
1998 (20-4-1998), páginas
1205-1213). Hoppe H.-J. y col. da a conocer un haz
alfa-helicoidal de tres hebras paralelas en el sitio
de nucleación de formación de triple hélice de colágeno (FEBS
LETTERS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, AMSTERDAM, NL, vol. 344, n.º
2/3, 1994, páginas 191-195). El documento
WO95/31540 describe polipéptidos formadores de trímeros, su
elaboración
y uso.
y uso.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se refiere a una materia sujeto
según se define en las reivindicaciones adjuntas.
La presente descripción contempla un
procedimiento de preparar proteínas de mamíferos multiméricas,
solubles cultivando una célula huésped transformada o transfectada
con un vector de expresión que codifique una proteína de fusión que
comprenda la región del nodo, la región del cuerpo y la región del
cuello de una molécula SPD y un dominio extracelular de una
proteína de SFTNF.
Se da a conocer que, se incluyen o se retiran
sitios de degradación proteolítica de la proteína de fusión; las
formas de proteína de fusión resultantes forman un multímero del que
se escinden unidades individuales a una velocidad hecha variable
por la naturaleza de los sitios de digestión proteolíticos bien
incluidos o bien excluidos.
Se da a conocer que, se da especial atención a
la inmunogenicidad de la proteína de fusión alterando la
articulación entre las dos proteínas que se dan en la naturaleza de
las que ella está hecha; la proteína de fusión resultante puede ser
menos o más capaz de facilitar una respuesta inmune contra ella,
misma, lo que podría alargar su persistencia o contribuir a su
efectividad inmunológica.
Se da a conocer una secuencia de nucleótidos
híbridos de no más de 1528 pares de bases que incluye una secuencia
que define un gen estructural que expresa una hebra individual unida
de una proteína de fusión de SFTNF-SPD multimérica,
teniendo dicho gen estructural una secuencia de bases nucleotídicas
seleccionada de miembros del grupo constituidos por SEC ID N.º 1,
SEC ID N.º 3 y SEC ID N.º 5. Se da a conocer que, el segmento de
ADN del gen estructural tiene una secuencia que expresa una cadena
de aminoácidos híbrida individual de SFTNF-SPD,
teniendo el segmento una primera secuencia de bases nucleotídicas de
SPD de SEC ID N.º 1, desde la base 32 hasta la base 799 y una
segunda secuencia, que expresa una parte del tallo de la SFTNF,
seleccionada de miembros del grupo constituido por SEC ID N.º 1,
desde la base 800 hasta la base 1444, SEC ID N.º 3, desde la base
800 hasta la base 1528 y SEC ID N.º 5, desde la base 800 hasta la
base 1441.
Se da a conocer que, una molécula de ADN
recombinante tiene vector unido operativamente a un segmento de ADN
exógeno que define un gen estructural que expresa una cadena de
aminoácidos individual de SFTNF-SPD. Este gen
estructural tiene una secuencia de bases nucleotídica seleccionada
de miembros del grupo constituido por SEC ID N.º 1, SEC ID N.º 3 y
SEC ID N.º 5., cualesquiera equivalentes funcionales de los mismos y
cualesquiera modificaciones de los mismos. Está unido también un
promotor apropiado para conducir la expresión de dicho gen
estructural en un organismo huésped compatible. El organismo puede
ser E. coli, una levadura, una planta superior o una animal
superior.
Se da a conocer que la proteína de fusión
SFTNF-SPD multimérica puede tener una pluralidad de
péptidos triméricos, un primer trímero que consiste en hebras
peptídicas de miembros de la superfamilia de TNF (SFTNF) de ligandos
y una segunda hebra de trímero de una molécula de colectina,
estando cada primer trímero unido con una segunda hebra de trímero
de polipéptidos de una molécula de colectina, estando dominios de
reconocimiento de carbohidratos nativos (CRD) de las moléculas de
colectina sustituidos por dicha hebra de ligando. Las hebras de
colectina que forman un conjunto están unidas en paralelo
covalentemente unas a otras, formando una proteína de fusión
multimérica que comprende una pluralidad de hebras polipeptídicas
híbridas triméricas que irradian a partir de un nodo central unido
covalentemente de la molécula. El extremo libre de cada hebra que
irradia trimérica tiene un resto unido de SFTNF. El resto de SFTNF
es uno seleccionado del grupo constituido por ligandos LTA, TNF,
LTB y SFTNF4 a TNTSF18 como se muestra en la tabla II y sus
equivalentes funcionales y modificaciones de los
mismos.
mismos.
La invención también contempla un procedimiento
para preparar un polipéptido de fusión multimérico
CD40-SPD, que incluye las etapas de iniciar un
cultivo, en un medio nutriente, de células huésped procariotas o
eucariotas transformadas con una molécula de ADN recombinante que
incluye un vector de expresión, apropiado para las células, unido
operativamente a un segmento de ADN exógeno que define un gen
estructural para ligando CD40-SPD. El gen
estructural tiene una secuencia de bases nucleotídicas de SEC ID N.º
1 desde la base 32 hasta la base 1444. A partir de entonces, el
cultivo se mantiene durante un periodo de tiempo suficiente para que
las células expresen la molécula multimérica.
También está contemplado un procedimiento de
producir una quimera de proteína de fusión de ligando de
superfamilia de factor de necrosis tumoral multimérica, segregada,
muy grande, biológicamente activa, que es altamente inmunogénica y
no fácilmente difundible. Las etapas para este procedimiento son
como sigue:
1. introducir dentro de una célula huésped una
primera construcción de ADN quimérico que incluye un promotor
transcripcional unido operativamente a una primera secuencia señal
secretora, seguido cadena adelante por, y en fase de lectura
apropiada con una primera secuencia de ADN que codifica una cadena
polipeptídica de un primer ligando de SFTNF que requiere
multimerización de actividad biológica. Esta secuencia está unida a
una segunda secuencia de ADN que codifica un polipéptido de
colectina en el sitio donde la CDR de colectina se retiró a
propósito.
2. introducir dentro de la célula huésped, una
segunda construcción de ADN que incluye un promotor transcripcional
unido operativamente a una segunda secuencia señal secretora seguido
cadena adelante por, y en fase de lectura apropiada con una tercera
secuencia de ADN que codifica una segunda cadena polipeptídica de un
segundo ligando de SFTNF, unida a una cuarta secuencia de ADN que
codifica un polipéptido de colectina, en el que la CDR de colectina
se retiró a propósito y después,
3. cultivar la célula huésped en un medio de
crecimiento apropiado en condiciones fisiológicas para permitir la
secreción de una proteína de fusión de polipéptido multimerizada
grande, en la que la primera cadena polipeptídica de una proteína
SFTNT-SF está unida mediante unión paralela al
trímero de dominio de colectina respectivo para la segunda cadena
polipeptídica de un trímero polipeptídico SFTNF-SPD
diferente; y en la que la proteína de fusión polipeptídica
multimerizada muestra actividad biológica característica de ambas
SFTNF unidas a membrana y
4. aislar la fusión polipeptídica
SFTNF-SPD multimerizada biológicamente activa, a
partir de dicha célula huésped. Los compuestos reaccionantes
quiméricos se humanizan para proteger contra destrucción por un
sistema inmune de receptor humano potencial.
Un procedimiento final de preparar una proteína
de fusión de ligando SFTNF-SPD multimérica requiere
a) preparar un primer segmento de ADN que codifica una hebra de una
parte extracelular expuesta de la SFTNF; b) preparar un segundo
segmento de ADN que codifica una hebra polipeptídica de colectina,
en la que el dominio CRD de colectina de la hebra se ha retirado;
c) unir los ADN primero y segundo en fase de lectura apropiada,
creando de este modo una construcción de ADN de
SFTNF-colectina; d) insertar la construcción dentro
de un sistema vector de expresión; e) introducir el sistema de
vector dentro de una célula apropiada en cultivo en condiciones
adecuadas; f) recoger y purificar medio gastado del cultivo; y
finalmente g) someter a ensayo para determinar la presencia de
proteína de fusión SFTNF-colectina multimérica.
Se contempla también un procedimiento para
estimular la respuesta inmune en células potencialmente
inmunocompetentes usando proteínas de fusión de la SFTNF
multiméricas poniendo en contacto las células con las proteínas de
fusión de la SFTNF multiméricas, causando la proliferación de las
células. Las células usadas pueden ser linfocitos B en reposo. Hay
también un procedimiento para incrementar antigenicidad de células
poniendo en contacto las células con las proteínas de fusión de la
SFTNF multiméricas. En este caso, las células pueden ser células
tumorales o células VIH positivas.
Se dan a conocer los procedimientos de
preparación descritos anteriormente, en los que el huésped
transformado es bien un procariota, tal como E. coli, bien
un eucariota, por ejemplo levadura, tal como S. cerevisiae,
o bien una planta superior, tal como alfalfa o tabaco.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1. Estructura de la proteína de fusión
CD40L-SPD. La parte extracelular del homotrímero
de CD40L, incluyendo su tallo proximal a membrana, se fusionó al
cuerpo de SPD. El extremo N-terminal de SPD contiene
dos cisteínas que unen al homopolímero entre sí con puentes
disulfuro que forman un nodo. El tallo colagenoso trimérico se
extiende a partir del nodo como una estructura cruciforme y finaliza
en una región de cuello que forma trímeros espontáneamente. Se
muestran los dominios de aminoácidos en una cadena individual de la
CD40L-SPD en la parte superior. En el fondo está el
tetramérico (cuatro trímeros de CD40L) que se espera que se forme.
Además, la región de nodo de SPD puede participar en apilar hasta 8
o más formas cruciformes en agregados de orden superior.
Figura 2. Cromatografía de intercambio iónico
de CD40L-SPD murina. Se cultivaron células CHO
que expresan CD40L-SPD murina en medios libres de
suero, se concentraron usando una membrana de ultrafiltración de
límite de 100 kDa y se diafiltraron en bicina 50 mM, pH 9,0, EDTA 1
mM. Usando un sistema de FPLC, la proteína de 400 ml de medios se
aplicó a una columna de Fractogel SO_{3}^{-} 650 M y se eluyó
con un gradiente de sal lineal. Se recogieron muestras de 3 ml. Se
mostraron curvas para concentración de proteínas (DO_{280}),
conductividad como % de NaCl 1 M en el tampón y se ensayó
CD40L-SPD detectable por ELISA a dilución 1:100.
Figura 3. Fraccionamiento de tamaño de
CD40L-SPD murina mediante ultrafiltración.
CD40L-SPD es una proteína de 471 aminoácidos con un
peso molecular predicho de 49.012 para cada una de las doce cadenas
componentes en el dodecámero (compuesto de cuatro subunidades
triméricas). Esto no incluye carbohidratos añadidos. Por lo tanto,
el dodecámero completo tendrá un peso molecular en exceso de
600.000. Sin embargo, a partir de la bibliografía sobre proteína D
tensioactiva recombinante fabricada en células CHO, parece que algo
del producto estará en la forma de trímeros que no son parte de un
dodecámero de forma cruciforme. Para determinar que porcentaje de
CD40L-SPD se produjo en una forma multimérica, el
sobrenadante de las células CHO transfectadas se hizo pasar a
través de filtros de diferentes porosidades (considerados por su
capacidad para retardar proteínas globulares). Se usó un ELISA para
detectar la cantidad de CD40L-SPD (medido a
diluciones múltiples) que pasó a través del filtro. Como se
muestra, aproximadamente el 90% de la proteína se retiene por un
filtro de límite de 300.000 kDa. Esto indica que la mayoría de la
proteína está en la forma dodecamérica. Además, los dodecámeros en
forma de cruz de la proteína D tensioactiva pueden también apilarse
en la parte superior unos de otros en formas de pesos moleculares
incluso mayores. Esta es la explicación probable para la fracción
pequeña de CD40L-SPD que se retiene por el filtro
de límite de
1.000 kDa.
1.000 kDa.
Figura 4. Activación de linfocitos B humanos
mediante CD40L-SPD humana. Los medios
condicionados de células CHO que expresan CD40-SPD
humana se añadieron a linfocitos B humanos junto con
IL-4. En el panel izquierdo, las células se tiñeron
con anti-CD19 marcado con CyChrome para identificar
linfocitos B y se tiñeron con anti-CD3 marcado con
PE para identificar linfocitos T. Como se muestra, la mayoría de las
células que proliferaron en el cultivo eran linfocitos B C19+ CD3-.
En el panel derecho, las células se tiñeron con
anti-CD19 marcado con CyChrome para identificar
linfocitos B y se tiñeron con anti-CD80
(B7-1) marcado con PE para identificar esta
molécula coestimuladora. Como se muestra, casi todos los linfocitos
B se indujeron mediante CD40L-SPD para expresar
CD80.
Figura 5. Activación de linfocitos B murinos
mediante CD40L-SPD murina. Se añadió
CD40L-SPD murina a linfocitos B esplénicos en
reposo durante un periodo de cultivo de dos días. Durante las cuatro
horas finales, los cultivos se sometieron a pulso con
^{3}H-timidina, tras lo que las células se
recogieron y la síntesis de ADN se midió mediante cuenta de
centelleo. Como se muestra, CD40L-SPD es casi tan
efectivo como anti-IgM en promover la proliferación
de linfocitos B en reposo.
Figura 6. Estimulación de
CD40L-SPD de producción de quimiocinas de
macrófagos. Se añadieron medios condicionados de células CHO
que expresan CD40L-SPD humana, un mutante inactivo
de CD40L-SPD humana
(T147N-CD40L-SPD), o de
CD40L-SPD murina (mCD40L-SPD) a
cultivos de macrófagos derivados de monolitos humanos. Como un
control negativo, estos medios se inactivaron al calor a 60ºC
durante 30 minutos. También se muestra una forma de CD40L soluble
(sCD40L) constituido por 149 aminoácidos a partir del dominio
extracelular de CD40L humana (Peprotech) añadida a 1 \mug/ml. Se
recogieron 24 horas más tarde los sobrenadantes y el ensayo para
MIP-1\Box por ELISA (R & D Systems). Es
patente la actividad débil de CD40L
individual-trímero soluble (sCD40L). En contraste,
CD40L-SPD nativa humana y murina activó fuertemente
los macrófagos para producir MIP-1\Box. En
contraste, CD40L-SPD inactivada por calor estuvo
inactiva. Como se esperaba, el mutante inactivo,
T147N-CD40L-SPD, también falló en
estimular macrófagos, demostrando que la parte de CD40L y no la
parte de SPD de la proteína fue responsable de estimular los
macrófagos.
Figura 7. Expresión de producción de
RANKL/TRANCE-SPD a partir de células de CHO
detectada por ELISA. Se usaron anticuerpos contra RANKL/TRANCE
para construir un ELISA capaz de detectar la proteína RANKL/
TRANCE. Como se muestra, no hubo ningún antecedente con el control de medios. Usando una proteína de fusión entre CD70 (CD27L o SFTNF7) y SPD, no hubo además ninguna señal, indicando la especificidad de la ELISA. Sin embargo, usando células CHO transfectadas con un plásmido de expresión para CD70-SPD, la proteína segregada inmunorreactiva fue claramente detectable. Esto demostró la generalizabilidad del procedimiento para expresar miembros SFTNF como proteínas de fusión con colectinas tales como SPD.
TRANCE. Como se muestra, no hubo ningún antecedente con el control de medios. Usando una proteína de fusión entre CD70 (CD27L o SFTNF7) y SPD, no hubo además ninguna señal, indicando la especificidad de la ELISA. Sin embargo, usando células CHO transfectadas con un plásmido de expresión para CD70-SPD, la proteína segregada inmunorreactiva fue claramente detectable. Esto demostró la generalizabilidad del procedimiento para expresar miembros SFTNF como proteínas de fusión con colectinas tales como SPD.
\vskip1.000000\baselineskip
Multimérico: como se usa en el presente
documento el término multimérico se refiere a un polipéptido que es
un trímero por sí mismo (es decir, una pluralidad de trímeros).
Equivalente Funcional: en el presente
documento se hace referencia a una secuencia de un péptido o
polipéptido que tiene similitud estructural sustancial y similitud
funcional con otra secuencia tal.
Modificaciones: en el presente documento
se hace referencia a cambios puntuales que involucran a aminoácidos
individuales, en los que la funcionalidad está alterada, sin alterar
apreciablemente la secuencia primaria o la estructura primaria de
un péptido o polipéptido.
Aminoácido: todos los residuos de
aminoácidos identificados en el presente documento están en la
configuración L natural. En conformidad con la nomenclatura
polipeptídica estándar, J. Biol. Chem., 243:
3557-59, (1969), las abreviaturas para residuos de
aminoácidos son como se muestran en la siguiente Tabla de
Correspondencia:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se debería destacar que todas las secuencias de
residuos de aminoácidos están representadas en el presente
documento por fórmulas cuya orientación de derecha a izquierda está
en la dirección convencional del extremo aminoterminal al extremo
carboxiterminal. Además, se debería destacar que un poco en el
comienzo o en el final de una secuencia de residuo de aminoácido
indica un enlace a un radical tal como H y OH (hidrógeno e
hidroxilo) en los extremos amino y carboxiterminal,
respectivamente, o una secuencia adicional de uno o más residuos de
aminoácidos hasta un total de aproximadamente cincuenta residuos en
la cadena polipeptídica.
Par de Bases (pb): una asociación de
adenina (A) con timina (T), o de citosina (C) con guanina (G) en una
molécula de ADN de doble cadena.
Promotor constitutivo: un promotor donde
la velocidad de unión e iniciación de la ARN polimerasa es
aproximadamente constante y relativamente independiente de
estímulos externos. Los ejemplos de promotores constitutivos
incluyen los promotores 35S y 19S del virus del mosaico de la
coliflor descritos por Poszkowski y col., EMBO J., 3: 2719 (1989) y
Odell y col., Nature, 313: 810 (1985).
ADN: ácido desoxirribonucleico.
Enzima: una proteína, polipéptido,
molécula de ARN peptídico, o proteína multimérica capaz de acelerar
o producir mediante acción catalítica algún cambio en un sustrato
para el que ella es a menudo específica.
Vector de expresión: una secuencia de ADN
que forma elementos de control que regulan expresión de genes
estructurales cuando se unen operativamente a esos genes.
Expresión: la combinación de
procedimientos intracelulares, incluyendo trascripción y traslación
sufridos por un gen estructural para producir un polipéptido.
Inserto: una secuencia de ADN extraña
para el ADNr, constituida por un gen estructural y opcionalmente por
secuencias de ADN adicionales.
Nucleótido: una unidad monomérica de ADN
o ARN constituida por un resto de azúcar (pentosa), un fosfato y
una base heterocíclica de nitrógeno. La base está unida al resto de
azúcar por medio del carbono glicosídico (carbono 1' de la pentosa)
y esa combinación de base y azúcar es un nucleósido. Cuando el
nucleósido contiene un grupo fosfato enlazado a la posición 3' o 5'
de la pentosa ellos se refiere como un nucleótido.
Operativamente unido o insertado: un gen
estructural está covalentemente unido en fase de lectura correcta a
otro segmento de ADN (o de ARN según sea apropiado), tal como a un
vector de expresión de tal forma que el gen estructural esté bajo
el control del vector de expresión.
Polipéptido y péptido: una serie lineal
de residuos de aminoácidos conectados uno al otro por enlaces
peptídicos entre los grupos alfa-amino y los grupos
carboxi de residuos adyacentes.
Promotor: un sitio de reconocimiento en
una secuencia de ADN o en un grupo de secuencias de ADN que
proporciona un elemento de control de expresión para un gen y al
que se une específicamente ARN polimerasa e inicia la síntesis de
ARN (trascripción) de ese gen.
Promotor Inducible: un promotor donde la
velocidad de unión e iniciación de ARN polimerasa está modulada por
estímulos externos. Tales estímulos incluyen luz, calor, estrés
anaeróbico, alteración en condiciones de nutrientes, presencia o
ausencia de un metabolito, presencia de un ligando, ataque
microbiano, provocación de heridas y
similares.
similares.
Promotor regulado espacialmente: un
promotor donde la velocidad de unión e iniciación de ARN polimerasa
está modulada en una estructura específica del organismo tal como
la hoja, el tallo o la raíz. Se dan ejemplos de promotores
regulados espacialmente en Chua y col., Science, 244:
174-181 (1989).
Promotor regulado espaciotemporalmente:
un promotor donde la velocidad de unión e iniciación de ARN
polimerasa está modulada en una estructura específica del organismo
en un tiempo específico durante el desarrollo. Un típico promotor
regulado espaciotemporalmente es el promotor de la EPSP
sintasa-35 S descrito por Chua y col., Science,
244: 174-181 (1989).
Promotor regulado temporalmente: un
promotor donde la velocidad de unión e iniciación de ARN polimerasa
está modulada en un tiempo específico durante el desarrollo. Se dan
ejemplos de promotores regulados temporalmente en Chua y col.,
Science, 244: 174-181 (1989).
Proteína: una serie lineal de más de
aproximadamente 50 residuos de aminoácidos unidos uno al otro como
en polipéptido.
Molécula de ADN recombinante: una
secuencia de ADN híbrida que comprende al menos dos secuencias de
nucleótidos no encontradas normalmente juntas en la naturaleza.
ARN: ácido ribonucleico.
Marcador Genético Selectivo: una
secuencia de ADN que codifica para un rasgo fenotípico por medio del
que se pueden seleccionar células transformadas a partir de células
no transformadas.
Gen estructural: una secuencia de ADN que
se expresa como un polipéptido, es decir, una secuencia de residuos
de aminoácidos.
Promotor sintético: un promotor que se
sintetizó químicamente más que derivarse biológicamente. Usualmente
los promotores sintéticos incorporan cambios de secuencia que
optimizan la eficiencia de la iniciación de ARN polimerasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta descripción da a conocer la producción de
proteínas de la SFTNF como ligandos multiméricos (es decir, muchos
trímeros) fusionados sobre un armazón de proteína ramificada,
trimérico. Las moléculas de colectina son ideales para este
propósito debido a que están formadas a partir de muchos brazos
colagenosos, triméricos unidos a un nodo central por puentes
disulfuro. De las colectinas, se eligió la proteína D tensioactiva
pulmonar (SPD) inicialmente debido a que ella es un homopolímero
codificado por un gen individual, a diferencia de C1q y de la
proteína tensioactiva A, que están compuestas de dos subunidades
proteicas diferentes. Además, se ha expresado exitosamente SPD
recombinante in vitro en rendimiento razonable [Crouch, 1994]
y un péptido que contiene la región "cuello" de SPD se mostró
que trimeriza espontáneamente en solución [Hoppe, 1994].
Consecuentemente, el dominio de reconocimiento de carbohidratos de
tensioactivo pulmonar D (SPD) se sustituyó por los dominios
extracelulares de CD40L humanos y murinos para crear una molécula de
cuatro brazos (tres cadenas peptídicas por brazo) con CD40L al
final de cada brazo. Esta molécula se llama
CD40L-SPD. Además, debido a que la SPD tiende a
apilarse en agregados de orden superior con hasta 8 moléculas
asociadas en el nodo [Crouch], puede ocurrir incluso mayor grado de
multimerización [Lu, 1993]. CD40L-SPD por lo tanto
imita la expresión de CD40L por un linfocito T activado en el que
se presenta un complejo multivalente similar a CD40L unida a
membrana. Mientras que permanezca soluble, CD40L-SPD
equivale a CD40L de membrana en su intervalo de actividades.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ADNc de CD40L humana y murina expuestas,
retirados de membranas celulares, se clonaron por PCR mediante
procedimientos bien conocidos. La proteína D tensioactiva murina se
clonó por PCR hemi-anidada de mRNA de pulmón murino
(Clonetech). El ADNc se preparó usando transcriptasa inversa
Superscript II (Life Technologies, Gaithersburg, MD) y hexámeros al
azar como cebadores. Las secuencias cebadoras de PCR eran como sigue
(las bases subrayadas indican sitios de endonucleasas de
restricción para clonar dentro del vector):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Debido a que la secuencia de SPD murina de la
región 5' no traducida que contiene el sitio de unión ribosomal era
desconocida cuando este trabajo se comenzó [Motwani, 1995], se
diseñó un cebador (rmSPD5) en base a la secuencia de rata
disponible [Shimizu, 1992] que prolongó el extremo 5'con secuencia
de rata (mostrada en negrita) junto con un sitio de Nhe I añadido
(subrayado).
\vskip1.000000\baselineskip
Para crear las fusiones
CD40L-SPD, se usó PCR solapante. Se amplificó SPD
murina por PCR anidada usando mSPD5 y mSPD3ext durante la primera
ronda de 30 ciclos. El producto se diluyó 1: 1.000 y se amplificó 1
\mul durante otros 30 ciclos usando rmSPD5 y CD40L/SPD3, donde la
mitad 3' de CD40L/SPD3 es un cebador inverso para SPD
C-terminal a la región de cuello (eliminando la CRD)
y la mitad 5' de CD40L/SPD3 contiene bases desde el extremo
N-terminal de la parte extracelular de CD40L
(inmediatamente adyacente a la región transmembrana). De forma
similar, el plásmido CD40L se amplificó con SPD/CD40L5 y CD40L3, que
contienen un sitio Kpn I (subrayado). Todas estas PCR se llevaron a
cabo con polimerasa clonada Pfu (Stratagene), usando comienzo
caliente (Ampliwax, Perkin-Elmer) y el programa de
termociclación: 94ºC durante 2,5 minutos; después 30 ciclos de 94ºC
durante 10 segundos, 43ºC durante 30 segundos y 75ºC durante 7
minutos.
Para formar la construcción quimérica, se
combinó y amplificó 1 \mul de una dilución 1:1.000 de productos
purificados en gel a partir de las reacciones anteriores con mSPD5 y
CD40L3. Debido a que la polimerasa Pfu no proporciona
consistentemente las 1,62 kb esperadas de producto solapante, se usó
ADN polimerasa AccuTaq LA (Sigma) para esta PCR, usando el programa
de termociclación: 94ºC durante 2,5 min; después 30 ciclos de 98ºC
durante 20 segundos, 43ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 10
minutos. El producto resultante se digirió con Nhe I y Kpn I, se
purificó en gel y se ligó en los sitios de Nhe I y de Kpn I en el
plásmido de expresión, pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se
transformaron E. coli DH5 con la construcción y el plásmido
de ADN se purificó bien por bandeo doble en gradientes de bromuro de
etidio-CsCl o bien por resina de intercambio
aniónico (QIAgen). Para formar la construcción
T147N-CD40L-SPD, se usó la misma
aproximación excepto en que se tomó la región codificante de CD40L
del plásmido de expresión para T147N-CD40L
[Kornbluth]. La secuencia de aminoácidos en la unión entre SPD y
CD40L es ...KAALFPDG/HRRLDKIE..., donde la parte
C-terminal empieza la secuencia para CD40L. Se tomó
una aproximación simular para formar mCD40L-SPD,
excepto en que se usaron cebadores SPD/mCD40L5, mCD40L/SPD3 y
mCD40L3 para amplificaciones que implican secuencias de CD40L
murina. La secuencia de aminoácidos en la articulación entre SPD y
CD40L murina es ...KAALFPDG/HRRLDKVE..., donde la parte
C-terminal empieza la secuencia para CD40L murina.
Se secuenciaron ambas hebras de cada construcción para confirmar
que las construcciones eran correctas. En otros experimentos, se
construyó una construcción enteramente humanizada, consistente en
CD40L humana fusionada a SPD humana (datos no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
Se estimularon células del bazo de ratones
C3H/HeJ con 5 \mug/ml de concanavalina A y 10 ng/ml de
IL-2 (Sigma) durante 8 horas (31). Se aisló mRNA
usando el kit Micro FastTrack (Invitrogen). Se preparó ADNc usando
transcriptasa inversa Superscript II (Life Technologies) y
hexámeros al azar como cebadores. Las secuencias cebadoras de PCR
eran como sigue (donde las bases subrayadas indican sitios de
endonucleasas de restricción para clonar dentro del vector):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se clonó la parte extracelular de RANK/TRANCE
por PCR anidada. En la primera ronda de PCR, se usaron
5mRANK-ext y 3mRANK-int con
polimerasa clonada Pfu (Stratagene) usando el programa
termociclador: 94ºC durante 2,5 minutos; después 30 ciclos de 94ºC
durante 10 segundos, 50ºC durante 30 segundos y 75ºC durante 2
minutos.
El producto se diluyó 1:1.000 y se amplificó 1
\mul durante otros 30 ciclos usando 5mRANK-ext y
3mRANK-int, que contienen un sitio Xho I y un sitio
Not I respectivamente. El producto resultante se digirió con Xho I,
se hicieron sus extremos romos con ADN polimerasa T4, después se
digirió con Not I y se purificó mediante gel. Se digirió el
plásmido de expresión CD40L-SPD descrito
anteriormente con Msc I y Not I y se purificó mediante gel. Después
la secuencia RANK/TRANCE se ligó dentro de este vector en fase con
la secuencia codificante de SPD. La secuencia de aminoácidos en la
articulación entre SPD y RANK/TRANCE es ...KAALFPDG/RAQMDPNR...,
donde la parte N-terminal es desde SPD y la parte
C-terminal es la secuencia extracelular de
RANK/TRANCE. Ambas hebras de ADN de cada construcción se
secuenciaron para confirmar que las construcciones eran
correctas.
\vskip1.000000\baselineskip
DG44 (una línea de células CHOK1 deficientes en
dihidrofolato reductasa (DHFR)) (32) y pCH1P (un plásmido que el
minigén DHFR de hámster) (33) fueron regalos del doctor Lawrence
Chasin, Columbia University, Nueva York, NY. Las células DG44 se
cultivaron en \Box-MEM constituido por
\Box-MEM libre de ribonucleótidos y de
desoxinucleósidos (BioWhittaker, Watersville, MD) suplementados con
L-glutamina 200 \muM, suero fetal bovino al 10%
(FBS) y 10 \mug/ml de cada uno de adenosina, desoxiadenosina y
timidina (Sigma). Todos los cultivos celulares descritos eran
negativos en un ensayo de ARN de micoplasma
(Gen-Probe, San Diego). Se transfectaron células
DG44 en placas de 6 pocillos por el procedimiento de Okayama y Chen
((34) con 10 \mug de plásmido de expresión y 0,05 \mug de pCH1P
(proporción 200:1)). Después de dos días, las DG44 transfectadas se
tripsinizaron y transfirieron a placas de 10 mm. En este punto, los
medios se cambiaron a \Box-MEM que difiere de
\Box-MEM en que se usa FBS dializado (HyClone
Systems, Logan, UT) y no se añaden suplementos de nucleósidos. Sólo
las células que contienen el minigén DHFR son capaces de crecer en
\Box-MEM y se seleccionaron colonias después de 10
días, se clonaron usando anillos de clonación y se transfirieron a
matraces de 12,5 cm^{2}. Se seleccionaron clones para expansión
usando un ELISA para rastrear la producción de bien CD40L murino o
bien CD40L humano (véase más adelante). Usando el procedimiento
descrito por Kingston y col. (35), se usaron las dosis que aumentan
de metotrexato para amplificar los genes transfectados durante un
periodo de 6-14 meses hasta que las células
crecieron bien en metotrexato 80 \muM. Cada clon que se expresa se
reclonó una vez o dos veces más con el fin de seleccionar las
células de expresión más
alta.
alta.
\vskip1.000000\baselineskip
Los clones seleccionados se adaptaron para
crecimiento en medios UltraCHO libres de nucleósido (BioWhittaker)
suplementados con 50-100 \mug/ml de ácido
ascórbico y metotrexato 50 \muM (Sigma). La población no adherente
se adaptó adicionalmente para crecimiento en suspensión en botellas
rotatorias. En algunos experimentos, las células se adaptaron de
medios \Box-MEM a medios
CHO-S-SMF II (Life Technologies)
suplementados con ácido ascórbico y 50 \mug/ml de prolina.
\vskip1.000000\baselineskip
Para ensayar para CD40L correctamente plegada,
se recubrieron pocillos de una placa de 96 pocillos MaxiSorb (Nunc)
durante toda una noche a 4ºC con 50 \mul de
carbonato-bicarbonato, tampón de pH 9,40 que
contiene 0,5 \mug/ml de MAb anti-CD40L humana
24-31 (Ancell) o MAb anti-murino MR1
(Bioexpress, Lebanon, NH). Se bloquearon los pocillos con
seroalbúmina bovina (BSA) al 3% en PBS. Se añadieron 100 \mul de
muestras a los pocillos bien puros o bien diluidos en un tampón de
dilución constituido por BSA al 1%, NaCl al 0,9%, Tris a pH 7,40 50
mM y Tween 20 (Sigma) libre de peróxido al 1%. Después de agitar
durante 2 horas a 600 RPM, se usó un lavador de placas para lavar
la placa cuatro veces con NaCl al 0,9%, Tris a pH 7,40 50 mM y Tween
20 libre de peróxido al 0,1%. Después, se añadieron 100 \mul de
tampón diluyente que contenía MAb anti-CD40L humana
24-31 (Ancell) biotinilado o MAb
anti-CD40L murina MR1 (Pharmingen, San Diego) a cada
pocillo y se agitaron de nuevo durante 2 horas. Tras otros cuatro
lavados, se añadieron a cada pocillo 100 \mul de tampón diluyente
que contenía 1 \mug/ml de estreptavidina-fosfatasa
alcalina (Jackson) a cada pocillo y la placa se agitó durante 1
hora. Por último, después de otros cuatro lavados, se desarrolló
color durante 10-20 minutos usando 100
\mul/pocillo de BluePhos (Kierkegaard & Perry), se añadió
solución de parada y los pocillos se leyeron a 650 \mum en un
lector de placa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se filtraron los medios de UltraCHO
condicionados usando unidad de filtro PES 0,2 \mu (Nalgene) y se
almacenaron a 4ºC durante hasta tres meses. Se llevó a cabo un
fraccionamiento de tamaño preliminar mediante ultrafiltración a
través de membrana de 76 mm de límite 100 KDa
(YM-100, Milipore) en 400 ml de células agitadas a
presión de 68947,6 pascales (10 libras/pulgada cuadrada) de argón.
Se concentraron los medios a aproximadamente 10 ml, se diluyeron a
100 ml con tampón y se concentraron de nuevo a 10 ml durante un
total de 3 ciclos de ultrafiltración e intercambio de tampón. El
tampón fue Bicina 50 mM (Calbiochem), se ajustó a pH 9,0 con NaOH
(Na a aproximadamente 32 mM) y EDTA 1 mM para evitar la actividad
de cualquier metaloproteinasa. Usando equipamiento FPLC
(Amersham-Pharmacia), el concentrado se filtró a
través de un filtro 0,45 \mu, se situó dentro de superbucle de 10
ml, se aplicó a una columna de 10 x 30 mm (HR10/30,
Amersham-Pharmacia) empaquetada con Fractogel
SO_{3}^{-} 650 M (EM Biosciences) y se eluyó a 0,5 ml/min a 4ºC
con un gradiente lineal de NaCl 0-500 mM en tampón.
Como se describe por el fabricante, la resolución de las proteínas
en Fractogel SO_{3}^{-} está potenciada usando una geometría de
columna fina, larga. Las fracciones se recogieron y se rastrearon
para CD40L humana o murina por ELISA. Se almacenaron las fracciones
positivas, se concentraron por ultrafiltración
(Centri-Prep, Millipore), se filtraron a través de
filtro 0,45 \mu y se aplicaron a una columna de Superosa 6
(Amersham-Pharmacia) en medio salino tamponado con
fosfato.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometieron a eutanasia ratones CH3/HeJ
mediante inhalación de CO_{2} según un protocolo aprobado por el
Animal Subjects Committee del San Diego VA Healthcare System. Los
esplenocitos se aislaron mediante centrifugación sobre
Lympholyte-M (Chemical & Scientific Corp.,
Westbury, NY segura) y se aislaron los linfocitos B por
selección negativa usando perlas inmunomagnéticas
anti-CD43 (Miltenyi Bistec. Inc., Auburn,
CA). Los linfocitos B en reposo se suspendieron en MEM de
Dulbecco con FBS al 10% a una concentración de 1 x 10^{6}/ml y se
añadieron 100 \mul a los pocillos de placas de fondo plano de 96
pocillos. Se añadieron 100 \mul de diluciones de
CD40L-SPD murina en medios o se añadieron medios
solos a los pocillos, que se incubaron en CO_{2} al 8,5% a 37ºC
durante 48 horas. Después, se añadieron 0,5 \muCi/pocillo de
^{3}H-timidina a cada pocillo y se recogieron las
células 4 horas más tarde sobre filtros de fibra de vidrio usando un
recolector de células automatizado. Se usó un contador de centelleo
para determinar la radiactividad incorporada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó sangre venosa de sujetos voluntarios como
una fuente de linfocitos B humanos según un protocolo aprobado por
la UCSD Institutional Review Board. Se recogió sangre en
jeringuillas que contenía 5 U/ml de heparina y se aislaron células
mononucleares de sangre periférica (PBMC) por centrifugación sobre
Ficoll-hypaque. Las células se suspendieron a 2 x
10^{5}/ml en RPMI 1640 que contenía L-glutamina
200 \muM, FBS al 10%, ciclosporina A (Sigma) 0,832 \muM y 25
ng/ml de IL-4 humana (R & D Systems) y se
incubaron en CO_{2} al 5% a 37ºC como se describe por Schultz y
col. (36). A intervalos, las células se tiñeron con anticuerpos
monoclonales anti-CD19 conjugados con CyChome y
anticuerpos monoclonales anti-CD80
(B7-1) conjugados con PE (Parmingen) y se analizaron
por citometría de flujo.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se describió previamente [Kornbluth], los
monocitos se aislaron a partir de PBMC mediante adherencia a placas
recubiertas de fibronectina, se plaquearon en placas de 48 pocillos
y después se cultivaron en RPMI 1640 conteniendo
L-glutamina 200 \muM y suero autólogo al 10%
durante 7-10 días. Se lavaron después monocapas de
las células maduras (aproximadamente 2 x 10^{5}/pocillo), llamadas
macrófagos derivados de monocitos o MDM, en medios y se cultivaron
en 1 ml/pocillo de RPMI 1640 que contenía
L-glutamina 200 \muM y FBS inactivado por calor
al 10%. Como alternativa, se formaron células dendríticas (DC) a
partir de monocitos añadiendo GM-CSF e
IL-4 a los medios de cultivo y el DC resultante se
usó 6 días más tarde. Se añadieron preparaciones de
CD40L-SPD a los pocillos como se indicó. Como un
control positivo, se añadieron 100 ng/ml de lipopolisacárido
bacteriano (LPS) a partir de E. coli 0111:B4 (Calbiochem).
Los sobrenadantes se recogieron 24 horas más tarde y se analizaron
para contenido en citoquinas usando ELISA (R & D Systems).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Para expresar CD40L y otros miembros de SFTNF
como proteínas multiméricas, estables, se unió la región codificante
de la parte C-terminal, extracelular, de CD40L en
fase a la colectina, proteína D tensioactiva (SPD). El extremo
N-terminal de SPD contiene dos cisteínas que forman
los puentes disulfuro necesarios para la estructura cruciforme de 4
brazos de la molécula general [Brown-Augsburger,
1996 n.º 506]. Está en posición C-terminal con
respecto a estas cisteínas en la SPD un "tallo" colagenoso de
triple hélice largo que finaliza en la región de "cuello" que
promueve la trimerización de cada brazo de la estructura.
Inmediatamente después de esta región de cuello, se añadió la
secuencia codificante para la parte extracelular de CD40L, en lugar
del dominio de reconocimiento de carbohidratos (CRD) de SPD. Se
eligieron las colectinas como el marco para la construcción
multimérica debido a su estructura de subunidades múltiples y a la
naturaleza trimérica de sus regiones de tallo. La adecuabilidad de
reemplazar la CRD de una colectina con la región extracelular de un
miembro de la SFTNF está respaldada adicionalmente por estudios
estructurales de las dos familias de proteínas. Un análisis de la
estructura del cristal de CRD de otra colectina, ACRP30, indicó que
era estructuralmente superponible sobre las estructuras cristalinas
de las regiones extracelulares de CD430L, TNF y Fas [Shapiro, 1998].
La expresión exitosa de la proteína de fusión de
colectina-SFTNF, CD40L-SPD, indicó
que otros miembros de SFTNF (Tabla I) podrían estar formando un
conjunto con SPD en una manera similar y que otras colectinas además
de SPD (Tabla II) podrían usarse como un marco proteico en vez de
SPD. Debido a que estas moléculas se forman enteramente a partir de
proteínas que se dan en la naturaleza, se minimiza la producción de
una respuesta inmune (por ejemplo, anticuerpos) para estas
proteínas de fusión. Eliminando partes de la región de tallo de las
proteínas SFTNF, se pueden fabricar construcciones adicionales que
pueden ser incluso menos
inmunogénicas.
inmunogénicas.
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Ejemplo
2
Se unieron las regiones codificantes para la
parte extracelular de la CD40L humana, la T147-CD40L
humana, un mutante inactivo de CD40L, o CD40L murino, a la región
de cuello de SPD murina, reemplazando la CRD SPD (figura 1). Se
cotransfectó un plásmido de expresión que dirige CMV para la
construcción con un minigén de DHFR en células CHO deficientes en
DNFR. Tras selección en medios libres de nucleósidos, los clones de
CHO que expresan se amplificaron por cultivo en dosis ascendentes
de metotrexato. Los clones resultantes produjeron aproximadamente
1-10 \mug/ml de la proteína de fusión durante un
periodo de 3 días en medios que contienen FBS.
Se adaptaron clones para cultivar en forma de
células en suspensión en dos tipos de medios libres de suero. Se
retuvieron grandemente (aproximadamente el 60% según se determina
por ELISA) CHO-SPD murinas producidas en UltraCHO
(BioWhitaker) mediante una membrana de ultrafiltración de límite
1.000 kDa (Pall Corp., Prot Washington, NY), consistente con un
complejo multimérico grande formado por el apilado de la parte DPD
de la molécula. Sin embargo, en
CHO-S-SFM II (Life Technologies),
casi todo el CHO-SPD murino detectable por ELISA se
hizo pasar a través de una membrana de ultrafiltración de límite
100 kDa (Millipore), sugiriendo que la proteína bien se plegó
incorrectamente en estos medios o bien se degradó por proteolisis.
Consecuentemente, el procedimiento de purificación se optimizó para
el gasto de medios UltraCHO.
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Ejemplo
3
Se desarrollaron procedimientos de purificación
para CD40L-SPD murina, pero los mismos
procedimientos podrían aplicarse a CD40L-SPD humana
con modificaciones secundarias. La CD40L-SPD murina
tiene un peso molecular predicho de 40 kDa por cadena, o de
aproximadamente 600 kDa por 12 cadenas, molécula cruciforme, la
secuencia de aminoácidos predice un pI de 9,10. De acuerdo con
ello, se concentraron los medios condicionados mediante
ultrafiltración a través de un filtro de límite de 100 kDa, que
también fracciona la muestra en base al tamaño. Después de
diafiltración en bicina 50 mM, pH 9,0 (conteniendo también EDTA 1 mM
añadido para inhibir meteloproteinasas), se aplicó la muestra a una
diversidad de resinas de intercambio catiónico. Usando Fuente 30S
(Amersham-Pharmacia), la mayoría de la proteína
detectable por ELISA no se unió y se recuperó en el flujo a través.
Sin embargo, como se comunicó por Morris y col. (Morris), Fractogel
SO_{3} 650 M retuvo la proteína. La retención por esta resina
tentacular y no por Fuente 30S sugiere unión a residuos cargados
positivamente que no están en la superficie de la proteína. Usando
un gradiente de NaCl lineal, la proteína detectable por ELISA eluye
a NaCl entre 0,15-0,30 M según estas condiciones
(figura 2). En experimentos seleccionados, la proteína se purificó
adicionalmente usando una columna de tamaño 6 de Superosa. La
mayoría de la proteína detectable por ELISA eluyó en el volumen
excluido, indicando un peso molecular patente de más de 1.000 kDa
(figura 3).
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Ejemplo
4
Schultze y col. describió un sistema usando
células que expresan CD40L más IL-4 y ciclosporina A
(para inhibir crecimiento de linfocitos T) como un medio para
cultivar números muy grandes de linfocitos B a partir de una
muestra pequeña de sangre. Debido a que CD40L activa estos
linfocitos B para expresar niveles altos de moléculas B7 (CD80 y
CD86), los linfocitos B proliferantes fueron efectivas en presentar
antígenos peptídicos y rivalizar con células dendríticas que no se
dividen como células presentadoras de antígenos (APC) (36). Para
determinar si la proteína de fusión CD40L-SPD
podría reemplazar a las células que expresan CD40L en este sistema,
PBMC se cultivó con CD40L-SPD además de con
IL-4 y ciclosporina A. Según estas condiciones las
células crecieron a densidad de saturación cada tres días. Después
de 3 semanas, los cultivos fueron casi enteramente linfocitos B
CD19+ que expresan altos niveles de CD80 (figura 4). Esto indica que
CD40L-SPD se puede usar en sistemas ex vivo
donde se necesita una forma aún efectiva soluble de CD40L para
estimular células para aplicaciones inmunoterapéuticas.
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Ejemplo
5
Los linfocitos B murinos en reposo son
particularmente difíciles de estimular con la mayoría de las formas
solubles de CD40L. Incluso con proteínas de fusión de
CD40L-CD8 murinas, es necesario reticular la
proteína con anticuerpos contra CD8 con el fin de lograr
proliferación máxima en cultivo [Klauss, 1999]. De acuerdo con
ello, los linfocitos B murinos en reposo se seleccionaron
negativamente con perlas inmunomagnéticas. Como se muestra en la
figura 5, la CD40L-SPD murina fue tan efectiva como
el anticuerpo anti-IgM en conducir a proliferar los
linfocitos B. Esto indica que CD40L-SPD puede imitar
las interacciones multivalentes que ocurren cuando una célula que
responde entra en contacto con células activadoras que llevan
CD40L.
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Ejemplo
6
CD40L es un estimulante potente para macrófagos
(revisado en (28)) y células dendríticas (40). De acuerdo con ello,
se añadieron las preparaciones de CD40L-SPD a
macrófagos derivados de monocitos y se usó la producción de
MIP-1\Box como una medida de estimulación. Como se
usa en la figura 6, tanto CDL40-SPD humana como
CDL40-SPD murina fueron capaces de estimular
macrófagos, mientras que el mutante
T147N-CD40L-SPD estuvo inactivo
según se esperaba.
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Estos ejemplos definen un nuevo procedimiento de
producir multímeros (es decir, muchos trímeros) de CD40L como una
proteína de fusión con SPD. También se prepararon y se expresaron
proteínas de fusión similares entre RANKL/TRANCE murina (SFTNF11) o
CD27L/CD70 murina (SFTNF7) unida a SPD murina (datos no mostrados).
Esto sugiere que virtualmente todos los miembros de la SFTNF
podrían producirse exitosamente como proteínas de fusión con SPD.
Además, también es probable que otras colectinas además de SPD
pudieran usarse en estas fusiones, dadas las homologías
estructurales fuertes entre las CDR de las colectinas y los dominios
extracelulares de los miembros de la SFTNF [Shapiro] que pueden
sustituirse por estos CRD. Dados los 17 miembros de SFTNF conocidos
y las 9 colectinas conocidas, son posibles al menos 153
combinaciones de proteínas de
fusión.
fusión.
Se seleccionó SPD inicialmente debido a que es
un homopolímero soluble. Otras colectinas, tales como proteína
tensioactiva A, tienen afinidades de unión fuertes con lípidos y
receptores celulares específicos. Aunque la retirada del CRD anula
mucha de esta unión, ello puede estar parcialmente mediado por la
secuencia de la región de cuello, que retiene las proteínas de
fusión. De acuerdo con ello, se esperaría que las colectinas
distintas de SPD pudieran conferir diferentes comportamientos de
unión celular y farmacocinéticos a una proteína de fusión. Por
ejemplo, se sabe que los macrófagos captan y degradan SPD completa
[Dong, 1998]. Si se usan proteínas de condensación distintas de
SPD, se podría alterar la disposición de la proteína de fusión in
vivo. Adicionalmente, se sabe que las metaloproteinasas
degradan la colectina, C1q, de tal forma que una condensación con
C1q puede alterar la degradación de la proteína de condensación. Por
ejemplo, debido a que CD40L activa macrófagos y otros linfocitos B
para producir metaloproteinasas, que podrían degradar potencialmente
la parte colagenosa de SPD y otras colectinas. Se esperaría que la
escisión del tallo colagenoso liberase trímeros individuales de
CD40L, que podrían difundirse a partir de la molécula parental
original, mucho más como una formulación de liberación lenta de un
fármaco. Además, la parte de membrana proximal de CD40L se ha
retenido en CD40L-SPD. Esta secuencia también
contiene secuencias de aminoácidos susceptibles a proteasas, que
pueden eliminarse por mutagénesis para retardar la escisión de CD40L
a partir de la proteína de fusión. Las mutaciones en tal(es)
sitio(s) de escisión de proteasa(s) retardarían tal
escisión y favorecerían la persistencia local del estímulo de
CD40L.
CD40L-SPD es una macromolécula
grande (> 1.000 kDa) y se esperaría que las otras proteínas de
fusión de SFTNF-colectina fueran grandes de manera
similar. Para SPD nativa, los agregados que forma espontáneamente
miden 100 nm en diámetro. Cuando se inyectan dentro de tejido, se
esperaría que este complejo largo permaneciera en el sitio de
inyección durante un periodo prolongado. La localización de la
proteína que contiene SFTNF se esperaría también que reduzca
cualquier toxicidad sistémica causada por la liberación de trímeros
individuales libres dentro de la circulación. Por ejemplo, se ha
relacionado CD40L soluble en sangre con la actividad de la
enfermedad en lupus y esta molécula más pequeña puede incluso puede
cruzar el glomérulo para causar daño a los túbulos renales [Kato y
Kipps, J. Clin. Invest. Nov. 1999]. Por otro lado, debido a que
CD40L induce la producción de quimiocinas que atraen células
inmunes [Kombluth], se esperaría que los linfocitos T, los
monocitos y las células dendríticas migren al sitio donde se inyectó
CD40L-SPD. Esto puede ser ventajoso si las
CD40L-SPD se usaron como un coadyuvante de vacuna.
En ratones, la CD40L soluble (sCD40LT) estimula producción de IgG1
pero no de linfocitos T citotóxicos (CTL) [Wong, 1999]. De forma
interesante, la misma proteína que se expresa a partir de un
plásmido inyectado estimula tanto una respuesta de anticuerpos
fuerte como una respuesta CTL fuerte [Gurunathan, 1998]. En el
último caso, se esperaría que el plásmido dé un suministro
localizado de CD40L, mientras que la proteína sCD40LT esté libre
para difundirse aparte. Se proporciona respaldo para el uso
localizado de CD40L en una formulación coadyuvante por un estudio
usando un plásmido que expresa CD40L de membrana de longitud total,
que fue muy efectivo en estimular tanto respuestas inmunes humorales
como respuestas inmunes CTL [Mendoza, 1997]. De forma similar, la
inyección de adenovirus que expresan CD40L de membrana tiene
potente actividad antitumoral en ratones [Kikuchi, 1999].
Consideraciones similares se pueden aplicar probablemente a otras
proteínas de fusión entre la SFTNF y las colectinas.
Finalmente, para las proteínas
inmunoestimuladoras, es particularmente importante que la proteína
no sea antigénica si se necesitan inyecciones repetidas. Por
ejemplo, la vacunación con TNF-\mu modificada por
la adición de secuencias de péptido cortas fue capaz de inducir la
producción de autoanticuerpos
anti-TNF-\mu modificadores de
enfermedades [Dalum, 1999]. Debido a que CD40L-SPD y
otras proteínas de fusión SFTNF-colectina están
formadas a partir de secuencias de proteínas endógenas (con la
posible excepción de la proteína peptídica en la articulación), la
producción de anticuerpos no podría limitar la efectividad de
inyecciones repetidas.
En conclusión, las fusiones entre miembros de la
SFTNF y colectinas ofrecen un medio novedoso de generar complejos
de proteínas grandes que pueden proporcionar estimulación localizada
en un sitio de inyección. Debido a la naturaleza multimérica del
armazón de colectina, tales proteínas de fusión pueden imitar la
superficie de ligando multivalente presentada por las formas de
membrana de miembros de SFTNF a células sensibles que llevan
SFTNFR. Además, limitando la toxicidad sistémica mientras que se
mantiene eficacia localizada, tales proteínas de fusión pueden
tener un papel como coadyuvantes de vacuna contra agentes
infecciosos y tumores.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Todas las colectinas se forman como multímeros
de subunidades triméricas, conteniendo cada una un dominio
colagenoso. El extremo C-terminal de cada colectina
contiene un CRD que une carbohidratos y otros ligandos. Debido a
las estrechas similitudes entre las estructuras de CRD conocidas y
los dominios extracelulares de miembros de la SFTNF, es probable
que el CRD de cualquier colectina pudiera reemplazarse con el
dominio extracelular de cualquier miembro de SFTNF en una manera
estructuralmente compatible.
<110> Kombluth, Richard S.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Formas multiméricas de CD40L y otros
miembros de la familia TNF
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Proteínas de fusión de
SFTNF-colectina
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 60/111.471
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
8-12-1998
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1552
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> 5'UTR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(31)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (88)..(799)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína D tensioactiva murina
madura que incluye la región de nodo, la parte colagenosa y el
cuello, pero excluyendo dominio de reconocimiento de carbohidrato
(CRD)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (801)..(1546)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región extracelular de ligando CD40
humano, incluyendo tallo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(88)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido señal a partir de proteína D
tensioactiva murina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(1444)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
proteína D tensioactiva murina (sin el CRD) fusionada a la parte
extracelular de CD40L humana.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Spriggs, Melanie K.
\hskip1cmArmitage, Richard J.
\hskip1cmStrocbine, L.
\hskip1cmClifford, K.N.
\hskip1cmMacduff, B.M.
\hskip1cmSato, T.A.
\hskip1cmMaliszewski, C.R.
\hskip1cmFanslow, William C.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Ligando CD40 humano recombinante
estimula proliferación de linfocitos B y secreción de
inmunoglobulina E.
\vskip0.400000\baselineskip
<303> J. Exp. Med.
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 176
\vskip0.400000\baselineskip
<305> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 1554-1500
\vskip0.400000\baselineskip
<307> 1992
\vskip0.400000\baselineskip
<313> 801 A 1600
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Motwani, M.
\hskip1cmWhite, R.A.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Proteína D tensioactiva de ratón.
Clonación del ADNc, caracterización y localización del gen en el
cromosoma 14.
\vskip0.400000\baselineskip
<303> J. Immunol.
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 155
\vskip0.400000\baselineskip
<305> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 5671-5677
\vskip0.400000\baselineskip
<307> 1995
\vskip0.400000\baselineskip
<313> 32 A 800
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 471
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
proteína D murina tensioactiva (sin el CRD) fusionada con la parte
extracelular de CD40L
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1574
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> 5'UTR
\vskip0.400000\baselineskip
<220> (7)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 5'UTR tomada de secuencia de rata
para la proteína tensioactiva D
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(88)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido señal de proteína D
tensioactiva murina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(1534)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(800)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína D tensioactiva murina
madura que incluye la región de nodo, la parte colagenosa y el
cuello, pero excluyendo dominio de reconocimiento de carbohidrato
(CRD)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (801)..(1534)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región extracelular RANK/TRANCE
murina, incluyendo tallo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Motwani, M.
\hskip1cmWhite, R.A.
\hskip1cmGuo, N.
\hskip1cmDowler, L.L.
\hskip1cmTauber, A.I.
\hskip1cmMotwani, M.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Proteína D tensioactiva de ratón.
Clonación del ADNc, caracterización y localización del gen en el
cromosoma 14.
\vskip0.400000\baselineskip
<303> J. Immunol.
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 155
\vskip0.400000\baselineskip
<305> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 5671-5677
\vskip0.400000\baselineskip
<307> 1995
\vskip0.400000\baselineskip
<313> 32 A 800
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Anderson, D.M.
\hskip1cmMaraskovsky, E.
\hskip1cmBillingsley, W.L.
\hskip1cmDougall, W.C.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Un homólogo del receptor TNF y su
ligando potencian el crecimiento de linfocitos T y la función
celular dendrítica.
\vskip0.400000\baselineskip
<303> Nature
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 390
\vskip0.400000\baselineskip
<305> 6656
\vskip0.400000\baselineskip
<306> 175-179
\vskip0.400000\baselineskip
<307> 1997
\vskip0.400000\baselineskip
<313> 801 A 1534
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 501
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\hskip0,8cm
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<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1477
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
proteína D tensioactiva murina (excepto CRD) fusionada al dominio
extracelular de ligando CD40 murino.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> 5'UTR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 5'UTR de proteína D tensioactiva de
rata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_péptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(88)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido señal de proteína D
tensioactiva murina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(1441)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_recomb
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (88)..(799)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Proteína D tensioactiva murina
madura que incluye región de nodo, parte colagenosa y cuello, pero
que excluye dominio de reconocimiento de carbohidratos (CRD)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (800)..(1441)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región extracelular de ligando CD40
murino, incluyendo tallo
\vskip1.000000\baselineskip
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<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Motwani, M.
\hskip1cmWhite, R.A.
\hskip1cmGuo, N.
\hskip1cmDowler, L.L.
\hskip1cmTauber, A.I.
\hskip1cmMotwani, M.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Proteína D tensioactiva de ratón.
Clonación del ADNc, caracterización y localización del gen en el
cromosoma 14.
\vskip0.400000\baselineskip
<303> J. Immunol.
\vskip0.400000\baselineskip
<304> 155
\vskip0.400000\baselineskip
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<306> 5671-5677
\vskip0.400000\baselineskip
<307> 1995
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<313> 32 A 800
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<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<301> Armitage, R.
\hskip1cmFanslow, W.
\hskip1cmSato, T.A.
\hskip1cmClifflord, K.N.
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Caracterización molecular y
biológica de un ligando murino para CD40
\vskip0.400000\baselineskip
<303> Nature
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<304> 357
\vskip0.400000\baselineskip
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<307> 1992
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<313> 801 A 1441
\newpage
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<400> 5
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 6
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<211> 470
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
proteína D tensioactiva murina (excepto CRD) fusionada al dominio
extracelular de ligando CD40 murino.
\newpage
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<400> 6
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\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
Claims (4)
1. Una proteína de fusión
SFTNF-SPD multimérica que comprende:
- \quad
- una pluralidad de trímeros polipeptídicos,
- i)
- un primer trímero constituido por hebras peptídicas de dominios extracelulares de un miembro de la superfamilia de TNF (SFTNF) de ligandos, siendo el resto de SFTNF uno seleccionado del grupo constituido por ligandos LTA, TNF, LTB y SFTNF4 a SFTNF18 como en tabla I; y
- ii)
- una segunda hebra de trímero de una molécula de proteína D tensioactiva pulmonar (SPD)
comprendiendo cada primer trímero
unido con dicha segunda hebra de trímero polipeptídica de molécula
SPD la región del nodo, del cuerpo y del cuello, estando
sustituidos dominios de reconocimiento de carbohidratos nativos
(CRD) de las moléculas SPD por dicha hebra de ligando, y dichas
hebras de SPD están unidas covalentemente en paralelo unas a otras,
formando así una proteína de fusión multimérica que comprende una
pluralidad de hebras polipeptídicas híbridas triméricas que
irradian de un nodo de centro unido covalentemente de la molécula,
teniendo el extremo libre de cada hebra trimérica que irradia unido
dicho resto de
SFTNF.
2. La proteína de fusión multimérica según la
reivindicación 1, en la que el resto de SFTNF es uno seleccionado
del grupo constituido por ligandos de CD40L humana o murina,
RANK/TRANCE murina (SFTNF11) o CD17L/CD70 (SFTNF7), y en la que SPD
es murino.
3. Un procedimiento para preparar un polipéptido
de fusión multimérico CD40L-SPD, que comprende las
etapas de:
iniciar un cultivo, en un medio nutriente, de
células huésped procariotas o eucariotas transformadas con una
molécula de ADN recombinante que incluye un vector de expresión,
apropiado para dichas células, unido operativamente a un segmento
de ADN exógeno que define un gen estructural para ligando
CD40L-SPD, teniendo dicho gen estructural una
secuencia de bases nucleotídicas de SEC ID N.º: 1 desde la base 32 a
la base 1444; y
mantener dicho cultivo durante un periodo de
tiempo suficiente para que dichas células expresen dicha molécula
multimérica.
4. Un procedimiento para preparar una proteína
de fusión de ligando SFTFN-SPD, que comprende:
preparar un primer segmento de ADN que codifique
una hebra de una parte extracelular expuesta de SFTNF;
preparar un segundo segmento de ADN que
codifique una hebra polipeptídica de SPD, en la que dicho dominio
CRD de SPD de la hebra se ha retirado;
unir dichos ADN primero y segundo en fase de
lectura apropiada, creando así una construcción de ADN de
SFTNF-SPD; insertando dicha construcción en un
sistema vector de expresión;
introducir dicho sistema vector de expresión
dentro de una célula apropiada en cultivo en condiciones
adecuadas;
recoger y purificar medio gastado de dicho
cultivo; y
someter a ensayo para determinar presencia de
proteína de fusión SFTNF-SPD multimérica.
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