ES2329697T3 - Complejos de rutenio para el tratamiento de canceres. - Google Patents
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Abstract
Composición farmacéutica que comprende, en un soporte farmacéuticamente aceptable, al menos un compuesto complejo de rutenio (II) de fórmula general (I) o (II) siguiente: ** ver fórmula** fórmula (I) o (II) en las que: L 1, L 2, L 3 y L 4, iguales o diferentes, representan bien un ligando donante de 2 electrones por átomo de nitrógeno, de oxígeno, de fósforo o de azufre, bien un átomo de halógeno, R1 representa un átomo de hidrógeno o una o varias sustituciones en el grupo fenilo elegidas entre un radical alquilo (C 1-6) y arilo (C 6-18), Y es un contraión (cuando m = 1), m es 0 ó 1, entre C y N, representada por una línea curva, existe una sucesión de átomos que forman, con los átomos de carbono, de nitrógeno y de rutenio representados en las fórmulas (I) y (II), el metalociclo, que está constituido por 5 a 8 átomos (incluyendo los átomos de carbono, de nitrógeno y de rutenio representados en las fórmulas (I) y (II)).
Description
Complejos de rutenio para el tratamiento de
cánceres.
La presente invención se refiere composiciones
farmacéuticas que comprenden compuestos de rutenio, así como a sus
usos en procedimientos para el tratamiento de patologías
proliferativas, en particular de cánceres.
La invención trata igualmente de compuestos de
rutenio novedosos, así como a su procedimiento de preparación.
Se sabe que los compuestos metálicos análogos
del platino presentan importantes actividades antitumorales. El más
conocido de ellos es el cisplatino, que se usa habitualmente para el
tratamiento clínico de numerosos cánceres. La resistencia de
algunas células cancerosas y la toxicidad intrínseca del platino son
una parte de los problemas que aparecen cuando se utiliza este
compuesto. Desde los años 70, se han intensificado las
investigaciones para encontrar moléculas susceptibles de sustituir
el cisplatino y desde hace algunos años parece que los compuestos
que contienen rutenio podrían ser una alternativa interesante a los
que contienen platino. Por tanto, algunos complejos de rutenio ya
se han descrito como una potencial alternativa en tratamientos
anticancerosos (documentos WO 9736595, WO 0056743).
Existe por tanto una necesidad de agentes
anticancerosos novedosos que puedan ser una alternativa a los que
se usan actualmente y/o que presenten menores efectos
secundarios.
La presente invención propone así compuestos de
rutenio que presentan propiedades antitumorales particularmente
interesantes. Estos compuestos son compuestos organometálicos, es
decir, que contienen al menos un enlace covalente
carbono-rutenio (C-Ru). Además, este
enlace C-Ru está estabilizado por un enlace
intramolecular nitrógeno-rutenio, siendo el
nitrógeno un elemento de la parte orgánica unida al metal mediante
el átomo de carbono, de acuerdo con el esquema siguiente:
En este tipo de disposición de los átomos, el
rutenio, por tanto, forma parte de una entidad cíclica, y este tipo
de compuestos es denominado por los químicos de la disciplina, como
la clase de los compuestos ciclometálicos. La entidad cíclica que
contiene el rutenio se denomina un metalociclo. En un metalociclo,
el metal está por tanto unido a la vez a un ligando orgánico
mediante un enlace covalente carbono-metal y un
enlace de tipo donante-aceptor
(ácido-base de Lewis, o enlace de coordinación)
nitrógeno-metal. La existencia de un metalociclo en
una molécula organometálica confiere a ésta propiedades particulares
en términos de reactividad y estabilidad termodinámica. Varios
tipos de carbonos (aromático, bencílico o alifático) pueden estar
metalizados, y la naturaleza del enlace entre el átomo donante (el
nitrógeno) y el carbono pueden modificarse de múltiples maneras.
Según un primer aspecto, la presente invención
tiene por tanto por objeto une composición farmacéutica que
comprende, en un soporte farmacéuticamente aceptable, al menos un
compuesto complejo de rutenio (II) de fórmula general (I) o (II)
siguiente:
fórmula (I) o (II) en la
que:
L_{1} L_{2}, L_{3} y L_{4}, iguales o
diferentes, representan bien un ligando donante de 2 electrones por
átomo de nitrógeno, de oxígeno, de fósforo o de azufre, o bien un
átomo de halógeno,
R1 representa un átomo de hidrógeno o una o
varias sustituciones en el grupo fenilo, seleccionadas entre un
radical alquilo(C1-6) y arilo
(C6-18),
Y es un contraión (cuando m = 1),
m es 0 ó 1,
entre C y N, representada por una línea curva,
existe una sucesión de átomos que forman, con los átomos de
carbono, nitrógeno y rutenio representados en las fórmulas (I) y
(II), el metalociclo, que está constituido por 5 a 8 átomos
(incluyendo los átomos de carbono, nitrógeno y rutenio representados
en las fórmulas (I) y(II)).
Los compuestos de la invención pueden estar en
forma de sales, solvatos y/o de profármacos farmacéuticamente
aceptables. Los profármacos son variantes de los compuestos de la
invención que se pueden transformar in vivo en compuestos de
fórmula (I) o (II) según la invención.
Según la invención, el término "alquilo"
designa un radical hidrocarburo lineal o ramificado que tenga
ventajosamente de 1 a 6 átomos de carbono, tales como metilo,
etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo,
terc-butilo, pentilo, neopentilo,
n-hexilo, etc. Se prefieren los grupos en
C_{1}-C_{4}. Los grupos alquilo pueden estar
sustituido por un grupo arilo tales como los anteriormente
definidos, en cuyo caso se habla de un grupo arilalquilo. Son
ejemplos de grupos arilalquilo particularmente bencilo y
fenetilo.
Los grupos "arilo" son sistemas de
hidrocarburos aromáticos mono, bi o tricíclicos, eventualmente
interrumpidos por al menos un heteroátomo (en particular O, S o N).
Preferentemente, los grupos arilo incluyen sistemas de
hidrocarburos aromáticos monocíclicos o bicíclicos que tengan entre
6 y 8 de átomos de carbono, aún más preferentemente 6 átomos de
carbono. Se pueden citar, por ejemplo, los grupos fenilo, naftilo y
bifenilo. Cuando están interrumpidos por heteroátomos, los grupos
arilo incluyen los ciclos piridilo, imidazoilo, pirrolilo y
furanilo. Los grupos arilo pueden eventualmente presentar uno o
varios sustituyentes, elegidos particularmente entre un átomo de
halógeno, un grupo alquilo tal como se ha definido anteriormente, un
radical alcoxi (-O-alquilo), tiol, tioéter
(-S-alquilo), hidroxilo, nitro, ciano y éster
(-CO_{2}-alquilo).
Por "halógeno", se entiende un átomo de
flúor, de cloro, de bromo o de yodo. Ventajosamente, el átomo de
halógeno es cloro.
Los ligandos donantes de dos electrones por
átomo de nitrógeno, de oxígeno, de fósforo o de azufre incluyen,
por ejemplo, H_{2}O,
di(alquil(C_{1}-_{6}))O,
di(alquil(C_{1}-_{6}))S,
di(alquil(C_{1}-_{6})S(O),
(alquil(C_{1}-_{6}))SO_{3},
di(alquil(C_{1}-_{6})C=O,
alquil(C_{1}-_{6})alquilCO_{2}-.
Otros ligandos incluyen particularmente ligandos nitrilos, como por
ejemplo los ligandos de fórmula
alquil(C_{1}-_{6})CN (en
particular CH_{3}CN) y ligandos piridina, eventualmente
sustituidos, en uno o varios átomos de carbono de los ciclos de
piridina, por un radical
alquilo(C_{1}-_{6}) o un átomo de
halógeno, tales como se ha definido más arriba.
Entre otros ligandos, se pueden particularmente
citar las aminas primarias
alquil(C_{1}-_{6}), tales como
metilamina o etilamina.
Los ligandos donantes de dos electrones por un
átomo de fósforo incluyen ligandos del tipo fosfina. Ventajosamente,
son de la fórmula
P(Ph)_{3-x}(alquilo)_{x},
con x representando 0, 1 ó 2 (preferentemente x representa 2) (Ph
representa el grupo fenilo). Entre estos ligandos, se puede citar
particularmente P(Ph)(CH_{3})_{2}.
Según una forma de realización particular, en el
caso de la fórmula (II), al menos dos de los agrupamientos L_{1},
L_{2}, L_{3} y L_{4} tomados de dos en dos, pueden estar
unidos entre sí por al menos un enlace covalente. En ese ámbito, se
pueden citar particularmente los motivos bipiridina o fenantrolina.
Eventualmente sustituidos, particularmente por al menos un radical
alquilo tal como se ha definido anteriormente. En el caso de los
ligandos donantes de dos electrones por átomo de fósforo, se puede
citar ventajosamente los ligandos bidentados de fórmula
PR'_{2}(alquilideno)PR'_{2}, representando R' un
grupo alquilo o arilo) preferentemente fenilo) e incluyendo el
grupo alquilideno agrupamientos del tipo C_{n}H_{2n}, o
(CR^{1}R^{2})_{n}, con n = 1 a 6 (preferentemente 2 ó
3) y R^{1} y R^{2}, iguales o diferentes, representan un grupo
alquilo o arilo tal como se ha definido anteriormente,
correspondiendo el grupo alquilideno al enlace covalente enlazando
entre sí al menos dos de los grupos L_{1}, L_{2}, L_{3} y
L_{4}. En ese ámbito, se puede citar particularmente el ligando
bidentado 1,2-bisdifenilfosfinoetano.
Así, de forma preferente, los compuestos de la
invención presentan al menos un agrupamiento L_{1}, L_{2},
L_{3} y L_{4} representando un ligando donante de dos electrones
por átomo de nitrógeno o de fósforo, en particular un grupo
piridina, fosfina (por ejemplo, de fórmula
P(Ph)_{3-x}(alquilo)_{x},
tal como se ha definido anteriormente), bipiridina o fenantrolina,
estando dichos grupos eventualmente sustituidos.
Según otra forma particular de la invención, en
el caso de la fórmula (II), al menos dos de los grupos L_{1},
L_{2}, L_{3} y L_{4} representan ligandos nitrilos, como por
ejemplo los ligandos de la fórmula
alquil(C_{1}-_{6})CN (en
particular CH_{3}CN).
Según otra forma particular de la invención, en
el caso de la fórmula (II), al menos dos de los grupos L_{1},
L_{2}, L_{3} y L_{4} representan ligandos nitrilos, como por
ejemplo los ligandos de la fórmula
alquil(C_{1}-_{6})CN (en
particular CH_{3}CN) y los otros dos ligandos están unidos entre
sí por al menos un enlace covalente, ventajosamente tales como los
que se han descrito anteriormente.
Y- en los compuestos según la invención es un
contraión y está únicamente presente en el compuesto cuando el
complejo de rutenio lleva una carga positiva. Y- es preferentemente
un anión poco nucleófilo, tal como por ejemplo BF_{4}^{-},
PF_{6}^{-}, CF_{3}SO_{3}^{-}, CF_{3}CO_{2}^{-},
CH_{3}CO_{2}^{-} y NO_{3}^{-}, en particular
PF_{6}^{-}.
Según una forma particular de la invención, m es
igual a 1.
La línea curva representa con los átomos de
carbono, de nitrógeno y de rutenio representados en las fórmulas
(I) y (II), el metalociclo. Este metalociclo está generalmente
constituido por 5 a 8 átomos (incluyendo los átomos de carbono, de
nitrógeno y de rutenio representados en las fórmulas (I) y (II)).
Típicamente, los átomos del metalociclo (diferentes de los
representados en las fórmulas (I) y (II)) se escogen entre los
átomos de carbono, de nitrógeno, de oxígeno o de azufre. Cada uno
de estos átomos puede independientemente del metalociclo formar
estructuras lineales o cíclicas, saturadas o no, para las que no
existen limitaciones particulares.
Así, entre las unidades estructurales que
incluyen un metalociclo de 5 ó 6 átomos (incluyendo los átomos Ru,
C y N representados en las fórmulas (I) y (II)), se pueden citar
particularmente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Entre otras estructuras que incluyen un
metalociclo de 6 ó 7 átomos, se pueden citar particularmente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
con R, igual o diferente,
representando H o un radical alquilo, preferentemente metilo, y
R_{2} y R_{3}, iguales o diferentes, representando un átomo de
hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo alquilo tal como se ha
definido anteriormente, un radical alcoxi
(-O-alquilo), tiol, tioéter
(-S-alquilo), hidroxilo, nitro, ciano y éster
(-CO_{2}-alquilo).
En el metalociclo (5), preferentemente R^{2} y
R^{3} representan ambos CO_{2}Me y/o los dos R representan un
radical metilo.
En el metalociclo (6), preferentemente R^{2}
representa H y R^{3} un radical metilo (Me) y/o los dos R
representan un radical metilo.
La presente invención se refiere igualmente a
los isómeros ópticos y geométricos, tomados individualmente o
mezclados (particularmente los racematos), de los compuestos
complejos del rutenio (II).
Ventajosamente, el átomo de nitrógeno del
metalociclo y representado en las fórmulas (I) y (II) no es un átomo
de nitrógeno incluido en una estructura de tipo benzodiacepina, en
particular, los compuestos descritos en Organometallics, vol. 21,
2002, pp 5437-5438.
Según una forma particular de la invención, los
compuestos según la invención no son los compuestos siguientes
(descritos en Organometallics, vol. 21, 2002, pp
1184-1189).
Entre los compuestos de fórmula (I) o (II), se
pueden citar particularmente los compuestos representados en la
figura 8 (compuestos numerados como 3-6 y
8-29). En particular, los compuestos numerados 9,
11, 12, 14-29 y, más particularmente, los
compuestos 9, 11 y 12.
Así, la invención tiene igualmente por objeto
los compuestos 9, 11, 12 y 14-29. Preferentemente,
los compuestos 9, 11, 12 y 28. Estos compuestos se pueden usar como
fármacos y en particular para tratar enfermedades relacionadas con
un hiperproliferación celular, en particular cánceres, tales como
los que se describen en la presente invención.
Existen diferentes vías de síntesis para obtener
los compuestos según la invención. El procedimiento de preparación
más ventajoso es el que utiliza la reacción denominada de
ciclometalación. Esta reacción se basa en las propiedades químicas
particulares de los metales a partir de los que se inicia la
reacción. Algunos metales de transición son efectivamente capaces
de activar en condiciones suaves un enlace C-H
gracias al cual sustituyen directamente el átomo de hidrógeno para
formar el compuesto ciclometalado. El paladio es efectivamente el
metal más frecuentemente usado en este tipo de reacciones. Varios
artículos en revistas científicas (A. D. Ryabov, Chem. Rev. 1990,
90, 403-424) se han dedicado a esta reacción y a las
propiedades particulares de los compuestos resultado de las mismas.
En lo que respecta a los compuestos de rutenio, se ha publicado un
procedimiento de preparación de estos compuestos en Organometallics
1999, 18, 2390-2394. Son igualmente posibles otras
vías de síntesis, particularmente cuando no se puede poner en
práctica la reacción de activación C-H directa por
el metal de transición. En este caso, el coordinado orgánico
nitrogenado se metala en el carbono mediante el mercurio(II)
y el compuesto organomercuriado así obtenido puede transmetalarse al
compuesto de rutenio (véase J. Organometal. Chem. 1995, 494,
187-193, para los compuestos de mercurio, e Inorg.
Chim. Acta 1996, 249, 63-67, para la reacción de
transmetalación).
Así, los compuestos de la presente invención se
pueden obtener a partir de las familias de compuestos A y B
descritas a continuación
\vskip1.000000\baselineskip
En estas familias de compuestos, la unidad
"metalocíclica" representa en particular y esquemáticamente
las unidades (1) a (6) anteriormente descritas.
Las vías de síntesis para obtener estas dos
familias de compuestos (A) o (B) (incluidas respectivamente en las
fórmulas (I) y (II), con S representando un grupo acetonitrilo
NCCH_{3}) son, bien la vía directa denominada de ciclometalación
por activación del enlace C-H en orto del arilo,
bien la vía de transmetalación mediante un compuesto
organomercuriado. El esquema general de la síntesis de los
compuestos A y B se resume en el diagrama siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos procedentes de las familias A y B
con los diferentes coordinados orgánicos ciclometalados pueden
modificarse sustituyendo uno o dos ligandos acetonitrilo por
respectivamente un ligando monodentado como una fosfina
P(Ph)_{3-x}(alquilo)_{x},
tal como se ha definido anteriormente, lo que ha llevado a los
productos de tipo C y D, o por un ligando bidentado como una
bipiridina o fenantrolina o adicionalmente un ligando bidentado que
contiene fósforo, como 1,2-bisdifenilfosfinoetano,
lo que ha llevado a los productos de tipo E. ^{L}
\vskip1.000000\baselineskip
Existen numerosos compuestos adicionales que
contienen idéntica unidad estructural metalocíclica. Por ejemplo,
es realmente posible trasformar los compuestos de tipo A mediante
reacción con un compuesto acetilénico (R_{2}CCR_{3}) o un
alqueno (R_{2}CH=CH_{2}, habiéndose definido anteriormente
R_{2} y R_{3}. Los compuestos así formados tiene una estructura
que recuerda la de A, pero que muestra un grupo metalocíclico que
contienen un mayor número de átomos, 7 y 6 respectivamente.
Los compuestos modificados son particularmente
los siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis de estos dos compuestos se describe
en Bull. Soc. Chim. Fr. 1997, 134, 947-954 y en
Organometallics 2003, 22, 347-354. Se pueden
aplicar reacciones idénticas a las que producen los compuestos C, D
y E a estas especies, y ampliar de esta manera el número de
compuestos que muestran propiedades anticancerosas.
Como se ha especificado anteriormente, las
composiciones según la invención son particularmente ventajosas
para tratar dolencias ligadas a una hiperproliferación celular, en
particular de los cánceres. Los cánceres incluyen aquellos con
tumores tanto sólidos como líquidos. Los cánceres representan
particularmente glioblastomas, leucemias (promielocitarias),
canceres de próstatas, de ovarios, de los pulmones, de las mamas, de
las vías digestivas, en particular del hígado, de la cabeza y el
cuello, del cólon, de la vesícula, los linfomas no de de Hodgkin y
los melanomas.
La presente invención tiene igualmente por
objeto el uso de al menos un compuesto de fórmula (I) o (II), tales
como se han definido anteriormente, en el marco de la preparación de
una composición farmacéutica destinada a tratar dolencias ligadas a
una hiperproliferación celular, en particular los cánceres.
Los compuestos según la invención muestran un
efecto antiproliferativo respecto a las células tumorales. Son
particularmente útiles para tratar los cánceres por acumulación de
células tumorales en la fase G0/G1 y eventualmente por inducción de
apoptosis en las células tumorales.
En efecto, sin desear quedar ligado a teoría
alguna sobre la invención, los compuestos según la invención
parecen particularmente capaces de acumular las células tumorales en
la fase G0/G1, y por tanto de bloquear su ciclo celular, pero
igualmente parecen capaces de generar sus apoptosis rápidamente, en
particular cuando aumenta su concentración, signo de una toxicidad
dependiente de la dosis.
Además, los compuestos según la invención son
particularmente ventajosos para tratar los tumores resistentes al
cisplatino o a otros fármacos anticancerosos.
Los compuestos o composiciones según la
invención pueden administrarse de diferentes maneras y en formas
diferentes. Así, pueden administrarse de manera sistémica, por vía
oral, por inhalación o por inyección, como por ejemplo por vía
intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica, intraarterial,
etc., siendo preferidas las vías intravenosa, intramuscular,
subcutánea, oral y por inhalación. Para las inyecciones, los
compuestos se acondicionan en general en forma de suspensiones
líquidas, que se pueden inyectar mediante jeringuillas o de
perfusiones, por ejemplo. A este respecto, los compuestos se
disuelven generalmente en soluciones salinas, fisiológicas,
isotónicas, tamponadas, etc., compatibles con un uso farmacéutico y
conocidas de la persona experta en la técnica. Así, las
composiciones pueden contener uno o varios agentes o vehículos
elegidos entre dispersantes, solubilizantes, estabilizantes,
conservantes, etc. Agentes o vehículos que se pueden usar en las
formulaciones líquidas y/o inyectables son particularmente
metilcelulosa, hidroximetilcelulosa, carboximetilcelulosa,
polisorbato 80, manitol, gelatina, lactosa, aceites vegetales,
arábiga, etc.
Los compuestos pueden igualmente administrarse
en forma de geles, aceites, comprimidos, supositorios, polvos,
píldoras, cápsulas, aerosoles, etc., eventualmente mediante
formulaciones o dispositivos que aseguren una liberación prolongada
y/o retardada. Para este tipo de formulación, se usa ventajosamente
un agente tal como la celulosa, los carbonatos o los almidones.
Se entiende que la persona experta en la técnica
puede adaptar el caudal y/o la dosis inyectada en función del
paciente, de la patología implicada, de la forma de administración,
etc. Típicamente, los compuestos se administran a dosis que pueden
variar entre 0,1 \mug y 100 mg/kg de peso corporal, más
generalmente entre 0,01 y 10 mg/kg, típicamente entre 0,1 y 10
mg/kg. Además, se pueden realizar inyecciones repetidas, si es el
caso. Por otra parte, en tratamientos crónicos, los sistemas de
retardo o prolongado pueden ser ventajosos.
La invención se refiere, igualmente a un
procedimiento de tratamiento de una patología relacionada con una
hiperproliferación celular, en particular un cáncer, mediante la
administración a un sujeto afectado por dicha patología de una
cantidad eficaz de uno de los componentes según la invención.
En el contexto de la invención, el término
"tratamiento" designa el tratamiento preventivo, curativo,
paliativo así como la toma en consideración de los pacientes
(reducción del sufrimiento, mejora de la duración de la vida,
ralentización de la progresión de la dolencia, reducción del
crecimiento tumoral, etc.). El tratamiento además puede realizarse
en combinación con otros agentes o tratamientos químicos o físicos
(quimioterapia, radioterapia, terapia genérica, etc.). Los
tratamientos y medicamentos de la invención están particularmente
destinados a los seres humanos.
Así, los compuestos según la invención se pueden
usar de manera ventajosa en combinación con un tratamiento
anticanceroso que emplee radiaciones, tales como la radioterapia y
la braquiterapia. Las radiaciones empleadas son en particular los
rayos X, los rayos gamma, partículas ionizantes tales como los
electrones, los neutrones o los iones carbono.
Según otro aspecto de la invención, los
compuestos según la invención se pueden usar con otros agentes
químicos o tratamientos anticancerosos, tales como los siguientes
agentes químico terapéuticos: el cisplatino, el carboplatino, el
NCS (Neocarcinostatina), el taxotero o el taxol, ventajosamente NCS
o taxol. Los compuestos según la invención están preferentemente
acondicionados y se administran de manera combinada, separada o
secuencial con respecto a otros agentes o tratamientos
terapéuticos.
La invención se refiere también a un
procedimiento para inhibir in vivo, in vitro o ex
vivo la proliferación de células tumorales que comprende poner
en contacto dichas células tumorales con uno de los productos según
la invención. Las células tumorales pueden particularmente proceder
de las patologías especificadas anteriormente.
En las figuras y ejemplos que siguen, los
términos "CDR" o de manera equivalente "RDC" significan
"compuesto derivado del rutenio".
Figura 1: Las células A172 se cultivaron en
placas de 96 pocillos en medio DMEM con suero de ternera al 10%. A
una confluencia del 30%, las células se trataron, durante 48 h con
el cisplatino o los diferentes compuestos derivados del rutenio en
las concentraciones indicadas (1, 5, 15, 50 \muM). La cantidad de
células actualmente en los pocillos se evaluaron con un ensayo MTT
(MTT, Sigma) en el que los productos de la reacción se cuantifican
mediante un lector de placas Elisa (Metertech, EEUU)
(490-650 nm). Los resultados obtenidos se han
referido a los valores del estado control (viabilidad del 100%).
Los gráficos son un promedio de 8 puntos con las desviaciones
estándar en un experimento representativo de cada 4 realizados. La
línea negra gruesa indica la DC50 para cada gráfico. ^{L}
Tabla 2: resumen de los resultados obtenidos
para las diferentes líneas celulares y los cultivos primarios de
glías. Los experimentos se realizaron en las mismas condiciones que
las descritas para las células A172. Cada DC50 es un valor
indicativo obtenido en 4 experimentos independientes.
Figura 2: A- Las células A172 se cultivaron
sobre láminas de vidrio. A una confluencia del 50%, las células se
trataron durante 24 h con cisplatino, CDR2 (25 \muM) o CDR6 (15
\muM). Las células se fijaron a continuación con paraformaldehído
al 4%, se permeabilizaron can NP40 al 0,1% y se marcaron con el
colorante Hoechst (en azul) y el anticuerpo
anti-p20 (fragmento activo de la caspasa 3, en
rojo). Las células a continuación se observaron al microscopio de
fluorescencia. B- Representación gráfica del número de células con
un núcleo apoptótico, fragmentado o condensado. Las barras son una
medida de dos láminas de un experimento representativo de 3
realizados. C- En paralelo, se prepararon extractos proteicos
procedentes de células tratadas con diferentes fármacos (cisplatino
15 \muM; CDR2 25 \muM; CDR6 15 \muM; CDR9 \muM) y tras la
desnaturalización los extractos se depositaron sobre un gel
SDS-Page al 10%. Tras la migración, las proteínas se
transfirieron sobre nitrocelulosa (Biorad, 0,2 \mum) y el
fragmento p20 de la caspasa 3 se detectó mediante transferencia
Western con un anticuerpo anti-p20 (1/1000, R&D
System).
Figura 3: Detección de p53 y p73 en las células
A172 tratadas con los CDR. Las células A172 se trataron en las
concentraciones indicadas (2, 5 ó 10 \muM) con los diferentes
compuestos y las duraciones indicadas (24 h o 6 h). Las proteínas
se extrajeron con un tampón de lisis y se separaron sobre gel
SDS-Page al 10%. Después de la transferencia a
nitrocelulosa, las proteínas p53 y p73 se detectaron mediante
transferencia Western mediante los anticuerpos
anti-p53 (pAb1801) y anti-p73
(1/200, Ab2, Oncogene).
Figura 4: Detección de p21 y Bax en las células
A172 tratadas con los CDR. Las células A172 se trataron con los
diferentes compuestos (10 PM) durante 24 h. Las proteínas se
extrajeron con un tampón de lisis y se separaron sobre gel
SDS-Page al 10%. Después de la transferencia a
nitrocelulosa, las proteínas p21 y Bax se detectaron mediante
transferencia Western mediante los anticuerpos
anti-p21 (1/200, Oncogene) y
anti-Bax (1/2000, Santacruz).
Figura 5: Detección de p53, p21 y de la
fosforilación de la histona H3 en las células HCT116 tratadas con
los CDR. Las células HCT116 se trataron con los diferentes
compuestos (10 PM) y las duraciones indicadas (24 h ó 6 h). Las
proteínas se extrajeron con un tampón de lisis y se separaron sobre
gel SDS-Page al 10%. Después de la transferencia a
nitrocelulosa, las proteínas p53, p21 e histona H3 se detectaron
mediante transferencia Western mediante los anticuerpos
anti-p53 (pAb1801), anti-p21 (1/200,
Oncogene) y anti-fosfoserina 10 de la histona H3
(1/2000, Santacruz).
Figura 6: Las células 2008/CMV y 2008/ATP7B
(donación del Dr. Howell) se cultivaron en placas de 96 pocillos en
medio DMEM con suero de ternera al 10%. A una confluencia del 30%,
las células se trataron durante 48 h con el cisplatino o con los
diferentes compuestos derivados del rutenio en las concentraciones
indicadas (1, 5, 15, 50 \muM). La cantidad de células actualmente
en los pocillos fue evaluada con un ensayo MTT (MTT, Sigma). Los
resultados obtenidos se refirieron a los valores del estado control
(viabilidad del 100%). Los gráficos son un promedio de 8 puntos con
las desviaciones típicas para un experimento representativo de cada
tres realizados. La línea negra gruesa indica la DC50 para cada
gráfico.
Figura 7: Las células A172 se cultivaron en
placas de 96 pocillos en medio DMEM con suero de ternera al 10%. A
una confluencia del 30%, las células se trataron durante 48 h con el
cisplatino, CDR6, NCS (Neocarzinostatin), Taxol o una combinación
de estos fármacos en las concentraciones indicadas. La cantidad de
células actualmente en los pocillos fue evaluada con un ensayo MTT
(MTT, Sigma), cuyos productos de la reacción se cuantificaron
mediante un lector de placa plaque Elisa (Metertech, EEUU)
(490-650 nm). Los resultados obtenidos se refirieron
a los valores del estado control (viabilidad del 100%). Los
gráficos son un promedio de 8 puntos con las desviaciones típicas
para un experimento representativo de cada 4 realizados. La línea
negra gruesa indica la DC50 para cada gráfico.
Figura 8: Ejemplos de los compuestos de fórmula
(I) o (II), con excepción de los compuestos numerados 1 y 2 que se
muestran como referencia.
Figura 9: Efecto de una irradiación (4 Gy), de
un tratamiento mediante RDC-11
(RDC-11/NI) y de la asociación "irradiación +
RDC-11". (RDC-11/4 Gy) sobre la
proliferación de las células RDM4 en cultivo.
Figura 10: Porcentaje de apoptosis en células
RDM4 inducida mediante RDC-11
(RDC-11), por irradiación con neutrones rápidos (4
Gy), o por la combinación de ambos tratamientos (4 Gy +
RDC-11), tres días tras el inicio del tratamiento.
El análisis fue realizado mediante citometría de flujo, tras marcado
de las células con yoduro de propidio.
Figura 11: Porcentaje de viabilidad de las
células HCT-116 en presencia de
RDC-11, RDC-24 y
RDC-23 o de Cisplatino a diferentes
concentraciones.
Figura 12: Volumen medio (mm^{3}) de los
tumores aparentes de células U-87 (glioblastoma
humano) injertadas en ratones atímicos SWISS nu/nu en función del
tiempo (días) tras el inicio del tratamiento con
RDC-11 o el DPBS (control).
Figura 13: Evolución de los pesos medios de
ratones SWISS injertados con las células U-87
(glioblastoma humano) en función del tiempo (días) tras el inicio
del tratamiento con RDC-11 o el DPBS (control).
Figura 14: Peso de los tumores (tras disección)
de ratones SWISS injertados con las células U-87
(glioblastoma humano) tras un tratamiento con
RDC-11 o el D-PBS (control).
Otros aspectos y ventajas de la presente
solicitud aparecerán con la lectura de los ejemplos siguientes, que
se deben considerar como ilustrativos y no como limitantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos ciclometalados del
rutenio(II) son sensibles al oxígeno del aire y a los ácidos.
En consecuencia, todos los disolventes deben estar perfectamente
secos y desoxigenados antes de su uso. La experimentación se
realiza en atmósfera controlada (nitrógeno o argón) usando la
técnica de los tubos Schlenk.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis del compuesto 5 (según
Organometallics, 1999, 18, 2390)
Se añadió N,N dimetilaminometilbenceno (0,120
ml, 0,8 mmol), NaOH (0,031 g, 0,8 mmol) y KPF_{6} (0,292 g, 1,6
mmol) a una suspensión de
[(\eta^{6}-C_{6}H_{6})RuCl_{2}]_{2}
(0,2 g, 0,4 mmol) en acetonitrilo (5 ml) a 20ºC durante 3 días. La
solución amarilla así obtenida se filtró (cromatografió) a
continuación sobre alúmina normalizada (12x3 cm) con acetonitrilo
como eluyente. Se recoge la fracción amarilla, se secó a vacío. El
residuo obtenido se redisolvió en un mínimo de acetonitrilo (2 ml).
La adición de éter etílico a esta disolución provocó la
cristalización de un producto amarillo vivo que es el compuesto
esperado (rendimiento 0,32 g, 80%).
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis del compuesto 6
[Ru
(\eta^{6}-C_{6}H_{6})-2-(CH_{2}NMe_{2})-C_{6}H_{4}-(PMe_{2}Ph)]PF_{6}:
se añadió PMe_{2}Ph (0,019 ml, 0,162 mmol) a una disolución
amarilla del complejo 5 (0,08 g, 0,156 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (10
ml) y la solución resultante se agitó a temperatura ambiente
durante 3 horas. El disolvente se evaporó a vacío y el residuo
resultante se disolvió en un mínimo de CH_{2}Cl_{2} (1 ml). La
adición de n-hexano provocó la precipitación del
complejo 6 (rendimiento: 0,09 g, 95%). Análisis elemental: calculado
para C_{23}H_{23}NF_{6}P_{2}Ru^{+}1/2 CH_{2}Cl_{2}:
C, 44,13; H, 4,69; N, 2,19. Encontrado: C, 44,30, H, 4,59; N,
2,16.
RMN ^{1}H (CD_{3}CN): 7,75 (dt, 1H, H6,
^{3}J=7,5), 7,39 (tdd, 1H, p, ^{3}J=7,5, ^{4}J=1,7),
7,22 (td, 2H, m, ^{3}J=8,0, ^{4}J=2,0), 7,08 (tdd, 1 H,
H4 o H5, ^{3}J=7,1), 7,00-6,88 (m, 3H, o/y H4 o
H5), 6,72 (d, 1H, H3, ^{3}J=7,5), 5,74 (d, 6H, C6H6,
^{3}J_{HP}=1,1), 2,85 y 2,43 ((AB, 2H, 2J=14,5), 2,77 (d, 3H,
NMe, ^{4}J_{HP}=1,1), 2,66 (s, 3H, NMe), 1,99 (d, 3H, PMe,
2J=9,3), 1,50 (d, 3H, PMe, 2J=9,7).^{L}
RMN ^{31}P (CD_{3}CN): 6,37 (s, 1P,
PMe_{2}), -142,97 (sept, 1P, PF_{6}, ^{1}J=711).
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis del compuesto 8 (según
Organometallics, 1999, 18, 2390)
Se añadieron 2-fenilpiridina
(6,02 mmol), NaOH (0,48 g, 6,02 mmol) y KPF_{6} (2,22 g, 12,04
mmol) a una suspensión de
[(\eta6-C_{6}H_{6})RuCl_{2}]_{2}
(1,5 g, 3,01 mmol) en acetonitrilo (50 ml) a 45ºC durante 20 h. A
continuación el disolvente se evaporó a vació y el residuo obtenido
se cromatografió en una columna de alúmina normalizada con
acetonitrilo como eluyente. La banda amarilla se recogió y secó a
vacío. Este residuo se disolvió en una mezcla de acetonitrilo y
diclorometano (1:1); la difusión lenta de éter etílico permitió la
obtención del compuesto 8 en forma de cristales amarillo vivo
(rendimiento 68%).
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis del compuesto 9
[Ru(C_{6}H_{4}-2-C_{5}H_{4}N)(PMe_{2}Ph)(NCMe)_{3}]PF_{6}
9: se añadió PMe_{2}Ph (0,031 ml, 0,22 mmol) a una disolución
amarilla del complejo 8 (0,124 g, 0,22 mmol) en CH_{3}CN (5 ml) y
la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 18
horas. La solución amarillo-verdosa se filtró sobre
alúmina con acetonitrilo como eluyente. La fracción amarilla se
recogió y concentró a vacío. El polvo obtenido se disolvió en un
mínimo de acetonitrilo y éter etílico. (1:1). La adición de
n-hexano provocó la precipitación del compuesto 9
en forma de un polvo amarillo. (rendimiento: 0,122 g, 84%). Análisis
elemental: calculado para C_{25}H_{28}N_{4}F_{6}P_{2}Ru:
C, 45,39, H, 4,27, N, 8,47. encontrado: C, 45,35, H, 4,49, N,
8,33.
RMN ^{1}H(CD_{3}CN): 8,39 (ddd, 1H,
H12, ^{3}J=5,8, ^{4}J=1,6, ^{5}J=0,8), 8,08 (dddd, 1H, H6,
^{3}J=7,1, ^{4}J_{HP}=4,7, ^{4}J=1,3, ^{5}J=0,5), 7,89
(d, 1 H, H9, ^{3}J=8,1), 7,80 (d, 1 H, H3, ^{3}J=7,8),
7,71-7,63 (m, 3H, H10 y o),
7,53-7,49 (m, 2H, m), 7,44 (t, 1H, p,
^{3}J=7,4), 7,20 (td, 1H, H5, ^{3}J=7,3, ^{4}J=1,4), 7,06
(td, 1H, H4, ^{3}J=7,5, ^{4}J=1,4), 6,92 (ddd, 1H, H11,
^{3}J=7,3, ^{3}J=5,8, ^{4}J=1,5), 2,33 (d, 3H, NCMe,
^{5}J_{HP}=1,7), 1,97 (d, 3H, NCMe, ^{5}J_{HP}=1,8), 1,86
(d, 6H, PMe_{2}, ^{2}J_{HP}=5,8). ^{L}
\newpage
RMN ^{13}C{^{1}H} (CD_{3}CN): 185,5 (C1),
170,2 (C8), 156,6 (C12), 147,1 (C2), 138,0 (C6), 137,5 (C10), 131,0
(Co), 129,7 (Cm), 129,3 y 129,2 (C5 y Cp), 124,4 (C4 y
Cipso), 123,6 (NCMe), 122,9 (C4), 122,3 (C11), 119,4 (C9),
13,55 y 13,41 (PMe_{2}), 4,31 y 3,99 (NCMe).^{L}
RMN ^{31}P(CD_{3}CN): -7,08 (s, 1P,
PMe_{2}), -144,40 (sept, 1P, PF6, ^{1}J=704,6).
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis del compuesto 11
[Ru(C_{6}H_{4}-2-C_{5}H_{4}N)(phen)(NCMe)_{2}]PF_{6}
11: se añadió fenantrolina (0,032 g, 0,178 mmol) al compuesto 8
(0,1 g, 0,178 mmol) disuelto en CH_{2}Cl_{2} (13 ml). La
solución se agitó a temp. ambiente durante 2 días, se siguió la
evolución de la reacción mediante RMN de protón. A continuación el
disolvente se evaporó a vacío y el residuo se disolvió en el mínimo
de acetonitrilo/CH_{2}Cl_{2} (1:1) y de n-hexano
(20 ml) y esta solución se dejó reposar durante 3 días. El producto
11 se obtuvo en forma de cristales marrón oscuro (rendimiento:
0,099 g, 84%). Análisis elemental: calculado para
C_{27}H_{22}N_{5}F_{6}PRu: C, 48,95, H, 3,35, N, 10,57.
encontrado: C, 48,00, H, 3,58, N, 10,60.
RMN ^{1}H (CD_{3}CN): 9,72 (dd, 1H, H14,
^{3}J=5,0, ^{4}J=1,5), 8,72 (dd, 1 H, H16, ^{3}J=8,2,
^{4}J=1,4), 8,30 (dd, 1H, H23, ^{3}J=7,4, ^{4}J=1,3), 8,22
(m, 1H, H18), 8,20-8,17 (m, 2H, H15 y H11), 8,15
(dd, 1H, H12, ^{3}J=5,3, ^{4}J=1,4), 8,03 (d, 1H, H19,
^{3}J=8,9), 7,88 (dd, 1H, H9, ^{3}J=7,8, ^{4}J=1,2), 7,84 (d,
1 H, H6, ^{3}J=8,1), 7,48 (ddd, 1H, H5, ^{3}J=8,1, ^{3}J=7,4,
^{4}J=1,6), 7,37 (dd, 1 H, H10, ^{3}J=8,1, ^{3}J=5,4), 7,34
(ddd, 1H, H3, ^{3}J=5,7, ^{4}J=1,6, ^{5}J=0,8), 7,30 (dd, 1H,
H21, ^{3}J=7,3, ^{4}J=1,3), 7,11 (dd, 1H, H22, ^{3}J=7,7,
^{3}J=7,2), 6,58 (ddd, 1H, H4, ^{3}J=7,3, ^{3}J=5,8,
^{4}J=1,5), 2,29 (s, 3H, NCMe), 2,07 (s, 3H, NCMe).
RMN ^{13}C{1H} (CD_{3}CN): 192,6 (C1), 169,5
(C8), 156,1 (C15), 152,0 (C3), 151,5 (C14), 150,7 (C2), 147,4 y
146,8 ( C26 y C25), 139,0 (C23), 136,5 (C16), 136,4 (C5), 135 (C18),
131,3 y 131,1 (C20 y C17), 129,2 (C21), 128,4 (C12), 128,3 (C19),
126,8 (C11), 125,1 (C10), 124,7 (C9), 125,5 y 122,7 (NCMe), 121,9
(C4), 121,5 (C22), 118,8 (C6), 4,40 y 4,01 (NCMe).
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis del compuesto 12
[Ru(C_{6}H_{4}-2-C_{5}H_{4}N)(4,4'-dimetil-2,2'-bipiridina)(NCMe)_{2}]PF_{6}
12: se añadió
4,4'-diMe-2,2'-bipiridina
(0,032 g, 0,181 mmol) al compuesto 8 (0,102 g, 0,181 mmol) disuelto
en CH_{2}Cl_{2} (13 ml). La solución se agitó a temperatura
ambiente durante 2 días, se siguió la evolución de la reacción
mediante RMN de protón. A continuación el disolvente se evaporó a
vacío y el residuo se disolvió en el mínimo de
acetonitrilo/Et_{2}O (1:1) y de n-hexano (30 ml)
y esta solución se dejó reposar durante 3 días. El producto 11 se
obtuvo en forma de cristales marrón oscuro Anal. Calcd. para
C_{27}H_{26}N_{5}F_{6}PRu C, 48,65, H, 3,93, N, 10,51.
encontrado: C, 48,83, H, 4,32, N, 10,30.
RMN ^{1}H(CD_{3}CN): 9,18 (d, 1H,
H14, ^{3}J=5,5), 8,30 (s, 1 H, H16), 8,21 (ddd, 1 H, H6,
^{3}J=7,4, ^{4}J=1,3, ^{5}J=0,5), 8,09 (s, 1H, H17),
7,85-7,81 (m, 2H, H9 y H12),
7,68-7,66 (m, 2H, H15 y H19), 7,52 (ddd, 1H, H10,
^{3}J=8,2, ^{3}J=7,4, ^{4}J=1,6), 7,44 (ddd, 1H, H3,
^{3}J=5,7, ^{4}J=1,6, ^{5}J=0,8), 7,24 (td, 1 H, H11,
^{3}J=7,3, ^{4}J=1,3), 7,05 (ddd, 1H, H5, ^{3}J=7,7,
^{3}J=7,2, ^{4}J=1,3), 6,85 (dd, 1H, H18, ^{3}J=5,9,
^{4}J=1,8), 6,73 (ddd, 1H, H4, ^{3}J=7,3, ^{3}J=5,7,
^{4}J=1,5), 2,64 y 2,34 (2s, 6H, CH3), 2,21 y 2,19 (2s, 6H,
NCMe).
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis del compuesto 13
[Ru-2-(CH_{2}NMe_{2})-C_{6}H_{4}-(bipi)(NCMe)_{2}]PF_{6}
Se añadió un equivalente de
2,2'-bipiridina a una solución de 5 (0,1 g) en 15 ml
de acetonitrilo. La mezcla se agitó durante 24 h. La solución
púrpura obtenida se evaporó a vacío y el residuo se cromatografió en
una columna de alúmina con acetonitrilo como eluyente. La banda
púrpura oscura se recogió y se evaporó a vacío. El compuesto 13 se
obtuvo en forma de cristales púrpura oscuro haciendo difundir éter
etílico en una solución de 13 disuelto en el mínimo de
diclorometano/acetonitrilo (1:1) (rendimiento: 53%). Análisis
elemental: calculado para C_{29}H_{38}N_{5}F_{6}PRu: C,
49,57, H, 5,45, N, 9,97. encontrado: C, 49,21, H, 5,60, N, 9,62.
RMN ^{1}H (CD_{3}CN): 9,52 (dd, 1H,
^{3}J 6,0, 4J 1,6, H2''), 8,69 (dd, 1H,
^{3}J 5,5, ^{4}J 1,1, H2'), 8,65 (d, 1H,
^{3}J 8,2, H''), 8,53 (d, 1 H, ^{3}J 7,7, H5'),
8,17 (td, 1H, ^{3}J 7,7, ^{4}J 1,1, H4''), 7,92
(td, 1H, ^{3}J 8,2, ^{4}J 1,6, H4'), 7,86 - 7,80
(m, 2H, H3'' + H5), 7,36 (ddd, 1H, ^{3}J 7,1, 3J
6,0, ^{4}J 1,6, H3'), 7,08 (td, 1 H, ^{3}J 7,1,
^{4}J 1,1, H4), 7,00 (d, 1H, ^{3}J 7,2, H2), 6,85
(td, 1 H, ^{3}J 7,1, ^{4}J 1,1, H3), 3,88 (d, 1
H, ^{2}J 13,8, CH_{2}), 3,30 (d, 1H, ^{2}J 13,8,
CH^{2}), 2,45 (s, 3H, NCMe), 2,18 (s, 3H, NMe2), 2,07 (s, 3H,
NCMe), 1,36 (s, 3H, NMe_{2}).
RMN ^{13}C (CD_{3}CN): 168,46, 159,49,
155,80, 153,17 (C2'), 150,65 (C2''), 148,03, 137,61 (C5), 135,96
(C4''), 134,96 (C4'), 126,52 (C3''), 125,43 (C3'), 125,28 (C4),
122,82 (C5'), 122,60 (C5''), 120,76 (C2), 120,27 (C3), 118,03,
73,02 (CH2), 52,00 (NMe2), 50,46 (NMe2), 4,00 (NCMe), 3,16
(NCMe).
\newpage
Síntesis de los compuestos 14 a 25
Los compuestos 14 a 25 se han obtenido mediante
un procedimiento análogo al usado en la síntesis de 13. En un
primer momento, los compuestos análogos al compuesto 5 se han
obtenido usando en lugar del N,N dimetilaminometilbenceno el
ligando sustituido correspondiente. En un segundo momento, estos
compuestos se trataron con 2,2'-bipiridina como en
el ejemplo anterior, los rendimientos son análogos a los obtenidos
para 13.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis del compuesto 26
Se sintetizó inicialmente el compuesto
[(\eta_{6}-C_{6}H_{6})Ru(C_{6}H_{4}-2-CHCH_{3}NMe_{2})(NCMe)]PF_{6}
por un procedimiento análogo al usado para sintetizar el compuesto
5. En este protocolo, se sustituye N,N dimetilaminometilbenceno por
l (R) (1,1-feniltildimetilamina) (0,8 mmol) y se
opera exactamente igual que para la síntesis de 5, siendo los
rendimientos iguales. Se añadió a continuación
2,2'-bipiridina (0,030 g, 0,19 mmol) a una solución
de
[(\eta_{6}-C_{6}H_{6})Ru(C_{6}H_{4}-2-CHCH_{3}NMe_{2})(NCMe)]PF_{6}
en 15 ml de acetonitrilo. La solución púrpura resultante se agitó
durante 12 h. A continuación el disolvente se evaporó a vacío y el
compuesto 26 se purificó por el uso de una cromatografía sobre
alúmina, siendo el eluyente diclorometano. Se recogió la banda
púrpura que se evaporó a vacío. La difusión lenta de dietil éter en
una solución del residuo obtenido tras esta última operación en
CH_{2}Cl_{2}:MeCN (1:1) permitió la obtención de 26 en forma de
cristales púrpuras con un rendimiento de 53% (0,064
g)^{L}.
RMN ^{1}H (CD_{3}CN) d: 9,33 (ddd, 1H, H6'
^{3}J= 5,3, ^{4}J= 1,5, ^{5}J=0,7), 8,44 (d, 1 H, H3'
^{3}J= 8,2), 8,31 (d, 1 H, H6'' ^{3}J= 7,9), 8,18 (ddd, 1H, H6
^{3}J= 5,6, ^{4}J= 1,5, ^{5}J=0,6), 8,08 (ddd, 1H, H4'
^{3}J=9,15, ^{3}J=7,6, ^{4}J=1,5), 7,79 (m, 2H, H5'' y H4),
7,73 (ddd, 1H, H5' ^{3}J= 7,5, ^{3}J= 5,2, ^{4}J= 1,1), 7,17
(ddd, 1 H, H5 ^{3}J= 7,3, ^{4}J= 1,4), 7,07 (m, 1 H, H4''), 6,92
(m, 2H, H3 y H3''), 3,40 (q, 1H, CH ^{3}J= 6,6), 2,41 (s, 3H,
CH_{3}CN), 2,04 (s, 3H, NCH_{3}), 1,96 (s, 3H, CH_{3}CN),
1,49 (s, 3H, NCH_{3}), 1,18 (d, 3H, CH_{3}
^{3}J=6,7).^{L}
Anal. Calc. para
C_{24}H_{28}N_{5}F_{6}PRu: C, 45,57, H, 4,46, N, 11,07.
Encontrado: C, 45,59, H, 4,51, N, 10,93.
El compuesto 27 se obtuvo de la misma forma
sustituyendo la (R) (1,1-feniltildimetilamina) por
la (S) (1,1-feniletildimetilamina).
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis del compuesto 28
Se añadió
1,2-bis-difenilfosfinoetano
((P(C_{6}H_{5})_{2}CH_{2}CH_{2}P(C_{6}H_{5})_{2})
(0,141 g, 0,35 mmol) a una solución del compuesto 8 (0,2 g, 0,35
mmol) en metanol (30 ml). Esta solución amarilla se agitó y calentó
a reflujo en metanol durante 19 h. A continuación el metanol se
evaporó a vacío y el compuesto 28 se purificó por cromatografía en
alúmina, siendo el eluyente CH_{2}Cl_{2}. La fracción amarilla
se recogió, se concentró a vacío, provocando la adición de dietil
éter la precipitación del producto esperado, que a continuación se
lavó tres veces con éter etílico (rendimiento 46%, 0,143 g).
RMN ^{1}H (CD_{3}CN) \delta: 8,94 (m, 1H,
H6), 8,07 (d, 1H, H12 ^{3}J= 8,2), 7,95-7,84 (m,
3H, H9, H3 y H10), 7,64-7,36 (m, 20H, PPh_{2}),
7,07-7,01 (m, 2H, H5 y H4), 6,88 (ddd, 1H,
^{3}J=7,3, H11 ^{3}J= 6,0, ^{4}J= 1,3), 2,69 (m, 4H, CH2),
1,50 (d, 6H, 5JH-P= 1,1 Hz, CH_{3}CN).
RMN ^{31}P (CD_{3}CN) \delta: 68,41 (s,
PPh_{2}), 43,64 (s, PPh_{2}), -143,3 (sept, PF_{6}).
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis del compuesto 29
Se añadió trifenilfosfina (0,186 g, 0,71 mmol) a
una solución del compuesto 8 (0,2 g, 0,35 mmol) en metanol (30 ml
Esta solución amarilla se agitó y calentó a reflujo en metanol
durante 72 h. A continuación el metanol se evaporó a vacío y el
compuesto 29 se purificó por cromatografía en alúmina, siendo el
eluyente CH_{2}Cl_{2}. La fracción amarilla se recogió y se
secó a vacío. El sólido resultante se disolvió en una mezcla de
CH_{2}Cl_{2}:MeCN (1:1) al que la adición de dietil éter
produjo la cristalización de 29 (rendimiento 37%, 0,131
g).^{L}
RMN ^{1}H (CD_{3}CN) \delta: 7,95 (dd, 1H,
H6 ^{3}J= 5,9, ^{4}J= 0,7), 7,52 (m, 1H, H12),
7,4-7,0 (m, 33H, o, m, p PPh_{3}, H10, H9
y H3), 6,75 (ddd, 1H, H5 o H4 ^{3}J=8,2, ^{3}J= 7,9), 6,67 (ddd,
1 H, H4 o H5 ^{3}J= 8,1, ^{4}J= 1,5), 6,47 (ddd, 1H, H11
^{3}J= 8,1), 2,14 (s, 3H, CH_{3}CN), 1,96 (s, 3H,
CH_{3}CN).
RMN ^{31}P (CD_{3}CN) \delta: 35,3 (s,
PPh_{3}), -143,4 (sept, PF_{6}).^{L}
Anal. Calc. para
C_{51}H_{44}N_{3}F_{6}P_{3}Ru: C, 60,83, H, 4,40, N, 4,17.
Encontrado: C, 61,15, H, 4,54, N, 4,46.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos se ensayaron en diferentes líneas
celulares. Las células usadas fueron células RDM4 procedentes de un
linfoma T de murino, así como una línea MOLT-4,
procedente de una leucemia linfoblástica aguda. Ambas líneas
cancerosas expresan la proteína p53, a diferencia de las células
HL-60 procedentes de una leucemia promielocitaria
humana en la que, tras una delección de su gen, la proteína p53 está
ausente.
La influencia de la proteína p53 sobre los
efectos inducidos por los productos se determinó usando la línea
linfoblastoide humana TK6 (p53 de tipo natural) y su variante NH32
cuyo gen p53 ha sido completamente inactivado mediante doble
recombinación homóloga (Chuang y col., 1999). Las células TK6
proceden de la American Tissue Culture Collection (ATGC, Manassas,
VA, EEUU). Las células NH32 fueron proporcionadas por H. L. Liber
(Chuang y col., 1999).
Todas estas células se cultivaron en RPMI
1640-Glutamax, suplementado con suero fetal de
ternera al 10% inactivado por calor a 56ºC durante 30 minutos,
piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales 1 mM y 50
\mug/ml de gentamicina (Life Technologies, Cergy Pontoise,
Francia). Los cultivos se mantuvieron en una incubadora a 37ºC en
una atmósfera saturada de humedad y con un 5% de CO^{2}.
La concentración y la viabilidad de las células
se determinaron por el ensayo de exclusión al Azul de Tripano
(Sigma-Aldrich, Francia) y la densidad celular se
mantuvo a una concentración inferior a 10^{6} células/ml.
Este ensayo utiliza el reactivo UptiBlue
(Interchim, Montluçon, Francia), metabolizado por las células vivas.
Las células se incubaron en placas de 96 pocillos a 10^{4}
células/pocillo (200 \mul) con el producto y se cultivaron
durante 72 horas. A continuación se añadieron 20 \mul de UptiBlue
a cada pocillo. Tras 3 horas de incubación, se midió la
fluorescencia de las muestras contenidas en las placas a 590 nm
(excitación a 560 nm), mediante un lector de microplacas Fluorolite
1000 (Dynex technologies,
Issy-Les-Moulineaux, Francia).
Los resultados se recogen en la tabla 1
siguiente:
El compuesto 9 en otras líneas celulares produjo
las CI50 siguientes: 9 (NH32): 3; 9 (Molt-4): 3,8;
9
(WTK1): 3; 9 (U-937): 3.
RDM4: linfoma, ratón AKR
TK6: línea linfoblastoide humana
NH32: variante de TK6, que no expresa p53
("p53 knockout")
WTK1: otra variante de TK6, que expresa un gen
p53 mutado
MOLT-4: leucemia linfoblástica T
humana
U-937: leucemia promonocitaria
humana
\vskip1.000000\baselineskip
La selección de los anticancerosos potenciales,
en un primer momento, se realizó con la línea RDM4. El efecto de
los diferentes compuestos organorrutenados sobre la viabilidad
celular se determinó inicialmente mediante un ensayo de
proliferación en función de la concentración en producto. La
actividad de los compuestos derivados del Ru se comparó con la del
cisplatino. La exposición de las células RDM4 a estos derivados se
traduce en una disminución de la proliferación dependiente de la
dosis. El efecto depende entonces del complejo orgánico que rodea
el núcleo de Ru. La concentración de inhibición del crecimiento del
50% de las células (CI50) se determinó para cada uno de los
productos. De todos los compuestos probados, los compuestos 9 y 11
parecen ser los más activos con una CI50 comprendida entre 10 y 15
\muM. Los derivados de rutenio que muestran una CI50 demasiado
elevada (>50 \muM) se han eliminado del estudio biológico.
\vskip1.000000\baselineskip
La medida de la muerte celular se realizó
mediante un primer marcado específico de la apoptosis. La
externalización de los fosfolípidos aniónicos, habitualmente
situados en la hoja interna de la membrana plasmática, es uno de
los marcadores precoces de la apoptosis (Martin y col., 1996). La
anexina-V es una proteína que se fija
específicamente a las fosfatidil serinas en presencia de calcio.
Cuando la anexina-V está acoplada a un fluorocromo,
permite cuantificar las células apoptóticas mediante citometría de
flujo.
Las células se marcaron tras 24 h, 48 h y 72 h
de tratamiento con los productos 9 y 11 a dos concentraciones
diferentes: la CI50 (15 \muM) y una concentración mayor que
garantice una inhibición importante de la proliferación (45
\muM). Las células control se trataron con un equivalente en
volumen de disolvente (etanol). El tratamiento con 15 \muM de
producto no muestra efecto. Tras 72 h, la tasa de apoptosis es tan
débil como el de las células control. Por el contrario, con el
tratamiento a 45 \muM, este índice alcanza ya el 70% a 24 h y
sobrepasa el 99% tras 48 h, signo de una inducción de apoptosis
importante.
\vskip1.000000\baselineskip
Un segundo marcador específico de la apoptosis
es la fragmentación del ADN entre los nucleosomas. El ADN
fragmentado se encuentra en los cuerpos apoptóticos en fase
terminal de la apoptosis. Este ADN es hiplodiploide y por tanto de
cantidad inferior a la presente en las células normales. Se puede
cuantificar mediante citometría de flujo tras una permeabilización
de la membrana de las células y un marcado con IP. La cantidad de
ADN en una célula normal es de 2n en fase G0/G1 y de 4n en fase G2.
El ADN sub-G0 de cantidad inferior a 2n muestra
entonces una intensidad de fluorescencia más débil.
Las células tratadas con 15 \muM de producto
muestran una acumulación en fase G0/G1 durante los dos primeros
días del experimento. Este fenómeno tiende a detenerse tras 48 h de
tratamiento. Por el contrario, cuando las células se tratan a 45
\muM, la formación de partículas hipodiploides, visualizadas por
el contenido en ADN sub-G0, es inferior al 10% a 24
h y sobrepasa el 50% a 48 h para alcanzar el 60% a 72 h. La
fragmentación del ADN muestra que la apoptosis inducida por los
productos sucede rápidamente. La cantidad de partículas
hipodiploides en las células control permanece inferior al 4%
durante este mismo periodo.
Los dos complejos organorrutenados que muestran
un efecto antiproliferativo son capaces de acumular las células
RDM4 en fase G0/G1, pero también de generar su apoptosis rápidamente
a una mayor concentración, signo de una toxicidad dependiente de la
dosis.
\vskip1.000000\baselineskip
El papel de la proteína p53 es fundamental en la
gestión de la apoptosis y en la inducción del bloqueo celular. En
caso de alteración del ADN celular, esta proteína es un factor
transcripcional que regula la expresión de otras proteínas que
intervienen en el bloqueo del ciclo, en la reparación del ADN y en
la inducción de la apoptosis (Alarcon-Vargas
&
Ronai, 2002).
Ronai, 2002).
\vskip1.000000\baselineskip
Las células MOLT-4 poseen el gen
p53 que está suprimido por delección en las HL-60.
Los resultados de los ensayos de proliferación comparados muestran
que el producto 11 y el cisplatino tienen incidencias diferentes
sobre la actividad proliferativa de estas líneas. El cisplatino
disminuye la proliferación de las células MOLT-4 de
forma más importante, (CI50 < 0,5 \muM) que en las
HL-60 p53 deficientes (leucemia promielocitaria
humana) (CI50 = 1 \muM). Esta sensibilidad se invierte con el
complejo de Ru. La inhibición del crecimiento inducida por el Ru es
más importante en las HL-60 que en las
MOLT-4. Estas últimas, que tienen un gen p53
normal, son menos sensibles al complejo de Ru. La diferencia de
proliferación en presencia de cisplatino podría explicarse por un
retardo en el desencadenamiento de la apoptosis en las células
HL-60 con respecto a las MOLT-4 con
la activación de una vía secundaria independiente de la proteína p53
(Coelho y col., 2002). En el caso del tratamiento con el producto
organorutenado 11, esta variación de sensibilidad puede imputarse
al estado de p53 en la célula o a la diferencia en el tipo
celular.
\vskip1.000000\baselineskip
El papel de la proteína p53 sobre la
proliferación celular en presencia del complejo 11 y del cisplatino
se estudió igualmente en otras líneas celulares: las células
linfoblastoides humanas TK6 (p53 de tipo natural) y sus variantes
NH32 (p53 -/-). Las curvas de proliferación de los dos tipos
celulares se pueden superponer. La variación del estado de la
proteína p53 no parece tener efectos sobre la acción
antiproliferativa del complejo de Ru. Por el contrario, el
cisplatino provoca un efecto más importante sobre las células p53
+/+ que sobre las células p53 deficientes. p53 tiene, por tanto un
papel en el poder inhibidor del cisplatino. Sin embargo, la acción
antiproliferativa del cisplatino es menos importante que la del
complejo 11.
\vskip1.000000\baselineskip
La toxicidad del complejo organorutenado sobre
las células linfoblastoides TK6 y NH32 se mide con la
anexina-V, marcado específico de la apoptosis
precoz. Este marcado se efectuó en las células tratadas con el
derivado 11 a 1,5 \muM tras 0 h, 24 h, 48 h, 72 h y 96 h. Los
resultados muestran que la externalización de las fosfatidil
serinas sobrepasa el 50% a 48 h y alcanza el 90% tras 72 h de
tratamiento continuo. Más allá de 72 h, la apoptosis alcanza el
límite máximo del 90% y forma una meseta. En las células control, la
tasa de apoptosis se mantiene inferior al 10% durante todo el
experimento. El aumento con el tiempo de los fosfolípidos aniónicos
es similar en ambas líneas celulares, pero las células TK6 entran
en apoptosis con un retraso de una docena de horas respecto de sus
variantes deficientes en p53 La línea NH32 alcanza el límite formado
por la meseta del 90% más pronto que las células TK6. La proteína
p53 parece retrasar la activación de los signos precoces de la
apoptosis inducida por los complejos del Ru.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
Las radiaciones utilizadas eran neutrones
rápidos procedentes de la colisión de protones de 65 MeV sobre una
diana de berilio (productos del ciclotrón de Louvain la Neuve (LLN)
en Bélgica. Se presentan los resultados de uno solo de estos
experimentos, que es representativo de un conjunto de tres
experimentos realizados con este tipo de radiación. Se han
observado resultados similares con rayos X (productos del centro
Paul Strauss, Estrasburgo), e iones carbono (productos de GANIL,
Caen).
\vskip1.000000\baselineskip
Las células RDM4 se ajustaron a 50.000
células/ml, en el medio de cultivo RPMI 1640 al que se había añadido
suero de ternera fetal al 10%. Se llenaron frascos de cultivo de 25
cm^{2} con la suspensión celular, a razón de 10 ml/frasco, es
decir 500.000 células/frasco.
Así, se prepararon cuatro frascos,
correspondiendo cada uno a un grupo experimental diferente:
Grupo 1: células no irradiadas, no tratadas
(Et/NI en la figura 9)
Grupo 2: células no irradiadas, tratadas con
RDC-11 (RDC-11/NI en la figura
9)
Grupo 3: células irradiadas, no tratadas (Et/4
Gy en la figura 9)
Grupo 4: células irradiadas, tratadas con
RDC-11 (RDC-11/4 Gy en la figura
9)
El RDC-11, preparado a partir de
una disolución etanólica, se añadió a las células (frasco 2 y 4) 6
horas antes de la irradiación. Se añadió un volumen idéntico de
etanol (Et, 66 \mul) a los frascos 1 y 3. La concentración final
de RDC-11 es de 10 \muM, y el medio no se
sustituyó durante los 9 días del experimento.
Los frascos 3 y 4 se irradiaron a 4 Gy, a
temperatura ambiente, a continuación se volvieron al cultivo a
37ºC.
Los días posteriores a la irradiación, se
extrajeron alícuotas de las suspensiones celulares de manera
regular. Se determinó el número de células mediante un equipo
Coulter Counter. Otras células se fijaron en etanol y
posteriormente se marcaron con yoduro de propidio con el fin de
determinar el porcentaje de apoptosis.
\vskip1.000000\baselineskip
Los recuentos celulares ponen claramente de
manifiesto la acción de las radiaciones y del RDC-11
sobre la proliferación de las RDM4. Cuando se combinan estos dos
tratamientos, el crecimiento celular se ralentiza fuertemente. Este
efecto es particularmente remarcable tras 9 días desde la
irradiación (figura 9).
El análisis mediante citometría de flujo de las
células marcadas con yoduro de propidio indica, además, que el
tratamiento conjunto indujo más apoptosis que la irradiación por
separado, o que el RDC-11 por separado, y que el
porcentaje de células en apoptosis es superior a la suma de los
tratamientos tomados por separado (figura 10).
\vskip1.000000\baselineskip
Sobre la base de estos dos criterios, y
partiendo de estos resultados, se puede concluir que la combinación
RDC-11 + irradiación tiene un efecto sinérgico. Se
han obtenido resultados comparables con los rayos X usados en
radioterapia, y con iones carbono. Esto se ha confirmado con otras
pruebas, tales como MTT o el azul Alamar.
\vskip1.000000\baselineskip
La primera etapa en la caracterización de los
efectos anticancerosos de los compuestos derivados del rutenio
consiste en probar su actividad sobre líneas tumorales mantenidas en
cultivo y comparar estos efectos en líneas que muestran
características diferentes de resistencia a los tratamientos
anticancerosos. Se usaron dos líneas de glioblastomas humanos
(A172, HS683) y dos líneas de neuroblastomas (N2A y SH5Y) con el fin
de probar los efectos citostáticos de los compuestos según la
invención. Se eligió el cisplatino como agente citotóxico de
comparación. En una primera hipótesis, se usó un ensayo MTT para
medir la actividad de una enzima mitocondrial, lo que proporciona
una estimación del número de células. A continuación, se
caracterizaron más refinadamente los efectos citotóxicos de los
compuestos según la invención mediante un análisis de la morfología
del núcleo y de la activación de la caspasa 3, dos marcadores de la
apoptosis celular.
\vskip1.000000\baselineskip
Varios compuestos derivados del rutenio
disminuyen el número de células tumorales y en el conjunto de líneas
ensayadas, A172, HS683, N2A, y SH5Y (Figura 1, tabla 2). Para los
compuestos más activos (compuestos 6, 9 y 12), este efecto se
observa a una concentración similar o inferior a la del cisplatino.
Basándose en estos experimentos, se han estimado los valores de la
CI50 correspondientes a la concentración necesaria para disminuir a
la mitad la cantidad de células tumorales presentes con respecto al
estado control. Estos resultados resumidos en la tabla 1 se han
reproducido igualmente en otras líneas celulares, las HCT116 y las
293, y en cultivos primarios de glías.
Los análisis inmunocitoquímicos de las células
de glioblastoma A172 mostraron que tras 48 h de tratamiento, los
compuestos 6, 9 y 12 inducen una condensación y una fragmentación
nuclear característica de la apoptosis (figura 2A, B). Además, las
células tratadas con los compuestos más activos (compuesto 6)
muestran un marcado importante del fragmento activo de la caspasa 3
(figura 2A, B). Este resultado se refuerza por el aumento de los
niveles proteicos del fragmento activo de la caspasa 3 detectados
mediante transferencia Western en las células A172 tratadas con
cisplatino o con un compuesto (compuesto 6 ó 9, figura 2C). Se han
observado igualmente resultados equivalentes en las células N2A y
HCT116 (no se muestran los resultados)).
En su conjunto, los resultados muestran que los
compuestos de rutenio (6, 9 y 12) ejercen efectos citostáticos y
citotóxicos sobre las líneas de neuroblastoma, de glioblastoma y de
otros tipos celulares. La caracterización de los efectos
citotóxicos muestra que los CDR inducen la apoptosis en estos
diversos tipos celulares, de manera similar a lo que se observa con
el cisplatino.
\vskip1.000000\baselineskip
La detención de la proliferación celular o la
inducción de la apoptosis son procesos celulares inducidos por
diversos fármacos anticancerígenos. Dos de las proteínas importantes
en el desencadenamiento de estos procesos son proteínas codificadas
por los genes homólogos p53 y p73 (Marin y Kaelin 2000). Las
proteínas p53 y p73 codificadas por estos dos genes son factores de
transcripción cuyos niveles proteicos se inducen en respuesta a
daños en el ADN o a otros estresores celulares. La inducción de
niveles proteicos de p53 pasa por un aumento de la estabilidad de
la proteína que ya no se degrada por la ruta del proteosoma (Vargas,
Takahashi y col. 2003; Yang, Li y col.. 2004). El cisplatino es un
inductor de p53 y de p73 (Siddik 2003). Además, estas proteínas, en
tanto que factores de transcripción, inducen la expresión de genes
concretos directamente implicados en la detención del crecimiento
celular, como p21 un inhibidor de las quinasas dependientes de las
ciclinas, o en la apoptosis, como bax que se localiza en la
mitocondria y participa en la liberación del citocromo C (Prives y
Hall 1999).
Con el objetivo de determinar los mecanismos
moleculares usados por los derivados del rutenio y compararlos con
los inducidos por el cisplatino, se ha analizado la expresión de
p53, p73 p21 y bax en las líneas A172 y HCT116.
Se han realizado análisis mediante transferencia
Western con el fin de determinar si los CDR inducen los niveles
proteicos de p53 en las células A172. Los resultados muestran
diferencias entre los CDR y el cisplatino. Tras 24 h de
tratamiento, el cisplatino induce niveles proteicos de p53 pero no
se observó efecto alguno con el CDR 6 (figura 3). Por el contrario,
tras 6 h de tratamiento, el CDR6 y el cisplatino inducen p53. Un
resultado equivalente se observa en los niveles proteicos de
p73.
Con el fin de determinar si la inducción de las
proteínas p53 y p73 conduce a la activación de los genes diana de
estas proteínas, se analizó la expresión de p21 y de Bax por
transferencia Western. Tras 24 horas de tratamiento, tanto el CDR 6
como el cisplatino inducen la expresión de p21 y de Bax (figura
4).
Estos experimentos se repitieron con las células
HCT116 que se emplean con mucha frecuencia como modelos de estudio
de la activación de p53 mediante agentes anticancerosos. En estas
células, se ha observado igualmente una inducción de p53 por los
CDR (CDR6), pero con algunas diferencias (figura 5). Por una parte,
la cinética de activación es similar a la del cisplatino
iniciándose a las 6 h y manteniéndose hasta 24 h. Por otra parte,
los CDR inducen p53 más débilmente que el cisplatino. Por tanto, el
aumento de la expresión de p21 y la inhibición de la fosforilación
de la histona H3, un marcador de proliferación celular, son
idénticos entre CDR 6 y cisplatino.
Los datos recogidos muestran que los CDR inducen
mecanismos celulares parcialmente idénticos a los usados por el
cisplatino (p53, p73, Bax, p21). Sin embargo, existen también
diferencias que indican que los CDR desencadenan mecanismos
diferentes de los del cisplatino o de otros compuestos
anticancerosos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los efectos anticancerosos de fármacos tales
como el cisplatino quedan desgraciadamente muy disminuidos por el
desencadenamiento de procesos de resistencia en la célula que
bloquean los mecanismos apoptóticos (mutación de p53...) o aumenta
la expresión de proteínas que decodifican la célula. Para el
cisplatino, se han descrito varios mecanismos, y estos son
igualmente eficaces contra el carboplatino, un derivado del
cisplatino (Safaei, Katano y col. 2004). Es por tanto
particularmente importante ensayar la sensibilidad de los CDR
respecto de estos mecanismos de resistencia con el fin de
determinar el aporte exacto que pueden representar estos compuestos
para el tratamiento de tumores resistentes a los tratamientos
quimioterapéuticos ya existentes. Uno de estos mecanismos es la
sobreexpresión de la bomba de extracción de cobre (ATP7B) que
expulsa al cisplatino de la célula. Se ha demostrado que esta
molécula está sobreexpresada en los tumores humanos, y que las
líneas celulares que sobreexpresan esta molécula son más
resistentes al cisplatino y al carboplatino que las líneas
control.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han estudiado dos líneas celulares derivadas
de células 2008 (Katano, Safaei y col. 2003). Una sobreexpresa la
bomba ATP7B y la otra únicamente contiene el vector control. Se ha
ensayado la actividad citostática del cisplatino y de los CDR en
estas dos líneas usando el ensayo MTT. De forma interesante, se ha
observado que la línea que expresa ATP7B es significativamente
menos sensible al cisplatino, mientras que su sensibilidad respecto
del CDR6 es equivalente a la de la línea control (figura 5).
Estos resultados sugieren que los mecanismos de
resistencia desarrollados por una célula contra el cisplatino o
frente a otro fármaco son, en parte, menos eficaces contra los CDR.
Por tanto se puede pensar en el uso de los CDR en el tratamiento de
tumores resistentes al cisplatino o a otros fármacos
anticancerosos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los mecanismos inducidos por los diversos
fármacos anticancerosos son diferentes según el modo de acción de
dichos fármacos. Desde hace muchos años se usan tratamientos
anticancerosos que combinan varios fármacos con el fin de aumentar
su eficacia. Basándose en esta hipótesis, se han iniciado
tratamientos que combinan derivados del rutenio con otros fármacos
como el NCS (Neocarzinostatin) y el taxol, y se ha comparado su
eficacia con la de los tratamientos individuales. El NCS induce
roturas en la doble hebras del ADN, similares a las producidas por
los rayos gamma (Smith y Nicolaou 1996). El taxol perturba los haces
mitóticos (Oberlies y Kroll 2004).
\vskip1.000000\baselineskip
NCS o Taxol son fármacos con una CI50 del orden
del nM. Se realizó una comparación usando dos dosis de NCS y dos
dosis de Taxol. Una que permitía alcanzar la CI50, y la otra que
conllevaba una disminución del 10% en la viabilidad de 10% de la
celular tras 48 h de tratamiento. Estas dos concentraciones se
combinaron con una concentración de derivado del rutenio o de
cisplatino que producía un 10% del efecto máximo. El tratamiento
simultáneo con los derivados del rutenio (CDR 6) es
significativamente más eficaz con respecto a un tratamiento
simultáneo con el cisplatino (figura 6). Se han obtenido resultados
equivalentes con el taxol y con el NCS.
Estos resultados muestran que los compuestos
derivados del rutenio tienen un efecto "potenciador"
significativamente más fuerte que el cisplatino sobre la actividad
de otros fármacos como el NCS o el taxol.
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos se realizaron en una cabina de
flujo laminar vertical. El medio de crecimiento celular está
compuesto por DMEM (medio Eagle modificado por Dulbecco), HEPES, FCS
al 10% (suero de ternera fetal), PS al 5% (Penicilina,
Estreptomicina) y se almacenó a + 4ºC, así como PBS (solución salina
tamponada con fosfato, pH= 7,4). La solución
Tripsina-EDTA (tripsina al 0,25% en
Na_{4}(EDTA) 1 mM) y el FCS se almacenaron a - 15ºC y se
descongelaron antes del uso. El MTT (bromuro de
4,5-dimetiltiazol-2-difeniltetrazolio)
es un sólido amarillo producido por la empresa Aldrich. Se lleva a
disolución acuosa estéril a una concentración de 5 mg/ml y se
conservó a + 4ºC. Se diluyó al 10% en el medio de cultivo celular en
el momento de su uso como agente de coloración de células vivas.
Las células humanas cancerosas del cólon (HCT-116) o
del hígado (A-172) se adquirieron en la European
Type Culture Collection, y se colocaron en una incubadora a 37ºC,
CO_{2} al 5% en placas de Petri redondas (diámetro 10 cm.) con 10
ml de medio. Cuando fueron suficientemente numerosas (confluencia
del 70%), se lavaron con PBS a temperatura ambiente y a continuación
se mezclaron con 1,5 ml de Tripsina-EDTA para
despegarlas de la placa de Petri. Se colocaron en la incubadora
durante varios minutos para acelerar este despegado. Esta
suspensión celular se colocó en medio de cultivo calentado a 37ºC, a
continuación esta solución se esparció en placas de cultivo celular
de 96 pocillos (100 \mul/pocillo) que se deja incubar durante 48
horas hasta alcanzar una confluencia celular del 50%. El medio se
sustituye por medio celular conteniendo concentraciones diferentes
de los RDC y cisplatino a 37ºC, que se deja incubar. Al cabo de 48
horas, el medio se sustituye por una disolución a 37ºC de MTT en el
medio, que se coloca en la incubadora durante al menos una hora o
hasta que se formen cuantitativamente cristales de color violeta
procedentes de la complejación del MTT en el fondo de cada pocillo.
Finalmente, esta medio se sustituyó por 100 \mul/pocillo de una
disolución HCl/iPrOH 0,04 M a temperatura ambiente para disolver los
cristales. Se realizó una lectura de la densidad óptica de las
disoluciones. Se compararon las densidades ópticas de los pocillos
tratados con los RDC o cisplatino respecto de los pocillos no
tratados (controles).
Una operación consiste en tratar 4 placas (3 X
RDC y el cisplatino). Cada placa contiene un único producto a
diferentes concentraciones. Se trataron 9 columnas a 50, 20, 15, 10,
7,5, 5, 2,5, 1 y 0,2 \muM y 3 columnas se dejaron como controles.
Únicamente las columnas control denotadas como (i)m
(1<i<4) (fig. 11) se toman en consideración para los
cálculos.
La determinación de la CI50 y las pruebas
estadísticas de varianza y de Newmann-Keuls se
realizaron con el programa informático Prism GraphPad v. 4.
Los resultados de los MTT se proporcionan en la
figura 11 para las células HCT-116.
Se proporciona a continuación una tabla resumen
de las CI50 obtenidas:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El RDC-11 se ensayó in
vivo con el fin de confirmar sus propiedades anticancerosas
in vitro caracterizadas anteriormente. Un experimento
preliminar en unos pocos ratones SWISS sanos demostró la ausencia de
toxicidad aparente del RDC-11.
Los animales se manipularon en una cabina de
flujo laminar. Diez ratones SWISS nu/nu (atímicos) con once semanas
de edad, se injertaron subcutáneamente con células
U-87 (un glioblastoma humano) a la altura de la pata
derecha. Al cabo de 7 días, los tumores eran evidentes y se inició
el tratamiento. Los animales se dividieron en dos grupos de cinco,
así, 5 ratones se trataron con el D-PBS (ratones
control) y los otros 5 con el RDC-11 (ratones
tratados).
tratados).
Para los ratones tratados, se usaron 2 mg de
RDC-11 disueltos en 4 ml de D-PBS
caliente en cada inyección. 0,5 ml de esta disolución enfriada a
temperatura ambiente se administraron por vía intraperitoneal a cada
ratón. Para los ratones control, se administraron 0,5 ml de
D-PBS a temperatura ambiente de la misma
manera..
Los días de las inyecciones están marcados con
una cruz en la tabla siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La dosis de RDC-11 inyectada es
de 18,5 mg/kg de ratón. La dosis acumulada es por tanto de 185
mg/Kg.
La evolución de los tumores aparentes se siguió
midiéndolos con un calibre, pesando los ratones y escaneando un
ratón de cada lote mediante CT-scan tras la
inyección de un producto de contraste (Fenestra VC). Los ratones se
individualizaron por marcado en la oreja.
El volumen de los tumores aparentes se calculó
mediante la fórmula:
V = (4/3) *
\pi * (L/2) *
(I/2)^{2}
en la que L es la longitud y l la
anchura
medidas.
Las figuras 12 y 13 muestran la evolución de los
volúmenes de los tumores aparentes y de los pesos de los ratones en
función del tiempo.
En el momento de la disección de los ratones, se
aislaron y pesaron (en g) los tumores procedentes de ambos grupos.
Los resultados se proporcionan en la figura 14. Comparando las
figuras de las medidas de los tumores (volumen calculado y peso),
es posible concluir que el volumen calculado de los tumores es
inferior al volumen observado de los tumores. En efecto, los
tumores se profundizaron, de ahí la dificultad de medirlos con un
calibre. Sin embargo, el peso y el volumen de los tumores tratados
son inferiores respecto de los controles.
\vskip1.000000\baselineskip
RDC-11 produce inflexión en el
crecimiento tumoral, esto en ausencia de cualquier toxicidad.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (25)
1. Composición farmacéutica que comprende, en un
soporte farmacéuticamente aceptable, al menos un compuesto complejo
de rutenio (II) de fórmula general (I) o (II) siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
fórmula (I) o (II) en las
que:
L_{1}, L_{2}, L_{3} y L_{4}, iguales o
diferentes, representan bien un ligando donante de 2 electrones por
átomo de nitrógeno, de oxígeno, de fósforo o de azufre, bien un
átomo de halógeno,
R1 representa un átomo de hidrógeno o una o
varias sustituciones en el grupo fenilo elegidas entre un radical
alquilo (C_{1-6}) y arilo
(C_{6-18}),
Y es un contraión (cuando m = 1),
m es 0 ó 1,
entre C y N, representada por una línea curva,
existe una sucesión de átomos que forman, con los átomos de
carbono, de nitrógeno y de rutenio representados en las fórmulas (I)
y (II), el metalociclo, que está constituido por 5 a 8 átomos
(incluyendo los átomos de carbono, de nitrógeno y de rutenio
representados en las fórmulas (I) y (II)).
2. Composición según la reivindicación
precedente, caracterizada porque los ligandos donantes de dos
electrones por átomo de nitrógeno, de oxígeno, de fósforo o de
azufre se escogen entre H_{2}O,
di(alquil(C_{1-6}))O,
di(alquil(C_{1-6}))S,
di(alquil(C_{1-6}))S(O),
alquil(C_{1-6}))SO_{3}^{-},
di(alquil(C_{1-6}))C=O y
alquil(C_{1-6})CO_{2}.
3. Composición según la reivindicación 1,
caracterizada porque los ligandos donantes de dos electrones
por átomo de nitrógeno se escogen entre los ligandos de fórmula
alquilo(C_{1-6})CN (en particular
CH_{3}CN) y los ligandos piridina, eventualmente sustituidos, en
uno o varios átomos de carbono de los ciclos piridina, por un
radical alquilo(C_{1-6}) o un átomo de
halógeno.
4. Composición según la reivindicación 1,
caracterizada porque los ligandos donantes de dos electrones
por átomo de nitrógeno se escogen entre las aminas primarias
alquilo(C_{1-6}), tales como metilamina o
etilamina.
5. Composición según la reivindicación 1,
caracterizada porque los ligandos donantes de dos electrones
por átomo de fósforo son ligandos de tipo fosfina.
6. Composición según la reivindicación 1,
caracterizada porque los ligandos donantes de dos electrones
por átomo de fósforo tienen la fórmula
P(Ph)_{3-x}(alquilo)_{x},
representando x 0, 1 ó 2.
7. Composición según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizada porque en el caso de la fórmula
(II), al menos dos de los grupos L_{1}, L_{2}, L_{3} y
L_{4}, tomados de dos en dos, están unidos por al menos un enlace
covalente.
8. Composición según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizada porque en el caso de la fórmula
(II), al menos dos de los grupos L_{1}, L_{2}, L_{3} y
L_{4}, tomados de dos en dos, representan motivos bipiridina o
fenantrolina, eventualmente sustituidos, en particular por al menos
un radical alquilo, o preferiblemente
1,2-bisdifenilfosfinoetano.
9. Composición según una de las reivindicaciones
precedentes, caracterizada porque, en el caso de la fórmula
(II), al menos un grupo L_{1}, L_{2}, L_{3} y L_{4},
representando un ligando donante de dos electrones por átomo de
nitrógeno o de fósforo, es un grupo piridina, fosfina, bipiridina o
fenantrolina.
10. Composición según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizada porque, en el
caso de la fórmula (II), al menos dos de los grupos L_{1},
L_{2}, L_{3} y L_{4} representan ligandos nitrilos, como por
ejemplo ligandos de fórmula
alquil(C_{1-6})CN (en particular
CH_{3}CN).
11. Composición según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizada porque, en el
caso de la fórmula (II), dos de los grupos L_{1}, L_{2},
L_{3} y L_{4} representan ligandos nitrilos, como por ejemplo
ligandos de fórmula alquil(C_{1-6} CN (en
particular CH_{3}CN), y los otros dos ligandos están unidos por
al menos un enlace covalente.
12. Composición según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizada porque Y es
PF_{6}, BF_{4}, CF_{3}CO_{2}, CH_{3}CO_{2},
CF_{3}SO_{3}, o NO_{3}^{-}.
13. Composición según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizada porque m es igual
a 1.
14. Composición según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la línea
curva es un metalociclo de 5 átomos elegido entre un metalociclo
definido según una de las fórmulas siguientes:
15. Composición según una de las
reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la línea
curva es un metalociclo de 6 ó 7 átomos elegido entre un
metalociclo definido según una de las fórmulas siguientes:
con R, igual o diferente,
representando H o un radical alquilo, preferentemente metilo, y R2 y
R3, iguales o diferentes, representando un átomo de hidrógeno, un
átomo de halógeno, un grupo alquilo, un radical alcoxi, tiol,
tioéter, hidroxilo, nitro, ciano o
éster.
16. Composición según la reivindicación 1,
caracterizada porque el compuesto se elige los compuestos 3 a
6 y 8 a 29.
17. Compuesto de rutenio, elegido entre los
compuestos siguientes:
18. Composición según una de las
reivindicaciones 1 a 16, para uso en el tratamiento de dolencias
relacionadas con una hiperproliferación celular.
19. Composición según una de las
reivindicaciones 1 a 16, para uso en el tratamiento de cánceres.
20. Composición según una de las
reivindicaciones 1 a 16, para uso en el tratamiento de
glioblastomas, leucemias (promielocitarias), de cánceres de la
próstata, de los ovarios, de los pulmones, de las mamas, de las vías
digestivas, en particular del hígado, del páncreas, de la cabeza y
del cuello, del colon, de la vejiga, de linfomas no de Hodgkin o de
melanomas.
21. Composición según una de las
reivindicaciones 1 a 16, para uso en el tratamiento de cánceres por
acumulación de las células tumorales en fase G0/G1, y eventualmente
por inducción de apoptosis.
22. Composición según una de las
reivindicaciones 1 a 16, para uso en el tratamiento de tumores
resistentes al cisplatino o a otros fármacos anticancerosos.
23. Composición según una de las
reivindicaciones 1 a 16, para uso en el tratamiento de cánceres en
combinación con un tratamiento anticanceroso que utilice
irradiación, tal como la radioterapia y la braquiterapia.
24. Composición según una de las
reivindicaciones 1 a 16, para uso en el tratamiento de cánceres en
combinación con al menos otro agente químico anticanceroso,
acondicionado y administrado de manera combinada, separada o
secuencial.
25. Compuestos según la reivindicación 17, como
medicamentos.
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