ES2329565T3 - Pruebas para monitorear pacientes con cancer, basadas en los niveles de analito de dominio extracelular (ecd) del factor receptor del crecimiento epidermico (egfr),solo o en combinacion con otros analitos,en muestras de fluidos corporales. - Google Patents

Pruebas para monitorear pacientes con cancer, basadas en los niveles de analito de dominio extracelular (ecd) del factor receptor del crecimiento epidermico (egfr),solo o en combinacion con otros analitos,en muestras de fluidos corporales. Download PDF

Info

Publication number
ES2329565T3
ES2329565T3 ES03709354T ES03709354T ES2329565T3 ES 2329565 T3 ES2329565 T3 ES 2329565T3 ES 03709354 T ES03709354 T ES 03709354T ES 03709354 T ES03709354 T ES 03709354T ES 2329565 T3 ES2329565 T3 ES 2329565T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
egfr
ecd
levels
cancer
normal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES03709354T
Other languages
English (en)
Inventor
Walter P. Carney
Peter J. Hamer
Allan Lipton
Kim Leitzel
Suhail M. Ali
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Original Assignee
Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Siemens Healthcare Diagnostics Inc filed Critical Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2329565T3 publication Critical patent/ES2329565T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/57585—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds identifiable in body fluids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57515—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5752—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the lungs
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57535—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the large intestine, e.g. colon, rectum or anus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57545—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the ovaries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57555—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the prostate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57557—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of other specific parts of the body, e.g. brain
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/485—Epidermal growth factor [EGF] (urogastrone)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Un método para monitorear el tratamiento de cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de ovarios y cáncer de colon, o la eficacia de este, en un paciente con cáncer sometido a dicho tratamiento, que comprende: (a) medición del nivel del dominio extracelular dividido activamente o descartado (ECD) del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en una muestra de fluido corporal del paciente con cáncer, siendo dicho fluido corporal seleccionado de sangre, suero o plasma; y (b) determinar si dicho nivel del ECD del EGFR se disminuye durante el curso del tratamiento del cáncer en comparación con el nivel en controles normales; en donde el rango normal del nivel en controles normales es 45 a 78 ng/ml; y además en donde una disminución en el nivel del ECD descartado o dividido activamente de EGFR en comparación con el nivel del ECD descartado o dividido activamente de EGFR en controles normales durante el periodo de seguimiento indica uno o más de los siguientes: (i) evolución del cáncer, (ii) una etapa más avanzada del cáncer, o (iii) falta de respuesta por el paciente al tratamiento del cáncer.

Description

Pruebas para monitorear pacientes con cáncer, basadas en los niveles de analito del dominio extracelular (ECD) del factor receptor del crecimiento epidérmico (EGFR), solo o en combinación con otros analitos, en muestras de fluidos corporales.
Campo de la invención
La presente invención se relaciona con análisis para el seguimiento o la evaluación del progreso de los pacientes con cáncer durante el curso de la enfermedad o tratamiento o terapia de la enfermedad, mediante la determinación de los niveles de un analito del cáncer, i.e., el dominio extracelular, o ectodominio, (ECD), del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), en comparación con los niveles del ECD del EGFR en controles normales. De acuerdo con un aspecto de los métodos descritos en este documento, la determinación de una disminución en los niveles del paciente de ECD del EGFR comparados con los niveles de este analito en controles normales es indicativo de resultados pobres del paciente y/o tratamiento en relación con el estado de la enfermedad. De acuerdo con otro aspecto de esta invención, la determinación de una disminución en los niveles del paciente de ECD del EGFR, en combinación con la determinación de los niveles de uno o más analitos adicionales, por ejemplo, un incremento en los niveles de HER-2/neu, proporciona además información clínica de diagnóstico y pronóstico relacionada con la evolución de la enfermedad y supervivencia global del paciente.
Antecedentes de la invención
El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es una proteína unida a la membrana de 170 kilodalton (kDa) expresada sobre la superficie de células epiteliales. El EGFR es un miembro de la familia del receptor del factor de crecimiento de la proteína tirosina quinasas, una clase de moléculas reguladoras del ciclo celular. (W.J. Gullick et al., 1986, Cancer Res., 46:285-292). EGFR se activa cuando su ligando (ya sea EFR o TGF\alpha) se une al dominio extracelular, resultando en la autofosforilación del dominio de la tirosina quinasa intracelular del receptor (S. Cohen et al, 1980, J. Biol. Chem., 255:4834-4842; A.B. Schreiber et al, 1983, J. Biol. Chem., 258:846-853). Los siguientes documentos indican un papel del EGFR en cáncer y carcinogénesis: Choi et al, 1997, Cancer, 79:1879-1883; Patanen et al, J. Occupational medicine, 1994, 36: 1324-1328; Zhou et al, FRONTIERS OF BIOTECHNOLOGY & PHARMACEUTICALS, 2002, 3:29-45; patent publication US-A-5 674 753.
EGFR es el producto de la proteína de un oncogén que promueve el crecimiento, erbB o ErbB1, que no es sino un miembro de una familia, i.e., la familia de ERBB de protooncogenes, que se cree que juega papeles esenciales en el desarrollo y progresión de varios cánceres humanos. La familia de ERBB, de oncogenes codifica cuatro, receptores transmembrana relacionados estructuralmente, a saber, EGFR, HER-2/neu (erbB2), HER-3 (erbB3) y HER-4 (erbB4). Clínicamente, la amplificación del oncogén de ERBB y/o la sobreexpresión del receptor en tumores han sido reportadas para correlacionar con la recurrencia de la enfermedad y pronóstico pobre del paciente, así como con la capacidad de respuesta en la terapia. (L. Harris et al., 1999, Int J. Biol. Markers, 14:8-15; y J. Mendelsohn y J. Baselga, 2000, Oncogene, 19:6550-6565).
EGFR se compone de tres dominios principales, a saber, el dominio extracelular (ECD), que es glicosilado y contiene el bolsillo enlace-ligando con dos regiones ricas en cisteina; un dominio transmembrana pequeño, y un dominio intracelular que tiene actividad de la tirosina quinasa intrínseca. La región transmembrana une el dominio enlace-ligando con el dominio Intracelular. El análisis de la secuencia de aminoácido y ADN, así como estudios de las formas no-glicosiladas de EGFR, indican que el esqueleto de la proteína del EGFR tiene una masa de 132 kDa, con 1186 residuos de aminoácido (A.L. Ullrich et al., 1984, Nature, 307:418-425; J. Downward et al., 1984, Nature, 307:521-527; C.R. Carlin et al., 1986, Mol. Cell. Biol., 6: 257-264; y F.L.V. Mayes and M.D. Waterfield, 1984, The EMBO J., 3:531-537).
El enlace de EGF o TGF\alpha con EGPR activa una senda de transducción de señales y da lugar a la proliferación celular. La dimerización, cambios conformacionales e internalización de la función de las moléculas de EGFR para transmitir señales intracelulares que conducen a la regulación del crecimiento celular (G. Carpenter and S. Cohen, 1979, Ann. Rev. Biochem., 48:193-216). Las alteraciones genéticas que afectan la regulación de la función del receptor del factor de crecimiento, o dan lugar a la sobreexpresión del receptor y/o ligando, resultan en la proliferación celular. Además, se ha determinado que EGFR juega un papel en la diferenciación celular, aumento de la motilidad celular, secreción de la proteína, neovascularización, invasión, metástasis y resistencia de las células cancerosas a los agentes quimioterapéuticos y la radiación. (M.-J. Oh et al., 2000, Clin. Cancer Res., 6:4760-4763).
El cáncer resulta de una serie de alteraciones genéticas que pueden incluir la activación de oncogenes que promueven el crecimiento celular y/o la pérdida de la función del gen supresor de tumor, que inhibe el crecimiento celular. Mientras que la mutación o sobreexpresión de los oncogenes produce las proteínas que pueden estimular crecimiento celular descontrolado, mutación o deleción de genes supresores del tumor dando lugar a la producción de proteínas no-funcionales que ya no controlan la proliferación celular. (W.P. Carney and J. Williams, 2001, Advance Laboratory, Women's Health, pp. 1-3).
Un número de reportes han indicado que la sobreexpresión de EGFR sucede en muchos tumores, cánceres, y afecciones malignas; específicamente, en cánceres de mama, células escamosas, cabeza y cuello, glioma, pulmón, gástrico, pancreático, vejiga, cuello del útero, ovario y próstata. (M.-J. Oh et al., 2000, Ibid.; (W.J. Gullick et al., 1986, Cancer Res., 46:285-292; B. Ozanne et al., 1986, J. Pathol., 149:9-14; S.J. McKenzie, 1991, Biochim. et Biophys. Acta, 1072:193-214; C. Wright et al., 1992, Br. J. Cancer, 65:118-212; G.N. Fuller et al., 1992, Mutation Res., 276:299-306; J.G.M. Klijn et al., 1992, Endocrine Rev., 13:3-17; S. Nicolson et al., 1991, Oncology, 1:43-52; y C. Wright et al., 1991, Br. J. Cancer, 63:967-970). El papel exacto de EGFR en tumorigénesis sigue sin determinar; sin embargo, algunos estudios del paciente con cáncer de mama han sugerido que EGFR elevado en tumores se puede correlacionar con malos parámetros de pronóstico y evolución de la enfermedad, tales como invasión o metástasis del nódulo linfático (J.-H. Choi et al., 1997, 87th Ann. Meeting AACR, Washington, D.C., April 20-24, 1996, pp. 1879-1883; J.G.M. Klijn et al., 1992, Endocrine Reviews, 13:3-17; S. Nicolson et al., 1991, Diagnostic Oncology; 1:43-52; C. Wright et al., 1991, British Journal Cancer, 63:967-970; J.R.C. Sainsbury et al., 1987, Lancet, 1:1398-1402; M.A. Rios et al., 1988, Anticancer Research, 8:173-176; A. Ullrich et al., 1990, Cell, 61:203-212; R. Nicolson et al., 1991, British Journal Cancer, 63:146-150).
Trabajos recientes han mostrado que los tumores que sobreexpresan EGFR pueden ser suceptibles al tratamiento con una variedad de terapias dirigidas a EGFR. Tales tratamientos incluyen inhibidores de molécula pequeña de la actividad de la quinasa del EGFR (R.G. Dullea et al., 2000, Proc. 91st Ann. Meeting of the American Association for Cancer Research (AACR), 41 (Abstract #2550):401; J.M. Nelson et al., 2000, Proc. 91st Ann. Meeting AACR, 41 (Abstract #2533):241; T. O'Reilly et al., 2000, Proc. 91st Ann. Meeting AACR, 41 (Abstract #3069):481; y H.C. Kelly et al., 2000, Proc. 91st Ann. Meeting AACR, 41 (Abstract #3896):612); oligonucleotidos antisentido (L. Witters et al., 1999, Breast Cancer Research and Treatment, 53:41-50); e inmunoterapias que actúan directamente en EGFR (X-D Yang et al., 2000, Proc. 91st Ann. Meeting AACR, 41 (Abstract #3380):530; X-D Yang et al., 1999, Cancer Research, 59:1236-1243; y L. Milas et al., 2000, Clinical Cancer Research, 6:701-708). Dichas terapias se pueden combinar con tradicionales regímenes de quimioterapia, con el fin de incrementar la eficacia terapéutica en una variedad de cánceres (T. Ohmori et al., 2000, Proc. 91st Ann. Meeting AACR, 41 (Abstract #3072): 48236 y A. Budillon et al., 2000, Proceedings of the 91st Ann. Meeting AACR, 41 (Abstract #4910):773).
Además del EGFR, el Receptor-2 del Factor de Crecimiento Epidérmico Humano (también denominado HER-2, HER-2/neu, neu, o c-erbB-2), otro receptor del factor de crecimiento de la superficie celular de la familia de ERBB del receptor de las tirosinas quinasas, también se ha reportado que se asocia con la proliferación celular descontrolada y cánceres. Como EGFR, HER-2/neu es un receptor de la tirosina quinasa transmembrana expresado en las células epiteliales. El polipéptido de HER-2/neu de longitud completa tiene un peso molecular de 185 kDa (p185).
Se ha demostrado que los ECDs de tanto EGFR como HER-2/neu, se liberan de la superficie celular y se ha encontrado que circulan en gente normal y en pacientes con cáncer. El ECD o ECD descartado de HER-2/neu es una glicoproteína de entre 97 y 115 kDa, denominada como p105 (W.P. Carney et al., 1991, J. Tumor Marker Oncol., 6(2):53-72). El ECD primario del EGFR es 110 kDa y se denomina como p110. Los fragmentos circulantes más pequeños de EGFR también se han reportado. (A.J. Baron et al., 1999, Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention, 8:129-137) en pacientes. El ECD descartado de HER-2/neu se ha demostrado que se incrementa en suero de pacientes con cáncer (por ejemplo, W.P. Carney et al., 1991, J. Tumor Marker Oncol., 6(2):53-72). Los incrementos en EGFR se han documentado principalmente en el nivel de los tejidos, basándose en los análisis del EGFR de longitud completa, p170. Los niveles incrementados de ECD del EGFR han sido reportados en el suero de pacientes con cáncer cervical. (M.-J. Oh et al., 2000, Clin. Cancer Res., 6:4760-4763).
Debido a que tanto el EGFR como HER-2/neu se expresan en al menos un 20-40% de las mujeres con cáncer de mama, ovario y cervical, así como en una amplia variedad de otros cánceres que afectan ambos sexos, es un problema en el oficio que sea capaz de identificar con precisión y sensibilidad, seleccionar y monitorear aquellos individuos que son propensos a responder, y que responden a, o se benefician de, terapia anti-EGFR y/o terapia anti-HER-2/neu, tratamientos o terapias convencionales anti-cáncer o antineoplasticos, o terapias combinadas, cuando sea apropiado.
La presente invención resuelve este problema, proporcionando un método sensible y fiable, particularmente un método de inmunoensayo, para determinar los niveles de cambio, particularmente, niveles disminuidos, de ECD del EGFR en muestras de fluido corporal de pacientes con cáncer en relación con aquellos de individuos normales. También se proporcionan los métodos en los que niveles de ECD del EGFR se determinan en relación con los niveles de otros analitos, en particular, HER-2/neu, para diagnosticar y/o pronosticar la evolución de la enfermedad y la supervivencia en pacientes con cáncer. Además, la presente invención es ventajosa ya que se emplea para monitorear los pacientes con cáncer sometidos a tratamientos y terapias de cáncer o anti-neoplásicos para cánceres asociados con sobreexpresión de EGFR para ayudar en la determinación del progreso del tratamiento del cáncer y evolución del paciente durante el curso de la o las terapias anti-cáncer y/o la enfermedad.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona un ensayo (método) de acuerdo con la reivindicación 1 para el análisis de muestras de fluido corporal, particularmente, muestras de suero o plasma, en pacientes con cáncer para detectar y medir cambios en los niveles del ECD descartado a partir del EGFR, así como ECD que se divide activamente a partir del EGFR, y particularmente, para determinar si hay una disminución en tales niveles de ECD del EGFR en pacientes con cáncer en comparación con los niveles de ECD del EGFR encontrados en individuos normales.
\newpage
De acuerdo con esta invención, la determinación de una disminución medible en niveles de ECD del EGFR en la muestra de fluido corporal de pacientes con cáncer en comparación con los niveles de ECD del EGFR en controles normales es una indicación de severidad de la enfermedad, mala respuesta del paciente al tratamiento, y/o mala evolución del paciente de una enfermedad. De esta manera, el conocimiento del progreso del paciente y/o eficacia del tratamiento, o la ausencia de este, se proporciona mediante la práctica del método de esta invención. Esta información es disponible para la comunidad médica, el médico y el paciente, para ayudar en la toma de decisiones informadas concernientes al tratamiento del cáncer del paciente y las consecuencias del tratamiento y enfermedad durante el curso de la enfermedad y/o tratamiento o terapia para la enfermedad.
Un aspecto particular de la presente invención proporciona un método de seguimiento en los que los niveles en suero de ECD del EGFR en pacientes con cáncer de mama se monitorean durante el curso del tratamiento del cáncer o anti-neoplásico, y también preferiblemente, antes de y en el inicio del tratamiento. La determinación de una disminución en los niveles en suero de ECD del EGFR en el paciente con cáncer de mama en comparación con los niveles de ECD del EGFR en individuos normales sin cáncer permite la siguiente evaluación relacionada con progreso y/o evolución del paciente: (i) un estadio o grado del cáncer más grave; (ii) menor tiempo de evolución de la enfermedad, y/o (iii) ausencia de un positivo, i.e., respuesta, eficaz por el paciente al tratamiento del cáncer.
Otro aspecto de la presente invención proporciona un método de seguimiento en el cual los niveles de ECD del EGFR en una muestra de fluido corporal de pacientes que tienen cáncer o enfermedad neoplásica, por ejemplo, de colon, vejiga, próstata, mama (mamario), o pulmón, se monitorean durante el curso del tratamiento del cáncer o anti-neoplásico, y preferiblemente antes de, o justo a, el inicio del tratamiento. La determinación de una disminución en la muestra de los niveles del analito de ECD del EGFR en el paciente con cáncer en comparación con los niveles normales de ECD de EGFR, permite que el médico sea capaz de evaluar la evolución del paciente de la enfermedad y/o resultado de la enfermedad. Por ejemplo, basándose en el seguimiento de los niveles del analito del ECD del EGFR del paciente, durante el tiempo en relación con niveles normales de este analito, así como con los niveles propios del paciente determinados antes, una determinación se puede hacer en cuanto a si un régimen de tratamiento se debería cambiar, i.e., que sea más agresivo o menos agresivo; para determinar si el paciente está respondiendo favorablemente a su tratamiento; y/o para determinar el estado de la enfermedad, tal como estado avanzado o fase del cáncer, o una remisión, reducción o regresión del cáncer o enfermedad neoplásica.
Otro aspecto de la presente invención proporciona un análisis in vitro para un seguimiento del paciente con cáncer para evaluar el curso de la enfermedad en un paciente con cáncer y/o respuesta del paciente al tratamiento o terapia del cáncer utilizando muestras de fluido corporal para medir y determinar una disminución en los niveles de ECD del EGFR en la muestra de fluido corporal en comparación con un nivel de rango normal de ECD del EGFR en individuos saludables como controles. De acuerdo con modalidades particulares, el seguimiento involucra pacientes que tienen cáncer de mama metastásico, u otros tipos de cánceres, por lo cual la severidad del grado o estado del cáncer se correlaciona con la disminución porcentual en niveles de ECD del EGFR en la muestra del paciente en comparación con los niveles de ECD del EGFR en controles normales.
Incluso otro aspecto de esta invención proporciona un rango normal de ECD del EGFR en el suero de individuos masculinos y femeninos saludables para utilizar en la comparación de los niveles de ECD del EGFR en el suero de pacientes sometidos a prueba de acuerdo con los métodos actuales.
Otro aspecto de la presente invención, proporciona de acuerdo con la reivindicación 31 análisis y métodos de prueba y seguimiento de un paciente con cáncer de mama, y más particularmente, de prueba y seguimiento de un paciente con cáncer de mama metastásico, para evaluar el curso y resultado de la enfermedad del paciente con cáncer, y/o respuesta del paciente al tratamiento o terapia del cáncer. Los análisis y métodos emplean muestras de fluido corporal para medir y determinar una disminución en los niveles de ECD del EGFR en combinación con un incremento en los niveles de HER-2/neu (> 15 ng/ml), preferiblemente HER-2/neu ECD, en la muestra de fluido corporal en comparación con los niveles de rangos normales de ECD del EGFR y HER-2/neu en individuos normales como controles. El análisis de los niveles de EGFR y HER-2/neu, en combinación, proporciona una nueva visión médica y clínica acerca de un criterio de valoración de la respuesta, tratamiento, pronóstico, curso de enfermedad y supervivencia de un paciente con cáncer que puede mejorar las evaluaciones de diagnóstico y pronóstico del paciente.
De acuerdo con una modalidad particular relacionada, el ensayo y método involucra pacientes que tienen cáncer de mama, especialmente cáncer de mama metastásico, en el que el hallazgo de una combinación de niveles elevados de HER-2/neu en suero, preferiblemente, niveles de ECD de HER-2/neu, y niveles disminuidos de ECD del EGFR en la muestra del paciente, era indicativo de un menor tiempo a la progresión y menor tiempo de supervivencia global en comparación con mujeres que tienen cáncer de mama que tenían una o más de las siguientes características: a) niveles normales de EGFR (por ejemplo, 45-78 ng/ml) y niveles normales de ECD de HER-2/neu (por ejemplo, <15 ng/ml); b) niveles normales de EGFR y niveles elevados de HER-2/neu (por ejemplo, \geq15 ng/ml); y/o c) niveles disminuidos de EGFR, pero niveles normales de HER-2/neu. Este aspecto de la presente invención es particularmente ventajosa, ya que le permite al médico seleccionar más efectivamente los mejores tratamientos, así como utilizar regímenes de tratamiento y terapia más agresivos, para las mujeres cuyos niveles de la oncoproteína de EGFR se reduce y cuyos niveles de la oncoproteína de HER-2/neu, se elevan para contrarrestar su mal pronóstico y tiempo de supervivencia global en relación con los individuos control.
\newpage
Otro aspecto de esta invención proporciona un valor normal para los niveles de HER-2/neu en una muestra de suero del individuo, preferiblemente, un individuo de sexo femenino, para utilizar en la comparación de los niveles de ECD de HER-2/neu en el suero de pacientes sometidos a la prueba de acuerdo con los métodos actuales. De acuerdo con estos métodos, un nivel normal HER-2/neu se define como menor de 15 ng/ml, mientras que un nivel elevado se define como mayor de o igual a 15 ng/ml.
Otros aspectos, características y ventajas de la presente invención se apreciaran mejor en una lectura de la descripción detallada de la invención cuando se considera en relación con las figuras y dibujos acompañantes.
Breve descripción de las figuras
Figs. 1A y 1B ilustran el cambio de los niveles en suero de ECD del EGFR en comparación con los niveles de ECD del EGFR en suero en individuos normales, como se determina siguiendo la práctica del método de acuerdo con la presente invención empleando muestras de pacientes con cáncer que tienen cáncer de pulmón, vejiga, próstata, ovario, mama y colon. Fig. 1A muestra el cambio en ECD del EGFR en el suero de pacientes con cáncer como un incremento o disminución en comparación con los niveles de ECD del EGFR en controles normales. Fig. 1B presenta el cambio porcentual en niveles en suero de ECD del EGFR de pacientes con cáncer en comparación con niveles normales en suero de ECD del EGFR, dónde el rango normal de ECD del EGFR es 45-78 ng/ml. Para los niveles de ECD del EGFR de pacientes con cáncer de pulmón, el incremento porcentual fue de 0%, y la disminución porcentual fue de 42%; para los niveles de ECD del EGFR de pacientes con cáncer de vejiga, el incremento porcentual fue 0%, y la disminución porcentual fue del 56%; para los niveles de ECD del EGFR de pacientes con cáncer de próstata, el incremento porcentual fue del 7%, y la disminución porcentual fue del 44%; para los niveles de ECD del EGFR de pacientes con cáncer de ovarios, el incremento porcentual fue del 0%, y la disminución porcentual fue del 48%; para los niveles de ECD del EGFR de pacientes con cáncer de mama (cáncer de mama en estadio IV), el incremento porcentual fue del 2%, y la disminución porcentual fue del 32%; y para los niveles de ECD del EGFR de pacientes con cáncer de colon, el incremento porcentual fue del 0%, y la disminución porcentual fue
del 67%.
Fig. 2 ilustra los valores medio de ECD del EGFR en suero (en ng/ml) como se determina en suero de hombre normal y suero de mujer normal. (Tabla 1).
Fig. 3 ilustra los resultados de la determinación de niveles de ECD del EGFR en suero o plasma de pacientes que tienen cáncer de ovarios. Como se muestra, según el estadio de cáncer de ovarios aumentado, también hizo el porcentaje de muestras de suero que mostraron niveles disminuidos de EGFR, lo que refleja una correlación de la etapa aumentada de cáncer de ovarios con una disminución en los niveles en suero de ECD del EGFR en el
paciente.
Fig. 4 describe el tiempo a la progresión de la enfermedad, basándose en una evaluación de la combinación de suero EGFR y niveles de HER-2/neu en el suero de mujeres con cáncer de mama. La Fig. 4 ilustra la probabilidad de la progresión del inicio de la terapia de cáncer versus el tiempo (días) basándose en el análisis del pre-tratamiento de muestras de suero de 265 mujeres que tienen cáncer de mama, en los que las siguientes combinaciones de niveles del analito de la oncoproteína se determinaron y compararon:
a) niveles normales de EGFR/niveles normales de HER-2/neu (<15 ng/ml);
b) niveles bajos de EGFR/niveles normales de HER-2/neu (<15 ng/ml);
c) niveles elevados de HER-2/neu (\geq15 ng/ml)/niveles normales de EGFR; y
d) niveles elevados de HER-2/neu (\geq15 ng/ml)/niveles bajos de EGFR.
Para a) versus b) arriba, p = 0.45; para c) versus d) arriba, p = 0.01. Como se puede observar de los resultados, el tiempo a la progresión se determina que es aproximadamente 6 meses para aquellos pacientes que tienen niveles elevados de HER-2/neu en suero combinados con niveles bajos de EGFR en suero, versus (i) en aproximadamente 1.5 años para pacientes que tienen niveles elevados de HER-2/neu combinados con niveles normales de EGFR, o niveles bajos de EGFR combinados con niveles normales de HER-2/neu; y (ii) en aproximadamente 3.5 años para pacientes que tienen niveles normales de EGFR y niveles normales de HER-2/neu.
Fig. 5 describe el tiempo de supervivencia global para pacientes con cáncer de mama, basándose en una evaluación de la combinación de niveles séricos de EGFR y de HER-2/neu en el suero de mujeres con cáncer de mama. La Fig. 5 ilustra la probabilidad de supervivencia a partir del inicio de la terapia de cáncer versus el tiempo (días) basándose en el análisis de muestras de suero (n = 23) a partir de mujeres que tienen cáncer de mama, en las cuales las siguientes combinaciones de niveles del analito de la oncoproteína se determinaron y compararon:
a) niveles normales de EGFR/niveles normales de HER-2/neu (<15 ng/ml);
b) niveles bajos de EGFR/niveles normales de HER-2/neu (<15 ng/ml);
c) niveles elevados de HER-2/neu (\geq15 ng/ml)/niveles normales de EGFR; y
d) niveles elevados de HER-2/neu (\geq15 ng/ml)/niveles bajos de EGFR.
Para a) versus b) arriba, p = 0.06; para b) versus d), p = 0.03; y para c) versus d), p = 0.18. Como se puede observar de los resultados, el tiempo de supervivencia global es aproximadamente 2.5 años para aquellos pacientes que tienen niveles elevados de HER-2/neu en suero combinado con niveles bajos de EGFR en suero. El tiempo de supervivencia global para pacientes que tienen niveles elevados de HER-2/neu combinado con niveles normales de EGFR es ligeramente menor de aproximadamente 3 años. Para aquellos pacientes que tienen niveles bajos de EGFR combinados con niveles normales de HER-2/neu, el tiempo de supervivencia global es casi 3.5 años, mientras que el tiempo de supervivencia global para pacientes que tienen niveles normales de EGFR y niveles normales de HER-2/neu es mayor de 4 años.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se relaciona con una determinación exacta y sensible de si los pacientes con cáncer tienen niveles disminuidos del dominio extracelular o ectodominio (ECD) de EGFR relativo o en comparación con los niveles de este analito en individuos normales. La determinación de niveles disminuidos o inferiores del analito ECD del EGFR en una muestra de fluido corporal de un paciente con cáncer comprende un método o ensayo especialmente para utilizar para seleccionar en el tiempo, o monitorear, pacientes con cáncer sometidos a terapias de cáncer, incluyendo terapias anti-EGFR, tales como aquellas descritas en este documento, para evaluar uno o más de los siguientes parámetros: eficacia terapéutica, respuesta del paciente, estado del paciente, progreso de la terapia y el curso clínico y/o resultado del cáncer o enfermedad neoplásica. Los métodos actuales también abarcan un método para determinar o la valoración de la evolución del paciente o severidad de la enfermedad, basándose en la determinación de los niveles disminuidos del analito de ECD del EGFR en pacientes con cáncer en comparación con los niveles de estos analitos en individuos normales.
La presente invención abarca el uso de los métodos de análisis in vitro descritos para evaluar pacientes que tienen una variedad de tipos de cánceres, tumores, o neoplasmas. Ejemplos no-limitantes de cánceres, tumores, y enfermedades neoplásicas incluidos por esta invención incluyen cánceres de tumor sólido, y cánceres de pulmón; mama (mamario); próstata; cánceres ginecológicos, tales como aquellos del cuello del útero, ovario, vulva, vagina y endometrio; cánceres del tracto urinario, tales como aquellos de la vejiga; cánceres del páncreas; esófago; cabeza y cuello; riñón; hígado; estómago (gástrico); y colon.
Esta invención además plasma la capacidad para monitorear o examinar la progresión de un cáncer dado durante el curso de análisis o tratamiento como se describe en este documento. Por ejemplo, el desempeño del método de esta invención proporciona una determinación de un correlación entre los niveles disminuidos de ECD del EGFR en comparación con niveles normales de ECD del EGFR (i.e., una comparación con un rango normal, un valor normal, o un valor normal de corte), y estadio o grado de un cáncer, tal como cáncer de mama, cáncer de ovarios, y cáncer de próstata. Además, para cáncer de mama metastásico, la invención permite una determinación del beneficio clínico, tiempo a la progresión (TTP), y duración del tiempo de supervivencia basándose en los hallazgos de niveles disminuidos de ECD del EGFR en comparación con los niveles de este analito en individuos normales, preferiblemente en muestras de suero.
De acuerdo con esta invención, el análisis preferiblemente involucra una muestra de fluido corporal, o una muestra de tejido, tomada de un mamífero, preferiblemente un humano, más preferiblemente un paciente con cáncer. Se debe entender que el fluido corporal o muestras de tejidos de otros mamíferos, por ejemplo, primates no-humanos, y otros animales grandes y pequeños, son capaces de ser monitoreados por los métodos, como se describen en este documento. Los fluidos corporales apropiados incluyen, pero no se limitan a, muestras de fluido pleural, muestras de fluido de lavado bronquial o pulmonar, muestras de fluido sinovial, muestras de fluido peritoneal, muestras de aspirado de la médula ósea, linfa, fluido cerebroespinal, muestras de fluido ascítico, muestras de fluido amniótico, muestras de esputo, lavados de vejiga, semen, orina, saliva, lágrimas, sangre, y sus componentes suero y plasma, y similares. El suero es una muestra de fluido corporal preferida, ya que permite la evaluación a tiempo real del estado de EGFR de un paciente con cáncer, permite las pruebas repetidas para el seguimiento del paciente y se puede realizar de una manera estandarizada y cuantitativa. Las muestras de tejidos apropiados incluyen varios tipos de cáncer de tumor o tejido, o tejido de órgano, tales como aquellos tomados en la biopsia.
En otra de sus modalidades, la presente invención abarca análisis y métodos para prueba y seguimiento de un paciente con cáncer, particularmente prueba y seguimiento de un paciente con cáncer de mama, y más particularmente, prueba y seguimiento de cáncer de mama metastásico, para evaluar el curso y resultado de la enfermedad de un paciente con cáncer, y/o respuesta de un paciente al tratamiento o terapia del cáncer, mediante la medición dos analitos en combinación. Más específicamente, el análisis y métodos emplean una muestra de fluido corporal del paciente para medir y determinar, en combinación, una disminución en los niveles de ECD del EGFR y un incremento en los niveles de HER-2/neu, preferiblemente, ECD de HER-2/neu, en la muestra de fluido corporal en comparación con los valores de nivel normal de ECD del EGFR y HER-2/neu en individuos utilizados como controles.
Las interacciones entre miembros de la superfamilia de EGFR proporcionan una base para la evaluación de los niveles de dos de las proteínas receptor en combinación de acuerdo con la presente invención. Actualmente, la superfamilia de EGFR incluye cuatro miembros, a saber, EGFR, HER-2/neu, HER-3 y HER-4. Para su activación, estas proteínas se combinan para formar un complejo de dos receptores. Por ejemplo, los complejos pueden ser tanto homodímeros (por ejemplo, HER-2/neu y HER-2/neu; EGFR y EGFR) o heterodímeros (por ejemplo, EGFR y HER-2/neu). Reciéntemente se proporciona por la presente invención una herramienta de diagnóstico y pronóstico para la determinación de los criterios de valoración clínicos que comprenden una evaluación de los niveles de HER-2/neu y EGFR, en combinación, para ayudar al médico y al paciente en ciertas terapias dirigidas para tratar el paciente, y para seleccionar los tipos de tratamientos que se deberían utilizar. La invención además proporciona parámetros medibles sobre los que el médico puede confiar en la determinación de, si se debe iniciar, continuar, o modificar un curso del tratamiento y terapia para un paciente.
De acuerdo con una modalidad particular relacionada, la presente invención abarca un ensayo y método que involucra pacientes que tienen cáncer, particularmente cáncer de mama, más particularmente cáncer de mama metastásico, en el que el hallazgo de una combinación de niveles elevados de HER-2/neu en suero (por ejemplo, mayor del nivel normal de <15 ng/ml) y niveles disminuidos de ECD del EGFR (por ejemplo, menor del rango normal de 45-78 ng/ml) en la muestra del paciente era indicativo de un menor tiempo a la progresión y menor tiempo de supervivencia global en comparación con las mujeres que tienen cáncer de mama que tenían una o más de las siguientes características:
a) niveles normales de EGFR (por ejemplo, 45-78 ng/ml) y niveles normales de ECD de HER-2/neu (por ejemplo, <15 ng/ml);
b) niveles normales de EGFR y niveles elevados de HER-2/neu (\geq15 ng/ml); y/o
c) niveles disminuidos de EGFR, pero niveles normales de HER-2/neu.
La modalidad que abarca los análisis combinados de ambos niveles de ECD del EGFR y HER-2/neu en pacientes, es particularmente valiosa e informativa, ya que le permite al médico seleccionar más efectivamente los mejores tratamientos, así como utilizar regímenes de tratamiento y terapia más agresivos, para las mujeres cuyos niveles de la oncoproteína de EGFR se reducen y cuyos niveles de la oncoproteína de HER-2/neu se elevan en relación con los individuos control. El tratamiento, o combinación de tratamientos y regímenes más agresivos, pueden servir para contrarrestar el mal pronóstico del paciente y el tiempo de supervivencia global. Como se describe en el Ejemplo 5, pacientes que tienen niveles en suero de HER-2/neu elevados y bajos de EGFR podrían beneficiarse de las terapias dirigidas combinadas de EGFR- y HER-2/neu, mientras que los pacientes que tienen niveles normales de HER-2/neu en suero y niveles bajos de EGFR podrían beneficiar de terapia dirigida de EGFR sola.
Además, los métodos de esta invención son beneficiosos, ya que pueden ayudar médicos, personal médico y profesionales médicos en subdividir a los pacientes con cáncer de mama en poblaciones de alto riesgo y bajo riesgo. Aquellos pacientes que tienen niveles de EGFR por debajo del rango normal límite de aproximadamente 45-78 ng/ml y niveles de HER-2/neu por encima de <15 ng/ml se pueden determinar que son los pacientes con el menor tiempo a la progresión y la menor supervivencia global. Armado con esta información, el médico puede optar por proporcionar ciertos tipos de tratamiento y/o terapia y/o tratamientos más agresivos para el paciente que está en una categoria de alto riesgo.
En otra modalidad, un rango normal de niveles de HER-2/neu en el suero de individuos, preferiblemente mujeres, se ofrece por esta invención para utilizar en la comparación de los niveles de ECD de HER-2/neu en el suero de pacientes sometidos a la prueba, diagnóstico, y/o seguimiento de acuerdo con los métodos actuales. El rango normal de HER-2/neu en suero es menor de aproximadamente 15 ng/ml (<15 ng/ml).
En una modalidad más preferida, esta invención se relaciona con la prueba y análisis de niveles en suero de las oncoproteínas de EGFR y HER-2/neu en mujeres con cáncer de mama metastásico para obtener clínicamente información útil basándose en los niveles de estas oncoproteínas, cuando se examina en relación uno con el otro. Un hallazgo de niveles disminuidos de EGFR, en donde la disminución se refiere a los niveles que son menores del rango control de aproximadamente 45-78 ng/ml, combinado con niveles elevados de HER-2/neu, en donde elevados se refiere a niveles que son mayores del valor control de aproximadamente <15 ng/ml, avisa al médico que estos pacientes tienen un menor tiempo a la progresión de su cáncer, y/o un tiempo menor de supervivencia global. Los valores obtenidos de las muestras de pacientes se compararon (i) con valores de mujeres que tienen ambos niveles de EGFR (45-78 ng/ml) y de HER-2/neu (<15 ng/ml) normales; (ii) con valores de mujeres que tienen niveles normales de EGFR, pero niveles elevados de HER-2/neu; y (iii) con valores de mujeres que tienen niveles disminuidos de EGFR, pero niveles normales de HER-2/neu.
De acuerdo con esta invención, el ECD del EGFR se puede medir en la muestra de fluido corporal, por ejemplo, suero o plasma, utilizando análisis que detectan el dominio extracelular del EGFR, por ejemplo, inmunoensayos radioisotópicos o inmunoensayos no-isotópicos, por ejemplo, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos enzimáticos, tales como un inmunoensayo ligado de enzima (ELISA), que son disponibles comercialmente, conocidos y practicados en el oficio. (Ver, por ejemplo, U.S. Patent Nos. 5,344,760 y 5,674,753 a J. Harvey et al.; EGF-R ELISA (CN Biosciences, Boston, MA); y EGFr Microtiter ELISA (Bayer Diagnostics/Oncogene Science, Cambridge, MA).
Además, HER-2/neu (o HER-2/neu ECD) se puede medir en la muestra de fluido corporal, por ejemplo, suero o plasma, utilizando análisis que detectan HER-2/neu, y/o el dominio extracelular de HER-2/neu, por ejemplo, inmunoensayos radioisotópicos o inmunoensayos no-isotópicos, por ejemplo, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos enzimáticos, tales como un inmunoensayo ligado de enzima (ELISA), que son disponibles comercialmente, conocidos y practicados en el oficio. (Ver, por ejemplo, U.S. Patent No. 5,401,638 y EP 0494135 relating to detection of the p105 dominio of HER-2/neu, y U.S. Patent No. 5,604,107, EP 0412116 y Canadian patent 2,026,250-8 relating to the detection and quantification of the full length p185 protein; HER-2/neu ELISA (CN Biosciences, Boston, MA); y HER-2/neu Microtiter ELISA (Bayer Diagnostics/Oncogene Science, Cambridge, MA).
A modo de ejemplo, otros medios para determinar y medir los niveles de ECD del EGFR, así como niveles de HER-2/neu en una muestra incluyen, cromatografía de afinidad, análisis de enlace de ligando y análisis de enlace de lectina. Inmunoensayos, especialmente se prefieren, los inmunoensayos no-radioisotópicos. Valores de rango normal y normal promedio se pueden determinar, para que el ensayo se realice basándose en muestras de población normal (saludable), como se conoce y practica en el oficio.
Los anticuerpos dirigidos contra la proteína de EGFR, la proteína de HER-2/neu, o epitopes antigénicos o inmunogénicos de este, particularmente los ECDs de estas proteínas receptor, pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales. Los anticuerpos apropiados para utilizar en el análisis de esta invención también incluyen anticuerpos quiméricos, de cadena sencilla, y humanizados, así como fragmentos Fab, F(ab')2, o Fv, o el producto de una biblioteca de fago, por ejemplo, una biblioteca de expresión de Fab. Varios procedimientos conocidos en el oficio se pueden utilizar para la producción de tales anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. Ejemplos de métodos despliegue de fagos que se pueden utilizar para hacer anticuerpos para utilizar en la presente invención incluyen aquellos revelados en Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods, 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Los métodos, 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol., 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene, 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology, 57:191-280; y en U.S. Patent Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 y 5,969,108.
Los anticuerpos generados contra el ECD del EGFR, el ECD de HER-2/neu, o las proteínas completas, se pueden obtener por inyección directa de una preparación inmunogénica del EGFR o HER-2/neu en un animal, o por la administración completa, o la porción de ECD, de los polipéptidos del EGFR o de HER-2/neu a un animal, preferiblemente un animal no-humano. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de línea celular continuos se pueden utilizar. Ejemplos incluyen la técnica de hibridoma (Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Ed. 1988; and Hammerling, et al., In: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y., pages 563-681, 1981), la técnica del trioma, la técnica de hibridoma de la célula-B humana (Kozbor et al., 1983, Immunol. Today, 4:72), y la técnica de hibridoma-EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., 1985. In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (U.S. Patent No. 4,946,778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla para el ECD del EGFR. También, se pueden utilizar ratones transgénicos para expresar anticuerpos humanizados para el ECD del EGFR inmunogénico, o el ECD de HER-2/neu.
Los métodos para producir y seleccionar anticuerpos específicos de ECD de anti-EGFR- o anticuerpos específicos anti-ECD de HER-2/neu, utilizando tecnología de hibridoma son rutinarios y bien conocidos en el oficio. En un ejemplo no-limitante, los ratones se pueden inmunizar con un inmunógeno, i.e., polipéptido o péptido de ECD del EGFR de este, polipéptido o péptido de ECD de HER-2/neu de este, o con una célula que expresa estos polipéptidos o péptidos. Una vez que una respuesta inmune se detecta, por ejemplo, los anticuerpos específicos para el antígeno se detectan en el suero de ratones inmunizados, el bazo se cosecha y los esplenocitos se aíslan. Los esplenocitos luego se funden por técnicas bien conocidas con cualquier célula del mieloma apropiada, por ejemplo células de la línea celular SP2/0 o P3X63-AG8.653 disponibles de la ATCC. Los hibridomas se seleccionan y clonan por técnicas de dilución limitadas. Los clones de hibridoma luego se ensayan por métodos conocidos en el oficio para determinar y seleccionar aquellas células que secretan anticuerpos capaces de unirse a un polipéptido de la invención. El líquido ascítico, que generalmente contiene altos niveles de anticuerpos, se puede generar, inyectando ratones con clones de hibridoma positivos.
Los polipéptidos de EGFR o polipéptidos de HER-2/neu que comprenden uno o más epitopes de ECD inmunogénico que inducen una respuesta del anticuerpo se pueden introducir junto con una proteína transportadora, tal como una albúmina, a un animal huésped (tal como conejo, ratón, rata, oveja, o cabra). Alternativamente, si el polipéptido tiene una longitud suficiente (por ejemplo, al menos de aproximadamente 25 aminoácidos), el polipéptido se puede presentar sin un portador. Sin embargo, se ha demostrado que los epitopes inmunogénicos que comprenden tan solo 5 a 10 aminoácidos son suficientes para crear anticuerpos capaces de unirse a, en al menos, epitopes lineales en un polipéptido desnaturalizado (por ejemplo, en Western blotting).
La proteína de EGFR que lleva un epitope de ECD o proteína de HER-2/neu o péptidos de estas, se pueden utilizar para inducir anticuerpos de acuerdo con métodos bien conocidos en el oficio incluyendo, pero no limitando a, inmunización in vivo, inmunización in vitro, y métodos de despliegue de fagos. Ver, por ejemplo, Sutcliffe et al., 1983, Science, 219:660-666; Wilson et al., 1984. Cell, 37:767-778; y Bittle et al., 1985, J. Gen. Virol., 66:2347-2354). Si la inmunización in vivo se utiliza, los animales se pueden inmunizar con péptido libre; sin embargo, el título del anticuerpo anti-péptido se puede impulsar, por el acoplamiento del péptido con un portador macromolecular, tales como hemocianina extraída de lapa californiana (KLH), o toxoide del tétano (TT). Por ejemplo, péptidos que contienen residuos de cisteina se pueden acoplar a un portador utilizando un ligador tal como maleimidobenzoil-N-hidroxisucinimida éster (MBS), mientras que otros péptidos se pueden acoplar a portadores utilizando un agente de enlace más general, tal como glutaraldehido.
Los anticuerpos específicos para el ECD del EGFR o de HER-2/neu se pueden producir por cualquier método conocido en el oficio para la síntesis de anticuerpos, en particular, por síntesis química, por inmunización intracelular (i. e., tecnología intracuerpo), o por técnicas de expresión recombinante. Los métodos para producir anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, tecnología de hibridoma, transformación de EBV, así como a través del uso de tecnología de ADN recombinante. La expresión recombinante de un anticuerpo, o un fragmento, derivado, variante o análogo de este, (por ejemplo, una cadena ligera o pesada de un anticuerpo ECD de anti-EGFR, o de un anticuerpo anti-ECD de HER-2/neu), requiere de la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el anticuerpo. Una vez un polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo o una cadena ligera o pesada de un anticuerpo, o porción de este (que contiene preferiblemente el dominio variable de cadena ligera o pesada) se ha obtenido, el vector para la producción de la molécula de anticuerpo se puede producir por tecnología de ADN recombinante utilizando técnicas bien conocidas en el oficio. Técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y métodos de recombinación genética in vivo, que son bien conocidas por aquellos de habilidad en el oficio, se pueden utilizar para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican un anticuerpo y apropiadas señales control transcripcional y traduccional. Tales vectores pueden incluir la secuencia de nucleótido que codifica la región constante de la molécula de anticuerpo (ver, por ejemplo, PCT Publication WO 86/05807; PCT Publication WO 89/01036; y U.S. Patent No. 5,122,464) y la región variable del anticuerpo clonado en dicho vector de expresión de cadena ligera o pesada total.
El vector de expresión, luego se introduce en una célula huésped por técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan por técnicas convencionales para producir un anticuerpo anti-EGFR-ECD o un anticuerpo anti-ECD de HER-2/neu. Una variedad de sistemas de vector de expresión huésped, se pueden utilizar para expresar las moléculas de anticuerpos. Tales sistemas de expresión representan vehículos por los cuales las secuencias codificantes de interés se pueden expresar, sus productos codificados producidos y purificados posteriormente. Estos sistemas también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias de nucleótido apropiadas que codifican, expresan una molécula de anticuerpo de la invención in situ. Sistemas de expresión celular incluyen, pero no se limitan, a microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN bacteriofago recombinante, ADN del plásmido o ADN del cósmido que contienen secuencias que codifican el anticuerpo; levadura (por ejemplo, Saccharomyces o Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias que codifican el anticuerpo; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias que codifican el anticuerpo; sistemas de célula vegetal infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, virus mosaico del coliflor (CaMV) o virus mosaico del tabaco (TMV)), transformados con vectores de expresión de plásmido recombinante (por ejemplo, plásmido Ti) que contiene secuencias que codifican el anticuerpo; o sistemas de célula de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 3T3, NSO) que hospedan construcciones de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de la metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor rezagado del adenovirus; el promotor 7.5K del virus de la vacuna). Preferiblemente, células bacterianas tales como E. coli, y más preferiblemente, células eucariotas, especialmente para la expresión de moléculas de anticuerpos recombinantes completas, se utilizan para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante. Por ejemplo, células de mamífero tales como células de ovario de hámster Chino (CHO), en relación con un vector tal como el principal elemento promotor del gen temprano intermedio a partir de un citomegalovirus humano, es un sistema de expresión eficaz para la producción de anticuerpo (Foecking et al., 1986, Gene, 45:101; Cockett et al., 1990, BioTechnology, 8:2).
Una vez que un ECD de anti-EGFR o un anticuerpo anti-HER-2/neu se ha producido por un animal, se sintetiza químicamente, o se expresa recombinantemente, se puede purificar por cualquier método conocido en el oficio para la purificación de una molécula de inmunoglobulina o polipéptido, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad para el antígeno específico, Proteína A, y cromatografía de columna de exclusión molecular), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas.
Usualmente, un ensayo de ELISA inicialmente involucra la preparación de un anticuerpo específico con el EGFR o el ECD de HER-2/neu, preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Además, se utiliza un anticuerpo indicador En algunos protocolos de ELISA, el anticuerpo indicador se reconoce y se une al anticuerpo monoclonal del ECD específico anti-EGFR, o el anticuerpo monoclonal de ECD específico anti-HER-2/neu. Al anticuerpo indicador se une un reactivo detectable tal como un isotopo radioactivo, una fracción fluorescente, una fracción quimioluminiscente, o, en un ELISA, una enzima, tal como peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina.
Como se aprecia por aquellos de habilidad en el oficio, el ELISA se puede realizar en un número de formatos de ensayo. En un formato ELISA, una muestra huésped, por ejemplo, una muestra de fluido corporal del paciente, se incuba sobre un soporte sólido, por ejemplo, los pozos de una placa de microtitulación, o un plato de poliestireno, en los cuales las proteínas en la muestra se pueden unir. Cualquiera de los sitios de enlace de proteína libre sobre el plato luego se bloquean, por incubación con una proteína no-específica tal como albúmina de suero bovina. El anticuerpo monoclonal luego se adiciona al soporte sólido, por ejemplo, los pozos o el plato, y se dejan incubar. Durante el tiempo de incubación, los anticuerpos monoclonales se unen a cualquiera de los polipéptidos de ECD del EGFR o ECD de HER-2/neu que se han unido en el plato de poliestireno.
Todos los anticuerpos monoclonales no-unidos se lavaron utilizando una solución reguladora apropiada. El anticuerpo indicador, por ejemplo, unido a la peroxidasa de rábano picante, se adiciona al soporte, resultando por consiguiente en el enlace del anticuerpo indicador con cualquier anticuerpo monoclonal que se ha unido a ECD del EGFR o ECD de HER-2/neu presente en la muestra. El anticuerpo indicador no-unido, luego se lava. El sustrato de la peroxidasa se adiciona al soporte y la cantidad de color desarrollado en un periodo de tiempo dado, proporciona una medición de la cantidad de ECD del EGFR o ECD de HER-2/neu que está presente en un determinado volumen de muestra del paciente cuando se compara con una curva estándar.
En otro formato de ELISA, como se describe más adelante y se ejemplifica aquí, el anticuerpo específico para un analito particular se une al soporte sólido, i.e., los pozos de una placa de microtitulación o un plato de poliestireno, y una muestra que contiene el analito se adiciona al sustrato. Los anticuerpos indicadores detectables, que se unen al analito que se ha unido a los anticuerpos capturan sobre el soporte, luego se adicionan, después de las incubaciones y lavados apropiados, y complejos analito-anticuerpo se detectan y cuantifican.
En una modalidad preferida, la presente invención involucra un inmunoensayo de ELISA de tipo de fase doble, usualmente realizado utilizando placas de microtitulación. Un anticuerpo de captura, que puede ser policlonal o monoclonal, preferiblemente se utiliza un anticuerpo monoclonal, que específicamente reconoce un epitope en la porción extracelular de EGFR o HER-2/neu, junto con un anticuerpo detector marcado, por ejemplo, un anticuerpo marcado de fosfatasa alcalina, o un anticuerpo marcado de peroxidasa de rábano picante, preferiblemente un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo detector también reconoce específicamente un epitope sobre el dominio de proteína extracelular de EGFR, o HER-2/neu. Preferiblemente, el anticuerpo captura no inhibe el enlace EGF, y no reacciona en cruz con la oncoproteína de erbB-2 o antígeno del grupo A de sangre humana. Preferiblemente también, el anticuerpo captura no inhibe el enlace con HER-2/neu o ECD de HER-2/neu. La producción de ambos anticuerpos policlonales y monoclonales, particularmente anticuerpos monoclonales que son específicos para el ECD del EGFR, o el ECD de HER-2/neu, se realiza utilizando técnicas y protocolos que se conocen convencionalmente y se practican en el oficio, tal como se describen, por ejemplo, en las patentes para J. Harvey et al., supra.
En una modalidad particular de acuerdo con esta invención, un anticuerpo de ECD de anti-EGFR de captura del método de ensayo, o un anticuerpo anti-HER-2/neu de captura, se inmovilizó en la superficie interior de los pozos de la placa de microtitulación. (ver, por ejemplo, Ejemplos 1A y 1B y Ejemplo 2). Para realizar el ensayo, un volumen apropiado de muestra se incuba en los pozos para permitir el enlace del antígeno por el anticuerpo captura. El antígeno inmovilizado luego se expone al anticuerpo detector marcado. La adición de sustrato a los pozos, si el marcador detectable es la fosfatasa alcalina, por ejemplo, permite la catálisis de un cromogen, i.e., para-nitrofenilfosfato (pNPP), si el marcador es la fosfatasa alcalina, en un producto coloreado. La intensidad del producto coloreado es proporcional a la cantidad de EGFR que se une a la placa de microtitulación.
Los estándares se utilizan para permitir las determinaciones cuantitativas exactas de ECD del EGFR o HER-2/neu (o ECD de HER-2/neu) en el análisis de muestras sometidas. Un lector de placa de microtitulación, simultáneamente mide la absorbancia del producto coloreado en los pozos de estándar y de la muestra. La correlación de los valores de absorbancia de muestras con la corrida de estándares en paralelo en el ensayo permite la determinación de los niveles de ECD del EGFR o ECD de HER-2/neu en la muestra. Las muestras se asignan un valor cuantitativo de ECD del EGFR en nanogramos por mililitro (ng/ml) de suero, plasma, otro fluido corporal, o líquido de cultivo celular.
Para la modalidad en la que los niveles de ECD del EGFR se analizan específicamente o evalúan en combinación con niveles de HER-2/neu, los anticuerpos dirigidos contra HER-2/neu se utilizan para la detection y medición de HER-2/neu. Además, se emplean inmunoensayos para la determinación de HER-2/neu en muestras, preferiblemente muestras de suero. (Ejemplo 1B).
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método que permite la identificación y/o seguimiento de pacientes que se beneficiaran de tanto tratamientos como terapias tradicionales y no-tradicionales para una variedad de cánceres, particularmente aquellos cánceres o neoplasmas asociados con la sobreexpresión de EGFR. La presente invención abarca así el ensayo, selección y seguimiento de pacientes sometidos a tratamientos y terapias anti-cáncer o anti-neoplásicos, tales como aquellos que involucran inhibidores del EGFR de molécula pequeña, inmunoterapias basadas en anticuerpo anti-EGFR, utilizado sola, en combinación entre sí, y/o en combinación con fármacos anti-cáncer, agentes anti-neoplásicos, quimioterapéuticos, radiación, y/o cirugía, para tratar pacientes con cáncer.
También de acuerdo con la presente invención, la prueba combinada y el seguimiento de niveles de EGFR y niveles de HER-2/neu, particularmente el ECD de estas proteínas receptor, en un muestra de paciente con cáncer, y la evaluación de una disminución concomitante en los niveles de EGFR y elevación en los niveles de HER-2/neu en las muestras, proporcionan una valiosa herramienta para el médico o clínico para determinar rápidamente que formas agresivas de tratamientos, incluyendo tanto tratamientos como terapias tradicionales y no-tradicionales, se deberían utilizar para combatir el cáncer. Estos análisis combinados se aplican especialmente a pacientes con cáncer de mama y cáncer de mama metastásico, como el hallazgo de que el nivel de EGFR disminuye y el nivel de HER-2/neu aumenta en el suero de estos tipos de pacientes, en relación con los valores control, es indicativo de un menor tiempo a la progresión y un tiempo menor de supervivencia global. Armado con esta información, el proveedor del tratamiento o la facilidad se puede seleccionar para administrar uno o más tratamientos o regímenes de tratamiento rápido y agresivamente en un intento para contrarrestar la enfermedad. De esta manera, la prueba, selección y seguimiento de los pacientes sometidos a tratamientos y terapias anti-cáncer o anti-neoplásicos, tales como aquellos que involucran inhibidores de molécula pequeña de EGFR y/o inmunoterapias basadas en anticuerpo HER-2/neu, anti-EGFR y/o anti-HER-2/neu, utilizado sola, en combinación entre sí, y/o en combinación con otros fármacos anti-cáncer, agentes anti-neoplásicos, quimioterapéuticos, radiación, y/o cirugía, para tratar pacientes con cáncer, son todos parte de la modalidad en la que ambos valores EGFR y HER-2/neu se co-determinan en muestras de pacientes.
Se debe entender que la disminución en niveles de EGFR y la elevación en niveles de HER-2/neu usualmente se determinan por comparación con los controles. Por ejemplo, una disminución del nivel de EGFR es aquella, que es menor del rango control normal de EGFR, i.e., 45-78 ng/ml. De manera similar, un nivel incrementado de HER-2/neu es aquel, que es mayor de los niveles normales de HER-2/neu de <15 ng/ml. En particular, menor tiempo a la progresión y supervivencia global menor se encontraron en mujeres con cáncer de mama metastásico que tenían niveles disminuidos de EGFR (menor del rango control) y niveles elevados de HER-2/neu, en comparación con uno o más controles que comprenden mujeres que tenían (a) niveles normales de EGFR (45-78 ng/ml) y niveles normales de HER-2/neu (<15 ng/ml); (b) niveles normales de EGFR, pero niveles elevados de HER-2/neu; o (c) niveles disminuidos de EGFR, pero niveles normales de HER-2/neu.
Una ventaja de la presente invención es la capacidad para identificar y monitorear, o seleccionar durante el tiempo, aquellos pacientes que pueden beneficiarse de una, o varias, de las terapias disponibles, y preferiblemente, para monitorear pacientes que reciben una o una combinación de terapias durante el tiempo; para determinar como el paciente está llevando el tratamiento(s); para determinar si un cambio, alteración, o cese del tratamiento se garantiza; para determinar si la enfermedad del paciente se ha reducido, mejorado, o se reduce; y para determinar si la enfermedad del estado o estadio del paciente ha avanzado así como para llegar a ser metastásico o invasivo. Los tratamientos de cáncer incluidos aquí también incluyen cirugías para remover o reducir en tamaño un tumor, u opresión del tumor, en un paciente. Por consiguiente, los métodos de la invención son útiles para monitorear el progreso del paciente y el estado de la enfermedad post-cirugía.
La identificación de los pacientes correctos para una terapia de cáncer, empleando los métodos de acuerdo con esta invención, puede proporcionar un incremento en la eficacia del tratamiento y puede evitar someter un paciente a los efectos secundarios no deseados, de amenaza de vida de la terapia. Por la misma señal tomada, la capacidad para monitorear un paciente sometido al curso de la terapia utilizando el método de la presente invención, puede determinar si un paciente se responde adecuadamente a la terapia durante el tiempo, para determinar si la dosificación o cantidad o modo de entrega se debería alterar o ajustar, y para averiguar si un paciente se mejora durante la terapia, es retrograda o se entra a un estado más grave o avanzado de la enfermedad, incluyendo invasión o metástasis.
Un método de monitoreo de acuerdo con esta invención refleja la prueba o análisis, serial o secuencial, de un paciente con cáncer por prueba o análisis de la muestra del paciente de fluido corporal durante un periodo de tiempo, tal como durante el curso del tratamiento o terapia, o durante el curso de la enfermedad del paciente. Por ejemplo, en prueba serial, muestras, por ejemplo, sangre o plasma, se toman del mismo paciente a diferentes tiempos con el propósito de observar, comprobar, o examinar los niveles de ECD del EGFR en el paciente, mediante la medición de los niveles de este analito durante el curso del tratamiento, y/o durante el curso de la enfermedad, de acuerdo con el método de la invención. Tal prueba serial también puede incluir la evaluación, por ejemplo, prueba serial o repetida, niveles de EGFR y de HER-2/neu en combinación, como se ha descrito anteriormente.
De manera similar, un paciente se puede seleccionar durante el tiempo para evaluar los niveles de ECD de EGFR, así como los niveles de ECD del EGFR y HER-2/neu en combinación, en una muestra de fluido corporal para el propósitos de determinar el estado de su enfermedad y/o la eficacia, reacción, y la respuesta del paciente a tratamientos o terapias del cáncer o enfermedad neoplásica a la que él o ella está sometido(a). Será apreciado que una o más muestras de pretratamiento se tomen óptimamente de un paciente antes de y en el inicio de un curso del tratamiento o terapia para ayudar en el análisis y evaluación del progreso del paciente y/o respuesta en uno o más puntos de prueba posteriores durante el periodo de tiempo que el paciente está recibiendo el tratamiento y es sometido a evaluación clínica y médica.
En el seguimiento a los niveles del paciente de ECD de EGFR, o la combinación de niveles de ECD del EGFR y HER-2/neu, durante un periodo de tiempo, que puede ser días, semanas, meses, y en algunos casos, años, o varios intervalos de estos, la muestra del paciente de fluido corporal, por ejemplo, suero o plasma, se recolecta en intervalos, como se determina por el médico, tal como un médico o profesional médico, para determinar los niveles de ECD de EGFR, o la combinación de niveles de ECD del EGFR y de HER-2/neu, en el paciente con cáncer en comparación con los niveles de este analito en individuos normales durante el curso o tratamiento o enfermedad. Por ejemplo, se pueden tomar y monitorear muestras de pacientes cada mes, cada dos meses, o combinaciones de uno, dos, o tres intervalos de mes de acuerdo con la invención. Cada tres meses, o más frecuente el seguimiento del paciente es conveniente. Además, los niveles de ECD de EGFR, o una combinación de ECD del EGFR y los niveles de HER-2/neu, del paciente con cáncer obtenidos durante el tiempo se pueden comparar convenientemente entre sí, así como con los valores de ECD de EGFR, o una combinación de valores de ECD del EGFR y HER-2/neu, de controles normales, durante el periodo de seguimiento, por consiguiente proporcionando los valores propios del paciente de ECD del EGFR, o una combinación de valores de ECD del EGFR y HER-2/neu, como un control interno, o personal, para el seguimiento de ECD del EGFR a largo plazo, o seguimiento a largo plazo de ECD del EGFR y niveles de HER-2/neu, en combinación.
En los tiempos probados, los niveles de ECD del EGFR encontrados en el paciente se comparan con los niveles de ECD del EGFR en individuos normales para determinar el progreso o resultado del tratamiento o enfermedad. Los niveles últimos de ECD del EGFR muestreados del paciente, también se pueden comparar con sus niveles previos durante el periodo de prueba. Como se describe en este documento, siguiendo el curso del tratamiento o enfermedad, la determinación de una disminución en los niveles de ECD del EGFR en el paciente con cáncer durante el tiempo en comparación con los niveles de ECD del EGFR en individuos normales refleja la capacidad para determinar la severidad de la enfermedad, o el curso de una terapia o criterio de evaluación del paciente. De manera similar, en el aspecto en el que ambos niveles de ECD del EGFR y los niveles de HER-2/neu se determinan en combinación, los niveles de HER-2/neu también se comparan con aquellos de individuos normales, o con los niveles de otros pacientes con cáncer, como se describe en este documento.
Modalidades de ECD del EGFR
Para una variedad de cánceres, por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de ovarios, cáncer de colon y cáncer de mama (mamario), una disminución en los niveles de ECD del EGFR en la muestra de paciente con cáncer, por ejemplo, suero, relativo o en comparación con los niveles de este analito determinado en los controles normales, siguiendo la realización del método de la invención es indicativo de la evolución de la enfermedad o una etapa más avanzada del cáncer. Una disminución en el nivel del analito de ECD del EGFR en pacientes con cáncer se determina, comparando el valor obtenido del análisis de la muestra de pacientes con cáncer con los valores de rango de control normal. En el desarrollo del método de la presente invención, cualquier valor exterior del rango de control normal se considera aumento o disminución, dependiendo del valor. El rango normal es la media normal (i.e., promedio) valor más/menos (\pm) dos desviaciones estándar.
En una modalidad de esta invención, en seguimiento un paciente durante el tiempo, un incremento o elevación en los niveles de un analito de ECD del EGFR del paciente de una disminución de nivel anterior con un nivel en o cerca al nivel del analito encontrado en individuos normales es indicativo del progreso o eficacia del tratamiento, y/o mejora de la enfermedad, remisión, reducción o eliminación del tumor, y similares. Igualmente, en todos los métodos descritos en las modalidades de esta invención, una determinación de un incremento en los niveles del paciente de ECD del EGFR en relación con niveles pasados y con niveles normales; o el regreso de unos niveles de ECD del EGFR del paciente a, o aproximadamente a, los niveles de ECD del EGFR encontrado en individuos normales, proporciona otras ventajas del método de la invención, tal que una mejora del paciente, recuperación o remisión, y/o progreso o eficacia del tratamiento, es capaz de ser determinada siguiendo la realización del método, observando un cambio a partir de la disminución al aumento de niveles de ECD del EGFR en comparación con niveles normales de ECD del EGFR durante un periodo de seguimiento.
En otra modalidad, una muestra de paciente con cáncer se analiza de acuerdo con los métodos de esta invención para determinar si hay una disminución en los niveles de ECD del EGFR en comparación con los niveles de ECD del EGFR encontrado que es un rango normal de ECD del EGFR en el suero de individuos normales, libres de cáncer. (Tabla 1). De acuerdo con la presente invención, los valores normales de ECD del EGFR en suero han sido determinados para permitir una comparación fiable y estandarizada entre los niveles del analito de ECD del EGFR en controles normales y en pacientes con cáncer.
Los valores normales para el analito de ECD del EGFR en suero se presentan en la siguiente Tabla 1:
TABLA 1
1
Los valores de EGFR normales, tales como aquellos proporcionados en la Tabla 1, se pueden expresar en femtomoles (fmole). Para el ECD de EGFR, 1 ng = 9.09 fm, y 1 ng/mL = 9.09 fm/mL. De esta manera, el valor medio de 61 ng/ml = 555.10 fm/mL; 62 ng/mL = 564.20 fm/mL, etc. Además, en la Tabla 1, 62 ng/ml constituye el valor medio de ECD del EGFR en suero; 45 ng/ml es el valor de corte para el límite inferior del normal, y 78 ng/ml es el valor de corte para el límite superior del normal.
Otra modalidad de la presente invención abarca un método para monitorear un curso de la enfermedad de un paciente con cáncer, o la eficacia de un tratamiento o terapia de un paciente con cáncer, en el que el paciente tiene un cáncer asociado con sobreexpresión de EGFR. Preferiblemente, el paciente tiene un cáncer seleccionado de cáncer de mama, colon, vejiga, pulmón y próstata. El tratamiento o terapia del paciente puede involucrar un tratamiento o terapia específico anti-EGFR, o terapias más tradicionales, tales como terapia de hormona, terapia de fármaco quimioterpéutico, radiación, o una combinación de cualquiera de los precedentes. El método involucra la medición de los niveles de ECD del EGFR en una muestra de fluido corporal del paciente con cáncer, preferiblemente una muestra de suero o plasma, y determinar si los niveles del ECD del EGFR en la muestra del paciente se disminuyen en comparación con los niveles del ECD del EGFR en controles normales durante el curso de la enfermedad o tratamiento. Para las determinaciones de ECD del EGFR, los niveles en suero y plasma de este analito son comparables. Por consiguiente, los rangos normales para un analito en diferentes tipos de muestra de fluido corporal, preferiblemente son específicos al tipo de muestra que se analiza.
De acuerdo con este método, una disminución en los niveles del ECD del EGFR en el paciente con cáncer en comparación con los niveles de ECD del EGFR en controles normales es indicativo de un incremento en el estadio, grado, severidad, mejoría, o progresión del cáncer del paciente y/o una ausencia de eficacia o beneficio del tratamiento o terapia del cáncer proporcionado al paciente durante un curso del tratamiento, i.e. criterio de valoración clínico o tratamiento pobre. Como un ejemplo específico, para el propósito de comparación de ECD del EGFR en pacientes con cáncer e individuos normales en el método, el valor normal de ECD del EGFR es en el rango de aproximadamente 45-78 ng/ml. De esta manera, la determinación de una disminución en el nivel de ECD del EGFR en comparación con este rango normal en un paciente con cáncer pone en alerta al médico con un estadio o grado de enfermedad más serio, o con una ausencia de efectividad del tratamiento del cáncer del paciente. En la práctica del método presente, cualquier valor exterior del rango control normal se considera aumentado o disminuido. El rango normal es la media normal (i.e., promedio) valor más/menos (\pm) dos desviaciones estándar.
Como será entendido por el médico de habilidad en el oficio, el método de seguimiento preferiblemente se realiza de una manera serial o secuencial, utilizando muestras tomadas de un paciente durante el curso de la enfermedad, o un régimen de tratamiento de la enfermedad, (por ejemplo, después de un número de días, semanas, meses, o ocasionalmente, años, o varios múltiplos de estos intervalos) para permitir una determinación de la evolución de la enfermedad o criterio de valoración, y/o eficacia del tratamiento o criterio de valoración. Si la muestra es sensible al almacenamiento en congelación o refrigerado, las muestras se pueden tomar de un paciente (o un individuo normal) y almacenar por un periodo de tiempo antes de análisis.
En una modalidad particular de esta invención, el método anterior se realiza utilizando muestras de fluido corporal, preferiblemente muestras de suero, a partir de pacientes de cáncer de ovarios para verificar los niveles de ECD del EGFR en el suero de los pacientes de cáncer de ovarios que tienen el cáncer de ovarios en estadio I-IV en comparación con los niveles de ECD del EGFR en individuos normales. Para mujeres normales, y hombres y mujeres normales, los rangos de valores normales de ECD del EGFR son 45-78 ng/ml en suero. Para las mujeres normales, el valor medio normal de los niveles en suero de ECD del EGFR es 61 ng/ml (2 SD); para hombres normales, el valor medio normal de los niveles en suero de ECD del EGFR es 62 ng/ml (2 SD).
De acuerdo con la presente invención, como el estadio de cáncer de ovarios aumentado (i.e., a partir de benigno a estadio IV), el porcentaje de muestras de suero que muestran una disminución en los niveles de ECD del EGFR también aumentados. Como se describe en el Ejemplo 2, el suero de ovario benigno mostró el 8% de las muestras por debajo del rango normal para ECD de EGFR, mientras que suero de cáncer de ovarios estadio I mostró que el 29% de las muestras disminuyeron en los niveles de ECD de EGFR; suero de cáncer de ovarios estadio II mostró que el 50% de las muestras disminuyeron en niveles de ECD de EGFR, suero de cáncer de ovarios estadio III mostró que el 74% de las muestras disminuyeron en niveles de ECD del EGFR y suero de cáncer de ovarios estadio IV mostró que el 78% de las muestras disminuyeron por debajo del valor normal para ECD de EGFR. Por consiguiente, el método presente permite que el criterio de valoración de la determinación de niveles en suero disminuidos de ECD del EGFR de pacientes con cáncer de ovarios en comparación con aquellos de individuos normales, sirva como un indicador de la severidad o grado o estadio avanzado de cáncer de ovarios.
En otra de sus modalidades, la presente invención proporciona un método para monitorear el tratamiento del cáncer o la respuesta clínica de un paciente con cáncer sometido al tratamiento del cáncer, preferiblemente para un cáncer o enfermedad neoplásica que se asocia con la sobreexpresión del EGFR. El tratamiento puede involucrar tratamiento o terapia receptor del factor de crecimiento anti-epidérmico (anti-EGFR), tal como inhibidores de molécula pequeña de EGFR, o anticuerpos anti-EGFR, o pueden involucrar terapias de cáncer más tradicionales, o combinaciones de cualquiera de los tipos de terapias. El método comprende la medición de los niveles del ECD del EGFR en una muestra de suero o plasma del paciente con cáncer durante el curso del tratamiento del cáncer del paciente y determinar si el paciente con cáncer ha disminuido niveles en suero o plasma del ECD del EGFR en comparación con los niveles en suero o plasma del ECD del EGFR como se determina para individuos normales para cada muestra analizada.
El criterio de valoración del tratamiento del cáncer del paciente se determina basándose en niveles en suero disminuidos o plasma de ECD del EGFR en el paciente en comparación con niveles normales de ECD del EGFR en suero o plasma durante el curso de tiempo que el paciente se monitorea, dónde los niveles disminuidos de ECD del EGFR en plasma o suero en pacientes con cáncer en relación con los niveles normales de este analito, se correlacionan con el tratamiento o criterio de valoración clínico pobres. El método además comprende la determinación de los niveles en suero o plasma de ECD del EGFR después de que un paciente ha experimentado el tratamiento por un periodo de tiempo que se estima por el médico o profesional médico para permitir una determinación adecuada de eficacia del tratamiento, y determinación por funcionamiento del método sí o no los niveles de ECD del EGFR del paciente tratado, se han elevado, o están cerca de, aquellos de los individuos normales. Un incremento o alza en los niveles del paciente de ECD del EGFR siguiendo un curso del tratamiento o terapia indica el progreso y/o eficacia del tratamiento o terapia del cáncer.
Una especialmente una determinación alentadora para el paciente y el médico o profesional médico es la observación de un cambio en los niveles del paciente de ECD del EGFR durante un curso del tratamiento del paciente, i.e., a partir de un hallazgo de niveles disminuidos de ECD del EGFR en las muestras de pacientes de pretratamiento o primer tratamiento para un hallazgo en el paciente de niveles aumentados de ECD de EGFR, o niveles de este analito que están en, o cerca de, el nivel respectivo de ECD del EGFR determinado en individuos normales. Tal hallazgo puede reflejar, entre otras cosas, mejora del paciente del tratamiento o terapia, criterio de valoración del tratamiento exitoso, y/o un cambio a un estadio o fase de la enfermedad menos seria.
En otra de sus modalidades, la presente invención abarca un método para monitorear la severidad o progresión de la enfermedad de un paciente con cáncer. El método comprende la medición de los niveles del ECD del EGFR en una muestra de fluido corporal, por ejemplo, una muestra de suero o plasma, del paciente con cáncer y determinar si el paciente con cáncer tiene niveles disminuidos del ECD del EGFR en comparación con los niveles del ECD del EGFR en individuos normales. La severidad o progresión del cáncer se monitorea en el paciente basándose en niveles disminuidos de ECD del EGFR en la muestra del paciente de fluido corporal en comparación con niveles normales de ECD del EGFR en individuos normales. De acuerdo con este método, el estado más severo del cáncer se correlaciona con los niveles más bajos de plasma o ECD del EGFR en suero en relación con los niveles controles normales del analito de ECD de EGFR. También de acuerdo con el método de esta modalidad, el nivel normal de ECD del EGFR está en el rango de aproximadamente 45 ng/ml a aproximadamente 78 ng/ml, con un valor medio normal de ECD del EGFR en hombres de aproximadamente 62 ng/ml \pm 2 SD, y un valor medio normal de ECD del EGFR en mujeres de aproximadamente 61 ng/ml \pm 2 SD.
En incluso otra modalidad relacionada, la presente invención proporciona un método para monitorear el tratamiento del cáncer, o eficacia de este, en un paciente con cáncer sometido a dicho tratamiento. El método involucra la medición de los niveles de ECD del EGFR en una muestra de fluido corporal del paciente con cáncer y determinar si el nivel de ECD del EGFR en el paciente disminuye durante el tratamiento del cáncer en comparación con el nivel de ECD del EGFR encontrado en controles normales, dónde una disminución en los niveles de ECD del EGFR en el paciente con cáncer en comparación con los niveles de ECD del EGFR en los controles normales durante el periodo de seguimiento indica uno o más de los siguientes: (i) evolución del cáncer; (ii) un estado más grave del cáncer; o (iii) falta de respuesta por el paciente al tratamiento del cáncer.
Además, si, durante el curso para monitorear los niveles de ECD del EGFR en el paciente sometido al tratamiento, un cambio en los niveles de ECD del EGFR del paciente se observa, tal que los niveles del paciente de ECD del EGFR se aumentan o elevan a o cerca a los valores normales del ECD de EGFR, después de haber monitoreado una disminución en estos niveles para un periodo de tiempo anterior durante el tratamiento, se puede hacer una evaluación como a uno o más de los siguientes: (i) el paciente está progresando bien en el tratamiento, (ii) el tratamiento es eficaz; (iii) el paciente está respondiendo favorablemente al tratamiento,; y/o (iv) el cáncer del paciente no está avanzando, o ha estado mejorando o eliminado por el tratamiento.
De acuerdo con la presente invención, dicho método para monitorear y evaluar los niveles de ECD del EGFR durante un curso del tratamiento del paciente o terapia, en comparación con los niveles normales de ECD de EGFR, puede proporcionar al médico o profesional médico con una determinación de un progreso de paciente con cáncer o ausencia de este, como una consecuencia de un tratamiento o terapia particular. Tal determinación permite ajustar la medida del tratamiento del cáncer o anti-neoplásico o terapia para atacar mejor o más agresivamente (o tratar) un cáncer y seleccionar el tratamiento más apropiado, o curso del tratamiento o terapia para un paciente individual. Esta metodología también permite al médico determinar si la dosificación o modo de administración se debería alterar, o si el régimen de fármaco se debería modificar, por ejemplo, por terapias de combinación o terapias discontinuas, para tratar de lograr un tratamiento global y criterio de valoración más eficaz para el paciente. Como un ejemplo, si se determina por medio de la práctica de la presente invención que un paciente tiene una alta probabilidad de recaída (debido al seguimiento de un disminución continuada en niveles de ECD del EGFR en comparación con niveles normales del analito de ECD del EGFR durante un número de intervalos de prueba), el paciente se puede tratar más rigurosamente, tal como utilizando quimioterapia sistémica y/o terapia de radiación, u otras combinaciones de tratamiento. De manera similar, cuando los niveles de ECD del EGFR monitoreados por los métodos actuales se determinan para incrementar durante el tiempo, i.e., a niveles de o cerca a aquellos de controles normales, terapias menos agresivas se pueden decidir por encima. La capacidad para seleccionar un curso de terapia o régimen de tratamiento personalizado, i.e., que sea capaz de seleccionar un tratamiento menos agresivo en o cerca del inicio del tratamiento, o para alterar el tratamiento de agresivo a menos agresivo en un tiempo antes del convencional final de un régimen de tratamiento en la base de los métodos de análisis de seguimiento de esta invención, pueden proporcionar menos angustia y sufrimiento para el paciente en ambos un nivel emocional y físico.
\newpage
Modalidades que abarcan el análisis de niveles de ECD del EGFR y el análisis de niveles de ECD del EGFR en combinación con los niveles de HER-2/neu
En una modalidad más preferida, la presente invención abarca un método para monitorear, seleccionar, o examinar durante el tiempo el criterio de valoración y/o beneficio clínico del tratamiento o terapia del cáncer en un paciente que tiene un cáncer metastásico, por ejemplo, cáncer de mama metastásico. El cáncer de mama puede además involucrar la sobreexpresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Este método abarca, determinar si una muestra de fluido corporal de un paciente con cáncer tiene niveles de ECD del EGFR disminuidos en comparación con los niveles de ECD del EGFR en controles normales. Preferiblemente, la muestra de fluido corporal es una muestra de suero o plasma. El método puede adicionalmente, u opcionalmente, también involucrar una determinación combinada de ambos niveles de EGFR y HER-2/neu en la muestra del paciente. Por consiguiente, el método comprende determinar si una muestra de fluido corporal del paciente con cáncer, preferiblemente una muestra de suero, tiene niveles disminuidos de EGFR y niveles aumentados de HER-2/neu, en combinación, en comparación con los niveles de estos analitos en controles normales, u otros controles, como se ha descrito en este documento anteriormente. Se debe entender que los niveles de los dominios extracelulares de ECD del EGFR y HER-2/neu se pueden evaluar en el método.
La realización del método utilizando una muestra del paciente antes del tratamiento (i.e., pretratamiento), en el inicio del tratamiento y en diferentes intervalos de tiempo durante el tratamiento permite la determinación que el paciente que tiene niveles disminuidos de ECD del EGFR en comparación con los niveles de ECD del EGFR de controles normales (o que tiene una combinación de niveles disminuidos de ECD del EGFR y niveles aumentados de HER-2/neu en comparación con los niveles de estas proteínas en individuos control) es probable que tenga un criterio de valoración no-satisfactorio del tratamiento o terapia del cáncer, como se caracteriza por el beneficio clínico reducido, menor tiempo a la progresión, y supervivencia global menor, basándose en la determinación de los niveles disminuidos de ECD del EGFR en el paciente en comparación con individuos control normales, (Ejemplo 3), o basándose en la determinación de una combinación de niveles disminuidos de ECD del EGFR en el paciente en comparación con individuos control y de niveles aumentados de HER-2/neu en el paciente en comparación con individuos control.
En otra modalidad preferida de esta invención, una muestra del paciente, preferiblemente una muestra de suero, es probada o seleccionada de sus niveles de EGFR y sus niveles de HER-2/neu, en combinación, en la muestra. Los niveles de estos dos analitos se evalúan en combinación con el fin de determinar y pronosticar el riesgo de población del paciente, así como la evolución y supervivencia del paciente. El método de selección y prueba, es particularmente aplicable a pacientes con cáncer de mama y cáncer de mama metastásico. Como se ha descrito y demostrado, una determinación de una disminución en los niveles de EGFR y una elevación en los niveles de HER-2/neu en una muestra del paciente, en relación con valores control, se correlaciona altamente con criterio de valoración de mal pronóstico y supervivencia.
La prueba en serie de pacientes para examinar si las alteraciones o revés en los niveles de EGFR y HER-2/neu han ocurrido, por ejemplo, siguiendo o durante los regímenes de tratamiento o terapia, se puede realizar para determinar si los cambios o modificaciones del tratamiento o terapia del paciente se deberían considerar o emprender, o para evaluar el progreso del paciente, o ausencia de este, durante el tratamiento. De esta manera, si se determina concomitantemente que unos niveles del paciente en suero de EGFR han aumentado, o están en niveles normales, en relación con los niveles de control, y que los niveles del paciente de HER-2/neu en suero han disminuido en relación con los niveles de control, o están en niveles normales, siguiendo un curso del tratamiento o terapia, el progreso positivo y que estimula y los resultados del tratamiento o terapia, se pueden evaluar. Alternativamente, la ausencia del progreso asociado con los resultados del tratamiento o terapia, también se puede determinar en virtud del examen de los niveles del EGFR y HER-2/neu, en combinación, en muestras de pacientes durante el tiempo.
Se debe entender que en todas las modalidades que describen los métodos de acuerdo con la presente invención, el seguimiento de un paciente con cáncer de la evolución o criterio de valoración de la enfermedad, o para eficacia o criterio de valoración del tratamiento o terapia del cáncer, pueden incluir el análisis de una muestra de pretratamiento, tomada del paciente en un primer punto en el tiempo, así como muestras de pacientes tomadas en un segundo, tercer, cuarto, o posteriores puntos de tiempo, durante el curso de la enfermedad o durante un régimen de tratamiento del cáncer o anti-neoplásico o terapia, o una combinación de regímenes de tratamiento o terapia. Los niveles resultantes de ECD del EGFR, o la combinación de los niveles de ECD del EGFR y HER-2/neu, en muestras tomadas de todos los puntos de prueba pueden ser en comparación con los niveles normales de ECD del EGFR, o con los niveles control de ECD del EGFR y HER-2/neu; o entre sí, i.e., el propio de muestras de pacientes puede ser comparado uno con el otro, y en vista de los otros parámetros control como se describe en este documento, para determinar el estado de la enfermedad y/o la efectividad del tratamiento.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos describen aspectos específicos de la invención para ilustrar la invención y proporcionar una descripción de los métodos actuales para aquellos de habilidad en el oficio. Los ejemplos no se construyen como limitación de la invención, ya que los ejemplos simplemente proporcionan la metodología específica útil en el entendimiento y práctica de la invención y sus diversos aspectos.
Ejemplo 1 A. Inmunoensayo con Enzimas ligadas (ELISA) para Medir los Niveles de ECD del EGFR en una Muestra de Fluido Corporal
Los fluidos de cultivo celular, se centrifugan para remover toda la materia particulada. Después de la centrifugación, las muestras se pueden analizar sin otro tratamiento, o almacenar a -70ºC para análisis futuros. Los sobrenadantes de cultivo celular se analizan en un rango de concentraciones para asegurar que los valores en los cultivos positivos, por ejemplo, las células A431, caen en la curva estándar. El mantenimiento de pH óptimo es importante para la incubación de la muestra; por consiguiente, una dilución inicial de al menos 1:5 del sobrenadante del cultivo en el diluente de la muestra es necesaria para el inmunoensayo ELISA (Bayer Diagnostics/Oncogene Science EGFR Microtiter ELISA, Cambridge, MA). Diluciones de dos veces en el diluente de la muestra de 1:5 a 1:160 proporcionan resultados útiles. El cálculo de la recuperación de EGFR en diluciones diferentes de 1:50 necesitan una corrección de la siguiente manera: cada resultado se multiplica por 50; este resultado se divide por el factor de dilución para cada punto probado. Por ejemplo, una dilución 1:5 del líquido del cultivo se reporta directamente a partir de la curva estándar a 10 ng/ml. 10 x 50/5 = 100 ng/ml en el fluido sin diluir.
Para muestras de suero o plasma, la concentración inicial que se analiza debería no exceder una concentración del 2% (por ejemplo, una dilución 1:50 de la muestra en el diluente de la muestra). Por ejemplo, 0.020 ml de muestra de suero o plasma se pueden diluir en 0.980 ml de diluente de la muestra y 100 \mul se adicionan a los pozos de la placa de microtitulación.
En relación a la sensibilidad, el Bayer Diagnostics/Oncogene Science EGFR Microtiter ELISA detecta 0.25 ng/ml del analito de EGFR (por ejemplo, ECD de EGFR) en una matriz diluente de la muestra. La señal del estándar de 0.25 ng/ml es aproximadamente dos veces la señal cero. Además, el ELISA de ECD del EGFR es específico para la detección de ECD del EGFR; por ejemplo, HER-2/neu p105 no se detecta, incluso cuando se prueba en niveles que son diez veces más alto que el nivel 6 estándar en el ensayo como se describe abajo.
Protocolo Detallado
El kit ELISA de Microtitulación de EGFR (disponible comercialmente de Bayer Diagnostics/Oncogene Science, Cambridge, MA) utilizado en este Ejemplo tiene 96 pozos diseñados como tiras removibles (12 tiras de 8 pozos) de tal manera que el ensayo se puede realizar en múltiples ocasiones, si se desea. Los pozos se pre-cubren con anticuerpo monoclonal ECD del EGFR antihumano. (ver, U.S. Patent No. 5,344,760 a Harvey et al.). Una curva estándar se requiere para cada ensayo por separado. Ambos los estándares y las muestras de prueba se analizaron por duplicado. Para una exactitud mayor, cada muestra se probó a más de una concentración. Los tips de pipeta desechables y los pilones de los reactivos de limpieza se utilizaron para todas las transferencias para evitar la contaminación en cruz de reactivos y muestras.
Los estándares de EGFR se albergaron en seis viales separados que contienen ECD del EGFR (p110) obtenidos del sobrenadante de las células A431. A431 (ATCC #CRL 1555) es una línea celular de carcinoma epidermoide humano que expresa un exceso de 50- a 100- veces de EGFR y produce una transcripción reducida del gen de EGFR que codifica el ECD (p110). (A.L. Ullrich et al., 1984, Nature, 307:418-425; R.N. Fabricant et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:565-569; M.M. Wrann et al., 1979, J. Biol. Chem., 254:8083-8086). Los estándares se calibran utilizando varios análisis de aminoácido cuantitativos independientes de inmunoafinidad de EGFR purificado y se marcan con valores que son 50-veces mayores de la actual dosificación de los viales. La asignación de los valores marcador a una curva estándar, obvia la necesidad de corregir la dosis reportada para una muestra diluida 1:50 (2% de suero en solución reguladora). Como se proporciona en el kit ELISA de ECD del EGFR de Bayer Diagnostics/Oncogene Science, el estándar 6 comprendía EGFR p110 a 300 ng/ml; el estándar 5 comprendía EGFR p110 a 200 ng/ml; estándar 4 comprendía EGFR p110 a 125 ng/ml; el estándar 3 comprendía EGFR p110 a 60 ng/ml; el estándar 2 comprendía EGFR p110 a 12.5 ng/ml; y el estándar 1 comprendía EGFR p110 a 0 ng/ml.
Para las determinaciones de ECD del EGFR realizadas de acuerdo con el ELISA de ECD del EGFR de este Ejemplo, la curva estándar corre de 12.5 a 300 ng/mL, i.e., 113.6 a 2727 fm/mL.
Tiras de 8-pozos se seleccionaron de la placa de microtitulación; las tiras no-utilizadas restantes se guardan para el uso posterior. En algunos casos, la placa total se utilizó. Una 1 x solución de trabajo de solución reguladora de lavado de placa, como se proporciona en el kit de Microtitulación de EGFR de Bayer Diagnostics/Oncogene Science, se preparó, adicionando una parte de lavado de placa concentrada a 19 partes de agua desionizada y se mezcla bien. El volumen total necesario depende del método de lavado utilizado. Aproximadamente 1 litro de la solución reguladora de lavado se necesitó para imprimir un lavador automático y se corre una placa de microtitulación. La solución reguladora de lavado de placa se prepara recientemente en el día de uso.
Las muestras, estándares y otros reactivos de kit se calentaron a temperatura ambiente antes de la adición a los pozos de la placa de microtitulación e iniciar el ensayo. Las muestras de fluido corporal diluidas, i.e., suero de prueba del paciente, se adicionaron por duplicado a los pozos de las placas, junto con cada uno de seis estándares de EGFR (0 a 300 ng/ml) por duplicado, pipeteando 100 \mul en los pozos apropiados. El estándar 0 se adicionó a un pozo adicional de cada placa de microtitulación utilizada, para la determinación del sustrato blanco. Cuando la dilución de la muestra fue necesaria, el diluente de la muestra (BSA, IgG de ratón y 0.09% de azida de sodio) como suministro se utilizó. Los estándares no-utilizados se almacenaron a 4ºC. Después de que la muestra ha sido adicionada, los pozos se cubrieron con envoltura de plástico o sellante de placa y las muestras se incubaron a 37ºC por 1.5 horas. Durante este tiempo, el trabajo conjugado se preparó por dilución de un volumen apropiado de conjugado concentrado a (50x anticuerpo monoclonal anti ECD del EGFR marcado con fosfatasa alcalina) en diluente de conjugado (solución reguladora, pH 7.0 que contiene BSA y 0.09% de azida de sodio), como suministro y de acuerdo con las instrucciones proporcionadas en el kit.
Después de la incubación, la envoltura de plástico o sellante de placa se retiró, y los pozos se lavaron utilizando 300 \mul por pozo de solución reguladora de lavado de placa en seis ciclos, como suministro y se controlan en el kit. Las placas se lavaron por tres ciclos, girándolas 180º, y se lavaron por tres ciclos más. Después de esto, 100 \mul del conjugado de trabajo se adicionaron a todos los pozos, excepto para el pozo de sustrato blanco, que se dejó vacío. Los pozos se cubrieron con un pedazo fresco de envoltura de plástico o sellante de placa y el conjugado se incubó a temperatura ambiente (18-27ºC) por 30 minutos. A continuación, 100 \mul del sustrato reactivo (pNPP) se dispensaron en un bebedero de reactivo de limpieza y se deja alcanzar la temperatura ambiente. Los pozos se lavaron de nuevo como se describe anteriormente, sin permitir que las placas se sequen. Inmediatamente después del lavado, 100 \mul de sustrato de Pnpp se adicionaron a todos los pozos y las placas se cubrieron con envoltura de plástico o sellante de placa. Las placas se incubaron con sustrato a temperatura ambiente (18-27ºC) por 45 minutos. Después de esta incubación, la solución de parada (100 \mul; solución EDTA) se adicionó a cada uno de los pozos y la absorbancia se midió en cada pozo utilizando un lector de placa espectrofotométrico a una longitud de onda de 405 nm. Los pozos de la placa se leyeron dentro de 15 minutos de adición de la solución de parada para el desarrollo óptimo
del color.
Los anticuerpos utilizados en el ELISA de Microtitulación de EGFR (Bayer Diagnostics/Oncogene Science, Cambridge, MA) específicamente reconocen el enlace del dominio extracelular-ligando del receptor de EGF. Esta forma de EGFR tiene un peso molecular de aproximadamente 110 kDa. Los estándares en el kit se calibran en nanogramos, que tienen en cuenta la forma de peso molecular de 110 kDa de ECD del EGFR que se detecta en el suero. Los estándares se preparan a partir de una forma que ocurre naturalmente del EGFR de 110 kDa.
Para evaluar los resultados obtenidos del ELISA de ECD del EGFR del Ejemplo 1, los valores de absorbancia se promediaron para cada estándar y la dilución de la muestra para lograr en las absorbancias medias. La concentración de incógnitas se interpoló de la curva estándar. Una variedad de paquetes de software de lector de microplaca son disponibles para el análisis de los datos de microplaca, por ejemplo, SoftmaxPro^{TM} (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA; KC4^{TM}, BioTek Instruments, Inc. Winooski, VT) que simplifican el proceso. Una curva cuadrática de ajuste algoritmo (segundo orden polinomial) se utilizó. Los resultados para las muestras se expresaron en ng/ml por lectura directamente de la curva de concentraciones estándar, como se controlan en el kit manual. Por conveniencia, sin corrección de dilución matemática se necesitó por muestra diluidas 1:50, dado que la concentración actual en las preparaciones estándar fue al 2% de la dosificación marcada, i.e., los estándares se pre-diluyeron 1:50).
Para las muestras que tienen los valores OD que exceden el rango de la curva estándar, fue necesario un ensayo posterior en las diluciones superiores. Cualquier resultado de dicha muestra necesita corregir el valor obtenido a partir del ensayo para cualquier dilución que fue superior de 1:50. Por ejemplo, para una dilución de la muestra de 1:100, el resultado reportado se multiplicó por 2 (el factor de corrección de dilución); para una dilución de la muestra de 1:200, el resultado reportado se multiplicó por 4 (el factor de corrección de dilución); para una dilución de la muestra de 1:400, el resultado reportado se multiplicó por 4 (el factor de corrección de dilución).
Los resultados para cultivos celulares líquidos se expresaron en ng/ml corrigiendo los valores obtenidos a partir de la curva estándar para la dilución utilizado en este punto. El cálculo de recuperación de EGFR en diluciones diferentes de 1:50 necesita la corrección. Por consiguiente, para estos casos, cada resultado se multiplicó por 50, luego se dividió por el factor de dilución para cada punto probado. Por ejemplo, una dilución 1:5 del líquido del cultivo reportada directamente a partir de la curva estándar a 10 ng/ml. (10 x 50/5 = 100 ng/ml en líquido sin diluir).
B. Inmunoensayo con Enzimas ligadas (ELISA) para Medir los Niveles de HER-2/neu en un Muestra de Fluido Corporal o Tejido
La parte B de este Ejemplo describe una fase sólida, ELISA de Microtitulación de doble fase de HER-2/neu para la determinación cuantitativa de HER-2/neu en muestras de suero, plasma y tejidos del paciente. El ELISA se llevó a cabo utilizando un kit (ELISA Microtiter HER-2/neu) que es comercialmente disponible de Oncogene Science, Bayer Diagnostics, Cambridge, MA. El Microtiter ELISA de HER-2/neu Oncogene Science, puede detectar y cuantificar tanto el ECD presente en fluidos corporales y el p185 de longitud completa, que usualmente está presente en lisados celulares obtenidos de muestras de tejidos. El ELISA Microtiter de HER-2/neu utiliza anticuerpos monoclonales, que unen específicamente los epitopes presentes en ambos el ECD p105 y las moléculas p185. (S.J. McKenzie et al., 1989, Oncogene, 4:543-548).
El ELISA Microtiter de HER-2/neu detecta 44 pg (0.24 femtomoles) de HER-2/neu p185 por mL en una preparación de la muestra, y 1.5 ng de p105 por mL de suero. La sensibilidad se define como la señal media del ensayo entre el estándar de 0 y 2.5 ng. (folleto del producto del ELISA Microtiter de HER-2/neu). Cuando se prueba contra los niveles fm/mL de proteína de EGFR (p170), el ELISA HER-2/neu no mostró reactividad en cruz; mínima a ninguna reactividad en cruz se observó utilizando las líneas celulares que tienen baja a ninguna expresión de la proteína de HER-2/neu.
Los estándares en el ELISA Microtiter de HER-2/neu se preparan a partir del ECD de p105 de la proteína de HER-2/neu, y han sido calibrados en ng/mL. Los estándares se proporcionan convenientemente para las determinaciones de p105 de muestras de suero diluidas 1:50, pero no son apropiados, en esta configuración para la determinación directa de resultados de lisado de tejidos, (ver abajo, ELISA Microtiter de HER-2/neu, Oncogene Science, Bayer Corporation, Cambridge, MA).
En resumen, el ELISA Microtiter de HER-2/neu Oncogene Science es un inmunoensayo de enzima de doble fase que emplea un anticuerpo monoclonal de ratón para la captura y un anticuerpo monoclonal de ratón biotinilado diferente para la detección de proteína neu humana. Ambos los reactivos de captura y de detección específicamente unidos al dominio extracelular de la proteína neu. El anticuerpo de captura se inmovilizó sobre las superficies interiores del pozo de una placa de microtitulación. Para realizar la prueba, un volumen apropiado de muestra diluida se incuba en el pozo cubierto para permitir el enlace del antígeno por el anticuerpo captura. El antígeno inmovilizado luego se hace reaccionar con el antisuero detector. La cantidad de anticuerpo detector que se une al antígeno se mide por el enlace de este con una estreptavidina/peroxidasa de rábano picante conjugado, que luego cataliza la conversión del sustrato cromogénico, o-fenilenodiamina (OPD) en un producto coloreado. El producto de reacción coloreado se cuantifica por espectrofotometria (490 nm) y se relaciona con la cantidad de proteína neu en la muestra.
Las muestras de suero y plasma (y controles), se microcentrifugan para remover material floculante. Antes del ensayo, las muestras de suero y plasma centrifugadas y los controles se diluyen 1:50 (2%) en diluente de la muestra (solución acuosa que contiene BSA y 0.1% de azida de sodio, como suministro), se mezcla a fondo y se adicionan a los pozos de microtitulación en alícuotas de 100 \muL. Pozos por duplicado de muestras y controles se utilizan. Un pozo de la placa se forma con 100 \muL de diluente de la muestra para utilizar como un sustrato blanco. La placa se cubre y se deja incubar por 3 horas a 37ºC. Después de esto, los pozos se lavaron en lavado de placa como suministro y 100 \muL del anticuerpo detector (anticuerpo biotinilado monoclonal anti-proteína neu o anticuerpo proteína anti-HER-2/neu en PBS 0.01 M, pH 7.4, estabilizador de la proteína y 0.1% de azida de sodio) se adicionan a todos los pozos, excepto para el pozo que contiene el sustrato blanco control. Las placas luego se cubren e incuban por 1 hora a 37ºC. Durante la incubación con el anticuerpo detector, el conjugado de trabajo se prepara por dilución del conjugado concentrado a (50X estreptavidina/peroxidasa de rábano picante en solución reguladora) con diluente conjugado (PBS 0.01 M, pH 7.4, BSA y 0.01% de cloroacetamida) para una concentración final 1x, dependiendo del número de tiras del pozo de mocrotitulación que se ensaya.
Continuando la incubación con el anticuerpo detector, los pozos de placa de microtitulación se lavaron con lavado de placa y 100 \muL del conjugado de trabajo luego se adicionan a todos los pozos, excepto para el pozo de sustrato blanco. Los pozos de nuevo se cubren e incuban a temperatura ambiente (15ºC-30ºC) por 30 minutos. Durante la incubación con el conjugado de trabajo, el sustrato de trabajo se prepara disolviendo tabletas de OPD sustrato en diluente del sustrato (solución reguladora citrato 0.1 M, pH 5.0, y 0.01% de H_{2}O_{2}). La tableta/solución del sustrato se somete al vortex vigorosamente para asegurar la disolución completa. Una vez preparado, el sustrato de trabajo se utiliza dentro de 30 minutos y se protege de la exposición a la luz.
Los pozos de microtitulación se lavaron con lavado de placa después de la incubación en conjugado de trabajo. El sustrato de trabajo (100 \muL/pozo) luego se adiciona a todos los pozos, incluyendo el pozo de sustrato blanco. Los pozos/placa se cubren y los pozos/placa se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente (15ºC-30ºC) por 45 minutos. La solución de parada (solución acuosa de H_{2}SO_{4} 2.5 N) se adiciona a cada pozo para detener la reacción. La absorbancia a 490 nm se lee dentro de 30 minutos.
Los resultados obtenidos del ELISA Microtiter de HER-2/neu utilizando muestras de suero o plasma se comparan con los estándares y controles como suministro en el kit (Oncogene Science, Bayer Diagnostics, Cambridge, MA). Los anticuerpos que contienen el ensayo reconocen el enlace del dominio extracelular-ligando de la proteína neu (W.P. Carney et al., 1991, J. Tumor Marker Oncol., 6:53-72; S.J. McKenzie et al., 1989, Oncogene, 4:543-548). Esta forma de ECD de HER-2/neu ha sido identificada con un peso molecular de aproximadamente 105 kDa. Los estándares en el kit se calibran en nanogramos, que tienen en cuenta el peso molecular de la forma de ECD encontrada en suero, y se preparan a partir de una forma recombinante de la porción de 105 kDa de HER-2/neu.
Los valores de absorbancia para cada dilución del estándar, control y de la muestra de prueba se promedian para obtener las absorbancias medias. Para preparar una curva estándar, la absorbancia media para cada estándar se registra en el eje de y versus la concentración de la proteína neu (ng/mL) en el eje de la x. La concentración de la proteína neu se determina para cada dilución de la muestra probada por interpolación de la curva estándar. Los paquetes de software están disponibles para este proceso, por ejemplo, Softmax^{TM}, Molecular Devices, Sunnyvale, CA; y KinetiCal^{TM}, Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT). Se utiliza un algoritmo de ajuste de curva cuadrático (segundo orden polinomial).
Los resultados a partir de las muestras sometidas a la prueba se expresan en ng/mL mediante lectura de la curva estándar como se señala. Usualmente no se necesita corrección de dilución matemática para las muestras diluidas 1:50, ya que la concentración actual de las preparaciones estándar es a 2% de la dosificación marcada. Para las muestras que producen los valores OD que exceden el rango de la curva estándar, un ensayo posterior con diluciones más grandes son necesarias. Si otras diluciones se hacen, el valor obtenido del ensayo se debe corregir para cualquier dilución más allá de 1:50, por ejemplo, el resultado reportado se multiplica por un factor de corrección de dilución de 2 para una dilución de la muestra de 1:100; el resultado reportado se multiplica por un factor de corrección de dilución de 4 para una dilución de la muestra de 1:200; y el resultado reportado se multiplica por un factor de corrección de dilución de 8 para una dilución de la muestra de 1:400.
Para muestras de tejido, un citosol se prepara; una muestra del homogeneizado se retira justo antes de la ultracentrifugación y se utiliza para la medición de proteína neu después de otro proceso como se describe en el folleto del kit. (Oncogene Science, Bayer Diagnostics, Cambridge, MA). En resumen, para la preparación de la muestra de tejido, una muestra de tejido congelada se pesa y corta en piezas pequeñas. La solución reguladora receptor fría (4ºC) (Tris-HCl 10 mM, pH 7.4; EDTA 1.5 mM; 10% de glicerol; y 0.1% de azida de sodio) se adiciona a las piezas de tejido a una relación solución reguladora:tejido de 10:1 (v/w), por ejemplo, 10 mL de solución reguladora se adiciona a 1 g de tejido). Un cóctel inhibidor de proteasa que se puede utilizar contiene 0.5 \mug/mL de leupeptina, 1 \mug/mL de pepstatina y pA-PMSF 0.2 mM.
El tejido se homogeniza sobre hielo utilizando un homogenizador (por ejemplo, Polytron) con dos, ráfagas a la velocidad de 25 segundos (ajuste de 6). Entre las ráfagas, la muestra de tejido homogeneizado se enfría sobre hielo por 15-20 segundos. Una alícuota (50 \muL) del homogeneizado se mezcla con 10 \muL de PBS que contiene 6% de Triton X-100 en un tubo de microcentrífuga, i.e., en una dilución 1:6, y se incuban por 5 minutos a temperatura ambiente con agitación. En este punto las muestras se pueden utilizar, o almacenar congeladas a -70ºC por al menos un mes. Para uso inmediato, el homogeneizado se centrifuga a 15,000 rpm (\sim14-16,000 x g) por 10 minutos en una microcentrifuga y el sobrenadante se recupera. La concentración de la proteína en el sobrenadante se determina utilizando métodos convencionales, por ejemplo, el ensayo Micro-BCA (P.K. Smith et al., 1985, Analyt. Biochem., 150:76-85; Pierce Chemical Co., Rockford, IL); microensayo de proteína Bio-Rad (M.M. Bradford, 1976, Analyt. Biochem., 72:248-254; Bio-Rad Laboratories, Richmond, VA); o el método Lowry (O.H. Lowry et al., 1951, J. Biol. Chem., 193:265-275).
Antes de la medición de los niveles de la proteína neu en el ELISA Microtiter de HER-2/neu, la muestra se diluye a una concentración de proteína apropiada. Una concentración de la proteína lisada inicial de 5 \mug/mL en diluente de la muestra se recomienda. (ELISA Microtiter de HER-2/neu, Oncogene Science, Bayer Corporation, Cambridge, MA).
Debido a la forma molecular de HER-2/neu en tejido (p185 de longitud completa), es mayor de 1.76-veces en peso molecular que la forma de HER-2/neu en los estándares, se debe hacer corrección para esta discrepancia, como se especifica en "Ajuste de los resultados para los Lisados", (ELISA Microtiter de HER-2/neu manual, Oncogene Science, Bayer Corporation, Cambridge, MA). Los resultados se reportan en ng de p185 por unidad de la proteína total en la muestra lisada (ng p185/mg proteína lisada), dado que las preparaciones de la muestra se ensayaron en una concentración de proteína seleccionada en diluente de la muestra, en lugar de utilizar un factor de dilución.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Microtitulador basado en ELISA para examinar niveles en suero de EGFR en muestras de suero de pacientes con cáncer y normales
Las muestras de suero humano se diluyeron en diluente de la muestra del kit de ELISA disponible comercialmente (Bayer Diagnostics/Oncogene Science ELISA de Microtitulación de EGFR, Cambridge, MA) y luego se analiza en el ELISA microtiter de EGFr, como se describe en el Ejemplo 1. Una curva estándar con estándares probados por duplicado se corrió en cada ELISA. Todas las muestras de suero normal se probaron por duplicado por al menos dos operadores diferentes. Los valores medios se obtuvieron para todas las muestras probadas. Un total de suero de 110 hombres normales y 111 mujeres normales, se probó con el fin de determinar un título normal. El límite se definió como el valor medio +/- dos desviaciones estándar (+/- SD). El suero de paciente con cáncer luego se analizó en el ELISA de EGFR, con muestras probadas por duplicado por al menos dos operadores diferentes. Todos los otros parámetros experimentales fueron como los anteriores.
La determinación de un valor normal se definió como el valor medio para las 221 muestras de suero normal +/- dos desviaciones estándar. Los resultados a partir de las muestras de suero con cáncer, luego se compararon con el rango normal. Cualquiera de las muestras de suero con cáncer que estuvieron arriba del rango normal se consideraron elevados para ECD del EGFR y cualquiera de las muestras de suero con cáncer que estuvieron por debajo del rango normal se consideraron disminuidas para ECD de EGFR.
Utilizando más de doscientas muestras de suero humano normal, un rango normal se estableció para los niveles de ECD del EGFR utilizando el ELISA microtiter-basado EGFr (Bayer Diagnostics/Oncogene Science, Cambridge, MA). (Fig. 2). Este rango se determinó calculando el valor medio para muestras de suero de hombres normales y mujeres normales y adicionando dos desviaciones estándar con el fin de establecer un límite superior de ECD del EGFR en suero normal. El rango para ECD del EGFR en suero de hombre normal se determinó que es 46-79 ng/ml, el rango de suero de mujer normal se determinó que es 45-78 ng/ml y para hombres y mujeres combinado el rango normal en suero se encontró que es 45-78 ng/ml.
Una variedad de muestras de suero con cáncer se analizaron utilizando el kit de detección de ECD de ELISA de EGFR (Bayer Diagnostics/Oncogene Science) y los resultados se compararon con el rango de los valores normales descrito arriba. Los valores obtenidos del suero de paciente con cáncer mostraron una disminución en todos los tipos de cáncer examinados. (Figs. 1A y 1B). Específicamente, 42% del suero del paciente con cáncer de pulmón, 44% del suero de paciente con cáncer de próstata de último estadio, 48% del suero de paciente con cáncer de ovarios, 67% del suero de paciente con cáncer de colon, 56% del suero de paciente con cáncer de vejiga; 44% del suero de paciente con cáncer de mama estadio III; y 32% del suero de paciente con cáncer de mama estadio IV (46% total en suero de paciente con cáncer de mama) mostraron niveles de ECD del EGFR por debajo del rango normal.
En pacientes con cáncer de ovarios, hubo descensos observados en un gran porcentaje de las muestras como el estado del cáncer aumentado. (Fig. 3). Específicamente, el suero de ovario benigno mostró 8% de las muestras por debajo del rango normal para ECD de EGFR, mientras que suero de cáncer de ovarios estadio I mostró 29% de disminución en niveles de ECD del EGFR de las muestras; suero de cáncer de ovarios estadio II mostró el 50% de disminución en niveles de ECD del EGFR de las muestras, suero de cáncer de ovarios estadio III mostró el 74% de disminución en niveles de ECD del EGFR de las muestras y suero de cáncer de ovarios estadio IV mostró el 78% de disminución de las muestras por debajo del valor normal para ECD de EGFR. El rango normal de ECD del EGFR en muestras de suero de hombres y mujeres normales también se determinó utilizando el ELISA basado en mocrotiter para ECD del EGFR (i.e., Bayer Diagnostics/Oncogene Science, Cambridge, MA). Como se puede observar de los resultados del suero analizado a partir de una variedad de pacientes con cáncer, un gran porcentaje de todos los tipos de suero de pacientes con cáncer mostraron una disminución significante en ECD del EGFR en comparación con el valor de rango normal de ECD de EGFR. Además, una disminución porcentual más alta frecuentemente se correlaciona con una etapa más avanzada o grado del cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3 Los niveles de suero de ECD del EGFR en pacientes de cáncer de mama metastásico
En este Ejemplo, ECD del EGFR en suero se cuantificó en individuos saludables (controles) y en pacientes con cáncer de mama utilizando el ELISA de Microtitulación de EGFR Bayer Diagnostics/Oncogene Science, como se describe en el Ejemplo 1.
El suero de pretratamiento se obtuvo de 265 pacientes con cáncer de mama metastásico post-menopaúsico en una prueba clínica de fase III multicentro, aleatoria, doble enlace, de terapia de hormona de línea segunda (Fadrozole versus Megestrol acetato). Los controles normales consistieron de dos grupos de mujeres: (i) 46 mujeres pre-menopáusicas que tienen un valor medio de ECD del EGFR de 79.54 \pm 9.87 ng/ml, con un rango (media \pm 2 SD) a partir de 59.80-99.28 ng/ml; y (ii) 13 mujeres pos-menopáusicas que tienen un valor medio de ECD del EGFR de 89.87 \pm 16.40 ng/ml, con un rango (media \pm 2 SD) de apartir de 57.07-122.67 ng/ml. Para los grupos control, el nivel medio de ECD del EGFR en suero, fue significantemente más alto en mujeres pos-menopáusica (i.e., 89.87 \pm 16.40 ng/ml; n=13) en comparación con el nivel medio de ECD del EGFR en mujeres pre-menopáusicas (i.e., 79.54 \pm 9.87 ng/ml; n=46; p=0.006).
Los análisis de los valores de ECD del EGFR en suero de los 265 pacientes pos-menopáusicas con cáncer revelaron un nivel medio de ECD del EGFR en suero de 66.2 ng/ml, que fue significantemente inferior que aquel del grupo control de mujeres pos-menopáusicas (p<0.00001). Utilizando un punto límite de 57.07 ng/ml (media \pm 2 SD) forma el grupo control de mujeres pos-menopáusicas, 71/265 de pacientes con cáncer (26.8%) tuvo un nivel disminuido ECD del EGFR en suero, en comparación con 0/13 de los controles.
El beneficio clínico (i.e., CR + PR + Estable > 24 semanas) fue significantemente menor en pacientes con un nivel disminuido de ECD del EGFR en suero (p=0.04). Los pacientes con niveles disminuidos de ECD del EGFR en suero tuvieron un menor tiempo a la progresión (TTP), (media proporcional 3.5 meses) en comparación con los pacientes con niveles normales en suero de ECD del EGFR (media proporcional 6.4 meses), (p=0.04). Además, los pacientes con niveles disminuidos de ECD del EGFR en suero (media proporcional 21.8 meses) tienden hacia una supervivencia global menor en comparación con pacientes con EGFR de suero normal (27.8 meses), (p=0.06). Estos resultados muestran que los niveles de ECD del EGFR en suero de pretratamiento se disminuyeron significantemente en pacientes con cáncer de mama metastásico en comparación con controles saludables, y pacientes con niveles disminuidos de ECD del EGFR en suero han reducido el beneficio clínico, TTP y la supervivencia global en comparación con pacientes con niveles normales en suero de ECD del EGFR.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4 Análisis seriales de niveles de ECD del EGFR en suero de pacientes con cáncer de próstata
Las muestras de suero se obtuvieron a partir de 25 pacientes con cáncer de próstata. Cada uno de los pacientes tuvo de 4 a 6 muestras de extracciones de sangre en serie, del cual el componente de suero se utilizó. Las muestras de suero se obtuvieron en forma congelada y se descongelaron antes del análisis por ELISA, como se describe en el Ejemplo 1, para una determinación de los niveles de ECD del EGFR durante el tiempo. Las muestras se analizaron de una manera serial sobre una base mensual, o cada dos o tres meses, durante un periodo de tiempo de nueve a doce meses. Los niveles monitoreados de ECD del EGFR en muestras de suero a partir de pacientes tomados durante el tiempo de acuerdo con los métodos de la presente invención proporcionan una ventajosa metodología para chequear y examinar la respuesta del paciente a la terapia o tratamiento de cáncer durante un periodo de tiempo ex-
tendido.
Será apreciado que a pesar de que, como se ejemplifica aquí, las muestras de suero se congelaron y luego de analizaron en el último tiempo, las muestras de sangre frescas se pueden recolectar de pacientes en los intervalos de tiempo deseados durante el periodo de seguimiento en serie, y las muestras de suero (o plasma) fresco utilizadas igualmente bien para el análisis del estado del paciente o tratamiento y la información de acuerdo con esta invención. La Tabla 2 presenta los resultados representativos de niveles de ECD del EGFR determinados a partir de 5 pacientes con cáncer de próstata cuyas muestras de suero se analizaron en serie a seis diferentes intervalos de tiempo durante el periodo de seguimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2
2
3
Ejemplo 5 Análisis de los niveles de ECD del EGFR y niveles de HER-2/neu, en combinación, en suero de pacientes con cáncer de mama
Este Ejemplo describe el análisis y la medición de los niveles de EGFR y HER-2/neu utilizando protocolos ELISA como se describe (Oncogene Science, Bayer Corporation, por ejemplo, Ejemplo 1B). Los sueros del pre-tratamiento fueron disponibles de 265 pacientes con cáncer de mama metastásico quienes participan en una prueba de terapia hormonal de segunda línea. Otro análisis se hizo dividiendo los pacientes en los siguientes 4 subgrupos:
1) HER-2/neu normal y EGFR normal (n=135, 50.9%),
2) HER-2/neu normal y EGFR bajo (n=61, 23%),
3) HER-2/neu elevados y EGFR normal (n=46, 17.4%),
4) HER-2/neu elevados y EGFR bajo (n=23, 8.7%).
Los puntos finales clínicos estudiados fueron velocidad de beneficio clínico (CBR) (i.e., CR+ PR + enfermedad estable >24 semanas), tiempo a la progresión (TTP) y supervivencia global (OS). CBR se evaluó utilizando un modelo de regresión logístico. TTP y OS se analizaron utilizando el modelo peligro proporcional de Cox. Los valores P de menos de 0.05 se consideraron estadísticamente significantes después de la corrección por comparaciones múltiples.
Cuando en comparación con pacientes con niveles normales en suero de HER-2/neu y EGFR (subgrupo 1), los pacientes con HER-2/neu normal y EGFR bajo (subgrupo 2) se asocian con una tendencia hacia una supervivencia más breve (p=0.06). El subgrupo de pacientes con niveles altos de HER-2/neu y niveles bajos de EGFR (subgrupo 4) también tuvo un TTP más breve (p<0.0001) y supervivencia global (p<0.0001) cuando se compara con pacientes con niveles normales en suero de HER-2/neu y EGFR (subgrupo 1). (Figs. 4 y 5).
Los resultados de estos análisis demuestran que el análisis de una combinación de suero HER-2/neu y niveles de EGFR permite la identificación de subgrupos de pacientes que tienen diferentes resultados de predicción y pronóstico de la enfermedad. Los pacientes con niveles elevados en suero de HER-2/neu y niveles bajos en suero de EGFR (subgrupo 4) se encontraron que tienen la TTP y supervivencia más pequeña. Este grupo de pacientes tendría un beneficio más probable a partir de terapias combinadas de EGFR- y HER-2/neu-dirigidas. La identificación de un subgrupo de pacientes con niveles normales en suero de HER-2/neu y niveles bajos de EGFR (subgrupo 2) debería identificar pacientes que son más probables de beneficio de una terapia de EGFR-dirigida sola. Por consiguiente esta medición y análisis combinado proporcionan importante información para identificar pacientes de las terapias de EGFR- y/o HER-2/neu-dirigida.
Como varios cambios se pueden hacer de la materia descrita anteriormente sin retirarse del alcance de la presente invención, se pretende que toda la materia comprendida en la descripción anterior y definida en las reivindicaciones anexas, se interpretan como descriptivas e ilustrativas de la presente invención. Varias modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles a la luz de las instrucciones anteriores y están dentro del alcance definido por las reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citada por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patentes citadas en la descripción
\bullet US 5674753 A [0002] [0039]
\bullet US 5344760 A [0039] [0092]
\bullet US 5401638 A [0040]
\bullet EP 0494135 A [0040]
\bullet US 5604107 A [0040]
\bullet EP 0412116 A [0040]
\bullet CA 20262508 [0040]
\bullet US 5698426 A [0042]
\bullet US 5223409 A [0042]
\bullet US 5403484 A [0042]
\bullet US 5580717 A [0042]
\bullet US 5427908 A [0042] [0042]
\bullet US 5750753 A [0042]
\bullet US 5821047 A [0042]
\bullet US 5571698 A [0042]
\bullet US 5516637 A [0042]
\bullet US 5780225 A [0042]
\bullet US 5658727 A [0042]
\bullet US 5733743 A [0042]
\bullet US 5969108 A [0042]
\bullet US 4946778 A [0043]
\bullet WO 8605807 A [0047]
\bullet WO 8901036 A [0047]
\bullet US 5122464 A [0047]
Literatura no-patente citada en la descripción
\bullet W.J. Gullick et al. Cancer Res, 1986, vol. 46, 285-292 [0002]
\bullet S. Cohen et al. J. Biol. Chem., 1980, vol. 255, 4834-4842 [0002]
\bullet A.B. Schreiber et al. J. Biol. Chem., 1983, vol. 258, 846-853 [0002]
\bulletChoi et al. Cancer, 1997, vol. 79, 1879-1883 [0002]
\bulletPatanen et al. J. Occupational medicine, 1994, vol. 36, 1324-1328 [0002]
\bulletZhou et al. FRONTIERS OF BIOTECHNOLOGY & PHARMACEUTICALS, 2002, vol. 3, 29-45 [0002]
\bullet L. Harris et al. Int J. Biol. Markers, 1999, vol. 14, 8-15 [0003]
\bullet J. Mendelsohn; J. Baselga. Oncogene, 2000, vol. 19, 6550-6565 [0003]
\bullet A.L. Ullrich et al. Nature, 1984, vol. 307, 418-425 [0004] [0093]
\bullet J. Downward et al. Nature, 1984, vol. 307, 521-527 [0004]
\bullet C.R. Carlin et al. Mol. Cell. Biol., 1986, vol. 6, 257-264 [0004]
\bullet F.L.V. Mayes; M.D. Waterfield. The EMBO J., 1984, vol. 3, 531-537 [0004]
\bullet G. Carpenter; S. Cohen. Ann. Rev. Biochem., 1979, vol. 48, 193-216 [0005]
\bullet M.J. Oh et al. Clin. Cancer Res., 2000, vol. 6, 4760-4763 [0005] [0010]
\bullet W.P. Carney; J. Williams. AdvanceLaboratory Women's Health, 2001, 1-3 [0006]
\bullet W.J. Gullick et al. Cancer Res., 1986, vol. 46, 285-292 [0007]
\bullet B. Ozanne et al. J. Pathol., 1986, vol. 149, 9-14 [0007]
\bullet S.J. McKenzie. Biochim. et Biophys. Acta, 1991, vol. 1072, 193-214 [0007]
\bullet C. Wright et al. Br. J. Cancer, 1992, vol. 65, 118-212 [0007]
\bullet G.N. Fuller et al. Mutation Res., 1992, vol. 276, 299-306 [0007]
\bullet J.G.M. Klijn et al. Endocrine Rev., 1992, vol. 13, 3-17 [0007]
\bullet S. Nicolson et al. Oncology, 1991, vol. 1, 43-52 [0007]
\bullet C. Wright et al. Br. J. Cancer, 1991, vol. 63, 967-970 [0007]
\bullet J.H. Choi et al. 87th Ann. Meeting AACR, 20 April 1996, 1879-1883 [0007]
\bullet J.G.M. Klijn et al. Endocrine Reviews, 1992, vol. 13, 3-17 [0007]
\bullet S. Nicolson et al. Diagnostic Oncology, 1991, vol. 1, 43-52 [0007]
\bullet C. Wright et al. British Journal Cancer, 1991, vol. 63, 967-970 [0007]
\bullet J.R.C. Sainsbury et al. Lancet, 1987, vol. 1, 1398-1402 [0007]
\bullet M.A. Rios et al. Anticancer Research, 1988, vol. 8, 173-176 [0007]
\bullet A. Ullrich et al. Cell, 1990, vol. 61, 203-212 [0007]
\bullet R. Nicolson et al. British Journal Cancer, 1991, vol. 63, 146-150 [0007]
\bullet R.G. Dullea et al. Proc. 91st Ann. Meeting of the American Association for Cancer Research (AACR), 2000, vol. 41, 401 [0008]
\bullet J.M. Nelson et al. Proc. 91st Ann. Meeting AACR, 2000, vol. 41, 241 [0008]
\bullet T. O'Reilly et al. Proc. 91st Ann. Meeting AACR, 2000, vol. 41, 481 [0008]
\bullet H.C. Kelly et al. Proc. 91st Ann. Meeting AACR, 2000, vol. 41, 612 [0008]
\bullet L. Witters et al. Breast Cancer Research and Treatment, 1999, vol. 53, 41-50 [0008]
\bullet X-D Yang et al. Proc. 91st Ann. Meeting AACR, 2000, vol. 41, 530 [0008]
\bullet X-D Yang et al. Cancer Research, 1999, vol. 59, 1236-1243 [0008]
\bullet L. Milas et al. Clinical Cancer Research, 2000, vol. 6, 701-708 [0008]
\bullet T. Ohmori et al. Proc. 91st Ann. Meeting AACR, 2000, vol. 41, 48236 [0008]
\bullet A. Budillon et al. Proceedings of the 91st Ann. Meeting AACR, 2000, vol. 41, 773 [0008]
\bullet W.P. Carney et al. J. Tumor Marker Oncol., 1991, vol. 6 (2), 53-72 [0010] [0010]
\bullet A.J. Baron et al. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention, 1999, vol. 8, 129-137 [0010]
\bulletBrinkman et al. J. Immunol. Methods, 1995, vol. 182, 41-50 [0042]
\bulletAmes et al. J. Immunol. Methods, 1995, vol. 184, 177-186 [0042]
\bulletKettleborough et al. Eur. J. Immunol., 1994, vol. 24, 952-958 [0042]
\bulletPersic et al. Gene, 1997, vol. 187, 9-18 [0042]
\bulletBurton et al. Advances in Immunology, 1994, vol. 57, 191-280 [0042]
\bulletKohler; Milstein. Nature, 1975, vol. 256, 495-497 [0043]
\bulletHarlow et al. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 [0043]
\bulletHammerling et al. Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas. Elsevier, 1981, 563-681 [0043]
\bulletKozbor et al. Immunol. Today, 1983, vol. 4, 72 [0043]
\bulletCole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy. Alan R. Liss, Inc, 1985, 77-96 [0043]
\bulletSutcliffe et al. Science, 1983, vol. 219, 660-666 [0046]
\bulletWilson et al. Cell, 1984, vol. 37, 767-778 [0046]
\bulletBittle et al. J. Gen. Virol., 1985, vol. 66, 2347-2354 [0046]
\bulletFoecking et al. Gene, 1986, vol. 45, 101 [0048]
\bulletCockett et al. BioTechnology, 1990, vol. 8, 2 [0048]
\bullet R.N. Fabricant et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, vol. 74, 565-569 [0093]
\bullet M.M. Wrann et al. J. Biol. Chem., 1979, vol. 254, 8083-8086 [0093]
\bullet S.J. McKenzie et al. Oncogene, 1989, vol. 4, 543-548 [0102] [0109]
\bullet W.P. Carney et al. J. Tumor Marker Oncol., 1991, vol. 6, 53-72 [0109]
\bullet P.K. Smith et al. Analyt. Biochem. Pierce Chemical Co, 1985, vol. 150, 76-85 [0113]
\bullet M.M. Bradford. Analyt. Biochem. Bio-Rad Laboratories, 976, vol. 72, 248-254 [0113]
\bullet O.H. Lowry et al. J. Biol. Chem., 1951, vol. 193, 265-275 [0113].

Claims (52)

1. Un método para monitorear el tratamiento de cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de ovarios y cáncer de colon, o la eficacia de este, en un paciente con cáncer sometido a dicho tratamiento, que comprende:
(a) medición del nivel del dominio extracelular dividido activamente o descartado (ECD) del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en una muestra de fluido corporal del paciente con cáncer, siendo dicho fluido corporal seleccionado de sangre, suero o plasma; y
(b) determinar si dicho nivel del ECD del EGFR se disminuye durante el curso del tratamiento del cáncer en comparación con el nivel en controles normales; en donde el rango normal del nivel en controles normales es 45 a 78 ng/ml; y además en donde una disminución en el nivel del ECD descartado o dividido activamente de EGFR en comparación con el nivel del ECD descartado o dividido activamente de EGFR en controles normales durante el periodo de seguimiento indica uno o más de los siguientes: (i) evolución del cáncer, (ii) una etapa más avanzada del cáncer, o (iii) falta de respuesta por el paciente al tratamiento del cáncer.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde además los niveles de ECD del EGFR del paciente con cáncer, se comparan entre sí durante el periodo de seguimiento, proporcionando por consiguiente, los valores de ECD del EGFR propio del paciente como un control interno para el seguimiento de ECD del EGFR a largo plazo.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los pacientes con cáncer tienen un cáncer de tumor sólido.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la muestra de fluido corporal es suero.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde además un cambio en el nivel de ECD del EGFR (i) a partir de una disminución en comparación con el nivel de ECD del EGFR en los controles normales para un incremento o (ii) de una disminución en comparación con el nivel de ECD del EGFR en controles normales para un nivel del ECD del EGFR en controles normales indica una mejora en el paciente con estado de cáncer que resulta de la eficacia del tratamiento.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho nivel de ECD del EGFR se determina por un ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA) que comprende anticuerpos inmunoreactivos con el ECD de EGFR.
7. El método de la reivindicación 1 que comprende:
(a) medición de los niveles de ECD descartado o dividido activamente de EGFR en una muestra de fluido corporal del paciente con cáncer en un primer punto de tiempo durante el tratamiento del cáncer;
(b) determinar si los niveles del ECD descartado o dividido activamente de EGFR se disminuyen en comparación con los niveles del ECD descartado o dividido activamente de EGFR en controles normales; en donde el rango normal de los niveles del dominio extracelular dividido activamente o descartado (ECD) del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en controles normales esta en el rango de 45 a 78 ng/ml;
(c) repetición de las etapas (a) y (b) en diferentes intervalos de tiempo durante el curso del tratamiento o terapia del paciente; en donde una disminución en los niveles en suero del ECD descartado o dividido activamente de EGFR en comparación con los niveles del ECD descartado o dividido activamente de EGFR en controles normales en cada intervalo probado es indicativo de uno o más de (i) un incremento en estadio o grado del cáncer durante el tratamiento del cáncer del paciente; (ii) falta de respuesta al tratamiento o terapia del cáncer por el paciente; (iii) resultado pobre de la terapia del paciente; (iv) corto tiempo de evolución de la enfermedad; o (v) corto tiempo de supervivencia.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde se determina un incremento o la elevación de los niveles en suero del ECD del EGFR en comparación con aquellos de los controles normales en un intervalo de prueba, durante el tratamiento o la terapia, y en donde el incremento o elevación resulta en un nivel del ECD del EGFR que se aproxima a los niveles de control, lo que indica uno o más de (i) respuesta favorable del paciente al tratamiento o terapia del cáncer; o (ii) remisión de la enfermedad.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el valor medio normal de ECD del EGFR en suero en mujeres es 61 ng/ml.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el valor medio normal de ECD del EGFR en suero en hombres es 62 ng/ml.
11. El método de la reivindicación 1 que comprende:
(a) medición de los niveles de ECD descartado o dividido activamente de EGFR en una muestra de fluido corporal del paciente con cáncer en un primer punto de tiempo durante el tratamiento del cáncer;
(b) determinar si los niveles del ECD descartado o dividido activamente de EGFR se disminuyen en comparación con los niveles del ECD descartado o dividido activamente de EGFR en controles normales;
(c) repetición de las etapas (a) y (b) a diferentes intervalos de tiempo durante el curso del tratamiento o terapia del paciente; en donde una disminución en los niveles en suero del ECD descartado o dividido activamente de EGFR en comparación con los niveles del ECD descartado o dividido activamente de EGFR en controles normales en cada intervalo probado es indicativo de uno o más de (i) un incremento en estadio o grado del cáncer durante el tratamiento del cáncer del paciente; (ii) falta de respuesta al tratamiento o terapia del cáncer por el paciente; (iii) resultado pobre de la terapia del paciente; (iv) el menor tiempo de evolución de la enfermedad que los pacientes con niveles normales en suero de ECD de EGFR; o (v) tiempo de supervivencia menor que los pacientes con niveles normales en suero de ECD de EGFR
12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde se determina un incremento o elevación en los niveles en suero del ECD del EGFR en comparación con aquellos de controles normales en un intervalo probado durante el tratamiento o terapia, y en donde dicho incremento o elevación resulta en un nivel del ECD del EGFR de niveles de control, lo que indica uno o más de (i) velocidad de beneficio clínico mejorada (CBR) al tratamiento o terapia del cáncer; o (ii) remisión de la enfermedad.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde en la etapa (b), el rango normal de los niveles del dominio extracelular (ECD) del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en controles normales está en el rango de 45 a 78 ng/ml.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde, en la etapa (b), el valor medio normal de ECD del EGFR en suero en mujeres es 61 ng/ml.
15. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde, en la etapa (b), el valor medio normal de ECD del EGFR en suero en hombres es 62 ng/ml.
16. El método de la reivindicación 1 que comprende:
(a) medición de los niveles del ECD descartado o dividido activamente de EGFR en una muestra de suero o plasma del paciente con cáncer que tiene un cáncer seleccionado del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer cervical y cáncer de pulmón;
(b) determinar si el paciente con cáncer ha disminuido los niveles en suero o plasma del ECD descartado o dividido activamente del EGFR en comparación con los niveles en suero o plasma del ECD descartado o dividido activamente del EGFR en controles normales; y
(c) seguimiento de la severidad del cáncer o evolución del cáncer en el paciente basándose en la disminución en suero o plasma de los niveles de ECD descartado o dividido activamente del EGFR en el suero o plasma del paciente en comparación con niveles en suero o plasma normales de ECD descartado o dividido activamente del EGFR en la etapa (b), en donde el estado del cáncer más severo se correlaciona con los niveles más bajos de ECD descartado o dividido activamente del EGFR en plasma o suero en comparación con los niveles control normales.
17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el paciente con cáncer tiene cáncer de mama.
18. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde se determinan los niveles de ECD del EGFR en suero.
19. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el nivel en suero normal de ECD del EGFR está en el rango de 45 ng/ml a 78 ng/ml.
20. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el valor medio normal de ECD del EGFR en suero en mujeres es 61 ng/ml.
21. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el valor de corte para el límite inferior del normal es 45 ng/ml y el valor de corte para el límite superior del normal es 78 ng/ml.
22. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el valor medio normal de ECD del EGFR en suero en hombres es 62 ng/ml.
23. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el valor de corte para el límite inferior de lo normal es 46 ng/ml en hombres, y el valor de corte para el límite superior del normal es 79 ng/ml en hombres.
24. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde se determinan los niveles de ECD del EGFR en plasma o suero, mediante un ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA).
25. El método de la reivindicación 1 que comprende:
(a) determinar si el paciente con cáncer tiene niveles en suero disminuidos de ECD del EGFR comparados con niveles en suero del ECD del EGFR en controles normales a uno o más intervalos de tiempo durante el curso del tratamiento del cáncer del paciente; y
(b) concluyendo que el paciente con cáncer que tiene niveles en suero disminuidos del ECD del EGFR en comparación con los niveles en suero del ECD del EGFR en controles normales es probable que tenga un resultado no-satisfactorio del tratamiento o terapia del cáncer como se caracteriza por una reducida velocidad de beneficio clínico (CBR),) menor tiempo de evolución de la enfermedad que los pacientes con niveles normales en suero de ECD del EGFR; o tiempo de supervivencia menor que en pacientes con niveles normales en suero de ECD de EGFR, basándose en la determinación de los niveles en suero disminuidos del ECD del EGFR en comparación con los valores normales.
26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el cáncer es cáncer de mama metastásico.
27. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el nivel en suero normal de EGFR está en el rango de 45 ng/ml a 78 ng/ml.
28. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde los niveles en suero del EGFR se determinan por un ELISA.
29. Un método para determinar la evolución de la enfermedad y supervivencia total del paciente en un paciente con cáncer de mama, que comprende:
(a) medición del nivel del ECD descartado o dividido activamente de EGFR en una muestra de fluido corporal del paciente con cáncer, siendo dicho fluido corporal seleccionado de sangre, suero o plasma;
(b) medición del nivel del ECD descartado del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano-2 (HER-2/neu) en la misma muestra de fluido corporal del paciente con cáncer; y
(c) determinación, en combinación, (i) si el nivel del ECD descartado o dividido activamente de EGFR se disminuye en comparación con el nivel del ECD descartado o dividido activamente de EGFR en controles normales; y (ii) si el nivel del ECD descartado del HER-2/neu se eleva en comparación con el nivel de ECD descartado del HER-2/neu en controles normales,; en donde el rango normal del nivel del dominio extracelular ECD dividido activamente o descartado de EGFR en controles normales es 45 a 78 ng/ml y el nivel normal de ECD descartado del HER-2/neu en los controles es menor de 15 ng/ml y un nivel elevado es igual o mayor de 15 ng/ml; y en donde además una disminución en el nivel del ECD descartado o dividido activamente de EGFR en comparación con el nivel del ECD descartado o dividido activamente de EGFR en controles normales y una elevación en el nivel de ECD descartado del HER-2/neu en comparación con el nivel de ECD descartado del HER-2/neu en controles normales en la muestra del paciente indica uno o más de los siguientes: (i) menor tiempo para la evolución del cáncer, (ii) supervivencia global menor para el paciente.
30. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde el menor tiempo de evolución de la enfermedad en comparación con pacientes con niveles normales en suero de ECD de EGFR; o tiempo de supervivencia menor en comparación con pacientes con niveles normales en suero de ECD de EGFR, además se asocia con niveles disminuidos de ECD del EGFR y niveles elevados de HER-2/neu en pacientes en comparación con controles que tienen niveles normales de EGFR y niveles elevados de HER-2/neu; o controles que tienen niveles disminuidos de EGFR y niveles normales de HER-2.
31. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde los pacientes con cáncer tienen un cáncer de tumor sólido.
32. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde los pacientes con cáncer tienen un cáncer seleccionado de cáncer de ovario, vejiga, colon, pulmón, mama, o próstata.
33. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde los pacientes tienen cáncer de mama o cáncer de mama metastásico.
34. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde el nivel de ECD del EGFR se determina por un ELISA que comprende anticuerpos inmunoreactivos con el ECD del EGFR y el nivel de HER-2/neu se determina, mediante un ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA) que comprende anticuerpos inmunoreactivos con HER-2/neu o el dominio extracelular de estos.
35. El método de la reivindicación 29 que adicionalmente comprende:
(d) la evaluación de una estrategia de tratamiento para el paciente.
\newpage
36. El método de acuerdo con la reivindicación 35, en donde los resultados de la evaluación de la etapa (c) indican (i) un tratamiento o terapia agresiva del paciente; o (ii) a la vez un tratamiento o terapia EGFR-dirigido y un tratamiento o terapia HER-2/neu-dirigido.
37. El método de acuerdo con la reivindicación 35, en donde el paciente es un paciente de cáncer de mama o cáncer de mama metastásico.
38. El método de acuerdo con la reivindicación 35, en donde la muestra de fluido corporal es suero.
39. El método de la reivindicación 29 en donde, los resultados son indicativos de uno o más de (i) un incremento en el estadio o grado del cáncer durante el tratamiento del cáncer del paciente; (ii) falta de respuesta al tratamiento o terapia del cáncer por el paciente; (iii) resultado pobre de la terapia del paciente; menor tiempo de evolución de la enfermedad que los pacientes con niveles normales en suero de ECD del EGFR; o (v) tiempo de supervivencia menor que los pacientes con niveles normales en suero de ECD del EGFR.
40. El método de acuerdo con la reivindicación 39, en donde se determina un incremento o elevación en los niveles en suero del ECD del EGFR en comparación con aquellos de los controles normales y una disminución concomitante en los niveles en suero de HER-2/neu en comparación con aquellos de los controles normales en un intervalo probado durante el tratamiento o terapia, y en donde el incremento o elevación de ECD del EGFR resulta en niveles de control y la disminución de los niveles de HER-2/neu resulta en niveles de control, lo que indica uno o más de (i)) velocidad de beneficio clínico mejorada (CBR) al tratamiento o terapia del cáncer; (ii) tiempo más largo a la progresión; (iii) supervivencia mayor del paciente; o (iv) remisión de la enfermedad.
41. El método de acuerdo con la reivindicación 39, en donde el valor medio normal de ECD del EGFR en suero en mujeres es 61 ng/ml.
42. El método de acuerdo con la reivindicación 39, en donde el valor medio normal de ECD del EGFR en suero en hombres es 62 ng/ml.
43. El método de acuerdo con la reivindicación 39, en donde los niveles normales de HER-2lneu en suero es menor de 15 ng/ml.
44. El método de acuerdo con la reivindicación 39, en donde la muestra de fluido corporal es suero.
45. El método de acuerdo con la reivindicación 39, en donde el cáncer es cáncer de mama o cáncer de mama metastásico.
46. El método de la reivindicación 29 que comprende:
(a) medición de los niveles de dominio extracelular (ECD) descartado o dividido activamente del EGFR y niveles de ECD descartado del HER-2/neu en una muestra de fluido corporal del paciente con cáncer en un primer punto de tiempo durante el tratamiento del cáncer;
(b) determinación (i) si los niveles del ECD descartado o dividido activamente del EGFR se disminuyen en comparación con los niveles del ECD descartado o dividido activamente del EGFR en controles normales, y (ii) si los niveles de ECD descartado del HER-2/neu se elevan en comparación con los niveles del ECD descartado del HER-2/neu en los controles;
(c) repetición de las etapas (a) y (b) en diferentes intervalos de tiempo durante el curso del tratamiento o terapia del paciente; en donde una disminución en los niveles en suero del ECD descartado o dividido activamente del EGFR en comparación con los niveles del ECD descartado o dividido activamente del EGFR en controles normales, y una elevación en los niveles en suero del ECD descartado de HER-2/neu en comparación con los niveles de ECD descartado del HER-2/neu en controles, en donde y un nivel elevado es igual o mayor de 15 ng/ml, a cada intervalo probado es indicativo de uno o más de (i) un incremento en estadio o grado del cáncer durante el tratamiento del cáncer del paciente; (ii) falta de respuesta al tratamiento o terapia del cáncer por el paciente; (iii) prueba del resultado de la terapia del paciente; menor tiempo de evolución de la enfermedad que los pacientes con niveles normales en suero de ECD de EGFR; o (v) tiempo de supervivencia menor que los pacientes con niveles normales en suero de ECD de EGFR.
\vskip1.000000\baselineskip
47. El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde se determina un incremento o elevación en los niveles en suero del ECD de EGFR, o una disminución o decline en los niveles en suero de HER-2/neu comparados con los niveles de controles normales en un intervalo probado durante el tratamiento o terapia, y en donde el incremento o elevación resulta en un nivel de ECD del EGFR de niveles control normales, y en donde la disminución o decline resulta en un nivel de HER-2/neu de niveles control normales, lo que indica uno o más de (i) velocidad de beneficio clínico mejorada (CBR) al tratamiento o terapia del cáncer; o (ii) remisión de la enfermedad.
\newpage
48. El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde, en la etapa (b), el rango normal de los niveles del dominio extracelular (ECD) del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en controles normales está en el rango de 45 a 78 ng/ml, y el valor normal de HER-2/neu en controles normales es menor de 15 ng/ml.
49. El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde, en la etapa (b), el valor medio normal de ECD del EGFR en suero en mujeres es 61 ng/ml.
50. El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde, en la etapa (b), el valor medio normal de ECD del EGFR en suero en hombres es 62 ng/ml.
51. El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde la muestra de fluido corporal es suero.
52. El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde el cáncer es cáncer de mama o cáncer de mama metastásico.
ES03709354T 2002-03-01 2003-02-27 Pruebas para monitorear pacientes con cancer, basadas en los niveles de analito de dominio extracelular (ecd) del factor receptor del crecimiento epidermico (egfr),solo o en combinacion con otros analitos,en muestras de fluidos corporales. Expired - Lifetime ES2329565T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36067802P 2002-03-01 2002-03-01
US360678P 2002-03-01
US42948702P 2002-11-27 2002-11-27
US429487P 2002-11-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2329565T3 true ES2329565T3 (es) 2009-11-27

Family

ID=27791650

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES03709354T Expired - Lifetime ES2329565T3 (es) 2002-03-01 2003-02-27 Pruebas para monitorear pacientes con cancer, basadas en los niveles de analito de dominio extracelular (ecd) del factor receptor del crecimiento epidermico (egfr),solo o en combinacion con otros analitos,en muestras de fluidos corporales.

Country Status (7)

Country Link
US (1) US7473534B2 (es)
EP (1) EP1573316B1 (es)
AT (1) ATE441107T1 (es)
AU (1) AU2003212415A1 (es)
DE (1) DE60329020D1 (es)
ES (1) ES2329565T3 (es)
WO (1) WO2003073909A2 (es)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7892541B1 (en) 1999-09-30 2011-02-22 Tumor Biology Investment Group, Inc. Soluble epidermal growth factor receptor isoforms
DE10042137A1 (de) * 2000-08-28 2002-03-14 Florian Lang sgk2 und sgk3 als diagnostische und therapeutische Targets
WO2005011607A2 (en) * 2003-08-01 2005-02-10 Smithkline Beecham Corporation Treatment of cancers expressing p95 erbb2
US20050136671A1 (en) * 2003-12-22 2005-06-23 Goldberg Wendy B. Compositions and methods for low downforce pressure polishing of copper
WO2007002505A1 (en) * 2005-06-23 2007-01-04 Bayer Healthcare Llc Quantitative assays for ras p21 in body fluids
WO2007016597A2 (en) * 2005-07-29 2007-02-08 The Regents Of The University Of California Targeting tnf-alpha converting enzyme (tace)-dependent growth factor shedding in cancer therapy
WO2007016367A2 (en) 2005-07-29 2007-02-08 Bayer Healthcare Llc Neoplastic disease-related methods, kits, systems and databases
WO2007021860A2 (en) * 2005-08-11 2007-02-22 Bayer Healthcare Llc QUANTITATIVE ASSAYS FOR PDGFR-β IN BODY FLUIDS
US20070117123A1 (en) * 2005-09-14 2007-05-24 The Regents Of The University Of California Salivary protein and rna for breast cancer detection
US20090047656A1 (en) * 2006-03-13 2009-02-19 Baden Jonathan F Molecular analysis of primary cells
ES2315101B1 (es) * 2006-05-30 2009-11-12 Universidad De Vigo Procedimiento para el diagnostico de cancer de cabeza y cuello mediante la valoracion en suero humano del receptor del factor de crecimiento epidermico y de su ligando especifico, el factor de crecimiento epidermico.
US8583380B2 (en) 2008-09-05 2013-11-12 Aueon, Inc. Methods for stratifying and annotating cancer drug treatment options
US20100261212A1 (en) * 2009-01-09 2010-10-14 Chinmay Prakash Soman Kinetics of molecular recognition mediated nanoparticle self-assembly
WO2010138362A1 (en) * 2009-05-27 2010-12-02 Vanderbilt University Combination therapy using an igf-1r specific antibody with an anti-egfr specific antibody and/or a cytotoxic agent
CN103228798B (zh) 2010-09-24 2015-12-09 斯坦福大学托管董事会 使用固定的引物直接捕获、扩增及测序靶标dna
US10445846B2 (en) 2011-04-14 2019-10-15 Elwha Llc Cost-effective resource apportionment technologies suitable for facilitating therapies
US9626650B2 (en) 2011-04-14 2017-04-18 Elwha Llc Cost-effective resource apportionment technologies suitable for facilitating therapies

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3668186D1 (de) 1985-04-01 1990-02-15 Celltech Ltd Transformierte myeloma-zell-linie und dieselbe verwendendes verfahren zur expression eines gens, das ein eukaryontisches polypeptid kodiert.
GB8601597D0 (en) * 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5401638A (en) * 1986-06-04 1995-03-28 Oncogene Science, Inc. Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
JPH03505964A (ja) 1988-04-18 1991-12-26 アプライド・バイオテクノロジー・インコーポレーテッド ｎｅｕ遺伝子の発現及び遺伝子産物の検出
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
WO1991005264A1 (en) 1989-09-29 1991-04-18 Oncogenetics Partners Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
CA2026250C (en) 1989-09-29 2007-04-10 Walter Patrick Carney Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
US5427908A (en) * 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
ATE414768T1 (de) 1991-04-10 2008-12-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
US5344760A (en) 1991-06-03 1994-09-06 Ciba Corning Diagnostics Corp. Method of cancer detection
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5516637A (en) * 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003073909A3 (en) 2005-06-02
EP1573316B1 (en) 2009-08-26
WO2003073909A2 (en) 2003-09-12
EP1573316A4 (en) 2006-05-03
AU2003212415A8 (en) 2003-09-16
EP1573316A2 (en) 2005-09-14
DE60329020D1 (de) 2009-10-08
AU2003212415A1 (en) 2003-09-16
US20030219842A1 (en) 2003-11-27
ATE441107T1 (de) 2009-09-15
US7473534B2 (en) 2009-01-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2329565T3 (es) Pruebas para monitorear pacientes con cancer, basadas en los niveles de analito de dominio extracelular (ecd) del factor receptor del crecimiento epidermico (egfr),solo o en combinacion con otros analitos,en muestras de fluidos corporales.
Cui et al. CD147 receptor is essential for TFF3-mediated signaling regulating colorectal cancer progression
US7732159B2 (en) Assays for cancer patient monitoring based on levels of analyte components of the plasminogen activator system in body fluid samples
ES2637411T3 (es) Métodos y ensayos para medir p95 Y/O p95 en una muestra y anticuerpos específicos para p95
US10365283B2 (en) Activated HER3 as a marker for predicting therapeutic efficacy
ES2535723T3 (es) Métodos de determinación de la respuesta del paciente mediante la medición de Her-3
KR101523419B1 (ko) 베바시주맙 병용 치료법을 위한 종양 조직 기본 바이오마커
US12233077B2 (en) Therapeutic treatment of breast cancer based on c-MAF status
ES3043607T3 (en) Therapeutic treatment of breast cancer based on c-maf status
US10793642B2 (en) Binding members for human c-MAF
ES2560219T3 (es) Biomarcadores del plasma sanguíneo para terapias de combinación con bevacizumab para el tratamiento del cáncer pancreático
Lai et al. Enhanced COMP catabolism detected in serum of patients with arthritis and animal disease models through a novel capture ELISA
ES2717627T3 (es) Métodos, kits, sistemas y bases de datos relacionados con enfermedades neoplásicas
JP2015502543A (ja) 乳癌治療向けベバシズマブ併用療法用血漿バイオマーカー
KR101358600B1 (ko) 가용성 인간 ｍ-ｃｓｆ 수용체 및 이의 용도
AU2020348457A1 (en) Use of DKK-1 inhibitors for treating cancer
US20100190199A1 (en) Gpr30 estrogen receptor in breast and ovarian cancers
JP2015522815A (ja) 乳癌の治療用ベバシズマブ併用療法の血漿バイオマーカー
CN101415440A (zh) 治疗肺癌的方法
ES2527926T3 (es) HER3 activado como marcador para predecir la eficacia terapéutica
AU2013203539A1 (en) Biomarkers for detection and diagnosis of head and neck squamous cell carcinoma
AU2013203603A1 (en) Activated HER3 as a marker for predicting therapeutic efficacy