ES2329467T3 - Utilizacion de heterogublina como factor de crecimiento de celulas epiteliales. - Google Patents

Abstract

Utilización de un ácido nucleico que codifica un ligando activador de HER2, HER3 y/o HER4, el cual es un polipéptido de heregulina (HRG) o un fragmento del mismo capaz de unirse al receptor HER2, HER3 y/o HER4 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de dificultades respiratorias, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfisema, enfermedad pulmonar del neonato, lesiones agudas del pulmón, pneumonitis debida a aspiración o radicación, ahogo, fibrosis quística y otras enfermedades traumáticas de las células epiteliales, incluyendo las lesiones asociadas con heridas quirúrgicas y las resecciones, las lesiones, las úlceras y rasgado de tejidos.

Description

Utilización de heterogublina como factor de crecimiento de células epiteliales.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención hace referencia a la utilización de ligandos de HER2, HER3 y/o HER4, en particular a polipéptidos de heregulina como factores de crecimiento de células epiteliales.

Descripción de los antecedentes y de materias relacionadas

La familia HER (ErbB) pertenece a la superfamilia de subclase I de receptores tirosina quinasa y consiste en tres receptores distintos, HER2, HER3 y HER4. Uno de los ligandos de esta familia ErbB es la proteína heregulina (HRG), una proteína que contiene un multidominio con al menos 15 isoformas distintas.

La transducción de señales que regulan el crecimiento y la diferenciación celular se regula en parte por la fosforilación de varias proteínas celulares, siendo las proteínas tirosina quinasas las enzimas que catalizan este proceso. Se cree que los receptores protein tirosina quinasa dirigen directamente el crecimiento celular mediante la fosforilación de tirosinas estimulada por ligandos de sustratos intracelulares. En los receptores protein tirosina quinasa del factor de crecimiento de la subfamilia de clase I se incluye el receptor del factor de crecimiento epidérmico de 170 KDa (EGFR), que está codificado por el gen erbB1. El erbB1 está implicado causalmente en procesos malignos en humanos. Por ello, se ha observado un incremento de la expresión de este gen en los carcinomas más agresivos de mama, de vejiga, de pulmón y de estómago.

El segundo miembro de la subfamilia de clase I, p^{158neu} se identificó originalmente como el producto del gen transformante de neuroblastomas de ratas tratadas químicamente. El gen neu (también denominado erbB2 y HER2) codifica un receptor protein quinasa de 185 KDa. La amplificación y la sobrexpresión del gen HER2 humano se correlaciona con un pronóstico peor tanto en el cáncer de mama como en el de ovario (Slamon y col., Science 235:177-182 (1987); y Slamon y col., Science 244:707-712 (1989). La sobreexpresión de HER2 se ha correlacionado con otros carcinomas incluyendo los carcinomas de estómago, endometrio, glándula salivar, pulmón, riñón, colon y vejiga. Según ello, Slamon y col., en la patente americana 4.968.603 se describen y reivindican los ensayos diagnósticos para la determinación de la amplificación o la expresión del gen HER2 en células tumorales. Slamon y colaboradores descubrieron que la presencia de múltiples copias génicas del oncogene HER2 en las células tumorales era una indicación de que la enfermedad probablemente se propaga más allá del foco tumoral primario, con lo que, en dicho caso, la enfermedad puede requerir un tratamiento más agresivo que el indicado por otros factores diagnósticos. Slamon y colaboradores concluyeron que el análisis de la amplificación del gen HER2, junto con la determinación del estado del nódulo linfático, proporciona una mejor utilidad pronóstica.

También se ha descrito otro gen relacionado, denominado erbB3 o HER3. Véase la patente americana 5.183.884; Kraus y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 86:9193-9197 (1989); la patente europea EP 444.961A1; y Kraus y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2900-2904 (1993). Kraus y col., (1989) descubrieron que los niveles acentuadamente elevados del mRNA de erbB3, presentes en ciertas líneas celulares de tumores mamarios humanos, eran indicadores de que el erbB3, al igual que el erbB1 y el erbB2 podían desempeñar una función en los procesos malignos en el hombre. También, Kraus y col., (1993) mostraron que la activación dependiente de EGF del dominio catalítico de ErbB3 de un receptor quimérico EGFR/ErbB3 daba como resultado una respuesta proliferativa en las células NIH-3T3 transfectadas. Actualmente se piensa que es el resultado del ErbB1 o ErbB2 endógenos sobre NIH3T3. Además, estas investigaciones demostraron que algunas líneas celulares de tumores mamarios humanos presentan un aumento de la fosforilación de tirosina de ErbB3 en el estado de equilibrio, lo que indica que este receptor puede desempeñar una función en los procesos malignos en el hombre. La función del erbB3 en el cáncer también ha sido explorada por otros investigadores, hallándose sobreexpresado en el cáncer de mama (Lemoine y col., Br. J Cancer 66:1116-1121 (1992)), cáncer gastrointestinal (Poller y col., J. Pathol. 168:275-280 (1992), Rajkumer y col., J. Pathol. 170:271-278 (1993), y Sanidas y col., Int. J Cancer 54:935-940 (1993)) y en cánceres de páncreas (Lemoine y coll., J. Pathol. 168:269-273 (1992) y Fries y col., Clinical Cancer Research 1:1413-1420 (1995)).

La subfamilia de clase I de los receptores proteína tirosina quinasa del factor de crecimiento ha sido ampliada posteriormente para incluir al receptor HER4/Erb4. Véase la patente europea 599.274; Plowman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1746-1750 (1993); y Plowman y col., Nature 366:473-475 (1993). Plowman y col., hallaron que el aumento de la expresión de HER4 se correlacionaba estrechamente con ciertos carcinomas de origen epitelial, incluyendo los adenocarcinomas de mama. Los procedimientos diagnósticos para la detección de las condiciones neoplásicas en el hombre (especialmente los cánceres de mama), que evalúan la expresión de HER4 se describen en la patente europea 599.274.

La búsqueda del activador del oncogen HER2 ha conducido al descubrimiento de una familia de polipéptidos de heregulina. Estas proteínas parecen ser el resultado del ayuste alternativo de un solo gen que se ha localizado mediante mapeo en el brazo corto del cromosoma 8 humano por Orr-Urtreger y col., Proc Natl Acad Sci. USA 90:1867-1871 (1993). Véase también Lee y Wood, Genomics, 16:790-791 (1993).

Holmes y col., aislaron y clonaron una familia de activadores polipeptídicos para el receptor HER2 que denominaron heregulina-\alpha (HRG-\alpha), heregulina-\beta1 (HRG-\beta1), heregulina-\beta2 (HRG-\beta2), de tipo-heregulina-\beta2 (tipo-HRG-\beta2) y heregulina-\beta3 (HRG-\beta3). Véase Holmes y col., Science 256:1205-1210 (1992); patente internacional WO 92/20798; y patente americana U.S. 5.367.060. El polipéptido de 45 Kda, HRG-\alpha, se purificó a partir del medio condicionado de la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231. Estos investigadores demostraron la capacidad de los polipéptidos de heregulina purificados para activar la fosforilación de tirosinas del receptor HER2 en células de tumor mamario MCF7. Además, se demostró la actividad mitogénica de los polipéptidos de heregulina sobre las células SK-BR-3 (que expresan niveles elevados del receptor HER2). Al igual que otros factores de crecimiento que pertenecen a la familia EGF, los polipéptidos HRG solubles parecen derivar de un precursor unido a membrana (denominado pro-HRG) que se procesa proteolíticamente para liberar la forma soluble de 45 KDa. Estos pro-HRGs carecen de un péptido señal N-terminal.

Mientras que las heregulinas son idénticas en los primeros 213 residuos aminoacídicos, se clasifican en dos tipos principales, \alpha y \beta, basándose en dos dominios similares al EGF variantes que difieren en sus porciones C-terminales. Sin embargo, estos dominios similares al EGF son idénticos en la región que contiene los seis residuos de cisteína. Según una comparación de secuencia aminoacídica, Holmes y col., hallaron que entre la primera y la sexta cisteína en el dominio de tipo-EGF, las HRGs eran similares en un 45% al factor tipo-EGF de unión a la heparina (HB-EGF), idénticos en un 35% a la amfiregulina (AR), idénticos en un 32% al TGF-\alpha y en un 27% al EGF.

El factor de diferenciación neu de 44KDa (NDF), el equivalente de rata al humano HRG, fue el primero que se describió por Peles y col., Cell, 69:205-216 (1992); y Wen y col., Cell, 69:559-572 (1992). Al igual que los polipéptidos HRG, el NDF tiene un dominio homólogo con la inmunoglobulina (1G) seguido por un dominio de tipo-EGF y carece de un péptido señal N-terminal. Wen y col., J Mol. Cell Biol., 14(3):1909-1919 (1994) llevaron a cabo un "clonaje exhaustivo" para ampliar la familia de los NDFs. Este trabajo demostró seis pro-NDFs fibroblásticos distintos. Adoptando la nomenclatura de Holmes y col., los NDFs se clasificaron como polipéptidos \alpha o \beta según la secuencia de los dominios de tipo-EGF. Las isoformas 1 a 4 se caracterizan por la longitud variable del fragmento de membrana (entre el dominio de tipo-EGF y el dominio transmembrana). También, se describen las isoformas a, b y c que tienen dominios citoplasmáticos de longitud variable. Estos investigadores concluyen que las distintas isoformas de NDF se generan mediante ayuste alternativo y realizan funciones específicas de tejido distintas. Véase también la patente europea 505.148; la patente internacional WO 93/22424; y la patente internacional 94/28133 referentes
al NDF.

Falls y col., Cell, 72:801-815 (1993) describen otro miembro de la familia de heregulinas que denominaron polipéptidos con actividad inductora del receptor de acetil-colina (ARIA). El polipéptido ARIA del pollo estimula la síntesis de los receptores de acetilcolina del músculo. Véase la patente internacional WO 94/08007. La ARIA es una heregulina de tipo \beta que carece de la región espaciadora entera rica en sitios de glicosilación entre el dominio de tipo-Ig y el dominio de tipo-EGF de la HRG\alpha y la HRG\beta1-\beta3.

Marchionni y col., Nature, 362:313-318 (1993) identificaron varias proteínas bovinas que denominaron factores de crecimiento gliales (GGFs). Estos GGFs comparten el dominio de tipo-Ig y el dominio de tipo-EGF con las otras proteínas de heregulina descritas anteriormente, pero también un dominio kringle. Los GGFs, generalmente, no tienen la región espaciadora glicosilada de forma completa entre el dominio de tipo-Ig y el dominio de tipo-EGF. Únicamente uno de los GGFs, GGFII, posee un péptido señal N-terminal. Véase también la patente internacional WO 94/00140; la patente internacional WO 94/04560; la patente internacional WO 94/26298; y la WO 95/32724 que hacen referencia a los GGFs y sus utilizaciones.

Ho y col., J Biol Chem 270(4):14523-14532 (1995) describen otro miembro de la familia de heregulinas denominado factor derivado de las neuronas motoras y sensoriales (SMDF). Esta proteína tiene un dominio de tipo-EGF característico de todos los polipéptidos de heregulina, pero un dominio N-terminal distinto. La diferencia estructural principal entre el SMDF y los otros polipéptidos de heregulina es la ausencia en el SMDF del dominio de tipo-Ig y de la región espaciadora "glico" característica de los otros polipéptidos de heregulina. Otra característica del SMDF es la presencia de dos regiones de aminoácidos hidrofóbicos próximas al extremo N-terminal.

Aunque los polipéptidos de heregulina se identificaron en primer lugar según su capacidad para activar el receptor HER2 (véase Holmes y col., supra), se descubrió que ciertas células de ovario que expresaban neu y fibroblastos transfectados con neu no se unían ni interaccionaban con el NDF y tampoco respondían al NDF para desencadenar la fosforilación de tirosinas (Peles y col., EMBO J. 12:961-971 (1993)). Ello indicaba que otro componente celular era necesario para otorgar una respuesta completa a heregulina. Carraway y col., demostraron a continuación que I^{125}-rHRG\beta1_{177-244} se unía a fibroblastos NIH-3T3 transfectados de forma estable con el erbB3 bobino, pero no así con las células parentales no-transfectadas. Según ello, concluyeron que el ErbB3 es un receptor de HRG que facilita la fosforilación de residuos tirosina intrínsecos así como también la fosforilación del receptor ErbB2 en las células que expresan ambos receptores. Carraway y col., J Biol Chem 269(19):1403-1406 (1994). Silwkoski y col., J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665 (1994) hallaron que las células transfectadas sólo con HER3 mostraban baja afinidad por la heregulina, mientras que las células transfectadas con el HER2 y el HER3 mostraban mayor afinidad.

Esta observación se correlaciona con el "receptor cross-talking" descrito anteriormente por Kokai y col., Cell 58:287-292 (1989); Stern y col., EMBO J 7:995-1001 (1988); y King y col., 4:13 (1989). Estos investigadores hallaron que la unión de EGF con el EGFR resultaba en la activación del dominio quinasa de EGFR y en la fosforilación cruzada de p185^{HER2}. Se piensa que ello es el resultado de la heterodimerización del receptor inducida por ligando y la fosforilación cruzada concomitante de los receptores en el heterodímero (Wada y col., Cell 61:1339-1347 (1990)).

Plowman y sus colegas estudiaron de forma similar la activación de p185^{HER4}/p185^{HER2}. Expresaron el p185^{HER2} solo, el p185^{HER4} solo, o los dos receptores juntos en linfocitos T humanos y demostraron que la heregulina es capaz de estimular la fosforilación de tirosinas del p185^{HER4}, pero que únicamente era capaz de estimular la fosforilación de p185^{HER2} en las células que expresaban ambos receptores, Plowman y col., Nature 336:473-475 (1993).

La función biológica de la heregulina ha sido investigada por diversos grupos. Por ejemplo, Falls y col., (citados anteriormente) hallaron que ARIA desempeña una función en la diferenciación de miotubos, afectando a la síntesis y la concentración de receptores de neurotransmisores en las células del músculo postsináptico de las neuronas motoras. Corfas y Fischbach demostraron que ARIA también aumenta el número de canales de sodio en el músculo del pollo. J. Neuroscience, 13 (5):2118-2125 (1993). También se demostró que el GGFII es mitogénico para los mioblastos humanos quiescentes subconfluentes y que la diferenciación de mioblastos humanos clonales en presencia continua de GGFII resultaba en un mayor número de miotubos al cabo de 6 días de diferenciación (Sklar y col., J Cell Biochem., Abst. W462, 18D, 540 (1994). Véase también, la patente internacional WO 94/26298, publicada el 24 de noviembre de 1994.

Holmes y col., supra, hallaron que la HRG ejercía un efecto mitogénico sobre las líneas celulares mamarias (como SK-BR-3 y MCF-7). También se describió actividad mitogénica de los GGFS sobre las células de Schwann. Véase, p.ej., Brockes y col., J. Biol. Chem. 255(18):8374-8377 (1980); Lemke y Brockes, J. Neurosci. 4:75-83 (1984, Lemke y Brockes, J. Neurosci. 4:75-83 (1986); Brockes, J. Methods in Enzym., 147:217-225 (1987) y Marchionni y col., supra. Las células de Schwann constituyen células gliales importantes que proporcionan las membranas de mielina alrededor de los axones de las neuronas, formando así las fibras nerviosas. En consecuencia, es evidente que las células de Schwann desempeñan un papel importante en el desarrollo, función y regeneración de los nervios periféricos, cuyas implicaciones desde un punto de vista terapéutico han sido indicadas por Levi y col., J. Neuroscience 14(3):1309-1319 (1994). Levi y col. Discuten el potencial para la construcción de una prótesis celular que comprenda células de Schwann humanas que podría transplantarse en áreas lesionadas de la médula espinal. Los procedimientos de cultivo de las células de Schwann ex vivo se han descrito en, por ejemplo, la patente internacional WO 94/00140 y Li y col., J. Neuroscience 16(6):2012-2019 (1996).

Pinkas-Kramarski y col., hallaron que el NFD parece expresarse en las neuronas y células glías en el cerebro embrionairo y de rata adulta y en cultivos primarios de células de cerebro de rata. Por ello, sugieren que pueda actuar como un factor de supervivencia y maduración astrocitos (Pinkas-Kramarski y col., PNAS, USA 91:9387-9391 (1994)). Meyer y Brichmeier, PNAS, USA 91: 1064-1068 (1994) analizaron la expresión de la heregulina durante la embriogénesis murina y en el animal perinatal utilizando la hibridación in situ y los experimentos de protección a la RNasa. Véase también Meyer y col., Development 124 (18):3575-3586 (1997). Estos autores concluyen que, basándose en la expresión de esta molécula, la heregulina desempeña un papel in vivo como un factor mesenquimal y neuronal. De modo similar, Danilenko y col., Abstract 3101, FASEB 8(4-5):A535 (1994); Danilenko y col., Journal of Clinical Investigation 95(2):842-851 (1995), hallaron que la interacción del NDF y el receptor HER2 era importante para dirigir la migración y la diferenciación epidérmica durante la reparación de la herida.

Ram y col., Journal of Cellular Physiology 163:589-596 (1995) evaluaron la actividad mitogénica de NDF en la línea de células epiteliales de mama humana inmortalizada MCF-10A. Danilenko y col., J. Clin Invest 95:842-851 (1995) investigaron si el NDF influenciaría la migración epidérmica en un modelo in vivo de reparación de la herida de grosor-profundidad parcial producida por excisión. Estos autores no hallaron diferencias estadísticas significativas en los queratinocitos proliferantes basales y superbasales en las heridas controles respecto a las heridas tratadas con rhNDF-\alpha_{2}. Marikovsky y col., Oncogene 10:1403-1411 (1995), estudiaron las respuestas proliferativas de una línea celular contínua de queratinocitos BALBA/MK aneuploide y evaluaron los efectos de las isoformas \alpha y \beta del NDF sobre los queratinocitos epidérmicos.

La relación entre la estructura y la función de proteínas nuevas puede investigarse utilizando cualquier variedad de técnicas de análisis mutacional disponible. En los ejemplos de dichas técnicas se incluye la mutagénesis por rastreo de alaninas y la expresión en fagémidos. El rastreo de alaninas puede utilizarse para identificar los residuos activos (es decir, residuos que tengan un efecto significativo sobre la función de la proteína) en una proteína o dominio proteico. Por ejemplo, Cunningham y Wells utilizaron el rastreo de alaninas para identificar los residuos en la hormona de crecimiento humana que eran importantes para la unión con su receptor. Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085 (1989). En el rastreo de alaninas, un gen que codifica la proteína o un dominio proteico a escanear se inserta en un vector de expresión y se lleva a cabo la mutagénesis para generar una serie de vectores que codifican las proteínas o dominios en los que sus residuos se convierten secuencialmente en alanina. Las proteínas el dominio codificados o se expresan a partir de estos vectores y se analizan las actividades de las variantes de sustitución con alanina para identificar aquellos que presentan una actividad alterada. Una alteración de la actividad es indicativa de que el residuo en la posición sustituida por alanina era un residuo activo.

La expresión de fagémidos se desarrolló para permitir el rastreo de un gran número de polipéptidos variantes para una actividad de unión particular. Smith y Parmely demostraron que pueden "expresarse" de forma eficiente péptidos foráneos en la superficie de fagos filamentosos insertando fragmentos génicos cortos en el gen III del fago fd. Smith, Science 228:1315-1317 (1985); Parmley y Smith, Gene 73:305-318 (1985). Del gen de la proteína de la cubierta III existen aproximadamente 5 copias en uno de los extremos de la partícula fágica. El fago modificado se denominó "fago de fusión" porque expresa péptidos foráneos fusionados con el gen de la proteína de la cubierta III. Puesto que cada partícula de fago fusionado expresa aproximadamente cinco copias de la proteína de fusión, este modo de expresión en fagos se denominó "expresión polivalente".

Scott y col., y Cwirla y col., mostraron que las librerías de fagos de fusión podían rastrearse mediante selección por afinidad secuencial como el "panning". Scott y col., Science 249:386-390 (1990); Cwirla y col., PNAS USA 87:6378-6382 (1990). Sin embargo, los primeros esfuerzos para seleccionar los fagos de fusión de alta afinidad no tuvieron éxito, presuntamente debido a la polivalencia de las partículas fágicas. Este problema se solventó con el desarrollo de un sistema de expresión en fagos "monovalentes", en el que la proteína de fusión se expresa a un nivel bajo a partir de un fagémido y un fago auxiliar proporciona de la proteína la cubierta de tipo salvaje en exceso. Bass y col., Proteins 8:309-314 (1990); Lowman y col., Biochem. 30:10832-10838 (1991). La expresión en fagos monovalentes se puede utilizar para generar y rastrear un gran número de polipéptidos variantes y así aislar los que se unan con una elevada afinidad a una diana de interés.

En los Estados Unidos de América nacen cada año aproximadamente 50.000 niños con un peso al nacer inferior a 1,5 Kg. Y alrededor de dos tercios de estos niños con muy bajo peso al nacer presentan evidencias de inmadurez pulmonar, que se manifiesta por una dificultada respiratoria poco tiempo después del nacimiento. La mayoría de estos niños requieren ventilación mecánica. El síndrome de la dificultad respiratoria, causado por la producción insuficiente de tensoactivo pulmonar, así como la inmadurez estructural del pulmón, son responsables de las dificultades respiratorias observadas en estos neonatos nacidos prematuramente. Para una transferencia de oxígeno eficiente desde la interfaz aire-líquido del pulmón a la circulación sistémica, es necesario que los alvéolos estén bien desarrollados. Las proteínas tensoactivas son críticas para reducir la tensión superficial alveolar a un volumen pulmonar bajo y para prevenir el colapso alveolar.

Por todo ello, continúa existiendo la necesidad de hallar un procedimiento para el tratamiento del síndrome de la dificultad respiratoria y para otras enfermedades asociadas con el desarrollo inmaduro del pulmón y con la producción de tensoactivos pulmonares.

Resumen de la invención

En general, un objeto de la presente invención es proporcionar medios de inducción del crecimiento y desarrollo de células epiteliales con el propósito de promover la reparación y la curación de la lesión o herida tisular.

Según ello, uno objeto de la presente invención es proporcionar un medio de tratamiento del síndrome de la dificultad respiratoria en pacientes, principalmente en pacientes humanos, que necesiten de dicho tratamiento. Otro objetivo es proporcionar un medio de inducción del crecimiento y desarrollo de las células epiteliales del pulmón. Otro objetivo es proporcionar un medio para aumentar la producción de la proteína A tensoactiva pulmonar en el pulmón de personas con una transferencia de oxígeno defectuosa en los alvéolos. La presente invención es útil en el tratamiento de niños/neonatos con dificultad respiratoria, así como también en jóvenes y adultos con una función pulmonar pobre debido a una lesión o herida pulmonar.

En un aspecto de esta invención, se ha descubierto ahora que estos objetivos y el objetivo más amplio de tratamiento de las condiciones asociadas con la lesión o herida de células epiteliales se alcanza mediante administración a un paciente que lo requiera de una cantidad efectiva de un ligando heregulina, preferentemente un polipéptido o un fragmento de ésta. Estos polipéptidos de heregulina (HRG), incluyen la HRG-\alpha, la HRG-\beta1, la HRG-\beta2, la HRG-\beta3 y otros polipéptidos HRG que reaccionen de forma cruzada con los anticuerpos dirigidos contra estos miembros de la familia y/o que sean esencialmente homólogos, tal como se define más abajo, incluyendo las variantes de HRG como sus fragmentos N-terminal y C-terminal. Una HRG preferida es el ligando descrito en la Fig. 1A-1D, denominado HRG-\alpha. Otras HRGs preferidas son los ligandos descritos en la Fig. 2A-2E, denominados HRG-\beta1; los descritos en la Fig. 3A-3E denominados HRG-\beta2 y los descritos en la Fig. 4A-4C, denominados HRG-\beta3. Del mismo modo, la invención proporciona medios como se define en las reivindicaciones.

En general, la invención proporciona medios de regeneración y/o reparación de la lesión de células epiteliales estimulando el crecimiento y la proliferación de dichas células epiteliales, en particular las células epiteliales ductales y ciliadas. Los tipos de lesiones y sus causas son muy variadas, por ejemplo, como se define en las reivindicaciones, la lesión causada por una incisión o resección quirúrgica, la inhalación o aspiración química de productos químicos o humo, la ulceración química o bioquímica, la lesión celular causada por la infección vírica o bacteriana, etc. Las células epiteliales que pueden estar afectadas por los medios de la invención incluyen cualquier célula epitelial que exprese HER2, HER3 y/o HER4; las células en cuestión se localizan, por ejemplo, en el pulmón, la mucosa gástrica, el endometrio, los oviductos, las glándulas mamarias, el páncreas, las glándulas salivares, etc. El medio de la invención estimula el crecimiento y la proliferación de células epiteliales, la reparación y el restablecimiento de las barreras celulares de los órganos, permitiendo que los tejidos afectados desarrollen sus funciones fisiológicas normales más rápidamente. Por ejemplo, la lesión en las células epiteliales del pulmón causada por inhalación de humo genera un enfisema. El tratamiento de las células pulmonares con el medicamento preparado de acuerdo con la invención regenera la capa-barrera de células epiteliales pulmonares, mejora la oxigenación y acelera el desarrollo de una barrera contra la infección. De manera similar, la lesión celular causada por la aspiración de ácido gástrico puede tratarse con el medicamento preparado de acuerdo con la invención para facilitar la regeneración de las células epiteliales.

Descripcion resumida de las figuras

Figura 1A-1D muestra la secuencia aminoacídica deducida (SEC ID Nº:1) de la secuencia del cDNA (SEC ID Nº:2) contenida en un clon obtenido de acuerdo con la patente americana U.S. 5.367.060. La metionina iniciadora (Met) de la HRG-\alpha se halla en la posición 45.

Figura 2A-2E muestra la secuencia aminoacídica deducida (SEC ID Nº:3) y la secuencia del cDNA (SEC ID Nº:4) de una secuencia codificante potencial de un clon obtenido de acuerdo con la patente americana U.S. 5.367.060 para HRG-\beta1. La Met de iniciación es la Met31.

Figura 3A-3E muestra la secuencia aminoacídica deducida (SEC ID Nº:5) y la secuencia del cDNA (SEC ID Nº:6) de una secuencia nucleotídica de un clon obtenido de acuerdo con la patente americana U.S. 5.367.060 para HRG-\beta2.

Figura 4A-4C muestra la secuencia aminoacídica deducida (SEC ID Nº:7) y la secuencia del cDNA (SEC ID Nº:8) de un clon obtenido de acuerdo con la patente americana U.S. 5.367.060 para HRG-\beta3.

Figura 5A-4D muestra la secuencia aminoacídica deducida (SEC ID Nº:9) y la secuencia del cDNA (SEC ID Nº:10) de un clon obtenido de acuerdo con la patente americana U.S. 5.367.060 para la proteína de tipo-HRG-\beta2.

Figura 6A-6C muestra una comparación de homologías aminoacídicas de varias heregulinas conocidas, \alpha, \beta1, \beta2, tipo-\beta2 y \beta3 en orden descendente y muestra las inserciones, deleciones y sustituciones aminoacídicas que caracterizan estas formas de HRG (SEC ID Nº: 1, 3, 5, 9 y 7).

Figura 7A-7C muestra la secuencia aminoacídica deducida (SEC ID Nº:11) y la secuencia del cDNA (SEC ID Nº:12) de HRG-\gamma obtenida tal como se describe en la patente americana U.S. 08/891.845. La región hidrofóbica está subrayada. El dominio de tipo-EGF está sombreado, los residuos cisteína en el dominio de tipo-EGF están dentro de un círculo. Los sitios de N-glicosilación están marcados sobre la secuencia nucleotídica con un ().

Figura 8 muestra la secuencia del cDNA (SEC ID Nº.13) y la secuencia aminoacídica (SEC ID Nº:14) de SMDF, obtenidas tal como se describe en la patente americana 08/339.517. Un dominio de tipo-EGF y los dominios apolares y no cargados (es decir, "apolar I" que consisten en los residuos aproximadamente 48-62 y el "apolar II" que consiste en los residuos aproximadamente 76-100) están subrayados. Las cisteínas en el dominio de tipo-EGF y el grupo de cisteínas del único dominio N-terminal ("NTD-grupo cys" están encuadradas. El codón de parada está indicado por la letra "O".

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Los ligandos HRG, en particular los polipéptidos y anticuerpos agonistas de lo mismo, tienen afinidad por y estimulan la autofosforilación de los receptores HER2, HER3 y/o HER4 o combinaciones de éstos. Se incluyen dentro de la definición de ligandos HRG, además de HRG-\alpha, HRG-\beta1, HRG-\beta2, HRG-\beta3 y de tipo-HRG-\beta2, otros polipéptidos de unión al receptor HER2, HER3 y/o HER4 con una identidad de secuencia aminoacídica importante con HRG-\alpha o HRG-\beta1. Dichos polipéptidos adicionales se hallan dentro de la definición de HRG como una familia de ligandos polipeptídicos que se unen a los receptores HER2, HER3 y/o HER4.

Los polipéptidos de heregulina se unen con diversa afinidad a los receptores HER2, HER3 y/o HER4. En general, con los receptores HER3 y HER4 se unen con elevada afinidad. También se sabe que la heterodimerización de HER2 con HER3 y HER2 con HER4 tiene lugar con la consiguiente fosforilación cruzada del receptor, tal como se describió más arriba. En la presente invención, el crecimiento y/o la proliferación de las células epiteliales se induce cuando una proteína heregulina interactúa y se une con una molécula de receptor individual o un dímero, induciéndose de este modo la fosforilación del receptor. La unión y la activación de HER2, HER3, HER4 o combinaciones de lo mismo, incluye la activación de cualquier forma del receptor necesaria para la activación y función biológica de éste, incluyendo las formas monoméricas y diméricas del receptor. Las formas diméricas del receptor pueden ser referidas más adelante como HER2/HER3, HER2/HER4 y HER3/HER4.

I. Definiciones

En general, tanto en la descripción como en los ejemplos y reivindicaciones se mantendrá la definición indicada para los términos y frases siguientes.

Ligando "heregulina" (HRG) se define aquí como cualquier ligando aislado, preferentemente una secuencia polipeptídica que posea una propiedad biológica de un polipéptido HRG natural. Los ligandos abarcados dentro del ámbito de la presente invención incluyen las proteínas heregulina, indicadas anteriormente, NDF, ARIA y el factor de crecimiento GGF, así como los polipéptidos de SMDF y HRG discutidos con detalle en la presente invención. Estos polipéptidos de heregulina, NDF, ARIA y GGF son bien conocidos en la materia. La HRG incluye los polipéptidos que se muestran en las Figs. 1A-1D, 2A-2E, 3A-3E, 4A-4C, 5A-5D, 6A-6C, 7A-7C y 8 y sus análogos de mamíferos. Se incluyen las variantes HRG como la \gamma-HRG descrita en la patente internacional WO 98/02541, publicada el 22 de enero de 1998; las variantes descritas en la patente internacional WO 98/35036, publicada el 13 de agosto de 1998; y las variantes SMDF descritas en la patente americana US 5.770.567 publicada el 23 de junio de 1998 (patente internacional WO 96/15244). Estas variantes pueden prepararse por lo procedimientos descritos más adelante, opcionalmente junto con las técnicas conocidas en la materia del rastro por alaninas y la expresión en fagos. Cunningham y Wells, Science 244:1081-85 (1989); Bass y col., Proteins 8:309-14 (1990); Lowman y col., Biochem. 30:10832-38 (1991).

El término "una célula epitelial normal" significa una célula epitelial que no ha sido transformada, es decir, no es cancerosa ni está inmortalizada. Además, las células epiteliales normales son preferentemente no aneuploides. Existe aneuploidía cuando el núcleo de una célula no contiene un múltiplo exacto del número haploide de cromosomas, es decir uno o más cromosomas están presentes en mayor o menor número que el resto. Las propiedades típicas de las células transformadas que se hallan fuera del ámbito de la presente invención incluyen la capacidad para formar tumores cuando se implantan en ratones inmuno-deprimidos (ratones atímicos desnudos), la capacidad para crecer en suspensión o en medio semi-sólido como el agar, la pérdida de inhibición por contacto que permite que las células se acumulen formando colonias o focos, la pérdida de la dependencia de los factores de crecimiento o del suero, la muerte celular si se inhibe el crecimiento celular y desorganización de los filamentos de actina. Se incluyen de forma específica dentro de la presente invención las células epiteliales normales que no formarán tumores en los ratones, las células que crecen adheridas al plástico o vidrio (son dependientes del anclaje), las que presentan inhibición por contacto, necesitan suero que contenga hormonas y factores de crecimiento, las que permanecen viables si el crecimiento se para por falta de suero y las que contienen filamentos de actina bien organizados. Aunque las células epiteliales normales no son preferentemente células cultivadas, también son adecuadas para la presente invención las células epiteliales no-inmortalizadas y no-transformadas aisladas de tejidos de mamífero. Estas células aisladas pueden cultivarse durante diversas generaciones (hasta aproximadamente 10 o 50 generaciones) en presencia de una heregulina con el fin de inducir el crecimiento y/o proliferación de una muestra de células aisladas, es decir para crecer la muestra. La muestra crecida se reintroduce a continuación en el mamífero con el objetivo de repoblar el tejido de células epiteliales (repitelización). Ello es particularmente útil para reparar el tejido lesionado o dañado.

Una célula "epitelial" es una célula localizada en una capa celular avascular que recubre la superficie libre (cutánea, mucosa o serosa) de un órgano o forra un tubo o cavidad del cuerpo de un animal. Las células epiteliales del pulmón incluyen las células epiteliales bronquiales, las células de tipo II y las células Clara. El término "célula epitelial", tal como se utiliza aquí, es consistente con la definición reconocida en la materia de células epiteliales del epitelio. Véase, por ejemplo, la definición en el Diccionario Enciclopédico Médico Taber, Edición 12, (1973) F.A. publicación de Davis Company.

El término "característica biológica" para los propósitos de la presente invención hace referencia a una función biológica o antigénica in vivo o actividad que se realice directa o indirectamente por una secuencia HRG (bien en su conformación nativa o desnaturalizada), o mediante una subsecuencia de la misma. Las funciones biológicas incluyen la unión al receptor, cualquier actividad enzimática o actividad moduladora de la actividad enzimática, cualquier actividad de unión al transportador, cualquier actividad hormonal, cualquier actividad promotora o inhibidora de la adhesión celular a una matriz extracelular o moléculas de superficie celular, o cualquier función estructural. Sin embargo, las funciones biológicas no incluyen las funciones antigénicas, es decir, poseer un epitopo o sitio antigénico capaz de reaccionar de forma cruzada con los anticuerpos generados contra un polipéptido HRG producido de forma natural.

El término HRG "activa biológicamente" se define aquí como un polipéptido que comparte una función biológica de una secuencia HRG que puede (aunque no lo necesite) poseer además una función antigénica. Un efecto o función principal de la HRG es actuar como un polipéptido ligando con actividad biológica cualitativa de unión a HER2, HER3 y/o HER4, dando como resultado la activación del receptor de tirosina quinasa (un "ligando activador"). Un test para los ligandos de activación es el ensayo de autofosforilación de la tirosina de HRG, que se describe más adelante. Se incluyen dentro del ámbito de la presente invención, las HRG con secuencias aminoacídicas maduras traducidas de la HRG humana completa; los derivados desglicosilados o no glicosilados de la HRG, las variantes de secuencia aminoacídica de la secuencia de HRG y los derivados de HRG, capaces de presentar una característica biológica en común con la HRG. Aunque la HRG nativa es un polipéptido unido a membrana, también se incluyen dentro de esta definición las formas solubles, como las formas carentes de un dominio transmembrana funcional. En particular, se incluyen los fragmentos polipeptídicos de la secuencia de HRG que tienen un extremo N-terminal en cualquiera de los residuos S216 a A227 y su extremo C-terminal en cualquier residuo desde el K268 al R286 y las secuencias homólogas que se muestran en la Fig. 6A-C, de aquí en adelante referido en todas las HRGs como dominio del factor de crecimiento (GFD).

Una HRG "activa antigénicamente" se define como un polipéptido que posee una función antigénica de una HRG y que puede (aunque no lo necesite) tener además una función biológica.

En realizaciones preferidas, la HRG activa antigénicamente es un polipéptido que se une con una afinidad de al menos 10^{-9}l/mol a un anticuerpo producido contra una secuencia HRG natural. Generalmente el polipéptido se une con una afinidad de al menos 10^{-8}l/mol. Más preferentemente, la HRG activa antigénicamente es un polipéptido que se une a un anticuerpo producido contra una de las HRGs en su conformación nativa. La HRG en su conformación nativa corresponde generalmente a la HRG hallada en la naturaleza, que no ha sido desnaturalizada por agentes caotrópicos, calor ni otros tratamientos que modifican esencialmente la estructura tridimensional de la HRG, según se determina, por ejemplo, por migración en geles de separación de tamaño no reductores ni desnaturalizantes. El anticuerpo utilizado en esta determinación puede ser un anticuerpo policlonal de conejo generado mediante formulación de la HRG nativa de una especie distinta al conejo en adyuvante completo de Freund, inyectando subcutáneamente la formulación y estimulando la respuesta inmune mediante inyección intraperitoneal de la formulación hasta alcanzar la meseta en la curva de titulación de anticuerpos anti-HRG.

Generalmente, la HRG activa biológica o antigénicamente tendrá una secuencia aminoacídica con al menos una identidad de secuencia del 75% con una secuencia HRG dada, más preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 90% y más preferentemente al menos un 95%. La identidad u homología respecto a una secuencia de HRG se define aquí como el porcentaje de residuos aminoacídicos en la secuencia candidata que son idénticos con los residuos HRG de la Fig. 6A-6C, tras alinear las secuencias e introducir los huecos necesarios, para lograr el porcentaje máximo de identidad y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. En cuanto a la identidad de secuencia, no se deberá considerar que ésta se vea afectada por las extensiones en los extremos N- o C-terminal o las extensiones internas, ni tampoco por las deleciones o inserciones en la secuencia de HRG.

En consecuencia, los polipéptidos HRG activos antigénica y biológicamente que son el objetivo de esta invención incluyen cada una de las SECUENCIAS completas de HRG; los fragmentos con una secuencia consecutiva de al menos 5, 10, 15, 20 25, 30 o 40 residuos de aminoácidos procedentes de la secuencia HRG; las variantes de secuencia aminoacídica de la secuencia HRG en donde un residuo aminoacídico se ha insertado en el extremo N- o C-terminal de, o dentro, de la secuencia HRG o su fragmento, tal como se definió anteriormente; variantes de secuencia aminoacídica de la secuencia HRG o su fragmento tal como se definió anteriormente en donde se ha realizado una sustitución aminoacídica. Los polipéptidos HRG incluyen aquellos polipéptidos que contienen mutaciones predeterminadas, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida o por PCR y otras especies animales de polipéptidos HRG como el HRG de conejo, rata, cerdo, primate no-humano, equino, murino y ovino y los alelos u otras variantes naturales de las secuencias anteriores y las secuencias humanas; derivados de HRG o sus fragmentos tal como se definió anteriormente, en donde la HRG o sus fragmentos se han modificado covalentemente mediante sustitución, enzimáticamente, químicamente o por otros medios adecuados con una porción distinta al aminoácido natural (por ejemplo una porción como una enzima o un radioisótopo); variantes de glicosilación de HRG (inserción de un sitio de glicosilación o deleción de cualquier sitio de glicosilación mediante deleción, inserción, o sustitución del aminoácido adecuado); y las formas solubles de HRG, como HRG-GFD o las que carecen de un dominio transmembrana funcional.

El término "aislado" significa un ligando, como la HRG, que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir con las utilizaciones diagnósticas o terapéuticas de la HRG e incluyen proteínas, hormonas y otras sustancias. En realizaciones preferidas, la HRG se purificará (1) a un grado superior al 95% en peso de proteína, según se determina por el procedimiento de Lowry u otros procedimientos de determinación de proteínas validados y más preferentemente superior al 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia aminoacídica N-terminal o interna utilizando la mejor secuencia aminoacídica comercial disponible en la actualidad, o (3) a homogeneidad mediante SDS-PAGE y utilizando azul de Coomassie o, preferentemente tinción de plata. La HRG aislada incluye la HRG in situ dentro de las células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural de HRG no estará presente. La HRG aislada incluye también la HRG de una especie en un cultivo de células recombinantes de otra especie, con lo que la HRG en dichas circunstancias será una fuente de polipéptidos. Sin embargo, por lo general la HRG aislada se preparará al menos mediante una etapa de purificación.

De acuerdo con esta invención, el ácido nucleico de HRG es un RNA o DNA que contiene más de 10 bases que codifican una HRG activa biológica o antigénicamente y es complementario a la secuencia aminoacídica codificante de dicha HRG, o hibrida con la secuencia de ácido nucleico que codifica dicha HRG, permaneciendo unido de forma estable a ésta en condiciones astringentes.

Preferentemente, el ácido nucleico de HRG que codifica un polipéptido que comparte al menos el 75% de identidad de secuencia, más preferentemente al menos el 80%, todavía más preferentemente al menos el 85%, todavía mejor un 90%, y mucho mejor el 95%, con una secuencia HRG. Preferentemente, el ácido nucleico de HRG que hibrida contiene al menos 20, más preferentemente 40 y todavía más preferentemente 90 bases.

El ácido nucleico de HRG incluye un ácido nucleico que se puede identificar y separar del ácido nucleico con el que generalmente el ácido nucleico de HRG se halla asociado en la fuente original. El ácido nucleico de HRG así aislado se halla en una forma distinta a la natural. Este ácido nucleico aislado codificante de HRG incluye el ácido nucleico de HRG de células que normalmente expresan HRG, en donde el ácido nucleico se halla en una localización cromosómica distinta a la de las células naturales o, dicho de otro modo, está flanqueado por una secuencia de DNA distinta a la hallada en la naturaleza. El ácido nucleico que codifica HRG puede utilizarse en ensayos específicos de hibridación, en particular aquellas porciones de secuencia codificante de HRG que no hibridan con otras secuencias de DNA conocidas. "Condiciones astringentes" son aquellas condiciones que (1) emplean baja fuerza iónica y elevada temperatura para el lavado, por ejemplo, NaCl 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/NaDodSO4 al 0,1% a 50ºC; (2) utilizan durante la hibridación un agente desnaturalizante como la formamida, por ejemplo, formamida al 50% (vol/vol) con albúmina sérica bovina al 0,1%, Ficoll al 0,1%, polivinilpirrolidona al 0,1%, tampón fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con NaCl 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC; o (3) utilizan formamida al 50%, 5XSSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, solución de 5x Denhardt, DNA de esperma de salmón sonicado (50g/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en 0,2X SSC y SDS al 0,1%.

El término "secuencias control" hace referencia a las secuencias de DNA necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente a un organismo huésped determinado. Las secuencias control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, un sitio de unión a ribosomas y posiblemente, otras secuencias todavía poco conocidas. Las células eucariotas son conocidas por utilizar promotores, señales de poliadenilación e intensificadores de la transcripción.

El ácido nucleico está "unido operativamente" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el DNA para una presecuencia o líder secretor está unido operativamente al DNA codificante de un polipéptido si éste se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o secuencia intensificadora está unida operativamente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está unido operativamente a una secuencia codificante si está colocado en una posición que facilite la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de DNA que están unidas son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en la misma pauta de lectura. Sin embargo, los intensificadores no tienen porque ser contiguos. La unión se logra mediante ligación con dianas de restricción adecuadas. Si dichas dianas no existieran, entonces se utilizan adaptadores o engarces oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Un elemento "exógeno" se define aquí como una secuencia de ácido nucleico que es foránea a la célula, u homóloga a la célula pero en una posición en la célula huésped que no es la habitual.

Tal como se utilizan aquí, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan de modo intercambiable, incluyéndose la progenie en todas las denominaciones. En consecuencia, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula primaria en cuestión y los cultivos derivados de la misma, independientemente del número de transferencias. Se entenderá que toda la progenie no tiene porqué ser idéntica en cuanto a contenido de DNA debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas que puedan haber sucedido. Se incluye también, la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la analizada en la célula original transformada. Cuando se utilicen denominaciones distintas, la terminología será evidente según el contexto.

Los "plásmidos" se denominan por una "p" minúscula y/o seguida de letras mayúsculas y/o números. Los plásmidos de inicio en la presente invención están disponibles comercialmente, son de disponibilidad pública sin restricciones, o pueden construirse a partir de plásmidos disponibles de acuerdo con procedimientos publicados. Además, otros plásmidos equivalentes son conocidos en la materia y serán evidentes a un experto en la materia.

La "digestión por enzimas de restricción" del DNA hace referencia al corte catalítico del DNA con una enzima que actúa únicamente en ciertos sitios en el DNA. dichas enzimas son denominadas endonucleasas de restricción, y los sitios específicos para cada enzima, dianas de restricción. Las diversas enzimas de restricción utilizadas en la presente invención están disponibles comercialmente y se utilizan las condiciones de reacción, cofactores y otros requisitos establecidos por los fabricantes de las enzimas. Las enzimas de restricción se denominan generalmente por abreviaciones compuestas de una letra mayúscula, seguida por otras letras que representan el microorganismo de donde se obtuvo originalmente la enzima de restricción determinada y a continuación el número de la enzima en cuestión. En general, se utiliza aproximadamente 1 mg de plásmido o fragmento de DNA con aproximadamente 1-2 unidades de enzima en 20 ml de solución tamponada. Los tampones adecuados y las cantidades de sustrato precisas para cada enzima en particular se especifican por el fabricante. La incubación suele ser de 1 hora a 37ºC, pero puede variar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la incubación, se elimina la proteína o el polipéptido mediante extracción con fenol y cloroformo y se recupera el ácido nucleico digerido de la fracción acuosa mediante precipitación con etanol. La digestión con una enzima de restricción puede proseguirse con la hidrólisis con fosfatasa alcalina bacteriana de los fosfatos 5' terminales para evitar que los dos extremos cortados de restricción de un fragmento de DNA se recircularicen o formen un bucle cerrado que impediría la inserción de otros fragmento de DNA en la diana de restricción. Salvo que se indique lo contrario, la digestión de los plásmidos no se prosigue por la desfosforilación 5' terminal. Los procedimientos y reactivos para la desfosforilación son los convencionales descritos en las secciones 1.56-1.61 de Sambrook y col., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

La "recuperación" o el "aislamiento" de un fragmento de DNA dado de una digestión de restricción significa la separación del fragmento digerido en un gel de poliacrilamida o agarosa mediante electroforesis, la identificación del fragmento de interés por comparación de su movilidad respecto a los fragmentos de DNA de peso molecular conocido, la eliminación de la sección del gel que contiene el fragmento deseado y la separación del DNA del gel. Este procedimiento de aislamiento es bien conocida en la materia, véase, por ejemplo, Lawn y col., Nucleic Acids Res. 9:6103-6114 (1981) y Goeddel y col., Nucleic Acids Res, 8:4057, 1980).

El análisis de "transferencia de Northern" es un procedimiento utilizado para identificar secuencias de RNA que hibridan con una sonda conocida, un oligonucleótido, un fragmento de DNA, un cDNA o un fragmento de lo mismo, o un fragmento de RNA. La sonda se marca con un radioisótopo como el P^{32}, o mediante biotinilación, o con una enzima. El RNA a analizar se separa electroforéticamente en un gel de agarosa o poliacrilamida, se transfiere a una membrana de nitrocelulosa, nylon u otro tipo y se hibrida con la sonda, utilizando técnicas estándares bien conocidas en la materia como las descritas en las secciones 7.39-7.52 de Sambrook y col., supra.

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La "ligación" hace referencia al proceso de formación de enlaces fosfodiéster entre los dos fragmentos de ácido nucleico. Para ligar los fragmentos de DNA juntos, sus extremos deben ser compatibles. En algunos casos, los extremos serán directamente compatibles después de la digestión con endonucleasas. Sin embargo, a veces puede ser necesario convertir en primer lugar los extremos cohesivos en romos mediante digestión con endonucleasas de restricción para hacerlos compatibles para la ligación. Para convertir los extremos en romos, el DNA se trata en un tampón adecuado durante 15 min a 15ºC con aproximadamente 10 unidades del fragmento Klenow de DNA polimerasa 1 o la T4 DNA polimerasa en presencia de los cuatro desoxiribonucleótidos trifosfato. El DNA se purifica por extracción con fenol-cloroformo y se precipita con etanol. Los fragmentos de DNA que se han de ligar se ponen en una solución a aproximadamente cantidades equimolares. La solución también contendrá ATP, tampón de ligasa y una ligasa como la T4 DNA ligasa a aproximadamente 10 unidades por cada 0,5 mg de DNA. Si el DNA se ha de ligar en un vector, éste se lineariza mediante digestión con la(s) endoncleasa(s) de restricción adecuada(s). El fragmento linearizado se trata con fosfatasa alcalina bacteriana, o con fosfatasa intestinal bovina para prevenir la auto-ligación durante la etapa de ligación.

La "preparación" de DNA a partir de células quiere decir el aislamiento del DNA plasmídico de un cultivo de células huésped. Los procedimientos comúnmente utilizados para la preparación de DNA son las preparaciones plasmídicas a pequeña y gran escala descritas en las secciones 1.25-1.33 de Sambrook y col., supra.

Los "oligonucleótidos" son polidesoxinucleótidos de corta longitud, de cadena sencilla o doble que se sintetizan químicamente mediante procedimientos conocidos (como el fosfotriéster, el fosfito o la química de la fosforamidita, utilizando técnicas de fase sólida como las descritas en la patente europea EP 266.032, publicada el 4 de mayo de 1988, o mediante intermediarios desoxinucleósidos H-fosfonato, tal como se describe por Froehler y col., Nucl. Acids Res. 14: 5399-5407, 1986. Y a continuación se purifican en geles de poliacrilamida.

La técnica de la "reacción en cadena de polimerasa" o "PCR", tal como se utiliza aquí, hace referencia a un procedimiento en el que en cuestión de minutos un fragmento de ácido nucleico, RNA y/o DNA se amplifica tal como se describe en la patente americana U.S. 4.683.195, publicada el 28 de julio de 1987. En general, para que puedan diseñarse los cebadores oligonucleotídicos, es necesario que la información de secuencia de los extremos de la región de interés esté disponible; estos cebadores serán idénticos o similares a la secuencia de las cadenas opuestas del molde a amplificar. Los nucleótidos del extremo 5'terminal de los dos cebadores pueden coincidir con los extremos del material amplificado. La PCR puede utilizarse para amplificar las secuencias de RNA específicas, las secuencias de DNA específica del DNA genómico total y del cDNA transcrito a partir del RNA celular total, de secuencias de bacteriófago o plasmídicas, etc. Véase por ejemplo, Mullis y col., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263 (1987); Elrich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Tal como se utiliza aquí, la PCR se considera uno de los procedimientos, pero no el único, de la reacción de una polimerasa de ácido nucleico para amplificar una muestra de ácido nucleico en un ensayo, que comprende la utilización de un ácido nucleico conocido (DNA o RNA) como cebador y utiliza una polimerasa de ácido nucleico para amplificar o generar un fragmento específico de ácido nucleico, o para amplificar o generar un fragmento de ácido nucleico complementario de un ácido nucleico determinado.

El ensayo de autofosforilación de tirosinas de HRG para detectar la presencia o la bioactividad de ligandos HRG puede utilizarse para controlar la purificación de un ligando para los receptores de HER2 y HER3. Este ensayo se basa en asumir que un ligando específico para el receptor estimulará la autofosforilación del receptor, en analogía con el receptor de EGF y la estimulación de su propia autofosforilación. Véase Sadich y col., Anal. Biochem. 235:207-214 (1996). Las células MDA-MDB 453 o las células MCF7 que contienen niveles elevados de p185^{HER2} pero negligibles de receptores de EGF humanos, se obtuvieron del American Type Culture Collection, Rockville, Md. (ATCC Nº HTB-131) y se mantuvieron en el cultivo de tejidos con suero fetal bovino al 10% en DMEM/Ham F12 (1:1). Para el ensayo, las células se tripsinizaron y plaquearon a 150.000 células/pocillo en placas de 24 pocillos (Costar). Después de la incubación con medio que contenía suero durante toda la noche, las células se colocaron en medio sin suero durante 2-18 horas antes del ensayo. Se añadieron 100 \mul de las muestras a cada pocillo. Las células se incubaron durante 5-30 minutos (típicamente 30 min) a 37ºC y se eliminó el medio. A continuación, se trataron las células de cada pocillo con 100 \mul de un tampón desnaturalizante en gel con SDS (SEPROSOL, Enpotech, Inc.) y las placas se calentaron a 100ºC durante 5 minutos para disolver las células y desnaturalizar las proteínas, se migraron alícuotas de cada pocillo en una electroforesis en geles de gradiente al 5-50% con SDS (NOVEX, Encinitas, CA) de acuerdo con las direcciones del fabricante. Después de que el colorante alcanzara la parte inferior del gel, se finalizó la electroforesis y se colocó una membrana de PVDF (PRPBLOT, ABI) sobre el gel, transfiriéndose las proteínas del gel a la membrana en una cámara de transferencia (BioRad) a 200 mAmps durante 30-60 min. Después de la transferencia, las membranas se incubaron con solución salina tamponada con TRIS y un tampón detergente TWEEN-20 al 0,1% y BSA al 5% durante 2-18 h para bloquear la unión inespecífica, y luego se trataron con un anticuerpo anti-fosfotirosina (Upstate Biological, N.Y.). A continuación, las membranas de transferencia se trataron con el anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con fosfatasa alcalina. Los geles se revelaron utilizando el sistema PROTOBLOT de Promega. Después de secar las membranas, se cuantificó la densidad de las bandas correspondientes con el p185^{HER2} en cada muestra con un SCANJET Plus Scanner de Hewlett Packard acoplado a un ordenador Macintosh. El número de receptores por célula en las células MDA-MB-453 fue tal que en estas condiciones experimentales, la proteína del receptor p185^{HER2} es la principal proteína marcada.

La "microsecuenciación de proteínas" se realizó basándose en los procedimientos siguientes. Las proteínas de la etapa final de HPLC se secuenciaron directamente por degradación de Edman automatizada con un secuenciador de fase de gas de Applied Biosystems, modelo 470A, equipado con un analizador de aminoácidos 120A PTH, o se secuenciaron después de digerirse con diversas enzimas o agentes químicos. Los aminoácidos PTH se integraron utilizando el sistema de datos CHROMPERFECT (Justice Innovations. Palo Alto). La interpretación de la secuencia se realizó en un ordenador VAX 11/785 Digital Equipment Corporation tal como se describión en Henzel y col., J. Chromatography 404:41-52 (1987). En algunos casos, se migraron alícuotas de las fracciones de HPLC en electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS al 5-20%, se electrotransfirieron a una membrana de PVDF (PROBLOTT, ABI, Foster City, CA) y se tiñeron con Azul de Coommassie Brillante (Matsudaira, P. J. Biol. Chem. 262:10035-10038, 1987). La proteína específica se recortó de la membrana de transferencia para la secuenciación N-terminal. Para determinar las secuencias de proteínas internas, las fracciones de HPLV se secaron al vacío (SPEEDVAC), se resuspendieron en un tampón adecuado y digirieron con bromuro de cianógeno, la enzima específica de lisina Lys-C (Wako Chemicals, Richmond, VA) o Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind). Después de la digestión, los péptidos resultantes se secuenciaron como una mezcla, o se resolvieron por HPLC en una columna C4 con un gradiente de propanol en TFA al 0,1% antes de la secuenciación, tal como se describió anteriormente.

Los "anticuerpos" (Abs) y las "inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos presentan especificidad de unión contra un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen tanto los anticuerpos como otras moléculas de tipo anticuerpo que carecen de especificidad antigénica. Los polipéptidos de la última clase se producen, por ejemplo, a niveles bajos por el sistema linfático y a niveles mayores por mielomas.

La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio de unión al antígeno y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación antigénica y es todavía capaz de unirse con el antígeno.

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento y de unión al antígeno completo. Esta región consiste en un dímero de una cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en asociación estrecha, no-covalente. En esta configuración interactúan las tres regiones hipervariables de cada dominio variable para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero V_{H}-V_{L}. En conjunto, las seis regiones hipervariables confieren al anticuerpo especificidad de unión por el antígeno. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprenda las tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad para reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad inferior que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi-terminal del dominio CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominación para Fab', en la cual los residuos cisteína de los dominios constantes tienen un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se producen originalmente como parejas de fragmentos Fab' con las cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplantes químicos de los fragmentos de anticuerpo.

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrados pueden clasificarse en uno o dos tipos claramente distintos, denominados kappa (K) y lambda (\gamma), según las secuencias aminoacídicas de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia aminoacídica del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden clasificarse en clases distintas. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y algunas de éstas pueden además dividirse en subclases (isotipos), p.ej., IgG1, IgG3, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios de cadena constante que corresponden con las clases distintas de inmunoglobulinas se denominan \alpha, \delta, \varepsilon, \gamma y \mu, respectivamente. Las estructuras de la subunidad y las configuraciones en tres dimensiones de clases distintas de inmunoglobulinas se conocen con profundidad.

El término "anticuerpo" se utiliza aquí en el sentido amplio y abarca específicamente los anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud completa), los anticuerpos policlonales, los anticuerpos multiespecíficos (p.ej., los anticuerpos biespecíficos) y los fragmentos de anticuerpos siempre que presenten la actividad biológica deseada.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente el dominio de unión al antígeno o dominio variable de lo mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2} y Fv; los anticuerpos bivalentes o "diacuerpos"; los anticuerpos lineares; las moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y los anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpos.

El término "anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza aquí, hace referencia a un anticuerpo obtenido de una población homogénea de anticuerpos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por mutaciones posibles que ocurran de forma natural y puedan estar en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y están dirigidos contra un sitio antigénico único. Además, al contrario que las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que incluyen anticuerpos distintos dirigidos contra determinantes distintos (epitopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como el obtenido de una población homogénea de anticuerpos, y no debe considerarse que la producción de anticuerpos necesite ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para utilizar de acuerdo con la presente invención pueden generarse por el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y col., Nature 256:495 (1975), o por procedimientos del DNA recombinante (véase, p.ej., la patente americana U.S. 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de librerías de fagos utilizando la técnica descrita por Clackson y col., Nature 352:624-628 (1991) y Marks y col., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen específicamente anticuerpos (inmunoglobulinas) "quiméricos" en los que una porción de la cadena ligera y/o pesada es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase de anticuerpo determinada, mientras que la(s) cadena(s) restante(s) es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como también los fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (patente americana U.S. 4.816.567; y Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no-humanos (p.ej., murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia derivada de una inmunoglobulina no-humana. En la mayoría de los casos, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas (anticuerpo receptor) en los que se han reemplazado residuos de la región hipervariable del receptor por residuos de la región hipervariable de una especie no-humana (anticuerpo donante) como por ejemplo el ratón, la rata, el conejo o primates no-humanos con la especificidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de entramado (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen con los residuos no-humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se hallen en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para perfeccionar la generación del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá todos o al menos uno, y generalmente dos, dominios variables, en los que todas o esencialmente todas las regiones hipervariables corresponden con las de una inmunoglobulina no-humana y todas o esencialmente todas las FRs son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá opcionalmente una porción por lo menos de una región constante de inmunoglobulina (Fc), generalmente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase Jones y col., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann y col., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596
(1992).

Los fragmentos de anticuerpo "Fv cadena sencilla" o "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} del anticuerpo, en donde estos dominios presentan una sola cadena polipeptídica. En general, el polipéptido Fv comprende además un engarce polipeptídico entre los dominios V_{H} y V_{L} que permite que los sFv formen la estructura deseada para la unión con el antígeno. Para una revisión de sFv véase Pluckthun en The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies, vol., 113, Rosenburg and Moore, eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

El término "diacuerpos" hace referencia a fragmentos de anticuerpos pequeños con los dos sitios de unión al antígeno, que comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectada con un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) en la misma cadena polipeptídica (V_{H}-V_{L}). Utilizando un engarce que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se obliga a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, la patente europea EP 404.097; la patente internacional WO 93/11161; y Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-64448 (1993).

La expresión "anticuerpos lineales" cuando se utiliza en esta solicitud hace referencia a los anticuerpos descritos en Zapata y col., Protein Eng. 8 (10):1507-1062 (1995). En resumen, estos anticuerpos comprenden una pareja de segmentos Fd en tándem (V_{H}-C_{H}I-V_{H}-C_{H}I) que forman parte de una pareja de regiones de unión al antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

II. Utilizacion y preparacion de secuencias HRG H. Preparacion de secuencias HRG, incluyendo las variantes

El sistema a utilizar en la preparación de una secuencia HRG dependerá de la secuencia HRG particular seleccionada. Si la secuencia HRG es suficientemente pequeña puede prepararse mediante procedimientos de síntesis in vitro de polipéptidos. Sin embargo, la HRG se preparará mas frecuentemente en cultivo de células recombinantes utilizando los sistemas de huésped-vector descritos más adelante. Una HRG adecuada incluye cualquier HRG activa biológica y antigénicamente.

En general, se utilizarán las células huésped de mamífero, aunque dichos huéspedes pueden carecer de los sistemas post-traduccionales para procesar las preprosecuencias PRO de manera normal. Si las células huésped contienen dichos sistemas, entonces será posible recuperar fragmentos del subdominio natural como HRG-GFD de los cultivos. Si no, entonces se puede lograr el procesamiento adecuado transformando los huéspedes con la enzima(s) requerida(s) o suministrándola(s) en un procedimiento in vitro. Sin embargo, no es necesario transformar las células con los genes prepro o estructurales completos para una HRG seleccionada cuando se sólo desee producir fragmentos de secuencias HRG como, p.ej., HRG-GFD. Por ejemplo, se liga un codón de inicio al extremo 5' del DNA que codifica una HRG-GFD, este DNA se utilizó para transformar células huésped y el producto se expresa directamente como la forma Met N-terminal (si se desea, la Met foránea puede eliminarse in vitro o con desmetionilasas N-terminales endógenas). Alternativamente, la HRG-GFD se expresa como una fusión con una secuencia señal reconocida por la célula huésped, la cual procesará y secretará la HRG-GFD madura tal como se describe más adelante. De igual manera se producen variantes de secuencia aminoacídica de las secuencias HRG-GFD.

Las secuencias HRG localizadas entre el primer residuo maduro N-terminal y el primer residuo N-terminal de la secuencia HRG-GFD, denominado HRG-NTD puede funcionar al menos en parte como una secuencia señal no convencional, o como un precursor/transportador circulante normal para HRG-GFD con una sola actividad biológica. La HRG-NTD se produce de la misma manera que la molécula de longitud completa, pero a partir de la expresión de un DNA que tiene un codón de parada en el extremo C-terminal de HRG-NTD. Además, las variantes de HRG se expresan a partir del DNA que codifica la proteína en la que tanto el dominio GFD como el NTD están en su propia orientación pero contienen una inserción, deleción o sustitución aminoacídica en el sitio de corte GFD-NTD (localizado dentro de la secuencia VKC) que inhibe o evita la rotura proteolítica del sitio de unión NTD-GFD in vivo, y en donde un codón de parada se halla en el extremo 3' de la secuencia codificante GFD. En un ejemplo de este grupo de variantes (denominadas HRG-NTDXGFD), (1) el residuo lisina hallado en la secuencia de unión de NTD-GFD, VKC, se deleciona o (preferentemente) se sustituye por otro residuo distinto al arginil, como el histidil, alanil o seril y (2) se introduce un codón de parada en la secuencia RCT o RCQ en lugar de cisteinil, o treonil (para HRG-\alpha) o glutaminil (para HRG-\beta).

Un ligando HRG-\alpha preferido con afinidad de unión por p158^{HER} comprende los aminoácidos 226-265 de la figura 1A-D. El ligando HRG-\alpha puede comprender además de 1-20 aminoácidos adicionales antes del aminoácido 226 y de 1-20 aminoácidos después del aminoácido 265. Un ligando de HRG-\beta preferido con afinidad de unión por p185^{HER2} comprende los aminoácidos 226-265 de la figura 2A-E. Este ligando HRG-\beta puede comprender hasta 1-20 aminoácidos adicionales antes del 226 y de 1-20 aminoácidos después del 265.

Tal como indicó más arriba, otras secuencias HRG que se preparan de acuerdo con la presente invención corresponden a las de GFD. Éstas se sintetizan in vitro o se producen en el cultivo de células recombinantes. Se producen de forma más barata en levaduras o en E. coli mediante secreción bajo el control de una señal heteróloga de HRG, tal como se describe más adelante, aunque la preparación en células animales también se contempla utilizando una señal de proteína de mamífero como la de tPA, UK o una proteína viral de secreción. El GFD puede ser la secuencia de una HRG nativa o puede ser una variante de lo mismo tal como se describe más adelante. Las secuencias GFD incluyen aquellas en las que uno o más residuos de un miembro de la familia EGF se sustituyen en la secuencia de GFD.

Una HRG adicional es aquella que contiene el GFD y la secuencia entre el C-terminal del GFD y el N-terminal del dominio transmembrana (siendo este último denominado el dominio de corte C-terminal o CTC). En esta variante (HRG-GFD-CTC) el codón de inicio del DNA está presente en el extremo 5' de la secuencia señal heteróloga de HRG o adyacente al extremo 5' de la región codificante de GFD y un codón de parada se halla en lugar de los tres primeros residuos del dominio extracelular (ECD) o de los tres primeros residuos de la región transmembrana. Además, en algunas variantes HRG-GFD-CTC, los codones se modifican en el sitio de proteolisis GFD-CTC mediante sustitución, inserción o deleción. El sitio de proteolisis de GFD-CTC es el dominio que contiene el residuo C-terminal de GFD y aproximadamente 5 residuos en posición N-terminal y 5 residuos en C-terminal respecto a este residuo. Se sabe que la Met-227 terminal y la Val-229 terminal de HRG-\alpha-GFD son biológicamente activas. El C-terminal para HRG-\alpha-GFD puede ser Met-227, Lys-228, Gln-230, Asn-231 o Gln-232 y para HRG-\beta-GFD puede ser Met-226, Ala-227, Ser-228, Phe-229, Trp-230, o Lys231/Ser231. El extremo C-terminal nativo se determina fácilmente mediante secuenciación C-terminal, aunque no es necesario que la HRG-GFD tenga el extremo nativo tan largo, ya que la secuencia GFD posee la actividad deseada. En algunas realizaciones de variantes HRG-GFD-CTC, los cambios aminoacídicos en el CTC se rastrean por su capacidad para resistir la proteolisis in vitro e inhibir la proteasa responsable de la generación de HRG-GFD.

Las variantes HRG-ECD se generan proporcionando un codón de parada en la misma localización que las variantes HRG-GFD-CTC. HRG-ECD puede comprender una cualquiera o más de una de las variantes descritas anteriormente relativas a sus subfragmentos, por ejemplo, variantes GFD-CTC que contengan modificaciones del sitio de proteolisis CTC.

Si se desea preparar polipéptidos de HRG más largos y los extremos 5' o 3' de la HRG dada no se han descritoaquí, puede ser necesario preparar ácidos nucleicos en los que los dominios ausentes se sustituyan por regiones homólogas de los ácidos nucleicos HRG más completos. Alternativamente, los dominios ausentes pueden obtenerse hibridando librerías con los DNAs descritos en las Figuras, o con fragmentos de lo mismo.

A. Aislamiento del DNA que codifica la Heregulina

El DNA que codifica la HRG puede obtenerse de cualquier librería de cDNA a partir de un tejido que exprese el mRNA de HRG y lo haga a un nivel detectable. El gen HRG-\alpha puede obtenerse de este modo de una librería genómica. Se pueden utilizar procedimientos similares para el aislamiento de otra HRG, como por ejemplo los genes codificantes de HRG-\beta1, HRG-\beta2, o HRG-\beta3.

Las librerías se rastrean con sondas diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por éste. Para las librerías de expresión de cDNA, las sondas adecuadas incluyen anticuerpos monoclonales o policlonales que reconocen y se unen específicamente a HRG-\alpha; oligonucleótidos de aproximadamente 20-80 bases de longitud que codifican porciones conocidas o posibles del cDNA de HRG-\alpha de la misma o distinta especie; y/o cDNAs complementarios u homólogos o fragmentos de lo mismo que codifican el mismo gen o uno similar. Las sondas adecuadas para el rastreo de librerías de DNA genómicas incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos; cDNAs o fragmentos de lo mismo que codifican el mismo o un gen similar; y/o DNAs genómicos homólogos o fragmentos de lo mismo. El rastreo de la librería de cDNA o genómica con la sonda seleccionada se puede realizar utilizando procedimientos estándares, tal como se describen en los capítulos 10-12 de Sambrook y col., supra.

Un método alternativo para aislar el gen que codifica HRG-\alpha es utilizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tal como se describe en la sección 14 de Sambrook y col., supra. Este procedimiento requiere la utilización de sondas oligonucleotídicas que hibridarán con HRG-\alpha. Las estrategias para la selección de oligonucleótidos se describen más adelante.

Otro procedimiento alternativo para obtener el gen de interés es sintetizarlo químicamente utilizando uno de los procedimientos descritos en Engels y col., (Agnew. Chem. Int. Ed Engl. 28:716-734, 1989). Estos procedimientos incluyen el triéster, el fosfito, la fosforamidita y los procedimientos del H-fosfonato, la PCR y otros procedimientos de auto-cebado y la síntesis de oligonucleótidos en soportes sólidos. Estos procedimientos pueden utilizarse si se conoce toda la secuencia de ácido nucleico del gen, o si está disponible la secuencia de ácido nucleico complementaria a la cadena codificante, o alternativamente, si la secuencia aminoacídica es conocida, se puede deducir la secuencia de ácido nucleico potencial utilizando residuos codificantes y preferidos para cada residuo aminoacídico.

Un procedimiento preferido para la práctica de la presente invención es utilizar secuencias oligonucleotídicas seleccionadas cuidadosamente para rastrear librerías de cDNA de diversos tejidos, preferentemente de líneas de células humanas de mama, colon, glándulas salivares, placenta, feto, cerebro y carcinomas. Otras fuentes biológicas de DNA que codifica un ligando de tipo-heregulina incluye otros mamíferos y pájaros. Entre los mamíferos preferidos están los miembros de las especies siguientes: bovina, ovina, equina, murina y roedores.

Las secuencias oligonucleotídicas seleccionadas como sondas deberían ser de longitud suficiente y suficientemente no ambiguas para minimizar falsos positivos. La secuencia nucleotídica actual puede, por ejemplo, estar basada en secuencias nucleotídicas conservadas o altamente homólogas o en regiones de HRG-\alpha. Los oligonucleótidos pueden estar degenerados en más de una posición. La utilización de oligonucleótidos degenerados puede ser de particular importancia si se rastrea una librería en una especie en la que no se conoce su utilización preferencial de codones. El oligonucleótido debe estar marcado de modo que pueda detectarse tras hibridación con el DNA en la librería que se rastrea. El procedimiento preferido de marcaje es utilizar el ATP marcado con P^{32} por la polinucleótido quinasa, tal como se conoce en la materia, para marcar isotópicamente el oligonucleótido. Sin embargo, se pueden utilizar otros procedimientos para marcar el oligonucleótido, incluyendo, pero sin limitarse a, la biotinilación o el marcaje enzimático.

De interés particular es un ácido nucleico HRG-\alpha que codifica un polipéptido de tamaño completo. En algunas realizaciones preferidas, la secuencia de ácido nucleico incluye la secuencia señal de la HRG-\alpha nativa. El ácido nucleico con toda la secuencia codificante de la proteína se obtiene mediante rastreo de librerías de cDNA o genómicas, y, si es necesario, utilizando procedimientos de extensión del cebador tal como se describe en la sección 7.79 de Sambrook y col., supra, para detectar precursores y procesar los intermediarios del mRNA que no han sido retro-transcritos a cDNA.

El DNA codificante de la HRG de las Figuras 1A-1D puede utilizarse para aislar el DNA que codifica el ligando análogo de otra especie animal mediante procedimientos de hibridación ya discutidos anteriormente. Los animales preferidos son los mamíferos, en particular los bovinos, ovinos, equinos, felinos, caninos y roedores y más especialmente las ratas, los ratones y los conejos.

B. Variantes de secuencia aminoacídica de la heregulina

Las variantes de secuencia aminoacídica de HRG se preparan introduciendo los cambios nucleotídicos adecuados en el DNA de HRG, o mediante la síntesis in vitro del polipéptido HRG deseado. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, deleciones de, o inserciones o sustituciones de residuos en la secuencia aminoacídica mostrada para las secuencias HRG humanas. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución puede realizarse para lograr la construcción final, siempre que ésta posea las características deseadas. Se excluyen del ámbito de la invención las variantes de HRG o secuencias polipeptídicas que no sean nuevas ni las más indicadas según los antecedentes en la materia. Los cambios aminoacídicos también pueden alterar procesos post-traduccionales de HRG-\alpha, como cambiar el número o la posición de los sitios de glicosilación, alterar las características de anclaje a la membrana, alterar la localización intra-celular de HRG mediante inserción, deleción, o afectando la secuencia líder de la HRG nativa, o modificando su susceptibilidad al corte proteolítico.

La secuencia HRG puede procesarse proteolíticamente para crear diversos fragmentos HRG. Las secuencias HRG-GFD de HRG-\alpha contienen secuencias aminoacídicas entre las cisteína 226 y la cisteína 265 de HRG. El extremo amino-terminal del fragmento de HRG-\alpha puede resultar del corte de cualquier enlace peptídico entre la alanina 1 y la cisteína 226, preferentemente adyacente a una arginina, lisina, valina o metionina y más preferentemente entre la metionina 45 y la serina 46. El extremo carboxi-terminal del fragmento de HRG-\alpha puede resultar del corte de cualquier enlace peptídico entre la cisteína 265, preferentemente adyacente a una arginina, lisina, valina o metionina y más preferentemente entre la lisina 272 y la valina 273, entre la lisina 278 y la alanina 279, o entre la lisina 285 y la arginina 286. Los ligandos de HRG-\alpha resultantes de dicho procesamiento proteolítico son los ligandos preferidos.

Las HRG-\beta-GFD son análogas a los descritas más arriba para HRG-\alpha-GFD. Cada HRG-\beta-GFD contiene el segmento polipeptídico desde la cisteína 212 a la 251 de la figura 2A-E. El extremo amino-terminal del fragmento HRG-\beta1 puede resultar del corte de cualquier enlace peptídico entre la alanina 1 y la cisteína 212, preferentemente adyacente a una arginina, lisina, valina o metionina y más preferentemente entre la metionina 31 y la serina 32. El extremo carboxi-terminal del fragmento HRG-\beta1 puede resultar del corte de cualquier enlace peptídico entre la cisteína 251 de la Figura 2A-2E, preferentemente adyacente a una arginina, lisina, valina, o metionina y más preferentemente entre la valina 255 y la metionina 256, entre la lisina 261 y la histidina 262, entre la lisina 276 y la alanina 277, o entre la lisina 301 y la treonina 302. De modo similar, los ligando HRG-\beta1 resultantes de dicho procesamiento proteolítico se hallan entre los ligandos preferidos. Di igual modo, el procesamiento para producir ligandos de fragmentos preferidos de HRG-\beta2 según la Fig. 3A-3E y la HRG-\beta3 según la Fig. 4A-4C puede lograrse cortando las secuencias HRG de las Figs. 3A-3E y 4A-4C, preferentemente adyacentes a una arginina, lisina, valina o metionina.

En el diseño de variantes de secuencia aminoacídica de HRG, la localización del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación dependerá de las características a modificar. Los sitios de mutación pueden modificarse individualmente o en series, p.ej., (1) sustituyendo primero con aminoácidos conservadores y luego con otros más radicales dependiendo de los resultados logrados, (2) delecionando el residuo diana, o (3) insertando residuos de otros ligandos del receptor adyacentes al sitio localizado.

Un procedimiento de utilidad para la identificación de ciertos residuos o regiones del polipéptido HRG que sean localizaciones preferidas para la mutagénesis es el denominado "mutagénesis por rastreo de alaninas", tal como se describe por Cunningham y Wells (Science, 244:1081-1085, 1989). Aquí, se identifica un residuo o grupo de residuos diana (p.ej., residuos cargados como la arg, asp, his, lys y glu) y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (preferentemente la alanina o la polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con el entorno acuoso dentro o fuera de la célula. Aquellos dominios que demuestran una sensibilidad funcional a las sustituciones se remodelan a continuación introduciendo otras variantes en los sitios de sustitución. En consecuencia, mientras que el sitio para la introducción de una variación de secuencia aminoacídica está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no tiene porqué estarlo. Por ejemplo, para optimizar la realización de una mutación en un sitio dado, se puede realizar el rastreo de alaninas o la mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y a continuación, rastrear la combinación óptima que tenga la actividad deseada de las variantes HRG.

En la construcción de variantes de secuencia aminoacídica existen dos variables principales: la localización del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación. Estas variantes de la secuencia HRG pueden representar alelos naturales (que no requerirán manipulación del DNA de HRG) o formas mutantes predeterminadas generadas mediante mutagénesis del DNA, para obtener un alelo o una variante que no se halle en la naturaleza. En general, la localización y la naturaleza de la mutación elegida dependerán de la característica de la HRG a modificar. Obviamente, dichas variantes, que por ejemplo convierten la HRG en un ligando de receptor conocido, no se incluyen dentro del ámbito de la invención, tampoco las otras variantes de HRG o secuencias polipeptídicas que no sean nuevas ni las más indicadas según las referencias en la materia.

Las deleciones de secuencia aminoacídica abarcan generalmente de 1 a 30 residuos, más preferentemente de 1 a 10 residuos y típicamente de 1 a 5 residuos contiguos. Las deleciones se pueden introducir en las regiones de baja homología con otros precursores de la familia EGF para modificar la actividad HRG. Las deleciones de HRG en áreas de homología sustancial con las secuencias de la familia EGF modificarán probablemente la actividad biológica de HRG de forma más significativa. El número de deleciones consecutivas se seleccionará para preservar la estructura terciaria de HRG en el dominio afectado, p.ej., la unión de cisteínas, la hoja plegada beta o la hélice alfa.

Las inserciones de secuencia aminoacídica incluyen las fusiones amino- y/o carboxi-terminal cuya longitud varía desde 1 residuo a polipéptidos que contienen un centenar o más de residuos, así como la inserción intrasecuencia de uno o múltiples residuos aminoacídicos. Las inserciones intrasecuencia (es decir, inserciones dentro de la secuencia de HRG) pueden ser de aproximadamente 1 a 10 residuos, más preferentemente de 1 a 5 y todavía mejor de 1 a 3 residuos aminoacídicos. Ejemplos de inserciones terminales incluyen la HRG con un residuo N-terminal (un artefacto de la expresión directa de HRG en un cultivo de bacterias recombinantes) y la fusión de una secuencia señal N-terminal de HRG heteróloga para facilitar la secreción de la HRG madura en las células huésped recombinantes. Dichas secuencias señal se obtendrán generalmente de, y en consecuencia son homólogas a, las especies de huéspedes escogidas. Las secuencias adecuadas incluyen STII, tPA o Ipp para E. coli, el factor alfa para levaduras y las señales virales como gD del virus herpes para las células de mamífero.

Otras variantes de inserción de HRG incluyen la fusión del extremo N- o C-terminal de HRG de un polipéptido inmunogénico, p.ej., los polipéptidos de bacterias como la beta-lactamasa o una enzima codificada por el locus trp de E. coli, o la proteína de levadura, la albúmina sérica bovina y los polipéptidos quimiotácticos. También se contemplan las fusiones C-terminales de HRG-ECD con proteínas que tienen una vida media larga como las regiones constantes de inmunoglobulina (u otras regiones de inmunoglobulina), la albúmina, o la ferritina, tal como se describe en la patente internacional WO 89/02922, publicada el 6 de abril de 1989.

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Otro grupo de variantes son las variantes de sustitución. En estas variantes de HRG, se ha sustituido por lo menos un residuo aminoacídico por otro distinto en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis sustitucional incluyen los sitios identificados como sitios activos de HRG, y los sitios en donde los aminoácidos hallados en los ligandos HRG de diversas especies son diferentes en términos de volumen de cadena lateral, carga y/o hidrofobilicidad. Un sub-dominio similar de HRG-GFD que tenga actividad biológica como un factor de crecimiento es el segmento C-terminal, en particular dentro de la secuencia desde aproximadamente la glicina 218 a la valina 226 (HRG-\alpha), y la glicina 218 a la lisina 228/serina 228 (HRG-\beta) según la analogía con la subsecuencia de EGF con actividad EGF.

Otros sitios de interés son aquellos residuos idénticos en ligandos de tipo HRG obtenidos de especies diversas. Estas posiciones pueden ser importantes para la actividad biológica de la HRG. Estos sitios, especialmente aquellos que se hallan dentro de una secuencia que comprende al menos tres sitios conservados de forma idéntica, se sustituyen de forma relativamente conservada. Dichas sustituciones conservadas se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezamiento de "sustituciones preferidas". Si dichas sustituciones resultan en un cambio de la actividad biológica, se introducen y rastrean más cambios sustanciales, denominados ejemplos de sustituciones en la Tabla 1, o como se describe más adelante respecto a las clases de aminoácidos.

TABLA 1

1

Las modificaciones en la función o la identidad inmunológica de HRG se realizan seleccionando sustituciones que difieran significativamente en su efecto o manteniendo (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una hoja o conformación helicoidal, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos naturales se dividen en los siguientes grupos basándose en las propiedades de su cadena lateral común:

1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;

3) acídicos: asp, glu;

4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;

5) residuos que influencian la orientación de la cadena lateral: gly, pro y

6) aromáticos: trp, tyr, phe.

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Las sustituciones no conservadoras implican el cambio de un miembro de una de estas clases por otro. Dichos residuos sustituidos pueden introducirse en regiones HRG que sean homólogas con otros ligandos de receptor, o más preferentemente, en regiones no-homólogas de la molécula.

En una realización de la invención, se inactivan uno o más sitios de corte de proteasas presentes en la molécula. Estos sitios se identifican por la inspección de la secuencia aminoacídica codificada. Si se identifican los sitios de corte de proteasas, se vuelven inactivos al corte proteolítico por sustitución del residuo diana por otro residuo, preferentemente un residuo básico como la glutamina o un residuo hidrofílico como la serina; delecionando el residuo; o insertando un residuo prolil inmediatamente después del residuo.

En otra realización, se sustituyeron por otro residuo (preferentemente de acuerdo con la Tabla 1), o se delecionó cualquier residuo metionil distinto al residuo metionil de inicio de la secuencia señal, o cualquiera de los tres residuos N- o C-terminal para cada residuo metionil. Alternativamente, se insertaron 1-3 residuos adyacentes a dichos sitios.

También puede sustiturse cualquier residuo cisteína no implicado en mantener la conformación adecuada de HRG, en general por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir uniones aberrantes.

Sitios adecuados para las sustituciones, deleciones o inserciones, o para su utilización como fragmentos, incluyen los siguientes numerados desde el extremo N-terminal de HRG-\alpha de la Figura 1-A-1D:

1) adición de sitios de glicosaminoglicano potenciales en los dipéptidos serina-glicina en las posiciones: 42-43, 64-65, 151-152;

2) glicosilación potencial unida a asparragina en las posiciones: 164, 170, 208 y 437 (NDS), 164-166, (NIT) 170-172, (NTS) 208-210 y 609-611 (NTS);

3) O-glicosilación potencial en un grupo de serinas y treoninas en 209-218;

4) cisteínas en 226, 234, 254, 256 y 265;

5) dominio transmembrana en 287-309;

6) bucle I limitado por las cisteínas 226 y 240;

7) bucle 2 limitado por las cisteínas 234 y 254;

8) bucle 3 limitado por las cisteínas 256 y 265; y

9) sitios de procesamiento potencial de proteasas en 2-3, 8-9, 23-24, 33-34, 36-37, 45-46, 48-49, 62-63, 66-67, 86-87, 110-111, 123-124, 134-135, 142-143, 272-273, 278-279 y 285-286;

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Las regiones análogas en la HRG-\beta1 pueden determinarse por referencia a su secuencia. Los aminoácidos de HRG-\beta1 análogos pueden mutarse o modificarse tal como se describió para la HRG-\alpha. Las regiones análogas en HRG-\beta2 también pueden determinarse por referencia a su secuencia. Asimismo, las regiones análogas en HRG-\beta3 también pueden determinarse por referencia a su secuencia. Los aminoácidos análogos de HRG-\beta2 pueden mutarse o modificarse tal como se describió anteriormente para HRg-\alpha o HRG-\beta1. Además, los aminoácidos análogos de HRG-\beta3 pueden mutarse o modificarse tal como se discutió para HRG-\alpha, HRG-\beta1, o HRG-\beta2.

Otra variante HRG es la HRG-\gamma (o gamma-heregulina). La \gamma-heregulina es cualquier secuencia polipeptídica que posea al menos una propiedad biológica de secuencia nativa \gamma-HRG con la SEC ID Nº:11. La propiedad biológica de esta variante es la misma que la citada anteriormente. La variante abarca no sólo el polipéptido aislado de una fuente de HRG-\gamma nativa, como las células MDA-MB-175 o de otra fuente, como especies de otros animales, sino también el polipéptido preparado por procedimientos recombinantes o sintéticos. También incluye las formas de variantes funcionales, las variantes alélicas, las isoformas naturales y los análogos de lo mismo. A veces, la HRG-\gamma es una "HRG-\gamma nativa" que hace referencia a un polipéptido HRG-\gamma endógeno que se ha aislado de un mamífero. La HRG-\gamma también puede ser una "HRG-\gamma de secuencia nativa" en la medida en que tiene la misma secuencia aminoacídica que la HRG-\gamma nativa (p.ej., la HRG-\gamma humana que se muestra en la Fig. 7A-7C). Las variantes de secuencia aminoacídica de la secuencia nativa se preparan introduciendo cambios nucleotídicos en el DNA de secuencia nativa, o mediante síntesis in vitro del polipéptido deseado. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, deleciones, o inserciones o sustituciones de residuos dentro de la secuencia aminoacídica que se muestra para la proteína humana en la Fig. 7A-7C, tal como se describió anteriormente para otra HRG. Para una obtener una construcción final, será realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para lograr una, siempre que dicha construcción final posea las características deseadas. Los cambios aminoacídicos también pueden alterar los procesos post-traduccionales de la secuencia nativa, como el cambio del número o posición de los sitios de O-glicosilación.

Otra variante es la referida al polipéptido como el factor derivado de neuronas sensoriales y motoras (SMDF), cuyas secuencias de ácido nucleico y aminoacídicas (SEC ID Nº: 13 y 14), que se muestran en la Fig. 8, pueden prepararse tal como se describe en la patente internacional WO 96/15244. Los polipéptidos SMDF de la invención presentan propiedades de unión a los receptores de HER2/HER3 y estimulación del crecimiento y diferenciación de las células epiteliales de forma similar a los polipéptidos HRG descritos anteriormente. Las variantes de secuencia aminoacídica de SMDF de secuencia nativa se preparan introduciendo los cambios de nucleótidos adecuados en la secuencia nativa del DNA de SMDF, o mediante síntesis in vitro del polipéptido SMDF, tal como se indicó anteriormente para otra HRG. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, deleciones, inserciones o sustituciones de residuos dentro de la secuencia aminoacídica de SMDF que se muestra en la Fig. 8. Para una obtener una construcción final, será realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para lograr una, siempre que dicha construcción final posea las características deseadas. Los cambios aminoacídicos también pueden alterar los procesos post-traduccionales de SMDF de secuencia nativa, como un cambio en el número o posición de los sitios de O-glicosilación.

Variantes adicionales incluyen polipéptidos en los que la variante tiene una sustitución aminoacídica en un residuo seleccionado y correspondiente a un residuo de la heregulina-\beta1 humana nativa de 645 aminoácidos seleccionada a partir de:

3

En una variación de esta realización, la sustitución aminoacídica no es una sustitución del residuo seleccionado por un residuo de un factor de crecimiento epitelial (EGF) correspondiente con el residuo seleccionado.

Otras variantes de heregulina-\beta1 incluyen una sustitución aminoacídica seleccionado a partir de los residuos siguientes:

4

En una variación de esta realización, la variante de heregulina incluye sustituciones de aminoácidos que presentan al menos un incremento de 50 veces en la afinidad por el receptor HER3, que también se acompaña por un incremento en la afinidad por el receptor HER4. La variante específica incluye los residuos siguientes:

5

Además de incluir una o más de las sustituciones aminoacídicas aquí descritas, la variante de heregulina puede tener o no otras modificaciones, como la sustitución aminoacídica, una inserción de al menos un aminoácido, una deleción de al menos un aminoácido, o una modificación química. Por ejemplo, la invención proporciona una variante de heregulina que es un fragmento de ésta. En una variación de esta realización, el fragmento incluye residuos correspondientes a una porción de la heregulina-\beta1 humana que se extiende desde aproximadamente el residuo 175 al residuo 230 (es decir, el dominio de tipo-EGF). Por ejemplo, el fragmento puede extenderse desde el residuo 177 al 244 y puede prepararse mediante ténicas recombinantes (rHRG\beta1-177-244).

Las variantes de DNA codificante de la secuencia aminoacídica de la HRG se preparan mediante procedimientos conocidos en la materia. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, el aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia aminoacídica que ocurren de forma natural), o la preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o mutagénesis dirigida), mutagénesis por PCR y la mutagénesis de casete de una versión variante o no de la HRG preparada con anterioridad. Estas técnicas pueden utilizar el ácido nucleico de la HRG (DNA o RNA) o el ácido nucleico complementario al ácido nucleico de HRG.

La mutagénesis mediada por oligonucleótidos es un procedimiento preferido para preparar las variantes de sustitución, deleción e inserción del DNA de HRG. Esta técnica es bien conocida en la materia tal como se describe por Adelman y col., DNA, 2:183 (1983). En resumen, se modifica el DNA de HRG hibridando un oligonucleótido que codifica la mutación deseada con un molde de DNA, en donde el molde es la forma de cadena sencilla de un plásmido o bacteriófago que contiene la secuencia de DNA nativa o inalterada de la HRG. Después de la hibridación, se utiliza una polimerasa de DNA para sintetizar una segunda cadena complementaria completa del molde, que en consecuencia incorporará el cebador oligonucleotídico y codificará la alteración seleccionada en el DNA de HRG.

En general, se utilizan oligonucleótidos de menos de 25 nucleótidos de longitud. Un oligonucleótido óptimo tendrá de 12 a 15 nucleótidos que sean completamente complementarios con el molde por cada lado del nucleótido codificante de la mutación. Ello asegura que el oligonucleótido hibridará adecuadamente con la molécula molde de DNA de cadena sencilla. Los oligonucleótidos se sintetizan fácilmente utilizando técnicas conocidas en la materia como las descritas por Crea y col., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:576, 1978).

El molde de DNA de cadena sencilla puede también generarse desnaturalizando el DNA del plásmido (u otro) de cadena doble mediante técnicas estándares.

Para la alteración de la secuencia de DNA nativo (para generar variantes de secuencia aminoacídica, por ejemplo), se hibrida el oligonucleótido a un molde de cadena sencilla en condiciones de hibridación adecuadas. Una enzima polimerizante de DNA, generalmente el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I, se añade para sintetizar la cadena complementaria del molde utilizando el oligonucleótido como cebador en la síntesis. De este modo se forma una molécula heterodúplex en la que una cadena de DNA codifica la forma mutada de HRG y la otra cadena (el molde original) codifica la forma nativa de la secuencia inalterada de HRG. La molécula heterodúplex se transforma a continuación en una célula huésped adecuada, generalmente una procariota como E. coli JM101. Una vez las células están crecidas, se siembran en placas de agarosa y se rastrean utilizando el oligonucleótido marcado radioactivamente con fosfato-P^{32} para identificar las colonias bacterianas que contienen el DNA mutado. La región mutada se extrae a continuación y se coloca en un vector adecuado para la producción de proteína, en general un vector de expresión del tipo utilizado para la transformación de un huésped adecuado.

El procedimiento descrito más arriba puede modificarse para crear una molécula de homodúplex, en la que ambas cadenas del plásmido contengan la mutación. Las modificaciones son las siguientes: el oligonucleótido de cadena sencilla se anilla al molde de cadena sencilla, tal como se describió anteriormente. Una mezcla de tres desoxiribonucleótidos, desoxiriboadenosina (dATP), desoxiriboguanosina (dGTP) y desoxiribotimidina (dTTP), se combina con un tio-desoxiribocitosina denominado dCTP-(aS) (que puede obtenerse de Amersham Corporation). Esta mezcla se añade al complejo molde-oligonucleótido. Tras la adición de la polimerasa de DNA, se genera una cadena de cDNA idéntica al molde con excepción de las bases mutadas. Además, esta nueva cadena de DNA contendrá dCTP-(aS) en lugar de dCTP, que sirve para protegerlo de la digestión con endonucleasas de restricción. Después de que la cadena molde del heterodúplex de cadena doble se melle con una enzima de restricción adecuada, se puede digerir la cadena molde con la nucleasa ExoIII u otra nucleasa adecuada pasada la región que contenga los sitios a mutar. A continuación, se para la reacción para dejar una molécula que sea parcialmente de cadena sencilla. Se forma así un homodúplex de DNA de cadena doble utilizando la polimerasa de DNA en presencia de los cuatro desoxiribonucleótidos trifosfatos, ATP y DNA ligasa. Esta molécula de homodúplex puede transformarse en una célula huésped adecuada como E. coli JM101, tal como se describió más arriba.

El DNA que codifica los mutantes de HRG con más de un aminoácido sustituido puede generarse de diversas maneras. Si los aminoácidos se localizan próximos unos de otros en la cadena polipeptídica, pueden mutarse simultáneamente utilizando un oligonucleótido que codifique para todos las sustituciones aminoacídicas deseadas. Si, al contrario, los aminoácidos se localizan a cierta distancia unos de otros (separados por más de 10 aminoácidos aproximadamente), es más difícil generar un oligonucleótido que codifique todos los cambios deseados. En su lugar, puede utilizarse uno de los dos procedimientos alternativos.

En el primer procedimiento, se genera un oligonucleótido independiente para cada sustitución de aminoácido. Los oligonucleótidos se anillan a continuación con el DNA molde de cadena sencilla simultáneamente y así la segunda cadena de DNA que se sintetiza a partir del molde codificará todas las sustituciones de aminoácidos deseadas.

El procedimiento alternativo implica dos o más tandas de mutagénesis para producir el mutante deseado. La primera tanda es tal como se describió para los mutantes sencillos: se utiliza el DNA de tipo salvaje para el molde y un oligonucleótidos que codifica la(s) primera(s) sustitución(es) de aminoácidos deseados se hibrida con el molde, generándose en consecuencia la molécula de DNA heterodúplex. La segunda tanda de mutagénesis utiliza el DNA producido en la primera tanta de mutagénesis como el molde. En consecuencia, este molde contiene una o más mutaciones. El oligonucleótido codificante de la(s) sustitución(es) aminoacídica adicional se hibrida con el molde, con lo que la cadena de DNA resultante codifica ahora para las mutaciones de ambas tandas de mutagénesis. Este DNA resultante puede utilizarse como un molde en una tercera tanda de mutagénesis, y así sucesivamente.

La mutagénesis por PCR también es adecuada para generar variantes aminoacídicas de HRG. Mientras que la descripción siguiente hace referencia al DNA, se entiende que la técnica también halle aplicación con RNA. La técnica de PCR hace referencia en general al siguiente procedimiento (véase, Erlich, supra, el capítulo de R. Higuchi, p. 61-70). Cuando se utiliza como material de inicio para una PCR, cantidades pequeñas de DNA molde, es posible utilizar cebadores que difieran ligeramente en la secuencia de la región correspondiente en el DNA molde, para generar cantidades relativamente grandes de un fragmento de DNA específico que difiera de la secuencia molde únicamente en aquellas posiciones donde los cebadores difieren del molde. Para introducir una mutación en un DNA plasmídico, se diseña uno de los cebadores para que solape con la posición de la mutación y contenga dicha mutación, la secuencia del otro cebador debe ser idéntica a un fragmento de la secuencia de la cadena opuesta del plásmido, aunque esta secuencia puede estar localizada en cualquier sitio del DNA plasmídico. Sin embargo, es preferible que la secuencia del segundo cebador se localice en los siguientes 200 nucleótidos, para que al final pueda secuenciarse fácilmente toda la región amplificada del DNA sintetizado con los dos cebadores. La amplificación por PCR utilizando una pareja de cebadores similares a la descrita más arriba resulta en una población de fragmentos de DNA que difiere en la posición de la mutación especificada por el cebador y posiblemente en otras posiciones, ya que en la reacción de copiado del molde se producen errores.

Si la proporción de molde respecto a producto es extremadamente baja, la gran mayoría de fragmentos de DNA producidos habrán incorporado la(s) mutación(es) deseada(s). Este producto se utiliza para sustituir la región correspondiente en el plásmido que sirvió como molde de PCR utilizando tecnología estándar del DNA. Las mutaciones en posiciones separadas pueden introducirse simultáneamente utilizando un segundo cebador, o realizando una segunda PCR con cebadores mutantes distintos y ligando los dos fragmentos de PCR resultantes con el fragmento del vector en una ligación de tres (o más etapas).

En un ejemplo específico de mutagénesis por PCR, se lineariza el DNA plasmídico molde (1 mg) mediante digestión con una endonucleasa de restricción que tenga una diana única en el DNA plasmídico fuera de la región a amplificar. Se añaden 100 ng del material anterior a la mezcla de PCR que contiene el tampón de PCR con los cuatro desoxinucleótidos trifosfatos incluidos en el equipo GENEAMP (de Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT y Emeryville, CA), y 25 pmoles de cada uno de los cebadores oligonucleotídicos hasta un volumen final de 50 ml. La mezcla de reacción se cubre con 35 ml de aceite mineral. La reacción se desnaturaliza durante 5 minutos a 100ºC, se coloca rápidamente en hielo y se añade 1 ml de DNA polimerasa de Thermus aquaticus (Taq) (5 unidades/ml, de Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT y Emeryville, CA) por debajo de la capa de aceite mineral. La mezcla de reacción se inserta en un Termociclador de DNA (de Perkin-Elmer Cetus) y se procede con el programa siguiente:

2 min a 55ºC

30 s a 72ºC, luego 19 ciclos de lo siguiente:

30 s a 94ºC

30 s a 55ºC y

30 s a 72ºC.

Al término del programa, el vial de la reacción se extrae del termociclador y la fase acuosa se transfiere a un nuevo vial, se realiza una extracción con fenol/cloroformo (50:50:vol), una precipitación con etanol y se extrae el DNA mediante procedimientos estándares. Este material se somete a continuación a tratamientos adecuados para la inserción en un vector.

Otro procedimiento para la preparación de variantes, la mutagénesis en casete, se basa en la técnica descrita por Wells y col., (Gene, 34:315, 1985). El material de partida es el plásmido (u otro vector) que comprende el DNA de la HRG a mutar. En primer lugar, se identifica el codón/codones en el DNA de HRG a mutar. Debe existir una sola diana de restricción en cada lado de la mutación identificada. Si no existieran las dianas de restricción, se pueden generar utilizando el procedimiento de la mutagénesis mediada por oligonucleótidos descrita anteriormente para introducirlos en localizaciones adecuadas en el DNA de HRG. Después de introducir las dianas de restricción en el plásmido, éste se digiere por dichas dianas para su linearización. A continuación, utilizando los procedimientos estándares, se sintetiza un oligonucleótido de doble cadena que codifica la secuencia de DNA entre ambas dianas de restricción pero con la mutación deseada. Las dos cadenas se sintetizan separadamente y luego se hibridan juntas mediante técnicas estándares. A este oligonucleótido de doble cadena se le denomina casete. Este casete se diseña con extremos 3' y 5' compatibles con los extremos del plásmido linearizado, de modo que pueda ser ligado directamente en el plásmido. Este plásmido contiene ahora la secuencia mutada del DNA de HRG.

C. Inserción del DNA en un vector de clonaje

El cDNA o el DNA genómico que codifica una HRG nativa o variante se inserta en un vector replicable para su posterior clonaje (amplificación del DNA) o para su expresión. Existen en la actualidad muchos vectores disponibles, cuya selección dependerá de: 1) si se ha de utilizar para la amplificación del DNA o la expresión; 2) el tamaño del DNA a insertar en el vector, y 3) la célula huésped a transformar con el vector. Cada vector contiene varios componentes dependiendo de su función (amplificación o expresión del DNA) y de la célula huésped para la cual es compatible. Los componentes del vector incluyen generalmente, sin estar limitados por ello, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento intensificador de la transcripción, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.

(I) Componente de secuencia señal

En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del DNA de HRG que se inserta en el vector. El DNA de la HRG nativa contiene probablemente una secuencia señal en el extremo amino-terminal (extremo 5' del DNA que codifica HRG) del polipéptido que se corta post-traduccionalmente para formar el ligando polipeptídico de HRG madura que se une al receptor HER2/HER3, aunque no se ha demostrado la presencia de una estructura señal convencional. La HRG nativa es secretada por las células pero permanece alojada en la membrana porque contiene un dominio transmembrana y una región citoplasmática en la región carboxi-terminal del polipéptido. En consecuencia, en una versión soluble de la HRG secretada, se deleciona el dominio carboxi-terminal de la molécula, incluyendo el dominio transmembrana. Esta variante truncada del polipéptido HRG podrá secretarse por las células siempre que el DNA de la variante truncada codifique una secuencia señal que sea reconocida por el huésped.

La HRG de la presente invención puede expresarse no sólo directamente, sino también como una fusión con un polipéptido heterólogo, preferentemente una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de corte específico en el extremo N- o C-terminal de la proteína madura o polipéptido. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del DNA de HRG que se inserta en el vector. Se incluyen dentro del ámbito de la presente invención las HRG con la secuencia señal nativa delecionada y sustituida por una secuencia señal heteróloga. La secuencia señal heteróloga seleccionada debería ser una señal que sea reconocida y procesada, es decir se corte, por una peptidasa señal de la célula huésped. En las células huésped procariotas, donde no se reconoce ni procesa la secuencia señal de HRG nativa, dicha secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo compuesto por la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, Ipp, o los líderes de la enterotoxina II termo-estable. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal de HRG nativa puede sustituirse por la invertasa de levadura, el factor alfa, o los líderes de la fosfatasa ácida. En la expresión en células de mamífero, la secuencia señal de HRG nativa es satisfactoria, aunque también son adecuadas otras secuencias señal de mamíferos.

(II) Origen del componente de replicación

Tanto los vectores de expresión como los de clonaje contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector sea replicable en una o más células seleccionadas. En general, en los vectores de clonaje esta secuencia permite la replicación del vector independientemente del DNA cromosómico del huésped e incluye los orígenes de replicación o las secuencias de replicación autónomas. Dichas secuencias son bien conocidas para muchas bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2m es adecuado para levaduras y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son de utilidad para los vectores de clonaje en células de mamífero. Por lo general, no es necesario el origen de replicación para los vectores de expresión en mamíferos (el origen SV40 se utiliza comúnmente sólo porque contiene el promotor temprano).

Muchos de los vectores de expresión son vectores "lanzadera", es decir, son capaces de replicarse en al menos una clase de organismo, pero pueden transfectarse en otro organismo para su expresión. Por ejemplo, un vector se clona en E. coli y luego el mismo vector se transfecta en levaduras o células de mamífero para la expresión aún cuando no sea capaz de replicarse independientemente del cromosoma de la célula huésped.

El DNA puede amplificarse mediante inserción en el genoma huésped. Ello se logra utilizando especies de Bacillus como huésped, por ejemplo, incluyendo en el vector una secuencia de DNA complementaria a una secuencia hallada en el DNA genómico de Bacillus. La transfección de Bacillus con este vector da como resultado la recombinación homóloga con el genoma y la inserción del DNA de HRG. Sin embargo, la recuperación del DNA genómico que codifica HRG es más compleja que la de un vector replicado exógenamente, porque se requiere la digestión con una enzima de restricción para excisar el DNA de HRG. El DNA puede amplificarse por PCR y transfectarse directamente en las células huésped sin ningún componente de replicación.

(III) Componente de selección génica

Los vectores de clonaje y expresión deben contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o el crecimiento de células transformadas en un medio de cultivo selectivo, por lo que las células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobreviven en el medio de cultivo. Genes de selección típicos son aquellos que codifican proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos o a otras toxinas, p.ej., la ampicilina, la neomicina, el metotrexato, o la tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles del medio, p.ej., el gen que codifica la racemasa D-alanina de Bacilli.

Un ejemplo de selección es la utilización de un fármaco para parar el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que se transformen satisfactoriamente con un gen heterólogo expresarán una proteína que les conferirá resistencia al fármaco y por ello sobrevivirán al régimen de selección. Ejemplos de dicha selección dominante incluyen la utilización de neomicina (Southern y col., J. Molec. Appl. Genet. 1:327-1982), el ácido micofenólico (Mulligan y col., Science 209:1422, 1980) o la higromicina (Sugden y col., Mol. Cell. Biol. 5:410-413, 1985). Los tres ejemplos dados anteriormente utilizan genes bacterianos bajo el control eucariota para proporcionar la resistencia al fármaco G418 o neomicina (geneticina), xpgt (ácido micofenólico), o higromicina, respectivamente.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para las células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para incorporar el ácido nucleico de HRG, como la dihidrofolato reductasa (DHFR) o la timidina quinasa. Los transformantes de células de mamífero se someten a una presión de selección donde únicamente los transformantes están adaptados para sobrevivir gracias a que contienen el gen marcador. La presión de selección se impone cultivando los transformantes en condiciones determinadas, en las que se cambia sucesivamente la concentración del agente de selección en el medio y por ello se induce la amplificación del gen de selección y del DNA que codifica la HRG. La amplificación es el proceso por el cual, genes con mayor demanda de producción de una proteína crítica para el crecimiento, se repiten en tándem en los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. En consecuencia, se sintetizan cantidades crecientes de HRG a partir del DNA amplificado.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican en primer lugar cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo del DHFR. Cuando se utiliza el DHFR de tipo salvaje, una célula huésped adecuada es la línea celular de ovario de hámster Chino (CHO) deficiente en actividad DHFR, preparada y crecida en cultivo tal como se describe por Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980. A continuación, las células transformadas se exponen a niveles crecientes de metotrexato, lo que conduce a la síntesis de copias múltiples del gen DHFR, y, consecuentemente, copias múltiples del otro componente de DNA que contiene los vectores de expresión, como el DNA que codifica la HRG. Esta técnica de amplificación puede utilizarse con cualquier huésped adecuado, p.ej., ATCC Nº CCL61 CHO-K1, independientemente de la presencia de DHFR endógeno, si se utiliza, por ejemplo, un gen mutante DHFR que sea altamente resistente al MTx (patente europea 117.060). Alternativamente, las células huésped (en particular los huéspedes de tipo salvaje que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con las secuencias de DNA que codifican HRG, la proteína DHFR de tipo salvaje, y otro marcador seleccionable como la aminoglicósido 3'-fosfotransferasa (APH) puede seleccionarse por crecimiento celular en medio que contenga un agente de selección para el marcador seleccionable como un antibiótico aminoglicósido, p.ej., kanamicina, neomicina, o G418 (véase la patente americana U.S. 4.965.199).

Un gen de selección adecuado para utilizar con levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levaduras YRp7 (Stinchcomb y col., Nature, 282: 39, 1979; Kingsman y col., Gene, 7:141, 1979; o Tschemper y col., Gene, 10:157 (1980). El gen trp1 proporciona un marcador seleccionable para una cepa mutante de levaduras carentes de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC Nº 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12, 1977). La presencia de la lesión trp1 en el genoma de la célula huésped de levaduras proporciona un entorno eficaz para detectar la transformación por el crecimiento en ausencia de triptófano. De modo similar, las cepas de levadura Leu2-deficientes (ATCC 20.622 o 38.626) se complementan con plásmidos conocidos que contienen el gen Leu2.

(IV) Componente promotor

Los vectores de expresión y clonaje contienen generalmente un promotor que es reconocido por los organismos huésped y está unido operativamente al ácido nucleico de HRG. Los promotores son secuencias no traducidas localizadas cadena arriba (5') del codón de inicio de un gen estructural (generalmente en unas 100 a 1000 pb) que controlan la transcripción y la traducción de una secuencia de ácido nucleico determinada, como la HRG a la que está unida operativamente. Dichos promotores se agrupan generalmente en dos clases, los inducibles y los constitutivos. Los promotores inducibles son promotores que inician niveles elevados de transcripción a partir del DNA que está bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, p.ej., la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. En la actualidad, se conoce un gran número de promotores que son reconocidos por diversas células huésped potenciales bien conocidas. Estos promotores están unidos operativamente al DNA que codifica la HRG tras haber eliminado el promotor de la fuente de DNA mediante digestión con enzimas de restricción e insertado la secuencia promotora aislada en el vector. Para la amplificación y/o expresión directa del DNA de HRG, se pueden utilizar tanto la secuencia promotora de la HRG nativa como cualquiera de los muchos promotores heterólogos existentes. Sin embargo, son preferibles los promotores heterólogos, ya que permiten una transcripción mayor y rendimientos superiores de la HRG expresada en comparación con el promotor de la HRG nativa.

Los promotores adecuados para utilizar con huéspedes procariotas incluyen los sistemas de promotores de la \beta-lactamasa y la lactosa (Chang y col., Nautre, 275:615, 1978; Goeddel y col., Nature 281:544, 1979), la fosfatasa alcalina, un sistema de promotor del triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057, 1980 y la patente europea EP 36.776), tPA (patente americana U.S. 5.641.655) y los promotores híbridos como el promotor tac (deBoer y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25, 1983). Sin embargo, también son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias nucleotídicas se han publicado, con lo que se facilita al experto en la materia su ligación con el DNA que codifica la HRG (Siebenlist y col., Cell 20:269, 1980) utilizando engarces o adaptadores para suministrar cualquier diana de restricción requerida. Los promotores para utilizar en sistemas bacterianos contienen generalmente una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al DNA que codifica la HRG.

Las secuencias promotoras para utilizar con huéspedes de levaduras incluyen los promotores de la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J. Biol. Chem., 255:2073, 1980) o de otras enzimas glicolíticas (Hess y col., J.Adv. Enzyme Reg 7:149, 1968; y Holland, Biochemistry 17:4900, 1978), como la enolasa, la giceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructoquinasa, la glucosa-6-fosfato isomerasa, la 3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato quinasa, la triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, como los promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de inducir una transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, la isocitocromo C, la fosfatasa ácida, las enzimas degradadoras asociadas con el metabolismo del nitrógeno, la metalotioneína, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y las enzimas responsables de la utilización de la maltosa y la galactosa. Los vectores y promotores adecuados para utilizar en la expresión de levaduras se describen por Hitzeman y col., patente europea EP 73.657A. Las secuencias intensificadoras de la transcripción de levaduras también se utilizan de forma ventajosa con los promotores de levaduras.

Se conocen las secuencias promotoras de eucariotas. En general, todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada a aproximadamente 25-30 bases cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción. Otra secuencia a 70 a 80 bases cadena arriba del codón de inicio de la transcripción de muchos genes es una región CXCAAT, en donde X puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de muchos genes eucariotas se halla una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de una cola poliA en el extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan de forma adecuada en los vectores de expresión de mamíferos.

La transcripción del gen HRG a partir de vectores en células huésped de mamífero se controla mediante promotores obtenidos de los genomas de virus como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar (patente inglesa UK 2.211.504, publicada el 5 de julio de 1989), los adenovirus (como el adenovirus 2), el virus del papiloma, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y más preferentemente el Simian Virus 40 (SV40), de promotores heterólogos de mamífero, p.ej., el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, de los promotores de las proteína de choque térmico y del promotor asociado normalmente con la secuencia HRG, siempre que los promotores sean compatibles con los sistemas de células huéspedes.

Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen de forma conveniente como un fragmento de restricción que también contiene el origen de replicación del virus SV40 (Fiers y col., Nature 273:113 (1978); Mulligan y Berg, Science, 209:1422-1427 (1980); Pavlakis y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402 (1981)). El promotor inmediatamente temprano del citomegalovirus humano se obtiene de forma adecuada como un fragmento de restricción HindIII (Greenaway y col., Gene, 18:355-360 (1982)). Un sistema para la expresión del DNA en huéspedes mamíferos utilizando el virus del papiloma bovino como un vector se describe en la patente americana U.S. 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la patente americana U.S. 4.601.978. Véase también Gray y col., Nature, 295:503-508 (1982) sobre la expresión del cDNA que codifica el interferón inmune en células de mono; Reyes y col., Nature, 297:598-601 (1982) sobre la expresión del cDNA del interferón-\beta humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina quinasa del virus herpes simplex; Canaani y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:5166-5170 (1982) sobre la expresión del gen del interferón-\beta1 humano en células de ratón y conejo en cultivo; y Gorman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777-6781 (1982) sobre la expresión de secuencias CAT bacterianas en células de riñón de mono CV-1, fibroblastos embrionales de pollo, células de ovario de hámster chino, células HeLa y células de ratón NIH-3T3 utilizando como promotor la secuencia de repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous.

(v) Componente del elemento intensificador de la transcripción

La transcripción de un DNA que codifica la HRG de la presente invención por eucariotas superiores se aumenta a menudo insertando una secuencia intensificadora de la transcripción en el vector. Estas secuencias son elementos de actuación en cis del DNA, generalmente a aproximadamente 10-300 pb, que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Las secuencias intensificadoras de la transcripción tienen una posición y orientación relativamente independiente y se han hallado en 5' (Laimins y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993, 1981) y 3' (Lusky y col., Mol. Cell Biol., 3:1108, 1983) de la unidad de transcripción, dentro de un intrón, así como dentro de la propia secuencia codificante (Osborne y col., Mol. Cell. Bio., 4:1293, 1984). En la actualidad, se conocen muchas secuencias intensificadoras de la transcripción de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). De forma característica, sin embargo, se utilizará una secuencia intensificadora de la transcripción de un virus de células eucariotas. Los ejemplos incluyen la secuencia intensificadora de la transcripción de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), la secuencia intensificadora de la transcripción del promotor temprano del citomegalovirus, la secuencia intensificadora de la transcripción del polioma en el lado tardío del origen de replicación y las secuencias intensificadoras de la transcripción de adenovirus (véase también Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) sobre elementos intensificadores de la activación de promotores eucariotas). La secuencia intensificadora de la transcripción se puede ayustar en el vector en una posición 5' o 3' al DNA de HRG, pero se localiza preferentemente en 5' del promotor.

(vi) Componente de finalización de la transcripción

Los vectores de expresión utilizados en las células huésped eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) contendrán también secuencias necesarias para la finalización de la transcripción y para la estabilización del mRNA. Dichas secuencias están disponibles comúnmente de las regiones no traducidas 5', y ocasionalmente 3', de los DNAs o cDNAs eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mRNA que codifica la HRG. Las regiones 3' no traducidas también incluyen los sitios de finalización de la transcripción.

Para la construcción de vectores adecuados que contengan uno o más de los anteriores componentes enunciados, las secuencias codificantes y control deseadas, se utilizan técnicas de ligación estándar. Los plásmidos aislados, o los fragmentos de DNA se cortan, se recortan sus extremos y se religan en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.

En el análisis para confirmar que las secuencias de los plásmidos construidos son correctas, se utilizan mezclas de ligación para transformar la cepa de E. coli K12 294 (ATCC 31.446) y los transformantes con éxito se seleccionan por su resistencia a ampicilina o tetraciclina, según sea el caso. A continuación, se amplifican los plásmidos de los transformantes, se analizan mediante digestión con endonucleasas de restricción y/o se secuencian por el procedimiento de Messing y col., Nucleic Acids Res. 9:309 (1981) o por el procedimiento de Maxam y Col., Methdos in Enzymology 65:499 (1980).

En la práctica de la presente invención, son de especial interés los vectores de expresión que proporcionan la expresión transitoria del DNA que codifica la HRG en las células de mamífero. En general, la expresión transitoria implica la utilización de un vector de expresión que sea capaz de replicarse de forma eficaz, de modo que la célula huésped acumule muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetice niveles elevados de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión. Los sistemas de expresión transitorios, comprenden un vector de expresión y una célula huésped adecuada, que permiten la identificación positiva conveniente de los polipéptidos codificados por el DNA clonado, así como el rastreo rápido de dichos polipéptidos por sus propiedades biológicas o fisiológicas deseadas. Por ello, los sistemas de expresión transitoria son de especial interés en la presente invención con el propósito de identificar análogos y variantes de HRG que tengan una actividad similar a HRG. Dicho sistema de expresión transitoria se describe en la patente europea americana U.S. 5.024.939.

Otros procedimientos, vectores y células huésped adecuadas para la síntesis de HRG en el cultivo de células de vertebrados se describen en Gething y col., Nature 293:620-625; Mantei y col., Nature, 281:40-46, 1979; Levinson y col., patentes europeas EP 117.060 y EP 117.058. Un plásmido de expresión de utilidad para la expresión en el cultivo de células de mamífero de HRG es el pRK5 (patente europea EP 307.247).

D. Selección y transformación de células huésped

Las células huésped adecuadas para el clonaje o la expresión de los vectores de la presente invención son las procariotas, levaduras o eucariotas superiores, tal como se describió anteriormente. Las procariotas adecuadas incluyen las eubacterias, como los organismos Gram-negativos o los Gram-positivos, por ejemplo, E. coli, Bacilli como B. subtilis, Pseudomonas species como P. aeruginosa, Salmonella typhimurium o Serratia marcescans. Un huésped de clonaje preferido de E. coli es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque también son adecuadas otras cepas como E. coliB, E. coli 1776 (ATCC 31.537) y E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes. Preferentemente, la célula huésped debería secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Alternativamente, son adecuados los procedimientos in vitro de clonaje, p.ej., la PCR u otras reacciones de la polimerasa de ácidos nucleicos.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas como los hongos filamentosos o las levaduras son huéspedes adecuados para los vectores que codifican la HRG. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura del pan, es el más utilizado de entre los huéspedes eucariotas inferiores. Sin embargo, otros géneros, especies y cepas también están generalmente disponibles y son de utilidad en la presente invención, como Schizosaccharomyces pombe (Beach u Nurse, 249:140 (1981); patente europea EP 139.383, publicada el 2 de mayo de 1985), huéspedes de Kluyveromyces (patente americana U.S.S.N. 4.943.529) como por ejemplo K. lactis (Louvencourt y col., J. Bacteriol, 737 (1983); K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermorolerans y K. marxianus, yarrowia (patente europea EP 402.226); Pichia pastoris (patente europea EP 183.070), Streekrishna y col., J. Basic Microbiol. 28:265-278 (1988); Candida, Trichoderma reesia (patente europea EP 244.234); Neurospora crassa (Case y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979) y hongos filamentosos como Neurospora, Penicillium, Tolypoctadium (patente internacional WO 91/00357, publicada el 10 de enero de 1991) y huéspedes de Aspergillus como A. nidulans (Ballance y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983); Tilburn y col., Gene 26:205-221 (1983); Yelton y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 (1984) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J., 4:475-479 (1985)).

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Las células huésped adecuadas para la expresión del polipéptido HRG glicosilado provienen de organismos multicelulares. Dichas células huésped son capaces de realizar un procesamiento complejo y de presentar actividades de glicosilación. En principio, cualquier eucariota superior es adecuada para trabajar, bien sea en cultivo de vertebrados o invertebrados. Ejemplos de células de invertebrados incluyen las células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes de baculovirus y las correspondientes células huésped de insectos permisivas como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori (ver por ejemplo, Luckow y col., Biol Technology, 6:47-55 (1988); Miller y col., in Genetic Engineering, Setlow, JK y col., eds., Vol 8 (Plenum Publishing, 1986), pág. 277-279; y Maeda y col., Nature, 315:592-594 (1985)). Varias de estas cepas víricas son de disponibilidad pública, p.ej., la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombix mori NPV, pudiéndose utilizar dichos virus tal como se describe en la presente invención, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. También pueden utilizarse como huéspedes, los cultivos de plantas del algodón, el maíz, la patata, la soja, la petunia, el tomate y el tabaco. En general, las células de plantas se transfectan mediante incubación con ciertas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, previamente manipulada para contener el DNA de HRG. Durante la incubación del cultivo de células vegetales con A. tumefaciens, el DNA que codifica HRG se transfiere a la célula vegetal, de modo que ésta se transfecta y en condiciones adecuadas expresará el DNA de HRG. Además, también están disponibles secuencias reguladoras y secuencias señal compatibles con las células vegetales, como el promotor y las secuencias de señalización de la sintasa nopalina (Depicker y col., J. Mol. Appl. Gen., 1:561 (1982)). Además, los segmentos del DNA aislados de la región cadena arriba del gen T-DNA 780 son capaces de activar, o aumentar los niveles de transcripción de los genes expresables en plantas en el tejido vegetal que contiene el DNA recombinante (véase la patente europea EP 321.196, publicada el 21 de junio de 1989).

Sin embargo, se ha prestado un interés mucho mayor a las células de vertebrados, con lo que la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento de rutina en los últimos años (Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patterson, ed. (1973)). Ejemplos de líneas de células huésped de mamíferos son la línea CV1 de riñón de mono transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en un cultivo en suspensión, Graham y col., J. Gen Virol., 36:59, 1977); células de riñón de bebé hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO 76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical (HELA, ATCC CCL2); células de riñón canino (MDCK; ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humanas (W138, ATCC CCL75); células hepáticas humanas (HepG2, HB 8065); células de tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea celular de hepatoma humano (Hep G2). Las células huésped preferidas son las embrionarias humanas 293 y las células de ovario de hámster chino.

Las células huésped se transfectan y transforman preferentemente con los vectores de expresión o clonaje de la presente invención descritos anteriormente y se cultivan en medios con nutrientes convencionales modificados de forma adecuada para la inducción de promotores, selección de transformantes o la amplificación de los genes codificantes de las secuencias deseadas.

La transfección hace referencia a la incorporación de un vector de expresión por una célula huésped independientemente de que se exprese o no cualquier secuencia codificante. Se conocen numerosos procedimientos de transfección en la materia, por ejemplo, el procedimiento del CaPO_{4} y la electroporación. En general, se reconoce que la transfección ha sido satisfactoria cuando se tiene cualquier indicación de que el vector es operativo dentro de la célula huésped.

La transformación significa la introducción del DNA en un organismo para que dicho DNA se replicque, bien como elemento extracromosómico o mediante integración cromosómica. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándares adecuadas a dichas células. El tratamiento del calcio utiliza el cloruro cálcico, tal como se describe en la sección 1.82 de Sambrook y col., supra, se utiliza generalmente para procariotas u otras células que contienen barreras esenciales de pared celular. La infección con Agrobacterium tumefaciens se utiliza para la transformación de ciertas células vegetales, tal como se describió por Shaw y col., Gene, 23:315 (1983) y la patente internacional WO 89/0589, publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamífero sin dichas paredes celulares, es preferible el procedimiento del fosfato cálcico descrito en las secciones 16.30-16.37 de Sambrook y col., supra. Los aspectos generales de las transformaciones de sistemas de células huésped de mamíferos se han descrito en Axel en la patente americana U.S. 4.399.216, publicada el 16 de agosto de 1983. Las transformaciones en levaduras se llevan a cabo por lo general de acuerdo con el procedimiento de Van Sollingen y col., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, también se pueden utilizar otros procedimientos para la introducción de DNA en las células como la inyección nuclear, la electroporación o la fusión de protoplastos.

E. Cultivo de células huésped

Las células procariotas utilizadas para producir el polipéptido HRG de la presente invención se cultivan en un medio adecuado tal como se describe en general por Sambrook y col., supra.

Las células huésped de mamíferos utilizadas para producir la HRG de esta invención pueden cultivarse en muy diversos medios. Son adecuados para el cultivo de células huésped los medios disponibles comercialmente como el Ham F10 (Sigma), el Minimal Essential Medium (MEM, Sigma), el jRPMI-1640 (Sigma) y el Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma). Además, cualquier medio de los descritos por Ham y Wallace, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes y Sato, Anal. Biochem. 102:255 (1980), las patentes americanas U.S. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; o 4.560.655; las patentes internacionales WO 90/03430; WO 87/00195 y la patente americana U.S. Re. 30.085 o la U.S. 5.122.469 pueden utilizarse como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede suplementarse si fuera necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (como la insulina, la transferrina o el factor de crecimiento epitelial), sales (como el cloruro sódico, el calcio, el magnesio y el fosfato), tampones (como el HEPES), nucleósidos (como la adenosina y la timidina), antibióticos (como el fármaco Gentamicina^{TM}), oligoelementos (definidos como compuestos orgánicos generalmente presentes a concentraciones finales del orden micromolar) y glucosa o cualquier otra fuente de energía equivalente. También se puede incluir cualquier otro suplemento a concentraciones adecuadas, que será conocido por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, como la temperatura, pH y otras, son las previamente utilizadas por las células huésped seleccionadas para la expresión y serán evidentes a un experto en la materia.

Las células huésped referidas en esta descripción abarcan las células en un cultivo in vitro, así como las células que se hallan dentro de un animal huésped.

Además, se prevé que la HRG de esta invención pueda producirse mediante recombinación homóloga, o mediante procedimientos de producción recombinante utilizando elementos control introducidos en las células que contienen el DNA que codifica la HRG y actualmente en utilización. Por ejemplo, se inserta un elemento promotor/secuencia intensificadora de la transcripción potente, un supresor o un elemento modulador de la transcripción exógena en el genoma de la célula huésped deseada a proximidad y orientación suficientes para modificar la transcripción del DNA que codifica la HRG deseada. El elemento control no codifica la HRG de la presente invención, pero el DNA está presente en el genoma de la célula huésped. A continuación, se rastrean las células que generen la HRG de la presente invención, o presenten niveles aumentados o disminuidos de expresión, según se desee.

F. Detección de la amplificación/expresión génica

Se puede cuantificar directamente la amplificación y/o expresión génicas en una muestra, por ejemplo, mediante transferencia de Southern convencional, transferencia de Northern para cuantificar la transcripción del mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), transferencia de mancha (análisis de DNA) o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada adecuadamente basada en las secuencias proporcionadas aquí. Se pueden utilizar diversos marcajes, más comúnmente los radioisótopos, en particular el P^{32}. Sin embargo, también se pueden utilizar otras técnicas, como la utilización de nucleótidos modificados con biotina para su introducción en un polinucleótido. La biotina se utiliza a continuación como el sitio de unión de la avidina, o de los anticuerpos que pueden marcarse con una gran variedad de marcajes, como los radionúclidos, los fluorescentes, las enzimas o similares. Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos que reconozcan dúplex específicos, incluyendo dúplex de DNA, dúplex de RNA y dúplex híbridos de DNA-RNA o dúplex de DNA-proteína. Los anticuerpos a su vez se pueden marcar y el ensayo se puede llevar a cabo si el dúplex está unido a una superficie. De este modo, se puede detectar la presencia del anticuerpo unido al dúplex después de la formación del dúplex en la superficie.

Alternativamente, la expresión génica se puede cuantificar mediante procedimientos inmunológicos, como la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido y del ensayo del cultivo de células o de fluidos corporales, con el fin de cuantificar directamente la expresión del producto génico. Para las técnicas de tinción inmunohistoquímicas, la muestra celular se prepara normalmente mediante deshidratación y fijación, seguido por la reacción con anticuerpos específicos para el producto del gen acoplado si los marcajes son visualmente detectables como marcajes enzimáticos, marcajes fluorescentes, marcajes luminiscentes y similares. Una técnica de tinción particularmente sensible y adecuada para utilizar en la presente invención se describe por Hsu y col., Am. J. Clin. Path., 75:734-738 (1980).

Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de muestras de fluidos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden prepararse en cualquier mamífero. De forma adecuada, los anticuerpos pueden prepararse contra un polipéptido HRG o contra un péptido sintético basado en las secuencias del DNA proporcionadas aquí, tal como se describe más adelante.

G. Purificación de los polipéptidos de heregulina

La HRG se recupera de una fracción de membrana celular. Alternativamente, un fragmento de HRG soluble, cortado proteolíticamente o expresado de forma truncada se recupera del medio de cultivo como un polipéptido soluble. La HRG se recupera de los lisados de células huéspedes si se expresa directamente sin una secuencia señal.

Si la HRG se expresa en una célula recombinante distinta a la de origen humano, la HRG estará completamente libre de proteínas o polipéptidos de origen humano. Sin embargo, es deseable purificar la HRG de proteínas o polipéptidos celulares recombinantes para obtener preparaciones esencialmente homogéneas como la HRG. En una primera etapa, el medio de cultivo o lisado se centrifuga para eliminar los restos celulares y a continuación, se separan las fracciones de membrana y proteínas solubles. La HRG se purifica de la fracción de proteínas solubles (que requiere la presencia de una proteasa) y de la fracción de membranas del lisado del cultivo, dependiendo de que la HRG esté unida o no a la membrana. Los procedimientos siguientes son ejemplos adecuados de procedimientos de purificación: fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice, heparina-Sepharose o una resina de intercambio catiónico como la DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico; y filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75.

Las variantes de HRG en donde los residuos se delecionan, insertan o sustituyen se recuperan de la misma manera que la HRG nativa, teniendo en cuenta cualquier cambio esencial en las propiedades ocasionadas por la variación. Por ejemplo, la preparación de una fusión HRG con otra proteína o polipéptido, p.ej., un antígeno viral o bacteriano, facilita la purificación, ya que puede utilizarse una columna de inmunoafinidad que contenga el anticuerpo contra el antígeno para adsorber la fusión. Se pueden utilizar columnas de inmunoafinidad, como una columna anti-HRG policlonal de conejo para adsorber la variante HRG, uniéndola por lo menos a uno de los epitopos inmunes restantes. Un inhibidor de proteasa como el fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) también puede ser útil para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación y pueden incluirse antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes fortuitos. Un experto en la materia apreciará si los procedimientos de purificación adecuados para la HRG nativa necesitan modificarse para ajustar los cambios en el carácter de las variantes HRG, o después de la expresión en un cultivo de células recombinantes.

H. Modificaciones covalentes de HRG

Las modificaciones covalentes de los polipéptidos de HRG se incluyen dentro del ámbito de la presente invención. Opcionalmente, se modifican covalentemente tanto la HRG nativa como sus variantes de secuencia aminoacídica. Un tipo de modificación covalente, incluida dentro del ámbito de esta invención, es un fragmento polipeptídico de HRG. Los fragmentos de HRG, como HRG-GDF, que tienen hasta 40 residuos aminoacídicos se preparan de forma conveniente mediante síntesis química, o mediante corte enzimático o químico del polipéptido HRG de longitud completa, o del polipéptido variante de HRG. En la molécula, se introducen otros tipos de modificaciones covalentes de HRG, o de sus fragmentos, haciendo reaccionar residuos aminoacídicos diana de HRG, o fragmentos de lo mismo con un agente de derivación orgánico capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas de los residuos N- o C-terminal.

Los residuos cisteinil reaccionan más frecuentemente con los \alpha-haloacetatos (y las correspondientes aminas), como el ácido cloroacético o la cloroacetamida para producir derivados de carboximetil o carboximidometil. Los residuos cisteinil también se derivan mediante reacción con bromotrifluoroacetona, ácido \alpha-bromo-\beta(5-imidozoil)propiónico, cloroacetil fosfato, N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2-piridil disulfuro, metil 2-piridil disulfuro, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Los residuos histidil se derivan mediante reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0, porque este agente es relativamente específico para la cadena lateral histidil. También es útil el para-bromofenacil bromuro; la reacción se realiza preferentemente en cacodilato sódico 0,1 M a pH 6,0.

Los residuos lisinil y amino terminales se hacen reaccionar con ácido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivación con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos lisinil. Otros agentes adecuados para la derivación de residuos con grupso \alpha-amino incluyen los imidoésteres como el metil picolimidato; el piridoxal fosfato; el piridoxal; el cloroborohidruro; el ácido trinitobencenosulfónico; la O-metilisourea; la 2,4-pentanediona; y la reacción de transaminasas catalizada con glioxilato.

Los residuos arginil se modifican mediante reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos se hallan el fenilglioxal, la 2,3-butanediona, la 1,2-ciclohexanedina y la nihidrina. La derivación de residuos arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al elevado pKa del grupo funcional de guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina así como con el grupo épsilon-amina de la arginina.

La modificación específica de residuos tirosil puede realizarse, introduciendo marcajes espectrales en los residuos tirosil mediante reacción con compuestos de diazonio aromático de tetranitrometano. Se utilizan más frecuentemente el N-acetilimidizol y el tetrametano para formar especies O-acetil tirosil y derivados 3-nitro, respectivamente. Los residuos tirosil se yodan con I^{125} o I^{131} para preparar proteínas marcadas para utilizar en el radioinmunoensayo, siendo adecuado el procedimiento de cloramina T descrito anteriormente.

Los grupos laterales carboxil (aspartil o glutamil) se modifican selectivamente mediante reacción con carbodiimidas (R'-N=C=N-R'), en donde R y R' son diferentes grupos alquil, como el 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil) carbodiimida o el 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilfenil) carbodiimida. Además, los residuos aspartil y glutamil se convierten en asparraguinil y glutamil reaccionándolos con iones amonio.

La derivación con agentes bifuncionales es útil para la unión de HRG a una matriz soporte insoluble en agua o a una superficie a utilizar en un procedimiento de purificación de anticuerpos anti-HRG y vice versa. Los agentes de unión utilizados comúnmente incluyen, p.ej., la 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, el glutaraldehido, los ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, los ésteres con el ácido 4-azidosalicílico, los imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidil como el 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato) y las maleimidas bifuncionales como la bis-N-maleimida-1,8-octano. Los agentes de derivación como el metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato producen intermediarios fotoactivables que son capaces de formar uniones en presencia de la luz. Alternativamente, las matrices reactivas insolubles en agua como los carbohidratos activados con bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en las patentes americanas U.S. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537 y 4.330.440 se utilizan para la inmovilización de proteínas.

Los residuos glutaminil y asparraguinil se desaminan frecuentemente en los residuos correspondientes glutamil y aspartil. Alternativamente, estos residuos se desaminan en condiciones ligeramente acídicas. Cualquier forma de estos residuos se halla dentro del ámbito de la presente invención.

Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilos de residuos seril o treonil, la metilación de grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins:Structure and Molecular Properties, WH. Freeman & Co., San Francisco, pag. 79-86 (1983), la acetilación del grupo amino N-terminal y la amidación del grupo carboxilo C-terminal.

La HRG se fusiona opcionalmente con un polipéptido heterólogo a HRG. El polipéptido heterólogo es opcionalmente una secuencia de anclaje como la hallada en el factor de aceleración de la desintegración (DAF); una proteína de la cubierta de un fago, por ejemplo las proteínas de los genes III u VIII de M13. Estos polipéptidos heterólogos están unidos covalentemente a HRG a través de cadenas laterales o por los residuos terminales.

La HRG también se modifica covalentemente alterando su patrón nativo de glicosilación. En estas realizaciones, uno o más sustituyentes de carbohidratos se modifican añadiendo, eliminando o variando los componentes monosacáridos en un sitio determinado, o mediante la modificación de residuos en la HRG, de modo que se añaden o delecionan dichos sitios de glicosilación.

La glicosilación de polipéptidos, típicamente, está ligada a N- u O-. Ligada a N-, o N-glicosilación, hace referencia a la unión de la porción de carbohidratos a la cadena lateral de un residuo de asparragina. Las secuencias tri-peptídicas asparragina-X-serina y asparragina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido a excepción de la prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de la asparragina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio potencial de glicosilación. La O-glicosilación hace referencia a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa, a un ácido hidroxiamino, más comúnmente la serina o la treonina, aunque también puede utilizarse la 5-hidroxiprolina o la 5-hidroxilisina.

Los sitios de glicosilación se añaden a la HRG mediante alteración de su secuencia aminoacídica, a fin de contener una o más de las secuencias tripeptídicas anteriormente descritas (para sitios de N-glicosilación). La alteración también se puede realizar mediante adición de, o sustitución por, uno o más residuos serina o treonina a la HRG (para sitios de O-glicosilación). Para mayor facilidad, la HRG se modifica preferentemente mediante cambios a nivel del DNA, en particular mutando el DNA que codifica para la HRG en las bases preseleccionadas y generando así los codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

El acoplamiento químico o enzimático de los glicósidos a la HRG incrementa el número de sustituyentes de carbohidratos. Estos procedimientos son ventajosos ya que no requieren la producción del polipéptido en una célula huésped capaz de realizar N- u O-glicosilación. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el azúcar (o azúcares) puede unirse a (a) una arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfidrilos libres como los de la cisteína, (d) grupos hidroxilo libres como los de la serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos como los de la fenilalanina, la tirosina, o el triptófano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos procedimientos se describen en la patente internacional WO 87/05330, publicada el 11 de setiembre y en Aplin y Wriston (CRC Crit. REv. Biochem., pag. 259-306 (1981)).

Las porciones de carbohidrato presentes en una HRG también se eliminan química o enzimáticamente. La desglicosilación química requiere la exposición del polipéptido al compuesto de ácido trifluorometansulfónico, o a un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado el corte de todos o la mayoría de azúcares, excepto del azúcar de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), dejando el polipéptido intacto. La desglicosilación química se describe por Hakimuddin y col. (Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)) y por Edge y col., (Anal. Biochem., 118:131 (1981)). Las porciones de carbohidrato se eliminan de la HRG mediante diversas endo- y exo- glicosidasas, tal como se describe por Thotakura y col., (Meth. Enzymol., 138:350 (1987)).

La glicosilación también se suprime por tunicamicina, tal como se describe por Duskin y col., (J. Biol. Chem., 257:3105 (1982)). La tunicamicina bloquea la formación de las uniones proteína-N-glicósido.

La HRG también se modifica mediante unión de la HRG a diversos polímeros no proteicos, p.ej., el polietilén glicol, el propilén glicol o los polioxialquilenos, de la forma descrita en las patentes americanas U.S. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

Un modo preferido para aumentar la vida media circulante in vivo de la HRG no unida a membrana es conjugarla a un polímero que le confiera una vida media prolongada, como el polietilén glicol (PEG). (Maxfield y col., Polymer 16, 505-509 (1975); Bailey, F.E. y col., en Nonionic Surfactants (Schick, MJ, ed.) pag. 794-821 (1967); Abuchowski A. y col., J. Biol. Chem., 252:3582-3586 (1977); Abuchowski A. y col., Cancer Biochem Biophys. 7:175-186 (1984); Katre, N.V. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 1487-1491 (1987); Goodoon R y col., Bio Technology, 8:343-346, (1990). También se ha descrito que la conjugación con PEG reduce la inmunogenicidad y la toxicidad (Abuchowski A. y col., J. Biol. Chem., 252:3582-3586 (1977)).

La HRG también se inmoviliza en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli-[metilmetacilato], respectivamente), en sistemas de liberación del fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington Pharmaceutical Sciences, 16ª ed., Oslo, A., Ed. (1980).

Los expertos en la materia serán capaces de rastrear variantes con el fin de seleccionar la variante óptima para el propósito deseado. Por ejemplo, un cambio en el carácter inmunológico de HRG, como un cambio en la afinidad por un antígeno dado o por el receptor HER2, se cuantifica mediante un inmunoensayo de tipo competitivo utilizando un estándar o control como p.ej., una HRG nativa (en particular la HRG-GFD nativa). También se ensayan, mediante procedimientos bien conocidos en la materia, otras modificaciones potenciales de las propiedades de la proteína o del polipéptido, como la estabilidad redox o térmica, la hidrofobicidad, la susceptibilidad a la degradación proteolítica, la estabilidad en el cultivo de células recombinantes, o la tendencia a agregarse con vehículos o en multímeros.

2. Composiciones terapéuticas, administración y utilización de Heregulinas

La HRG se utiliza en la presente invención para inducir el crecimiento epitelial, por ejemplo el crecimiento, la proliferación y diferenciación de células epiteliales de pulmón, y para aumentar la producción de proteína A tensoactiva por las células pulmonares. Estos efectos permiten el tratamiento con el medicamento preparado de acuerdo con la presente invención de enfermedades asociadas con la lesión tisular, por ejemplo, la enfermedad de obstrucción pulmonar crónica (EPOC), incluyendo los subtipos de lo mismo como la bronquitis crónica, el enfisema, el asma, etc., las enfermedades pulmonares neonatales incluyendo el síndrome de la dificultad respiratoria neonatal, el síndrome de aspiración del meconio, la enfermedad pulmonar crónica del neonato, la hernia diafragmática congénita, etc., las lesiones agudas del pulmón incluyendo la inhalación de humo o de sustancias químicas, la pneumonitis debida a aspiración, radiación, etc., el ahogo, la fíbrosis quística y otras enfermedades traumáticas de las células epiteliales, incluyendo las lesiones asociadas con heridas quirúrgicas y las resecciones, las lesiones, las úlceras y rasgado de tejidos.

Una indicación preferida para el tratamiento con el medio de la invención es el tratamiento de EPOC. La EPOC es un espectro de enfermedades respiratorias inflamatorias crónicas caracterizadas por tos, esputo, disnea, limitación del flujo de aire e intercambio de gas deficiente. La EPOC es común en individuos de edad avanzada y presenta un patrón de disminución gradual de la función pulmonar. De forma característica, un paciente presentará una tos crónica con esputo claro que empeora a una tos con un esputo espeso acompañado por un intercambio de aire escaso. Estas condiciones conducen frecuentemente a enfermedades del corazón y a la muerte. Muchas personas con EPOC tendrán bronquitis crónica junto con enfisema. La presente invención es especialmente importante porque para, ralentiza y/o revierte el proceso de destrucción pulmonar en pacientes EPOC. En esta acción, el medicamento preparado de acuerdo con la invención es muy diferente de los tratamientos típicos para EPOC, en los que se tratan los síntomas pero no la destrucción subyacente del tejido de células pulmonares y su función.

El medio de la invención puede, sin embargo, combinarse con o administrarse junto con otras terapias para el tratamiento de enfermedades pulmonares como la EPOC. Por ejemplo, el medicamento preparado de acuerdo con la presente invención puede utilizarse junto con la administración de un broncodilatador anticolinérgico como el bromuro de ipratropio (ATROVENT, disponible por Boehringer Ingelheim) o el tiotropio, un agonista del receptor beta adrenérgico como el albuterol (PROVENT disponible por Scherig) o el salmeterol, esteroides como la prednisona, el ácido retinoico, los inhibidores de la fosfodiesterasa, los antagonistas del endotelio, los inhibidores de metaloproteinasas, los inhibidores de la elastasa, los inhibidores de radicales libres, los inhibidores de proteinasa serina, los inhibidores de la elastasa de neutrófilos, las composiciones de tensoacticos pulmonares como el beractant (SURVANTA, disponible por Ross LaBS.), PDGF, FGF, EGF, la hormona del crecimiento u otros factores de crecimiento proteicos, etc., o combinaciones de lo mismo. La cantidad relativa de la HRG y de los compuestos adicionales puede determinarse fácilmente por el clínico considerando los síntomas individuales del paciente. Se prevé que estas composiciones y las cantidades relativas de los componentes varíen en función de las necesidades de un paciente, por lo que se controlarán y ajustarán mediante análisis físicoquímicos y médicos convencionales de la función pulmonar.

Las formulaciones terapéuticas de la HRG se preparan para el almacenamiento mezclando la proteína HRG con el grado de pureza deseado y con vehículos, excipientes o estabilizantes opcionales fisiológicamente aceptables (Remington Pharmaceutical Sciences, supra), en la forma de una pasta liofilizada o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para el receptor en las dosis y concentraciones utilizadas e incluyen tampones como el fosfato, el citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes como el ácido ascórbico; polipéptidos de peso molecular bajo (menos de 10 residuos); proteínas como la albúmina sérica, la gelatina, o las inmunoglobulinas; los polímeros hidrofílicos como la polivinilpirrolidona; los aminoácidos como la glicina, la glutamina, la asparragina, la arginina o la lisina; los monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo la glucosa, la manosa o las dextrinas; los agentes quelantes como el EDTA; los alcoholes de azúcares como el manitol o el sorbitol; las parejas de iones formadores de sales; y/o los tensoactivos no-iónicos como el TWEEN, PLURONICS o el polietilén glicol (PEG).

La HRG a utilizar en la administración in vivo debe ser estéril. Ello se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o después de la liofilización y reconstitución. La HRG se guardará generalmente en la forma liofilizada o en solución.

Las composiciones terapéuticas de HRG se coloca generalmente en recipientes con un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón agujereable por una aguja de inyección hipodérmica.

La vía de administración de la HRG está de acuerdo con los procedimientos conocidos, p. ej., la inyección o la infusión por vía intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, administración de aerosol en polvo o líquido para la nariz o el pulmón o vías intralesionales, o mediante sistemas de liberación prolongada tal como se indica más adelante. El ligando HRG puede administrarse de forma continua mediante infusión o mediante inyección de bolo. Un anticuerpo agonista se administra preferentemente de la misma manera o mediante administración a la circulación sanguínea o linfa.

La HRG, la variante o fragmentos de HRG pueden secarse mediante pulverización, o liofilización por pulverización utilizando técnicas conocidas (Yeo y col., Biotech. Y Bioeng., 41:341-346 (1993); Gombotz y col., PCT/US90/02421).

Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación prolongada incluyen las matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la proteína, y se presentan en formatos diversos, p.ej., películas, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación prolongada incluyen los poliésteres, los hidrogeles (p.ej., poli(2-hidroximetil-metacrilato) tal como se describió por Langer y col., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) y Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982) o el poli-vinilalcohol, los poliláctidos (patente americana U.S. 3.773.919; patente europea EP 58.481), los copolímeros del ácido L-glutámico y el gamma-etil-L-glutamato (Sidman y col., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), el acetato de etilén-vinilo no degradable (langer y col., supra), los copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico degradables como el LUPRPN DEPOT (microesferas inyectables compuestas de copolímero ácido láctico-ácido glicólico y el acetato leuprolido), y el ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (patente europea EP 133.988). Mientras que los polímeros como el acetato de etilén-vinil y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos más cortos. Cuando las proteínas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante un período de tiempo largo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a la humedad a 37ºC, lo que produce una pérdida de la actividad biológica y cambios posibles en la inmunogenicidad. Se pueden idear estrategias racionales para la estabilización de proteínas dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación es la formación de un enlace S-S intermolecular a través del intercambio de tio-disulfuro, se puede lograr la estabilización modificando los residuos sulfidrilos, liofilizando a partir de las soluciones acídicas, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matrices poliméricas específicas.

Las composiciones de HRG de liberación prolongada también incluyen la HRG en liposomas. Los liposomas que contienen la HRG se preparan mediante procedimientos conocidos per se: patente DE 3.218.121; Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3691 (1985); Hwang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 (1980); patente europea EP 52.332; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.494; EP 142.641; solicitud de patente japonesa 83-118008; patente americana U.S. 4.485.045 y 4.544.545; y patente europea EP 102.324. Generalmente, los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800 Angstroms) en los que el contenido lipídico es superior a aproximadamente 30 moles. El % de colesterol, la proporción seleccionada se ajusta para una terapia óptima de HRG. Los liposomas con un tiempo de circulación aumentado se describen en la patente americana U.S. 5.013.556.

Una cantidad efectiva de HRG a utilizar terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración y la condición del paciente. Según ello, será necesario para el clínico titular la dosificación y modificar la vía de administración con el fin de obtener un efecto terapéutico óptimo. Una dosificación diaria típica puede hallarse en el intervalo de aproximadamente 1 \mug/Kg y hasta 100 mg/Kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En general, el clínico administrará la HRG hasta alcanzar una dosificación que logre el efecto deseado. El progreso de esta terapia se es fácilmente controlable mediante ensayos convencionales, por ejemplo, la producción de la proteína A tensoactiva.

En otra realización, se pueden obtiener células epiteliales o aislarse de un tejido de mamífero para obtener una muestra de células epiteliales normales utilizando técnicas bien conocidas en la materia (biopsia, etc.). Esta muestra se trata a continuación con una proteína heregulina con el fin de inducir el crecimiento y/o la proliferación de células epiteliales en la muestra, con lo que aumenta la población de células epiteliales primarias. En general, la heregulina se añadirá al cultivo de células epiteliales in vitro a una concentración de aproximadamente 0,1 a 100 nM, preferentemente de 1-50 nM. Si se desea, las células epiteliales primarias se pueden cultivar in vitro durante varias generaciones con el fin de aumentar la población de células epiteliales. A continuación las células se cultivan en condiciones adecuadas para el cultivo de células de mamífero, tal como se describió anteriormente. Después de la expansión, la muestra crecida se reintroduce en el mamífero con el propósito de regenerar el epitelio en el tejido del mamífero. Por ejemplo, pueden obtenerse células epiteliales del pulmón de un paciente con un enfisema o una enfermedad pulmonar obstructora, y a continuación, las células se pueden crecer y reintroducir en el pulmón con el fin de regenerar más rápidamente el epitelio del tejido pulmonar dañado y en consecuencia restablecer la función pulmonar. Las células así crecidas pueden reintroducirse en el pulmón mediante aspiración o intubación utilizando procedimientos bien conocidos en la materia.

Los procedimientos y procesos aquí descritos en relación con la HRG-\alpha o la HRG pueden aplicarse en general a otras HRG, como la HRG-\beta1, HRG-\beta2 y HRG-\beta3 y a variantes de la mismo, así como a los anticuerpos. Los ejemplos siguientes se ofrecen a título ilustrativo y no limitante.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de heregulinas

(a) Se aislaron las heregulinas HRG-\alpha, HRG-\beta1, HRG-\beta2, de tipo-HRG-\beta2 y HRG-\beta3, se clonaron, se expresaron y se aislaron del medio de cultivo tal como se describe en la patente americana U.S. 5.367.060.

(b) Los polipéptidos SMDF se prepararon tal como se describe en la patente internacional WO 96/15244.

(c) El polipéptido \gamma-HRG se preparó y caracterizó tal como se describe más adelante.

Reactivos: El dominio de tipo-EGF de la HRG\beta1_{(177-244)} se expresó en E. coli, se purificó y radioyodinó tal como se describió anteriormente (Sliwkowski y col., J. Biol. Chem. 14661-14665 (1994)). Los anticuerpos monoclonales anti-HER2, 2C4 y 4D5 corresponden a los descritos anteriormente por Fendly y col., Cancer Research 50:1550-1558 (1990)).

Inmunoadhesinas-HER3 y -HER4: se diseñó un único sitio M1 en un plásmido de expresión que expresaba la cadena pesada de la IgG humana en la región codificante del dominio bisagra de la inmunoglobulina. Los sitios M1 también se diseñaron en un grupo de plásmidos de expresión de HER en la región codificante de las uniones ECD/TM de estos receptores. Toda la mutagénesis se realizó utilizando el procedimiento de Kunkel (Kunkel, T., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:488 (1985)). Los sitios M1 se utilizaron para generar las construcciones de fusión HER-IgG adecuadas. Dichas uniones de fusión de las diversas quimeras HER-IgG fueron: para HER, E^{646}_{HER2}-(TR)-DKTH^{224}VH; para HER3, L^{636}_{HER3}-(TR)-DKTH^{224}VH; para HER4, G^{640}_{HER4}-(TR)-DKTH^{224}_{VH}. La secuencia conservada TR se derivó del sitio M1. La expresión final de las construcciones se realizó en un plásmido de tipo pRK, en donde la expresión eucariota está dirigida por un promotor de CMV (Gorman y col., DNA Prot. Eng. Tehc. 2:3-10 (1990)).

Para obtener la proteína para los experimentos in vitro, se transfectaron las células HEK-293 con los plásmidos de expresión adecuados (Gorman y col., Huang y col., Nucleic Acids Res. 18:937-947 (1990)). El medio con suero se reemplazó con medio sin suero 15 horas después de la transfección y las células transfectadas se incubaron durante 5-7 días. El medio condicionado resultante se cosechó y se pasó por una columna de Proteína A (Pharmacia HiTrap^{TM} de 1 ml). Las fusiones de IgG purificadas se eluyeron con ácido cítrico 0,1 M (pH 4,2) en tubos con Tris 1 M pH 9,0. Las proteínas eluidas se dializaron a continuación en PBS y se concentraron utilizando filtros Centri-prep-30 (Amicon). Se añadió glicerol a una concentración final del 25% y el material se almacenó a -20ºC. Las concentraciones del material se determinaron mediante un ELISA-Fc.

Cultivo de células: Las líneas de cáncer de mama humano MDA-MB-175, MDA-MB-231, SK-BR-3 y MCF7 se obtuvieron del American Type Culture Collection y se mantuvieron en una mezcla de 50:50 de medio F12 HAM y Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), suplementado con FBS al 10% inactivado al calor, glutamina 2 mM y penicilina-estreptomicina al 10%.

Generación y caracterización de la librería de cDNA: Se purificó el RNA total de las células MDA-MB-175 utilizando el procedimiento del isotiocianato de guanidinio-cloruro de cesio (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). El RNA poli-A+ se aisló utilizando Dynabeads de oligo(dT) (DYNAL), tal como recomienda el fabricante. Se realizó la síntesis de la primera y segunda cadena con un equipo de síntesis de cDNA de Gibco BRL. Se generaron recombinantes de cDNA \lambdagt10 utilizando un sistema de clonaje de cDNA de Amersham. El empaquetamiento se realizó in vitro con extracto de empaquetamiento GigapackII (Stratagene). El fragmento PstI-XhoI del cDNA de HRG\beta3 (nt 144-618) se marcó mediante random-priming y se rastrearon 1x10^{6} calvas. Se verificaron los clones positivos y se purificaron mediante un segundo y tercer cribaje. El DNA del fago se aisló como un fragmento BamHI y se subclonó en la diana correspondiente de pBluescript SK. El clon 5 se secuenció completamente utilizando el equipo de secuenciación de DNA Sequenase versión 2.0 (United States Biochemicals, Inc.). Se secuenciaron ambas cadenas.

Sistema de expresión en bacterias: Un fragmento del cDNA del clon 5 (nt 1690-2722) se subclonó en el vector de fusión pET-32 TRX (Novagen). Este fragmento BglII-BglII se insertó en la diana BamHI del plásmido pET32a. La expresión de la proteína trx\gamma-HRG (aminoácidos 455-768) en E. coli se indujo tal como recomienda el fabricante.

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Purificación de \gamma-HRG recombinante: Se recolectaron las células E. coli que expresaban trx\gamma-HRG y se resuspendieron en 9 ml/g en Tris 50 mM, pH 8,0. Se añadió lisozima a una concentración final de 0,2 mg/ml y la solución se agitó en hielo durante 1 h. A continuación se añadió Dnasa I (10 \mug/ml) y MgCl2 (4 mM). La solución se sonicó durante 30 min, recogiéndose el sedimento. La fracción del sedimento se disolvió en 250ml/g en Gdn HCl 6 M, Tris HCl 0,1 M, pH 8,8. Las proteínas solubilizadas se sulfitolisaron añadiendo 1/10 de volumen de Na_{2}SO_{3} 1 M. La reacción se continuó durante 1,5 h a temperatura ambiente, a continuación se purificó la proteína mediante cromatografía de filtración en gel con una columna de grado prep High Load Superdex^{TM} 75 (Pharmacia). El replegamiento se inició mediante adición de cisteína 1 M, luego se añadió metionina 10 mM como antioxidante y se incubó durante toda la noche a temperatura ambiente. La concentración de proteínas se determinó mediante el análisis cuantitativo de aminoácidos.

Hibridación de Northern y Southern: el RNA total se aisló por el procedimiento de Chomczynski y col., Anal. Biochem. 162:156-159 (1987). Se aisló el poli(A)+ utilizando columnas de oligo(dT) de celulosa (Qiagen), tal como recomienda el fabricante. El RNA se desnaturalizó y se fraccionó por tamaño en un gel de agarosa al 1%/formaldehído al 0,8% y se transfirió a una membrana de nylon (Hybond. Amersham). El RNA se fijó por UV (UV Strataliker, Stratagene). La prehibridación se llevó a cabo a 42ºC en formamida al 50%/SDS al 1%/NaCl 1 m, sulfato de dextrano al 10% y DNA de esperma de salmón a 100 \mug/ml durante al menos 2 horas. Para la hibridación se utilizaron sondas de cDNA, bien fragmentos de restricción con la secuencia complementaria al dominio de tipo-EGF de HRG\beta3 o un fragmento KpnI-AvaII del cDNA que codifica únicamente la secuencia de \gamma-HRG (nt 1238-1866), marcadas por random-priming (Prime-it II, Stratagene). La hibridación se llevó a cabo en la misma solución a 42ºC con las sondas marcadas con P^{32} durante 16 horas. Las transferencias se lavaron varias veces con 2xSSC/SDS al 1% a temperatura ambiente, se lavaron dos veces con la misma solución a 65ºC durante 20 minutos y por último se lavaron con 0,2XSSC/SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 15 min. Las transferencias se secaron al aire y se expusieron con una película autoradográfica Du Pont Reflection^{TM} y con pantallas intensificadoras a -80ºC durante 7-40 horas. Las transferencias de Northern (Clontech) de múltiples tejidos de 2 \mug de poli(A)+ de bazo, timo, próstata, testículos, ovario, intestino delgado, colon, leucocitos de sangre periférica, corazón, cerebro, pulmón, músculo esquelético, riñón y páncreas, se hibridaron con una sonda marcada radioactivamente del cDNA de \gamma-HRg (nt 841-1447) según las instrucciones del fabricante.

Se aisló el DNA genómico de MDA-MB-175 y MDA-MB-231 tal como se describe en Sambrook y col., supra. El DNA se digirió con distintas enzimas de restricción, antes de tratar el gel con HCl 0,25 N y transferirlo a una membrana de nylon (Hybond, Amersham). El fragmento BglII-NdeI del cDNA de \gamma-HRG (nt 1690-2351) también se marcó isotópicamente mediante random-priming y se utilizó como una sonda de hibridación. La prehibridación se llevó a cabo en 6xSSC/5xDenhardts (SDS al 0,75%, sulfato de dextrano al 1% y DNA de esperma de salmón a 100 \mug/ml a 68ºC durante 4 h. La hibridación se llevó a cabo con una sonda marcada radioactivamente durante toda la noche. Se utilizaron las mismas condiciones de lavado que para las transferencias de Northern, excepto que se añadió una etapa de lavado con 0,2XSSC/0,1% SDS a 68ºC y la detección se prosiguió tal como se describió más
arriba.

Ensayo de unión de HRG-I^{125}: se realizaron ensayos de unión en pocillos rompibles Nunc. Las placas se recubrieron con 100 \mul de anticuerpo de cabra anti-humano (Boehringer Mannheim) a 5 \mug/ml a 4ºC durante toda la noche en tampón carbonato 50 mM (pH 9,6). Las placas se lavaron dos veces con tampón de lavado (PBS/0,5% Tween-20) y se bloquearon con 100 \mul de 1% BSA/PBS durante 30 min. El tampón se retiró y cada pocillo se incubó con 15 ng de proteína de fusión IgG en 1% BSA/PBS con agitación vigorosa durante 1,5 horas. Las placas se lavaron tres veces con tampón y se llevó a cabo la unión competitiva añadiendo cantidades diversas de \gamma-HRG y HRG\beta1-I^{125} con agitación vigorosa. Después de la incubación durante 1,5-2 horas, los pocillos se lavaron tres veces con tampón de lavado, se drenaron y se contaron los pocillos individualmente utilizando un contador-\gamma 100 Series Iso Data.

Ensayo de fosforilación de tirosinas: se plaquearon células MCF7 a 1x10^{5} células/pocillo en placas de 24 pocillos en F12/DMEM con FBS al 10%. Al cabo de 48 horas, se lavaron las células con F12/DMEM sin suero y se dejaron sin suero durante 6 horas. Diversas concentraciones de de \gamma-HRG truncada expresada en bacterias (es decir, trx\gamma-HRG 0 pM, 22 pM, 66 pM, 200 pM y 600 pM) o medio condicionado no purificado de células MDA-MB-175 se prepararon en tampón de unión (BSA al 1% en F12/DMEM) y se añadieron a cada pocillo. Al cabo de 8 min de incubación a temperatura ambiente, se aspiró cuidadosamente el medio y se pararon las reacciones añadiendo 100 \mul de tampón de muestra (SDS al 5%, 2-mercaptoetanol al 0,25%, Tris-HCl 25 mM pH 6,8). Alícuotas de 20 \mul de cada muestra se migraron en un gel de gradiente del 4-12% (Novex) y luego, se transfirieron las electroforesis a una membrana de nitrocelulosa. Las inmunotransferencias se revelaron y la banda reactiva predominante de un PM aproximado de 180 KDa se cuantificó por densitometría.

Producción y caracterización del medio condicionado de las células MDA-MB 175. Las células se sembraron en frascos T175 y se crecieron hasta alcanzar el 70-80% de confluencia (\sim 2,5x10^{7} células/frasco). Seguidamente, se lavaron las células con PBS y se crecieron sin suero en medio F12/DMEM durante 3-4 días. El medio se recogió a continuación, se filtró y se concentró utilizando una célula de ultrafiltración con membranas YM10 Diaflo (Amicon). La \gamma-HRg se visualizó en el medio condicionado de las células MDA-MB-175 mediante análisis de transferencia de Western en condiciones no reductoras. La \gamma-HRG se purificó parcialmente por HPLC usando una columna de fase inversa C4. La HRG\beta1 de tamaño completo (carril 1) y la \gamma-HRG semi pura (carril 2) expresadas en células CHO se migraron en una electroforesis, se realizó una transferencia de Western y la membrana se hibridó con heterodímeros HER2/HER4 IgG. Se observó una banda de \sim 64 KDa en el carril que contenía el sobrenadante parcialmente purificado, mientras que la HRG-\beta1 de tamaño completo y expresada en CHO migró como una proteína de 45 KDa.

Ensayo de proliferación celular con cristal violeta. Las líneas tumorales se sembraron en placas de 96 pocillos a las siguientes densidades: 2x10^{4} células/pocillo para MDA-MB-175 y 1x10^{4} células/pocillo para SK-BR-3 en un medio contenía FBS al 1%. Las células se dejaron adherir durante 2 h. Se añadieron anticuerpos monoclonales, inmunoadhesinas (10 \mug/ml) o únicamente medio y las células se incubaron de nuevo durante 2 horas a 37ºC. Se añadió rHRG\beta1_{177-244} a una concentración final de 1 nM, o 100 nM para neutralizar la inmunoadhesión y las células se incubaron durante 4 días. Las monocapas se lavaron con PBS y se tiñeron/fijaron con cristal violeta al 0,5%. Las placas se secaron al aire, el colorante se diluyó con citrato sódico 0,1 M (pH 4,2) en etanol (50:50) y se cuantificó la absorbancia a 540 nm.

Aislamiento y análisis de secuenciación de \gamma-HRG. Para caracterizar el tránscrito de heregulina en las células MDA-MB-175, se construyó una librería de cDNA en \lambdagt10 con el mRNA derivado de esta línea celular. La librería se rastreó con una sonda de cDNA correspondiente con el dominio de tipo-EGF y parte de la secuencia N-terminal de HRG\beta3 y se identificaron diversos clones. Uno de los clones que parecía contener la secuencia del cDNA de tamaño completo, se aisló y secuenció. La Fig. 7A-7D muestra la secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos predicha de \gamma-HRG. La única pauta de lectura abierta predicha de 2303 pb comienza con un codón ATG en el nt 334. Este codón de inicio se halla en un contexto de secuencia nucleotídica conocido por ser un sitio potencial de iniciación de la transcripción (Kozak, Nucleic Acid Research 15:8125-8148 (1987)). Se hallaron diversos codones de terminación cadena arriba del codón de inicio El codón de parada TAG en el nt 2637 se prosigue por la secuencia 3' no codificante, idéntica a las otras secuencias de isoformas de HRG e incluye una señal de poliadenilación seguida por una región rica en A. La pauta de lectura abierta codifica una proteína de 768 residuos de aminoácidos con un peso molecular calculado de 84,2 KDa.

(d) La selección de las variantes de HRG-\beta1 que contenían residuos correspondientes con el dominio de tipo-EGF (HRG-\beta1 177-228) se realizó mediante expresión en fagos monovalentes. Para estas variantes, los números de los residuos se muestran entre paréntesis indicando la posición del residuo en el dominio mínimo de tipo-EGF (es decir, HRG-\beta1 EGF 1-52).

Las variantes de HRG-\beta1 EGF se prepararon y seleccionaron para la unión con HER-3-Ig utilizando la expresión en fagos monovalentes, de acuerdo con el procedimiento de Bass y col., Proteins 8:309-314 (1990). Tal como se describe con mayor detalle más adelante, se preparó un vector fagémido, en el que HRG-\beta1 EGF se fusionó con un fragmento C-terminal de la proteína pIII de la cubierta de M13. Se realizó la mutagénesis de Kunkel para introducir codones de parada en este vector en los sitios seleccionados para la mutagénesis aleatoria. Esta etapa asegura que el vector de inicio sea incapaz de expresar el polipéptido de tipo salvaje. Tramos de 4 a 6 residuos por librería se mutaron aleatoriamente de forma lineal, excepto para las 6 cisteínas, Phe189 (HRG\beta1 EGF Phe 13) y los dos residuos más C-terminales. La Phe 189 no se alteró, porque este residuo está conservado como un residuo aromático en el EGF y el TGF-\alpha y forma una interacción con la Tyr208 (HRG-\beta1 EGF Tyr32) Jacobsen y col., Biochemistry 35:3402-17 (1996). En consecuencia, HRG-\beta1 EGF se preparó en 8 librerías, denominadas A-E, G, H e I.

La librería E que comprendía HRG-\beta1 202-209 (HRG-\beta1 EGF 26-33), contenía una deleción de tres residuos. La región delecionada corresponde con un giro desordenado entre la segunda y la tercera hoja \beta de la HRG-\beta1 EGF y los aminoácidos equivalentes están ausentes en EGF y TGF-\alpha. Una variante control de HRG-\beta1 EGF, en la que se delecionó HRG-\beta1 202-204 (HRG-\beta1 EGF 26-28) de HRG8 (HRG63), se unió con HER-3-Ig con una afinidad similar a la de tipo salvaje.

Se creó una librería adicional (F) para mutar aleatoriamente un fragmento de superficie compuesto de cadenas laterales de la primera y segunda hoja \beta, incluyendo HRG-\beta1 178, 180, 198 y 200 (HRG-\beta1 EGF2, 4, 22 y 24).

Los sitios seleccionados en los vectores de inicio se mutaron aleatoriamente según el procedimiento de mutagénesis de Kunkel para producir librerías de HRG-\beta1 EGF. Se produjeron fagos que expresaban HRG-\beta1 EGFs a partir de librerías en condiciones tales, estadísticamente, que cada fago expresaba no más de una copia de HRG-\beta1 EGF mutada. Véase Bass y col., supra. Estos fagos se seleccionaron por su unión a (cribados contra) HER3-Ig inmovilizada en una placa de ELISA. Los fagos unidos se eluyeron y se utilizaron para reinfectar las células huésped, que se utilizaron para producir nuevos fagos para otra tanda de selección. Este proceso se repitió seis a siete veces por cada librería. Por último, se secuenciaron 12 clones de los fago seleccionados de cada librería.

TABLA 2

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TABLA 3

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TABLA 4

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TABLA 5

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TABLA 6

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TABLA 7

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Ejemplo 2 Expresión de HER2/HER3 en pulmón de rata embrionario

Se microdiseccionaron los pulmones de rata de embriones (E) de 16, 18, 20 días y de ratas post-natales (P) de 7 y 14 días y de adultos. El tejido aislado del pulmón se homogeneizó en un tampón con inhibidor de proteasas estándar y cantidades iguales de proteína se migraron en un gel de SDS-PAGE (4-20%), se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se identificaron con anticuerpos específicos (HER2, HER3, HER4-Santa Cruz Biological, San José, CA, y HRG, 3G11, Genentech, Inc.) mediante técnicas de inmunofluorescencia.

El análisis de las transferencias indica que HER2 se expresa a niveles elevados durante el desarrollo en el útero, aparece el día E18 y disminuye después del nacimiento hasta alcanzar los niveles bajos del adulto. La expresión de HER3 alcanza un pico máximo en E18 y luego disminuye después del nacimiento hasta los niveles bajos del adulto. HER4 no se identifica en ningún momento durante el desarrollo del pulmón. Una preforma de HRG puede estar presente (proteína de 75 KDa) el día E16, con un máximo el E18 y luego disminuye a los niveles bajos del adulto. Estos resultados sugieren que el sistema HER/HRG se modula durante el desarrollo del pulmón y el receptor activo puede ser un heterodímero HER2/HER3. El período de tiempo durante el cual la expresión de los receptores es máxima (E18) representa el estadio pseudoglandular, la proliferación de células epiteliales pulmonares es la mayor de cualquier otro período. Durante el estadio canalicular, la diferenciación se inicia con la aparición de pneumocitos de tipo I (producción de tensoactivos) y tipo II. Ello indica un papel para la interacción HRG/HER en cualquiera de estos procesos o en ambos.

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Ejemplo 3 Expresión de HER2/HER3 en el pulmón humano fetal

El pulmón humano fetal se obtuvo de embriones del segundo trimestre (17-22 semanas). El tejido del pulmón se cultivó en medio Weymouth sin suero en una interfaz de fluido aéreo a 37ºC y en atmósfera de humedad con CO_{2} al 5%. El tejido se cosechó el día 0 (el día de obtención del tejido), y después de 1-4 días (D) de cultivo (D1-D14), se homogeneizó en un tampón con inhibidor de proteasas estándar y cantidades equimolares de proteína se sometieron a una electroforesis de SDS-PAG (4-20%), se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se identificaron con anticuerpos específicos.

HER2 se expresó el día D0 e incrementó el nivel durante el cultivo in vitro. HER3 está presente a niveles bajos a indetectables en D0 e incrementa su expresión durante el cultivo in vitro. HER4 no se observó en ningún momento durante el desarrollo del pulmón. La HRG no se identificó en D0, sin embargo, se identificó una proteína de 75 KDa en D1-D2 y su expresión continuó aumentado durante el tiempo de cultivo. Este modelo de explantes humanos recapitula parte del programa de desarrollo normal del pulmón durante los 5 días de cultivo. El desarrollo tiene lugar rápidamente, y tanto la proliferación de las células epiteliales como su diferenciación se producen conjuntamente durante la formación del espacio aéreo. Estos resultados indican que el sistema HER2/HRG también se modula durante el desarrollo del pulmón humano in vitro, y el receptor activo puede ser un heterodímero HER2/HER3. El tercer trimestre representa el estadio pseudoglandular tardío (días 42-112) y el estadio canalicular (días 112-196) en el desarrollo del pulmón humano. Al igual que en la rata, también tiene lugar la proliferación celular y la formación de vías aéreas prospectivas durante el estadio pseudoglandular. Durante el estadio canalicular tiene lugar la diferenciación del epitelio.

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Ejemplo 4 Expresión de HER2 y HER3 en el pulmón humano

HER2 y HER3 se expresan exclusivamente en el epitelio pulmonar durante el desarrollo del pulmón. Se cultivó el pulmón humano del segundo trimestre in vitro, tal como se describió más arriba. El tejido se cosechó diariamente, se congeló y se cortaron secciones de 5 micras. Las secciones se montaron en cubreobjetos de vidrio y se realizó la inmunohistoquímica utilizando procedimientos ABC estándares. HER2, HER3 y HER4 se identificaron utilizando anticuerpos específicos tal como se describió anteriormente.

Como control, se tiñó el tejido de pulmón en el día D0 y D5 con un anticuerpo irrelevante sin que se observara ninguna señal. En D0, el pulmón estaba relativamente poco formado. La mayor parte de los tejidos estaban compuestos de células mesenquimatosas y se desarrollaron espacios aéreos temprano. En D5, los espacios aéreos eran claramente identificables, con un tejido mesenquimatoso más delgado y con proliferación del epitelio pulmonar necesario para recubrir los espacios áereos en crecimiento.

Utilizando la tinción de HER2 en D0 y D5, se demostró que HER2 estaba presente de forma no uniforme en el tejido de pulmón D0. No se observó expresión en el tejido mesenquimatoso. En D5, HER2 permanece uniforme y restringido al epitelio pulmonar.

Utilizando la tinción control de HER3 en D0 y D5, se identificó HER3 en el tejido pulmonar D0. La señal de tinción fue relativamente inferior a la de HER2 y tampoco homogénea, lo que sugiere que existen áreas específicas epiteliales que expresan el receptor HER3. En D5, la expresión fue más homogénea en el epitelio pulmonar, pero tampoco uniforme. La expresión continuó siendo específica de epitelio.

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Ejemplo 5 Preparación de rHRG\beta1_{177-244}

El fragmento del dominio de tipo-EGF HRG\beta1_{177-244} se amplificó del vector pHL89 (descrito por Holmes y col., Science 256:1205-1210 (1992)) mediante PCR con cebadores que contenían extremos con dianas protuberantes NsII/XbaI. El fragmento se insertó en vector de expresión fagémido pam-g3 mediante digestión con enzimas de restricción y ligación en las mismas dianas para generar la construcción pHRG2-g3 (177-244). El vector pam-g3 es un derivado de phGHam-g3, diseñado para la expresión en fagos de la hormona de crecimiento humana (hGH), descrito por Lowman y col., Biochemistry 30:10832-10838 (1991), pam-g3 se produjo mediante eliminación del gen hGH presente en phGHam-g3 y sustitución por un fragmento de relleno, que proporciona espacio para el corte por las dianas de restricción utilizadas en el clonaje. El fragmento HRG-\beta1 se unió al residuo 247 de pIII.

El dominio de tipo-EGF HRG-\beta1 expresado de la anterior construcción, descrita más arriba, se denominó sin la "p" y "-g3" que aparecen en el nombre de la construcción. En consecuencia, el dominio de tipo-EGF HRG-\beta1 expresado de la construcción pHRG2-g3 se denominó "HRG2".

El dominio se expresó de forma monovalente en los fagos como una proteína de fusión pIII, tal como se describe por Bass y col., Proteins 78:309-314 (1990).

De forma similar, las variantes HRG-\beta1_{147-227}, HRG-\beta1_{147-244} y HRG-\beta1_{177-227} se prepararon y expresaron tal como se describió anteriormente.

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Ejemplo 6 rHRG\beta1_{177-244} provoca un desarrollo acelerado del pulmón in vitro

La rHRG\beta1_{177-244} provoca un desarrollo acelerado del pulmón in vitro. Para determinar si los receptores HER2/
HER3 expresados eran funcionales y comprobar el papel de la estimulación de HRG durante el desarrollo del pulmón in vitro, se añadió al cultivo in vitro rHRG\beta1_{177-244} a 10 nM. El cultivo se cosechó en el día D5, se congeló y se cortaron secciones de 5 micras para su análisis.

La morfología, en comparación con las muestras control no tratadas fue extremadamente distinta. Hubo una proliferación marcada del epitelio. Los espacios aéreos que normalmente están revestidos de una única capa de células tenían ahora un espesor de 2-3 células. Los cambios fueron dependientes de la dosis con una mayor respuesta de células epiteliales a concentraciones mayores. HER2 y HER3 fueron todavía identificables y únicamente en el epitelio.

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Ejemplo 7 Diferenciación del pulmón humano

La diferenciación de las células epiteliales del pulmón humano tuvo lugar después del tratamiento con HRG. La diferenciación se cuantificó por la producción de proteína A tensoactiva (SPA). Todas las secciones se tiñeron para SPA. El explante de pulmón humano fue positivo para la tinción para SPA, localizándose en las células epiteliales de los ductos prealveolares. El explante humano expuesto a 10 nM de HRG mostró un efecto sobre la producción de SPA. Como un control de diferenciación, se expuso un explante de pulmón a dibutiril cAMP 1 mM. También se realizó un control negativo.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

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\bullet JP 58118008 A [0201]

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\bullet US 4544545 A [0201]

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

\hskip1cm

14

\hskip1cm

15

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16

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<210> 2

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<211> 2226

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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17

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18

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19

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20

\hskip1cm

21

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<210> 3

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<211> 675

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

\hskip1cm

22

\hskip1cm

23

\hskip1cm

24

\hskip1cm

25

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<210> 4

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<211> 2199

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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26

\hskip1cm

27

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28

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29

\hskip1cm

30

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<210> 5

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<211> 637

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\hskip1cm

31

\hskip1cm

32

\hskip1cm

33

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<210> 6

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<211> 2490

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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34

\hskip1cm

35

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36

\hskip1cm

37

\hskip1cm

38

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<210> 7

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<211> 241

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip1cm

39

\hskip1cm

40

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<210> 8

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<211> 1715

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 8

\hskip1cm

41

\hskip1cm

43

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<210> 9

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<211> 420

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm

45

\hskip1cm

46

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<210> 10

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<211> 2431

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<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip1cm

47

\hskip1cm

48

\hskip1cm

49

\hskip1cm

50

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<210> 11

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<211> 768

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\hskip1cm

51

\hskip1cm

52

\hskip1cm

53

\hskip1cm

54

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<210> 12

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<211> 3111

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 12

\hskip1cm

55

\hskip1cm

56

\hskip1cm

57

\hskip1cm

58

\hskip1cm

59

\hskip1cm

60

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

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<211> 1872

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 13

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\hskip1cm

61

\hskip1cm

62

\hskip1cm

63

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<210> 14

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<211> 296

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 14

\hskip1cm

64

Claims (20)

1. Utilización de un ácido nucleico que codifica un ligando activador de HER2, HER3 y/o HER4, el cual es un polipéptido de heregulina (HRG) o un fragmento del mismo capaz de unirse al receptor HER2, HER3 y/o HER4 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de dificultades respiratorias, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfisema, enfermedad pulmonar del neonato, lesiones agudas del pulmón, pneumonitis debida a aspiración o radicación, ahogo, fibrosis quística y otras enfermedades traumáticas de las células epiteliales, incluyendo las lesiones asociadas con heridas quirúrgicas y las resecciones, las lesiones, las úlceras y rasgado de tejidos.

2. Utilización según la reivindicación 1, en donde el ligando activador es una HRG humano o un fragmento de la misma.

3. Utilización según la reivindicación 2, en donde la HRG humana o fragmento de la misma es una HRG humano recombinante o fragmento de la misma.

4. Utilización según la reivindicación 1, en donde el ligando activador se selecciona de entre el grupo consistente en la HRG-\alpha, -\beta1, -\beta2, tipo-\beta2 y \beta3 y fragmentos de éstas.

5. Utilización según la reivindicación 1, en donde el ligando activador es la \gamma-HRG o un fragmento de ésta.

6. Utilización según la reivindicación 1 en donde la HRG es rHRG-\beta1-177-244.

7. Utilización según la reivindicación 1 en donde el ligando activador es una variante de HRG.

8. Utilización según la reivindicación 7 en donde la secuencia de variante de HRG codifica al menos una sustitución aminoacídica en un residuo correspondiente con un residuo de la heregulina-\beta1 humana nativa de 645 aminoácidos seleccionada a partir de:

66

9. Utilización según la reivindicación 8 en donde la secuencia de la variante HRG codifica al menos una sustitución aminoacídica en un residuo correspondiente con un residuo de la heregulina-\beta1 humana nativa de 645 aminoácidos seleccionada a partir de P213, N214 y E215.

10. Utilización según la reivindicación 7 en donde la secuencia de variante de la HRG codifica una variante de heruglina-\beta1, que incluye una o más substituciones aminoacídicas seleccionadas a partir de:

a) S177W;

b) H178 se substituye con S, E, R, o A;

c) V180 se substituye con Q, I, o E;

d) K181 se substituye con P o A;

e) A183G;

f) E184 se substituye con V, W, K, R, G, o N;

g) K185 se substituye con E, S, Q, o G;

h) E186R;

i) K187 se substituye con E o A;

j) T188 se substituye con Q o G;

k) E195Q;

l) M198 se substituye con R o K;

m) V199I

n) D201 se substituye con T o I;

o) P205 se substituye con T o Y;

p) S206 se substituye con K, H, G, P o R;

q) R207Y;

r) Y208 se substituye con R o L;

s) L209 se substituye con M o G;

t) K211R;

u) P213 se substituye con S, T, N, o K;

v) N214 se substituye con L, K, S, o E;

w) F216 se substituye con M o Y;

x) N223 se substituye con H o W;

y) M226I

z) F197Y; y

zz K200R

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11. Utilización según la reivindicación 7 en donde la secuencia de variante de la HRG codifica un conjunto de substituciones aminoacídicas, y en donde el conjunto de substituciones aminoacídicas se selecciona de un grupo consistente en:

a) A183G, E184W, K185D, E186R, K187E, T188G, y M226I;

b) A183D, E184K, K185S, E186R, K187E, T188G, y M226I;

c) F197Y, M198K, K200R, D201I, y M226I;

d) P205Y, S206G, R207Y, Y208L, y L209M;

e) P205Y, S206R, R207Y, Y208R, L209M, y M226I;

f) P205T, S206H, R207Y, Y208R, y L209M;

g) P205T, S206K, R207Y, Y208R, y L209G;

h) N223W y M226I;

i) N223H y M226I;

j) S177W, H178E, K181P, A183G, E184W, K185D, E186R, K187E, T188G, y M226I;

k) P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, y M226I;

l) A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T;

m) A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, y L209M;

n) A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, y L209M;

o) A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, y M226I;

p) F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, y L209M;

q) F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, y M226I;

r) F197Y, M198R, D201T, y M226I;

s) A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, y M226I;

t) A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, y M226I;

u) A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, y M226I;

v) F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H, y M226I; y

w) A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H, y M226I.

12. Utilización de una célula huésped que comprende un ácido nucleico como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de dificultades respiratorias, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfisema, enfermedad pulmonar neonatal, lesiones agudas del pulmón, pneumonitis debida a aspiración o radicación, ahogo, fíbrosis quística y otras enfermedades traumáticas de las células epiteliales, incluyendo las lesiones asociadas con heridas quirúrgicas y las resecciones, las lesiones, las úlceras y rasgado de tejidos.

13. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la dificultad respiratoria es una dificultad respiratoria neonatal o infantil.

14. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la enfermedad es un subtipo de EPOC seleccionada de entre bronquitis crónica, enfisema y asma.

15. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en donde la enfermedad pulmonar de neonatos se selecciona de entre el síndrome de dificultad respiratoria neonatal, el síndrome de aspiración del meconio, la enfermedad pulmonar crónica del neonato, la hernia diafragmática congénita.

16. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en donde la lesión pulmonar aguda es humo o inhalación química.

17. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde la HRG induce la proliferación de células epiteliales.

18. Utilización según la reivindicación 17, en donde las células epiteliales con células epiteliales pulmonares.

19. Ácido nucleico o célula huésped como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-12, 17 y 18, para utilizarse en el tratamiento de una condición seleccionada de entre dificultad respiratoria, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfisema, enfermedad pulmonar neonatal, lesiones agudas del pulmón, pneumonitis debida a aspiración o radicación, ahogo, fíbrosis quística y otras enfermedades traumáticas de las células epiteliales, incluyendo las lesiones asociadas con heridas quirúrgicas y las resecciones, las lesiones, las úlceras y rasgado de tejidos.

20. Ácido nucleico o célula huésped según la reivindicación 19, en donde la condición es tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 13-16.