ES2329541T3 - Prueba de diagnostico. - Google Patents
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Abstract
Un método para la detección de la vaginosis bacteriana, que comprende las etapas siguientes: (i) aplicar una muestra biológica obtenida de un sujeto humano en el substrato de sialidasa del ácido 5-bromo- 4-cloro-3-indoyl alfa-D-N-acetil neuramínico, o bien una sal del mismo, el cual se haya inmovilizado sobre un medio de soporte sólido; y (ii) detectar un cambio en el substrato de sialidasa inmovilizado.
Description
Prueba de diagnóstico.
Esta invención está relacionada con un método
para la detección de vaginosis bacteriana. Se expone también un
dispositivo para su uso en dicho método y un conjunto que comprende
dicho dispositivo.
La vaginosis bacteriana (VB) es un estado en el
cual la mayor parte de los numerosos microorganismos que pueblan la
vagina (Lactobacilli) son desplazados por otro microorganismo
tal como la Gardnerella vaginalis. La VB está asociada con
el parto pretérmino (PPT). El mecanismo responsable de esta
asociación se piensa a que es debido a la flora relacionada con la
VB que consigue el acceso al útero y que provoca la liberación de
mediadores de inflamatorios que inician el parto.
Se había pensado previamente que en la VB, la
infección bacteriana en sí misma daba lugar al PPT. Los antibióticos
se han utilizado comúnmente para el tratamiento de la VB, por
ejemplo para prevenir el PPT, pero dicho tratamiento obtiene rara
vez el éxito. Además, los antibióticos pueden eliminar las bacterias
no patógenas, incluyendo las cepas beneficiosas tales como el
Lactobacilli.
En el momento actual, la presencia de la VB se
detecta sobre la base de un examen clínico y por la tinción de Gram
por la característica de las bacterias de la enfermedad. Se
requieren unos pocos días con el fin de conseguir un resultado,
utilizando la tinción de Gram, de forma que no se puede informar al
paciente del resultado en el instante de la visita a la
clínica.
Durante el embarazo, no existe ninguna barrera
membranosa entre la vagina y el útero para poder prevenir una
infección bacteriana ascendente. No obstante, el tapón de moco
cervical se cree que actúa como una barrera física en la infección
intra-útero.
El tapón de moco está construido sobre una
infraestructura de glicoproteinas ricas en carbohidratos,
denominadas mucinas. Las mucinas están compuestas por cadenas
laterales de oligosacáridos unidas a un núcleo central de
proteínas. Los residuos del ácido sialico están presentes en los
extremos terminales de las cadenas laterales del carbohidrato.
Los altos niveles de la actividad de la
sialidasa bacteriana se han encontrado en las secreciones de la
vagina de las mujeres con VB, en oposición a las mujeres sin VB
(MacGregor y otros (1994) Am. J.Obstet. Gynaecol. 170
1048-1060; Briselden y otros (1992) J. Clin.
Microbiol. 30 663-666).
Las sialidasas bacterianas son enzimas que se
unen a los residuos del ácido siálico de los glicolipídos y
glicoproteinas. Hasta la fecha actual, la actividad de la sialidasa
se ha ensayado por técnicas de colorimetría, fluorimetría, y
técnicas radioactivas utilizando una amplia variedad de substratos
sialoglicoconjugados sintéticos. Los substratos que se han
utilizado previamente en los ensayos de la actividad de la sialidasa
incluyen: mucina de la glándula submandibular bovina y
glicoproteina ácida \alpha-1 humana (Howe y otros
(1999) en prensa); ácido
2'-(4-metil-umbeliferilo)-\alpha-D-N-acetilo
neuraminico (Paupermpoonsiri y otros (1996) Clin.Inf. Dis. Vol. 23
748-752; Brieselden y otros (1992) supra)
Moncla y otros (1989) J. Clin. Microbiol, 27,
182-184; ácido
4-nitrofenilo-\alpha sialico, y
ácido
2-(3-metoxifenilo)-N-acetilo-D
neuramínico (MacGregor y otros (1994) supra). La sensibilidad de
muchos de los substratos de sialidasa conocidos es baja.
Los substratos de sialidasa descritos hasta la
fecha se utilizan en una amplia variedad de ensayos. Por ejemplo,
pueden utilizarse ensayos de colorimetría o fluorimétricos con
substratos sintéticos, los cuales detectan la fracción no siálica
del substrato (por ejemplo, 4-metil umbeliferona ó
4-nitrofenol). Alternativamente, la cantidad de
ácido siálico liberado a partir de un substrato sialoglicoconjugado
puede ser detectada por HPLC (cromatografía líquida de alta
resolución y preparativo o un ensayo de colorimetría. Así mismo,
los ensayos radioactivos se utilizan algunas veces, lo cual incluye
la introducción de un radiomarcaje dentro del substrato
sialoconjugado y la detección del ácido siálico liberado por el
cómputo de centelleo líquido. Se ha descrito en el documento
JP5339283 un método para preparar ácido
4-cloro-3-indoilo \alpha-D-N-acetilo neuramínico, para su utilización en la recuperación de la enzima similar a la sialidasa.
4-cloro-3-indoilo \alpha-D-N-acetilo neuramínico, para su utilización en la recuperación de la enzima similar a la sialidasa.
Los presentes inventores han descubierto que la
conexión entre PPT y VB es debido a la actividad de la sialidasa
bacteriana, más bien que a la propia infección bacteriana. Se cree
que la actividad de la sialidasa está incluida en la degradación
del tapón de moco, lo cual da lugar a un acceso bacteriano en
incremento dentro del tracto reproductor superior.
Los grupos carboxílicos de los ácidos siálicos
en los extremos de las cadenas laterales de los carbohidratos de
las moléculas de mucina confieren una carga iónica negativa,
provocando rigidez en las cadenas laterales de azúcar. La unión del
ácido siálico destruye la carga mutuamente repelente entre las
moléculas de mucina, provocando una pérdida de viscosidad del tapón
de moco. El acceso bacteriano al interior del tracto reproductor
superior se incrementa como resultado de esta acción por dos
razones. En primer lugar, la mucina y por tanto la organización de
la matriz del moco se pierde después de la degradación, y las
propiedades mecánicas y bacterioestáticas de la matriz del moco se
convierten en menos efectivas como mecanismos de barrera. En segundo
lugar, la desintegración de la capa del moco facilita la adherencia
bacteriana al epitelio subyacente, lo cual altera las respuestas
del reconocimiento inmunológico, y reduce la probabilidad de que las
bacterias puedan ser lavadas y eliminadas por el movimiento del
fluido vaginal.
Se deduce de este descubrimiento que los
inhibidores de sialidasa tienen que ser útiles para tratar y
prevenir condiciones tales como la vaginosis bacteriana, y serán
útiles en terapias para prevenir PPT. Se deduce también que los
ensayos de la actividad de la sialidasa serán útiles para detectar
enfermedades tales como la VB.
Los presentes inventores han desarrollado un
ensayo de diagnóstico para enfermedades tales como la VB, que
detecta la presencia de actividad de la sialidasa. Un resultado de
este ensayo ha encontrado la correlación significativa con la
incidencia de VB utilizando la diagnosis convencional de la tinción
de Gram. El método del ensayo incluye la toma de una muestra en el
paciente y poner en contacto la muestra con el substrato de
sialidasa. Después de la incubación, se observa un cambio detectable
tal como un cambio del color en caso de detectar la actividad de la
sialidasa. En una realización preferida, el ensayo es un ensayo
rápido (o test spot), es decir que la muestra se aplica al
substrato de sialidasa, el cual está soportado en sí por un medio
sólido adecuado, tal como un papel de filtro.
El ensayo hace uso de substratos en los que se
ha encontrado una sensibilidad muy alta en la detección de la VB,
indicado posiblemente un entorno óptimo para la unión de sialidasas
a partir de la flora de la VB. El substrato preferido utilizado en
el presente ensayo es una sal de ácido neuramínico
5-bromo-4-cloro-3-indoil
\alpha-D-N-acetilo,
en particular el ciclohexilamina
(X-\alpha-NANA), que se encuentra
disponible a través de Rose Scientific Ltd., Edmonton, Canadá.
El método del ensayo de la presente invención
para detectar la actividad de la sialidasa es altamente sensible,
de bajo costo de ejecución rápido y sencillo de utilizar. El ensayo
es especialmente útil para la prueba de la actividad de la
sialidasa como un indicador de la VB, y por tanto un predictor de la
probabilidad de nacimiento pretérmino. El ensayo puede llevarse a
cabo en la misma sala del paciente o bien una clínica general o de
cirugía menor, puesto que el método de la invención no requiere el
uso de unidades de equipamiento costoso o bien materiales distintos
a los que están disponibles normalmente. Por ejemplo, en contraste
con los métodos convencionales, no hay necesidad de un equipo de
tinción de Gram o bien un microscopio básico. Además de ello, el
método de la invención exige menos trabajo que una tinción de
Gram.
Así mismo, el ensayo rápido (spot) de sialidasa
tiene una ventaja sobre las pruebas de colorimetría, fluorimetria o
radioactividad, las cuales se utilizan normalmente para detectar la
VB porque puesto que la actividad de la sialidasa no está siempre
presente en la orina de la VB o bien toda la flora de la VB, su
presencia puede ser un indicador de que el estado es más
perjudicial para el huésped en algunos casos que en otros.
De acuerdo con esta invención, se proporciona un
método para la detección de la VB que comprende los pasos
siguientes:
- (i)
- aplicar una muestra biológica de un sujeto humano en el substrato de sialidasa del ácido 5-bromo-4-cloro-3-indoyl \alpha-D-N-acetilo neuramínico, o bien una sal del mismo (por ejemplo, la sal de ciclohexilo amina), el cual se haya inmovilizado sobre un medio de soporte sólido; y
- (ii)
- detectar un cambio de color en el substrato de sialidasa inmovilizado.
Se expone aquí también un dispositivo para su
utilización en la detección de la VB, cuyo dispositivo comprende el
ácido
5-bromo-4-cloro-3-indoyl
\alpha-D-N-acetilo
neuramínico, o una sal del mismo inmovilizado sobre un medio
sólido.
El dispositivo puede ser utilizado en un método
de la presente invención, cuyo método comprende las etapas
siguientes:
- (i)
- aplicar una muestra biológica obtenida de un sujeto humano en el dispositivo; y
- (ii)
- detectar la presencia o ausencia de un cambio del color en el ácido inmovilizado 5-bromo-4-cloro-3-indolyl \alpha-D-N-acetilo neuramínico, o una sal del mismo (por ejemplo la sal de ciclohexil amina.
Se expone aquí también un conjunto de
componentes para la diagnosis de la VB, que comprende un dispositivo
para su uso en la detección de la VB tal como se ha descrito
anteriormente.
Este conjunto de componentes puede comprender un
medio de incubación, por ejemplo una solución tampón Tris/HCl y/o
unos medios de obtención de muestras.
El medio sólido puede ser, por ejemplo, un papel
de filtro.
Preferiblemente, el sujeto mamífero es una mujer
embarazada o bien una mujer que está a la espera del embarazo.
El reactivo del ensayo puede comprender, por
ejemplo, un medio de fase sólida, líquida o un gel, en donde se
encuentra soportado el ácido neuramínico
5-bromo-4-cloro-3-indoyl
\alpha-D-N-acetilo
o una sal del mismo, aplicado, absorbido o bien contenido de otra
forma.
El ácido
5-bromo-4-cloro-3-indoyl
\alpha-D-N-acetilo
neuramínico es preferiblemente de la forma de la sal
ciclohexilamina. Preferiblemente, el ácido
5-bromo-4-cloro-3-indoyl
\alpha-D-N-acetilo
neuramínico ciclohexil amina está soportado o absorbido sobre un
substrato sólido, por ejemplo un papel de filtro. De esta forma, el
compuesto reactivo puede estar inmovilizado sobre el substrato, para
facilitar la realización del ensayo del diagnóstico. Dicho ensayo
del diagnóstico en donde el compuesto reactivo es absorbido sobre un
medio sólido se denomina con frecuencia como un ensayo de tipo
mancha, puesto que el ensayo del diagnóstico en sí se realiza por
el "manchado" de la muestra (sobre un extracto de la muestra),
sobre el medio sólido en la zona en donde se haya absorbido el
compuesto reactivo.
La muestra puede obtenerse directamente a partir
de un sujeto mamífero, típicamente un sujeto humano, por ejemplo
como un tampón de algodón, o un lavado utilizando un tampón
adecuado. Después de haber tomado la muestra, puede aplicarse o
ponerla en contacto directamente con el reactivo del ensayo.
Alternativamente, por ejemplo cuando la muestra es un tampón de
algodón, los contenidos de la muestra pueden extraerse en un medio
líquido, por ejemplo una solución tampón tal como un tampón de
Tris/HC, y aplicándose después al reactivo del ensayo. Esta puede
ser la aplicación del método del ensayo más conveniente.
En una realización preferida, la muestra se toma
como un tampón de algodón vaginal o muestra del paciente humano
mujer.
El cambio en el reactivo del ensayo es un cambio
de color, desde el incoloro hacia el azul. Este cambio puede ser
observado visualmente, o bien puede llevarse a cabo utilizando un
equipamiento adecuado, tal como un colorímetro de pruebas de tira,
o bien un espectrofotómetro, el cual podría utilizarse para
cuantificar el resultado. Se prefiere que la parte del fondo del
substrato no tenga un color que pudiera oscurecer o enmascarar el
cambio de color en el compuesto del reactivo.
El dispositivo utilizado en la invención puede
tener la forma de un medio sólido sobre el cual esté soportado o
absorbido el ácido
5-bromo-4-cloro-3-indoyl
\alpha-D-N-acetilo
neuramínico o sal del mismo, por ejemplo el ciclohexilo amina. El
reactivo de ensayo preferido es un papel de filtro impregnado en una
solución de ácido
5-bromo-4-cloro-3-indoyl
\alpha-D-N-acetilo
neuramínico y ciclohexilo amina. Preferiblemente, el papel de
filtro está impregnado en una solución de ácido
5-bromo-4-cloro-3-indoyl
\alpha-D-N-neuramínico
y ciclohexilo amina, en aproximadamente 1 mg/ml. El papel de
filtro puede utilizarse directamente o bien secarse o almacenarse
para un uso futuro. En consecuencia, el equipo de elementos puede
comprender
5-bromo-4-cloro-3-indoyl
\alpha-D-N-acetilo
ácido neuramínico ciclohexilo amina (por ejemplo en solución) y un
medio sólido (por ejemplo un papel de filtro) tal que el usuario
pueda aplicar el substrato al medio sólido, o bien en donde el
conjunto de elementos puede comprender un medio sólido al cual se
haya aplicado y secado una solución de
5-bromo-4-cloro-3-indoyl
\alpha-D-N-acetilo
ácido neuramínico ciclohexilo amina.
Este conjunto de elementos puede comprender
también un medio de incubación, por ejemplo una solución tampón
Tris/HCL y/o unos medios de obtención de una muestra, y pudiendo
empaquetarse conjuntamente en un envase adecuado con las
instrucciones adecuadas para su utilización.
El reactivo del ensayo utilizado en la presente
invención puede prepararse por un proceso en el cual el compuesto
reactivo se lleva a entrar en contacto con un sólido adecuado o un
medio de fase de gel, de forma que el compuesto reactivo esté
contenido o soportado o absorbido en el medio. Por ejemplo, el
compuesto reactivo puede ser preparado en una solución adecuada, la
cual se aplica entonces al medio sólido.
El reactivo del ensayo puede aplicarse a una
superficie de un substrato sólido, para formar un parche local que
es donde se realizará el ensayo del diagnostico.
Preferiblemente el sujeto mamífero es una mujer
embarazada o bien una mujer que esté valorando quedarse
embarazada.
La presente invención puede ser utilizada en un
método para diagnosticar PPT en un sujeto humano, cuyo método
comprende la etapa de ensayo de la actividad de la sialidasa
bacteriana en el paciente o en una muestra tomada del paciente.
Para una mejor comprensión de la presente
invención, y para mostrar la forma en que la misma puede entrar en
efecto, se hace referencia a continuación, a modo de ejemplo, al
ejemplo siguiente.
100 mujeres en consulta en la Clínica Genito
Urinaria de Milne, Hospital de Bristol Royal, fueron sometidas a
pruebas de la actividad de sialidasa adicionalmente a la rutina de
tinción de Gram para la detección de la VB. Se tomó una compresa
por separado en el instante del examen, y se colocó inmediatamente
en una solución tampón compuesta por 2 mls 25 mM Tris/HC1/Tween 20
(ph 7,0). Las compresas se colocaron en un almacenamiento frío a 4ºC
hasta el final del examen clínico.
El ácido del substrato de ácido sialico
5-Bromo-4-cloro-3-indolyl-\alpha-D-N-acetiloneuramínico
y la sal de ciclohexilamina se pesaron hasta una concentración de 1
mg/ml en una solución tampón de 25 mM CaCl, 150 M Na acetato y 1 M
NaCl (ph 5,5). Esto se mezclo debidamente y se trasladó con pipeta
sobre una pieza de 10 cm de diámetro de papel de filtro, hasta que
el papel de filtro quedara humedecido. Las compresas se retiraron
de la solución Tris y se frotaron sobre el papel de filtro inoculado
con el substrato. El papel de filtro se colocó en un disco de
Petri, cerrándose la tapa y el disco incubado durante 1 hora a 37ºC.
Apareció una mancha azul indicando que estaba presente la actividad
de la sialidasa. En caso de no existir ninguna actividad de la
sialidasa, el papel permanecería sin color incluso después de un
periodo de 2 horas con antelación al secado del papel de filtro.
La diagnosis del test de Gram de VB se valoró
por los criterios de Spiegel (1980). El grado 2 VB según lo
definido por Hay y otros (1992) es una categoría problemática, cuya
relación tanto con la VB como con la flora vaginal "normal"
requiere una aclaración adicional. Esta categoría no cumple con la
definición de la VB, y no está claro si el Grado 2 VB es una
indicación de que la colonización con los microorganismos de la VB
desarrollan una progresión ascendente. En este estudio, por tanto,
los Grados 1 y 2 forman un conjunto común para los fines del
análisis estadístico, aunque la valoración inicial de las tinciones
de Gram los divide en el Grado 1 (predominantemente Lactobacilus
morfo-tipos, Grado 2 (mezclados los Lactobacilus y
los organismos asociados con la VB), y Grado 3 (pocos o ningún
Lactobacilli, organismos VB predominantes con la presencia de
células de indicio). Los observadores fueron ciegos a los
resultados del ensayo de tipo mancha, y los observadores del ensayo
spot fueron ciegos a los resultados de la tinción Gram.
Los resultados de la tinción Gram para la VB
fueron correlacionados con los resultados del ensayo mancha. Los
resultados de Grado 1 y Grado 2 fueron conjuntados en forma común
para los análisis estadísticos, ya que el Grado 2 no se consideró
como una diagnosis definitivo de la VB, y las cifras numéricas en
este estudio fueron relativamente pequeñas.
Los rangos de las edades de los pacientes fueron
de 16 años a 52 años con una edad media de 28,3 años, una mediana
de 26 años y la moda de 25 años.
Un ensayo mancha positivo de la actividad de la
sialidasa se correlacionó significativamente con la incidencia del
Grado 3 de la VB en el diagnóstico de la tinción Gram al nivel de
p<0,000001. La sensibilidad del ensayo mancha en la detección de
la VB fue por tanto de 93,5 y la especifidad 96,3. El valor
predictivo positivo fue de 95,6 y el valor predictivo negativo de
94,5. Los criterios de Amsells (1990) fueron asociados
significativamente con los resultados del ensayo mancha al nivel de
p=0,04, con una sensiblidad de 93,7, especifidad de 70,5, un valor
predictivo positivo de 57,6 y un valor negativo de 96,2.
Claims (6)
1. Un método para la detección de la vaginosis
bacteriana, que comprende las etapas siguientes:
- (i)
- aplicar una muestra biológica obtenida de un sujeto humano en el substrato de sialidasa del ácido 5-bromo-4-cloro-3-indoyl \alpha-D-N-acetil neuramínico, o bien una sal del mismo, el cual se haya inmovilizado sobre un medio de soporte sólido; y
- (ii)
- detectar un cambio en el substrato de sialidasa inmovilizado.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde el cambio detectado es un cambio del color desde el tono
incoloro al azul, el cual se detecta utilizando un colorímetro de
tira o un espectrofotómetro.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, en donde el medio de soporte sólido es un papel de filtro.
4. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde la muestra es una compresa de
algodón o un lavado.
5. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde la muestra es una compresa y en
donde los contenidos de la compresa se extraen en un medio líquido
antes de contactar con el reactivo del ensayo.
6. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde la sal del ácido
5-bromo-4-cloro-3-indoyl
\alpha-D-N-neuramínico
es una sal ciclohexilo amino.
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