ES2329799T3 - Mimeticuerpos de centro de bisagra mimeticos de epo humana, composiciones, metodos y usos. - Google Patents
Mimeticuerpos de centro de bisagra mimeticos de epo humana, composiciones, metodos y usos. Download PDFInfo
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Abstract
Un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 88.
Description
Mimeticuerpos de centro de bisagra miméticos de
EPO humana, composiciones, métodos y usos.
La presente invención se refiere a mimeticuerpos
de centro de bisagra miméticos de EPO de mamífero, ácidos nucleicos
que codifican mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO y
complementarios, células hospedadoras y métodos para preparar y
usar los mismos, que incluyen formulaciones terapéuticas y usos
médicos.
Las proteínas recombinantes son una clase
emergente de agentes terapéuticos. Tales terapéuticos recombinantes
han suscitado avances en la formulación y modificación química de
proteínas. Tales modificaciones pueden mejorar potencialmente la
utilidad terapéutica de proteínas terapéuticas, tal como aumentando
las semividas (por ejemplo, bloqueando su exposición en enzimas
proteolíticas), mejorando la actividad biológica o reduciendo
efectos secundarios indeseados. Una modificación de este tipo es el
uso de fragmentos de inmunoglobulina fusionados a proteínas de
receptor, tales como enteracept. También se han construido proteínas
terapéuticas que usan el dominio Fc para intentar proporcionar una
semivida más prolongada o para incorporar funciones tales como la
unión a receptor Fc, unión a proteína A y fijación de complemento.
Un papel específico y vital del sistema hematopoyético de mamíferos
es la producción de eritrocitos o glóbulos rojos que transportan
oxígeno a los diversos tejidos del cuerpo del animal. El proceso de
producir eritrocitos ("eritropoyesis") tiene lugar
continuamente a lo largo de la vida de un animal para compensar la
destrucción de eritrocitos. El glóbulo rojo típico tiene una vida
relativamente corta, habitualmente de 100 a 120 días. La
eritropoyesis es un mecanismo fisiológico controlado de forma
precisa, por el que se producen números suficientes de eritrocitos
para permitir la oxigenación tisular apropiada, pero no tantos como
para impedir la circulación.
Ahora se conoce que la eritropoyesis está
controlada principalmente por el polipéptido eritropoyetina (EPO),
una glucoproteína ácida. La eritropoyetina se produce como resultado
de la expresión de un gen de una sola copia localizado en un
cromosoma de un mamífero. La secuencia de aminoácidos para EPO
humana recombinante ("rHuEPO") es sustancialmente idéntica a
la secuencia de aminoácidos para EPO obtenida a partir de fuentes
urinarias humanas. Sin embargo, la glucosilación de rHuEPO difiere
de la de EPO urinaria y EPO sérica humana.
En un mamífero sano, la EPO está presente en el
plasma sanguíneo en concentraciones muy bajas, ya que los tejidos
se oxigenan de forma suficiente por el número existente de
eritrocitos circulantes. La EPO presente estimula la producción de
nuevos eritrocitos para sustituir los perdidos por el proceso de
envejecimiento. Adicionalmente, la producción de EPO está
estimulada en condiciones de hipoxia, en las que el suministro de
oxígeno a los tejidos corporales está reducido por debajo de niveles
fisiológicos normales a pesar de perfusión adecuada del tejido por
la sangre. La hipoxia puede estar provocada por hemorragia,
destrucción de eritrocitos inducida por radiación, diversas
anemias, gran altitud o periodos largos de inconsciencia. Por el
contrario, si el número de glóbulos rojos en circulación supera al
necesario para la oxigenación tisular normal, se reduce la
producción de EPO.
Sin embargo, ciertas patologías implican
eritropoyesis anormal. La EPO humana recombinante (rHuEPO) se está
usando terapéuticamente en varios países. En los Estados Unidos, la
Administración de Alimentos y Fármacos (FDA) de Estados Unidos ha
aprobado el uso de rHuEPO para tratar anemia asociada con enfermedad
renal de estadio final. Los pacientes que se someten a hemodiálisis
para tratar este trastorno típicamente padecen anemia grave,
provocada por la ruptura y muerte prematura de eritrocitos como
resultado del tratamiento de diálisis. La EPO también es útil en el
tratamiento de otros tipos de anemia. Por ejemplo, la anemia
inducida por quimioterapia, anemia asociada con mielodisplasia, las
asociadas con diversos trastornos congénitos, anemia relacionada con
SIDA y anemia asociada con prematuridad, se pueden tratar con EPO.
Adicionalmente, la EPO puede desempeñar un papel en otras áreas,
tales como ayudar a restaurar de forma más rápida un hematocrito
normal en pacientes con trasplante de médula ósea, en pacientes que
se están preparando para transfusiones de sangre autóloga y en
pacientes que padecen trastornos de sobrecarga de hierro.
La eritropoyetina (EPO) es una hormona
glucoproteica compuesta por 165 aminoácidos y cuatro cadenas de
hidratos de carbono que funcionan como el regulador principal de la
eritropoyesis uniéndose a un receptor específico sobre la
superficie de las células precursoras de eritrocitos. Esta unión
señaliza su proliferación y diferenciación en glóbulos rojos
maduros. El receptor de eritropoyetina es una glucoproteína de 484
aminoácidos con alta afinidad por eritropoyetina. Para el receptor
de eritropoyetina, la homodimerización inducida por ligando puede
ser uno de los acontecimientos clave que gobierna la activación.
La eritropoyetina tiene una semivida
relativamente corta. La eritropoyetina administrada por vía
intravenosa se elimina a una velocidad coherente con cinética de
primer orden con una semivida circulante que varía de
aproximadamente 3 a 4 horas en pacientes con CRF. Dentro del
intervalo de dosis terapéutica, se mantienen niveles detectables de
eritropoyetina en plasma durante al menos 24 horas. Después de la
administración subcutánea de eritropoyetina, se consiguen niveles
séricos máximos en el intervalo de 5-24 horas y
disminuyen lentamente después de esto.
Se identificaron pequeños peptidomiméticos de
eritropoyetina por varios grupos mediante exploración de una
biblioteca de péptidos de presentación en fago aleatoria para
afinidad por el receptor de eritropoyetina. Estas secuencias no
tienen homología con eritropoyetina. En ensayos funcionales, varios
de estos péptidos mostraron actividad, pero solamente 1/100.000 de
la eritropoyetina recombinante. Aunque se han realizado varios
intentos para aumentar la potencia de estos péptidos preparando
dímeros o multímeros covalentes de peptidomiméticos, estos
compuestos todavía son 1.000-10.000 veces menos
activos que la eritropoyetina en una base molar y tienen semividas
muy cortas que han hecho que no sean adecuados para uso como
terapéuticos.
Por consiguiente, existe una necesidad de
proporcionar versiones mejoradas y/o modificadas de proteínas
terapéuticas de EPO, que superen uno o más de estos y otros
problemas conocidos en la técnica.
La presente invención proporciona un
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO humana, como se
define en la reivindicación 2, así como una composición de
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO, como se define
en la reivindicación 1, un ácido nucleico codificante o
complementario, vectores, células hospedadoras, composiciones,
métodos para preparar el mimeticuerpo y usos médicos del mismo, de
acuerdo con las reivindicaciones 3 a 11.
El documento WO 00/24782 describe una fusión de
un dominio Fc con un péptido biológicamente activo. El péptido
biológicamente activo puede ser el péptido mimético de EPO
EMP-1 (véase D2, SEC ID Nº: 17-20,
página 110, líneas 1-5).
El documento US 2003/0082749 describe proteínas
de fusión HuEPO-L-vFc (isotipo
\gamma1, \gamma2 o \gamma4) que imitan EPO humana (véase el
párrafo [0002] y la Figura 2C).
Por tanto, el mimeticuerpo de centro de bisagra
mimético de EPO de la presente invención imita al menos una porción
de una estructura o función de anticuerpo o inmunoglobulina con sus
propiedades y funciones inherentes, mientras que proporciona un
péptido terapéutico y sus propiedades o actividades inherentes o
adquiridas in vitro, in vivo o in situ.
La presente invención proporciona, en un
aspecto, moléculas de ácido nucleico aislado que comprenden o
complementarias a un polinucleótido que codifica el mimeticuerpo
específico. La presente invención proporciona además vectores
recombinantes que comprenden las moléculas de ácido nucleico de
mimeticuerpo, células hospedadoras que contienen tales ácidos
nucleicos y/o vectores recombinantes, así como métodos para preparar
y/o usar tales ácidos nucleicos de mimeticuerpo de centro de
bisagra mimético de EPO, vectores y/o células hospedadoras.
El mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de
EPO imita la unión de la porción P del mimeticuerpo a al menos un
ligando o tiene al menos una actividad biológica de al menos una
proteína, subunidad, fragmento, porción o cualquier combinación de
los mismos.
La presente invención también proporciona el
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO, donde el
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO tiene al menos
una actividad, tal como, pero sin limitación, actividades
biológicas conocidas de al menos un péptido o polipéptido bioactivo
que se corresponde a la porción P de la Fórmula I. Por tanto, un
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO se puede explorar
para una actividad correspondiente de acuerdo con métodos
conocidos, tales como al menos una actividad de neutralización con
respecto a una proteína o un fragmento de la misma.
La presente invención también proporciona al
menos una composición que comprende (a) el ácido nucleico que
codifica el mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO
aislado y/o el mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO
como se describe en este documento; y (b) un vehículo o diluyente
adecuado. El vehículo o diluyente puede ser opcionalmente
farmacéuticamente aceptable, de acuerdo con métodos conocidos. La
composición puede comprender además opcionalmente al menos un
compuesto, proteína o composición adicional.
La presente invención también proporciona al
menos un método para expresar el mimeticuerpo de centro de bisagra
mimético de EPO en una célula hospedadora, que comprende cultivar
una célula hospedadora como se describe en este documento y/o como
se conoce en la técnica en condiciones en las que el mimeticuerpo de
centro de bisagra mimético de EPO se expresa en cantidades
detectables y/o recuperables.
La presente invención proporciona además el
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO o la composición
para la administración para el tratamiento de una afección
relacionada con ligando de EPO en un ser humano como se define en
la reivindicación 8.
El mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de
EPO puede ser opcionalmente al menos uno de: proteína de unión con
una afinidad de al menos una seleccionada entre al menos 10^{-9}
M, al menos 10^{-10} M, al menos 10^{-11} M o al menos
10^{-12} M; neutralizar sustancialmente al menos una actividad de
al menos una proteína o porción de la misma. También se proporciona
un ácido nucleico aislado que codifica el mimeticuerpo de centro de
bisagra mimético de EPO humana aislado; un vector de ácido nucleico
aislado que comprende el ácido nucleico aislado y/o una célula
hospedadora procariota o eucariota que comprende el ácido nucleico
aislado. La célula hospedadora puede ser opcionalmente al menos una
seleccionada de células COS-1,
COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1,
Hep G2, 653, SP2/0,293, HeLa, de mieloma o de linfoma o cualquier
célula derivada, inmortalizada o transformada de las mismas.
También se proporciona un método para producir el mimeticuerpo de
centro de bisagra mimético de EPO, que comprende traducir el ácido
nucleico que codifica mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de
EPO en condiciones in vitro, in vivo o in situ, de tal
forma que el mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO se
exprese en cantidades detectables o recuperables.
También se proporciona una composición que
comprende el mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO
humana aislado y al menos un vehículo o diluyente farmacéuticamente
aceptable. La composición puede comprender además opcionalmente una
cantidad eficaz de al menos un compuesto o una proteína seleccionado
de al menos uno de un marcador o indicador detectable, un fármaco
anti-infeccioso, un fármaco de sistema
cardiovascular (CV), un fármaco de sistema nervioso central (SNC),
un fármaco de sistema nervioso autónomo (SNA), un fármaco de vías
respiratorias, un fármaco de tracto gastrointestinal (GI), un
fármaco hormonal, un fármaco para equilibrio de fluidos o
electrolitos, un fármaco hematológico, un antineoplásico, un fármaco
de inmunomodulación, un fármaco oftálmico, ótico o nasal, un
fármaco tópico, un fármaco nutricional, un antagonista de TNF, un
antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, un fármaco
antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un analgésico, un anestésico,
un sedante, un anestésico local, un bloqueante neuromuscular, un
antimicrobiano, un antipsoriático, un corticosteroide, un esteroide
anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una
inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona del crecimiento, un
fármaco de sustitución hormonal, un radiofarmacéutico, un
antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, una medicación de
asma, un beta agonista, un esteroide inhalado, una epinefrina o
análogo, una citocina o un antagonista de citocina.
También se proporciona el mimeticuerpo de centro
de bisagra mimético de EPO humana aislado para tratar una afección
patológica en una célula, un tejido, un órgano o un animal, que
comprende
- (a)
- poner en contacto o administrar una composición que comprende una cantidad eficaz del mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO humana aislado de la invención con o a la célula, el tejido, el órgano o el animal. La composición puede comprender opcionalmente una cantidad eficaz de 0,001-50 mg/kg de las células, el tejido, el órgano o el animal. El mimeticuerpo puede usarse opcionalmente además poniendo en contacto o administrando mediante al menos un modo seleccionado entre parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intra-articular, intrabronquial, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intracelial, intracerebeloso, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocárdico, intraósteo, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniano, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, en embolada, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmico. El mimeticuerpo se puede usar opcionalmente administrando antes, concurrentemente o después de (a) poner en contacto o administrar al menos una composición que comprende una cantidad eficaz de al menos un compuesto o una proteína seleccionada entre al menos uno de un marcador o indicador detectable, un fármaco antiinfeccioso, un fármaco de sistema cardiovascular (CV), un fármaco de sistema nervioso central (SNC), un fármaco de sistema nervioso autónomo (SNA), un fármaco de vías respiratorias, un fármaco de tracto gastrointestinal (GI) un fármaco hormonal, un fármaco para equilibrio de fluido o electrolitos, un fármaco hematológico, un antineoplásico, un fármaco de inmunomodulación, un fármaco oftálmico, ótico o nasal, un fármaco tópico, un fármaco nutricional, un antagonista de TNF, un antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueante neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriático, un corticosteroide, un esteroide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona del crecimiento, un fármaco de sustitución hormonal, un radiofarmacéutico, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, una medicación de asma, un beta agonista, un esteroide inhalado, una epinefrina o análogo, una citocina o un antagonista de citocina.
La presente invención proporciona un
mimeticuerpo aislado, recombinante y/o sintético como se define en
la reivindicación 2 así como composiciones y moléculas de ácido
nucleico codificantes que comprenden al menos un polinucleótido que
codifica el mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO. Como
se usa en este documento un "mimeticuerpo de centro de bisagra
mimético de EPO" imita, tiene o simula al menos una unión a
ligando o al menos una actividad biológica de al menos una
proteína, tal como unión o actividad de ligando in vitro, in
situ y/o preferiblemente in vivo, tal como, pero sin
limitación, al menos una de las SEC ID Nº: 1-30.
Por ejemplo, el mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO
puede unirse al menos a un ligando de proteína e incluye al menos
un ligando de proteína, receptor, receptor soluble y similares. El
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO adecuado también
puede modular, aumentar, modificar, activar al menos una
señalización de receptor de proteína u otra actividad medible o
detectable.
El mimeticuerpo de la presente invención está
caracterizado por una afinidad de unión adecuada a ligandos de
proteína o receptores y que tiene opcionalmente y preferiblemente
una baja toxicidad. En particular, el mimeticuerpo de centro de
bisagra mimético de EPO posee preferiblemente baja inmunogenicidad.
El mimeticuerpo que se puede usar en la invención está
caracterizado opcionalmente por su capacidad de tratar pacientes
durante periodos prolongados con alivio de bueno a excelente de
síntomas y baja toxicidad. La baja inmunogenicidad y/o alta
afinidad, así como otras propiedades indefinidas, pueden contribuir
a los resultados terapéuticos conseguidos. La "baja
inmunogenicidad" se define en este documento como el aumento
significativo de respuestas HAMA, HACA o HAHA de menos de
aproximadamente el 75% o preferiblemente menos de aproximadamente el
50, 45, 40, 35, 30, 35, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 y/o 1%
de los pacientes tratados y/o el aumento de bajos títulos en el
paciente tratado (menor de aproximadamente 300, preferiblemente
menor de aproximadamente 100 medido con un inmunoensayo enzimático
de doble antígeno) (véase, por ejemplo, Elliott et al.,
Lancet 344 : 1125-1127 (1994)).
Los ácidos nucleicos aislados de la presente
invención se pueden usar para la producción de mimeticuerpo de
centro de bisagra mimético de EPO que se puede usar para actuar en
una célula, un tejido, un órgano o un animal (que incluye mamíferos
y seres humanos), para modular, tratar, aliviar, ayudar a evitar la
incidencia o reducir los síntomas de al menos una afección
relacionada con proteína, seleccionada entre, pero sin limitación,
al menos uno de un trastorno inmune CEN5039PCT o enfermedad, un
trastorno o enfermedad cardiovascular, un trastorno o una
enfermedad infecciosa, maligna y/o neurológica, una anemia; una
enfermedad inmune/autoinmune; y/o un cáncer/infección, así como
otras afecciones relacionadas con proteína conocidas o
especificadas.
El mimeticuerpo se puede administrar en una
cantidad eficaz en una composición o una composición farmacéutica
que comprende el mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO a
una célula, un tejido, un órgano, un animal o un paciente que
necesite tal modulación, tratamiento, alivio, prevención o reducción
de síntomas, efectos o mecanismos. La cantidad eficaz puede
comprender una cantidad de aproximadamente 0,0001 a 500 mg/kg por
administración única o múltiple, o para conseguir una concentración
sérica de 0,0001-5000 \mug/ml de concentración
sérica por administración única o múltiple o cualquier intervalo
eficaz o valor en el mismo, como se realiza y determina usando
métodos conocidos, como se describe en este documento o se conoce en
la técnica pertinente.
Todas las publicaciones o patentes citadas en
este documento muestran el estado de la técnica en el momento de la
presente invención y/o para proporcionar descripción y permitir la
presente invención. Las publicaciones se refieren a cualquier
publicación científica o de patente o a cualquier otra información
disponible en cualquier formato de medio, incluyendo todos los
formatos registrados, electrónicos o impresos. Las publicaciones
incluyen: Ausubel, et al., ed., Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY
(1987-2003); Sambrook, et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, segunda Edición, Cold Spring Harbor,
NY (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current
Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY
(1994-2003); Colligan et al., Current
Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY,
(1997-2003).
El mimeticuerpo de la presente invención
proporciona por tanto al menos una propiedad adecuada en comparación
con proteínas conocidas, tales como, pero sin limitación, al menos
una de semivida aumenta, actividad aumentada, actividad más
específica, avidez aumentada, velocidad de disociación aumentada o
disminuida, un subconjunto seleccionado o más adecuado de
actividades, menor inmungenicidad, calidad o duración aumentada de
al menos un efecto terapéutico deseado, menos efectos secundarios y
similares.
En una realización preferida, el mimeticuerpo de
centro de bisagra mimético de EPO de la presente invención se
produce por al menos una línea celular, línea celular mixta,
población de células inmortalizadas o clonal de células
inmortalizadas y/o cultivadas. Las células productoras de proteína
inmortalizada se pueden producir usando métodos adecuados.
Preferiblemente, el mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de
EPO se genera proporcionando ácido nucleico o vectores que
comprenden ADN obtenido o que tiene una secuencia sustancialmente
similar a al menos un locus de inmunoglobulina humana que está
redispuesto funcionalmente o que se puede someter a redisposición
funcional y que comprende además la estructura de mimeticuerpo como
se describe en este documento.
La expresión "redispuesto funcionalmente"
como se usa en este documento se refiere a un segmento de ácido
nucleico de un locus de inmunoglobulina que se ha sometido a
recombinación V (D) J, produciendo de este modo un gen de
inmunoglobulina que codifica una cadena de inmunoglobulina (por
ejemplo, cadena pesada) o cualquier porción de la misma. Un gen de
inmunoglobulina redispuesto funcionalmente se puede identificar
directamente o indirectamente usando métodos adecuados tales como,
por ejemplo, secuenciación de nucleótidos, hibridación (por
ejemplo, transferencia de Southern, transferencia de Northern)
usando sondas que pueden hibridar con uniones codificantes entre
segmentos génicos o amplificación enzimática de genes de
inmunoglobulina (por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa)
con cebadores que pueden hibridar con uniones codificantes entre
segmentos génicos. Si una célula produce el mimeticuerpo de centro
de bisagra mimético de EPO que comprende una región variable
particular o una región variable que comprende una secuencia
particular (por ejemplo, al menos una secuencia P) también se puede
determinar usando métodos adecuados.
El mimeticuerpo de la presente invención también
se puede preparar usando el ácido nucleico que codifica mimeticuerpo
de centro de bisagra mimético de EPO para proporcionar animales o
mamíferos transgénicos, tales como cabras, vacas, caballos, ovejas
y similares, que producen el mimeticuerpo en su leche. Tales
animales se pueden proporcionar usando métodos conocidos como se
aplica para secuencias que codifican anticuerpo. Véase, por ejemplo,
pero sin limitación, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.827.690;
5.849.992; 4.873.316; 5.849.992; 5.994.616; 5.565.362; 5.304.489 y
similares.
El mimeticuerpo de la presente invención se
puede preparar adicionalmente usando al menos un ácido nucleico que
codifica mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO para
proporcionar plantas transgénicas y células vegetales cultivadas
(por ejemplo, pero sin limitación, tabaco y maíz) que producen tales
mimeticuerpos en las partes vegetales o en células cultivadas a
partir de las mismas. Como un ejemplo no limitante, las hojas de
tabaco transgénico que expresan proteínas recombinantes se han usado
de forma exitosa para proporcionar grandes cantidades de proteínas
recombinantes, por ejemplo, usando un promotor inducible. Véase, por
ejemplo, Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:
95-118 (1999) y referencias citadas en ese
documento. Además se ha usado maíz o trigo transgénico para
expresar proteínas de mamífero a niveles de producción comercial,
con actividades biológicas equivalentes a las producidas en otros
sistemas recombinantes o purificados de fuentes naturales. Véase,
por ejemplo, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol. 464:
127-147 (1999) y referencias citadas en ese
documento. También se han producido los anticuerpos en grandes
cantidades a partir de semillas de planta transgénica que incluyen
fragmentos de anticuerpo, tales como mimeticuerpos de cadena única
(scFv), que incluyen semillas de tabaco y tubérculos de patata.
Véase, por ejemplo, Conrad et al., Plant Mol. Biol. 38:
101-109 (1998) y referencias citadas en ese
documento. Por tanto, el mimeticuerpo de la presente invención
también se puede producir usando plantas transgénicas, de acuerdo
con métodos conocidos. Véase también, por ejemplo, Fischer et
al., Biotechnol. Appl. Biochem. 30: 99-108
(Oct., 1999), Ma et al., Trends Biotechnol. 13:
522-7 (1995), Ma et al., Plant Physiol. 109:
341-6 (1995); Whitelam et al., Biochem. Soc.
Trans. 22: 940-944 (1994) y referencias citadas en
ese documento.
El mimeticuerpo de la invención puede unirse a
ligandos de proteína humana con un amplio intervalo de afinidades
(K_{D}). En una realización preferida, el mimeticuerpo de centro
de bisagra mimético de EPO de la presente invención puede unirse
opcionalmente al menos a un ligando de proteína con alta afinidad.
Por ejemplo, el mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO
de la presente invención puede unirse al menos a un ligando de
proteína con una K_{D} igual a o inferior a aproximadamente
10^{-7} M o, más preferiblemente con una K_{D} igual a o menor
de aproximadamente 0,1-9,9 (o cualquier intervalo o
valor en el mismo) X 10^{-7}, 10^{-8}, 10^{-9}, 10^{-10},
10^{-11}, 10^{-12} o 10^{-13} M o cualquier intervalo o valor
en el mismo.
La afinidad o avidez del mimeticuerpo de centro
de bisagra mimético de EPO por al menos un ligando de proteína se
puede determinar experimentalmente usando cualquier método adecuado,
por ejemplo, como se usa para determinar afinidad o avidez de unión
de anticuerpo-antígeno. (Véase, por ejemplo,
Berzofsky, et al. "Antibody-Antigen
Interactions", en Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven
Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immulology, W. H. Freeman
and Company: New York, NY (1992); y métodos descritos en este
documento). La afinidad medida de la interacción de mimeticuerpo de
centro de bisagra mimético de EPO- ligando puede variar si se mide
en diferentes condiciones (por ejemplo, concentración salina, pH).
Por tanto, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión a
ligando (por ejemplo, K_{D}, K_{n}, K_{d}) se realizan
preferiblemente con soluciones normalizadas de mimeticuerpo de
centro de bisagra mimético de EPO y ligando y un tampón normalizado,
tal como el tampón descrito en este documento.
Mediante el uso de la información proporcionada
en este documento, tal como las secuencias de nucleótidos que
codifican al menos el 90-100% de los aminoácidos
contiguos de al menos una de la SEC ID Nº: 1-30 así
como al menos una porción de un anticuerpo, en el que las
anteriores secuencias se insertan como la secuencia P de Fórmula
(I) para proporcionar el mimeticuerpo de centro de bisagra mimético
de EPO de la presente invención, o un vector depositado que
comprende al menos una de estas secuencias, se puede obtener una
molécula de ácido nucleico de la presente invención que codifica el
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO usando métodos
descritos en este documento o como se conocen en la técnica.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente
invención pueden estar en forma de ARN, tal como ARNm, ARNhn, ARNt
o cualquier otra forma, o en forma de ADN, que incluye, pero sin
limitación, ADNc y ADN genómico obtenido por clonación o producido
de forma sintética o cualquier combinación de los mismos. El ADN
puede ser tricatenario, bicatenario o monocatenario o cualquier
combinación de los mismos. Cualquier porción de al menos una cadena
del ADN o ARN puede ser la cadena codificante, también conocida como
la cadena con sentido, o puede ser la cadena no codificante,
también denominada la cadena antisentido.
Las moléculas de ácido nucleico aislado de la
presente invención pueden incluir moléculas de ácido nucleico que
comprenden una fase de lectura abierta (ORF), opcionalmente con uno
o más intrones, moléculas de ácido nucleico que comprenden la
secuencia codificante para el mimeticuerpo de centro de bisagra
mimético de EPO; y moléculas de ácido nucleico que comprenden una
secuencia de nucleótidos sustancialmente diferente de las que se
han descrito anteriormente pero que, debido a la degeneración del
código genético, todavía codifican el mimeticuerpo de centro de
bisagra mimético de EPO como se describe en este documento y/o como
se conoce en la técnica. Por supuesto, el código genético se conoce
bien en la técnica. Por tanto, sería rutinario para un especialista
en la técnica generar tales variantes de ácido nucleico degenerado
que codifiquen el mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO
de la presente invención. Véase, por ejemplo, Ausubel, et
al., anteriormente y tales variantes de ácido nucleico están
incluidas en la presente invención.
Como se indica en este documento, las moléculas
de ácido nucleico de la presente invención que comprenden un ácido
nucleico que codifica el mimeticuerpo de centro de bisagra mimético
de EPO pueden incluir, pero sin limitación, los que codifican la
secuencia de aminoácidos del fragmento de mimeticuerpo de centro de
bisagra mimético de EPO, por sí mismo; la secuencia codificante
para todo el mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO; la
secuencia codificante para el mimeticuerpo de centro de bisagra
mimético de EPO así como secuencias adicionales, tales como la
secuencia codificante de al menos un péptido líder señal o de
fusión, con o sin las secuencias codificantes adicionales que se
han mencionado anteriormente, tales como al menos un intrón, junto
con secuencias adicionales, no codificantes, que incluyen, pero sin
limitación, secuencias 5' y 3' no codificantes, tales como las
secuencias transcritas, no traducidas que desempeñan un papel en la
transcripción, el procesamiento de ARNm, incluyendo corte y empalme
y señales de poliadenilación (por ejemplo, unión a ribosoma y
estabilidad de ARNm); una secuencia codificante adicional que
codifica aminoácidos adicionales, tales como los que proporcionan
funcionalidades adicionales. Por tanto, la secuencia que codifica el
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO se puede fusionar
con una secuencia de marcador, tal como una secuencia que codifica
un péptido que facilita la purificación del mimeticuerpo de centro
de bisagra mimético de EPO fusionado.
Los ácidos nucleicos aislados de la presente
invención se pueden preparar usando (a) métodos recombinantes, (b)
técnicas sintéticas, (c) técnicas de purificación o combinaciones de
las mismas, como se conoce bien en la técnica.
Los ácidos nucleicos pueden comprender de forma
conveniente secuencias además de un polinucleótido de la presente
invención. Por ejemplo, un sitio multi-clonación que
comprende uno o más sitios de endonucleasa de restricción se puede
insertar en el ácido nucleico para ayudar al aislamiento del
polinucleótido. Además, se pueden insertar secuencias que se pueden
traducir para ayudar al aislamiento del polinucleótido traducido de
la presente invención. Por ejemplo, una secuencia de marcador
hexa-histidina proporciona un medio conveniente para
purificar las proteínas de la presente invención. El ácido nucleico
de la presente invención- excluyendo la secuencia codificante- es
opcionalmente un vector, adaptador o enlazador para la clonación y/o
expresión de un polinucleótido de la presente invención.
Se pueden añadir secuencias adicionales a tales
secuencias de clonación y/o expresión para optimizar su función en
la clonación y/o expresión, para ayudar al aislamiento del
polinucleótido o para mejorar la introducción del polinucleótido en
una célula. El uso de vectores de clonación, vectores de expresión,
adaptadores y enlazadores se conoce bien en la técnica. Véase, por
ejemplo, Ausubel, anteriormente; o Sambrook, anteriormente.
Las composiciones de ácido nucleico aislado de
esta invención, tales como ARN, ADNc, ADN genómico o cualquier
combinación de los mismos, se pueden obtener a partir de fuentes
biológicas mediante el uso de cualquier número de metodologías de
clonación conocidas por los especialistas en la técnica. En algunas
realizaciones, se usan sondas oligonucleotídicas que hibridan
selectivamente, en condiciones de rigurosidad adecuada, con los
polinucleótidos de la presente invención, para identificar la
secuencia deseada en una genoteca de ADNc o ADN genómico. El
aislamiento de ARN y la construcción de genotecas de ADNc y
genómico, se conoce bien por los especialistas habituales en la
técnica. (Véase, por ejemplo, Ausubel, anteriormente; o Sambrook,
anteriormente).
Los ácidos nucleicos aislados de la presente
invención también se pueden preparar mediante síntesis química
directa mediante métodos conocidos (véase, por ejemplo, Ausubel,
et al., anteriormente). La síntesis química produce
generalmente un oligonucleótido monocatenario, que se puede
convertir en ADN bicatenario por hibridación con una secuencia
complementaria o mediante polimerización con una ADN polimerasa
usando la cadena sencilla como un molde. El especialista en la
técnica reconocerá que mientras que la síntesis química de ADN se
puede limitar a secuencias de aproximadamente 100 o más bases, se
pueden obtener secuencias más largas mediante la ligación de
secuencias más cortas.
La presente invención proporciona además casetes
de expresión recombinantes que comprenden un ácido nucleico de la
presente invención. Una secuencia de ácido nucleico de la presente
invención, por ejemplo, una secuencia de ADNc o genómico que
codifica el mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO de la
presente invención, se puede usar para construir un casete de
expresión recombinante que se puede introducir en al menos una
célula hospedadora deseada. Un casete de expresión recombinante
comprenderá típicamente un polinucleótido de la presente invención
unido operativamente a secuencias reguladoras del inicio de la
transcripción que dirigirán la transcripción del polinucleótido en
la célula hospedadora deseada. Se pueden emplear promotores tanto
heterólogos como no heterólogos (es decir, endógenos) para dirigir
la expresión de los ácidos nucleicos de la presente invención.
En algunas realizaciones, se pueden introducir
ácidos nucleicos aislados que sirven como promotor, potenciador u
otros elementos en la posición apropiada (cadena arriba, cadena
abajo o en un intrón) de una forma no heteróloga de un
polinucleótido de la presente invención a fin de regular
positivamente o negativamente la expresión de un polinucleótido de
la presente invención. Por ejemplo, los promotores endógenos se
pueden alterar in vivo o in vitro mediante mutación,
deleción y/o sustitución, como se conoce la técnica. Un
polinucleótido de la presente invención se puede expresar en
orientación con sentido o anti-sentido como se
desee. Se entenderá que el control de la expresión génica en
orientación con sentido o anti-sentido puede tener
un impacto directo sobre las características observables. Otro
método de supresión es la supresión con sentido. La introducción
del ácido nucleico configurado en la orientación con sentido se ha
demostrado que es un medio eficaz por el que bloquear la
transcripción de genes diana.
La presente invención también se refiere a
vectores que incluyen moléculas de ácido nucleico aislado de la
presente invención, células hospedadoras que están modificadas
genéticamente con los vectores recombinantes y la producción del
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO mediante técnicas
recombinantes, como se conoce bien en la técnica. Véase, por
ejemplo, Sambrook, et al., anteriormente; Ausubel, et
al., anteriormente.
Los polinucleótidos se pueden unir opcionalmente
a un vector que contiene un marcador de selección para la
propagación en un hospedador. Generalmente, un vector plasmídico se
introduce en una célula usando métodos conocidos adecuados, tales
como electroporación y similares, otros métodos conocidos incluyen
el uso del vector como un precipitado, tal como un precipitado de
fosfato cálcico o en un complejo con un lípido cargado. Si el
vector es un virus, se puede empaquetar in vitro usando una
línea celular de empaquetamiento apropiada y después introducir por
transducción en células hospedadoras.
El inserto de ADN debe unirse operativamente a
un promotor apropiado. Las construcciones de expresión contendrán
además sitios opcionalmente para al menos uno de un sitio de inicio
de la transcripción, terminación y, en la región transcrita, un
sitio de unión a ribosoma para la traducción. La porción codificante
de los transcritos maduros expresados por las construcciones
incluirá preferiblemente un inicio de la traducción al comienzo y
un codón de terminación (por ejemplo, UAA, UGA o UAG) colocado de
forma apropiada en el extremo del ARNm a traducir, prefiriéndose
UAA y UAG para expresión de células de mamífero o eucariotas.
Los vectores de expresión incluirán
preferiblemente, pero opcionalmente al menos un marcador de
selección. Tales marcadores incluyen, por ejemplo, pero sin
limitación, resistencia a metotrexato (MTX), dihidrofolato
reductasa (DHFR, Patentes de Estados Unidos Nº 4.399.216; 4.634.665;
4.656.134; 4.956.288; 5.149.636; 5.179.017, ampicilina, neomicina
(G418), ácido micofenólico o glutamina sintetasa (GS, Patentes de
Estados Unidos Nº 5.122.464; 5.770.359; 5.827.739) para cultivo de
células eucariotas y genes de resistencia a tetraciclina o
ampicilina para cultivar en E. coli y otras bacterias o
procariotas. Los medios y las condiciones de cultivo apropiados
para las células hospedadoras se han descrito anteriormente se
conocen en la técnica. Los vectores adecuados serán fácilmente
evidentes para el técnico especialista. La introducción de una
construcción de vector en una célula hospedadora se puede realizar
por transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por
DEAE-dextrano, transfección mediada por lípido
catiónico, electroporación, transducción, infección u otros métodos
conocidos. Tales métodos se describen en la técnica, tales como
Sambrook, anteriormente, en los capítulos 1-4 y
16-18; Ausubel, anteriormente, capítulos 1, 9, 13,
15, 16.
El mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de
EPO de la presente invención se puede expresar en una forma
modificada, tal como una proteína de fusión, y pueden incluir no
solamente señales de secreción, sino también regiones funcionales
heterólogas adicionales. Por ejemplo, se puede añadir una región de
aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, al
extremo N de un mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO o
porción o variante especificada para mejorar la estabilidad y
persistencia en la célula hospedadora, durante la purificación o
durante el manejo y el almacenamiento posterior. Además, se pueden
añadir restos peptídicos al mimeticuerpo de centro de bisagra
mimético de EPO de la presente invención para facilitar la
purificación. Tales regiones se pueden eliminar antes de la
preparación del mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO.
Tales métodos se describen en muchos manuales de laboratorio
convencionales, tales como Sambrook, anteriormente, capítulos
17.29-17. 42 y 18.1-18.74; Ausubel,
anteriormente, capítulos 16, 17 y 18.
Los especialistas habituales en la técnica están
entendidos en los numerosos sistemas de expresión disponibles para
la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína de la
presente invención.
Son ilustrativas de cultivos celulares útiles
para la producción del mimeticuerpo las células de mamífero. Los
sistemas de células de mamífero con frecuencia estarán en forma de
monocapas de células aunque también se pueden usar suspensiones o
biorreactores de células de mamífero. En la técnica se han
desarrollado varias líneas de células hospedadoras adecuadas
capaces de expresar proteínas glucosiladas intactas e incluyen las
líneas celulares COS-1 (por ejemplo, ATCC CRL 1650),
COS-7 (por ejemplo, ATCC CRL-1651),
HEK293, BHK21 (por ejemplo, ATCC CRL-10), CHO (por
ejemplo, ATCC CRL 1610, DG-44) y
BSC-1 (por ejemplo, ATCC CRL-26),
células hepG2, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, células
293, células HeLa y similares, que están disponibles de forma
sencilla a partir de, por ejemplo, la Colección Americana de
Cultivos Tipo, Manassas, Va. Las células hospedadoras preferidas
incluyen células de origen linfoide tales como células de mieloma y
linfoma. Las células hospedadoras particularmente preferidas son
células P3X63Ag8.653 (Número de acceso de ATCC
CRL-1580) y células SP2/0-Ag14
(Número de acceso de ATCC CRL-1851).
Los vectores de expresión para estas células
pueden incluir una o más de las siguientes secuencias de control de
la expresión, tales como, pero sin limitación, un origen de
replicación; un promotor (por ejemplo, promotores de SV40 tardío o
temprano, el promotor de CMV (por ejemplo, Patentes de Estados
Unidos Nº 5.168.062; 5.385.839), un promotor de tk de HSV, un
promotor de pgk (fosfoglicerato cinasa), un promotor de
EF-1 alfa (por ejemplo, Patente de Estados Unidos
Nº 5.266.491), al menos un promotor de inmunoglobulina humana; un
potenciador y/o sitios de información de procesamiento, tales como
sitios de unión a ribosoma, sitios de corte y empalme de ARN,
sitios de poliadenilación (por ejemplo, un sitio de adición de poli
A de Ag T grande de SV40) y secuencias terminadoras de la
transcripción. Véase, por ejemplo, Ausubel et al.,
anteriormente; Sambrook, et al., anteriormente. Otras
células útiles para la producción de ácidos nucleicos o proteínas de
la presente invención se conocen y/o están disponibles, por
ejemplo, a partir del Catálogo de Líneas Celulares e Hibridomas de
la Colección Americana de Cultivo Tipo (www.atcc.org) u otras
fuentes conocidas o comerciales.
Cuando se emplean células hospedadoras
eucariotas, se incorporan típicamente secuencias de poliadenilación
o de terminación de la transcripción en el vector. Un ejemplo de una
secuencia terminadora es la secuencia de poliadenilación del gen de
la hormona de crecimiento bovina. También se pueden incluir
secuencias para el corte y empalme preciso del transcrito. Un
ejemplo de una secuencia de corte y empalme es el intrón VP1 de
SV40 (Sprague, et al., J. Virol. 45: 773-781
(1983)). Adicionalmente se pueden incorporar en el vector
secuencias génicas para controlar la replicación en la célula
hospedadora, como se conoce en la técnica. Purificación del
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO.
El mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de
EPO se puede recuperar y purificar a partir de cultivos de células
recombinantes mediante métodos bien conocidos que incluyen, pero sin
limitación, purificación en proteína A, precipitación con sulfato
de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de
intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa,
cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad,
cromatografía con hidroxiapatita y cromatografía de lectina. También
se puede emplear para la purificación cromatografía líquida de alto
rendimiento ("HPLC"). Véase, por ejemplo, Colligan, Current
Protocols in Immunology, o Current Protocols in Protein Science,
John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2003), por
ejemplo, capítulos 1, 4, 6, 8, 9, 10. El mimeticuerpo de la
presente invención incluye productos purificados naturalmente,
productos de procedimientos sintéticos químicos y productos
producidos mediante técnicas recombinantes a partir de un
hospedador eucariota, incluyendo, por ejemplo, células de levadura,
planta superior, insecto y mamífero. Dependiendo del hospedador
empleado en un procedimiento de producción recombinante, el
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO de la presente
invención puede estar glucosilado o no glucosilado, prefiriéndose el
glucosilado. Tales métodos se describen en muchos manuales de
laboratorio convencionales, tales como Sambrook, anteriormente,
Secciones 17.37-17.42; Ausubel, anteriormente,
capítulos 10, 12, 13, 16, 18 y 20, Colligan, Protein Science,
anteriormente, Capítulos 12-14.
El mimeticuerpo aislado de la presente invención
comprende un mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO
codificado por uno cualquiera de los polinucleótidos de la presente
invención como se analiza más completamente en este documento o
cualquier mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO aislado
o preparado.
Preferiblemente, el mimeticuerpo de centro de
bisagra mimético de EPO se une al menos a un ligando o receptor de
proteína EPO y, de este modo, proporciona al menos una actividad
biológica de EPO de la proteína correspondiente o un fragmento de
la misma. En la técnica se conocen bien diferentes proteínas
terapéuticamente o diagnósticamente significativas y también se
conocen bien en la técnica ensayos adecuados o actividades
biológicas de tales proteínas.
Los ejemplos no limitantes de péptidos miméticos
de EPO adecuados para esta invención aparecen en la siguiente Tabla
1. Estos péptidos se pueden preparar mediante métodos descritos y/o
conocidos en la técnica. Se usan en la mayoría de los casos
abreviaturas de aminoácidos de una sola letra. La X en estas
secuencias (y a lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que
se especifique de otro modo en un caso particular) significa que
cualquiera de los 20 restos aminoacídicos de origen natural o
conocidos o derivados conocidos de los mismos puede estar presente
o cualquier aminoácido modificado conocido de los mismos. Cualquiera
de estos péptidos puede estar unido en tándem (es decir,
secuencialmente), con o sin enlazadores y en la tabla se
proporcionan unos pocos ejemplos unidos en tándem. Los enlazadores
se enumeran como "\Delta" y pueden ser cualquiera de los
enlazadores descritos en este documento. Las repeticiones en tándem
y los enlazadores se muestran separados por línea discontinua por
motivos de claridad. Cualquier péptido que contenga un resto
cisteinilo puede estar reticulado opcionalmente con otro péptido
que contenga Cys, cualquiera de los cuales o ambos pueden estar
unidos a un vehículo. En la tabla se proporcionan unos pocos
ejemplos reticulados. Cualquier péptido que tenga más de un resto
Cys puede formar un enlace disulfuro intrapeptídico, así mismo;
véase, por ejemplo, péptidos miméticos de EPO en la Tabla 1. En la
tabla se especifican unos pocos ejemplos de péptidos enlazados por
disulfuro intrapeptídicos. Cualquiera de estos péptidos se pueden
derivatizar como se describe en este documento y en la tabla se
proporcionan unos pocos ejemplos derivatizados. Para derivados en
los que el extremo carboxilo puede estar protegido con un grupo
amino, el grupo amino de protección terminal se muestra como
-NH_{2}. Para derivados en los que los restos aminoacídicos están
sustituidos por restos diferentes de restos aminoacídicos, las
sustituciones se indican por una \delta, que significa cualquiera
de los restos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se
describe en Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39:
3814-9 y Cuthbertson et al. (1997), J. Med.
Chem. 40: 2876-82.
El sustituyente J y los sustituyentes Z
(Z_{5}, Z_{6}, ... Z_{40}) son como se definen en las Patentes
de Estados Unidos Nº 5.608.035, 5.786.331 y 5.880.096. Para las
secuencias miméticas de EPO (Tabla 1), los sustituyentes X_{2} a
X_{n} y el número entero "n" son como se definen en el
documento WO 96/40772.
Los restos que aparecen en negrita son
D-aminoácidos, pero opcionalmente pueden ser
L-aminoácidos. Todos los péptidos están unidos
mediante enlaces peptídicos a menos que se señale de otro modo. Las
abreviaturas se enumeran al final de esta memoria descriptiva. En
la columna de "SEC ID Nº", "NR" significa que no se
requiere ninguna lista de secuencias para la secuencia dada.
\vskip1.000000\baselineskip
En la técnica se conocen bien las actividades
biológicas de EPO. Véase, por ejemplo, Anagnostou A et al
Erythropoietin has a mitogenic and positive chemotactic effect on
endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Science
(USA) 87: 5978-82 (1990); Fandrey J y Jelkman WE
Interleukin 1 and tumor necrosis factor-alpha
inhibit erythropoietin production in vitro. Annals of the New
York Academy of Science 628: 250-5 (1991); Geissler
K et al Recombinant human erythropoietin: A multipotential
hemopoietic growth factor in vivo and in vitro.
Contrib. Nephrol. 87: 1-10 (1990); Gregory CJ
Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the
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in culture. Journal of Cellular Physiology 89:
289-301 (1976); Jelkman W et al Monokines
inhibiting erythropoietin production in human hepatoma cultures and
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recombinant erythropoietin directly stimulates B cell
immunoglobulin production and proliferation in
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Immunology 85: 151-6 (1991); Kimata H et al
Erythropoietin enhances immunoglobulin production and proliferation
by human plasma cells in a serum-free medium. Clin.
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IgE production in vitro Clinical and Experimental Immunology
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Erythropoietin retards DNA breakdown and prevents programmed cell
death in erythroid progenitor cells. Science 248:
378-81 (1990); Lim VS et al Effect of
recombinant human erythropoietin on renal function in humans. Kidney
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of human erythroid leukemic cells in vitro. Journal of
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erythropoietin and results for specimens from anemic and
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erythropoietin immunoprecipitation assay: application to
pharmacokinetic studies. Journal of Lab. Clin. Med. 119:
285-94 (1992); para información adicional véase
también líneas celulares individuales usadas en bioensayos
individuales.
La EPO se puede ensayar empleando líneas
celulares, tales como HCD57, NFS-60,
TF-1 y UT-7, que responden al
factor. La actividad de EPO se puede ensayar también en un ensayo de
formación de colonias determinando el número de
CFU-E de células de médula ósea. Un método de
detección alternativo y completamente diferente es la
cuantificación por RT-PCR de citocinas.
El mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de
EPO que proporciona parcialmente o preferiblemente sustancialmente
al menos una actividad biológica de al menos una proteína o un
fragmento, puede unirse al ligando de proteína o fragmento y
proporcionar de este modo al menos una actividad que de otro modo
está mediada por la unión de la proteína a al menos un ligando o
receptor de proteína o mediante otros mecanismos dependientes o
mediados por proteína. Como se usa en este documento, la expresión
"actividad de mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de
EPO" se refiere a un mimeticuerpo de centro de bisagra mimético
de EPO que puede modular o provocar al menos una actividad
dependiente de proteína de aproximadamente el
20-10.000%, preferiblemente de al menos
aproximadamente el 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,
99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250,
300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000,
4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000% o más dependiendo del
ensayo.
La capacidad del mimeticuerpo de centro de
bisagra mimético de EPO de proporcionar al menos una actividad
dependiente de proteína se ensaya preferiblemente mediante al menos
un ensayo biológico de proteína adecuado, como se describe en este
documento y/o como se conoce en la técnica.
El mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de
EPO de la invención se une al menos a un ligando especificado
específico para al menos una proteína, subunidad, fragmento, porción
o cualquier combinación de los mismos. El péptido mimético de EPO
del mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO de la presente
invención puede unirse opcionalmente al menos a un epítopo de
ligando especificado del ligando. El epítopo de unión puede
comprender cualquier combinación de al menos una secuencia de
aminoácidos de al menos 1-3 aminoácidos hasta la
porción especificada completa de aminoácidos contiguos de las
secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en un ligando
de proteína, tal como un receptor de EPO o una porción del
mismo.
Tales mimeticuerpos se pueden preparar uniendo
entre sí las diversas porciones de la Fórmula (I) del mimeticuerpo
de centro de bisagra mimético de EPO usando técnicas conocidas,
preparando y expresando al menos una molécula de ácido nucleico (es
decir, una o más) que codifique el mimeticuerpo de centro de bisagra
mimético de EPO, usando técnicas conocidas de tecnología de ADN
recombinante o mediante el uso de cualquier otro método adecuado,
tal como síntesis química.
Los mimeticuerpos que se unen a ligandos o
receptores de EPO humana y que comprenden al menos una porción
definida región variable de cadena pesada o ligera se pueden
preparar usando métodos adecuados, tales como presentación en fagos
(Katsube, Y., et al., Int. J Mol. Med, 1 (3):
863-868 (1998)) o métodos que empleen animales
transgénicos, como se conoce en la técnica y/o como se describe en
este documento. El mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de
EPO se puede expresar usando el ácido nucleico codificante o porción
del mismo en una célula hospedadora adecuada.
Preferiblemente, tales mimeticuerpo o fragmentos
de unión a ligando de los mismos pueden unirse a ligandos o
receptores de EPO humana con alta afinidad (por ejemplo, K_{D}
menor de o igual a aproximadamente 10^{-7} M).
Los aminoácidos que establecen el mimeticuerpo
de la presente invención con frecuencia están abreviados. Las
denominaciones de aminoácidos se pueden indicar nombrando el
aminoácido por su código de una sola letra, su código de tres
letras, nombre o codón o codones de tres nucleótidos como se
entiende en la técnica (véase Alberts, B., et al. Molecular
Biology of The Cell, Tercera ed., Garland Publishing, Inc., Nueva
York, 1994), como se presenta en la Tabla.
La siguiente descripción de los componentes del
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO de la presente
invención está basada en el uso de la fórmula I,
((V(m)-P(n)-L(o)-H(p)-CH2(q)-CH3(r))(s),
en la que V es al menos una porción
de un extremo N de una región variable de inmunoglobulina, P es al
menos un péptido bioactivo, L es al menos un polipéptido enlazador,
H es al menos una porción de al menos una región bisagra de
inmunoglobulina, CH2 es al menos una porción de una región constante
CH2 de inmunoglobulina, CH3 es al menos una porción de una región
constante CH3 de inmunoglobulina, m, n, o, p, q, r y s son
independientemente un número entero entre 0, 1 ó 2 y 10 que imitan
diferentes tipos de moléculas de inmunoglobulina, por ejemplo, pero
sin limitación, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD, IgE y
similares o cualquier subclase de los mismos o cualquier
combinación de los
mismos.
El mimeticuerpo de centro de bisagra, la porción
V En-terminal opcional puede comprender
1-20 aminoácidos de al menos una región flanqueante
1 (FR1) variable de cadena pesada, por ejemplo, como se presenta en
las Figuras 1-9 (SEC ID Nº: 31-39),
o al menos una región variable LC, por ejemplo, como se presenta en
las Figuras 10-31 (SEC ID Nº:
40-61) de la solicitud provisional de Estados Unidos
60/507.349, presentada el 30/09/2003, correspondiente a las Figuras
1-41 de la solicitud PCT Nº US04/19783, presentada
en 17 de junio del 2004, incluyendo sustituciones, deleciones o
inserciones como se presenta en estas Figuras, prefiriéndose las de
las Figuras 5, 6 y 8. También se prefieren secuencias variables que
comprenden la secuencia Q-X-Q.
La porción P puede comprender al menos uno de
cualquier péptido terapéutico como se conoce en la técnica o como
se describe en este documento, tal como, pero sin limitación, los
presentados en la Tabla 1. Las SEC ID Nº: 1-30, o
como se conoce en el técnica, o cualquier combinación o secuencia
consenso de las mismas o cualquier proteína de fusión de las
mismas.
La secuencia enlazadora opcional puede ser
cualquier enlazador peptídico adecuado como se conoce en la técnica.
La secuencia preferida incluye cualquier combinación de G y S, por
ejemplo,
X1-X2-X3-X4-Xn,
donde X puede ser G o S y n puede ser 5-30. Los
Ejemplos no limitantes incluyen GS, GGGS, GSGGGS, GSGGGSGG y
similares.
La porción CH1 no se usa y un número variable de
aminoácidos del extremo N de la región bisagra están delecionados,
por ejemplo, como se hace referencia en las Figuras
1-42 de la solicitud provisional de Estados Unidos
60/507.349, presentada el 30/09/2003, correspondiente a las Figuras
1-41 de la solicitud PCT Nº US04/19783, presentada
el 17 de junio del 2004 y la Tabla 3. El número variable de
aminoácidos usados para la porción de centro de bisagra de un
mimeticuerpo incluye, pero sin limitación, deleción de cualquiera de
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,
37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53,
54, 55, 56, 57 ó 1-3, 2-5,
2-7, 2-8, 3-9,
4-10, 5-9, 5-10,
5-15, 10-20, 2-30,
20-40, 10-50 o cualquier intervalo o
valor en el mismo, de los aminoácidos N-terminales
de al menos una región bisagra, por ejemplo, como se presenta en las
Figuras 32-40 de la solicitud provisional de
Estados Unidos 60/507.349 presentada el 30/09/2003, correspondiente
a las Figuras 1-41 de la solicitud PCT Nº
US04/19783 presentada el 17 de junio de 2004 o la anterior Tabla 3,
por ejemplo, pero sin limitación, deleción de cualquiera a todos de
los aminoácidos 99-101 a 105-157 de
los aminoácidos 99-105, 99-108,
99-111, 99-112,
99-113, 99-114,
99-115, 99-119,
99-125, 99-128,
99-134, 99-140,
99-143, 99-149,
99-155 y 99-158 de las figuras
32-40 de la solicitud provisional de Estados Unidos
60/507.349 presentada el 30/09/2003, correspondientes a las figuras
1-41 de la solicitud PCT Nº US04/19783 presentada el
17 junio de 2004, correspondiente a la SEC ID Nº:
62-70, incluyendo las sustituciones, inserciones o
deleciones descritas en las figuras 32-40 de la
solicitud provisional de Estados Unidos Nº 60/507.349 presentada
30/09/2003, correspondientes a las Figuras 1-41 de
la solicitud PCT Nº US04/19783, presentada el 17 de junio del 2004.
En realizaciones preferidas, una región de centro de bisagra
incluye una deleción del extremo N de la región bisagra para
proporcionar una región de centro de bisagra que incluye una
deleción hasta, pero no incluyendo, un resto Cys o hasta, pero no
incluyendo, una secuencia
Cys-Pro-Xaa-Cys. En
una realización preferida adicional, tales secuencias de centro de
bisagras usadas en un mimeticuerpo de centro de bisagra incluyen los
aminoácidos 109-113 o 112-113 de la
Figura 36 (SEC ID Nº: 66) (IgGl); 105-110 ó
109-110 de la Figura 37 (SEC ID Nº: 67) (IgG2);
111-160, 114-160,
120-160, 126-160,
129-160, 135-160,
141-160, 144-160,
150-160, 156-160 y
159-160 de la Figura 38 (SEC ID Nº: 68) (IgG3); o
106-110 ó 109-110 de la Figura 39
(SEC ID Nº: 69) (IgG4).
La secuencia CH2, CH3 y CH4 opcional pueden ser
cualquier secuencia humana adecuada o compatible humana, por
ejemplo, como se presenta en las Figuras 1-42 de la
solicitud provisional de Estados Unidos 60/507.349, presentada el
30/09/2003, correspondiente a las Figuras 1-41 de la
solicitud PCT Nº US04/19783, presentada el 17 de junio del 2004 y
la Tabla 3, o como se conoce en la técnica o cualquier combinación o
secuencia consenso de las mismas o cualquier proteína de fusión de
las mismas.
Los aminoácidos en un mimeticuerpo de centro de
bisagra mimético de EPO que son esenciales para la función se
pueden identificar mediante métodos conocidos en la técnica, tales
como mutagénesis dirigida o mutagénesis mediante alanina (por
ejemplo, Ausubel, anteriormente, Capítulos 8,15; Cunningham y Wells,
Science 244: 1081-1085 (1989)). El último
procedimiento incluye mutaciones únicas de alanina en cada resto de
la molécula. Después, las moléculas mutantes resultantes se ensayan
para actividad biológica, tal como, pero sin limitación, al menos
una actividad relacionada con proteína, como se especifica en este
documento o como se conoce en la técnica. Los sitios que son
críticos para la unión del mimeticuerpo de centro de bisagra
mimético de EPO o la porción especificada o variante también se
pueden identificar por análisis estructural tal como cristalización,
resonancia magnética nuclear o marcado por fotoafinidad (Smith,
et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992) y
de Vos, et al., Science 255: 306-312
(1992)).
(1992)).
Los mimeticuerpos pueden comprender como la
porción P de Fórmula (I), pero sin limitación, al menos una porción,
secuencia o combinación seleccionada de 3 a todas de al menos una
de las SEC ID Nº: 1-30. Las variantes no limitantes
que pueden mejorar o mantener al menos una de las actividades
enumeradas anteriormente incluyen, pero sin limitación, cualquiera
de los anteriores polipéptidos, que comprenden además al menos una
mutación correspondiente a al menos una sustitución, inserción o
deleción que no afecte significativamente a las actividades y
funciones biológicas adecuadas de dicho mimeticuerpo de centro de
bisagra mimético de EPO.
Un mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de
EPO puede comprender opcionalmente además al menos una porción
funcional de al menos un polipéptido como porción P de Fórmula (I),
al menos uno del 90-100% de las SEC ID Nº:
1-30. Un mimeticuerpo de centro de bisagra mimético
de EPO puede comprender opcionalmente además una secuencia de
aminoácidos para la porción P de Fórmula (I), seleccionada entre una
o más de las SEC ID Nº: 1-30.
En una realización, la secuencia de aminoácidos
P o porción de la misma tiene una identidad de aproximadamente el
90-100% (es decir, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97,
98, 99, 100 o cualquier intervalo o valor en el mismo) con la
secuencia de aminoácidos correspondiente de la porción
correspondiente de al menos una de las SEC ID Nº:
1-30. Preferiblemente, la identidad de aminoácidos
del 90-100% (es decir, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96,
97, 98, 99, 100 o cualquier intervalo o valor en el mismo) se
determina usando un algoritmo informático adecuado, como se conoce
en la técnica.
Los mimeticuerpos pueden comprender cualquier
número de restos aminoacídicos contiguos de un mimeticuerpo de
centro de bisagra mimético de EPO, donde ese número se selecciona
entre el grupo de números enteros que consisten en el
10-100% del número de restos contiguos en un
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO. Opcionalmente,
esta subsecuencia de aminoácidos contiguos tiene una longitud de al
menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40,
50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180,
190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 o más aminoácidos o cualquier
intervalo o valor en el mismo. Además, el número de tales
subsecuencias puede ser cualquier número entero seleccionado entre
el grupo que consiste en 1 a 20, tal como al menos 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más.
Los mimeticuerpos biológicamente activos tienen
una actividad específica de al menos el 20%, el 30% o el 40% y
preferiblemente al menos el 50%, el 60% o el 70% y mucho más
preferiblemente al menos el 80%, el 90% o el 95%-1000% de la
proteína nativa (no sintética), endógena o relacionada y conocida
insertada o fusionada o porción o variante especificada. Los
métodos para ensayar y cuantificar las medidas de actividad
enzimática y especificidad de sustrato se conocen bien por los
especialistas en la técnica.
Los mimeticuerpos humanos y fragmentos de unión
a ligando, como se describe en este documento, se pueden modificar
por la unión covalente de un resto orgánico. Tal modificación puede
producir un mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO o
fragmento de unión a ligando con propiedades farmacocinéticas
mejoradas (por ejemplo, semivida sérica in vivo aumentada).
El resto orgánico puede ser un grupo polimérico hidrófilo lineal o
ramificado, grupo de ácido graso o grupo de éster de ácido graso. En
realizaciones particulares, el grupo polimérico hidrófilo pueden
tener un peso molecular de aproximadamente 800 a aproximadamente
120.000 Daltons y puede ser un polialcanoglicol (por ejemplo,
polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol (PPG)), polímero de
hidrato de carbono, polímero de aminoácidos o polivinilpirrolidona y
el grupo de ácido graso o éster de ácido graso puede comprender de
aproximadamente ocho a aproximadamente cuarenta átomos de
carbono.
Los mimeticuerpos modificados pueden comprender
uno o más restos orgánicos que están unidos covalentemente,
directamente o indirectamente, al mimeticuerpo de centro de bisagra
mimético de EPO. Cada resto orgánico que está unido a un
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO puede ser
independientemente un grupo polimérico hidrófilo, un grupo de ácido
graso o un grupo de éster de ácido graso. Como se usa en este
documento, la expresión "ácido graso" incluye ácidos
monocarboxílicos y ácidos dicarboxílicos. Un "grupo polimérico
hidrófilo", como se usa en este documento la expresión, se
refiere a un polímero orgánico que es más soluble en agua que en
octano. Por ejemplo, la polilisina es más soluble en agua que en
octano. Por tanto, un mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de
EPO modificado por la unión covalente de polilisina está incluido
por esta descripción. Los polímeros hidrófilos adecuados para
modificar mimeticuerpos pueden ser lineales o ramificados e
incluyen, por ejemplo, polialcanoglicoles (por ejemplo, PEG,
monometoxi-polietilenglicol (mPEG), PPG y
similares), hidratos de carbono (por ejemplo, dextrano, celulosa,
oligosacáridos, polisacáridos y similares), polímeros de aminoácidos
hidrófilos (por ejemplo, polilisina, poliarginina, poliaspartato y
similares), óxidos de polialcano (por ejemplo, óxido de
polietileno, óxido de polipropileno y similares) y
polivinilpirrolidona. Preferiblemente, el polímero hidrófilo que
modifica el mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO de la
invención tiene un peso molecular de aproximadamente 800 a
aproximadamente 150.000 Dalton como una entidad molecular separada.
Por ejemplo, se puede usar PEG_{2500}, PEG_{5000},
PEG_{7500}, PEG_{9000}, PEG_{10000}, PEG_{12500},
PEG_{15000} y PEG_{20000}, donde el subíndice es el peso
molecular promedio del polímero en Dalton.
El grupo polimérico hidrófilo se puede sustituir
con uno a aproximadamente seis grupos alquilo, ácido graso o éster
de ácido graso. Los polímeros hidrófilos que están sustituidos con
un grupo ácido graso o éster de ácido graso se pueden preparar
empleando métodos adecuados. Por ejemplo, un polímero que comprende
un grupo amino se puede acoplar a un carboxilato del ácido graso o
éster de ácido graso y un carboxilato activado (por ejemplo,
activado con N, N-carbonil diimidazol) en un ácido
graso o éster de ácido graso se puede acoplar a un grupo hidroxilo
en un polímero.
Los ácidos grasos y ésteres de ácidos grasos
adecuados para modificar mimeticuerpos pueden estar saturados o
pueden contener una o más unidades de insaturación. Los ácidos
grasos que son adecuados para modificar mimeticuerpos incluyen, por
ejemplo, n-dodecanoato (C_{12}, laurato),
N-tetradecanoato (C_{14}, miristato),
N-octadecanoato (C_{18}, estearato),
N-eicosanoato (C_{20}, araquidato),
N-docosanoato (C_{22}, behenato),
N-triacontanoato (C_{30}),
n-tetracontanoato (C_{40}),
cis-\Delta9-octadecanoato
(C_{18}, oleato), todo
cis-\Delta5,8,11,14-eicosatetraenoato
(C_{20}, araquidonato), ácido octariedioico, ácido
tetradecanodioico, ácido octadecanodioico, ácido docosanedioico y
similares. Los ésteres de ácidos grasos adecuados incluyen
mono-ésteres de ácidos dicarboxílicos que comprenden un grupo
alquilo inferior lineal o ramificado. El grupo alquilo inferior
puede comprender de uno a aproximadamente doce, preferiblemente de
uno a aproximadamente seis átomos de carbono.
Los mimeticuerpos humanos modificados se pueden
preparar usando métodos adecuados, tales como por reacción con uno
o más agentes modificadores. Un "agente modificador" como se
usa en este documento la expresión, se refiere a un grupo orgánico
adecuado (por ejemplo, polímero hidrófilo, un ácido graso, un éster
de ácido graso) que comprende un grupo de activación. Un "grupo
de activación" es un resto químico o grupo funcional que puede
reaccionar, en condiciones apropiadas, con un segundo grupo químico
formando de este modo un enlace covalente entre el agente
modificador y el segundo grupo químico. Por ejemplo, los grupos de
activación que son reactivos con amina incluyen grupos electrófilos
tales como tosilato, mesilato, halo (cloro, bromo, flúor, yodo),
ésteres de N-hidroxisuccinimidilo (NHS) y
similares. Los grupos de activación que pueden reaccionar con tioles
incluyen, por ejemplo, maleimida, yodoacetilo, acriloilo,
disulfuros de piridilo, tiol de ácido
5-tiol-2-nitrobenzoico
(TNB-tiol) y similares. Un grupo funcional aldehído
se puede acoplar con moléculas que contienen amina o hidrazida y un
grupo azida puede reaccionar con un grupo fósforo trivalente para
formar enlaces fosforamidato o fosforimida. Los métodos adecuados
para introducir grupos de activación en moléculas se conocen en la
técnica (véase, por ejemplo, Hermanson, GT, Bioconjugate
Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)). Un grupo de
activación se puede unir directamente al grupo orgánico (por
ejemplo, polímero hidrófilo, ácido graso, éster de ácido graso) o
mediante un resto enlazador, por ejemplo, un grupo
C_{1}-C_{12} divalente en el que uno o más
átomos de carbono se puede sustituir por un heteroátomo tal como
oxígeno, nitrógeno o azufre. Los restos de enlazador adecuados
incluyen, por ejemplo, tetraetilenglicol,
-(CH_{2})_{3}-,-NH-(CH_{2})_{6}-NH-,
-(CH_{2})_{2}-NH y
CH_{2}-O-CH_{r}
CH_{Z}-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH-NH-.
Los agentes modificadores que comprenden un resto de enlazador se
pueden producir, por ejemplo, haciendo reaccionar un
mono-Boc-alquildiamina (por
ejemplo, mono-Boc-etilenodiamina,
mono-Boc-diaminohexano) con un ácido
graso en presencia de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)
carbodiimida (EDC) para formar un enlace amida entre la amina libre
y el carboxilato de ácido graso. El grupo protector Boc se puede
retirar del producto mediante tratamiento con ácido trifluoroacético
(TFA) para exponer una amina primaria que se puede acoplar a otro
carboxilato como se describe o se puede hacer reaccionar con
anhídrido maleico y el producto resultante se puede ciclar para
producir un derivado de maleimido activado del ácido graso. (Véase,
por ejemplo, Thompson, et al. documento WO 92/16221).
Los mimeticuerpos modificados se pueden producir
haciendo reaccionar un mimeticuerpo de centro de bisagra mimético
de EPO humana con un agente modificador. Por ejemplo, los restos
orgánicos se pueden enlazar al mimeticuerpo de centro de bisagra
mimético de EPO de un modo no específico de sitio empleando un
agente modificador reactivo con amina, por ejemplo, un éster de NHS
de PEG. Los mimeticuerpos humanos modificados también se pueden
preparar reduciendo enlaces disulfuro (por ejemplo, enlaces
disulfuro intra-cadena) de un mimeticuerpo de centro
de bisagra mimético de EPO. El mimeticuerpo de centro de bisagra
mimético de EPO reducido después se puede hacer reaccionar con un
agente modificador reactivo con tiol para producir el mimeticuerpo
de centro de bisagra mimético de EPO modificado. Los mimeticuerpos
humanos modificados que comprenden un resto orgánico que está unido
a sitios específicos de un mimeticuerpo de centro de bisagra
mimético de EPO se pueden preparar usando métodos adecuados, tales
como proteólisis inversa (Fisch et al., Bioconjugate Chem.,
3: 147-153 (1992); Werlen et al.,
Bioconjugate Chem., 5: 411-417 (1994); Kumaran et
al., Protein Sci. 6(10): 2233-2241
(1997); Itoh et al. Bioorg. Chem., 24(1):
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Bioeng., 56(4): 456-463 (1997)), y los
métodos descritos en Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques,
Academic Press: San Diego, CA (1996).
Al menos un mimeticuerpo de centro de bisagra
mimético de EPO o una porción especificada de la composición
variante que comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres, al
menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o más mimeticuerpos o
porciones especificadas o variantes de los mismos se describe en
este documento y/o como se conoce en la técnica se proporciona en
una composición mezcla o forma que no tiene origen natural. Tales
porcentajes de composición son en peso, volumen, concentración,
molaridad o molalidad como soluciones líquidas o secas, mezclas,
suspensión, emulsiones o coloides, como se conoce en la técnica o
como se describe en este documento.
Tales composiciones pueden comprender el
0,00001-99,9999 por ciento en peso, volumen,
concentración, molaridad o molalidad como soluciones líquidas,
gaseosas o secas, mezclas, suspensión, emulsiones o coloides, como
se conoce en la técnica o como se describe en este documento o en
cualquier intervalo o valor en el mismo, tal como, pero sin
limitación, 0,00001, 0,00003, 0,00005, 0,00009, 0,0001, 0,0003,
0,0005, 0,0009, 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05,
0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2,
1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5,
2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8,
3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20,
25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77,
78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94,
95, 96, 97, 98, 99, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5, 99,6, 99,7, 99,8,
99,9%. Tales composiciones de la presente invención incluyen por
tanto, pero sin limitación, 0,00001-100 mg/ml y/o
0,00001-100 mg/g.
La composición puede comprender además
opcionalmente una cantidad eficaz de al menos un compuesto o
proteína seleccionada entre al menos uno de un fármaco
anti-infeccioso, un fármaco de sistema
cardiovascular (CV), un fármaco de sistema nervioso central (SNC),
un fármaco de sistema nervioso autónomo (SNA), un fármaco de vías
respiratorias, un fármaco de tracto gastrointestinal (GI), un
fármaco hormonal, un fármaco para equilibrio de fluido o
electrolitos, un fármaco hematológico, un antineoplásico, un fármaco
de inmunomodulación, un fármaco oftálmico, ótico o nasal, un
fármaco tópico, un fármaco nutricional o similares. Tales fármacos
se conocen bien en la técnica, incluyendo formulaciones,
indicaciones, dosificación y administración para cada uno presentado
en este documento (véase, por ejemplo, Nursing 2001 Handbook of
Drugs, 21ª edición, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001;
Health Professional's Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang,
Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ;
Pharmcotherapy Handbook, Wells et al., ed., Appleton &
Lange, Stamford, CT).
El fármaco anti-infeccioso puede
ser al menos uno seleccionado entre amebicidas o al menos un
antiprotozoario, antihelmíntico, antifúngico, antipalúdico,
antituberculósico o al menos un antileprósico, aminoglucósido,
penicilina, cefalosporinas, tetraciclinas, sulfonamidas,
fluoroquinolonas, antivirícos, anti-infecciosos
macrólidos, anti-infecciosos diversos. El fármaco
CV puede ser al menos uno seleccionado entre fármacos
cardiovasculares inotrópicos, antiarrítmicos, antiangina,
antihipertensores, antilipémicos, diversos. El fármaco de SNC puede
ser al menos uno seleccionado entre analgésicos no narcóticos o al
menos uno seleccionado entre antipiréticos, fármacos
antiinflamatorios no esteroideos, narcóticos o al menos un
analgésico opioide, sedante-hipnótico,
anticonvulsivo, antidepresivo, fármacos ansiolíticos, antipsicótico,
estimulantes del sistema nervioso central, antiparquinsonianos,
fármacos diversos del sistema nervioso central. El fármaco de SNA
puede ser al menos uno seleccionado entre colinérgicos
(parasimpaticomiméticos), anticolinérgicos, adrenérgicos
(simpaticomiméticos), bloqueantes adrenérgicos (simpaticolíticos),
relajantes de músculo esquelético, bloqueantes neuromusculares. El
fármaco de vías respiratorias puede ser al menos uno seleccionado
entre antihistamínicos, broncodilatadores, expectorantes o al menos
un antitusivo, fármacos respiratorios diversos. El fármaco de tracto
GI puede ser al menos uno seleccionado entre antiácidos o al menos
un adsorbente o al menos un antiflatulento, enzimas digestivas o al
menos un solubilizante de piedras de vesícula biliar,
antidiarreicos, laxantes, antieméticos, fármacos antiúlceras. El
fármaco hormonal puede ser al menos uno seleccionado entre
corticosteroides, andrógenos o al menos un esteroide anabólico,
estrógenos o al menos un progestágeno, gonadotropina, fármacos
antidiabéticos o al menos un glucagón, hormonas tiroideas,
antagonistas de hormona tiroidea, hormonas hipofisarias, fármacos
similares a paratiroides. El fármaco para equilibrio de fluidos y
electrolitos pueden ser al menos uno seleccionado entre diuréticos,
electrolitos o al menos una solución de sustitución, acidificantes o
al menos un alcalinizante. El fármaco hematológico puede ser al
menos uno seleccionado entre antianémicos, anticoagulantes,
derivados sanguíneos, enzimas trombolíticas. El antineoplásico
pueden ser al menos uno seleccionado entre agentes alquilantes,
antimetabolitos, antineoplásicos antibióticos, antineoplásicos que
alteran el equilibrio hormonal, antineoplásicos diversos. El
fármaco de inmunomodulación puede ser al menos uno seleccionado
entre inmunosupresores, vacunas o al menos un toxoide, antitoxina o
al menos un antídoto, suero inmune, modificadores de la respuesta
biológica. Los fármacos oftálmicos, óticos y nasales pueden ser al
menos uno seleccionado entre anti-infecciosos
oftálmicos, antiinflamatorios oftálmicos, mióticos, midriáticos,
vasoconstrictores oftálmicos, fármacos oftálmicos, óticos, nasales
diversos. El fármaco tópico puede ser al menos uno seleccionado
entre antiinfecciosos locales, escabicidas o al menos un
pediculicida, corticosteroides tópicos. El fármaco nutricional puede
ser al menos uno seleccionado entre vitaminas, minerales o
calóricos. Véase, por ejemplo, contenidos de Nursing 2001
Drug Handbook, anteriormente.
Las composiciones de anticuerpo o polipéptido de
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO de la presente
invención pueden comprender adicionalmente al menos una de cualquier
cantidad adecuada y/o eficaz de una composición o composición
farmacéutica comprende al menos una proteína o anticuerpo de
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO a una célula,
tejido, órgano, animal o paciente que necesite tal modulación,
tratamiento o terapia, comprendiendo opcionalmente además al menos
uno seleccionado entre al menos un antagonista de TNF (por ejemplo,
pero sin limitación, un antagonista químico o proteico de TNF,
anticuerpo monoclonal o policlonal o fragmento de TNF, un receptor
de TNF soluble (por ejemplo, p55, p70 o p85) o fragmento,
polipéptidos de fusión de los mismos o un antagonista de TNF de
molécula pequeña, por ejemplo, proteína I o II de unión a TNF
(TBP-I o TBP-II), nerelimonmab,
infliximab, enteracept, CDP-571,
CDP-870, afelimomab, lenercept y similares), un
antirreumático (por ejemplo, metotrexato, auranofina,
aurotioglucosa, azatioprina, etanercept, tiomalato sódico de oro,
sulfato de hidroxicloroquina, leflunomida, sulfasalazina), un
relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no
esteroideo (AINE), un analgésico, un anestésico, un sedante, un
anestésico local, un bloqueante neuromuscular, un antimicrobiano
(por ejemplo, aminoglucósido, un antifúngico, un antiparasitario,
un antivírico, un carbapenemo, cefalosporina, un flurorquinolona, un
macrólido, una penicilina, una sulfonamida, una tetraciclina, otro
antimicrobiano), un antipsoriático, un corticosteroide, un esteroide
anabólico, un agente relacionado con diabetes, un mineral, un
nutricional, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona
relacionada con calcio, un antidiarreico, un antitusivo, un
antiemético, un antiulceroso, un laxante, un anticoagulante, una
eritropoyetina (por ejemplo, epoyetina alfa), una filgrastima (por
ejemplo, G-CSF, Neupogen), una sargramostima
(GM-CSF, Leukine), una inmunización, una
inmunoglobulina, un inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab,
ciclosporina, daclizumab), una hormona de crecimiento, un fármaco
de sustitución hormonal, un modulador de receptor de estrógenos, un
midriático, un ciclopléjico, un agente alquilante, un
antimetabolito, un inhibidor mitótico, un radiofarmacéutico, un
antidepresivo, un agente antimaníaco, un antipsicótico, un
ansiolítico, un hipnótico, un simpaticomimético, un estimulante,
donepezil, tacrina, una medicación para asma, un beta agonista, un
esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrienos, una metilxantina,
una cromolina, una epinefrina o análogo, dornasa alfa (Pulmozyme),
una citocina o un antagonista de citocina. Los ejemplos no
limitantes de tales citocinas incluyen, pero sin limitación,
cualquiera de IL-1 a IL-23. En la
técnica se conocen bien las dosificaciones adecuadas. Véase, por
ejemplo, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2a
Edición, Appleton y Lange, Stanford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia,
Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon
Publishing, Loma Linda, CA (2000).
Tales composiciones también pueden incluir
moléculas de toxina que están asociadas, unidas,
co-formuladas o co-administras con
al menos un anticuerpo o polipéptido de la presente invención. La
toxina puede actuar opcionalmente para inactivar selectivamente la
célula o el tejido patológico. La célula patológica puede ser una
cancerosa u otra. Tales toxinas pueden ser, pero sin limitación, una
toxina o fragmento de toxina purificado recombinante que comprenda
al menos un dominio citotóxico funcional de toxina, por ejemplo,
seleccionado entre al menos uno de ricina, toxina diftérica, una
toxina de veneno o una toxina bacteriana. El término toxina también
incluye tanto endotoxinas como exotoxinas producidas por cualquier
bacteria o virus de origen natural, mutante o recombinante que
pueda provocar cualquier afección patológica en seres humanos y
otros mamíferos, incluyendo choque tóxico, que puede dar como
resultado muerte. Tales toxinas pueden incluir, pero sin limitación,
enterotoxina termolábil (LT) de E. coli enterotoxigénica,
enterotoxina termoestable (ST), citotoxina de Shigella,
enterotoxinas de Aeromonas, toxina 1 de síndrome de choque
tóxico (TSST-1), enterotoxina estafilocócica A
(SEA), B, (SEB), o C (SEC), enterotoxinas estreptocócicas y
similares. Tales bacterias incluyen, pero sin limitación, cepas de
una especie de E. coli enterotoxigénica (ETEC), E.
coli enterohemorrágica (por ejemplo, cepas del serotipo
0157:H7), especies de Staphylococcus (por ejemplo, Staphylococcus
aureus, Staphylococcus pyogenes), especies de Shigella
(por ejemplo, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella
boydii y Shigella sonnei), especies de Salmonella
(por ejemplo, Salmonella typhi, Salmonella
cholera-suis, Salmonella enteritidis), especies
de Clostridium (por ejemplo, Clostridium perfringens,
Clostridium dificile, Clostridium botulinum), especies de
Camphlobacter (por ejemplo, Camphlobacter jejuni,
Camphlobacter fetus), especies de Heliobacter, (por
ejemplo, Heliobacter pylori), especies de Aeromonas
(por ejemplo, Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas
caviae), especies de Pleisomonas shigelloides,
Yersinia enterocolitica, especies de Vibrios (por
ejemplo, Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus),
especies de Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa y
Streptococci. Véase, por ejemplo, Stein, ed., INTERNAL
MEDICINE, 3ª ed., págs. 1-13, Little, Brown and Co.,
Boston, (1990); Evans et al., eds., Bacterial Infections of
Humans: Epidemiology and Control, 2d. Ed., págs.
239-254, Plenum Medical Book Co., New York (1991);
Mandell et al, Principles and Practice of Infectious
Diseases, 3d. Ed., Churchill Livingstone, New York (1990); Berkow
et al, eds., The Merck Manual, 16a edición, Merck and Co.,
Rahway, N.J., 1992; Wood et al, FEMS Microbiology Immunology,
76:121-134 (1991); Marrack et al, Science,
248:705-711 (1990).
Las composiciones de mimeticuerpo de centro de
bisagra mimético de EPO de la presente invención pueden comprender
además al menos uno de cualquier auxiliar adecuado, tal como, pero
sin limitación, diluyente, aglutinante, estabilizante, tampones,
sales, disolventes lipófilos, conservantes, adyuvantes o similares.
Se prefieren los auxiliares farmacéuticamente aceptables. Los
ejemplos no limitantes y los métodos para preparar tales soluciones
estériles se conocen bien en la técnica, tal como, pero sin
limitación, Gennaro, Ed., Remington Pharmaceutical Science, 18a
Edición, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990. Se pueden
seleccionar vehículos farmacéuticamente aceptables rutinariamente
que son adecuados para el modo de administración, la solubilidad
y/o estabilidad de la composición de mimeticuerpo de centro de
bisagra mimético de EPO como se conoce bien en la técnica o como se
describe en este documento.
Los excipientes y aditivos farmacéuticos útiles
en la presente composición incluyen, pero sin limitación,
proteínas, péptidos, aminoácidos, lípidos y hidratos de carbono (por
ejemplo, azúcares, incluyendo monosacáridos, di-, tri-, tetra- y
oligosacáridos; azúcares derivatizados tales como ácidos aldónicos
de alditoles, azúcares esterificados y similares; y polisacáridos o
polímeros de azúcar), que pueden estar presentes de forma única o
en combinación, que comprenden solos o en combinación el
1-99,99% en peso o volumen. Los excipientes de
proteína ilustrativos incluyen albúmina sérica tal como albúmina
sérica humana (HSA), albúmina humana recombinante (rHA), gelatina,
caseína y similares. Los aminoácidos representativos/componentes de
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO o porción
especificada o variante, que también pueden funcionar en una
capacidad de tamponamiento incluyen alanina, glicina, arginina,
betaína, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína,
lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina,
aspartamo y similares. Uno aminoácido preferido es glicina.
Los excipientes de hidratos de carbono adecuados
para el uso en la invención incluyen, por ejemplo, monosacáridos
tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa,
D-manosa, sorbosa y similares; disacáridos tales
como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa y similares;
polisacáridos, tales como rafinosa, melecitosa, maltodextrinas,
dextranos, almidones y similares; y alditoles, tales como manitol,
xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol),
mioinositol y similares. Los excipientes de hidratos de carbono
preferidos para el uso en la presente invención son manitol,
trehalosa y rafinosa.
Las composiciones de mimeticuerpo de centro de
bisagra mimético de EPO también puede incluir un tampón o un agente
de ajuste del pH; típicamente, el tampón es una sal preparada a
partir de un ácido o una base orgánica. Los tampones
representativos incluyen sales de ácido orgánico tales como sales de
ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucónico, ácido carbónico,
ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético o ácido ftálico;
Tris, clorhidrato de trometamina o tampones fosfato. Los tampones
preferidos para el uso en las presentes composiciones son sales de
ácido orgánico tales como citrato.
Adicionalmente, las composiciones de
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO de la invención
pueden incluir excipientes/aditivos poliméricos tales como
polivinilpirrolidonas, ficoles (un azúcar polimérico), dextratos
(por ejemplo, ciclodextrinas, tales como
2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina),
polietilenglicoles, agentes saporíferos, agentes antimicrobianos,
edulcorantes, antioxidantes, agentes antiestáticos, tensioactivos
(por ejemplo, polisorbatos tales como "Tween 20" y "Tween
80"), lípidos (por ejemplo, fosfolípidos, ácidos grasos),
esteroides (por ejemplo, colesterol) y agentes quelantes (por
ejemplo, EDTA).
Estos excipientes y/o aditivos farmacéuticos
conocidos y adicionales adecuados para el uso en las composiciones
de mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO de acuerdo con
la invención se conocen en el técnica, por ejemplo, como se enumera
en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19a
ed., Williams & Williams, (1995), y en el "Physician's Desk
Reference", 52a ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998).
Los materiales de vehículo o excipiente
preferidos son hidratos de carbono (por ejemplo, sacáridos y
alditoles) y tampones (por ejemplo, citrato) o agentes
poliméricos.
Como se ha señalado anteriormente, la invención
proporciona formulaciones estables, que pueden incluir
preferiblemente un tampón adecuado con solución salina o una sal
seleccionada, así como soluciones opcionalmente conservadas y
formulaciones que contienen un conservante así como formulaciones
conservadas multiuso adecuadas para uso farmacéutico o veterinario,
que comprenden el mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO
en una formulación farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones
conservadas contienen al menos un conservante conocido y se
seleccionan opcionalmente del grupo que consiste en al menos un
fenol, m-cresol, p-cresol,
o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico, nitrito
fenilmercúrico, fenoxietanol, formaldehído, clorobutanol, cloruro de
magnesio (por ejemplo, hexahidrato), alquilparabeno (metilo, etilo,
propilo, butilo y similares), cloruro de benzalconio, cloruro de
bencetonio, dehidroacetato sódico y timerosal o mezclas de los
mismos en un diluyente acuoso. Se puede usar cualquier
concentración o mezcla adecuada como se conoce en la técnica, tal
como el 0,001-5% o cualquier intervalo o valor en
el mismo, tal como, pero sin limitación, 0,001, 0,003, 0,005, 0,009,
0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7,
0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0,
2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3,
3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 o
cualquier intervalo o valor en el mismo. Los ejemplos no limitantes
incluyen ningún conservante, m-cresol al
0,1-2% (por ejemplo, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%),
alcohol bencílico al 0,1-3% (por ejemplo, 0,5, 0,9,
1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%), timerosal al 0,001-0,5%
(por ejemplo, 0,005, 0,01), fenol al 0,001-2,0%
(por ejemplo, 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%),
alquilparabeno(s) al 0,0005-1,0% (por
ejemplo, 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01,
0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%) y
similares.
Como se ha señalado anteriormente, la invención
proporciona un artículo de fabricación, que comprende material de
envasado y al menos un vial que comprende una solución del
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO con los tampones
y/o conservantes prescritos, opcionalmente en un diluyente acuoso,
donde dicho material de envasado comprende un marcador que indica
que tal solución se puede mantener a lo largo de un periodo de 1,
2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72
horas o más. La invención comprende además un artículo de
fabricación, que comprende material de envasado, un primer vial que
comprende el mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO
liofilizado y un segundo vial que comprende un diluyente acuoso de
tampón o conservante prescrito, donde dicho material de envasado
comprende un marcador que da instrucciones a un paciente para
reconstituir el mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO o
porción especificada o variante en un diluyente acuoso para formar
una solución que se puede mantener a lo largo de un periodo de
veinticuatro horas o más.
El mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de
EPO usado de acuerdo con la presente invención se puede producir
mediante medios recombinantes, incluyendo de preparaciones de
células de mamífero o transgénicas o se puede purificar de otras
fuentes biológicas, como se describe en este documento o como se
conoce en la técnica.
El intervalo de cantidades del mimeticuerpo de
centro de bisagra mimético de EPO o porción especificada o variante
en el producto de la presente invención incluye cantidades que
proporcionan después de la reconstitución, en un sistema
húmedo/seco, concentraciones de aproximadamente 1,0 \mug/ml a
aproximadamente 1000 mg/ml, aunque son funcionales concentraciones
menores y mayores y dependen del vehículo de suministro deseado, por
ejemplo, las formulaciones en solución diferirán de métodos de
parche transdérmico, pulmonares, transmucosales u osmóticos o
microbombas.
Preferiblemente, el diluyente acuoso comprende
opcionalmente además un conservante farmacéuticamente aceptable.
Los conservantes preferidos incluyen los seleccionados entre el
grupo que consiste en fenol, m-cresol,
p-cresol, o-cresol, clorocresol,
alcohol bencílico, alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo y
similares), cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio,
dehidroacetato sódico y timerosal o mezclas de los mismos. La
concentración de conservante usado en la formulación es una
concentración suficiente para obtener un efecto
anti-microbiano. Tales concentraciones dependen del
conservante seleccionado y se determinan de forma sencilla por el
especialista en la técnica.
Otros excipientes, por ejemplo, agentes de
isotonicidad, tampones, antioxidantes, mejoradores de conservante
se pueden añadir opcionalmente y preferiblemente al diluyente. Un
agente de isotonicidad, tal como glicerina, se usa de forma común a
concentraciones conocidas. Un tampón fisiológicamente tolerado se
añade preferiblemente para proporcionar un control del pH mejorado.
Las formulaciones pueden abarcar un amplio intervalo de pH, tal
como de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 10 e intervalos
preferidos de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 9 y un
intervalo más preferido de aproximadamente 6,0 a aproximadamente
8,0. Preferiblemente, las formulaciones de la presente invención
tienen un pH entre aproximadamente 6,8 y aproximadamente 7,8. Los
tampones preferidos incluyen tampones fosfato, más preferiblemente
fosfato sódico, particularmente solución salina tamponada con
fosfato (PBS).
Otros aditivos, tales como solubilizantes
farmacéuticamente aceptables como Tween 20 (monolaurato de
polioxietileno (20) sorbitán), Tween 40 (monopalmitato de
polioxietileno (20) sorbitán), Tween 80 (monooleato de
polioxietileno (20) sorbitán), Pluronic F68 (copolímeros de bloque
de polioxietileno polioxipropileno) y PEG (polietilenglicol) o
tensioactivos no iónicos tales como polisorbato 20 u 80 o poloxámero
184 ó 188, polioles Pluronic® otros copolímeros de bloque y
quelantes tales como EDTA y EGTA se pueden añadir opcionalmente a
las formulaciones o composiciones para reducir la agregación. Estos
aditivos son particularmente útiles si se usa una bomba o un
recipiente de plástico para administrar la formulación. La presencia
de un tensioactivo farmacéuticamente aceptable mitiga la propensión
de la proteína a agregarse.
Las formulaciones de la presente invención se
pueden preparar mediante un proceso que comprende mezclar el
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO y un conservante
seleccionado entre el grupo que consiste en fenol,
m-cresol, p-cresol,
o-cresol, clorocresol, alcohol bencílico,
alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo y similares),
cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, dehidroacetato sódico
y timerosal o mezclas de los mismos en un diluyente acuoso. La
mezcla del mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO y
conservante en un diluyente acuoso se realiza usando procedimientos
convencionales de disolución y mezcla. Para preparar una
formulación adecuada, por ejemplo, una cantidad medida de
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO en solución
tamponada se combina con el conservante deseado en una solución
tamponada en cantidades suficientes para proporcionar la proteína y
conservante a las concentraciones deseadas. El especialista habitual
en la técnica reconocería variaciones de este proceso. Por ejemplo,
el orden en el que se añaden los componentes, si se usan aditivos
adicionales, la temperatura y el pH a los que se prepara la
formulación, son todos factores que se pueden optimizar para la
concentración y los medios de administración usados.
Las formulaciones reivindicadas se pueden
proporcionar a pacientes como soluciones claras o como viales duales
que comprenden un vial del mimeticuerpo de centro de bisagra
mimético de EPO liofilizado que se reconstituye con un segundo vial
que contiene agua, un conservante y/o excipientes, preferiblemente
un tampón fosfato y/o solución salina y una sal seleccionada, en un
diluyente acuoso. Un vial de solución única o un vial dual que
requiere la reconstitución se puede reutilizar múltiples veces y
pueden ser suficientes para un solo ciclo o múltiples ciclos de
tratamiento de paciente y pueden proporcionar, por tanto, un régimen
de tratamiento más conveniente que el disponible actualmente.
Los artículos de fabricación son útiles para la
administración a lo largo de un periodo de inmediatamente hasta
veinticuatro horas o mayor. Por consiguiente, los artículos de
fabricación ofrecen ventajas significativas al paciente. Las
formulaciones de la invención se pueden almacenar opcionalmente de
forma segura a temperaturas de aproximadamente 2 a aproximadamente
40ºC y conservar la actividad biológica de la proteína durante
periodos de tiempo prolongados, por tanto, permitiendo una etiqueta
de envase que indica que la solución se puede mantener y/o usar a
lo largo de un periodo de 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 o 96 horas o
más. Si se usa un diluyente conservado, tal etiqueta puede incluir
el uso hasta al menos uno de 1-12 meses, medio, uno
y medio y/o dos años.
Las soluciones del mimeticuerpo de centro de
bisagra mimético de EPO en la invención se pueden preparar mediante
un proceso que comprende mezclar el mimeticuerpo de centro de
bisagra mimético de EPO en un diluyente acuoso. La mezcla se
realiza usando procedimientos convencionales de disolución y mezcla.
Para preparar un diluyente adecuado, por ejemplo, una cantidad
medida del mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO o
porción especificada o variante en agua o tampón se combina en
cantidades suficientes para proporcionar la proteína y
opcionalmente un conservante o tampón a las concentraciones
deseadas. Las variaciones de este proceso se reconocerían por el
especialista habitual en la técnica. Por ejemplo, el orden en el que
se añaden los componentes, si se usan aditivos adicionales, la
temperatura y el pH a los que se prepara la formulación, son todos
factores que se pueden optimizar para la concentración y los medios
de administración usados.
Las formulaciones de la presente invención se
pueden preparar mediante un proceso que comprende mezclar el
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO y un tampón
seleccionado, preferiblemente un tampón fosfato que contiene
solución salina o una sal seleccionada. La mezcla del mimeticuerpo
de centro de bisagra mimético de EPO y tampón en un diluyente
acuoso se realiza usando procedimientos convencionales de disolución
y mezcla. Para preparar una formulación adecuada, por ejemplo, una
cantidad medida del mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de
EPO en agua o tampón se combina con el agente de tamponamiento
deseado en agua en cantidades suficientes para proporcionar la
proteína y el tampón a las concentraciones deseadas. Las variaciones
de este proceso se reconocerían por el especialista habitual en la
técnica. Por ejemplo, el orden en el que se añaden los componentes,
si se usan aditivos adicionales, la temperatura y el pH a los que se
prepara la formulación, son todos factores que se pueden optimizar
para la concentración y los medios de administración usados.
El mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de
EPO en formulaciones estables o conservadas o soluciones descrito
en este documento se puede administrar a un paciente mediante una
diversidad de métodos de suministro que incluyen inyección SC o IM;
transdérmico, pulmonar, transmucosal, implante, bomba osmótica,
cartucho, microbomba u otro medio comprendido por el especialista
en la técnica, como se conoce bien en la técnica.
La presente invención también proporciona los
mimeticuerpos de centro de bisagra miméticos de EPO para el uso en
un método para modular o tratar anemia, en una célula, tejido,
órgano, animal o paciente que incluye, pero sin limitación, al
menos uno de cualquier anemia, anemia relacionada con tratamiento de
cáncer, anemia relacionada con radioterapia o quimioterapia, anemia
relacionada con tratamiento de infección vírica o bacteriana,
anemia renal, anemia de prematuridad, anemia asociada a cáncer
pediátrico y/o de adulto, anemia asociada con linfoma, mieloma,
mieloma múltiple, anemia asociada con SIDA, tratamiento concomitante
para pacientes con o sin donación de sangre autóloga que esperan
cirugía opcional, preoperatorio y post operatorio para cirugía,
donación o transfusión de sangre autóloga, tratamiento
perioperatorio, neutropenia cíclica o síndrome de Kostmann
(agranulocitosis congénita), enfermedad renal de estadio final,
anemia asociada con diálisis, insuficiencia renal crónica,
enfermedades hemopoyéticas primarias tales como anemia hipoplásica
congénita, talasemia mayor o anemia falciforme, complicaciones
vaso-oclusivas de anemia falciforme. Furman et
al., Pediatrics 1992; 90: 716-728, Goldberg
Science. 1988; 242: 1412-1415; Paul et al.,
Exp Hematol. 1984; 12: 825-830; Erslev et
al., Arch Intern Med. 1968; 122: 230-235;
Ersley et al., Ann Clin Lab Sci. 1980; 10:
250-257; Jacobs et al., Nature. 1985; 313:
806-810; Lin et al., Proc Natl Acad Sci USA.
1985; 82: 7580-7584; Law et al., Proc Natl
Acad Sci USA. 1986; 83: 6920-6924; Goldwasser et
al., J Biol Chem. 1974; 249: 4202-4206; Eaves
et al., Blood. 1978; 52: 1196-1210; Sawyer
et al., Blood. 1989; 74: 103-109; Winearls
et al., Lancet. 1986; 2: 1175-1178; Eschbach
et al., N Engl J Med. 1987; 316: 73-78;
Eschbach et al., Ann Intern Med. 1989; 111:
992-1000.
Los mimeticuerpos de la presente invención
también se pueden usar para formas no renales de anemia inducida,
por ejemplo, por infecciones crónicas, procesos inflamatorios,
radioterapia y tratamiento con fármacos citostáticos y se han
descrito resultados prometedores en pacientes con anemia no renal.
Véase, por ejemplo, Abels Rl y Rudnick SA Erythropoietin: evolving
clinical applications. Experimental Hematology 19:
842-50 (1991); Graber SE y Krantz SB
Erythropoietin: biology and clinical use. Hematology/Oncol. Clin.
North Amer. 3: 369-400 (1989); Jelkman W y Gross AJ
(eds) Erythropoietin. Springer, Berlin 1989; Koury MJ y Bondurant MC
The molecular mechanism of erythropoietin action. European Journal
of Biochemistry 210: 649-63 (1992); Krantz SB
Erythropoietin. Blood 77: 419-34 (1991); Tabbara IA
Erythropoietin. Biology and clinical applications. Archives of
Internal Medicine 153: 298-304 (1993).
La presente invención también proporciona el uso
del mimeticuerpo para modular o tratar una afección relacionada con
anemia o células sanguíneas en una célula, tejido, órgano, animal o
paciente, donde dicha afección relacionada con la anemia o células
sanguíneas está asociada con al menos uno que incluye, pero sin
limitación, al menos uno de enfermedad relacionada con sistema
inmune, enfermedad cardiovascular, enfermedad infecciosa, maligna
y/o neurológica. Un método de este tipo puede comprender
opcionalmente administrar una cantidad eficaz de al menos una
composición o composición farmacéutica que comprende el mimeticuerpo
de centro de bisagra mimético de EPO a una célula, tejido, órgano,
animal o paciente que necesite tal modulación, tratamiento o
terapia.
La presente invención también proporciona el uso
del mimeticuerpo para modular o tratar enfermedad
cancerosa/infecciosa en una célula, tejido, órgano, animal o
paciente, que incluye, pero sin limitación, al menos uno de
infección bacteriana aguda o crónica, procesos parasitarios o
infecciosos agudos y crónicos, que incluyen infecciones
bacterianas, víricas y fúngicas, infección por VIH/neuropatía de
VIH, meningitis, hepatitis, artritis séptica, peritonitis,
neumonía, epiglotitis, E. coli 0157: H7, síndrome urémico
hemolítico/púrpura trombocitopénica trombolítica, malaria, fiebre
hemorrágica del dengue, leishmaniasis, lepra, síndrome de choque
tóxico, miositis estreptocócica, gangrena gaseosa, mycobacterium
tuberculosis, mycobacterium avium intracellulare, neumonía por
pneumocystis carinii, enfermedad inflamatoria pélvica,
orquitis/epididimitis, legionela, enfermedad de lyme, gripe A,
virus de epstein-barr, síndrome hematofagocítico
asociado a signos vitales, encefalitis vital/meningitis aséptica y
similares, (ii) leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblástica
aguda (ALL), ALL de células B, células T o FAB, leucemia mieloide
aguda (AML), leucemia mielocítica crónica (CML), leucemia
linfocítica crónica (CLL), leucemia de células ciliadas, síndrome
mielodisplásico (MDS), un linfoma, enfermedad de Hodgkin, un
linfoma maligno, enfermedad no Hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma
múltiple, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorrectal, carcinoma
pancreático, carcinoma nasofaríngeo, histiocitosis maligna; síndrome
paraneoplásico/hipercalcemia de neoplasia, tumores sólidos,
adenocarcinomas, sarcomas, melanoma maligno y similares; o (iii)
enfermedades neurodegenerativas, esclerosis múltiple, cefalea de
tipo migraña, complejo de SIDA demencia, enfermedades
desmielinizantes, tales como esclerosis múltiple y mielitis
transversa aguda; trastornos extrapiramidales y cerebelosos tales
como lesiones del sistema corticoespinal; trastornos de los ganglios
basales o trastornos cerebelosos, trastornos de movimiento
hipercinético tales como corea de Huntington y corea senil;
trastornos del movimiento inducidos por fármacos, tales como los
inducidos por fármacos que bloquean los receptores de dopamina del
SNC; trastornos del movimiento hipocinético, tales como enfermedad
de Parkinson; parálisis supranuclear progresiva; lesiones
estructurales del cerebelo; degeneraciones espinocerebelosas, tales
como ataxia espinal, ataxia de Friedreich, degeneraciones
corticales cerebelosas, degeneraciones de múltiples sistemas
(Mencel, Dejerine-Thomas,
Shi-Drager y Machado-Joseph);
trastornos sistémicos (enfermedad de Refsum, abetalipoprotemia,
ataxia, telangiectasia y trastorno multisistémico mitocondrial),
trastornos centrales desmielinizantes, tales como esclerosis
múltiple, mielitis transversa aguda; y trastornos de la unidad
motora tales como atrofias musculares neurógenas (degeneración
celular de asta anterior, tales como esclerosis lateral amiotrófica,
atrofia muscular espinal infantil y atrofia muscular espinal
juvenil); enfermedad de Alzheimer; síndrome de Down en la mediana
edad; enfermedad de cuerpos de Lewy difusos; demencia senil de tipo
cuerpos de Lewy; síndrome de Wernicke-Korsakoff;
alcoholismo crónico; enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob; panencefalitis esclerosante
subaguda, enfermedad de Hallerrorden-Spatz; y
demencia pugilística y similares. Un método de este tipo puede
comprender adicionalmente, administrar una cantidad eficaz de una
composición o composición farmacéutica que comprende al menos un
anticuerpo de TNF o porción especificada o variante a una célula,
tejido, órgano, animal o paciente que necesite tal modulación,
tratamiento o terapia. Véase, por ejemplo, el Merck Manual, 16a
Edición, Merck & Company, Rahway, NJ (1992). Un método de este
tipo puede comprender opcionalmente administrar una cantidad eficaz
de al menos una composición o composición farmacéutica que comprende
el mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO a una célula,
tejido, órgano, animal o paciente que necesite tal modulación,
tratamiento o terapia.
La presente invención también proporciona el uso
del mimeticuerpo para modular o tratar al menos una enfermedad
cardiovascular en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, que
incluye, pero sin limitación, al menos uno de síndrome de
atontamiento cardíaco, infarto de miocardio, insuficiencia cardiaca
congestiva, apoplejía, apoplejía isquémica, hemorragia,
arteriosclerosis, ateroesclerosis, enfermedad arteriosclerótica
diabética, hipertensión, hipertensión arterial, hipertensión
renovascular, síncope, choque, sífilis del sistema cardiovascular,
insuficiencia cardiaca, cor pulmonale, hipertensión pulmonar
primaria, arritmias cardíacas, latidos ectópicos auriculares,
aleteo auricular, fibrilación auricular (sostenida o paroxística),
taquicardia auricular caótica o multifocal, taquicardia de QRS
estrecho regular, arritmias específicas, fibrilación ventricular,
arritmias de haz de His, bloqueo auriculoventricular, bloqueo de
rama, trastornos isquémicos de miocardio, arteriopatía coronaria,
angina pectoral, infarto de miocardio, cardiomiopatía,
cardiomiopatía congestiva dilatada, cardiomiopatía restrictiva,
cardiopatías valvulares, endocarditis, enfermedad pericárdica,
tumores cardíacos, aneurismas aórticos y periféricos, disección
aórtica, inflamación de la aorta, oclusión de la aorta abdominal y
sus ramas, trastornos vasculares periféricos, trastornos arteriales
oclusivos, enfermedad aterosclerótica periférica, tromboangitis
obliterante, trastornos arteriales periféricos funcionales, fenómeno
de Raynaud y enfermedad, acrocianosis, eritromelalgia, enfermedades
venosas, trombosis venosa, venas varicosas, fístula arteriovenosa,
linfedema, lipedema, angina inestable, lesión por reperfusión,
síndrome post-bomba, lesión por
isquemia-reperfusión y similares. Un método de este
tipo puede comprender opcionalmente administrar una cantidad eficaz
de una composición o composición farmacéutica que comprende al
menos un mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO o
porción especificada o variante a una célula, tejido, órgano, animal
o paciente que necesite tal modulación, tratamiento o terapia.
Cualquier uso médico de la presente invención
puede comprender administrar una cantidad eficaz de una composición
o composición farmacéutica que comprende el mimeticuerpo de centro
de bisagra mimético de EPO a una célula, tejido, órgano, animal o
paciente que necesite tal modulación, tratamiento o terapia. Un uso
de este tipo puede comprender opcionalmente además la
co-administración o terapia de combinación para
tratar tales enfermedades inmunes, donde la administración de dicho
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO comprende además
administrar, antes, de forma concurrente y/o después al menos uno
seleccionado de al menos un antagonista de TNF (por ejemplo, pero
sin limitación, un anticuerpo o fragmento de TNF, un receptor o
fragmento de TNF soluble, proteínas de fusión de los mismos o un
antagonista TNF de molécula pequeña), un antirreumático, un
relajante muscular, un narcótico, un fármaco antiinflamatorio no
esteroideo (AINE), un analgésico, un anestésico, un sedante, un
anestésico local, un bloqueante neuromuscular, un antimicrobiano
(por ejemplo, aminoglucósidos, un antifúngico, un antiparasitario,
un antivírico, un carbapenemo, cefalosporina, un flororquinolona, un
macrólido, una penicilina, una sulfonamida, una tetraciclina, otro
antimicrobiano), un antipsoriático, un corticosteroide, un
esteroide anabólico, un agente relacionado con diabetes, un mineral,
un nutricional, un agente tiroideo, una vitamina, una hormona
relacionada con calcio, un antidiarreico, un antitusivo, un
antiemético, un antiulceroso, un laxante, un anticoagulante, una
eritropoyetina (por ejemplo, epoyetina alfa), una filgrastima (por
ejemplo, G-CSF, Neupogen), una sargramostima
(GM-CSF, Leukine), una inmunización, una
inmunoglobulina, un inmunosupresor (por ejemplo, basiliximab,
ciclosporina, daclizumab), una hormona del crecimiento, un fármaco
de sustitución hormonal, un modulador del receptor de estrógenos,
un midriático, un ciclopléjico, un agente alquilante, un
antimetabolito, un inhibidor mitótico, un radiofarmacéutico, un
antidepresivo, agente antimaníaco, un antipsicótico, un
ansiolítico, un hipnótico, un simpaticomimético, un estimulante,
donepezilo, tacrina, una medicación para asma, un beta agonista, un
esteroide inhalado, un inhibidor de leucotrieno, una metilxantina,
una cromolina, una epinefrina o análogo, dornasa alfa (Pulmozyme),
una citocina o un antagonista de citocina. Las dosificaciones
adecuadas se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Wells
et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2ª Edición, Appleton
y Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia. Tarascon Pocket
Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma
Linda,
CA (2000).
CA (2000).
Los mimeticuerpos también se pueden usar ex
vivo, tal como en cultivo de médula autóloga. En resumen, la
médula ósea se retira de un paciente antes de quimioterapia y se
trata con TPO y/o EPO, opcionalmente en combinación con
mimeticuerpo, opcionalmente en combinación con una o más citocinas
adicionales. Después, la médula tratada se devuelve al paciente
después de la quimioterapia para acelerar la recuperación de la
médula. Además, también se pueden usar TPO solo y en combinación
con mimeticuerpo de EPO y/o EPO para la expansión ex vivo de
células de médula o progenitoras de sangre periférica (PBPC). Antes
del tratamiento de quimioterapia, la médula se puede estimular con
factor de células madre (SCF) o G-CSF para liberar
células progenitoras tempranas a la circulación periférica. Estos
progenitores se recogen y concentran opcionalmente de sangre
periférica y después se tratan en cultivo con TPO y mimeticuerpo,
opcionalmente en combinación con una o más citocinas adicionales,
que incluyen, pero sin limitación, SCF, G-CSF,
IL-3, GM-CSF, IL-6 o
IL-11, para diferenciarse y proliferar en cultivos
de megacariocitos de alta densidad, que después se devuelven
opcionalmente al paciente después de quimioterapia de alta dosis.
Las dosis de TPO para tratamiento ex vivo de médula ósea
estarán en el intervalo de 100 pg/ml a 10 ng/ml, preferiblemente
500 pg/ml a 3 ng/ml. Las dosis de mimeticuerpo serán equivalentes
en la actividad a la EPO que se puede usar de 0,1 unidades/ml a 20
unidades/ml, preferiblemente de 0,5 unidades/ml a 2 unidades/ml o
cualquier intervalo o valor en el mismo.
Los antagonistas de TNF adecuados para
composiciones, terapia de combinación,
co-administración, dispositivos y/o métodos (que
comprenden además al menos un mimeticuerpo de la presente invención)
incluyen, pero sin limitación, anticuerpos
anti-TNF, fragmentos de unión a ligando del mismo y
moléculas de receptor que se unen específicamente a TNF; compuestos
que evitan y/o inhiben la síntesis de TNF, liberación de TNF o su
acción sobre células diana, tales como talidomida, tenidap,
inhibidores de fosfodiesterasa (por ejemplo, pentoxifilina y
rolipram), agonistas del receptor de adenosina A2b y mejoradores
del receptor de adenosina A2b; compuestos que evitan y/o inhiben la
señalización de receptor de TNF, tales como inhibidores de proteína
cinasa activada por mitógeno (MAP); compuestos que bloquean y/o
inhiben la escisión de TNF en membrana, tales como inhibidores de
metaloproteinasa; compuestos que bloquean y/o inhiben la actividad
de TNF, tales como inhibidores de enzima conversora de angiotensina
(ACE) (por ejemplo, captopril); y compuestos que bloquean y/o
inhiben la producción y/o síntesis de TNF, tales como inhibidores
de MAP cinasa.
Como se usa en este documento, un "anticuerpo
de factor de necrosis tumoral", "anticuerpo de TNF" o
"anticuerpo de TNF\alpha" o fragmento y similares disminuye,
bloquea, inhibe, anula o interfiere con la actividad de TNFa in
vitro, in situ y/o preferiblemente in vivo. Por
ejemplo, un anticuerpo humano de TNF adecuado de la presente
invención puede unirse a TNF\alpha e incluye anticuerpos
anti-TNF, fragmentos de unión a antígeno del mismo
y mutantes o dominios especificados del mismo que se unen
específicamente a TNF\alpha. Un anticuerpo o fragmento de TNF
adecuado también puede disminuir, bloquear, anular, interferir,
evitar y/o inhibir la síntesis de ARN, ADN o proteína de TNF, la
liberación de TNF, señalización del receptor de TNF, escisión de
TNF de membrana, actividad de TNF, producción y/o síntesis de
TNF.
El anticuerpo quimérico cA2 consiste en la
región variable de unión a antígeno del anticuerpo IgG1
anti-TNF\alpha humano de ratón neutralizante de
alta afinidad, denominado A2, y las regiones constantes de una IgG1
humana, inmunoglobulina kappa. La región Fc de IgG1 humana mejora
la función efectora de anticuerpo alogénico, aumenta la semivida
sérica circulante y disminuye la inmunogenicidad del anticuerpo. La
avidez y especificidad de epítopo del anticuerpo quimérico cA2 se
produce por la región variable del anticuerpo murino A2. En una
realización particular, una fuente preferida para ácidos nucleicos
que codifica la región variable del anticuerpo murino A2 es la
línea celular de hibridoma A2.
El A2 quimérico (cA2) neutraliza el efecto
citotóxico de TNF\alpha humano tanto natural como recombinante de
un modo dependiente de dosis. A partir de ensayos de unión del
anticuerpo quimérico cA2 y TNF\alpha humano recombinante se
calculó la constante de afinidad del anticuerpo quimérico cA2 que
era 1,04x10^{10} M^{-1}. Los métodos preferidos para determinar
la especificidad y afinidad de anticuerpo monoclonal por inhibición
competitiva se pueden encontrar en Harlow, et al.,
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Colligan et al.,
eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc, and
Wiley Interscience, New York, (1992-2003); Kozbor
et al., Immunol. Today, 4: 72-79 (1983);
Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology,
Wiley Interscience, New York (1987-2003); y Muller,
Meth. Enzymol., 92: 589-601 (1983).
En una realización particular, el anticuerpo
monoclonal murino A2 se produce por una línea celular denominada
c134A. El anticuerpo quimérico cA2 se produce por una línea celular
denominada c168A.
Los ejemplos adicionales de anticuerpos
anti-TNF monoclonales que se pueden usar en la
presente invención se describen en la técnica (véase, por ejemplo,
Patente de Estados Unidos Nº 5.231.024; Möller, A. et al.,
Cytokine 2(3): 162-169 (1990); Solicitud de
Estados Unidos Nº 07/943.852 (presentada el 11 de septiembre de
1992); Rathjen et al., Publicación Internacional Nº WO
91/02078 (publicada el 21 de febrero de 1991); Rubin et al.,
Publicación de Patente EPO Nº 0 218 868 (publicada el 22 de abril de
1987); Yone et al., Publicación de Patente EPO Nº 0 288 088
(26 de octubre de 1988); Liang, et al., Biochem. Biophys.
Res. Comm. 137: 847-854(1986); Meager, et
al., Hybridoma 6: 305-311 (1987); Fendly et
al., Hybridoma 6: 359-369 (1987); Bringman,
et al., Hybridoma 6: 489-507 (1987); y
Hirai, et al., J. Immunol. Meth. 96: 57-62
(1987)).
Las moléculas de receptor de TNF útiles son las
que se unen a TNF\alpha con alta afinidad (véase, por ejemplo,
Feldmann et al. Publicación internacional Nº WO 92/07076
(publicada el 30 de abril de 1992); Schall et al., Cell 61:
361-370 (1990) y Loetscher et al. Cell 61:
351-359 (1990)) y posee opcionalmente una baja
inmunogenicidad. En particular, los receptores de superficie
celular de TNF de 55 kDa (p55 TNF-R) y de 75 kDa
(p75 TNF-R) son útiles en la presente invención.
También son útiles las formas truncadas de estos receptores, que
comprenden los dominios extracelulares (ECD) de los receptores o
porciones funcionales de los mismos (véase, por ejemplo, Corcoran
et al., Eur. J. Biochem. 223: 831-840
(1994)). Las formas truncadas de los receptores de TNF, que
comprenden el ECD se han detectado en orina y suero como proteínas
de unión inhibidoras de TNF\alpha de 30 kDa y 40 kDa (Engelmann,
H. et al., J. Biol. Chem. 265: 1531-1536
(1990)). Las moléculas multiméricas de receptor de TNF y moléculas
de fusión de inmunorreceptor de TNF y derivados y fragmentos o
porciones de los mismos son ejemplos adicionales de moléculas de
receptor de TNF que son útiles. Las moléculas de receptor de TNF
que se pueden usar se caracterizan por su capacidad de tratar
pacientes durante periodos prolongados con alivio de bueno a
excelente de síntomas y baja toxicidad. La baja inmunogenicidad y/o
alta afinidad, así como otras propiedades indefinidas, pueden
contribuir a los resultados terapéuticos conseguidos.
Las moléculas multiméricas de receptor de TNF
útiles comprenden todo o una porción funcional del ECD de dos o más
receptores de TNF unidos mediante uno o más enlazadores
polipeptídicos u otros enlazadores no peptídicos, tales como
polietilenglicol (PEG). Las moléculas multiméricas pueden comprender
además un péptido señal de una proteína secretada para dirigir la
expresión de la molécula multimérica. Estas moléculas multiméricas
y los métodos para su producción se han descrito en la Solicitud de
Estados Unidos Nº 08/437.533 (presentada el 9 de mayo de 1995). Las
moléculas de fusión de inmunorreceptor de TNF útiles comprenden al
menos una porción de una o más moléculas de inmunoglobulina y todo
o una porción funcional de uno o más receptores de TNF. Estas
moléculas de fusión de inmunorreceptor se pueden ensamblar como
monómeros o hetero- u homo-multímeros. Las
moléculas de fusión de inmunorreceptor también pueden ser
monovalentes o multivalentes. Un ejemplo de una molécula de fusión
de inmunorreceptor de TNF de este tipo es la proteína de fusión de
receptor de TNF/IgG. Las moléculas de fusión de inmunorreceptor de
TNF y los métodos para su producción se han descrito en la técnica
(Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 21:
2883-2886 (1991); Ashkenazi et al., Proc.
Natl. Acad Sci. USA 88: 10535-10539 (1991); Peppel
et al., J. Exp. Med 174: 1483-1489 (1991);
Kolls et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:
215-219 (1994); Butler et al. Cytokine
6(6): 616-623 (1994); Baker et al,
Eur. J. Immunol. 24: 2040-2048 (1994); Beutler
et al, Patente de Estados Unidos Nº 5.447.851; y la solicitud
de Estados Unidos Nº 08/442.133 (presentada el 16 de mayo de
1995)). Los métodos para producir moléculas de fusión de
inmunorreceptor también se pueden encontrar en Capon et al.,
Patente de Estados Unidos Nº 5.116.964; Capon et al., Patente
de Estados Unidos Nº 5.225.538; y Capon et al. Nature 337:
525-531 (1989).
Un equivalente funcional, derivado, fragmento o
región de molécula de receptor de TNF se refiere a la porción de la
molécula de receptor de TNF o la porción de la secuencia de la
molécula de receptor de TNF que codifica la molécula de receptor de
TNF, que tiene tamaño y secuencia suficientes para parecerse
funcionalmente a las moléculas de receptor de TNF que se pueden
usar (por ejemplo, se unen a TNF\alpha con alta afinidad y poseen
baja inmunogenicidad). Un equivalente funcional de molécula de
receptor de TNF también incluye moléculas de receptor de TNF
modificadas que se parecen funcionalmente a las moléculas de
receptor de TNF que se pueden usar (por ejemplo, se unen a
TNF\alpha con alta afinidad y poseen baja inmunogenicidad). Por
ejemplo, un equivalente funcional de molécula de receptor de TNF
puede contener un codón "SILENCIOSO" o una o más sustituciones,
deleciones o adiciones de aminoácidos (por ejemplo, sustitución de
un aminoácido ácido por otro aminoácido ácido, o sustitución de un
codón que codifica el mismo o un aminoácido hidrófobo diferente por
otro codón que codifica un aminoácido hidrófobo). Véase, Ausubel
et al. Current Protocols in Molecular Biology, Greene
Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, New York,
(1987-2003).
Las citocinas incluyen, pero sin limitación,
todas las citocinas conocidas. Véase, por ejemplo,
CopewithCytokines.com. Los antagonistas de citocina incluyen, pero
sin limitación, cualquier anticuerpo, fragmento o mimético,
cualquier receptor soluble, fragmento o mimético, cualquier
antagonista de molécula pequeña o cualquier combinación de los
mismos.
Cualquier uso médico de la presente invención
puede comprender un método para tratar un trastorno mediado por
proteína, que comprende administrar una cantidad eficaz de una
composición o composición farmacéutica que comprende el
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO a una célula,
tejido, órgano, animal o paciente que necesite tal modulación,
tratamiento o terapia. Un método de este tipo puede comprender
opcionalmente además la co-administración o terapia
de combinación para tratar tales enfermedades inmunes, donde la
administración de dicho mimeticuerpo de centro de bisagra mimético
de EPO, porción especificada o variante del mismo, comprende además
administrar, antes, concurrentemente y/o después al menos uno
seleccionado de al menos una citocina adicional tal como
IL-3, -6 y -11; factor de células madre;
G-CSF y GM-CSF.
Típicamente, el tratamiento de afecciones
patológicas se realiza administrando una cantidad eficaz o
dosificación de la composición de mimeticuerpo de centro de bisagra
mimético de EPO que completa, como promedio, un intervalo de al
menos aproximadamente 0,01 a 500 miligramos de mimeticuerpo de
centro de bisagra mimético de EPO/kilogramo de paciente por dosis y
preferiblemente de al menos aproximadamente 0,1 a 100 miligramos de
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO/kilogramo de
paciente por administración única o múltiple, dependiendo de la
actividad específica contenida en la composición. Alternativamente,
la concentración sérica eficaz puede comprender
0,1-5000 \mug/ml de concentración sérica por
administración única o múltiple. Las dosificaciones adecuadas se
conocen por los facultativos médicos y, por supuesto, dependerán de
la patología particular, actividad específica de la composición que
se administra y el paciente particular que se somete a tratamiento.
En algunos casos, para conseguir la cantidad terapéutica deseada,
puede ser necesario proporcionar administración repetida, es decir,
administraciones individuales repetidas de una dosis controlada o
graduada particular, donde las administraciones individuales se
repiten hasta que se consiguen la dosis o el efecto diario
deseado.
Las dosis preferidas puede incluir
opcionalmente, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09,
0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,
25, 26, 27, 28, 29 y/o 30 mg/kg/administración o cualquier
intervalo, valor o fracción del mismo o para conseguir una
concentración sérica de 0,1, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,5, 1,9, 2,0,
2,5, 2,9, 3,0, 3,5, 3,9, 4,0, 4,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5,
6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9,
11, 11,5, 11,9, 20, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14,0, 14,5, 4,9,
5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0,
9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 12, 12,5,12,9, 13,0, 13,5,
13,9, 14, 14,5, 15, 15,5, 15,9, 16, 16,5, 16,9, 17, 17,5, 17,9, 18,
18,5, 18,9, 19, 19,5, 19,9, 20, 20,5, 20,9, 21, 22, 23, 24, 25, 26,
27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96,
100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000,
2500, 3000, 3500, 4000, 4500 y/o 5.000 \mug/ml de concentración
sérica por administración única o múltiple, o cualquier intervalo,
valor o fracción de mismo.
Alternativamente, la dosificación administrada
puede variar dependiendo de factores conocidos, tales como las
características farmacodinámicas del agente particular y su modo y
vía de administración; edad, salud y peso del receptor; naturaleza
y alcance de los síntomas, tipo de tratamiento concurrente,
frecuencia del tratamiento y el efecto deseado. Habitualmente, una
dosificación de ingrediente activo puede ser de aproximadamente 0,1
a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal. Normalmente, de 0,1
a 50 y preferiblemente de 0,1 a 10 miligramos por kilogramo por
administración o en forma de liberación sostenida es eficaz para
obtener resultados deseados.
Como un ejemplo no limitante, el tratamiento de
seres humanos o animales se puede proporcionar como una dosificación
en un momento o periódica de al menos un mimeticuerpo de centro de
bisagra mimético de EPO o porción especificada o variante de la
presente invención de 0,01 a 100 mg/kg, tal como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1,
1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,
19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70,
80, 90 ó 100 mg/kg, por día, en al menos uno del día 1, 2, 3, 4, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,
24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ó 40
o alternativamente, al menos una vez por semana 1, 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 o cualquier
combinación de los mismos usando dosis únicas, en infusión o
repetidas.
Las formas de dosificación (composición)
adecuadas para la administración interna contienen generalmente de
aproximadamente 0,0001 miligramos a aproximadamente 500 miligramos
de ingrediente activo por unidad o recipiente. En estas
composiciones farmacéuticas, el ingrediente activo estará presente
normalmente en una cantidad de aproximadamente el
0,5-95% en peso basándose en el peso total de la
composición. Para administración parenteral, el mimeticuerpo de
centro de bisagra mimético de EPO se puede formular como una
solución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado en asociación o
se puede proporcionar por separado, con un vehículo parenteral
farmacéuticamente aceptable. Los Ejemplos de tales vehículos son
agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y
albúmina sérica humana al 5%. También se pueden usar vehículos
liposómicos y no acuosos tales como aceites no volátiles. El
vehículo o polvo liofilizado puede contener aditivos que mantienen
la isotonicidad (por ejemplo, cloruro sódico, manitol) y
estabilidad química (por ejemplo, tampones y conservantes). La
formulación se esteriliza mediante técnicas conocidas o
adecuadas.
Se describen vehículos farmacéuticos adecuados
en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences,
A. Osol, un texto de referencia convencional en este campo.
Se pueden usar muchos modos conocidos y
desarrollados para administrar cantidades farmacéuticamente eficaces
de mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO de acuerdo con
la presente invención. Aunque se usa la administración pulmonar en
la siguiente descripción, se pueden usar otros modos de
administración con resultados adecuados.
El mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de
EPO de la presente invención se puede suministrar en un vehículo,
como una solución, emulsión, coloide o suspensión o como un polvo,
usando cualquiera de una diversidad de dispositivos y métodos
adecuados para la administración por inhalación u otros modos
descritos en este documento que pertenecen o conocidos en la
técnica.
Las formulaciones para administración parenteral
pueden contener como excipientes comunes agua estéril o solución
salina, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de
origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares. Se pueden
preparar suspensiones acuosas u oleosas para inyección mediante el
uso de un emulsionante o humidificante apropiado y un agente de
suspensión, de acuerdo con métodos conocidos. Los agentes para
inyección pueden ser un agente no-tóxico, diluyente
que no se puede administrar por vía oral tal como una solución
acuosa o una solución o suspensión inyectable estéril en un
disolvente. Como el vehículo o disolvente útil se permiten agua,
solución de Ringer, solución salina isotónica, etc.; como un
disolvente normal o un disolvente de suspensión se puede usar
aceite no volátil estéril. Para estos propósitos se puede usar
cualquier tipo de aceite no volátil y ácido graso, incluyendo
aceites grasos o ácidos naturales o sintéticos o semisintéticos;
mono- o di- o tri-glicéridos naturales o sintéticos
o semisintéticos. En la técnica se conoce la administración
parenteral e incluye, pero sin limitación, medios de inyección
convencionales, un dispositivo de inyección sin aguja presurizado
por gas como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº
5.851.198 y un dispositivo perforador con láser como se describe en
la Patente de Estados Unidos Nº 5.839.446 incorporada completamente
en este documento como referencia.
La administración del mimeticuerpo de centro de
bisagra mimético de EPO se puede realizar mediante medios
parenterales, subcutáneos, intramusculares, intravenosos, en
embolada, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o
transdérmico. La proteína, el mimeticuerpo de centro de bisagra
mimético de EPO o las composiciones de porción especificada o
variante se pueden preparar para el uso para administración
parenteral (subcutánea, intramuscular o intravenosa)
particularmente en la forma de soluciones o suspensiones líquidas;
para el uso en administración vaginal o rectal particularmente en
formas semisólidos tales como cremas y supositorios; para
administración bucal o sublingual particularmente en forma de
comprimidos o cápsulas; o por vía intranasal, particularmente en
forma de polvos, gotas nasales o aerosoles o ciertos agentes; o por
vía transdérmica particularmente en forma de un gel, pomada,
loción, suspensión o sistema de suministro por parche con
mejoradores químicos tales como dimetilsulfóxido para modificar la
estructura cutánea o para aumentar la concentración de fármaco en
el parche transdérmico (Junginger, et al. In "Drug
Permeation Enhancement"; Hsieh, D. S, Eds., págs.
59-90 (Marcel Dekker, Inc. Nueva York, 1994), o con
agentes oxidantes que permiten la aplicación de formulaciones que
contienen proteínas y péptidos sobre la piel (documento WO 98/53847)
o aplicaciones de campos eléctricos para crear rutas de transporte
transitorias tales como electroporación o para aumentar la movilidad
de fármacos cargados a través de la piel tales como iontoforesis o
aplicación de ultrasonidos tales como sonoforesis (Patentes de
Estados Unidos Nº 4.309.989 y 4.767.402).
\newpage
En ocasiones puede ser deseable suministrar los
compuestos de la presente invención al sujeto a lo largo de
periodos de tiempos prolongados, por ejemplo, durante periodos de
una semana a un año de una única administración. Se puede utilizar
diversas formas de dosificación de liberación lenta, liberación
sostenida o implante. Por ejemplo, una forma de dosificación puede
contener una sal no tóxica farmacéuticamente aceptable de los
compuestos que tenga un bajo grado de solubilidad en líquidos
corporales, por ejemplo, (a) una sal de adición de ácidos con un
ácido polibásico tal como ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido
cítrico, ácido tartárico, ácido tánico, ácido pamoico, ácido
algínico, ácido poliglutámico, ácidos naftaleno mono- o di-
sulfónicos, ácido poligalacturónico y similares; (b) una sal con un
catión de metal polivalente tal como cinc, calcio, bismuto, bario,
magnesio, aluminio, cobre, cobalto, níquel, cadmio y similares o
con un catión orgánico formado, por ejemplo, por
N,N'-dibencil-etilenodiamina o
etilenodiamina; o (c) combinaciones de (a) y (b), por ejemplo, una
sal de tanato de cinc. Adicionalmente, los compuestos de la
presente invención o, preferiblemente, una sal relativamente
insoluble tales como las que se acaban de describir, se pueden
formular en un gel, por ejemplo, un gel de monoestearato de aluminio
con, por ejemplo, aceite de sésamo, adecuado para inyección. Las
sales particularmente preferidas son sales de cinc, sales de tanato
de cinc, sales de pamoato y similares. Otro tipo de formulación de
liberación sostenida de liberación lenta para inyección contendría
el compuesto o la sal dispersada encapsulada en un polímero de
degradación lenta, no tóxico, no antigénico tal como un polímero de
ácido poliláctico/ácido poliglicólico, por ejemplo, como se
describe en la Patente de Estados Unidos Nº 3.773.919. Los
compuestos o, preferiblemente, sales relativamente insolubles tales
como las que se han descrito anteriormente también se pueden
formular en gránulos silásticos de matriz de colesterol,
particularmente para el uso en animales. En la bibliografía se
conocen formulaciones adicionales de liberación lenta, liberación
sostenida o implante, por ejemplo, liposomas de gas o líquido
(Patente de Estados Unidos Nº 5.770.222 y "Sustained and
Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson, ed.,
Marcel Dekker, Inc., NY, 1978).
Habiendo descrito generalmente la invención, la
misma se comprenderá de forma de forma más sencilla por referencia
a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración
y no tienen por objeto ser limitantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Un vector de expresión de mamífero típico
contiene al menos un elemento promotor, que media en el inicio de
la transcripción de ARNm, la secuencia codificante de mimeticuerpo
de centro de bisagra mimético de EPO y señales requeridas para la
terminación de la transcripción y poliadenilación del transcrito.
Los elementos adicionales incluyen mejoradores, secuencias Kozak y
secuencias intermedias flanqueadas por sitios donadores y aceptores
para el corte y empalme del ARN. Se puede conseguir la transcripción
altamente eficaz con los promotores temprano y tardío de SV40, las
repeticiones terminales largas (LTR) de retrovirus, por ejemplo,
RSV, HTLVI, HIVI y el promotor temprano de citomegalovirus (CMV).
Sin embargo, también se pueden usar elementos celulares (por
ejemplo, el promotor de actina humana). Los vectores de expresión
adecuados para el uso en la practica de la presente invención
incluyen, por ejemplo, vectores tales como pIRESIneo,
pRetro-Off, pRetro-On, PLXSN, o
pLNCX (Clonetech Labs, Palo Alto, CA), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo
(+/-) o pcDNA3.1/Hygro (+/-) (Invitrogen), PSVL y PMSG (Pharmacia,
Uppsala, Suecia), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) y
pBC12MI (ATCC 67109). Las células hospedadoras de mamífero que se
podrían usar incluyen células Hela 293 humanas, H9 y Jurkat, células
NIH3T3 y C127 de ratón, células Cos 1, Cos 7 y CV 1,
QC1-3 de codorniz, células L de ratón y células de
ovario de hámster chino (CHO).
Alternativamente, el gen se puede expresar en
líneas celulares estables que contienen el gen integrado en un
cromosoma. La co-transfección con un marcador de
selección tal como dhrf, gpt, neomicina o higromicina permite la
identificación y el aislamiento de las células transfectadas.
El gen introducido por transfección también se
puede amplificar para expresar grandes cantidades del mimeticuerpo
de centro de bisagra mimético de EPO codificado. El marcador de DHFR
(dihidrofolato reductasa) es útil para desarrollar líneas celulares
que llevan varios cientos e incluso varios miles de copias del gen
de interés. Otro marcador de selección útil es la enzima glutamina
sintasa (GS) (Murphy, et al., Biochem. J.
227:277-279 (1991); Bebbington, et al.,
Bio/Technology 10:169-175 (1992)). Mediante el uso
de estos marcadores, las células de mamífero se cultivan en medio
selectivo y se seleccionan las células con la mayor resistencia.
Estas líneas celulares contienen el gen o los genes amplificados
integrados en un cromosoma. Las células de ovario de hámster chino
(CHO) y NSO se usan con frecuencia para la producción del
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO o la porción
especificada o las variantes.
Los vectores de expresión pC1 y pC4 contienen el
promotor fuerte (LTR) del Virus de Sarcoma de Rous (Cullen, et
al., Molec. Cell. Biol. 5:438-447 (1985)) más un
fragmento del potenciador de CMV (Boshart, et al., Cell
41:521-530 (1985)). Múltiples sitios de clonación,
por ejemplo, con los sitios de escisión por enzima de restricción
BamHI, Xbal and Asp718, facilitan la clonación del gen de interés.
Los vectores contienen además el intrón 3', la señal de
poliadenilación y terminación del gen prepoinsulina de rata.
El vector pC4 se usa para la expresión del
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO. El plásmido pC4
es un derivado del plásmido pSV2-dhfr (Nº de acceso
de ATCC 37146). El plásmido contiene el gen de DHCR de ratón bajo
el control del promotor temprano de SV40. Las células de ovario de
hámster chino u otras que carecen de actividad de dihidrofolato que
se transfectan con estas plásmidos se pueden seleccionar cultivando
las células en un medio selectivo (por ejemplo, alpha minus MEM,
Life Technologies, Gaithersburg, MD) complementado con el agente
quimioterapéutico metotrexato. La amplificación de los genes de DHFR
en células resistentes a metotrexato (MTX) se ha documentado bien
(véase, por ejemplo, F. W. Alt, et al., J. Biol. Chem. 253:
1357-1370(1978); J. L. Hamlin y C. Ma,
Biochem. et Biophys. Acta 1097:107-143 (1990); y M.
J. Page and M. A. Sydenham, Biotechnology 9:64-68
(1991)). Las células cultivadas en concentraciones crecientes de MTX
desarrollan resistencia al fármaco
sobre-produciendo la enzima diana, DHFR, como
resultado de la amplificación del gen de DHFR. Si un segundo gen
está unido al gen de DHFR, habitualmente se
co-amplifica y sobre-expresa. Se
conoce en la técnica que esta estrategia se puede usar para
desarrollar líneas celulares que llevan más de mil copias del gen o
los genes amplificados. Posteriormente, cuando se retira el
metotrexato, se obtienen líneas celulares que contienen el gen
amplificado integrado en uno o más cromosoma o cromosomas de la
célula hospedadora.
El plásmido pC4 contiene para la expresión del
gen de interés el promotor fuerte de la repetición terminal larga
(LTR) del Virus de Sarcoma de Rous (Cullen, et al., Molec.
Cell. Biol. 5:438-447 (1985)) más un fragmento
aislado del potenciador del gen temprano inmediato del
citomegalovirus (CMV) humano (Boshart, et al., Cell
41:521-530 (1985)). Cadena abajo del promotor están
los sitios de escisión por enzima de restricción BamHI, Xbal. y
Asp718 que permiten la integración de los genes. Más allá de estos
sitios de clonación, el plásmido contiene el intrón 3' y el sitio
de poliadenilación del gen de prepoinsulina de rata. Otros
promotores de alta eficacia también se pueden usar para la
expresión, por ejemplo, el promotor de b-actina
humana, los promotores temprano o tardío de SV40 o las repeticiones
terminales largas de otros retrovirus, por ejemplo, VIH y HTL VI.
Se pueden usar sistemas de expresión génica Tet-Off
y Tet-On de Clontech y sistemas similares para
expresar la EPO de un modo regulado en células de mamífero (M.
Gossen, y H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
5547-5551 (1992)). Para la poliadenilación del ARNm
también se pueden usar otras señales, por ejemplo, de los genes de
hormona de crecimiento humana o globina. También se pueden
seleccionar líneas celulares estables que llevan un gen de interés
integrado en los cromosomas después de la
co-transfección con un marcador de selección tal
como GPT, G418 o higromicina. Es ventajoso usar más de un marcador
de selección al comienzo, por ejemplo, G418 más metotrexato.
El plásmido pC40 se digiere con enzimas de
restricción y después se desfosforila usando fosfatasa intestinal
de ternero mediante procedimientos conocidos en la técnica. Después,
el vector se aísla de un gel de agarosa al 1%.
La secuencia de ADN que codifica el mimeticuerpo
de centro de bisagra mimético de EPO completo se usa,
correspondientemente a las regiones variables de HC y LC del
mimeticuerpo de centro de bisagra mimético de EPO de la presente
invención, de acuerdo con etapas de método conocidas. El ácido
nucleico aislado que codifica una región constante humana adecuada
(es decir, regiones HC y LC) también se usa en esta
construcción.
La región variable y constante aislada que
codifica ADN y el vector desfosforilado después se ligan con T4 ADN
ligasa. Después, se transforman células de E. coli HB101 o
XL-1 Blue y se identifican las bacterias que
contienen el fármaco insertado en el plásmido pC4, usando, por
ejemplo, análisis por enzimas de restricción.
Se usan células de ovario de hámster chino (CHO)
que carecen de un gen de DHFR activo para la transfección. 5 \mug
del plásmido de expresión pC4 se co-transfectan con
0,5 \mug del plásmido pSV2-neo usando lipofectin.
El plásmido pSV2-neo contiene un marcador de
selección dominante, el gen neo de Tn5 codifica una enzima que
otorga resistencia a un grupo de antibióticos incluyendo G418. Las
células se siembran en alpha minus MEM complementado con 1
\mug/ml G418. Después de 2 días, las células se tripsinizan y se
siembran en placas de clonación de hibridoma (Greiner, Alemania) en
alpha minus MEM complementado con 10, 25 ó 50 ng/ml de metotrexato
más 1 \mug/ml de G418. Después de aproximadamente
10-14 días, se tripsinizan clones individuales y
después se siembran en placas de petri de 6 pocillos o matraces de
10 ml usando diferentes concentraciones de metotrexato (50 nM, 100
nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Los clones que se desarrollan a las
mayores concentraciones de metotrexato después se transfieren a
nuevas placas de 6 pocillos que contienen concentraciones incluso
mayores de metotrexato (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM). Se repite
el mismo procedimiento hasta que se obtienen clones que se
desarrollan a una concentración de 100-200 mM. La
expresión del producto génico deseado se analiza, por ejemplo,
mediante SDS-PAGE y transferencia de Western o
mediante análisis de HPLC de fase inversa.
Antecedentes: El EMP-1
(péptido mimético de EPO 1) es un péptido de 20 aminoácidos sin
homología de secuencia con la eritropoyetina humana (HuEPO), pero
con la capacidad (como un dímero) de activar el receptor de EPO
(Wrighton et al, 1996, Science, vol.
273,458-463). Sin embargo, su actividad
relativamente baja (de 10.000 a 100.00 veces menor que la de HuEPO)
y semi-vida corta (semi-vida ex
vivo de 8 horas en suero al 50%, semi-vida
in vivo desconocida) compromete su utilidad como un
terapéutico. Por lo tanto, se necesitaba un modo de otorgar al
péptido una semi-vida más prolongada, sin alterar y
posiblemente mejorando su potencia. Con ese propósito se han
realizado varios intentos de aumentar la actividad de
EMP-1 estabilizando la dimerización del péptido o
incorporando el péptido en mayores estructuras para aumentar la
semi-vida. Wrighten et al. (1997, Nature
Biotechnology, vol. 15, 1261-65) combinaron
EMP-1 marcado con biotina con estreptavidina para
estabilizar la dimerización. Observaron un aumento de 100 veces en
la actividad en un ensayo de proliferación de células in
vitro. También usaron anticuerpos anti-biotina
para estabilizar el dímero peptídico, sin embargo, se observó
solamente un aumento de 10 veces en la actividad. Los mismos autores
prepararon una forma dimérica químicamente definida de
EMP-1. En este caso se observó in vivo un
aumento en la actividad de 100 veces. Otro grupo intentó mejorar la
actividad de EMP-1 mediante enlace covalente con
polietilenglicol (PEG) (Johnson et al., 1997, Chem. &
Bio., vol. 4(12), 939-50). Describieron un
aumento en la potencia de hasta 1000 veces, sin embargo, se observó
que la construcción era inmunógena en ratones (los anticuerpos se
dirigían al péptido) (Dana Johnson, Personal communications). Kuai
et al. (2000, J. Peptide Res., vol. 56,
59-62) insertaron el péptido EMP-1
en la secuencia del inhibidor 1 de activador de plasminógeno
(PAI-1). Se pensaba que la inserción de
EMP-1 en este armazón estabilizaría tanto la
dimerización como aumentaría la semi-vida. En un
ensayo in vivo se observó que la potencia de esta
construcción es significativamente superior, tal como más de 2500
veces superior al EMP-1 solo. Se debe señalar que se
usaron diferentes ensayos in vitro y modelos in vivo
en estos estudios y las potencias descritas pueden no ser
comparables entre sí o con los resultados presentados en este
documento.
Un ejemplo especifico, no limitante de esta
invención es la construcción de mimeticuerpo de centro de bisagra
de EMP donde V es los primeros varios aminoácidos
N-terminales de un anticuerpo de HC o LC de origen
natural, P es una copia única del péptido bioactivo
EMP-1 y L es una repetición en tándem del enlazador
flexible Gly-Ser o
Gly-Gly-Gly-Ser
flexible, H es una región de centro de bisagra y CH2 & CH3 son
de las subclase de isotipo IgG 1 o IgG4. Se piensa que esta
estructura restringirá el péptido EMP-1 pero
permitirá suficiente flexibilidad de tal forma que la dimerización
de los péptidos como parte del homodímero ensamblado se estabilice.
En respaldo de esto, la actividad del mimeticuerpo de centro de
bisagra de EMP en un ensayo de proliferación de células in
vitro es más de 500 veces superior a la del péptido
EMP-1 y solamente substancialmente similar a la de
HuEPO recombinante (rHuEPO). Además, se espera que la
semi-vida de esta construcción sea muchas veces la
de rHuEPO o el péptido EMP-1 solo y similar a la de
una IgG. De forma uniforme, los ratones normales tratados con
mimeticuerpo de centro de bisagra de EMP consiguen un hematocrito
máximo significativamente superior en comparación con ratones
tratados con rHuEPO, cuando se proporcionan unidades de actividad
igual y se mantienen los niveles elevados durante un periodo más
prolongado. Esta construcción se secreta de forma eficaz de células
y parece estar plegada apropiadamente; superando los problemas
asociados con los mimeticuerpos de primera generación.
Además de la estructura básica que se ha
descrito anteriormente, se describen variantes con características
biológicas potencialmente favorables. Las mismas incluyen
construcciones que pueden tener una tendencia disminuida a
auto-asociarse, funciones efectoras inmunes
reducidas o inmunogenicidad disminuida. Se consideran otras
modificaciones que otorgan características deseadas tales como
conformación mejorada del péptido biológicamente activo y se
transfieren a través de la barrera hematoencefálica. Las variantes y
las modificaciones propuestas se pueden combinar de cualquier modo
para proporcionar construcciones con actividades deseadas.
Mediante el uso de métodos de ADN recombinante,
el péptido EMP-1 se insertó en un vector intermedio
entre un péptido señal de inmunoglobulina y una secuencia J humana.
Esto se realizó usando oligonucleótidos sintéticos complementarios
con extremos compatibles con los sitios de restricción presentes en
el vector. Estos oligonucleótidos comprendían secuencias
codificantes para el sitio consenso de peptidasa señal (QIQ), el
péptido EMP-1 (SED ID Nº: 2) y un enlazador
flexible compuesto por GS o GGGS. Un fragmento de restricción que
contenía los elementos funcionales que se han mencionado
anteriormente después se transfirió a un vector de expresión. Este
vector contenía el promotor y mejorador de inmunoglobulina
anti-CD4 y la secuencia codificante para una
secuencia de centro de bisagra de IgG1 humana y una porción de una
región de centro de bisagra de IgG1, CPPCP (109-113
de SEC ID Nº: 66, como se muestra en la figura 36C), una región
constante de HC 2 (CH2) y una región constante 3 (CH3) así como los
elementos necesarios para la replicación y selección de plásmidos en
bacterias y selección para expresadores estables en células de
mamífero.
Este plásmido se linealizó e introdujo en la
línea de célula de mieloma de ratón NSO mediante electroporación.
Las células resistentes se seleccionaron y se identificaron los
altos expresadores de mimeticuerpo de centro de bisagra de EMP
mediante ensayo ELISA de sobrenadantes de cultivo. La purificación
de la construcción de los sobrenadantes de cultivo celular se
consiguió mediante cromatografía de afinidad de proteína A
convencional. El paso del producto purificado a través de geles de
poliacrilamida que contienen SDS en condiciones tanto
desnaturalizantes como reductoras confirmó el tamaño esperado del
producto purificado. La identidad de la proteína purificada se
confirmó adicionalmente mediante espectrometría de masas y
secuenciación N-terminal.
Las secuencias de aminoácidos de los
mimeticuerpos de centro de bisagra de EMP se muestran a
continuación. El mimeticuerpo de la SEC ID Nº: 88 está de acuerdo
con la presente invención. Los dominios funcionales se indican
sobre la secuencia codificadora del péptido. La secuencia consenso
de péptido señal de tres aminoácidos se corresponde a los primeros
tres aminoácidos de una inmunoglobulina de origen natural. Se piensa
que estos aminoácidos contribuyen a la eliminación eficaz del
péptido señal por peptidasa señal en el retículo endoplásmico. Esta
secuencia está seguida inmediatamente por la secuencia codificante
de EMP-1. Los dos aminoácidos
C-terminales de la secuencia EMP-1
combinados con los siguientes seis aminoácidos forman un enlazador
flexible caracterizado por la repetición
Gly-Gly-Gly-Ser.
Sigue una secuencia de región de unión (J) humana. Se piensa que la
secuencia J proporcionará incluso más flexibilidad para permitir
que el dímero de EMP-1 asuma la conformación
apropiada y permitirá que el dímero sobresalga de la estructura
globular de la inmunoglobulina y penetre en la hendidura entre los
dos receptores de EPO. La región bisagra de HC también se incluye en
la construcción inmediatamente después de la región J. Existen tres
cisteínas en la región bisagra de IgG1 (resaltada). La primera
normalmente se emparejaría con la cadena ligera (LC) de
inmunoglobulina y la segunda participaría en enlaces intercadena
entre dos HC. El resto de la secuencia está compuesta por las
regiones CH2 & CH3, que constituyen la parte voluminosa de la
proteína. Uno de los motivos por los que se piensa que las
inmunoglobulinas tienen una semi-vida sérica larga
es su capacidad de unirse al FcRn que prolonga la
semi-vida sérica devolviendo la inmunoglobulina
pinocitosada de vuelta al espacio extracelular. El sitio de unión
del
FcRn se solapa con la unión de las regiones CH2 y CH3 (Sheilds et al, 2001, J. Biol. Chem., vol. 276 (9), 6591-6604).
FcRn se solapa con la unión de las regiones CH2 y CH3 (Sheilds et al, 2001, J. Biol. Chem., vol. 276 (9), 6591-6604).
La secuencia peptídica del mimeticuerpo de
centro de bisagra de EMP muestra dominios funcionales
importantes.
Se conoce bien que se ensamblan dos cadenas
pesadas de IgG durante el procesamiento celular mediante enlaces
disulfuro entre cisteínas localizadas en la región bisagra para
formar un homodímero. Se espera que esto también tenga lugar entre
los péptidos modificados para formar la construcción de mimeticuerpo
de centro de bisagra de EMP ensamblada. Además, se espera que el
enlace disulfuro intracadena entre las dos cisteínas también se
formará en el péptido EMP-1. La estructura esperada
de mimeticuerpo de centro de bisagra de EMP contiene dos péptidos
EMP-1. La disposición espacial de los péptidos en el
extremo N junto con la flexibilidad de secuencias adyacentes debe
permitir a los péptidos formar el dímero bioactivo.
La actividad del mimeticuerpo de centro de
bisagra de EMP se ensayó por primera vez en un ensayo de
bioactividad in vitro. Para este ensayo se usó la línea
celular UT-7/EPO dependiente de EPO, procedente de
un paciente con leucemia megacarioblástica aguda (Komatsu et
al., 1993, Blood, vol, 82 (2), 456, 464). Estas células se
someten a muerte celular programada de 48 a 72 horas después de la
retirada de medio complementado con rHuEPO. Las células que se han
incubado en ausencia de rHuEPO durante 24 horas se pueden salvar si
se tratan con rHuEPO o un agonista de EPO. Se añadió mimeticuerpo
de centro de bisagra de EMP a las células privadas de rHuEPO y se
determinó la viabilidad celular 48 horas después del tratamiento
usando compuesto de tetrazolio MTS (CellTiter 96 Aqueous One
Solucion, Promega) que se metaboliza por células vivas para
proporcionar un producto con una absorbancia que se puede medir.
Los resultados de un ensayo típico mostraron la potencia del
mimeticuerpo de centro de bisagra de EMP en una base molar que es
500 veces mayor que el péptido EMP-1 y 5 veces menor
que rHuEPO. Además, estas mismas células se estimularon con
mimeticuerpo de centro de bisagra de EMP y se visualizaron los
patrones de fosforilación de tirosina procesando el lisado celular a
través de un gel de poliacrilamida. El patrón mostrado por el
mimeticuerpo de centro de bisagra de EMP era similar al de rHuEPO,
indicando que el mecanismo por el que el mimeticuerpo de centro de
bisagra de EMP actúa sobre estas células es similar al de
rHuEPO.
Se realizaron estudios in vivo en ratones
normales para comparar la semi-vida de mimeticuerpo
de centro de bisagra de EMP con la de rHuEPO y para comparar sus
efectos sobre la eritropoyesis. Cuando los ratones se dosificaron
de forma igual, el mimeticuerpo de centro de bisagra de EMP dio una
respuesta máxima superior y la respuesta era prolongada en
comparación con rHuEPO.
Las concentraciones séricas tanto de rHuEPO como
de mimeticuerpo de centro de bisagra de EMP se midieron por ELISA.
La semi-vida aproximada de los mimeticuerpos de
centro de bisagra de EMP era al menos varias veces la de
rHuEPO.
Se ha demostrado que la mutación de dos restos
de lisina (L), L234 & L235 en la región bisagra inferior de
IgG1 hasta alanina (A) anulará la capacidad de la inmunoglobulina de
mediar en la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y la
citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (Hezereh
et al., 2001, J. Virol., vol. 75 (24),
12161-68). Los estudios preliminares han mostrado
que el mimeticuerpo de centro de bisagra de EMP no media en la
lisis de complemento de células que expresan el receptor de EPO.
Esto puede deberse al bajo número de receptores que se encuentran
en las células progenitoras eritroides. Además, la expansión in
vivo de progenitores eritroides como se demuestra por aumentos
significativos en el hematocrito respalda la posible irrelevancia
funcional de las funciones efectoras inmunes. Sin embargo, aunque no
se ha observado ningún efecto asociado con función efectora, existe
todavía un interés en la introducción de esta mutación como una
etapa de precaución.
Otra modificación que daría como resultado una
disminución en la mediación de las funciones efectoras inmunes es
la retirada del sitio de unión de glucosilación. Esto se puede
conseguir mediante mutación de la asparagina en la posición 297
(N297) a glutamina (Q). Los cambios adicionales pueden incluir
opcionalmente sustituir la treonina (T) con un aminoácido
alternativo para reducir o modificar la
O-glucosilación, por ejemplo, T34 o T47 con
versiones aglucosiladas de la subclase IgG1 que se conoce que son
malos mediadores de la función efectora inmune (Jefferis et
al., 1998, Immol. Rev., vol. 163, 50-76).
Ventajas: La construcción novedosa, el mimeticuerpo de
centro de bisagra de EMP que se ha descrito anteriormente, ofrece un
modo alternativo de presentar el péptido bioactivo
EMP-1. La actividad de esta construcción está en el
intervalo de rHuEPO y la semi-vida in vivo
es similar a la de una IgG. Además, se espera que las modificaciones
propuestas, en combinación y además de las características
novedosas del mimeticuerpo de centro de bisagra de EMP, mejoren la
utilidad de la construcción de mimeticuerpo de centro de bisagra de
EMP.
Será evidente que la invención se puede
practicar de otro modo que el particularmente descrito en la
anterior descripción y en los ejemplos.
Son posibles numerosas modificaciones y
variaciones de la presente invención a la luz de las anteriores
enseñanzas y, por lo tanto, pertenecen al alcance de la presente
invención.
<110> HEAVNER, George A.;
\hskip1cmKNIGHT, David;
\hskip1cmGHRAYEB, John;
\hskip1cmSCALLON, Bernard;
\hskip1cmNESSPOR, Thomas;
\hskip1cmHUANG, Chichang;
\hskip1cmCentocor, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
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<120> MIMETICUERPOS DE CENTRO DE BISAGRA
MIMÉTICOS DE EPO HUMANA
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<130> CEN5039
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<160> 89
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<170> PatentIn versión 3.3
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<210> 1
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<211> 14
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<212> PRT
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de origen natural
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de origen natural
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de origen natural
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de origen natural
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de origen natural
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de origen natural
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de origen natural
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de origen natural
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de origen natural
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de origen natural
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de origen natural
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de origen natural
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de origen natural
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de origen natural
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de origen natural
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<222> (8)..(8)
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de origen natural
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de origen natural
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complementariedad 2 (CDR2), x es 10-30 (17) de
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complementariedad 3 (CDR3), x es 25-55 (42) de
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complementariedad 1 (CDR1), x es 3-20 (7) de
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cualquier aminoácido
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complementariedad 1 (CDR1), x es 3-20 (5) de
cualquier aminoácido
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<222> (33)..(46)
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<223> flanqueante 2
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (47)..(47)
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<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), x es 10-30 (18) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
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<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (48)..(79)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (80)..(80)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), x es 20-40 (31) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (81)..(100)
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<223> flanqueante 4
\newpage
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<400> 33
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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<223> Región variable de cadena pesada
vh3b
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (1)..(30)
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<223> flanqueante 1
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (31).. (31)
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<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), x es 3-20 (5) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (32)..(45)
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<223> flanqueante 2
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (46)..(46)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), x es 5-25 (11) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
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<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (47)..(78)
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<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (79)..(79)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), x es 15-40 (23) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (80)..(102)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (101)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región variable de cadena pesada
vh3c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31).. (31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), X es 3-20 (5) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(45)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (46)..(46)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), X es 10-30 (19) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (47)..(79)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (80)..(80)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), X es 15-40 (25) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (81)..(101)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\hskip1cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(108)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región variable de cadena pesada
vh4
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
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<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), x es 3-20 (7) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (35)..(48)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (49)..(49)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), X es 10-30 (16) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (50)..(81)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (82)..(82)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), x es 20-45 (32) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (83)..(108)
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<223> flanqueante 4
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(132)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región variable de cadena pesada
vh5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
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<222> (1).. (31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> MISC_FEATURE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), X es 3-20 (5) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(46)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (47)..(47)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), X es 10-30 (17) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (48)..(79)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (80)..(80)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), x es 15-40 (23) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (81)..(132)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(125)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región variable de cadena pesada
vh6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), x es 3-20 (7) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(45)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (46).. (46)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), X es 10-30 (18) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (47)..(78)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (79)..(79)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), X es 5-30 (13) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (80)..(125)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(91)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región variable de cadena pesada
vh7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), x es 3-20 (5) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(45)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (46)..(46)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), X es 10-30 (17) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (47)..(78)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (79)..(79)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), X es 5-30 (13) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (80)..(91)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(93)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región variable de cadena ligera
Kappa 1_4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1(CDR1), X es 10-30 (17) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(40)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(40)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2(CDR2), X es 3-20 (7) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (42)..(73)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (74)..(74)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), X es 20-40 (30) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (75)..(93)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(92)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región variable de cadena ligera
Kappa2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), X es 10-30 (17) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..C39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (40)..(40)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), x es 3-20 (7) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (41)..(72)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (73)..(73)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), x es 20-40 (29) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (74)..(92)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(91)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región variable de cadena ligera
Kappa3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), X es 5-30 (13) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (40).. (40)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), x es 3-20 (7) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (41)..(72)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (73)..(73)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), X es 20-40 (30) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (74)..(91)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(85)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región variable de cadena ligera
Kappa5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), x es 5-20 (11) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25).. (39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (40)..(40)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), x es 3-20 (7) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (41)..(72)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (73)..(73)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), x es 10-30 (19) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (74)..(85)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (67)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región variable de cadena ligera
KappaNewl
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), x es 10-30 (17) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (34)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), x es 3-20 (7) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (35)..(66)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (67)..(67)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), x es 10-30 (21) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (68)..(79)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(65)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región variable de cadena ligera
KappaNew2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), x es 10-30 (18) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), X es 3-20 (7) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)..(64)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (65)..(65) .
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), x es 10-30 (21) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MIST_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (66)..(77)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(95)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región variable de cadena ligera
KappaNew3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), x es 10-30 (17) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(40)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (41)..(41)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), x es 3-20 (7) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (42)..(73)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (74)..(74)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), x es 3-30 (9) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (75).. (95)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(98)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región variable de cadena ligera
Lambda1a
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1). X es 5-25 (14) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2). x es 3-20 (7) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (40)..(71)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (72)..(72)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3). x es 30-50 (39) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (73)..(98)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(99)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región variable de cadena ligera
Lambda1b
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), X es 3-25 (13) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (40)..(40)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), x es 3-20 (7) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (41)..(72)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (73)..(73)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), X es 30-50 (41) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (74).. (99)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(72)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región variable de cadena ligera
Lambda2
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), x es 8-25 (14) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), X es 3-20 (7) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
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<222> (40)..(71)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (72)..(72)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), X es 25-50 (38) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (73)..(99)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
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<222> (1)..(107)
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<223> región variable de cadena ligera
Lambda3a
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
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<222> (1)..(22)
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<223> flanqueante 1
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), X es 5-20 (11) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), X es 3-20 (7) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (40)..(71)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (72)..(72)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), X es 15-40 (26) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
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<222> (73)..(107)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
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<400> 50
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
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<222> (1)..(93)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región variable de cadena ligera
Lambda3b
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 CCDR1), X es 5-20 (11) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (40)..(40)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), x es 3-20 (7) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (41)..(72)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (73)..(73)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), x es 15-40 (27) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (74)..(93)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (98)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región variable de cadena ligera
Lambda3c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), X es 5-20 (11) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), x es 3-20 (7) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (40)..(71)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (72)..(72)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), X es 25-50 (37) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (73)..(98)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(98)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región variable de cadena ligera
Lambda3e
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23).. (23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), X es 5-20 (11) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), x es 3-20 (7) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (40)..(71)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (72)..(72)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), x es 15-40 (26) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (73)..(98)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(94)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región variable de cadena ligera
Lambda4a
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), x es 5-25 (12) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), x es 5-25 (11) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (40)..(71)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (72)..(72)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), X es 10-40 (23) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (73)..(94)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(95)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región variable de cadena ligera
Lambda4b
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), X es 5-25 (12) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(38) <223> flanqueante
2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), X es 5-25 (11) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (40)..(71)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (72)..(72)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), x es 15-40 (25) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (73)..(95)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(75)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región variable de cadena ligera
Lambda5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), X es 5-25 (14) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (40)..(40)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), X es 5-20 (10) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (41)..(74)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (75)..(75)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), x es 10-35 (22) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE <222> (76)..(88)
<223> flanqueante 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(101)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región variable de cadena ligera
Lambda6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), X es 5-25 (13) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..C39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), X es 3-20 (7) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (40)..(73)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (74)..(74)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), X es 25-50 (38) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (75)..(101)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\hskip1cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(72)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región variable de cadena ligera
Lambda7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), X es 5-25 (14) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), X es 3-20 (7) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (40)..(71)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (72)..(72)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), X es 10-35 (23) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (73)..(89)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(89)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región variable de cadena ligera
Lambda8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), X es 5-25 (14) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), X es 3-20 (7) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (40)..(71)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (72)..(72)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), X es 15-35 (25) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (73)-(89)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (91)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región variable de cadena ligera
Lambda9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), X es 5-25 (12) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), X es 5-25 (12) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (40)..(79)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (80)..(80)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), X es 15-40 (28) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (81)..(91)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(87)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región variable de cadena ligera
Lambda9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 1 (CDR1), X es 5-25 (13) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)..(39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 2 (CDR2), X es 3-20 (7) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (40)..(71)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (72).. (72)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región determinante de
complementariedad 3 (CDR3), X es 15-40 (27) de
cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (73)..(87)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> flanqueante 4
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 354
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(354)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región constante pesada lgA1
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(102)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (103)..(121)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> bisagra
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (122)..(222)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (223)..(354)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH3
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 340
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(340)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región constante pesada lgA2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(102)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (103)..(108)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> bisagra
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (109)..(209)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (210)..(340)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 384
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(384)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región constante pesada IgD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(101)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (102)..(135)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> bisagra 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (136)..(159)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> bisagra 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (160)..(267)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (268)..(384)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 497
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(497)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región constante pesada IgE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(103)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (104)..(210)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (211)..(318)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (319)..(497)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 339
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(339)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región constante pesada IGG1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(98)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (99)..(113)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> bisagra
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (114)..(223)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (224)..(339)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH3
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 326
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(326)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región constante pesada lgG2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(98)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (99)..(110)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> bisagra
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (111)..(219)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (220)..(326)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 377
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(377)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región constante pesada lgG3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(98)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (99)..(115)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> bisagra 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_PEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (116)..(130)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> bisagra 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (131)..(145)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> bisagra 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (146)..(160)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> bisagra 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (161)..(270)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (271)..(377)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 327
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(327)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región constante pesada lgG4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(98)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (99)..(110)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> bisagra
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (111)..(220)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (221)..(327)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 476
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(476)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región constante pesada IgM
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(104)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (105)..(217)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (218)..(323)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (324)..(476)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CH4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(107)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Región constante de kappa de cadena
ligera (IgKc)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(107)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región constante lambda de cadena
ligera (IgLambda)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGly Gly Gly Ser
\hfill1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\hskip1cm
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<210> 78
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<223> péptido
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<400> 89
\hskip1cm
Claims (11)
1. Un ácido nucleico que codifica la secuencia
de aminoácidos de la SEC ID Nº: 88.
2. Un polipéptido que comprende todos los
aminoácidos contiguos de la SEC ID Nº: 88.
3. Un vector que comprende el ácido nucleico de
acuerdo con la reivindicación 1.
4. Una célula hospedadora que comprende el ácido
nucleico de acuerdo con la reivindicación 1.
5. Un método para producir un polipéptido de
acuerdo con la reivindicación 2, que comprende traducir un ácido
nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 en condiciones in
vitro, de tal forma que el polipéptido se exprese en cantidades
detectables o recuperables.
6. Una composición que comprende un polipéptido
de acuerdo con la reivindicación 2.
7. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 6, donde dicha composición comprende además al menos
un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
8. Un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 2 para tratar una afección relacionada con ligando de
EPO en un ser humano, donde dicha afección se selecciona entre
anemia, una afección relacionada con células sanguíneas, cáncer,
una enfermedad infecciosa o una enfermedad cardiovascular.
9. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 8, donde dicho polipéptido es para la administración
a 0,000001-500 mg por kilogramo.
10. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que dicha composición es para la
administración por al menos un modo seleccionado entre medio
parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, en embolada,
vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmico.
11. Un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 2, que se puede obtener mediante un método de acuerdo
con la reivindicación 5.
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