ES2329980T3 - Tira de prueba de reactivo que comprende medios de control y medios de temporizador. - Google Patents
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Abstract
Un dispositivo de ensayo inmunocromatográfico de flujo lateral para determinar la presencia de al menos un analito de interés en una muestra líquida, comprendiendo el dispositivo: medios para generar una primera señal, o señal "de prueba", que indica la presencia y/o cantidad de analito de interés en la muestra; y medios para generar una segunda señal, cuya generación indica tanto: (a) que la prueba se ha realizado de manera satisfactoria, como (b) que ha transcurrido el suficiente tiempo tras el contacto del dispositivo de ensayo con la muestra líquida como para leer la prueba y como para que la primera señal se haya generado correctamente; en el que las señales primera y segunda están simultáneamente listas para la lectura, y ambas señales se forman mediante la captura o localización de un reactivo de unión específico marcado con una perla de látex coloreada o con otra marca directa.
Description
Tira de prueba de reactivo que comprende medios
de control y medios de temporizador.
La invención se refiere a un dispositivo de
ensayo, a un método para realizar un ensayo y a un método para
hacer un dispositivo de ensayo.
Los dispositivos de ensayo que emplean
principios inmunocromatográficos son bien conocidos. Los
dispositivos de ensayo "de flujo lateral" son particularmente
comunes. En los dispositivos del tipo de flujo lateral, un reactivo
de unión específico marcado se inmoviliza de manera liberable
sobre una tira de material poroso. Se aplica una muestra líquida a
un extremo de la tira porosa y las propiedades capilares de la tira
transportan la muestra líquida a lo largo de la tira, liberando el
reactivo de unión específico marcado, que se une específicamente al
analito de interés (en un primer sitio de unión del mismo), si
está presente, en la muestra. El reactivo de unión marcado se
captura entonces generalmente en una zona de prueba mediante un
segundo reactivo que tiene una unión específica para un segundo
sitio de unión del analito de interés. El exceso de reactivo de
unión marcado se captura entonces normalmente en una zona de
control, aguas abajo de la zona de prueba mediante un reactivo
control que se une específicamente al reactivo marcado. Los
dispositivos de ensayo de este tipo se describen con más detalle
en, por ejemplo, el documento EP 0291194.
En un dispositivo de ensayo de flujo lateral
conocido (del tipo dado a conocer en los documentos EP 0291194 y EP
0560411), tal como el kit de prueba de embarazo Clearblue®
(disponible de Unipath Ltd, Bedford, Reino Unido), que funciona
detectando la presencia de hCG en una muestra de orina aplicada al
dispositivo de prueba, pueden generarse dos señales visibles. Una
señal es una señal "de control" y se forma por la localización
de perlas de látex azules derivatizadas: las perlas de látex se
recubren con una molécula de inmunoglobulina y se capturan mediante
un anticuerpo de captura, depositado en una línea sobre la varilla
de prueba generalmente perpendicular a la dirección del flujo de
muestra, teniendo el anticuerpo de captura una actividad de unión
específica para la inmunoglobulina transportada sobre las perlas.
La generación de esta señal informa a la usuaria de que:
(i) ni la inmunoglobulina sobre la perla de
látex ni el anticuerpo de captura sobre la varilla de prueba se han
desnaturalizado o degradado de otro modo suficientemente durante
la fabricación o el almacenamiento del kit como para interferir de
manera significativa en la unión específica entre las dos
moléculas; y
(ii) se ha aplicado suficiente muestra líquida
para movilizar las perlas de látex inmovilizadas de manera
liberable y para transportarlas a lo largo de la varilla de prueba
al menos hasta la zona "de control", en la que está ubicado el
anticuerpo de captura.
La importancia de (i) es que la inmunoglobulina
sobre la varilla de prueba es una que se une específicamente al
analito de interés. La señal de control indica que el anticuerpo de
captura y el anticuerpo unido por látex todavía pueden asociarse,
lo que implica que otros reactivos a base de inmunoglobulina (tales
como un reactivo de inmunoglobulina específica de analito) en el
kit de prueba deberá igualmente haber retenido su actividad de
unión específica. La importancia de (ii) es que la zona "de
control" está ubicada aguas abajo de la "zona de prueba",
en la que el analito está unido (junto con cualquier
inmunoglobulina marcada con látex asociada específicamente) mediante
una inmunoglobulina específica de analito adicional, depositada en
una línea sobre la varilla de prueba, generalmente perpendicular a
la dirección de flujo de la muestra. La línea de inmunoglobulina
específica de analito inmovilizada en la zona de prueba es
sustancialmente paralela a, pero aguas arriba de, la línea de
anticuerpo inmovilizado en la zona de control.
De este modo, una muestra de orina que contiene
hCG en contacto con la varilla de prueba en un ensayo realizado
correctamente provocará la deposición de perlas de látex tanto en
la zona de control como en la zona de prueba, dando como resultado
la formación de dos líneas azules visibles para la usuaria: una
línea en la zona de control y una línea en la zona de prueba.
Las instrucciones proporcionadas con el kit
indican a la usuaria que lea el resultado del ensayo 1 minuto tras
retirar la varilla de prueba del contacto con la muestra. En
consecuencia, es necesario que la usuaria tenga acceso a un reloj
externo con el fin de leer el resultado del ensayo después de que
haya transcurrido el intervalo de tiempo correcto.
La marca es generalmente una marca directa, que
es fácilmente visible a simple vista, para que se genere una señal
visual siempre que el reactivo marcado se acumule en una cantidad
suficiente.
Un problema con este tipo de dispositivo de
ensayo es que la señal de prueba tarda un poco de tiempo en
aparecer tras retirar el dispositivo de ensayo del contacto con la
muestra líquida. Obviamente a la usuaria le gustaría leer el
resultado del ensayo lo antes posible pero, igualmente, la usuaria
requiere la confianza de que haya transcurrido el suficiente tiempo
como para que se haya obtenido el resultado del ensayo correcto y
que la prueba no está leyéndose demasiado pronto, sin tener que
esperar un periodo excesivamente largo.
Con el fin de tratar este problema, se conoce la
incorporación de un "temporizador" en un dispositivo de
ensayo, tal como se describe en los documentos EP 0826777 y
WO-A-0186302. En particular, el
documento EP 0826777 da a conocer un dispositivo de ensayo que
comprende, además de los reactivos de ensayo habituales, una
variedad de componentes que interaccionan en un intervalo de tiempo
predeterminado tras la aplicación de la muestra al dispositivo de
prueba, para crear un cambio de color detectable. Estos reactivos
"de temporizador" adicionales se depositan en una sección
"de temporizador" de la tira de prueba y, tras la hidratación
por la muestra, interaccionan para producir un cambio de color.
Además, también se dice que los reactivos "de
temporizador" realizan una función de control de calidad.
Generalmente es indeseable que los dispositivos de ensayo estén
expuestos a la humedad. Sin embargo, como el reactivo de
temporizador cuando se hidrata produce un producto coloreado, el
temporizador revelará si el dispositivo ha estado expuesto a
humedad. La función de "control de calidad" es sin embargo muy
limitada, ya que solamente indica que el dispositivo ha estado
expuesto a una cantidad no cuantificada de humedad. La disposición
dada a conocer en el documento EP 0826777 no puede indicar, por
ejemplo, si los reactivos de prueba han retenido sus propiedades de
unión específica, que pueden deteriorarse con el tiempo,
especialmente si el dispositivo de ensayo se ha almacenado, por
ejemplo, en condiciones de temperatura que son subóptimas.
En un primer aspecto la invención proporciona un
dispositivo de ensayo para determinar la presencia de al menos un
analito de interés en una muestra líquida, comprendiendo el
dispositivo medios para generar una primera señal (la señal "de
prueba") que indica la presencia y/o cantidad de analito de
interés en la muestra; y medios para generar una segunda señal,
cuya generación indica:
(a) tanto que la prueba se ha realizado de
manera satisfactoria,
(b) como que ha transcurrido el suficiente
tiempo tras el contacto del dispositivo de ensayo con la muestra
líquida como para leer la prueba y como para que la primera señal
se haya generado correctamente.
El dispositivo de ensayo es un dispositivo de
ensayo inmunocromatográfico de flujo lateral.
El analito de interés puede ser cualquier
molécula adecuada tal como un polipéptido o péptido, ácido
nucleico, esteroide o similares. De manera conveniente, el analito
es una hormona. En una realización particular, el analito es una
hormona sexual tal como hormona luteinizante (LH) o una hormona
asociada al embarazo, tal como la gonadotropina coriónica humana
(hCG). En otras realizaciones, el analito de interés puede ser una
droga, tal como un opiáceo, anfetamina o cocaína.
La muestra líquida puede ser un líquido
ambiental (por ejemplo, agua de una fuente tal como un río, lago u
océano, o una disolución acuosa), pero más preferiblemente es una
muestra de un fluido corporal que comprende, por ejemplo, sangre,
plasma, suero, saliva, orina, sudor, fluido lacrimal, fluido
vaginal y similares. De los anteriores, la orina es la muestra
preferida, ya que puede obtenerse fácilmente sin técnicas de
muestreo invasivas y es una muestra relevante para el analito
preferido, hCG.
Las señales primera y/o segunda pueden, por
ejemplo, ser señales visibles. Generalmente se prefiere que las
señales tanto primera como segunda sean señales visibles. Los
medios para generar las respectivas señales primera y segunda serán
generalmente de tipo convencional. La primera señal o señal "de
prueba" y la segunda señal se forman ambas mediante la captura o
localización de perlas de látex coloreadas u otro reactivo de unión
específico marcado directamente, generalmente como se da a conocer
en los documentos EP 0291194 y EP 0560411. Resultará evidente para
los expertos en la técnica que el dispositivo de prueba puede
usarse para someter a prueba la presencia de más de un analito de
interés en una muestra. Por ejemplo, pueden proporcionarse dos
reactivos de unión específicos de analito diferentes en el
dispositivo, cada uno específico para un respectivo analito de
interés. La "primera" señal de prueba puede por tanto
comprender, en algunas realizaciones, una pluralidad de señales
diferentes, correspondiendo cada señal a la presencia o ausencia de
un analito respectivo. Por tanto, la expresión "primera señal"
no deberá interpretarse como limitada a la generación de una única
señal de prueba.
Además, es al menos posible que la
"segunda" señal pueda comprender ella misma una pluralidad de
señales. Por ejemplo, aunque se prefiere que la segunda señal se
genere en una única ubicación, también es posible que la segunda
señal se genere en dos ubicaciones diferentes sobre el dispositivo
de ensayo, por ejemplo una zona "de control" que indica la
señal de control, y una zona "de temporizador" que indica la
señal "de temporizador". En las realizaciones de este tipo, en
las que los dos componentes de la segunda señal se generan en
ubicaciones diferentes, se prefiere que la señal de control y la
señal de temporizador se generen (a) sustancialmente de manera
simultánea (es decir, a 1-5 segundos entre sí) y/o
(b) por el mismo reactivo que genera señal. Un medio, por ejemplo,
para obtener la generación sustancialmente simultánea de una señal
de control/de temporizador de dos componentes es proporcionar la
zona de control y la zona de temporizador en puntos en el
dispositivo de ensayo a los que llegan sustancialmente de manera
simultánea los respectivos reactivos que generan señal de control y
de temporizador. Cuando los reactivos que generan señal de control
y de temporizador tienen sustancialmente la misma velocidad de
avance a lo largo de la varilla de prueba, las zonas de control y
de temporizador pueden proporcionarse en una relación
colateral.
Los dispositivos de ensayo de la técnica
anterior, tales como el dispositivo de ensayo proporcionado en el
kit de prueba Clearblue®, incluyen medios para generar una primera
señal "de prueba" y una segunda señal "de control",
indicando la segunda señal que la prueba se ha realizado de manera
satisfactoria. Sin embargo, en el dispositivo de ensayo
proporcionado en el kit de prueba Clearblue® no hay ningún medio de
asegurarse de que la señal de control aparece solamente después de
un intervalo predeterminado específico tras el contacto del
dispositivo de ensayo con la muestra, y que coincide con el punto
de tiempo deseado en el que se pretende leer el resultado del
ensayo. En contraposición, es un requisito esencial de la presente
invención que la señal que actúa como señal de control (es decir,
que indica que los reactivos de prueba retienen suficiente
funcionalidad y propiedad de unión específica para que se obtenga
un resultado significativo de la prueba) para indicar que la prueba
se ha realizado de manera satisfactoria, solamente se genere un
tiempo predeterminado específico tras haber puesto en contacto el
dispositivo con la muestra, tiempo que también coincide con el
punto de tiempo en el que se pretende leer el resultado del
ensayo.
ensayo.
De este modo, la segunda señal no sólo actúa
como señal de control sino también como "temporizador"
integral de ensayo. Por tanto, en uso, el dispositivo de ensayo da
lugar a una señal que tiene al menos dos fines distintos.
En particular, es necesario que el dispositivo
de ensayo de la invención esté dispuesto de modo que la segunda
señal (la señal de control/de temporizador de doble fin) solamente
se forme en un tiempo en el que la primera señal (la señal de
prueba) se habrá formado correctamente, es decir una señal de
prueba positiva si el analito de interés está presente en la
muestra, y una señal de prueba negativa (de la que puede fiarse con
seguridad) si el analito no está presente o está presente a una
concentración por debajo de la sensibilidad mínima reivindicada
para el dispositivo de ensayo. En la práctica, un resultado
negativo se indica normalmente mediante la no aparición de una
señal visible en la zona de prueba.
Un dispositivo de ensayo típico, tal como el kit
de prueba de embarazo Clearblue®, está listo para usarse
aproximadamente 1 minuto tras retirar el dispositivo del contacto
con la muestra, manteniéndose habitualmente el dispositivo en una
corriente de orina durante aproximadamente 5 segundos. Por tanto,
en realizaciones preferidas, un dispositivo de ensayo según la
presente invención dará lugar a la segunda señal aproximadamente 1
minuto tras retirar el dispositivo del contacto con la muestra. Sin
embargo, otros dispositivos de ensayo pueden leerse normalmente
tras otros intervalos de tiempo (por ejemplo cualquiera desde 30
segundos hasta 5 minutos) y por tanto en otras realizaciones la
segunda señal puede formarse en un tiempo superior o inferior a 1
minuto tras el contacto con la muestra.
Pueden emplearse una gran variedad de métodos
para controlar el tiempo que transcurre entre poner en contacto el
dispositivo de ensayo con la muestra y la formación de la segunda
señal. Estos incluyen, pero no se limitan a: métodos que modulan el
tiempo que se tarda en transportar la muestra hasta la zona de
control y/o métodos que modulan el tiempo que tarda la perla de
látex u.otro reactivo que genera señal en alcanzar la zona de
control.
En el dispositivo de ensayo Clearblue®, la
segunda señal (es decir la señal "de control") generalmente
aparece aproximadamente 20 segundos tras retirar el dispositivo de
ensayo del contacto con la muestra. En consecuencia, con el fin de
modificar un dispositivo de ensayo Clearblue® convencional para
ajustarse a los requisitos de la presente invención, sería
necesario retardar la aparición de la segunda señal en
aproximadamente 40 segundos, con el fin de indicar a la usuaria
cuándo ha transcurrido 1 minuto y que el resultado de la prueba
está listo para la lectura.
Los métodos para conseguir un retardo de este
tipo en la aparición de la segunda señal incluyen una o más maneras
de reducir el caudal de la muestra y/o el o los reactivos que
generan señal dentro del dispositivo, tal como:
(i) aumentando el tamaño de la perla de látex u
otro resto unido al reactivo que genera señal;
(ii) alterando las propiedades reológicas de la
muestra, por ejemplo incorporando un inhibidor de caudal en el
dispositivo de ensayo - esto podría comprender, por ejemplo,
incorporar una cantidad eficaz de un compuesto polihidroxilado, tal
como un azúcar (por ejemplo sacarosa) u otro viscosificante en la
mecha u otra parte del dispositivo, resuspendiéndose el compuesto
tras el contacto con la muestra y alterando las propiedades
reológicas del mismo, específicamente la viscosidad de la
muestra;
(iii) alterando las propiedades de flujo del
dispositivo de ensayo, por ejemplo seleccionando una membrana con
diferentes propiedades de flujo (por ejemplo diferente porosidad y/o
de diferente material) o estratificando una o ambas superficies de
la membrana (normalmente estratificación sólo de la superficie
superior, es decir la superficie que está más alejada de la persona
que lo observa cuando se lee el resultado del ensayo). Puede ser
deseable usar un dispositivo de ensayo que comprenda una tira de
prueba compuesta de dos partes: una parte aguas arriba con una
membrana de caudal relativamente alto, y una parte aguas abajo
entre la zona de prueba y la zona de control, con una membrana de
caudal relativamente bajo.
Alternativamente, un retardo en la aparición de
la segunda señal podría obtenerse aumentando la distancia que se
requiere que la muestra (junto con el reactivo que genera señal
resuspendido) migre dentro del dispositivo de ensayo antes de
llegar a la zona de control. Esto puede efectuarse moviendo
simplemente la zona de control más aguas abajo, lejos de la mecha.
Otro enfoque es hacer que la segunda señal aparezca sustancialmente
al mismo tiempo que en el dispositivo Clearblue® convencional pero
reducir el tiempo que tarda la reacción de la prueba en producir la
primera señal en la zona de prueba. Esto puede efectuarse moviendo
la zona de prueba más aguas arriba, hacia la mecha. En cualquier
enfoque, el resultado neto es el aumento de la separación espacial
(y por tanto temporal) entre las zonas de prueba y de control, de
modo que las señales de prueba y de control están listas
simultáneamente para la
lectura.
lectura.
Otro tipo de enfoque no afecta a la generación
de la señal, sino que más bien pretende imponer un retardo tras su
detección o percepción por una usuaria. Por tanto, por ejemplo,
cuando la segunda señal es la aparición de una línea, mancha u otra
marca coloreada o señal visible, el efecto deseado puede obtenerse
aumentando el retardo antes de que la usuaria vea la señal visible
generada. Por ejemplo puede aplicarse una cubierta traslúcida a la
zona de control ocultando así de manera incompleta la zona de
control a la usuaria. Esto puede realizarse, por ejemplo, aplicando
una capa traslúcida de material estratificado de plástico u otro
material a la superficie inferior de la zona de control (es decir
el lado de la varilla de prueba que se examina por una usuaria para
leer el resultado del ensayo). Los materiales adecuados incluyen
ARcare® 7823 (disponible de Adhesives Research Europe Ltd, Great
Dunmow, Essex, Reino Unido) y material estratificado "de plata
escarchada" S/S (disponible de Davies Industrial Supplies,
Letchworth, Herts, Reino Unido).
Resultará evidente para los expertos en la
técnica que ninguno de los métodos tratados anteriormente son
excluyentes entre sí y cualquiera de los métodos puede usarse
aisladamente o junto con uno o más métodos adicionales cualquiera.
Además no se pretende que la lista sea de ningún modo exhaustiva, y
otros métodos para conseguir el objetivo deseado pueden ser
evidentes para los expertos en la técnica dado el beneficio de la
presente descripción.
También resultará evidente que, en aquellas
realizaciones en las que puede desearse reducir el tiempo que se
tarda en generar la segunda señal, entonces hacer generalmente lo
opuesto a los métodos explicados de manera resumida anteriormente
conseguirá el efecto deseado.
Una característica preferida significativa
adicional de la invención es reducir lo que puede denominarse como
el tiempo "de desarrollo de señal". Éste es el periodo de
tiempo que tarda en desarrollarse la segunda señal, desde su
aparición inicial, perceptible por algunos observadores (digamos,
menos del 20%), hasta una señal clara no ambigua perceptible por
más del 95% de los observadores (seleccionados al azar de la
población humana). Así, por ejemplo, la señal de control del
dispositivo convencional de ensayo Clearblue® tiene un tiempo de
desarrollo de señal relativamente largo, tardando aproximadamente
15 segundos en desarrollarse desde el primer matiz azul apenas
visible en la zona de control hasta una fuerte marca azul definida
que es fácilmente evidente. Aunque esto es aceptable cuando la
señal realiza solamente la única función de actuar como indicador
de control, un tiempo de desarrollo de señal largo es indeseable
cuando también se pretende que la señal actúe como temporizador,
dado que introduce incertidumbre en la mente de la usuaria en lo
que respecta a cuándo debe leerse el resultado de la prueba de
ensayo (por ejemplo ¿tras la percepción inicial de la segunda señal
o tras percibir la finalización del desarrollo o en algún punto
intermedio durante los 15 segundos intermedios de tiempo de
desarrollo?).
En consecuencia, es una característica preferida
de la presente invención que el tiempo de desarrollo de señal de
la segunda señal sea inferior a 15 segundos, preferiblemente
inferior a 12 segundos, más preferiblemente inferior a 10 segundos
y lo más preferiblemente inferior a 8 segundos. En general, cuanto
menor sea el tiempo de desarrollo de señal, mejor, de modo que se
da una indicación casi instantánea a la usuaria de cuándo leer el
resultado del
ensayo.
ensayo.
Los inventores han ideado varios métodos para
reducir el tiempo de desarrollo de señal. Una técnica es aplicar un
depósito separado de anticuerpo marcado con látex de control (u
otro reactivo marcado que genera señal de control en otras
realizaciones) más próximo a la zona de control y/o en una zona más
exactamente definida. Se encuentra que esto es eficaz, porque el
látex de control, cuando se resuspende mediante la captación de
muestra, tiende a pasar a estar bastante disperso durante su
migración a lo largo del dispositivo de ensayo, de modo que el
látex de control llega a la zona de control a lo largo de un
periodo prolongado. Esta dispersión puede reducirse reduciendo la
distancia que el látex de control tiene que desplazarse antes de
llegar a la zona de control. Así, por ejemplo, en una realización
el tiempo que tarda en formarse la segunda señal puede aumentarse
desplazando la zona de control aguas abajo, mientras que, al mismo
tiempo, el tiempo de desarrollo de señal puede reducirse
depositando el látex de control más próximo a la zona de
control.
Otro método, más preferido, de reducción del
tiempo de generación de señal es aumentar la cantidad de látex de
control aplicado al dispositivo de ensayo. Esto se consigue
convenientemente aumentando la concentración de la suspensión de
látex de control aplicada al dispositivo de ensayo.
Aproximadamente un 2% p/v de látex es
particularmente adecuado, lo que, para una realización típica,
daría como resultado la deposición de aproximadamente 22 \mug de
látex de control por dispositivo de ensayo.
En un segundo aspecto, la invención proporciona
un método para realizar un ensayo, que comprende el uso de un
dispositivo de ensayo según el primer aspecto de la invención
definido anteriormente.
Las diversas características de la invención se
describirán ahora adicionalmente a modo de ejemplo ilustrativo y
con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
las figuras 1 y 2 son diagramas de barras que
comparan la intensidad de la señal de control generada tras 40 ó 60
segundos usando dispositivos de ensayo que comprenden diversas
membranas de nitrocelulosa; y
la figura 3 es un gráfico de la intensidad de la
señal de control (unidades "Quasar" arbitrarias) frente al
tiempo (segundos).
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron un cierto número de experimentos
para demostrar la viabilidad de alterar el retardo entre poner en
contacto un dispositivo de ensayo con la muestra y la formación de
la segunda señal en la zona de control. Como modelo, los inventores
usaron el kit de prueba de embarazo Clearblue®, disponible
comercialmente de Unipath Ltd (Bedford, Reino Unido).
En el contexto del dispositivo Clearblue®, sería
necesario que la señal de control se formara en 60 segundos tras
poner en contacto el dispositivo de ensayo con una muestra de
orina, con el fin de que la señal indicara adicionalmente a una
usuaria que ha transcurrido la cantidad de tiempo deseada y que el
resultado del ensayo está listo para la lectura. Pruebas
preliminares mostraron que, con el dispositivo Clearblue® existente,
la señal de control generalmente aparecía 20-25
segundos tras una incubación inicial (de 20 segundos) con una
muestra de orina. En consecuencia, con el fin de modificar el
dispositivo existente sería necesario retardar la aparición de la
segunda señal en 35-40 segundos.
Se investigaron diversos enfoques con vistas a
obtener el retardo deseado en la aparición de la segunda señal.
Se llevaron a cabo pruebas para determinar la
posición en el dispositivo que el frente de la muestra alcanzaba en
1 minuto. El valor obtenido fue de 25,0 mm medidos desde la parte
inferior de la nitrocelulosa.
Con la línea de control a 16,5 mm medidos desde
el extremo inferior agua abajo de la tira de nitrocelulosa (la
posición de la línea de control en el dispositivo Clearblue® actual)
usando látex al 0,75% p/v en sólidos y un tiempo de incubación de
20 segundos para el contacto con una muestra de orina, entonces
tras 10 segundos la señal de la línea de control ya era visible con
una intensidad de 5 unidades (arbitrarias) Quasar y tras 60
segundos la intensidad estaba a 12-13 unidades
Quasar. (A modo de explicación el aparato Quasar® es un dispositivo
usado por los inventores para cuantificar la intensidad de las
señales visibles generadas por varillas de prueba de flujo lateral:
se ilumina la varilla de prueba con una luz y se mide la intensidad
de la luz mediante un detector al otro lado de la varilla de
prueba: la proporción de luz absorbida [y por tanto la intensidad
de las señales de prueba] se evalúa comparando la cantidad de luz
transmitida a través del dispositivo en presencia y ausencia de la
señal en la varilla). Con la línea de control a 25,0 mm, la
intensidad a los 10 segundos fue de aproximadamente 1 unidad Quasar
y fue de entre 6 y 8 unidades Quasar a los 60 segundos, y tardó 40
segundos en alcanzar una intensidad de 3-5
unidades, es decir la menor intensidad a la que las personas
inexpertas que realizan la lectura percibían una línea de control.
Por tanto, mover la posición de la línea de control desde 16,5 mm
hasta 25,0 mm retardó significativamente la formación de la línea
de control.
Se propuso que usar una membrana de
nitrocelulosa que fluyera más lentamente que la usada actualmente
para el dispositivo Clearblue® podría retardar la formación de la
señal de control. Se controla el caudal de la nitrocelulosa
mediante el tamaño de poro y esto, a su vez, se controla o bien
mediante la cantidad de agua en la mezcla de nitrocelulosa (para
controlar las velocidades de flujo dentro de un intervalo pequeño)
o bien cambiando toda la mezcla de la nitrocelulosa (es decir
incorporando cantidades variables de detergentes, tensioactivos,
agua y nitrocelulosa), para provocar una alteración importante del
caudal. Se sometieron a prueba varias membranas tanto de Schleicher
and Schuell GmbH ("S&S" Dassel, Alemania) como de
Millipore: 170/100 de S&S y la gama de membranas HiFlow de
Millipore: HF75, HF90, HF120, HF135, HF180, HF240.
Se usó la membrana 170/100 de S&S en un
experimento con partículas de látex de 100 nm de diámetro. Se
encontró que el látex de 100 nm podía fluir hasta la posición de la
línea de control (16,5 mm) de la membrana de nitrocelulosa 170/100
en el plazo de 1 minuto, pero que las partículas de látex de 380 nm
(el tamaño usado en el dispositivo Clearblue® convencional) tardaron
más de 5 minutos en alcanzar la zona de control. En consecuencia,
el uso de la membrana 170/100 de S&S puede ser adecuado junto
con partículas de látex de menor tamaño.
También se realizó un experimento sobre la
generación de la línea de control usando cada velocidad de
nitrocelulosa de la gama HiFlow (HF75, HF90, HF120, HF135, HF180 y
HF240) de las membranas de nitrocelulosa disponibles de la empresa
Millipore (Bedford, MA, EE.UU.). Los números se refieren al tiempo
en segundos que tarda el líquido en fluir 4 cm hacia arriba de la
tira cuando se sometió a prueba en los laboratorios de
Millipore.
Las características deseadas para la membrana de
nitrocelulosa eran que la línea de control no podía verse a los 40
segundos (es decir <5 unidades Quasar) tras la incubación con la
muestra pero podía verse a los 60 segundos (es decir >5 unidades
Quasar). Una intensidad de 5 unidades Quasar se tomó como la
intensidad de señal mínima discernible por una persona inexperta
que realiza la lectura. Se sometieron a prueba las diversas
membranas con una muestra de orina sin hCG y con una muestra de
orina que contenía hCG a una concentración de 400 mUI/ml. Los
resultados se muestran en las figuras 1 y 2 respectivamente.
Las figuras 1 y 2 son diagramas de barras que
muestran la intensidad de la señal de zona de control (medida en
unidades "Quasar" arbitrarias) tras 40 ó 60 segundos, tras la
incubación con una muestra de orina desprovista de hCG (figura 1) o
que contenía hCG a 400 mUI/ml (figura 2), para el dispositivo
Clearblue® actual y para cada dispositivo equivalente preparado
usando una membrana de nitrocelulosa de Millipore con un caudal
diferente.
Las figuras muestran que la membrana que mejor
se ajusta a los criterios deseables era HF180, que proporcionó una
señal de zona de control con un intensidad inferior a 5 unidades
tras 40 segundos, pero una señal de aproximadamente 10 unidades tras
60 segundos, independientemente de si la muestra a prueba contenía
hCG.
Si se permitiera que la línea de control se
formara de manera normal pero su percepción por parte de la usuaria
pudiera retardarse suficientemente, entonces sería posible
retardar la aparición efectiva de la señal de control. La
percepción de la línea de control por parte de la usuaria podría
retardarse estratificando un material traslúcido por encima del
área de la zona de control. Esto significaría que la usuaria sólo
podría ver una línea de control suficientemente intensa en la zona
de control.
Se fijó un material estratificado de refuerzo
(ARcare® 7823, de Adhesives Research Europe Ltd) en posición
(usando cinta adhesiva) de modo que no se cubriera la zona de
prueba (por tanto la aparición de la propia línea de prueba no se
alteró), pero cubriendo la zona de control. El material
estratificado usado era traslúcido, con un aspecto lechoso y se
colocó sobre el lado visto a través de la ventana de control. Este
material estratificado ralentizó la percepción de la generación de
la línea de control bloqueando una intensidad de señal de
aproximadamente 5 unidades Quasar y por tanto retardando la línea de
control para el Clearblue® existente desde 20 segundos hasta 30
segundos. Muestras de otros materiales estratificados están
actualmente en investigación.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se explicó anteriormente, cuando la
señal de control realiza también una función de temporizador, como
en la presente invención, es deseable que se minimice el tiempo de
desarrollo de señal. Los inventores realizaron algunos experimentos
para investigar la reducción del tiempo de desarrollo de señal, en
el contexto del dispositivo convencional de ensayo Clearblue®.
El producto convencional Clearblue® contiene
aproximadamente 7,6 \mug de látex de control, aplicado al
dispositivo a partir de una suspensión de látex al 0,5% p/v. El
látex de prueba también se unirá a la línea de control. Los
inventores pretendían determinar si el aumento de la cantidad de
látex de control depositado en el dispositivo reduciría el tiempo
de desarrollo de la señal de control. Se realizó un experimento en
el que se depositó látex de control sobre un dispositivo de ensayo
a partir de una suspensión al 0,75, 1,50 y 2,0% (p/v) de látex, y
se comparó el tiempo de desarrollo de señal. Los resultados se
muestran en la figura 3, que es un gráfico de la intensidad de
señal (unidades "Quasar") frente al tiempo.
La figura 3 muestra que la línea de control
tardó 15 segundos en desarrollar una intensidad que pudiera verse
por personas inexpertas que realizan la lectura (es decir 5
unidades) con látex de control a partir de una suspensión al 0,75%.
La línea de control tardó menos de 10 segundos en desarrollar la
misma intensidad cuando se depositó látex al 2,0% p/p en sólidos.
Los resultados también mostraron que la intensidad de la línea de
control a los 60 segundos aumentaba enormemente desde la intensidad
de 11 unidades Quasar obtenidas usando látex al 0,75% en sólidos
hasta 42 unidades Quasar obtenidas usando látex al 2,0% en
sólidos.
Claims (11)
1. Un dispositivo de ensayo inmunocromatográfico
de flujo lateral para determinar la presencia de al menos un
analito de interés en una muestra líquida, comprendiendo el
dispositivo: medios para generar una primera señal, o señal "de
prueba", que indica la presencia y/o cantidad de analito de
interés en la muestra; y medios para generar una segunda señal,
cuya generación indica tanto:
(a) que la prueba se ha realizado de manera
satisfactoria, como
(b) que ha transcurrido el suficiente tiempo
tras el contacto del dispositivo de ensayo con la muestra líquida
como para leer la prueba y como para que la primera señal se haya
generado correctamente;
en el que las señales primera y segunda están
simultáneamente listas para la lectura, y ambas señales se forman
mediante la captura o localización de un reactivo de unión
específico marcado con una perla de látex coloreada o con otra
marca directa.
2. Un dispositivo según la reivindicación 1, en
el que el analito es hCG.
3. Un dispositivo según una cualquiera de la
reivindicación 1 ó 2, en el que tanto los medios para generar la
primera señal como los medios para generar la segunda señal
comprenden un reactivo de unión específico marcado con látex.
4. Un dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la segunda señal se genera
aproximadamente 1 minuto después de poner en contacto el
dispositivo con la muestra.
5. Un dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la segunda señal tiene un
tiempo de desarrollo de señal inferior a 10 segundos.
6. Un dispositivo según la reivindicación 5, en
el que la segunda señal tiene un tiempo de desarrollo de señal
inferior a 8 segundos.
7. Un dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el dispositivo comprende un
depósito de reactivo de unión específico de analito, marcado, y,
aguas abajo del mismo, un depósito de reactivo de unión específico
de control, marcado.
8. Un método para realizar un ensayo para
determinar la presencia de un analito de interés en una muestra,
comprendiendo el método las etapas de: poner en contacto cualquier
dispositivo de ensayo según una cualquiera de las reivindicaciones
1-7 con la muestra; observar la aparición de la
segunda señal; y observar la aparición de la primera señal cuando
haya aparecido la segunda señal.
9. Un método según la reivindicación 8, en el
que la muestra es una muestra de fluido corporal.
10. Un método según la reivindicación 9, en el
que la muestra es orina.
11. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 8, 9 ó 10, en el que el analito de interés es
hCG.
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