ES2329761T3

ES2329761T3 - Deteccion de peptidos.

Info

Publication number: ES2329761T3
Application number: ES01969937T
Authority: ES
Inventors: Richard Barry; Albert Edward Platt; Elaine Scrivener; Mikhail Soloviev; Johnathan Alexander Terrett
Original assignee: Millipore Corp
Current assignee: EMD Millipore Corp
Priority date: 2000-09-19
Filing date: 2001-09-19
Publication date: 2009-12-01
Anticipated expiration: 2021-09-19
Also published as: WO2002025287A8; GB0022978D0; EP1320754B1; EP1320754A2; WO2002025287A2; ATE437364T1; US20020055186A1; DE60139326D1; EP1320754B8; WO2002025287A3; AU2001290062A1; EP2128619A1

Abstract

Un procedimiento para determinar la presencia de una o más proteínas de interés en una muestra, procedimiento que comprende: a) someter la muestra a condiciones que permiten la fragmentación de las proteínas en fragmentos peptídicos diana; y b) poner en contacto los fragmentos peptídicos diana con una matriz de agentes de captura inmovilizados, comprendiendo los agentes de captura inmovilizados aquellos que están diseñados para reconocer fragmentos peptídicos diana pronosticados de acuerdo con un protocolo de fragmentación seleccionado de las proteínas de interés; por lo que la unión de los fragmentos peptídicos diana con los agentes de captura es indicativa de la presencia de la proteína o proteínas en la muestra.

Description

Detección de péptidos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la captura y detección de fragmentos de péptidos por afinidad en una matriz multidimensional.

Antecedentes de la invención

El control de las expresiones y propiedades de un gran número de proteínas proporciona información importante sobre el estado fisiológico o bioquímico de una célula. Una célula puede expresar un gran número de proteínas diferentes y los patrones de expresión (el número de proteínas expresadas y los niveles de expresión) varían en los diferentes tipos celulares, explicando por qué diferentes células realizan diferentes funciones. Como muchas enfermedades están asociadas con o incluso son el resultado de cambios en el patrón de expresión de la proteína, comparando los patrones de expresión de la proteína entre estados normales y de enfermedad puede revelar proteínas cuyos cambios son críticos en la enfermedad y de esta manera identificar proteínas que son de valor terapéutico o que ayudan en el diagnóstico. Los métodos para detectar perfiles de expresión de proteínas también tienen aplicaciones importantes por ejemplo, y sin limitación, en la tipificación de tejidos, identificación forense y diagnóstico clínico.

Se han desarrollado formatos de micromatriz para la detección cuantitativa de proteínas (incluyendo la captura de anticuerpos y antígenos) para el diagnóstico (Ekins y Chu; Trends Biotechnol 1999, 17: 217-8) y el descubrimiento de la interacción proteína-proteína (Walter y col. Curr Opin Microbiol 2000, 3: 298-302; Patente de Estados Unidos Nº 6.197.599). Sin embargo, el desarrollo de un sistema de captura por afinidad de micromatriz para proteómica semicuantitativa o cuantitativa similar a los usados para el análisis de expresión del ARNm semicuantitativo (Schena y col. Trends Biotechnol. 1998, 16(7): 301-6) se ha demorado por numerosas razones.

En primer lugar existen pocos agentes de captura por afinidad no heterogénea bien caracterizados (por ejemplo, ADN, proteína, moléculas pequeñas) que presenten afinidades similares para cada proteína diana o analito que pueda desear detectar un investigador. Para matrices de análisis de ARNm los agentes para capturar por afinidad (clones de ADNc y secuencias de genes, UniGene - http://www.nc-bi.nlm.nih.gov/UniGene/) se diseñaron y estaban disponibles mucho antes que el sistema de micromatriz (Southern, J. Mol Biol. 1975, 98: 503-17, Maskos y Southern, Nucleic Acids Res 1992, 20: 1679-84).

En segundo lugar, los agentes proteicos a capturar existen en una diversidad de formas altamente heterogéneas-homogéneas, por ejemplo proteínas solubles pequeñas (citocinas), proteínas grandes muy modificadas postraduccionalmente (por ejemplo, colágeno) y proteínas con múltiples dominios de diversa hidrofilidad (por ejemplo, receptores transmembrana). Puede necesitarse para el plegamiento la variación del pH en el que el analito de la proteína está en una población mixta de tipos de proteína heterogéneos que corresponde a, por ejemplo, una localización subcelular. Esto significa que cualquier sistema de captura por afinidad de micromatriz para la proteómica semicuantitativa o cuantitativa requiere una optimización casi imposible de las interacciones agente de afinidad de captura-proteína para un formato a conseguir en el que cada agente de captura de afinidad interacciona con su proteína diana correspondiente o familia de proteínas diana de una manera uniforme y predecible. Como alternativa, se requerirían múltiples matrices para proporcionar condiciones de ensayo específicas para cada tipo de proteína diferente tal como los mencionados anteriormente.

Aunque las micromatrices de ARNm han avanzado mucho y la identificación de las diferentes secuencias es sencilla, hay una gran inconsistencia entre los niveles de ARNm y de proteína (Gygi SP y col. Mol. Cell Biol. 1999, 19: 1720-30) y puesto que las proteínas son los principales agentes responsables para las respuestas a enfermedades y fármacos, la presencia y la cantidad de la proteína de predicción por medición de ARNm puede conducir a errores significativos. Además las técnicas proteómicas actuales tales como electroforesis 2D requieren procedimientos complejos para identificar proteínas expresadas diferencialmente (Parekh y col. Journal of Commercial Biotechnology 2000, 6: 284-291). Por tanto es muy deseable un sistema de alto rendimiento, en formato de micromatriz, para la detección directa cuantitativa de proteínas como se requiere en aplicaciones proteómicas para, sin limitación, diagnóstico, farmacoproteómica, identificación de marcadores de enfermedades y descubrimiento de fármaco diana.

La presente invención supera las deficiencias de las técnicas proteómicas actuales basadas en matrices y proporciona un sistema que permite la medición cualitativa y cuantitativa de la expresión de las proteínas. Éstas y otras ventajas de la invención se indican más detalladamente en la Descripción y Dibujos adjuntos.

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Sumario de la invención

Un aspecto importante de la invención es un procedimiento para determinar la presencia de una proteína en una muestra. Este procedimiento comprende someter la muestra a condiciones que permiten la fragmentación de la proteína en fragmentos de péptido diana. Después de esto, los fragmentos de péptido diana, que pueden marcarse para facilitar la detección, se ponen en contacto con una matriz que comprende un soporte sólido sobre el que se une una pluralidad de agentes de captura, diseñados cada uno para reconocer un fragmento de péptido diana predicho de acuerdo con un protocolo de fragmentación elegido de interés, es decir, una matriz de anticuerpos sobre un soporte sólido. La matriz puede consistir en agentes de captura seleccionados para unir uno o más fragmentos peptídicos derivados de cada proteína de interés. Preferiblemente, para cada proteína se emplea una pluralidad de combinaciones de fragmento de péptido diana/agente de captura, aumentando de esta manera la confianza de una respuesta de la señal analítica. La unión específica de los fragmentos peptídicos diana con los agentes de captura es indicativa de la presencia de la proteína correspondiente en la muestra. Dicha unión puede detectarse detectando el marcador opcional o directamente sondeando la presencia de un fragmento de péptido diana unido mediante una técnica altamente sensible tal como, sin limitación, espectrometría de masas.

En una realización particular, este procedimiento comprende adicionalmente determinar la cantidad relativa de una o más proteínas en una muestra cuantificando la cantidad de los correspondientes fragmentos de péptido diana unidos; esto puede conseguirse determinando la cantidad de cada fragmento de péptido diana unido a la matriz respecto a la cantidad de uno o más fragmentos de péptido diana unidos a partir de otra proteína (o proteínas) expresada en la misma muestra cuyos niveles de expresión ya se sabe o se sabe que no varían.

Esta solicitud describe adicionalmente procedimientos para la obtención de un gran número de agentes de captura por afinidad que reconocen y se unen a péptidos que proceden de proteínas, preferiblemente en condiciones de unión convencionales, reproducibles y uniformes. Los péptidos generados por escisión enzimática o no enzimática de proteínas dan como resultado una mezcla de entidades moleculares que contienen especies, que son más adecuadas para la interacción con agentes de captura por afinidad que una mezcla de proteínas. Por ejemplo, y sin limitación, las proteínas contienen muchas regiones a las que no puede accederse fácilmente para la unión con agentes de captura por afinidad: las regiones están protegidas de la unión externa por glicosilación u otras formas de modificación postraduccional; las regiones de alta hidrofobicidad tales como dominios membrana o transmembrana pueden unirse con escasa especificidad; algunos sitios de unión surgen como resultado de un plegamiento tridimensional de segmentos no contiguos de la proteína. La fragmentación de dichas estructuras complejas da como resultado una pluralidad de unidades más pequeñas (péptidos) que independientemente de ello son representativos de y únicos para cada proteína fragmentada). Seleccionando los fragmentos de péptido diana que son únicos para cada proteína de interés y seleccionando adicionalmente aquellos que pueden interaccionar con agentes de captura de una manera predecible y uniforme es posible conseguir exactitud, precisión y reproducibilidad en la detección de los fragmentos de péptido diana superando la obtenible con proteínas en un formato de matriz. De esta manera cualquier proteína de cualquier clase puede ensayarse semicuantitativamente o cuantitativamente a partir de cualquier material de partida dado por ejemplo, y sin limitación, un fluido corporal, células enteras y tipos de células mixtos de órganos y microbios.

La solicitud describe adicionalmente procedimientos para diseñar péptidos usados para obtener los agentes de captura por afinidad. Se proporcionan también procedimientos para dispensar e inmovilizar agentes de captura por afinidad en un formato de micromatriz y para la detección, cuantificación y verificación de los péptidos capturados. Adicionalmente, se establecen fácilmente las identidades de los péptidos y por tanto de las proteínas responsables para las señales diferenciales.

En una realización preferida, el fragmento de péptido diana tiene una secuencia determinada por escisión enzimática o química de una proteína sometiendo una lista de proteínas de estructura conocida o nucleótidos traducidos conceptualmente a escisión teórica y prediciendo la secuencia teórica resultante por ordenador o teórica. Como alternativa, el fragmento de péptido diana tiene una secuencia determinada por la secuenciación directa de un fragmento de péptido producido por escisión enzimática o química de una proteína por procedimientos bien conocidos para un especialista en la técnica.

Los agentes de captura pueden ser y preferiblemente son anticuerpos. En una realización específica todos los anticuerpos tienen una afinidad de unión similar a su fragmento de péptido diana respectivo.

El fragmento de péptido diana puede comprender uno o más sitios para la modificación postraduccional de la proteína. El compuesto peptídico puede comprender también uno o más grupos funcionales de modificación postraduccional. En una realización particular, el agente de captura se une al fragmento de péptido diana, haya experimentado o no una modificación postraduccional.

Preferiblemente los agentes de captura en la matriz reconocen fragmentos de péptido diana a partir de proteínas múltiples cuyos niveles de expresión se correlacionan mejor con un estado fisiológico o bioquímico, por ejemplo, y sin limitación, como se determina mediante análisis multivariable de niveles de expresión de proteína. Este estado fisiológico o bioquímico puede ser una respuesta, tal como, sin limitación, una respuesta al estrés xenobiótico; un estado hiperplásico canceroso o metastático; un estado apoptótico disfuncional o de enfermedad o un fenotipo particular. Se contemplan particularmente disfunciones o enfermedades del sistema nervioso central tales como depresión, esquizofrenia, demencia vascular y otras afecciones neurodegenerativas. También se incluyen estados cancerosos tales como cáncer de mama o hepatoma.

De acuerdo con la presente invención, las condiciones que permiten la fragmentación de la proteína en fragmentos de péptido diana preferiblemente comprenden poner en contacto la muestra con una enzima proteolítica. En una realización preferida, el patrón de escisión de la enzima proteolítica se usa para determinar la escisión enzimática teórica de la proteína y la misma enzima se usa para obtener secuencias de fragmentos de péptido diana para usar la selección de agentes de captura por afinidad específicos.

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En otra realización, los agentes de captura por afinidad pueden seleccionarse usando presentación en fase sólida de compuestos peptídicos o fragmentos de péptido diana de interés.

El procedimiento para determinar la presencia de una proteína en una muestra puede comprender además determinar si el fragmento de péptido diana comprende una modificación postraduccional, por ejemplo y sin limitación, usando un análisis por espectrometría de masas.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama que muestra un ejemplo de un protocolo para preparar una matriz y para el análisis de una preparación de proteína en contacto con esta matriz.

La Figura 2 es la secuencia de proteína completa (SEC ID Nº 1) y fragmentos de péptido diana elegidos para la proteína de BCMP 11 (como se detalla en la Figura 1 de la Solicitud PCT Nº W0163289 que se incorpora por referencia en su totalidad) cuando va emplea un sistema de escisión basado en tripsina. Los dos fragmentos de péptido elegidos (subrayados) no contienen restos de Lys o Arg y son los más específicos para BCMP 11 en esta familia de proteínas.

La Figura 3 es un espectro de masas MALDI-TOF que muestra la abundancia relativa de proteínas individuales presentes en muestras de ovario (A) y suero (B) capturadas por un anticuerpo anti-albúmina. Los extractos de proteína (1 \mug cada uno) se incubaron con matrices idénticas de anticuerpos inmovilizados sobre capas de hidrogel.

La Figura 4 es un soporte para montar dianas MALDI de 2 cm^{2}. En este caso se usó para montar un chip de silicio de 2 cm^{2} con proteínas inmovilizadas que contienen acrilamida activadas con aldehído. Esto sitúa la superficie del chip de 2 cm^{2} a la misma altura que el chip de oro y acero Perspetive Voyager dentro del espectrómetro de masas (Perseptive. Voyager, Applied Biosystems, Framingham, MA).

La Figura 5 es un espectro de masas MALDI-TOF que muestra la desorción de albúmina de una capa de poliacrilamida.

La Figura 6 es un espectro de masas MALDI-TOF que muestra la desorción/ionización del péptido EGF.

La Figura 7 muestra los resultados de micromatrices de anticuerpos incubados con un intervalo de proteínas humanas marcadas fluorescentemente; los marcadores de proteína indicados en el panel inferior indican la especificidad de unión de los anticuerpos correspondientes.

La Figura 8 es un espectro de masas MALDI-TOF que se obtiene de péptidos procedentes de una digestión tríptica bruta de albúmina de suero humana. Los triángulos indican péptidos capturados por anticuerpos anti-albúmina inmovilizados, véase la Figura 9.

La Figura 9 es un espectro de masas MALDI-TOF que muestra la captura específica de tres péptidos (indicados por los triángulos en la Figura 8), procedentes de una digestión tríptica de albúmina de suero humana, por el anticuerpo anti-albúmina policlonal inmovilizado en capas de hidrogel.

La Figura 10 muestra espectros de masas MALDI-TOF que identifican fragmentos individuales de péptido diana capturados a partir de una mezcla de péptidos VCAM, anticuerpos individuales de cadena corta, cada uno específico para fragmentos de péptidos diana K, B, M y J se inmovilizaron en capas de hidrogel distintas de 2 mm de diámetro. Los paneles A, B, C y D muestran la captura específica de únicamente el fragmento de péptido diana esperado. Las flechas en cada panel indican las masas esperadas de los cuatro fragmentos de péptido diana en las mezclas. En el panel D, el pico de masa superior corresponde a un dímero del fragmento del péptido diana 4, como se observa a menudo para especies intensas en EM MALDI TOF. En el espectro C los picos de masas superiores se deben al polietilenglicol que estaba presente en el tampón de TBS.

Descripción detallada

La presente invención avanza en gran medida el esfuerzo para desarrollar micromatrices proteómicas. Las micromatrices de la invención reducen la complejidad de los ensayos de unión de proteínas proporcionando un sistema de unión uniforme, estandarizado basado en las interacciones de los agentes de captura (como se define a continuación) con péptidos. Los péptidos se unen a compañeros de unión (agentes de captura en la práctica de la presente invención) con una cinética y afinidad relativamente informe (con alguna variación debido a la secuencia de aminoácidos), sean estos compañeros de unión otros péptidos, anticuerpos, receptores, proteínas e incluso ácidos nucleicos. En este respecto, las micromatrices de la invención pueden tener características de unión más parecidas a las relacionadas con las matrices de hibridación de los ácidos nucleicos, y de esta manera proporcionan sistemas sólidos, estandarizados para detectar y, opcionalmente, cuantificar la cantidad total de una proteína particular presente. Esto es posible debido a que las matrices de la invención se diseñan para detectar péptidos procedentes de proteínas celulares, evitando de esta manera las complejidades de unión de las proteínas.

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Una característica exclusiva de la presente invención es, además, que los procedimientos emplean agentes de captura que se unen específicamente a los péptidos en lugar de a proteínas. Otra característica de los procedimientos de la invención está en la capacidad para cuantificar proteínas de actividades biofísicas muy diferentes mediante péptidos de detección, que tienen actividades fisiológicas mucho más informes. De nuevo, el uso de agentes de captura específicos de péptidos (en lugar de proteínas) posibilita esta ventaja.

Los procedimientos de la invención son útiles para proteómica, farmacoproteómica, identificación de marcadores de enfermedad, descubrimiento diana de fármacos, diagnóstico y junto con terapia.

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Definiciones

a) La expresión "agente de captura" se refiere a cualquier compuesto que es capaz de interaccionar por ejemplo uniéndose a un compuesto peptídico o a un fragmento de péptido diana. La interacción debe ser tan específica como sea posible, es decir sin reacción cruzada sustancial con otros péptidos o proteínas diferentes presentes normalmente en una muestra biológica. Se prefieren agentes de captura de alta afinidad con, por ejemplo, una K_{ef} de 10^{-6} M^{-1} o mejor o más preferiblemente 10^{-7} M^{-1} o mejor, o aún más preferiblemente 10^{-8} M^{-1} o mejor. Un agente que "reconoce" un compuesto peptídico o una secuencia del mismo se refiere a la capacidad de este agente para unirse específicamente a este compuesto peptídico. Los agentes de captura ejemplares incluyen, sin limitación, anticuerpos, receptores, proteínas y dominios de unión de las mismas, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, lectinas y similares. Los anticuerpos son los agentes de captura preferidos debido a sus propiedades bien caracterizadas, uniformes, de unión al antígeno y a la afinidad de unión relativamente alta.

b) El término "diagnóstico" se refiere a la medición o control de marcadores de proteína de presencia, predisposición o progresión de enfermedad en un animal y más particularmente un ser humano, caracterizado por seleccionar animales o seres humanos para estudio, incluyendo a los participantes en ensayos preclínicos y clínicos e identificar aquellos en riesgo de, o que tienen un trastorno en particular o aquellos que más probablemente responden a un tratamiento terapéutico particular o para evaluar o controlar una respuesta en animales o seres humanos a un tratamiento terapéutico o fármaco particular.

c) La expresión "compuesto peptídico" se usa en su sentido más amplio para referirse a un compuesto de dos o más subunidades de aminoácido, análogos de aminoácido o peptidomiméticos. Preferiblemente, para facilitar su síntesis, el compuesto peptídico es de 6 a aproximadamente 25 restos aminoacídicos de longitud (o el equivalente del mismo de subunidades peptidomiméticas). Las subunidades pueden unirse mediante enlaces peptídicos. En otra realización, la subunidad pueden unirse por otros enlaces, por ejemplo, éster, éter, etc. Como se usa en este documento, la expresión "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, incluyendo glicina y tanto los isómeros ópticos D o L y análogos de aminoácidos y peptidomiméticos. Por tanto, los compuestos peptídicos de la invención pueden comprender D-aminoácidos, una combinación de D y L aminoácidos y diversos aminoácidos de "diseño" (por ejemplo, beta-metil aminoácidos, C-alfa-metil aminoácidos y N-alfa-metil aminoácidos, etc.). Adicionalmente, evaluando aminoácidos específicos en etapas de acoplamiento específicas, pueden generarse péptidos con hélices alfa, giros beta, láminas beta, giros alfa y compuestos peptídicos cíclicos. Un péptido de tres o más aminoácidos se denomina habitualmente oligopéptido o péptido si la cadena peptídica es corta, por ejemplo menor de aproximadamente 30 aminoácidos. Si la cadena peptídica es larga, el péptido se denomina habitualmente polipéptido o
proteína.

Un compuesto peptídico puede ser un fragmento de péptido diana o puede comprender la secuencia o parte de la secuencia del fragmento de péptido diana. La unión de un compuesto peptídico es preferiblemente indistinguible a la del agente de captura al fragmento de péptido diana. Preferiblemente, el compuesto peptídico comprende la parte de la secuencia del fragmento de péptido diana que identifica únicamente la proteína que comprende esta secuencia. Típicamente, los compuestos peptídicos se producen por síntesis química, por ejemplo síntesis peptídica en fase sólida. Sin embargo, los compuestos peptídicos pueden obtenerse también purificando el fragmento de péptido diana o un subfragmento del mismo. Los compuestos peptídicos pueden derivatizarse para facilitar su uso, lo que incluye producir agentes de captura y seleccionar agentes de captura. Por ejemplo, el compuesto peptídico puede derivatizarse para corresponder a una modificación postraduccional de la proteína o un fragmento de péptido diana. Además, el compuesto peptídico puede contener un grupo engarzador o un reactivo funcional para unirse a una molécula portadora para inmunización, o a un soporte sólido para seleccionar agentes de captura por afinidad que son específicos para el compuesto específico.

d) La expresión "proteína de interés" se refiere a una proteína, cuya detección se desea y que comprende una proteína de secuencia conocida o una proteína cuya secuencia se conoce al menos parcialmente o es una traducción conceptual de una secuencia de nucleótidos que se considera que codifica una proteína o péptido.

De acuerdo con la presente invención las proteínas de interés no se limitan y por tanto incluyen proteínas secretadas, proteínas de membrana integrales (incluyendo receptores, moléculas de adhesión celular y similares) proteínas citoplasmáticas, proteínas de complejos (por ejemplo, proteínas ribosomales, proteínas de polimerasa, proteínas de señalización intracelular, etc.), proteínas de orgánulos (por ejemplo, proteínas mitocondriales, proteínas lisosomales, proteínas nucleares, proteínas del retículo endoplásmico, etc., estén o no asociadas a la membrana) y proteínas de unión al ácido nucleico (por ejemplo, histonas, represores, activadores transcripcionales, factores potenciadores transactivos, proteínas ribonucleicas, etc.). Como se ha indicado anteriormente, una ventaja de invención está en la detección de fragmentos peptídicos de una proteína de interés, que reduce o elimina interacciones competitivas y la unión anómala resultado de características endógenas de la proteína.

e) Como se usa en el presente documento, una "proteína de secuencia conocida" es cualquier proteína que incluye, sin limitación, una proteína en una muestra o fluido corporal o en una célula o tejido para la que está disponible la información de secuencia parcial o total. Dicha información de secuencia puede estar disponible a partir de cualquier fuente, incluyendo, aunque sin limitación, bioquímica tradicional, genómica, genómica funcional, análisis proteómico y similares. Los procedimientos preferidos para identificar una proteína de secuencia conocida son enfoques proteómicos, que se conocen bien en la técnica. El enfoque proteómico tiene la ventaja de correlacionar la presencia de la proteína real dentro de una célula de interés, por ejemplo, con el estado fisiológico de la célula de interés. Por el contrario, la genómica funcional, que mide los niveles de ARN mensajero, tiene una correlación menos directa con la expresión de proteínas y por tanto con el estado fisiológico o bioquímico de la célula.

f) Usando las micromatrices descritas en la invención el "análisis proteómico" puede usarse para determinar el estado fisiológico o bioquímico de un fluido corporal, un tejido o una célula. El estado o fisiológico o bioquímico se refiere a la condición de una célula o tejido después de someterse a un estímulo o de ponerse en contacto con una molécula, tal como un fármaco, hormona u otro ligando que estimula o efectúa la actividad celular, después de que la célula o tejido se transforme parcial o completamente para volverse por ejemplo, aunque sin limitación, hiperplásica, cancerosa o metastásica, donde la célula ha entrado en una ruta apoptótica u otra, donde la célula funciona mal o está enferma y el tipo de célula, es decir, el tejido del cual procede. Toda esta información está disponible a partir del análisis proteómico. El análisis proteómico puede usarse también para determinar el complemento proteico de los fluidos o exudados corporales.

g) La expresión "reconoce específicamente" como se usa en el presente documento se refiere a un agente de captura que se une preferentemente a su péptido diana afín con un mayor grado, es decir con mayor afinidad que a cualquier otra molécula. tal como la proteína de longitud completa.

h) Un "fragmento de péptido diana" comprende una secuencia identificable a partir de la proteína de interés. Preferiblemente, un fragmento de péptido diana de una proteína de secuencia conocida se produce mediante una proteolisis específica de secuencia reproducible. Por ejemplo, sin limitación, muchas enzimas proteolíticas, tales como, sin limitación, endopeptidasas, proteínas de escisión en sitios de escisión conocidos. Tales enzimas son particularmente útiles para producir fragmentos de péptido diana de acuerdo con la presente invención. Los fragmentos de péptido diana y enzimas proteolíticas para producirlos, así como otros enfoques para producir fragmentos de péptido diana se analizan con mayor detalle más adelante. Los fragmentos de péptido diana pueden producirse también por proteolisis química. Una combinación de uno o más fragmentos de péptido diana es representativa de la proteína de la cual proceden los fragmentos de péptido diana y es indistinguible de otros fragmentos de péptido diana procedentes de otras proteínas.

La presente invención representa un avance en los esfuerzos para desarrollar análisis proteómicos. Los inventores han descubierto que es posible ensayar la presencia de fragmentos peptídicos procedentes de proteínas en lugar de una proteína intacta completa y que tales ensayos pueden realizarse con un nivel de uniformidad que en su mayor parte es independiente de la naturaleza u origen de la proteína de interés. Esto permite que pueda realizarse un análisis semicuantitativo o más preferiblemente cuantitativo. Dicho enfoque tiene numerosas ventajas. En primer lugar, es uniforme con los enfoques para determinar la identidad de una proteína presente en una muestra biológica por electroforesis bidimensional y espectrometría de masas (véase en las Patentes de Estados Unidos 6.064.754 y 6.278.794 y en el documento WO-A-02/21139 presentado el 10 de septiembre de 2001). Los datos de espectrometría de masas pueden obtenerse fácilmente a partir de péptidos procedentes de proteolisis de proteínas aislados por electroforesis bidimensional. La segunda ventaja de la invención es que las interacciones del fragmento de péptido diana-agente de captura por afinidad se entienden mejor, son más predecibles, y se controlan más fácilmente que las interacciones agente de captura por afinidad-proteína. En particular, las interacciones anticuerpo-péptido se entienden bien. Por la naturaleza de su pequeño tamaño, los fragmentos de péptido diana puestos en contacto con una matriz se exponen bien a los agentes de captura por afinidad presentes en esta matriz. Por el contrario, las proteínas pueden someterse a degeneración, errores de plegamiento, modificación postransduccional y otras influencias ambientales que pueden dar como resultado la adopción de una conformación que reduce o bloquea la unión al anticuerpo o que da como resultado una unión impredecible, tanto aumentándola como
disminuyéndola.

La invención proporciona adicionalmente la generación de agentes de captura por afinidad, tales como anticuerpos, que son altamente específicos para secuencias únicas dentro de la proteína de interés. Usando tal enfoque altamente específico disminuye sustancialmente la reactividad cruzada que puede ser problemática cuando las proteínas de interés son moléculas relacionadas.

Finalmente, el enfoque peptídico permite la redundancia en la cuantificación de la cantidad de proteína presente en una muestra ya que es posible usar una pluralidad de agentes de captura por afinidad cada uno específico para una de la pluralidad de fragmentos de péptido diana procedentes de la misma proteína de interés. Esto da como resultado una pluralidad de señales o respuestas de unión que se obtienen para cada proteína de interés que se analiza; una pluralidad de fragmentos de péptido diana usados para producir los agentes de captura por afinidad permitirá una cuantificación más precisa de la proteína de interés presente en la muestra por comparación interna de las señales de detección de cada fragmento de péptido diana para cualquier proteína de interés dada.

En resumen, la presente invención aumenta la potencia de una micromatriz proteómica y simplifica técnicamente este enfoque. Los ejemplos, más adelante, demuestran claramente la viabilidad de la detección de proteína cuantitativa usando matrices de agentes de captura específicos de péptidos como se indica en la invención.

En una realización preferida, la invención permite generar agentes de captura contra fragmentos de péptido diana de proteínas de secuencia conocida a partir de un análisis genómico, genómico funcional o proteómico. Por tanto, la micromatriz de agentes de captura puede usarse como una amplia herramienta analítica proteómica para, por ejemplo, el análisis de la expresión de proteínas, modificación postraduccional u otras características fisiológicas de la célula o del tejido. En una realización específica, la invención permite realizar análisis multivariable de niveles de expresión de proteína individual de todas, la mayoría o un gran número de proteínas de interés en la célula. Debido a la especificidad conferida por los agentes de captura para fragmentos de péptido diana, incluyendo, sin limitación, especialmente modificaciones postraduccionales, combinado con el conocimiento previo de la secuencia de la proteína de interés y de esta manera la identidad de la proteína a partir de la cual procede cualquier péptido, una micromatriz de agente de captura general de esta clase proporciona una herramienta poderosa para el análisis proteómico para complementar la electroforesis bidimensional tradicional.

En otra realización preferida, las proteínas de interés de secuencia conocida que tienen una alta correlación con el estado fisiológico bioquímico de la célula o tejidos se seleccionan para producir agentes de captura para diagnóstico para usar en matrices de control y para propósitos terapéuticos de acuerdo con la invención. Tales proteínas pueden identificarse usando análisis multivariable de niveles de expresión de todas, la mayoría o un gran número de proteínas de interés en la célula, por enfoques bioquímicos tradicionales, análisis proteómicos en gel bidimensionales o usando una micromatriz de la invención. Por ejemplo, de las miles de proteínas en una célula, de doscientas a trescientas proteínas pueden identificarse por electroforesis en gel bidimensional tradicional. De éstas, 5 o más, 10 o más, particularmente 20 o más y más particularmente aún 30, 40 ó 50 o más, de tales proteínas pueden ser los indicadores más significativos del estado fisiológico o bioquímico, es decir "proteínas marcadoras". Por consiguiente, para maximizar la eficacia, una matriz de la invención puede comprender agentes de captura para fragmentos de péptido diana para cada una de estas 5 o más proteínas de secuencia conocida. Más preferiblemente, la matriz comprenderá dos o más agentes de captura específicos para dos o más fragmentos de péptido diana únicos de cada proteína de interés de secuencia conocida de interés primario.

Como se describe en el presente documento, preferiblemente, para potenciar la exactitud y reproducibilidad del sistema, especialmente para una cuantificación más eficaz, la afinidad de unión de cada agente de captura para su fragmento de péptido diana es similar a la de otros agentes de captura para sus fragmentos de péptido diana respectivos. Las afinidades de unión similares significan que la varianza de las afinidades de unión entre todos los agentes de captura para su fragmento de péptido diana correspondiente está dentro de 100 veces y preferiblemente de 10. Las afinidades de unión dentro de un intervalo de 10 veces, demostrará características de unión similares en un ensayo y dará como resultado un procedimiento semicuantitativo o cuantitativo más exacto. Los métodos para detectar proteínas biológicamente activas conformacionalmente correctas de longitud completa usando agentes de captura basados en afinidad en formatos de matriz se complican por el hecho de que muchos sitios de unión potencial entre la proteína de interés y el agente de captura por afinidad se oscurecen o son inaccesibles en la proteína plegada de longitud completa. En cambio cada proteína produce al menos uno o más fragmentos de péptido diana. Siempre que al menos uno de tales fragmentos de péptido diana esté disponible a partir de cada proteína de interés y sea específico para cada proteína de interés y un agente de captura se una con afinidad suficiente a tales fragmentos de péptido diana, el método de la invención producirá un sistema de ensayo capaz de detectar cualquier proteína de cualquiera de las características biológicas, bioquímicas y biofisiológicas bajo un conjunto de condiciones de ensayo que son en gran medida independientes de las características de cualquier proteína de interés.

La presente invención contempla la preidentificación de proteínas de secuencia conocida. Sin embargo, las matrices de la invención pueden usarse para refinar adicionalmente el conjunto de proteínas de secuencia conocida para usar en diagnóstico, control e indicaciones terapéuticas. Por tanto, usando la invención descrita en este documento permite la producción de una matriz que comprende agentes de captura para fragmentos de péptido diana a partir de por ejemplo, más de 100 proteínas candidatas (también pueden evaluarse menos con una gran ventaja). Basándose en los datos cuantitativos disponibles en las matrices de la invención, será posible identificar específicamente aquellas proteínas de interés a partir de la célula o tejido que, como se ha indicado anteriormente, proporciona la mayor información sobre el estado bioquímico o fisiológico de la célula o tejido.

Una vez identificadas las proteínas de secuencia conocida, es entonces posible diseñar compuestos peptídicos, preparar agentes de captura, preparar matrices que comprenden agentes de captura, preferiblemente inmovilizados sobre un soporte sólido y ensayar la presencia y, opcionalmente, la cantidad de fragmentos de péptido diana a partir de las proteínas de interés.

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Diseño de Compuestos Peptídicos para la Preparación de Agentes de Captura

Los compuestos peptídicos usados en el procedimiento de la invención pueden diseñarse por un análisis por ordenador de los sitios de escisión anticipados de una proteína de interés. Esta escisión por ordenador puede realizarse en:

\bullet: secuencias de proteínas que se han compilado usando espectrometría de masas o análisis Edman de una muestra

\bullet: secuencias de proteínas indicadas en bases de datos tales como SwissProt (World Wide Web at ca. expasy.org/sprot)

\bullet: secuencias de proteínas obtenidas por traducción conceptual de bases de datos de nucleótidos tales como bases de datos de secuencias de nucleótidos EMBL (World Wide Web at www.ebi.ac.uk/embl/index.html). En una realización preferida se usan patrones de escisión enzimática (preferiblemente una endopeptidasa tal como una tripsina) o química (por ejemplo, bromuro de cianógeno) de proteínas; éstos son fácilmente predecibles y reproducibles (Chong y col. Rapid Commun Mass Spectrom 1998,12(24): 1986-93). El número de fragmentos de péptido diana seleccionados para cada proteína de interés es de al menos uno.

Tales proteínas de interés pueden ser proteínas previamente identificadas por ejemplo en estudios de asociación de enfermedades, como se describe con mayor detalle a continuación. Pueden ser también proteínas que no se sabe que estén asociadas con enfermedades pero que en lugar de ello pueden reflejar el estado o ciclo de activación o funcionalidad o el fenotipo o alguna otra característica de la célula, cualquiera de las cuales pueden determinarse por los métodos de la invención.

En una realización preferida, se construye una lista de péptidos reales que se han detectado por espectrometría de masas en experimentos proteómicos (como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 6.064.754 y en el documento WO-A-02/21139 presentado el 10 de septiembre de 2001). De acuerdo con esta realización, los fragmentos de péptido diana se seleccionan a partir de esta lista o subconjuntos de la misma. Adicionalmente, esta lista proporciona intensidades de detección analítica relativa para cada fragmento de péptido diana dentro de la pluralidad de fragmentos de péptido diana de cada proteína de interés proporcionando mayor exactitud y precisión de detección y una cuantificación mejorada. En una realización preferida adicional las proteínas de interés se seleccionan a partir de proteínas presentes en un proteoma observado experimentalmente. Tal proteoma puede generarse realizando experimentos en gel bidimensional, con análisis por espectrometría de masas, usando las mismas tecnologías de referencia a las que se hace referencia en este documento.

En otra realización, el genoma humano se escanea de antemano con un software de predicción de exones para extraer datos de ADN que representan más probablemente las proteínas expresadas. Son ejemplos de tales programas de software: GenScan (Burge y Karlin J. Mol. Biol. 1997, 268: 78-94; genes.mit.edu/GENSCAN.html on the World Wide Web) y GeneFinder (search-launcher.bcm.tmc.edu/gene-finder/gfb.html on the World Wide Web). Las secuencias de ADN extraídas se traducen posteriormente en secuencias de proteínas que a su vez se escinden conceptualmente por cualquier procedimiento de proteolisis elegido para proporcionar fragmentos de péptido diana.

En una realización preferida la selección de fragmentos de péptido diana se basa en secuencias del genoma humano que se sabe que codifican proteínas sin ambigüedad, es decir exones, a través de análisis de proteína directo. Esto proporciona una mejora sustancial en la relación señal/ruido de la detección de la matriz evitando la posibilidad de unión no específica de péptidos reales a anticuerpos generados contra traducciones conceptuales de secuencias no codificantes del genoma humano.

En otra realización más, se usan los motivos de reconocimiento o determinantes específicos conocidos dentro de una proteína de interés para seleccionar una secuencia para preparar un agente de captura, incluyendo, sin limitación un fragmento de péptido de dominio conocido o módulos de interacción dominio-dominio. Tales modelos de interacción y determinantes de especificidad pueden incluir, aunque sin limitación, secuencias consenso que determinan la especificidad de proteínas quinasa y fosfatasa, motivos de reconocimiento de calmodulina (Rhoads y Friedberg, 1997, FASEB 11: 331 -340), dominios LG/LNS (RUdenko y col., 2001, TIBS 26: 363-368), dominios de dedos de cinc (Gillooly, y col., 2001, Biochem. J. 355: 249-258), dominios RING (Borden, 2000, J. Mol. Biol. 295: 1103-1112), dominios SH3 y SH2, dominios EH, PDZ, SAMS, FYVE y PH y otros como se mencionan en Pawson y Nash, 2000, Genes Dev. 14: 1027-1047 (véase también Schultz y col., 2000 Nucleic Acids Res. 28: 231-234; World Wide Web at smart.embl.Heidelberg.de/).

Un especialista en la técnica puede identificar también información de secuencia a partir de péptidos analizados por espectrometría de masas y/o espectrometría de masas en tándem usando diversos procedimientos de interpretación espectral y herramientas de búsqueda en bases de datos. Pueden encontrase ejemplos de algunos de estos procedimientos y herramientas en la página web del Swiss Institute of Bioinformatics en www.expasy.com y en la página web del European Molecular Biology Laboratory en www.mann-embl-heildelberg.de/Services/PeptideSearch/.

En una realización específica, se construye una matriz en la que los fragmentos peptídicos están dispuestos en la matriz y se usan como agentes de captura. La matriz puede exponerse entonces a una muestra que contiene una o más proteínas de interés o a una pluralidad de fragmentos de péptidos diana de dichas proteínas de interés para identificar secuencias en la proteína de interés o sus fragmentos de péptido diana correspondientes que se unen a los fragmentos del péptido dispuestos en la matriz. Esto identifica a los fragmentos de péptido dispuestos en la matriz de uso como agentes de captura para fragmentos de péptido diana específicos y también identifica la unión péptido-péptido de significado biológico o fisiológico potencial. En una realización específica adicional pueden usarse fragmentos peptídicos producidos a partir de una pluralidad de proteínas, por ejemplo péptidos identificados por una pluralidad de secuencias exón cartografiadas, como compuestos peptídicos. Los compuestos pueden usarse para producir matrices de agentes de captura que se ponen en contacto después con una muestra de ensayo y un control. Cualquier diferencia en las señales entre la muestra de ensayo y la muestra de control indica para un agente de captura dado que tal agente de captura o pluralidad de agentes de captura es una herramienta eficaz para controlar los cambios en tal muestra.

El procedimiento preferido es diseñar péptidos sintéticos como compuestos peptídicos para seleccionar los agentes de captura con la especificidad de unión requerida. Los compuestos peptídicos definidos por esta invención para usar en agentes de captura de diseño pueden diseñarse individualmente de acuerdo con procedimientos apropiados aunque en general corresponderían a las secuencias peptídicas predichas o parte de las mismas, de acuerdo con los reactivos de digestión elegidos que se usarán en la detección de péptidos experimentales procedentes de una proteína de interés. El número de fragmentos peptídicos seleccionados para cada proteína como fragmentos de péptidos diana puede ser uno y más preferiblemente más de uno. Un ejemplo de la selección de tales fragmentos de péptido diana a partir de la proteína BCMP 11 (SEC ID Nº 1) se muestra en la figura 2. Los péptidos elegidos preferiblemente deben ser también únicos para la proteínas que se están enseñando, como se determina por ejemplo y sin limitación por medio de un algoritmo Blast (Altschul, y col., J. Mol. Biol, 1990, 215: 403-410) u otras técnicas conocidas por un especialista en la técnica. Los péptidos de secuencias de señales que se retiran de la proteína inmadura también se evitan preferiblemente.

Adicionalmente, los fragmentos de péptido diana pueden seleccionarse basándose en información respecto a si pueden estar presentes en una proteína de interés en una región sometida a modificaciones postraduccionales y sometida a tales modificaciones postraduccionales. Tales péptidos pueden usarse para diseñar matrices útiles para diagnosticar una enfermedad asociada con tales modificaciones postraduccionales específicas. Esta información puede proceder directamente de la bibliografía de (por ejemplo, Hoffman y col., Biochemistry, 1996, 35 /47): 14848-61.3) de la evidencia directa (por ejemplo EM en tándem) o de predicción (por ejemplo, tirosinas intracelulares a menudo están sometidas a fosforilación, PSTORTII en la web).

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Modificaciones postraduccionales

Se han descrito más de 250 modificaciones postraduccionales (Véase la página web pir.georget-own.edu/cgi-bin/pirwww/nbrfcg?db=R [recuperada el 22-11-2000]; véase también Barker y col. Nucleic Acids Research 2000, 28: 41-44, cuyos contenidos se incorporan en este documento como referencia en su totalidad).

Los ejemplos de modificaciones postraduccionales pueden identificarse, secuenciarse o cartografiarse usando los procedimientos descritos en este documento, incluyen, aunque sin limitación: N-formil-L-metionina; L-selenocisteina; L-cistina; L-eritro-beta-hidroxiasparagina; ácido L-eritro-beta-hidroxiaspártico; 5-hidroxi-L-lisina; 3-hidroxi-L-prolina; 4-hidroxi-L-prolina; ácido 2-pirrolidona-5-carboxílico; ácido L-gamma-carboxiglutámico; L-aspártico 4-fosfórico anhídrido; S-fosfo-L-cisteína; 1'-fosfo-L-histidina; 3'-fosfo-L-histidina; O-fosfo-L-serina; O-fosfo-L-treonina; 4'-fosfo-L-tirosina; 2'-[3-carboxamido-3-(trimetilamonio)propil]-L-histidina; N-acetil-L-alanina; ácido N-acetil-L-aspártico; N-acetil-L-cisteína; ácido N-acetil-L-glutámico; N-acetil-L-glutamina; N-acetilglicina; N-acetil-L-isoleucina; N2-acetil-L-lisina; N-acetil-L-metionina; N-acetil-L-prolina; N-acetil-L-serina; N-acetil-L-treonina; N-acetil-L-tirosina; N-acetil-L-valina; N6-acetil-L-lisina; S-acetil-L-cisteína; N-formilglicina; D-glucuronil-N-glicina; N-miristoil-glicina; N-palmitoil-L-cisteína; N-metil-L-alanina; N,N,N-trimetil-L-alanina; N-metilglicina; N-metil-L-metionina; N-metil-L-fenilalanina; N,N-dimetil-L-prolina; omega-N,omega-N'-dimetil-L-arginina; omega-N,omega-N-dimetil-L-arginina; omega-N-metil-L-arginina; N4-metil-L-asparagina; N5-metil-L-glutamina; ácido L-glutámico 5-metil ester; 3'-metil-L-histidina; N6,N6,N6-trimetil-L-lisina; N6,N6-dimetil-L-lisina; N6-metil-L-lisina; N6-palmitoil-L-lisina; N6-miristoil-L-lisina; O-palmitoil-L-treonina; O-palmitoil-L-serin; L-alanin amida; L-arginin amida; L-asparagin amida; ácido L-aspártico 1 -amida; L-cisteín amida; L-glutamin amida; ácido L-glutámico 1-amida; glicin amida; L-histidin amida; L-isoleucin amida; L-leucin amida; L-lisina amida; L-metionin amida; L-fenilalanin amida; L-prolin amida; L-serin amida; L-treonin amida; L-triptófano amida; L-tirosin amida; L-valin amida; L-cisteín metil disulfuro; S-farnesil-L-cisteína; S-12-hidroxifarnesil-L-cisteína; S-geranilgeranil-L-cisteína; L-cisteína metil ester; S-palmitoil-L-cisteína; S-diacilglicerol-L-cisteína; S-(L-isoglutamil)-L-cisteína; 2'-(S-L-cisteinil)-L-histidina; L-lantionina; meso-lantionina; 3-metil-L-lantionina; 3'-(S-L-cisteinil)-L-tirosina; N6-carboxi-L-lisina; N6-1-carboxietil-L-lisina; N6-(4-amino-2-hidroxibutil)-L-lisina; N6-biotinil-L-lisina; N6-lipoil-L-lisina; N6-piridoxal fosfato-L-lisina; N6-retinal-L-lisina; L-allisina; L-lisinoalanina; N6-(L-isoglutamil)-L-lisina; N6-glicil-L-lisina; N-(L-isoaspartil)-glicina; ácido pirúvico; ácido L-3-feniláctico; ácido 2-oxobutanoico; N2-succinil-L-triptófano; S-ficocianobilin-L-cisteína; S-ficoeritrobilin-L-cisteína; S-fitocromobilin-L-cisteína; hemo-bis-L-cisteína; hemo-L-cisteína; tetrakis-L-cisteinil hierro; tetrakis-L-cisteinil dihierro disulfuro; tris-L-cisteinil trihierro trisulfuro; tris-L-cisteinil trihierro tetrasulfuro; tetrakis-L-cisteinil tetrahierro tetrasulfuro; L-cisteinil homocitril molibdeno-heptahierro nonasulfuro; L-cisteinil molibdopterina; S-(8alpha-FAD)-L-cisteína; 3'-(8alpha-FAD)-L-histidina; O4'-(8alpha-FAD)-L-tirosina; L-3',4'-dihidroxifenilalanina; L-2',4',5'-topaquinona; L-triptofil quinona; 4'-(L-triptófano)-L-triptofil quinona; O-fosfo-panteteina-L-serina; N4-glicosil-L-asparagina; S-glicosil-L-cisteína; 05-glicosil-L-hidroxilisina; O-glicosil-L-serina; O-glicosil-L-treonina; 1'-glicosil-L-triptófano; O4'-glicosil-L-tirosina; N-asparaginilglicosilfosfatidilinositoletanolamina; N-aspartilglicosilfosfatidilinositoletanolamina; N-cisteinilglicosilfosfatidilinositoletanolamina; N-glicilglicosilfosfatidilinositoletanolamina; N-serilglicosilfosfatidilinositoletanolamina; N-alanilglicosilfosfatidilinositoletanolamina; N-serilglicosilfosfatidilinositoletanolamina; O-(fosforibosil defosfocoenzima A)-L-serina; omega-N-(ADP-ribosil)-L-arginina; S-(ADP-ribosil)-L-cisteína; L-glutamil 5-glicerilfosforiletanolamina; S-sulfo-L-cisteína; O4'-sulfo-L-tirosina; L-bromohistidina; L-2'-bromofenilalanina; L-3'-bromofenilalanina; L-4'-bromofenilalanina; 3',3'',5'-triiodo-L-tironina; L-tiroxina; L-6'-bromotriptófano; dehidroalanina; (Z)-dehidrobutirino; dehidrotirosina; L-seril-5-imidazolinona glicina; L-3-oxoalanina; ácido láctico; L-alanil-5-imidazolinona glicina; L-cisteinil-5-imidazolinona glicina; D-alanina; D-aloisoleucina; D-metionina; D-fenilalanina; D-serina; D-asparagina; D-leucina; D-triptófano; L-isoglutamil-poliglicina; ácido L-isoglutamil-poliglutámico; O4'-(fosfo-5'-adenosina)-L-tirosina; S-(2-aminovinil)-D-cisteína; ácido L-cisteína sulfénico; S-glicil-L-cisteína; S-4-hidroxicinamil-L-cisteína; condroitín sulfato D-glucuronil-D-galactosil-D-galactosil-D-xilosil-L-serina; dermatan 4-sulfato D-glucuronil-D-galactosil-D-galactosil-D-xilosil-L-serina; heparán sulfato D-glucuronil-D-galactosil-D-galactosil-D-xilosil-L-serina; N6-formil-L-lisina; O4-glicosil-L-hidroxiprolina; 0-(fosfo-5'-RNA)-L-serina; L-citrulina; 4-hidroxi-L-arginina; N-(L-isoaspartil)-L-cisteína; 2'-alfa-manosil-L-triptófano; N6-mureinil-L-lisina; ácido ester 1-condroitín sulfato-L-aspártico; S-(6-FMN)-L-cisteína; 1'-(8alfa-FAD)-L-histidina; omega-N-fosfo-L-arginina; S-difitanilglicerol diéter-L-cisteína; complejo cromóforo alfa-1-microglobulin-lg alfa; bis-L-cisteinil bis-L-histidin dihierro disulfuro; hexakis-L-cisteinil hexahierro hexasulfuro; N6-(fosfo-5'-adenosin)-L-lisina; N6-(fosfo-5'-guanosin)-L-lisina; L-cisteína glutation disulfuro; S-nitrosil-L-cisteína; N4-(ADP-ribosil)-L-asparagina; ácido L-beta-metiltioaspártico; 5'-(N6-L-lisina)-L-topaquinona; S-metil-L-cisteína; 4-hidroxi-L-lisina; N4-hidroximetil-L-asparagina; O-(ADP-ribosil)-L-serina; ácido L-cisteína oxazolecarboxílico; ácido L-cisteína oxazolinecarboxílico; ácido glicina oxazolecarboxílico; ácido glicina tiazolcarboxílico; ácido L-serina tiazolcarboxílico; ácido L-fenilalanina tiazolcarboxílico; ácido L-cisteína tiazolcarboxílico; ácido L-lisina tiazolcarboxílico; O-(fosfo-5'-DNA)-L-serina; keratansulfato D-glucuronil-D-galactosil-D-galactosil-D-xilosil-L-treonina; dinucleótido L-selenocisteinil molibdopterin guanina; O4'-(fosfo-5'-RNA)-L-tirosina; 3-(3'-L-histidil)-L-tirosina; L-metionina sulfona; dipirrolilmetanometil-L-cisteína; S-(2-aminovinil)-3-metil-D-cisteína; O4'-(fosfo-5'-DNA)-L-tirosina O-(fosfo-5'-DNA)-L-treonina; O4'-(fosfo-5'-uridin)-L-tirosina; N-(L-glutamil)-L-tirosina; S-ficobiliviolin-L-cisteína; ficoeritrobilin-bis-L-cisteína; ficourobilin-bis-L-cisteína; ácido N-L-glutamil-poli-L-glutámico; ácido L-cisteína sulfínico; L-3',4',5'-trihidroxi-fenilalanina; O-(sn-1-glicerofosforil)-L-serina; 1-tioglicina; hemo P460-bis-L-cisteína-L-tirosina; O-(fosfo-5'-adenosin)-L-treonina; tris-L-cisteinil-L-cisteína persulfido-bis-L-glutamato-L-histidin tetrahierro disulfuro trióxido; L-cisteína persulfuro; 3'-(1'-L-histidil)-L-tirosina; hemo P460-bis-L-cisteína-L-lisina; 5-metil-L-arginina; 2-metil-L-glutamina; ácido N-pirúvico 2-iminil-L-cisteína; ácido N-pirúvico 2-iminil-L-valina; hemo-L-histidina; S-seleni-L-cisteína; N6-metil-N6-poli(N-metil-propilamina)-L-lisina; éster hemediol-L-aspartil ester-L-glutamil; hemediol-L-aspartil ester-L-glutamil ester-L-metionina sulfonio; dinucleótido L-cisteinil molibdopterin guanina; trans-2,3-cis-3,4-dihidroxi-L-prolina; pirroloquinolina quinona; tris-L-cisteinil-L-N1'-histidin tetrahierro tetrasulfuro; tris-L-cisteinil-L-N3'-histidin tetrahierro tetrasulfuro; tris-L-cisteinil-L-aspartato tetrahierro tetrasulfuro; ácido N6-pirúvico 2-iminil-L-lisina; tris-L-cisteinil-L-serinil tetrahierro tetrasulfuro; bis-L-cisteinil-L-N3'-histidin-L-serinil tetrahierro tetrasulfuro; O-octanoil-L-serina. Un especialista habitual en la técnica reconocerá fácilmente que pueden ocurrir otras modificaciones postraduccionales.

Un especialista podrá reconocer fácilmente que los procedimientos descritos en el presente documento pueden usarse para detectar diversas modificaciones postraduccionales pertinentes a la investigación básica o al diagnóstico clínico de la enfermedad. Los ejemplos de los tipos incluyen, aunque sin limitación, alquilación, véase por ejemplo Saragoni y col., Neurochem. Res. 2000; 25: 59-70; Fanapour y col., WMJ 1999, 98: 51-4; Raju y col., Exp. Cell Res. 1997, 235: 145-54; Zhao y col., Mol. Biol. Cell. 2000, 11: 721-34; o Seabra, J. Biol. Chem. 1996, 271: 14398-404.

Los ejemplos de fosforilación, incluyen, aunque sin limitación, Vanmechelen y col., Neurosci. Lett. 2000, 285: 49-52; Lutz y col., Pancreas 1994, 9: 418-24; Gitlits y col. J. Investig. Med. 2000, 48: 172-82; o Quin y McGuckin, Int. J. Cancer. 2000, 87: 499-506.

Un ejemplo de sulfatación incluye, aunque sin limitación, Manzella y col. J. Biol. Chem. 1995, 270S: 21665-71.

Los ejemplos de modificación postraduccional por oxidación o reducción incluyen, aunque sin limitación, Magsino y col., Metabolism 2000, 49: 799-803; o Stief y col., Thromb. Res. 2000, 97: 473-80.

Los ejemplos de ADP-ribosilación incluyen, aunque sin limitación, Galluzzo y col., Eur. J. Immunol. 1995, 25: 2932-9; o Thraves y col., Med. 1986, 50: 961-72.

Un ejemplo de hidroxilación incluye, aunque sin limitación, Brinckmann y col., J. Invest. Dermatol. 1999, 113: 617-21.

Los ejemplos de glucosilación, incluyen, aunque sin limitación, Johnson y col., Br. J. Cancer 1999, 81: 1188-95; Fulop y col., Biochem. 1996, J. 319, 935-40; Dow y col., Exp. Neurol. 1994, 28: 233-8; Kelly y col., J. Biol. Chem. 1993, 268: 10416-24; Goss y col., Clin. Cancer Res. 1995, 1: 935-44; o Sleat y col., Biochem. J. 1998, 334:547-51.

Un ejemplo de adición de glucosilfosfatidilinositida incluye, aunque sin limitación, Poncet y col., Acta Neuro-
pathol. 1996, 91: 400-8.

Un ejemplo de ubiquitinación incluye, aunque sin limitación, Chu y col., Mod. Pathol, 2000, 13: 420-6.

Un ejemplo de translocación que conduce a un estado de enfermedad incluye, aunque sin limitación, Reddy y col., Trends Neurosci. 1999,22: 248-55.

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La Síntesis de Compuestos Peptídicos

La síntesis y purificación de estos péptidos puede conseguirse usando sintetizadores de péptidos disponibles en el mercado (por ejemplo, Applied Biosystems, Framingham, MA) y restos de protección como se describe más adelante.

El acoplamiento de los aminoácidos puede conseguirse por técnicas familiares para los especialistas en la técnica y proporcionadas, por ejemplo, en Stewart y Young, 1984, Solid Phase Synthesis, Segunda Edición, Pierce Chemical Co., Rockford. Los aminoácidos usados para la síntesis de péptidos pueden ser una resina de Boc (Nalfa-t-butiloxicarbonilo protegido con Nalfa amino) aminoácido convencional con los protocolos convencionales de desprotección, neutralización, acoplamiento y lavado del procedimiento en fase sólida original de Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 1960, 85: 2149-2154), o preferiblemente los 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) aminoácidos protegidos con N-alfa-amino lábiles a bases descritos por primera vez por Carpino y Han (1972, J. Org. Chem. 37: 3403-3409). Ambos aminoácidos protegidos con Fmoc y Boc alfa-amino pueden obtenerse de Fluka, Bachem, Advanced Chemtech, Sigma, Cambridge Research Biochemical, Bachem o Peninsula Labs u otras compañías químicas conocidas por los practicantes de esta técnica. Además, el procedimiento de la invención puede usarse con otros grupos N-alfa protectores que son conocidos por los especialistas en esta técnica. En la práctica de la invención pueden usarse muchos procedimientos de activación e incluyen, por ejemplo, anhídridos simétricos preformados (PSA), anhídrido mixto preformado (PMA), cloruros de ácido, ésteres activos y activación in situ del ácido carboxílico, como se indica en Fields y Noble, Int. J. Pept. Protein Res. 1990,35: 161-214. La síntesis de péptidos en fase sólida puede conseguirse por técnicas conocidas por los especialistas en la técnica y se proporciona por ejemplo, en Stewart y Young, Solid Phase Synthesis, Segunda Edición, 1984, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Fields y Noble, Int. J. Pept. Protein Res. 1990,35: 161-214, o usando sintetizadores automatizados tales como los comercializados por Applied Biosystems (Framingham, MA).

Los siguientes aminoácidos no clásicos pueden incorporarse en péptidos para introducir motivos conformacionales particulares 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilato (Kazmierski y col., 1991, J. Am. Chem. Soc. 1991,113: 2275-2283); (2S,3S)-metil-fenilalanina, (2S,3R)-metil-fenilalanina, (2R,3S)-metil-fenilalanina y (2R,3R)-metil-fenilalanina (Kazmierski y Hruby, Tetrahedron Lett. 1991,); ácido 2-aminotetrahidronaftaleno-2-carboxílico (Landis, 1989, Ph.D. Thesis, Universidad de Arizona); hidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilato (Miyake y col., J. Takeda Res. Labs. 1989, 43: 53-76); beta-carbolina (D y L) (Kazmierski, 1988, Ph.D. Thesis, Universidad de Arizona); HIC (ácido histidina isoquinolina carboxílico) (Zechel y col., Int. J. Pep. Protein Res. 1991, 43); y HIC (histidina urea cíclica) (Dharanipragada).

Los siguientes análogos de aminoácido y peptidomiméticos pueden incorporarse para inducir o favorecer estructuras secundarias específicas: LL-Acp (ácido LL-3-amino-2-propenidon-6-carboxílico), un análogo de dipéptido inductor de giro beta (Kemp y col., J. Org. Chem. 1985, 50: 5834-5838); análogos inductores de láminas beta (Kemp y col., Tetrahedron Lett. 1988, 29: 5081 -5082); análogos inductores de giro alfa (Kemp y col., Tetrahedron Lett. 1988, 29: 5057-5060); análogos inductores de hélice-\mu (Kemp y col., 1988, Tetrahedron Lett. 29: 4935-4938) y análogos proporcionados por las siguientes referencias: Kemp y col., J. Org. Chem. 1989,54: 109:115; Nagai y Sato, Tetrahedron Lett. 1985, 26: 647-650; DiMalo y col., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1989, p. 1687; análogo de giro Gly-Ala (Kahn y col., Tetrahedron Lett. 1989, 30: 2317); isóstero de enlace amida (Jones y col., Tetrahedron Lett. 1988,29: 3853-3856); tretrazol (Zabrocki y col., J. Am. Chem. Soc. 1988,110: 5875-5880); DTC (Samanen y col., Int. J. Protein Pep. Res. 1990, 35: 501:509); y análogos explicados en Olson y col., J. Am. Chem. Sci. 1990, 112: 323-333 y Garvey y col., J. Org. Chem. 1990, 56: 436.

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Preparación de Agentes de Captura

Como se usa en este documento, un agente que "reconoce" un compuesto peptídico o una secuencia del mismo se refiere a la capacidad de este agente para interaccionar específicamente con este compuesto peptídico. Los agentes de captura pueden generarse de novo contra los compuestos peptídicos o seleccionarse de bibliotecas de agentes. Los ejemplos de agentes de captura incluyen anticuerpos (por ejemplo, policlonales de animales, monoclonales de hibridomas), anticuerpos de cadena única de bibliotecas de presentación de fagos (Vaughan y col., Nat Biotechnol. 1996, 14: 309-14), péptidos pequeños (Norman y col. Science 1999, 285: 591-5) bibliotecas de proteínas de fusión-ARN (Kredier y col. Med Res Rev. 2000, 20: 212-5), aptámeros de ADN y ARN (Kusser y col. J. Biotechnol. 2000, mar; 74: 27-38), moléculas pequeñas (Macbeath y col. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121: 7967-7968), péptidos y proteínas de longitud aleatoria (Walter y col. Curr Opin Microbiol, 3: 298-302), así como proteínas receptoras naturales o recombinantes y sus fragmentos (Alexander y Peters, 2000, Trends in Pharmacological Sciences, publicado por Current Trends, Londres).

En una realización los agentes de captura que se unen al fragmento de péptido diana son ellos mismos péptidos y permiten caracterizar las interacciones péptido-péptido.

En una realización adicional preferida los agentes que se unen a los compuestos peptídicos son anticuerpos.

En otra realización se usan sólo aquellos fragmentos de péptido diana que se sabe que se producen a partir de una proteína de interés por conocimiento previo, por ejemplo sin limitación, del análisis por fragmentación en tándem (EM/EM) mediante espectrometría de masas para producir compuestos peptídicos o agentes de captura.

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Anticuerpos

Los anticuerpos policlonales que pueden usarse en los procedimientos de la invención son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo procedentes del suero de animales inmunizados. También puede usarse suero inmune no fraccionado. Pueden usarse diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales para un compuesto peptídico seleccionado. En una realización particular, pueden obtenerse anticuerpos policlonales de conejo para un epítope de dicho compuesto peptídico. Por ejemplo, para la producción de anticuerpos policlonales o monoclonales, pueden inmunizarse diversos animales huésped, incluyendo aunque sin limitación, conejos; ratones, ratas, etc., por inyección con la versión nativa o sintética (por ejemplo, recombinante) de estos compuestos peptídicos.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales (mAb) dirigida al compuesto peptídico seleccionado, puede usarse cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Por ejemplo, la técnica del hibridoma originalmente desarrollada por Kohler y Milstein (Nature 1975, 256: 495-497), así como la técnica del trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozboret y col, Immunology Today 1983,4: 72), y la técnica del hibridoma-EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96). Dichos anticuerpos pueden ser cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce los mAb de la invención puede cultivarse in vitro o in vivo. En una realización adicional de la invención, los anticuerpos monoclonales pueden producirse en animales sin gérmenes utilizando tecnología conocida.

Los anticuerpos monoclonales incluyen, aunque sin limitación, anticuerpos monoclonales humanos y anticuerpos monoclonales quiméricos (por ejemplo, quimeras humano-ratón). Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes partes proceden de diferentes especies animales, tales como aquéllas que tienen una región constante y una región variable de inmunoglobulina humana procedentes de un mAb murino (véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 4.816.567 y 4.816.397).

Los anticuerpos pueden generarse también usando diversos procedimientos de presentación de fagos conocidos en la técnica. En los procedimientos de presentación de fagos, los dominios del anticuerpo funcionales se presentan sobre la superficie de partículas de fagos que llevan las secuencias de polinucleótidos que las codifican. En una realización particular, dichos fagos puede utilizarse para presentar dominios de unión al antígeno expresados a partir de un repertorio o biblioteca de anticuerpos combinatoria (por ejemplo, humana o murina). Los fagos que expresan un dominio de unión al antígeno que se unen al antígeno de interés pueden seleccionarse o identificarse con compuestos peptídicos antigénicos, por ejemplo usando péptidos marcados o péptidos unidos o capturados en una superficie sólida o perla. Los fagos usados en estos procedimientos son típicamente fagos filamentosos que incluyen dominios de unión fd y M13 expresados del fago con dominios del anticuerpo Fab, Fv o Fv estabilizado con disulfuro fusionados de forma recombinante con la proteína del gen III o del gen VIII del fago. Los métodos de presentación de fago que pueden usarse para preparar los anticuerpos de la presente invención incluyen los descritos en Brinkman y col., J. Immunol. Methods 1995, 182: 41-50; Ames y col., J. Immunol. Methods 1995, 184:177-186; Kettleborough y col., Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958; Persic y col., Gene 1997, 187:9-18; Burton y col., Advances in Immunology 1994, 57: 191-280; y en las Publicaciones PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108.

Como se describe en las referencias anteriores, después de la selección del fago, pueden aislarse las regiones del fago que codifican el anticuerpo y usarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos o cualquier otro fragmento de unión al antígeno deseado y expresado en cualquier huésped deseado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células vegetales, levaduras y bacterias, por ejemplo, como se describe en detalle a continuación. Por ejemplo, también pueden emplearse técnicas para producir fragmentos de Fab, Fab' y F(ab')2 recombinantes usando procedimientos conocidos en la técnica tales como los descritos en la Publicación PCT WO 92/22324; Mullinax y cl., BioTechniques 1992, 12: 864-869; y Sawai y col., AJRI 1995, 34: 26-34; y Better y col., Science 1998, 240: 1041-1043.

Los ejemplos de técnicas que pueden usarse para producir Fv de cadena única y anticuerpos incluyen los descritos en las Patentes de Estados Unidos 4.946.778 y 5.258.498; Huston y col., Methods in Enzymology 1991, 203: 46-88; Shu y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90: 7995-7999; y Skerra y col., Science 1988, 240: 1038-1040.

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Selección de Agentes de Captura

Para seleccionar agentes de captura por afinidad a partir de bibliotecas de agentes de captura potenciales, los compuestos peptídicos pueden inmovilizarse, incubarse con agentes de captura potenciales y lavarse. Los agentes de unión de alta afinidad se seleccionan de acuerdo con cualquier procedimiento bien conocido por un especialista en la técnica (Vaughan y col. 1996, Nat Biotechnol. 1996,14: 309-14). En una realización, los compuestos peptídicos pueden inmovilizarse en capas (20 \mum de profundidad) de hidrogel activado 1000 x 200 \mum2, separadas en dos dimensiones cada una, teniendo cada una un péptido diferente inmovilizado en la mismo (por ejemplo, Vasiliskov y col. Biotechniques 1999, 27: 592-4.596-8.600). Las bibliotecas de agentes de captura por afinidad potenciales pueden incubarse con los compuestos peptídicos inmovilizados para seleccionar agentes de captura para cada compuesto peptídico. Los agentes de captura pueden eluirse individualmente de las capas de hidrogel y amplificarse, por ejemplo, por propagación de fagos (Vaughan y col., Med Res Rev 2000, 20: 212-5). Después pueden realizarse rondas de enriquecimiento en estos agentes de captura amplificados por incubación adicional con péptidos inmovilizados similares. La selección de agentes de captura de alta afinidad individuales puede conseguirse cultivando fagos individuales o clonando los productos de RT-PCR, por ejemplo.

Como alternativa, cuando los agentes de captura son anticuerpos presentados por bibliotecas de fagos, estos fagos pueden seleccionarse directamente contra compuestos peptídicos.

En una realización específica, el ADNc de fago se liga a una cadena ligera de ARNm amplificada por PCR unida a regiones variables de cadena pesada, aislada de esplenocitos o células madre de médula ósea sin tratamiento previo. Las bacterias E. coli se cotransfectan con Fago (despolimerización de pilus) y con el fago auxiliar M13 para permitir el acondicionamiento del ADN del fagémido dentro del las partículas del fago. El ScFv (fragmento variable de cadena única) del Ab (anticuerpo) se presenta en gpIII, es decir, la proteína de revestimiento usada para unirse a e infectar E. coli.

Para la selección del fago, puede usarse una placa de 96 pocillos que contiene múltiples unidades de 25 para péptidos específicos (5 por péptido diferente). Los que no son agentes de unión se retiran por lavado en cada pocillo. Los agentes de unión se usan después de re-transfectar bacterias E. coli y cultivarlas hasta confluencia. Los fagos se recuperan y se re-exponen al péptido equivalente para eliminar los agentes de unión no específicos (por ejemplo, los que se unen a plástico o a cualquier fagémido pegajoso por naturaleza).

Después de tres rondas de selección, las muestras de E. coli que contienen fagémidos se dispersan en placas que contienen un factor de selección (1/10, 1/100). Las colonias resultantes se eligen y se cultivan en suspensión de manera que contiene el factor de selección. Los fagos secretados en el medio se recuperan después.

Los fagos que presentan anticuerpos se usan en ensayos ELISA para identificar agentes de unión fuertes que pueden rastrearse hacia atrás hasta los clones originales.

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Colocación e Inmovilización de Agentes de Captura

Los agentes de captura seleccionados de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente se inmovilizan sobre un soporte sólido para formar una matriz. La selección del soporte sólido y los procedimientos para inmovilización dependen del tipo de agentes de captura (proteínas, ácidos nucleicos, etc.). La inmovilización puede realizarse por unión covalente o no covalente. En una realización preferida, los agentes de captura se unen covalentemente a la superficie del soporte sólido a través de grupos reactivos o agentes de reticulación.

Cuando los agentes de captura son proteínas, tales como receptores o anticuerpos, la inmovilización covalente puede conseguirse a través de cisteínas libres usando superficies reactivas a tiol o a través de lisinas usando superficies reactivas a amina.

Como alternativa, los reticulantes heterobifuncionales pueden usarse para reticular los grupos NH de la superficie a grupos sulfhidrilo (SH) o restos cisteína. BMPS (N-hidroxisuccinimida éster del ácido beta-maleimidopropiónico, por ejemplo, adquirido en SIGMA) puede usarse para reticular grupos NH a grupos sulfhidrilo (SH) sobre restos cisteína de anticuerpos que pueden usarse para este fin.

Puede conseguirse interacción no covalente usando superficies revestidas con Avidina o Estreptavidina y agentes de captura por afinidad biotinilados; superficies revestidas con proteína A o proteína G y agentes de captura por afinidad que contienen Fc (por ejemplo, inmunoglobulinas, etc.); y superficies de quelato metálico y agentes de captura por afinidad marcados con Histidina.

En un procedimiento preferido, los agentes de captura son múltiples anticuerpos de cadena única (SCA) específicos para diferentes péptidos. Los mismos se purifican a partir de fagos y se solubilizan en PBS en concentraciones similares (aproximadamente 0,1 mg/ml^{-1}). Los SCA específicos se ponen en placas multipocillo (por ejemplo, 96 pocillos). Estas placas pueden usarse entonces en un sistema de micromatriz. Es preferible cuando se dosifican proteínas emplear un sistema que no use puntas de acero o contacte con el equipo de dosificación. De esta manera, un sistema preferido es el robot Packard BCA Piezo (Patente de Estados Unidos Nº 5.927.547), que dosifica gotas de pequeño volumen (menos de 1 nl) desde un capilar de vidrio desde encima de la superficie del sustrato de micromatriz. Un sustrato preferido es capas de poliacrilamida activados con aldehído inmovilizados sobre vidrio o silicio oxidado. Un tamaño preferido para las capas de poliacrilamida es 2 cm x 2 cm x 20 \mum. Se dosifican aproximadamente 300 pl de cada SCA en un área específica dentro de la capa de poliacrilamida para crear una matriz bidimensional en una estructura tridimensional. La mancha resultante es de aproximadamente 200 \mum de diámetro. Los aldehídos libres dentro de la poliacrilamida reaccionan con las aminas en los SCA de manera que los SCA se inmovilizan covalentemente. Una vez que esta reacción se completa (30 minutos después de la dosificación) cualquier aldehído restante se reduce con borohidruro sódico o se bloquea usando reactivos que contienen grupos amino (por ejemplo, tampón TRIS) y/o aminoácidos libres.

Otro sustrato preferido es hidrogel en el que los agentes de captura tales como anticuerpos pueden inmovilizarse, por ejemplo, a través del grupo NH de lisinas para formar una base de Schiff con los grupos aldehído presentes en el hidrogel. Las lisinas proporcionan también grupos NH libres que pueden reticularse a los grupos SH de restos cisteína en los anticuerpos (por ejemplo, a través de BMPS).

La inmovilización en hidrogel ha dado mejores resultados en términos de proporción de señal a ruido y fluorescencia específicamente cuando se compara con sustratos de vidrio o silicio.

En otro procedimiento preferido el sustrato se produce moldeando un gel de agarosa fino sobre un portaobjetos de vidrio, usando juntas adecuadas u otros separadores y el vidrio de revestimiento siliconado (o cubreobjetos o superficies sólidas similares para producir un gel con espesor uniforme). Después del moldeado, el gel se activa con CNBr. El uso de geles de agarosa se prefiere respecto a los Hidrogeles comerciales (por ejemplo, de Packard Instrument Co., Meriden, CT) ya que la agarosa retiene humedad más eficazmente y de esta manera permite la aplicación puntual de reactivos sensibles a la deshidratación. Otra ventaja de usar películas finas de gel de agarosa es que las mismas permiten una difusión más rápida de los compuestos debido a un mayor tamaño de poro. Por lo tanto, pueden usarse etapas de lavado más cortas y agentes de captura por afinidad menores. Esto contrasta con los Hidrogeles basados en acrilamida, que requieren tiempos de lavado largos y, por lo tanto, agentes de captura por afinidad mayores. Adicionalmente, los soportes basados en agarosa pueden deshidratarse (secarse) después de las etapas de incubación/lavado, antes de la exploración para mejorar la señal y resolución. Una ventaja adicional de las técnicas de inmovilización basadas en gel tridimensional es que, con la elección cuidadosa de las propiedades físicas y físico químicas del gel, es posible permitir la unión del fragmento de péptido diana-agente de captura para aproximarse más a la unión que es probable que ocurra en solución libre, es decir, menos obstaculizada por las superficies sólidas.

En otra realización más, los anticuerpos Fv de cadena única se marcan con histidina para la etapa de aislamiento descrita anteriormente. El marcador de histidina puede usarse adicionalmente para inmovilización, por ejemplo usando afinidad de quelato metálico en superficies modificadas con níquel, por ejemplo.

Adicionalmente, este sistema permite que múltiples agentes de captura por afinidad, específicos para diferentes fragmentos de péptido diana de la misma o de proteínas diferentes, se pongan en la misma mancha, particularmente cuando se está usando MALDI-MS como un procedimiento de detección. Las químicas de inmovilización adicionales son posibles usando otros agentes de afinidad y sustratos de matriz (por ejemplo, Lin, Science 1997, 278: 840-843).

Otros ejemplos de inmovilización incluyen el uso de membranas finas (tales como nitrocelulosa, nylon (cargado o no cargado), PVDF y/o sus derivados) unidas a o inmovilizadas sobre portaobjetos de vidrio u otras superficies sólidas. Por ejemplo, unir membranas disponibles en el mercado (membranas de nitrocelulosa, nitrocelulosa con soporte, nylon, nylon cargado o PVDF de Schleicher & Schuel, UK Ltd., Amersham, Millipore y otros distribuidores) a portaobjetos de vidrio o usar CAST^{TM} (capa de membrana de nylon cargada positivamente Nytran® SuPerCharge fijada al vidrio) y portaobjetos FAST^{TM} (superficie polimérica microporosa moldeada en vidrio) de Schleicher & Schuel, RU, Ltd. puede reducir costes significativamente. Para este procedimiento, los agentes de captura por afinidad pueden dosificarse usando robots piezo similares al descrito anteriormente para los SCA. Una de las ventajas de usar soportes basados en nitrocelulosa o nylon es que los mismos tienen una capacidad de unión a proteínas mucho mayor en comparación con Hidrogeles o soportes sólidos 2D (vidrio, silicio, plástico, etc.). Una capacidad de unión mayor da como resultado una señal fluorescente más fuerte y de esta manera permite el uso de aglutinantes que tienen una menor afinidad. Diversos materiales de soporte sólidos que pueden usarse en la micromatriz son los siguientes:

\bullet Capacidad de unión (de mayor a menor):

a): nitrocelulosa inmovilizada \sim nylon inmovilizado (cargado > descargado)

b): FAST^{TM} \sim CAST^{TM}

c): Hidrogel

d): superficies sólidas derivatizadas (vidrio; silicio, plásticos)

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\bullet Geometría de la mancha (de mejor a peor):

a): superficies sólidas derivatizadas (vidrio; silicio, plásticos)

b): FAST^{TM} \sim CAST^{TM}

c): nitrocelulosa inmovilizada \sim nylon inmovilizado

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\bullet Variabilidad en la aplicación puntual (de menos variable a más variable):

a): FAST^{TM}

b): CAST^{TM}

c): nitrocelulosa inmovilizada

d): nylon inmovilizados

e): Hidrogeles

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\bullet Retención de humedad (de mejor a peor)

a): capas de agarosa

b): capas de acrilamida (Hidrogeles)

c): membranas inmovilizadas o superficies sólidas derivatizadas (vidrio, silicio, plásticos)

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\bullet Tolerancia a glicerol en las mezclas de aplicación puntual (de mayor a menor):

a): FAST^{TM} \sim nitrocelulosa inmovilizada

b): CAST^{TM} \sim nylon inmovilizados

c): Hidrogel

Otra técnica de inmovilización preferida usa una combinación de inmovilización por afinidad no covalente acoplada a reticulación covalente. Esta técnica es especialmente provechosa para inmovilizar agentes de captura por afinidad tales como anticuerpos, ya que permite que los anticuerpos se unan en una orientación mediante la cual sus sitios activos sean fácilmente accesibles y, al mismo tiempo, permanecen reticulados covalentemente al soporte sólido. Esta técnica incluye, aunque sin limitación, el uso de Hidrogeles (Packard Instrument Co., Meriden, CT) para la inmovilización de proteína A o proteína G, seguido de tratamiento con glutaraldehído (alta concentración durante corto tiempo): esto da como resultado la reticulación covalente de la proteína A/G al soporte sólido y también la derivación de aldehído de grupos amino expuestos en solución de la proteína A/G. Los sustratos se lavan después para retirar el exceso de glutaraldehído libre, mientras que los grupos aldehído unidos permanecen desbloqueados. Posteriormente, los anticuerpos que contienen Fc (por ejemplo IgG) se aplican puntualmente o dosifican sobre la proteína A/G derivatizada, que después se une a los fragmentos Fc de los anticuerpos. Después de la incubación, la proteína A/G finalmente se reticula con los anticuerpos unidos a través de grupos derivatizados con aldheído sobre la proteína A/G y grupos amino disponibles en los fragmentos Fc. Este enfoque da como resultado una inmovilización de anticuerpos de alta densidad, con el anticuerpo correctamente orientado y reticulado covalentemente al soporte sólido. El pretratamiento con glutaraldehído de la Proteína A/G inmovilizada antes de la aplicación puntual de anticuerpo es una técnica preferida debido a que evita la incubación de los agentes de captura por afinidad (es decir, los anticuerpos) con el agente de reticulación (es decir, glutaraldehído), que podría dar como resultado la derivatización de los grupos amino de los anticuerpos y, por lo tanto, pérdidas de los sitios de unión de alta afinidad.

Se sabe bien que muchas proteínas contienen dominios de unión a ácido nucleico. Como tal el uso de agentes de captura de matrices de ácido nucleico permitirá la captura de proteínas que contienen dominios de unión a ácido nucleico. Como se usa en este documento, la expresión "matriz de ácido nucleico" se refiere a "microplacas de genes" y matrices relacionadas de oligonucleótidos, ADNc y otros ácidos nucleicos que se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, lo siguiente: Patentes de Estados Unidos Nº 6.045.996; 6.040.138; 6.027.880; 6.020.135; 5.968.740; 5.959.098; 5.945.334; 5.885.837; 5.874.219; 5.861.242; 5.843.655; 5.837.832; 5.677.195 y 5.593.839). En el contexto de la presente invención, los ácidos nucleicos que se unen al soporte sólido son preferiblemente aptámeros de ADN y ARN.

El ácido nucleico se une a un soporte sólido, que puede estar hecho de vidrio, silicio, plástico (por ejemplo, polipropileno, nylon), poliacrilamida, nitrocelulosa u otros materiales. Un procedimiento preferido para unir los ácidos nucleicos a una superficie es por impresión sobre placas de vidrio, como se describe en general en Schena y col., Science 1995, 270: 467-470. Este procedimiento es especialmente útil para preparar micromatrices de ADNc. Véase también DeRisi y col., Nature Genetics 1996,14: 457-460; Shalon y col., Genome Res, 1996,6: 639-645; y Schena y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1995, 93: 10539-11286.

Un procedimiento de preparación de micromatrices preferido es mediante el uso de un procedimiento de impresión por chorro de tinta para unir genes u oligonucleótidos directamente sobre una fase sólida, como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.965.352.

También pueden usarse otros procedimientos para preparar micromatrices, por ejemplo, por enmascaramiento (Maskos y Southern, Nucl. Acids Res. 1992, 20: 1679-1684). En principio, podría usarse cualquier tipo de matriz, por ejemplo, transferencia puntual sobre una membrana de nylon (véase Sambrook y col., Molecular Cloning A Laboratory Manual (2ª Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), aunque los especialistas en la técnica reconocen que se prefieren matrices muy pequeñas debido a que los volúmenes de muestra son más pequeños.

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Preparación de la Muestra Biológica

La presente invención contempla determinar la presencia de una proteína en una muestra. Puede ensayarse cualquier muestra que sea probable que contenga una proteína de interés. Tales muestras, denominadas en este documento muestras biológicas, incluyen líquido corporal (por ejemplo, sangre, suero, plasma, saliva, orina, efusiones plurales o líquido cefalorraquídeo), una muestra de tejido (por ejemplo, una biopsia, células sanguíneas y frotis) u homogenados y extractos, incluyendo citoplasma, membranas y organelos de la misma. Los cultivos celulares y el líquido de cultivo son también una muestra biológica.

La muestra puede pretratarse para obtener una preparación de proteína sustancialmente libre de contaminantes. Un tratamiento de este tipo puede comprender fraccionamiento, extracción diferencial (fracciones de membrana y citosólica); separación selectiva (por ejemplo, para la retirada de albúmina, haptoglobina e inmunoglobulina G); y la aplicación a cualquier columna de afinidad específica (por ejemplo, el receptor Manosa-6-Fosfato para enzimas lisosomales; Sleat y Lobel, J Biol Chem 1997, 272: 731-8).

Las proteínas presentes en la muestra pueden estar en forma nativa o desnaturalizada (Wilkins M. R.; y col., 1996, Biotechnology (N Y) 14(1): 61-5), por ejemplo, disolviendo en guanidina HCl 6 M (o urea 6-8 M), Tris-HCl 50 mM (pH 8), DTT 2-5 mM (o 2-mercaptoetanol). Las proteínas presentes en la muestra pueden pretratarse también, por ejemplo, con glucosidasas (kit de desglucosilación de glicoproteínas disponible en CN biosciences, RU. Ltd.) para retirar las cadenas laterales de glucosilación u otros medios para variar de forma predecible las modificaciones postraduccionales. La muestra se somete después a condiciones que permiten la escisión enzimática o química de las proteínas individuales en péptidos diana. Preferiblemente, este procedimiento usa las mismas condiciones usadas inicialmente para digerir o predecir la digestión de la secuencia de proteínas seleccionada para la generación de fragmentos de péptido diana a partir de los cuales se prepararon los agentes de captura. Sin embargo, pueden usarse otros agentes de escisión con la condición de que no alteren el sitio de unión del agente de captura, por ejemplo, determinante antigénico del fragmento de péptido diana.

Para romper los enlaces disulfuro, que enlazan proteínas mediante restos cisteína y evitar que los restos se recombinen, puede realizarse una etapa de reducción/alquilación antes de la proteólisis. Puede usarse Ditiotreitol (DTT) para la reducción y puede usarse yodoacetamida para la carboxiamidometilación de cisteína.

Los fragmentos de péptido reproducibles pueden generarse a partir de preparaciones de proteína usando procedimientos proteolíticos y químicos (por ejemplo, Schevchenko y col. Analytical Chemistry 1996, 68: 850-858; Houthaeve y col., FEBS Letters 1995, 376: 91-94; Wilkins y col., 1997, Springer ISBN 3-540-62753-7). La escisión puede ser una escisión enzimática. Preferiblemente, es una escisión enzimática selectiva, por ejemplo, con arginina endopeptidasa (ArgC); endopeptidasa N de ácido aspártico (aspN); quimotripsina; endopeptidasa C de ácido glutámico (gluC); endopeptidasa C de lisina (lysC); tripsina; o endopeptidasa V8.

La tripsina se prefiere, puesto que escinde específicamente proteínas en el extremo C de Arg o Lys. Para lisis con tripsina, pueden recogerse células de mamífero, por ejemplo, células Jurkat y lisarse en tampón RIPA (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1% (v/v), desoxicolato al 1% (p/v), dodecil sulfato sódico al 0,1% (p/v)), seguido de adición de tripsina porcina de alta pureza a una concentración de 10 ng/ml e incubarse durante 16 horas a 37ºC. La tripsina puede neutralizarse mediante la adición de un cóctel que contiene inhibidores de serina proteasa. Los péptidos trípticos pueden purificarse entonces y tamponarse con PBST mediante filtración en gel. Como alternativa, la tripsina puede retirarse por inmunoprecipitación o inactivarse por ebullición.

Las tablas a continuación muestran ejemplos de agentes de escisión y sitios de escisión.

TABLA 2 Escisión de proteínas usando Enzimas Proteolíticas

1

TABLA 3 Escisión química de proteínas

3

Independientemente del tipo de agente proteolítico usado, el tiempo de digestión óptimo para producir la calidad deseada de los fragmentos de péptido puede determinarse por ejemplo recogiendo alícuotas cada 2 horas y después de una digestión durante una noche.

Los fragmentos de péptido diana son preferiblemente péptidos que tienen entre 6 y 25 restos de longitud.

En una realización, una muestra que contiene proteínas de interés puede dividirse en dos o más alícuotas y cada una de las alícuotas tratarse con una enzima diferente o agente químico para producir fragmentos de péptido diana solapantes complementarios. Cada muestra escindida proteolíticamente se analiza entonces como se describe en este documento.

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Marcaje de Péptidos

Los fragmentos de péptido diana pueden marcarse de acuerdo con cualquier procedimiento convencional para facilitar la detección.

En una realización, el fragmento de péptido diana puede marcarse directamente. En otra realización, puede usarse un reactivo secundario marcado para detectar la unión del fragmento de péptido diana al soporte sólido que contiene el agente de captura. La unión puede detectarse por formación in situ de un cromóforo mediante un marcador enzimático. Las enzimas adecuadas incluyen, aunque sin limitación, fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano picante (HRP). Otros marcadores que pueden usarse en la invención incluyen isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE), rojo de Texas (TR), rodamina, sales de la serie de los lantánidos libres o queladas, especialmente Eu^{3+}, por nombrar algunos fluoróforos), moléculas quimioluminiscentes, isótopos radiactivos (^{125}I, ^{32}P, ^{35}S, Tc quelado, etc.) o marcadores de formación de imagen por resonancia magnética. Pueden realizarse dos ensayos de color usando fluoróforos que emiten a diferentes longitudes de onda.

El marcaje metabólico (o biosintético) con metionina-[^{35}S], se contempla también así como el marcaje con amino-
ácidos-[^{14}C] y aminoácidos-[^{3}H] (sustituyendo el tritio en las posiciones no inestables).

Un procedimiento preferido hace uso de éster de NHS de Bodipy TMR, Molecular Probes, Leiden, Holanda. Otros procedimientos incluyen el uso de Fluoróforos - grupos yodoacetamida, maleimida o succinimida (por ejemplo, Molecular Probes) Cy3, Cy5 o colorantes TAMRA por ejemplo mediante cisteínas o lisinas de marcaje (por ejemplo, colorantes Alexa Fluor).

Puede usarse también biotina activada unida a través de un grupo maleimida a restos cisteína. La detección se realiza usando estreptavidina-HRP para amplificar la señal. Los restos reactivos pueden incluirse también dentro del fragmento de péptido seleccionado. Por ejemplo, las cisteínas se modifican fácilmente mediante reactivos que contienen maleimida y yodoacetamida. Esto permite el enriquecimiento para aquellos péptidos a partir de una combinación escindida a través de, por ejemplo, yodoacetamida-biotina (Molecular Probes, Leiden, Holanda) y captura de estreptavidina. Otras señales fluorescentes pueden aumentarse, por ejemplo, mediante yodoacetamida-Bodipy TMR (Molecular Probes, Leiden, Holanda).

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Contacto de los Fragmentos de Péptido Diana con Agentes de Captura Inmovilizados

Los fragmentos de péptido diana marcados o no marcados (aproximadamente 1 mg ml^{-1}) en PBST u otro tampón adecuado se incuban con la matriz de agentes de captura inmovilizados. Un ejemplo de Tampón de incubación es PBS 1 x, pH 7,4, tampón fosfato (0,01 M) más NaCl (0,137 M), KCl (0,0027 M), sin detergente Tween.

La incubación puede transcurrir a temperatura ambiente o a 37ºC en una cámara humidificada sellada de 1 hora a 24 horas, en un volumen de aproximadamente 25 \mul bajo un cubreobjetos o 65 \mul en una cámara formada con juntas (Clontech). No es necesaria agitación.

Los fragmentos de péptido diana que se han unido no específicamente a la matriz se retiran mediante lavados 2 x 15 minutos en PBST (200 ml) a temperatura ambiente seguido de 3 aclarados en agua destilada. Los aclarados con agua retiran la sal y el detergente, que pueden interferir con los procedimientos de detección.

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Detección y Cuantificación de Fragmentos de Péptido Capturados

Puede realizarse cualquier procedimiento conocido en la técnica para detectar la unión de los fragmentos de péptido diana marcados a los agentes de captura de acuerdo con la presente invención. Cuando los fragmentos de péptido diana se conocen y la afinidad del agente de captura para cada fragmento de péptido diana puede medirse por técnicas conocidas en el campo, cualquier matriz puede calibrarse con respecto a cada péptido diana. Cuando uno o más pares de fragmento de péptido diana-agente de captura de especificidad conocida y afinidad conocida están disponibles para usar en un ensayo, pueden obtenerse resultados semicuantitativos o cuantitativos precisos con la matriz.

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Análisis de Fluorescencia

Cuando se usa marcaje fluorescente, la señal fluorescente puede analizarse por diversos procedimientos, incluyendo intensidad de fluorescencia o polarización (Onnerfjord y col., J. Immuno. Methods 1998, 213: 31-9), espectroscopía de correlación por fluorescencia (Tetin y col., Methods 2000, 20: 341-61), fluorescencia sensible a fase, anisotropía de fluorescencia, FRET (Transferencia de Energía por Resonancia de Fluorescencia), BRET (Transferencia de Energía por Resonancia de Bioluminiscencia) o fluorescencia en tiempo resuelto. Como alternativa, también pueden contemplarse el marcaje con isótopos radiactivos (Top Count NXT Microplate Scintillation and Luminescence Counters de Packard) o resonancia de plasmón superficial (SPR-Regnault y col. Br. J. Haematol 2000, 109: 187-94).

En una realización preferida, las micromatrices se lavan y se ponen en escáneres láser confocales disponibles en el mercado, por ejemplo, ScanArray 3000 (Gsi lumonics, EE.UU.). La cantidad de fluorescencia por punto (agente de captura) es relativa a la cantidad de péptido marcado capturado que, a su vez, está relacionada con la cantidad de proteína que contiene ese péptido en la preparación de proteína. Un programa tal como Optiquant puede usarse para medir con precisión la fluorescencia de cada punto.

Preferiblemente los ensayos de fluorescencia se realizan en matrices de hidrogel o gel de agarosa. Un ejemplo de matrices para ensayos de fluorescencia son hidrogeles de 12 x 12 mm (20 \mum de espesor) sobre portaobjetos de vidrio de microscopio. Estas dimensiones podrían aumentarse para números mayores de anticuerpos a inmovilizar.

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Espectrometría de Masa

Los fragmentos de péptido diana capturados pueden analizarse por espectrometría de masas; esto puede hacerse usando espectrometría de masas primaria (MALDI-TOF EM) o espectrometría de masas en tándem (fragmentación) (EM/EM); ambas se analizan en detalle más adelante.

En una realización preferida de esta invención, los péptidos se analizan inicialmente usando espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción láser asistida por matriz (EM). Esta configuración del instrumento se usa para determinar con exactitud los pesos moleculares (menores de 100 partes por millón (ppm)) de los péptidos modificados y no modificados. Generalmente se acepta que MALDI-EM no es un procedimiento cuantitativo. Sin embargo, normalmente esto se debe a variabilidades en la preparación de la muestra donde se producen grandes volúmenes y cristales de matriz no homogéneos. Preferiblemente, se realizan ensayos MALDI en matrices de silicio. Un ejemplo de una matriz para MALDI son capas de gel circulares de 200 \mum en centros de 350 \mum, sobre silicio oxidado. Una superficie hidrófoba (superficie repelente) entre las capas de gel proporciona adicionalmente una aplicación puntual más centrada de matriz/proteína para MALDI, mejorando de esta manera la señal tras la cuantificación. Los puntos producidos usando el sistema de esta invención (robot Packard BCA Piezo (Patente de Estados Unidos Nº 5.927.547), Packard Instrument Co., Meriden, CT) son menores de 200 \mum de diámetro. El mismo sistema puede suministrar aproximadamente 300 pl de matriz MALDI (por ejemplo DHB, ácido sinapínico) a la posición exacta del punto de agente de captura por afinidad-fragmento de péptido diana para crear un cristal homogéneo de fragmento de péptido diana/matriz. La desorción/ionización (Karas, y col. Ion Processes, 1987, 78, 53-68 o Zenobi, y col. Mass Spectrom. Rev. 1998, 17, 337-366) de este cristal en una MALDI-EM (por ejemplo, Perseptive Voyager) produce un espectro de masas donde la altura del pico es relativa a la cantidad de fragmento de péptido diana capturado (marcado o no marcado) que a su vez es relativa a la cantidad de proteína que contiene ese fragmento de péptido diana en la muestra aplicada puntualmente. Este sistema de detección verifica también la identidad de los fragmentos de péptido diana capturados mediante su masa medida. La abundancia relativa de proteínas individuales presentes en muestras de ovario y suero se analizó mediante matrices de anticuerpo. Los extractos de proteína (1 \mug cada uno) se incubaron con matrices idénticas de anticuerpos inmovilizados sobre capas de Hidrogel. Las matrices se lavaron y analizaron por MALDI-TOF-EM. Se muestran los espectros para la captura de albúmina mediada por anticuerpos anti-albúmina de ovario (A) y suero (B) (Figura 3).

La Figura 4 muestra un recipiente diana modificado para un Perseptive Voyager para contener una capa de poliacrilamida unida a silicio.

Después del análisis MALDI-TOF EM las masas identificadas excluyendo aquellas ignoradas se recogen y se usan para buscar una lista que contenga información de secuencia producida por cálculo por ordenador de fragmentos que podrían obtenerse por proteolisis de proteínas de interés con una endopeptidasa o compuesto químico apropiado. Los datos recogidos usando MALDI-TOF (EM) se representan como una lista de masas de ión precursor. Las masas debidas a la presencia del agente de captura pueden ignorarse y centrar los análisis en masas que surgen de los fragmentos de péptido diana. Las intensidades de cada característica de masa (m/z) en el espectro de masas pueden medirse por procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica o como se especifica en la Solicitud PCT Nº PCT/GB01/04034 presentada el 10 de septiembre de 2001. Cuando más de un fragmento de péptido diana está disponible para cada proteína de interés las intensidades de masas en el espectro de masas de tales fragmentos pueden normalizarse a través una pluralidad de señales de este tipo dando como resultado una mayor exactitud y
fiabilidad.

Sólo si fuera necesario, cuando la identificación no es posible o es ambigua o cuando se requieren datos de confirmación adicionales, por ejemplo para la validación o en el desarrollo de una matriz, el análisis adicional del punto de muestra/matriz puede realizarse usando cualquier procedimiento convencional de espectrometría de masas en tándem (EM/EM) y en particular usando MALDI-TOF/TOF (Applied Biosystems, Framingham, MA) o MALDI II Q-TOF (Micromass) o Q-STAR (Sciex) los cuales son sistemas que continúan MALDI EM con espectrometría de masas en tándem. Esto genera un espectro de fragmentación que se usa para generar información de secuencia.

La búsqueda en bases de datos de los datos de masa primarios proporcionados por MALDI-TOF EM puede usarse para identificar posibles modificaciones postraduccionales (PTM) de los péptidos. Cuando hay más de un posible sitio de modificación postraduccional la espectrometría de masas en tándem (EM/EM) puede usarse para proporcionar información específica sobre el sitio de dichas PTM. Por ejemplo, CID de alta energía proporcionada por MALDI-TOF/TOF EM ha demostrado que establece de forma no ambigua el sitio de fosforilación del péptido (Analysis of Post-Translational Modifications using a MALDI-TOF-TOF Mass Spectrometer, DeGnore y col. Presentación en Póster en la 49th ASMS conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Chicago).

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Aparato

Diversos tipos de aparatos, típicamente controlados por microprocesadores (es decir, ordenadores), están disponibles para la detección y cuantificación de fragmentos de péptido capturados, ya sea detectando la unión de péptido al agente de captura o la ausencia de marcador (como se detalla más adelante). En particular, la detección por fluorescencia y espectrometría de masas emplean tipos bien conocidos de aparatos, por ejemplo, como se ha expuesto en las referencias indicadas anteriormente. La invención además contempla específicamente la adaptación de dicho aparato para el análisis específico de micromatrices de la invención. En algunos aspectos, los ensayos uniformes, estandarizables y robustos de la presente invención (debido a la unión de péptidos a los agentes de captura) permiten la adaptación de características específicas del aparato, incluyendo aunque sin limitación, el tiempo de incubación, parámetros de detección y programas de procesamiento, que serían problemáticos si se adaptaran para micromatrices de agente de captura específico para proteína.

En particular, un aparato de la invención, sea para detección de marcador (por ejemplo, fluorescencia) o detección directa de unión de péptido (tal como espectrometría de masas), puede adaptarse específicamente para detectar la unión del péptido en una matriz de la invención. En particular, una adaptación de este tipo puede incluir un programa específico diseñado para el procesamiento de los datos de detección.

En una realización específica, el programa evalúa específicamente matrices de diagnóstico para determinar la presencia y cantidad de marcadores de enfermedad clave. El programa procesa los péptidos detectados frente a una base de datos de marcadores conocidos para condiciones celulares particulares y proporciona como salida datos de intensidad de unión no en bruto sino un diagnóstico más probable. Un aparato de este tipo tiene una aplicación clara en laboratorios de diagnóstico comerciales, donde el volumen de material a analizar es alto y las capacidades de los técnicos no están al nivel de científicos Ph.D.

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Aplicaciones

El diagnóstico representa una aplicación principal del procedimiento de la invención. En una realización, una proteína o un péptido que se expresa diferente en una enfermedad pueden detectarse en una muestra biológica y observarse como un marcador de la enfermedad o cambio en el estado bioquímico.

Los ejemplos de tales marcadores incluyen Cistatina C para disfunción renal (Fliser D. y Ritz E., Am. J. Kidney Dis. 2001, 37(1): 79-83); antígeno prostático específico (PSA) para cáncer de próstata, (Millenbrand y col., Anticancer Res., 2000, 20 (6D): 499-6) y Angiotensina Il/ACE para insuficiencia cardiaca (Kim SD; Biol. Res. Nurs. 2000, 1 (3): 210-26).

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Uso del Procedimiento de la Invención en Diagnóstico

Los datos producidos por el procedimiento de la invención pueden analizarse por técnicas estadísticas sofisticadas que incluyen herramientas de análisis univariable y multivariable. Las siguientes etapas pueden usarse para identificar fragmentos de péptido diana que surgen de proteínas que muestran una asociación con una enfermedad o estado bioquímico.

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1. Herramientas de análisis diferencial univariable

Los cambios tales como cambios de plegado, ensayos de suma de rango Wilcoxon y ensayo t, son útiles para determinar la significancia de los valores de expresión de cada uno de los fragmentos de péptido diana y su proteína de interés correspondiente.

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2. Análisis diferencial multivariable

La primera etapa es identificar una colección de respuestas de señal de fragmento de péptido diana que muestran individualmente una asociación significativa con cualquier afección particular. La asociación entre las proteínas identificadas y cualquier afección particular no tiene que ser necesariamente altamente significativa aunque es deseable cuando se usa una proteína individual en el diagnóstico. Cualquiera de los ensayos analizados anteriormente (cambios de plegado, ensayo de suma de rango wilcoxon, etc.) puede usarse en esta fase. Una vez que una colección adecuada de fragmentos de péptido diana se ha identificado, un análisis multivariable sofisticado capaz de identificar agrupaciones puede usarse entonces para estimar las asociaciones multivariables significativas con dicha enfermedad o estado bioquímico.

El Análisis de Discriminación Lineal (ALD) es uno de tales procedimientos, que puede usarse para detectar la asociación significativa entre una agrupación de variables y la enfermedad o estado bioquímico alterado. En la realización del ADL, un conjunto de pesos se asocia con cada variable de manera que la combinación lineal de pesos y los valores medidos de las variables pueden identificar la patología discriminando entre sujetos que tienen una enfermedad y sujetos que no tienen la enfermedad. La potenciación al ADL permite la inclusión gradual (o retirada) de variables para optimizar la potencia discriminatoria del modelo. El resultado del ADL por lo tanto es una agrupación de fragmentos de péptido diana y sus proteínas correspondientes que pueden usarse, sin limitación, para diagnóstico, pronóstico, terapia o desarrollo de fármacos. Otras variaciones potenciadas de ADL, tales como Análisis de Discriminación Flexible permiten el uso de combinaciones no lineales de variables para discriminar una patología de un estado normal. Los resultados del análisis discriminatorio pueden verificarse mediante ensayos post-hoc y también repitiendo el análisis usando técnicas alternativas, tales como árboles de clasificación.

Una categoría adicional de los fragmentos de péptido diana y su proteína correspondiente pueden identificarse por medidas cualitativas comparando el porcentaje de presencia de proteínas de interés en un grupo de muestras (por ejemplo, muestras de los sujetos enfermos) con el porcentaje de presencia de una proteína de interés en otro grupo de muestras (por ejemplo, muestras de los sujetos de control). El "porcentaje de presencia" de una proteína es el porcentaje de muestras en un grupo de muestras en el que la proteína de interés es detectable mediante el procedimiento de detección de elección. Por ejemplo, si una proteína de interés es detectable en el 95 por ciento de las muestras de los sujetos enfermos, el porcentaje de presencia de características de esta proteína de interés en ese grupo de muestras es el 95 por ciento. Si solamente el 5 por ciento de muestras de los sujetos no enfermos tienen niveles detectables de la misma proteína de interés, la detección de esa proteína de interés en la muestra de un sujeto sugeriría que es probable que el sujeto padezca la enfermedad.

El procedimiento de la presente invención puede ayudar a controlar un estudio clínico, por ejemplo, para evaluar fármacos para terapia de una enfermedad. Por ejemplo, las moléculas candidatas pueden ensayarse para determinar su capacidad para restaurar los niveles de proteína en un sujeto enfermo a niveles encontrados en los sujetos de control, o en un sujeto tratado, para conservar los niveles de proteína en valores normales. Pueden ensayarse los niveles de una o más proteínas de interés.

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En otra realización, el procedimiento de la presente invención se usa para seleccionar candidatos para un estudio clínico para identificar individuos que tienen una enfermedad; dichos individuos pueden excluirse entonces de o incluirse en el estudio o pueden ponerse en una cohorte diferente para el tratamiento o análisis. Los procedimientos para esta selección se conocen bien en la técnica.

El diagnóstico de cánceres, tales como cáncer mamario o cáncer de próstata son de particular interés. Muchas proteínas de interés asociadas con diversas enfermedades o respuestas se han identificado ya por los solicitantes (véase a continuación). La referencia a tales proteínas de interés puede encontrarse a continuación en las Publicaciones y Solicitudes de Patente Internacional.

4

Las matrices de la invención pueden construirse usando proteínas y sus fragmentos de péptido diana correspondientes identificados en las solicitudes anteriores. Las matrices de la invención pueden ser útiles también para detectar proteínas asociadas con una ruta biológica particular, por ejemplo, detectando las proteínas o antígenos en la superficie celular. Estos incluyen receptores, tales como aquéllos con dominios de receptor transmembrana 7/Receptor de angiotensina II, receptor de colecistoquinina/Receptor IL-8 de gastrina, receptor de endotelina, Receptor EGF, receptor beta-2-adrenérgico, etc. o receptores 5 HT, así como moléculas de adhesión celular, moléculas de transducción de señal y moléculas adaptoras. Esto puede incluir también la captura de proteínas asociadas con clases de proteína particulares tales como, aunque sin limitación, proteínas de membrana. Las matrices pueden diseñarse para capturar dominios específicos, proteínas que contienen estructuras particulares, sitios de unión a ácido nucleico y fragmentos de péptido diana asociados con un compartimiento intracelular tal como, aunque sin limitación, el aparato de golgi.

Los resultados obtenidos analizando las proteínas en muestras de interés pueden almacenarse en una base de datos y usar como referencia posteriormente. Por ejemplo, sin limitación, el uso de matrices de la invención para controlar pacientes con enfermedad neurodegenerativa o cáncer permite mantener resultados longitudinales y controlarlos con el tiempo. Cada nuevo resultado puede compararse con los resultados previos del mismo paciente permitiendo controlar el estado de las patologías.

En una realización, una matriz de la invención comprende la matriz y un medio legible por ordenador para almacenar la salida analítica de la matriz. En una realización adicional la salida analítica puede transmitirse electrónicamente a una localización y bases de datos del ordenador remoto.

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Formato Competitivo de Matrices de Proteína

La concentración de reactivos (fragmentos de péptido diana y agentes de captura de afinidad) en solución, afinidad de interacción y potencia de la señal (cantidad de pares unidos de agente de captura - fragmentos de péptido diana) son parámetros interconectados. Por lo tanto, para un experimento de matriz en el que se usa un número de diferentes pares de agente de captura - fragmentos de péptido diana, puede ser necesario ajustar la afinidad real de las moléculas de captura de acuerdo con la concentración de fragmento de péptido diana correspondiente para que sea cuantitativo para cada par de fragmentos de péptido diana. La realización preferida de este principio es la generación de pequeñas matrices de proteína para aplicaciones especializadas. El formato preferido para matrices más grandes (incluyendo matrices de proteína genéricas) es un formato competitivo. Las dos realizaciones más preferidas de un formato competitivo se ilustran a continuación.

En una de tales realizaciones, los agentes de captura por afinidad se inmovilizan en un formato de matriz y se ponen en contacto con uno o más de los fragmentos de péptido diana en la muestra (por ejemplo una mezcla de proteínas o péptidos) en presencia de péptidos sintéticos marcados correspondientes al ajuste de agentes de captura por afinidad inmovilizados usados en la producción de la matriz en condiciones que permiten la unión de los fragmentos de péptido a los agentes de captura. El conjunto preferido de péptidos usados para marcaje debería hacerse a partir de los compuestos peptídicos usados para la producción de los agentes de captura por afinidad o a partir de los péptidos que contienen secuencias usados en la producción de agentes de captura por afinidad.

Otra realización preferida del formato competitivo emplea péptidos sintéticos o compuestos peptídicos que se inmovilizan sobre la superficie de un soporte sólido. En esta realización, los agentes de captura de afinidad marcados correspondientes se ponen en contacto con la matriz en presencia de una muestra de ensayo (que comprende una mezcla de péptidos obtenidos después de la digestión enzimática o química de una muestra de ensayo). Las ventajas del formato competitivo descrito incluyen en primer lugar, la posible compensación de la variabilidad en las afinidades de los agentes de captura y/o variabilidad en la concentración de proteína, y por tanto péptidos, en las muestras de ensayo que pueden conseguirse variando la concentración de un reactivo de desplazamiento (péptido sintético) o un agente de captura por afinidad. Esto permite que matrices de proteínas idénticas se usen frente a una diversidad de muestras de ensayo diferentes. En segundo lugar, el uso de péptidos sintéticos marcados o agentes de captura por afinidad purificados significa que no se necesita marcar la muestra de ensayo. Esto permite un marcaje más eficaz y da como resultado un menor fondo durante la unión. Los siguientes ejemplos ilustran la invención sin limitar su alcance.

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Ejemplo 1 Preparación de Micromatrices 1. Generación de capas de poliacrilamida

Un portaobjetos de microscopio convencional de 72 mm x 25 mm se modifica frotándolo con silano de unión (Sigma-Aldrich) y cubreobjetos de cualquier tamaño se modifican con repel-silano (Sigma-Aldrich). 50 \mul de acrilamida al 8%-bisacrilamida (19:1) que contiene persulfato de amonio (Sigma-Aldrich) y TEMED (Sigma-Aldrich) se aplican puntualmente sobre el portaobjetos modificado, se cubre con un cubreobjetos modificado y se permite que polimerice.

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2. Generación de capas de agarosa

Una solución templada de agarosa de bajo punto de fusión (0,5 al 1% en agua) se aplicó a un portaobjetos de microscopio convencional (opcionalmente tratado con un silano de unión), se unió a una junta GeneFrame (ABgene, Surrey, UK) y se cubrió con un cubreobjetos tratado con repel-silano. Los geles pueden usarse inmediatamente o almacenarse bajo cubreobjetos a +4ºC en recipientes sellados. Los geles de agarosa se activan usando CNBr. Los portaobjetos cubiertos con gel se equilibran con tampón carbonato sódico 50 mM, pH 10,5, seguido de incubación en CNBr 200 mM/carbonato sódico 50 mM, pH 10,5. Se realizan lavados posteriores con grandes volúmenes de tampón citrato sódico 100 mM, pH 6,5 y agua. Los portaobjetos están ahora listos para unión del agente de captura o pueden almacenarse a +4ºC en citrato sódico 100 mM/azida sódica al 0,1% (p/v).

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3. Unión del agente de afinidad

La unión al agente de afinidad puede realizarse de diversas maneras, que pueden clasificarse en tres grupos: unión covalente, unión no covalente y una combinación de la unión covalente y no covalente.

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a) Ejemplo de técnicas de unión covalente

Portaobjetos de silicio con capas de gel de poliacrilamida (generadas como se ha descrito anteriormente u obtenidas en Packard Bioscience, Meriden, Connecticut, EE.UU.) se tratan con glutaraldehído (10-50%) durante una noche (seguido opcionalmente de TFA al 2% durante 5 min), se lavan exhaustivamente con agua y se secan al aire. Los agentes de captura por afinidad (como se ha definido previamente) se dosifican usando un formador de matriz (por ejemplo BioChip Arrayer con puntas Piezo, Packard Bioscience, Meriden, Connecticut; EE.UU.) o tratando todo o parte del portaobjetos con la solución que contiene los agentes de captura por afinidad. Los portaobjetos se incuban con el agente de captura por afinidad en una cámara humidificada, sellada, durante una noche. Para bloquear los sitios reactivos restantes y retirar los anticuerpos no unidos, los portaobjetos se lavan en Solución Salina Tamponada con Tris (Tris 0,05 M, NaCl 0,15 M, pH 7,6):glicina (1,5% p/v en agua) o en Solución Salina Tamponada con Tris en solitario, seguido de un aclarado final en agua y secado (secado centrífugo o al aire). Como alternativa, los portaobjetos se sumergen en Borohidruro Sódico 0,01 M durante 30 min, seguido de lavado exhaustivo con agua. Los portaobjetos que contienen anticuerpos pueden usarse inmediatamente o pueden almacenarse a +4ºC en una cámara humidificada, sellada. Los portaobjetos de agarosa (preparados como se ha descrito anteriormente), se usan para la aplicación puntual del agente de captura por afinidad, como se ha descrito para las capas de gel de acrilamida anteriores. Después de la aplicación puntual, los portaobjetos se incuban en cámaras humidificadas selladas a 4ºC durante una noche. Los grupos activos que no reaccionaron se bloquean por incubación de los portaobjetos en 1xTBS, 1xTBS/Glicina al 1,5% o solución de etanolamina 2 M durante al menos una hora. Después de la etapa de bloqueo, los portaobjetos de agarosa se equilibran en el tampón de unión.

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b) Ejemplo de una técnica de unión no covalente

Portaobjetos de silicio con capas de gel de poliacrilamida (por ejemplo obtenidos en Packard Bioscience, Meriden, Connecticut, EE.UU.) se tratan con glutaraldehído durante una noche, seguido de TFA al 2% durante 15 min y se lavan exhaustivamente con agua. Después de eso los portaobjetos se incuban con soluciones de 0,01-1 mg/ml de poli-lisina (o poli-Arginina), seguido de incubación con solución de 0,01-1 mg/ml de ácido poli-glutámico (o ácido poli-Aspártico), seguido de incubación con una solución de 0,01-1 mg/ml de Proteína A. Cada etapa de incubación anterior va seguida de varios lavados con etapas de lavado con agua. Antes de la aplicación puntual del anticuerpo, los portaobjetos preparados pueden almacenarse a +4ºC en una cámara humidificada sellada. Los anticuerpos pueden dosificarse usando un formador de matriz (por ejemplo, BioChip Arrayer con puntas piezo, Packard Bioscience, Meriden, Connecticut, EE.UU.) o tratando todo o una parte del portaobjetos con la solución que contiene el agente de captura por afinidad. Para bloquear los sitios reactivos restantes y para retirar los anticuerpos no unidos, los portaobjetos se lavan en Solución Salina Tamponada con Tris (Tris 0,05 M, NaCI 0,15 M, pH 7,6):glicina (1,5% p/v en agua) o en Solución Salina Tamponada con Tris en solitario, seguido de un aclarado final en H_{2}O y secado centrífugo (o secado al aire). Los portaobjetos que contienen anticuerpos se usan inmediatamente o pueden almacenarse a +4ºC en una cámara humidificada sellada.

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c) Ejemplo de la técnica de unión combinada

Los portaobjetos de silicio que contienen o están recubiertos con capas de gel de poliacrilamida (por ejemplo, obtenidos en Packard Bioscience, Meriden, Connecticut, Estados Unidos) se tratan con glutaraldehído durante una noche, seguido de TFA al 2% durante 15 min, y se lavan exhaustivamente con agua. Los portaobjetos se incuban entonces con una solución de 0,01-1 mg/ml de poli-Lisina, seguida de una solución de 0,01-1 mg/ml de ácido poli-Glutámico (o ácido poli-Aspártico), seguido de una solución de 0,01-1 mg/ml de Proteína A. Cada etapa de incubación anterior va seguida de lavados exhaustivos con agua. Después del tratamiento con Proteína A, los portaobjetos se incuban con solución de glutaraldehído (1-10%) durante 15-30 min y después se lavan con agua. Se aplican puntualmente agentes de captura por afinidad como se ha descrito anteriormente o, como alternativa, el conjunto o parte del portaobjetos se incuba con la solución que contiene el agente de captura por afinidad. Para bloquear los sitios reactivos restantes y retirar los anticuerpos no unidos, los portaobjetos se lavan en agua, seguido de Solución Salina Tamponada con Tris (Tris 0,05 M, NaCI 0,15 M, pH 7,6). Los portaobjetos que contienen anticuerpos se usan inmediatamente o pueden almacenarse a +4ºC en una cámara humidificada sellada.

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Ejemplo 2 Micromatriz de Anticuerpos 1. Superficies de Vidrio/Silicio a) Desorción de albúmina de la capa de poliacrilamida

La albúmina de suero bovino (Sigma) (1 \mul) era C18 limpiada usando una Zip Tip^{TM} (Millipore) y eluida con 0,5 \mul de una solución de 10 mg/ml de ácido sinapínico en acetonitrilo al 70%. Esto se aplicó puntualmente directamente sobre la poliacrilamida inmovilizada sobre el silicio oxidado. La microplaca de silicio-poliacrilamida se puso en el soporte de diana modificado (figura 4). El espectro en la figura 5 se obtuvo usando un Perseptive Voyager MALDI-EM en modo lineal y demuestra la utilidad de poliacrilamida inmovilizada en silicio como diana MALDI adecuada para proteínas y péptidos.

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b) Captura y desorción de péptido EGF a partir del silicio

El silicio oxidado se trató con 3-aminopropilsilano y se activó por incubación bajo un cubreobjetos de vidrio con maleimida-succinimida, creando una superficie reactiva a tiol. Se aplicó puntualmente anticuerpo anti-EGF (Sigma - 1 mg ml^{-1} en PBS) sobre la superficie reactiva y se dejó secar. Los grupos maleimida sin reaccionar se protegieron por incubación de toda la microplaca de silicio en 2-mercaptoetanol bajo un cubreobjetos durante 30 min. Se pusieron 50 \mul de péptido EGF (Sigma -1 mg ml^{-1} en PBS) sobre el silicio bajo un cubreobjetos y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Los péptidos EGF no unidos se retiraron por lavado de la microplaca de silicio 2 x 15 minutos en PBST, y 3 aclarados en agua destilada. La microplaca de silicio se puso en el soporte de diana modificado y se aplicaron puntualmente 0,5 \mul de ácido sinapínico (10 mg/ml en acetonitrilo al 70%) encima de la mancha anterior y se dejó secar antes de someterlo a MALDI-EM en un Perseptive Voyager usando el modo lineal. La Figura 6 muestra la desorción/ionización del péptido EGF, demostrando el uso de MALDI-EM para eluir y caracterizar antígenos unidos por afinidad de anticuerpos inmovilizados.

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2. Hidrogeles

Se dispusieron en matrices 300 pl cada uno de los 45 anticuerpos (Sigma, CN Biosciences, véase la Tabla 1) a 0,1 mg ml^{-1} en PBS sobre capas de hidrogel (Packard Biosciences) usando un robot Piezo Tip (Packard Biosciences) y se dejaron secar. Los grupos aldehído sin reaccionar se redujeron con borohidruro sódico. Los anticuerpos dispuestos en matrices se incubaron con 50 \mul (1 \mug) de extracto de proteína de cerebro (Clontech) que se había marcado con yodoacetamida-Cy5 (Oxford Glycosciences) en PBS durante 3 horas bajo un cubreobjetos. Las proteínas no unidas se retiraron mediante 2 x lavados de 15 minutos en PBST y 2 x aclarados con agua destilada. Las imágenes fluorescentes se capturaron usando un escáner de láser confocal (ScanArray3000-Gsi lumonics). Cada anticuerpo ha generado de forma reproducible un nivel distinto de fluorescencia demostrando el uso de proteína marcada y anticuerpos inmovilizados para generar señales cuantitativas proporcionales a la abundancia de proteína (Figura 7). Los anticuerpos 34, 35 y 36 son específicos para diferentes partes de la proteína factor IX humana, demostrando la variabilidad en la morfología de manchas y la afinidad inherente a los sistemas de anticuerpo-antígeno que no utilizan la invención descrita en este documento.

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Ejemplo 3 Caracterización del Agente de Captura por Afinidad

Pueden caracterizarse agentes de captura por afinidad e identificarse sus determinantes antigénicos específicos por contacto, en condiciones que permiten la unión, con reactivos de afinidad inmovilizados en una microplaca (Hidrogel sobre portaobjetos de silicio) con una pluralidad de fragmentos peptídicos diana y usando Espectrometría de Masas para identificar aquellos fragmentos peptídicos diana que se unen específicamente a los agentes de captura por afinidad inmovilizados. Este principio se ejemplifica por una captura por anticuerpos de fragmentos peptídicos diana generados a partir de una digestión tríptica compleja de albúmina de suero humana (HSA), seguida de detección usando MALDI-TOF-EM. Este ejemplo ilustra también la capacidad de los procedimientos basados en EM para explorar matrices de proteína/péptido.

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1. Agente de captura por afinidad e incubación

En este ejemplo, se usó un anticuerpo policlonal anti-albúmina para capturar péptidos. El sustrato usado consistía en capas de Hidrogel basadas en acrilamida de 2 mm de diámetro sobre un portaobjetos de silicio (obtenido en Packard). Antes de la inmovilización del anticuerpo, los portaobjetos se trataron de la siguiente manera:

1. Incubación en glutaraldehído al 10% durante 4 horas, seguida de un lavado de 30' con agua desionizada.

2. Incubación en TFA al 2% durante 30', seguida de un lavado de 20' con agua desionizada.

3. Incubación en poli-Lisina 0,4 mg/ml (189 kDa) durante 30', seguida de un lavado con agua de 20'.

4. Incubación en ácido poli-Glutámico 0,4 mg/ml (31 kDa) durante 40', seguida de un lavado con agua de 10'.

5. Incubación en solución a 0,1 mg/ml de Proteína A durante 1 hora, seguida de un lavado con agua de 19'.

6. Incubación en glutaraldehído al 10% durante 15', seguida de lavado con agua durante 15'.

Los agentes de captura por afinidad se inmovilizaron sumergiendo portaobjetos en una solución que contenía anticuerpo 0,01 mg/ml en agua desionizada durante 16 horas a 4ºC, seguido de un lavado de 30' con agua desionizada. Los grupos aldehído sin reaccionar se bloquearon TBS 1x (2 horas a 4ºC). Los portaobjetos con anticuerpo inmovilizado se aclararon con agua y se almacenaron en húmedo en rejillas selladas a 4ºC.

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2. Preparación de producto de digestión tríptica bruto

Se dirigió albúmina de suero humano (HSA) usando tripsina porcina modificada (Promega, Madison, WI). La HSA se redujo y se alquiló antes de la lisis con tripsina para que no se formaran enlaces disulfuro entre grupos cisteína. Se usó ditiotreitol (DTT, 10 mM en bicarbonato de amonio, 56ºC durante 1 h) para la etapa de reducción y los grupos cisteína se modificaron después usando yodoacetamida (55 mM en bicarbonato de amonio, 37ºC durante 45 min). Típicamente se digirieron 50 \mug de HSA con 1 \mug de tripsina (en bicarbonato de amonio 50 mM, pH 7,8). Durante dos horas a 37ºC. Para activar la tripsina antes del contacto con la matriz, el producto de la digestión tríptica se llevó a ebullición durante 3 min en un baño de agua seguido de la adición de un inhibidor de proteasas, fenilmetanosulfonilfluoruro (PMSF), a una concentración final de 1 mM. La incubación se realizó en portaobjetos con juntas GeneFrame (ABgene, Surrey, Reino Unido) unidas a los mismos. Se aplicaron 200 \mul de tampón de unión (TBS 1x) que contenía 9 \mug de HSA digerida en cada GeneFrame (sin cubreobjetos) y se realizó una incubación durante 15 horas a 4ºC. Después de la incubación y antes de la exploración EM, los portaobjetos se aclararon 10x veces con agua desionizada y se lavaron adicionalmente durante 10' en agua, 10' en TBS 0,5x, se aclararon tres veces en agua y se lavaron adicionalmente durante 10' en agua.

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3. Espectrometría de Masas

Las matrices que se han sometido a incubación y etapas de lavado se secaron y prepararon para MALDI-TOF-EM. La técnica MALDI requiere una matriz que sea absorbente a la longitud de onda del láser de desorción. La matriz usada para el análisis de los fragmentos peptídicos diana era ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA). Esto se aplicó en dos estratos a las capas de Hidrogel. El estrato 1 (CHCA 10 mg/ml en acetonitrilo al 60%) se aplicó usando una pipeta manual (<0,2 \mul) y se dejó secar al aire antes de la aplicación del estrato 2 (0,2 \mul de CHCA 7 mg/ml en acetonitrilo al 25%, TFA al 0,2%). Una vez que se había secado el segundo estrato, las microplacas se cortaron para ajustarse a una diana MALDI modificada. Los espectros obtenidos se adquirieron usando un Voyager DE-STR (Applied Biosystems, Framingham, MA) en el modo reflectrón.

Un espectro MALDI-TOF EM del producto de digestión tríptica bruto de HSA que se usó para contactar con la matriz en condiciones que permiten la unión se muestra en la Figura 8. El producto de digestión usado contenía más de 100 fragmentos peptídicos diana, algunos de los cuales representaban HSA digerida de forma incompleta (como se comprobó usando ajuste de masas frente a la HSA digerida por ordenador conocida). El espectro MALDI-TOF obtenido cuando se incubó el producto de digestión de HSA desactivado con el anticuerpo policlonal anti-albúmina inmovilizado se ilustra en la Figura 9. El espectro contiene tres picos, que están presentes en el producto de digestión tríptico completo (indicado por triángulos en la Figura 8) y que se han identificado como fragmentos trípticos de HSA de la secuencia conocida:

TABLA 4 Fragmentos Trípticos de HSA

5

Por lo tanto, los tres fragmentos peptídicos diana capturados específicamente caracterizan el repertorio de los dominios de interacción del anticuerpo inmovilizado.

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Ejemplo 4 Captura de Péptidos VCAM Individuales a partir de Mezclas de Péptidos por Anticuerpos scFv 1. Preparación de la matriz de scFV

Portaobjetos de silicio que contenían capas de gel de poliacrilamida (por ejemplo, Packard Bioscience, Meriden, Connecticut, Estados Unidos) se trataron con solución de glutaraldehído (50%) durante una noche, se lavaron en H_{2}O durante 1 hora y se secaron al aire. Un volumen de 100 nl de cada uno de los cuatro anticuerpos scFv anti-péptido VCAM (Cambridge Antibody Technologies) a 0,1 mg ml^{-1} en PBS se aplicaron puntualmente sobre capas de Hidrogel de 2 mm y se incubaron durante una noche a temperatura ambiente en un recipiente humidificado sellado. Las matrices de capas de gel de poliacrilamida se lavaron y los grupos aldehído sin reaccionar se bloquearon en una solución [1:1] de TBS 1x/glicina (1,5% p/v) a temperatura ambiente durante 2 horas.

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2. Incubación de fragmentos peptídicos diana con matriz de agente de captura

Una muestra de 65 \mul que contenía 100 ng de cada uno de cuatro péptidos VCAM (K, B, M, J) en tampón TBS 1x se incubó en juntas selladas con matrices idénticas de anticuerpo scFv anti-péptido VCAM durante una noche a temperatura ambiente. Las matrices se lavaron en TBS 1x durante 1 hora, H_{2}O durante 20 min; TBS 1x durante 20 min y se secaron.

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3. Espectrometría de Masas

Las matrices de péptidos capturados se analizaron por MALDI-TOF-EM exactamente como se describe en el Ejemplo 3. Los espectros de masas MALDI-TOF indican que cada anticuerpo scFv captura sus dianas respectivas; no se observa reacción cruzada con péptidos no relacionados (Figura 10).

La presente invención no se limita en ámbito a las realizaciones específicas descritas en el presente documento. De hecho, diversas modificaciones de la invención, además de las descritas en el presente documento resultarán evidentes para los especialistas en la técnica, a partir de la descripción anterior y las figuras adjuntas.

Debe entenderse también que todos los valores son aproximados y que se proporcionan por descripción.

Claims

1. Un procedimiento para determinar la presencia de una o más proteínas de interés en una muestra, procedimiento que comprende:

a): someter la muestra a condiciones que permiten la fragmentación de las proteínas en fragmentos peptídicos diana; y

b): poner en contacto los fragmentos peptídicos diana con una matriz de agentes de captura inmovilizados, comprendiendo los agentes de captura inmovilizados aquellos que están diseñados para reconocer fragmentos peptídicos diana pronosticados de acuerdo con un protocolo de fragmentación seleccionado de las proteínas de interés; por lo que la unión de los fragmentos peptídicos diana con los agentes de captura es indicativa de la presencia de la proteína o proteínas en la muestra.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los fragmentos peptídicos diana están marcados.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que los agentes de captura son anticuerpos.

4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente determinar la cantidad relativa de las proteínas en la muestra cuantificando la cantidad de los fragmentos peptídicos diana unidos.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la cuantificación de la cantidad de los fragmentos peptídicos diana comprende determinar la cantidad relativa a la cantidad de un fragmento peptídico de una proteína expresada constitutivamente.

6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa a) comprende poner en contacto la muestra con una enzima proteolítica.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la enzima proteolítica es una enzima usada para determinar la escisión enzimática teórica de la proteína.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la enzima proteolítica es una enzima usada para obtener fragmentos peptídicos producidos por escisión enzimática de las proteínas.

9. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la etapa a) comprende poner en contacto la muestra con un agente de escisión química.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el agente de escisión química se usa para determinar la escisión química teórica de la proteína.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el agente de escisión química se usa para obtener secuencias de fragmentos peptídicos producidos por escisión química de las proteínas.

12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente determinar si los fragmentos peptídicos diana comprenden una modificación postraduccional.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la determinación de una modificación postraduccional comprende análisis del espectro de masas.

14. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los agentes de captura plural tienen una afinidad similar por sus fragmentos peptídicos diana respectivos a los que se unen específicamente.

15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra se pretrata para obtener una preparación de proteínas sustancialmente libre de contaminantes.

16. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el pretratamiento comprende uno o más de fraccionamiento, extracción diferencial de fracciones de membrana o citosólicas, reducción selectiva, aplicación a una columna de afinidad.

17. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra se desnaturaliza antes de la proteolisis.

18. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, en el que la muestra se desnaturaliza en guanidina HCl 6 M o urea 6-8 M, Tris-HCl 50 mM (pH 8) y DTT 2-5 mM o 2-mercaptoetanol.

19. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra se pretrata con glucosidasas para eliminar las cadenas laterales de glucosilación.

20. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra se pretrata para eliminar las modificaciones postraduccionales variables que pueden predecirse.

21. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra se somete a una etapa de reducción/alquilación antes de la proteolisis.

22. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que cada uno de dichos agentes de captura es respectivamente altamente específico para una secuencia única.

23. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la matriz comprende dos o más agentes de captura, cada uno específico para un fragmento peptídico diana diferente de una proteína dentro de la muestra.

24. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la matriz comprende dos o más agentes de captura, cada uno específico para un fragmento peptídico diana diferente de la misma o diferentes proteínas dentro de la muestra, en el que dichos dos o más agentes de captura se ponen en el mismo punto en la matriz.

25. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 24, en el que la unión de los fragmentos peptídicos diana con los agentes de captura en b) se determina por MALDI-EM.

26. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que al menos un fragmento peptídico diana comprende una secuencia única para la proteína que se está ensayando.

27. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que al menos un fragmento peptídico diana está presente en una región sometida a modificación postraduccional.