ES2330239T3 - Usos de carbamoilfosfato sintetasa 1 (cps 1) como biomarcador humoral para la diagnosis de afecciones tumorales. - Google Patents
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Abstract
Uso de la carbamoilfosfato sintetasa (CPS 1) y/o de sus fragmentos con inmunorreactividad de CPS 1 como biomarcador humoral para la diagnosis in vitro y el control evolutivo y terapéutico de afecciones tumorales.
Description
Usos de la carbamoilfosfato sintetasa 1 (CPS 1)
como biomarcador humoral para la diagnosis de afecciones
tumorales.
La presente invención se refiere a nuevos usos
de la enzima carbamoilfosfato sintetasa 1 (E.C. 6.3.4.16, llamada
siempre abreviadamente de aquí en adelante CPS 1) y/o de fragmentos
de CPS 1 que se dan fisiológicamente y presentan inmunorreactividad
de CPS 1 como biomarcador humoral para la diagnosis médica para la
detección de afecciones tumorales (como marcador tumoral humoral),
es decir para la diagnosis de afecciones tumorales mediante la
detección de CPS 1 o de inmunorreactividad de CPS 1 en la
circulación, y en particular en el suero o plasma de pacientes a
los que se les efectúa un examen rutinario para detectar una posible
presencia de tumores, con respecto a los cuales hay una sospecha
fundada de tumores, o en los cuales ya fue detectado un tumor y que
se tienen en observación o sometidos a una terapia.
Dentro del marco de la presente solicitud, el
concepto de "tumor" se usa como concepto general o sinónimo
para las neoplasias, y en particular para las neoplasias malignas
como las que son típicas de las afecciones cancerosas (carcinomas).
En un país como Alemania enferman cada año de neoformaciones
malignas (tumores malignos), es decir de cáncer, más de 300.000
hombres y mujeres, siendo considerables tanto el número de nuevos
casos de cáncer que se diagnostican anualmente como la mortalidad.
Los tumores malignos pueden producirse en casi cada tejido u
órgano, y según el órgano afectado se distingue entre numerosas
afecciones cancerosas, que pueden diferenciarse considerablemente
entre sí tanto con respecto a su frecuencia estadística como con
respecto a su prognosis y su tratabilidad.
En los últimos años se ha desarrollado una
pluralidad de terapias que han traído consigo considerables avances
con respecto a la curabilidad de numerosas formas de afecciones
cancerosas. En todos los casos se cumple sin embargo la regla de
que las probabilidades de curación de las afecciones cancerosas son
siempre tanto mayores cuanto mayor sea la antelación con la que se
identifique la afección cancerosa. Es a este respecto muy
particularmente importante una identificación anticipada del cáncer
en un punto en el tiempo en el que no hayan surgido aún síntomas
clínicos o síntomas clínicos significativos.
Para la identificación lo más anticipada posible
de tumores en la diagnosis clínica se determinan en muestras
biológicas, y en particular en muestras de sangre y secreciones
corporales de los pacientes examinados, los llamados "marcadores
tumorales". Los marcadores tumorales son sustancias que son
formadas directamente por las células tumorales malignas, o bien se
producen debido a que las células tumorales inducen la síntesis del
respectivo marcador en células no tumorales. Al detectarse
marcadores tumorales en elevada concentración en muestras
biológicas líquidas (marcadores tumorales humorales) o localizados
en el tejido (marcadores tumorales celulares), permiten según las
circunstancias específicas del caso individual en cuestión una
identificación anticipada de tumores malignos en grupos de riesgo,
sirven para la diagnosis tumoral primaria y permiten la enunciación
de pronósticos y/o una supervisión de una terapia tumoral y dado el
caso una identificación anticipada de una recidiva tumoral. En la
presente solicitud se usa como concepto general para todas las
posibilidades de aplicación más específicas que se mencionan
(indicaciones) el concepto de "diagnosis". Se da una visión de
conjunto sobre los marcadores tumorales actualmente usados en la
diagnosis clínica en Lothar Thomas (redactor), Labor und Diagnose,
5ª edición ampliada, capítulo 34, véase en particular el resumen
34.1 "Afecciones Malignas" en las páginas
956-961, así como las contribuciones a los distintos
marcadores tumorales utilizados clínicamente en
34.2-34.17 en las páginas
916-1019.
Es común a todos los marcadores tumorales que se
determinan actualmente el hecho de que la sensibilidad de su
determinación es relativamente limitada, y de que los mismos
presentan una relativamente alta especificidad orgánica. La
relativamente alta especificidad orgánica de los marcadores
tumorales que se determinan actualmente tiene por un lado la
ventaja de que al producirse su detección se obtiene al mismo tiempo
una información sobre el órgano en el que con una alta probabilidad
ha surgido la afección cancerosa causal. Una alta especificidad
constituye sin embargo una desventaja en la medida en que con la
determinación de marcadores tumorales organoespecíficos no son
detectables las afecciones cancerosas de otros órganos, o en que
para una identificación anticipada completa es necesaria una
simultánea determinación de numerosos marcadores tumorales
distintos. La relativamente baja sensibilidad de la determinación
de los marcadores tumorales conocidos (con una alta sensibilidad de
una determinación se identifican correctamente la mayoría de los
enfermos o todos los enfermos), que según la afección cancerosa y
el marcador tumoral está situada entre un 20 y un 80%, tiene como
consecuencia el hecho de que, a pesar de la determinación de los
marcadores tumorales en sí adecuados para ello, sigue siendo
bastante considerable el peligro de una no identificación de
afecciones cancerosas.
Sigue habiendo por consiguiente necesidad de
nuevos biomarcadores humorales, y en particular de marcadores
tumorales humorales que debido a una propia organoespecificidad o
sensibilidad característica y ya al proceder a su determinación en
solitario o bien en combinación con la determinación de otro
biomarcador/marcador tumoral o de otros varios
biomarcadores/marcadores tumorales permitan una diagnosis mejorada,
y en particular una diagnosis de cáncer mejorada.
La presente invención se refiere a la
identificación de un biomarcador humoral que puede servir de nuevo
marcador tumoral humoral, y a todos los posibles usos derivados de
esta identificación en el ámbito de la diagnosis tumoral.
Las reivindicaciones están destinadas a proteger
al amparo de la legislación en materia de patentes a estos usos o
procedimientos de diagnosis in vitro haciendo uso de la
determinación del nuevo marcador tumoral humoral.
La presente invención se basa en la sorprendente
constatación de que en la circulación, es decir en particular en
los plasmas o sueros de pacientes en los que fueron identificados
tumores clínicamente distintos, en particular de partes blandas u
órganos internos, eran detectables con en parte excelente
sensibilidad concentraciones claramente elevadas de la enzima
carbamoilfosfato sintetasa (CPS 1), o sea una fuerte
inmunorreactividad de CPS 1, y ello se daba concretamente en claro
contraste con los sujetos sanos de control, lo cual hace de la CPS
1 y de la inmunorreactividad de CPS 1 un nuevo marcador tumoral
humoral.
Usando un inmunoensayo que había sido
desarrollado en conexión con el diagnóstico de sepsis y permite
selectivamente la detección o la medición de CPS 1 o de la
inmunorreactividad de CPS 1 en un suero o plasma de un paciente
humano, se constató en casa de la solicitante que también en la
circulación de pacientes con distintos tumores diagnosticados
clínicamente pueden encontrarse en concentraciones marcadamente
elevadas CPS 1 y/o una fuerte inmunorreactividad de CPS 1.
Dentro del marco de la misma investigación se
constató además que el mismo biomarcador se encuentra claramente
incrementado también en la circulación de pacientes con afecciones
intestinales inflamatorias crónicas (M.C.; C.U.) (M.C. =
enfermedad de Crohn; C.U. = colitis ulcerosa), en particular en los
accesos morbosos agudos que son típicos de estas enfermedades.
Para la diagnosis médica la CPS 1 y los
fragmentos de CPS 1 con inmunorreactividad de CPS 1 no han
desempeñado tradicionalmente papel práctico alguno. En el más
concreto ámbito especializado de la diagnosis tumoral aún nunca se
ha tratado sobre la CPS 1 como posible marcador tumoral humoral.
Sin embargo, la propia enzima CPS 1 (E.C.
6.3.4.16) es perfectamente conocida desde hace mucho tiempo. Dicha
enzima cataliza la conversión de amoníaco, bicarbonato y 2 ATP con
formación de fosfato de carbamoilo en el primer paso del ciclo de
la urea. Dicha enzima también desempeña además un papel en la
biosíntesis de arginina, que es por su parte un sustrato para la
biosíntesis de NO, p. ej. en un shock por endotoxinas (véase Shoko
Tabuchi et al., Regulation of Genes for Inducible Nitric
Oxide Synthase and Urea Cycle Enzymes in Rat Liver in Endotoxin
Shock, Biochemical and Biophysical Research Communications 268,
221-224 (2000)). La CPS 1 debe distinguirse de la
enzima citosólica CPS 2 (E.C. 6.3.5.5), que desempeña asimismo un
papel en el ciclo de la urea, pero procesa el sustrato glutamina.
Es sabido que la CPS 1 está localizada en las mitocondrias y se da
en esta forma en el tejido hepático en grandes cantidades
(representa un 2-6% de la proteína total del
hígado). Su secuencia de aminoácidos y su localización genética son
conocidas desde hace mucho tiempo (véase Haraguchi Y. et
al., Cloning and sequence of a cDNA encoding human carbamyl
phosphate synthetase I: molecular analysis of hyperammonemia, Gene
1991, nov. 1; 107 (2):335-340; véase también la
publicación WO 03/089933 A1 de la solicitante). Con respecto a su
papel fisiológico puede hacerse referencia a artículos de revistas
especializadas tales como p. ej. el de H.M. Holder et al.,
Carbamoyl phosphate synthetase: an amazing biochemical odyssey from
substrate to product, CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 56 (1999)
507-522 y a la literatura a la que ahí se hace
referencia, así como a la introducción de la publicación de Mikiko
Ozaki et al., Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay of Carbamoylphosphate Synthetase I: Plasma Enzyme in Rat
Experimental Hepatitis and Its Clearance, Enzyme Protein 1994,
95:48:213-221.
Según Shoko Tabuchi et al., loc.
cit., en hígados de rata en un shock por endotoxinas artificial
(LPS) no se observa incremento alguno de la enzima (proteína).
Según Li Yin et al., Participation of different cell types
in the restitutive response of the rat liver to periportal injury
induced by allyl alcohol, Journal of Hepatology 1999,
31:497-507, en una lesión hepática por alcohol
alílico se observa en los exámenes histológicos a los tres días en
todos los hepatocitos un incremento de la expresión de CPS 1.
Se constató además que en el modelo de la rata y
en una hepatitis aguda producida experimentalmente mediante
administración de galactosamina se encuentra en el plasma de la rata
una actividad inmunológica de CPS 1 marcadamente incrementada
(determinada con un ELISA con IgG de conejo anti-CPS
1 de rata), concretamente a las 24-48 h del
tratamiento con la galactosamina desencadenadora de la hepatitis. En
el plasma de rata fueron también crecientemente identificables
durante la hepatitis aguda fragmentos de CPS 1 con masas molares de
aproximadamente 140 y 125 kDa sin otra caracterización más precisa
(correspondencia secuencial), mientras que en un análisis
inmunoblot acompañante en muestras de autopsia humanas no pudieron
observarse fragmentos de CPS 1 con inmunorreactividad de CPS 1
(Mikiko Ozaki et al., loc. cit.).
En un trabajo de Liu Tong-hua
et al., Carbamoyl Phosphate Synthetase 1, A Novel Marker for
Gastric Carcinoma, Chinese Medical Journal,
102(8):630-638, 1989, se dan resultados de
exámenes inmunocitométricos de muestras tisulares de distintos
tumores eliminados por vía operatoria para la detección de una
posible presencia de CPS 1. Los autores hallaron indicios de
inmunorreactividad de CPS 1 solamente en tejido de carcinoma del
estómago, pero por el contrario no los hallaron en otros tejidos
tumorales (del esófago, del colon, del páncreas, del pulmón, de
mama, de ovario, de riñón, de próstata y de vejiga urinaria). Dichos
autores deducen de ello una posible aptitud de la CPS 1 como
marcador tisular selectivo, es decir como marcador tumoral celular
para el cáncer de estómago. No se trata sobre una posible aparición
de CPS 1 en la circulación, y de las investigaciones que se
describen no pueden sacarse conclusiones de tipo alguno con respecto
a una eventual aptitud de la CPS 1 como marcador tumoral
humoral.
En la WO 03/042661 se establece una relación
entre la elevada expresión de CPS 1 en el tejido del colon y el
cáncer de colon. No se menciona la aptitud de la CPS 1 como marcador
humoral.
Las mediciones que se describen en la presente
solicitud representan el primer informe de una aparición de CPS 1
en la circulación de pacientes tumorales. La CPS 1 fue hasta la
fecha determinada, y ello tan sólo en investigaciones de la
solicitante, únicamente en el suero o en el plasma de pacientes de
sepsis (véase la WO 03/089933 A1). Los pacientes de sepsis, cuya
afección altamente aguda y potencialmente amenazadora para la vida
se supervisa y se trata típicamente en estaciones de tratamiento
intensivo, representan una población de pacientes que es claramente
distinta de los pacientes tumorales, los pacientes de riesgo tumoral
o los pacientes con afecciones intestinales inflamatorias crónicas,
es decir los pacientes que padecen de una afección crónica o que se
desarrolla a lo largo de largos periodos de tiempo.
Para la determinación de la CPS 1 o de la
inmunorreactividad de CPS 1 como marcador tumoral/biomarcador
humoral en sueros de pacientes según la presente invención puede
procederse fundamentalmente como se ha descrito en la publicación
WO 03/089933 A1 de la solicitante en relación con la determinación
de CPS 1 como marcador de sepsis. El procedimiento de determinación
que se describe en la parte experimental de la presente solicitud,
que fue aplicado para el análisis de sueros o plasmas de pacientes
tumorales para la detección de la presencia de CPS 1 o de
inmunorreactividad de CPS 1, es el mismo procedimiento que ya ha
sido descrito en la susodicha solicitud WO 03/089933 A1 de la
solicitante.
En el sentido de la presente solicitud debe
entenderse como "uso" no tan sólo la determinación inmunológica
directa de CPS 1 en muestras in vitro dentro del marco de la
diagnosis tumoral, sino también un uso de CPS 1 o de fragmentos de
CPS 1 o de anticuerpos para su determinación selectiva para la
fabricación de kits (kits = conjuntos de materiales y utensilios)
de ensayo, o un uso para la producción de componentes de ensayo, o
sea p. ej. de anticuerpos poli- o monoclonales que se prevén p. ej.
en forma inmovilizada y/o marcada por regla general asimismo en
kits de ensayo para las afecciones indicadas, o de sustancias patrón
y de referencia.
Hay que señalar además explícitamente que en la
determinación según la invención de CPS 1 o de inmunorreactividad
de CPS 1 y según el diseño del ensayo puede tener lugar una
simultánea determinación de CPS 1 tanto en forma de la molécula en
esencia completa como en forma de otros fragmentos más cortos
(péptidos parciales que se dan fisiológicamente) de la CPS 1
completa posiblemente presentes en el fluido biológico. Cuando en la
presente solicitud se habla de una determinación de
"inmunorreactividad de CPS 1", debe entenderse que ello tiene
en cuenta esta circunstancia relativa a la técnica de medición,
para evitar una incorrecta interpretación limitativa de la doctrina
de la presente invención.
En lugar de la determinación de CPS 1 o de
inmunorreactividad de CPS 1, a efectos diagnósticos la determinación
de CPS 1 se efectúa dado el caso también indirectamente como
determinación de una actividad enzimática que corresponde a la
actividad de CPS 1 o a la actividad residual de los fragmentos de
CPS 1 en la sangre. Puesto que la CPS 1 no surge en la circulación
en los sujetos sanos, una actividad enzimática mensurable de CPS 1
en la sangre de un paciente puede constituir desde el punto de vista
diagnóstico un significativo indicio de una seria perturbación del
buen estado de salud del paciente. Hay que señalar también en este
punto que la actividad en la circulación de una enzima que
normalmente está localizada en el interior de las células y tan
sólo ahí desempeña su acción funcionalmente correcta debe valorarse
en sí negativamente, y por consiguiente puede contribuir también
como tal a una exacerbación del estado morboso.
Sobre la base de los resultantes que se
presentan a continuación, la CPS 1 y la inmunorreactividad de CPS 1
detectable en el plasma o en el suero son adecuadas como péptidos
marcadores específicos (marcadores tumorales) para la detección
diagnóstica de tumores (neoplasias).
Se prevé además realizar la determinación de CPS
1 y/o fragmentos de CPS 1 como marcadores de prognosis y marcadores
para la supervisión de la evolución morbosa de las afecciones
tumorales dentro del marco de una medición en combinación con otros
marcadores.
La determinación de CPS 1 propiamente dicha
puede efectuarse de cualquier manera adecuada en sí conocida,
siendo preferidos los inmunoensayos con un adecuado diseño de
ensayo.
Los procedimientos de determinación de
inmunorreactividad de CPS 1 en una muestra biológica pueden ser
cualesquiera procedimientos conocidos de la inmunodiagnosis de los
que se usan para la detección y la medición de antígenos. La CPS 1
se determina preferiblemente con ayuda de un ensayo de fijación de
ligando en el que para la fijación y marcación se usan adecuados
anticuerpos específicos en forma inmovilizada o bien en forma
marcada o marcable.
También formatos de ensayo competitivo pueden
ofrecer particulares ventajas. Preferiblemente no se trabaja ahí
con una marcación enzimática, sino que se elige otra marcación, como
p. ej. una marcación para una reacción de detección por
quimioluminiscencia, como p. ej. un éster de acridinio.
Naturalmente, para la determinación de CPS 1 se usa con preferencia
un ensayo de este tipo, que garantiza la alta sensibilidad necesaria
dentro de la gama de las concentraciones de CPS 1 que se dan y
permite una separación de las señales de medición del fondo del
ensayo.
El procedimiento de determinación puede estar
adaptado a la tecnología de los chips, o bien puede estar
configurado como ensayo rápido (ensayo de
Point-of-Care).
En una forma de realización preferida la
determinación inmunodiagnóstica se efectúa como inmunoensayo en
sándwich heterogéneo, en el cual uno de los anticuerpos está
inmovilizado en una fase estacionaria cualquiera, como por ejemplo
las paredes de tubitos de ensayo recubiertos (p. ej. de
poliestireno; "Coated Tubes"; CT), o en placas de
microtitulación, por ejemplo de poliestireno, o en partículas, como
por ejemplo partículas magnéticas, mientras que el otro anticuerpo
lleva un residuo que representa una etiqueta directamente detectable
o permite un enlace selectivo con una etiqueta y sirve para la
detección de las estructuras en sándwich formadas. Es también
posible una inmovilización posterior o retardada en el tiempo usando
adecuadas fases estacionarias.
Fundamentalmente pueden aplicarse todas las
técnicas de marcación que son susceptibles de ser usadas en los
ensayos de la clase que se describe, a las cuales pertenecen las
marcaciones con radioisotopos, enzimas y etiquetas de
fluorescencia, quimioluminiscencia o bioluminiscencia y las
marcaciones de color ópticamente detectables, como por ejemplo las
que se hacen con átomos de oro y partículas de colorante como los
que se usan en particular para los llamados ensayos de
Point-of-Care (POC) o ensayos
rápidos. En el caso de un inmunoensayo en sándwich heterogéneo,
ambos anticuerpos pueden también presentar partes de un sistema de
detección de la clase que se describe a continuación en conexión
con ensayos homogéneos.
El procedimiento según la invención puede ser
además configurado como procedimiento homogéneo en el que
permanecen en suspensión en la fase fluida los complejos en sándwich
formados a base de ambos anticuerpos y de la CPS 1 a detectar. En
un caso de este tipo se prefiere marcar ambos anticuerpos con partes
de un sistema de detección que al ser ambos anticuerpos integrados
en un único sándwich permite una generación de señales o emisión de
señales. Tales técnicas son en particular susceptibles de ser
configuradas como procedimientos de detección mediante
amplificación de fluorescencia o extinción de fluorescencia. Un
procedimiento de este tipo particularmente preferido implica el uso
de reactivos de detección que se usan por parejas, como son por
complejo los que se describen en los documentos
US-A-4 822 733,
EP-B1-180 492 o
EP-B1-539 477 y en el estado de la
técnica que ahí se cita. Dichos reactivos permiten efectuar
directamente en la mezcla de reacción una medición que incluye
selectivamente tan sólo productos de reacción que contienen ambos
componentes de marcación en un único inmunocomplejo. Como ejemplo
de ello hay que hacer referencia a la tecnología que se oferta con
las marcas TRACE® (Time Resolved Amplified Cryptate Emission) o
KRYPTOR®, que lleva a la práctica las doctrinas de las solicitudes
anteriormente mencionadas.
Habiéndose hecho explícitamente referencia a
estas solicitudes, debe considerarse como parte de la exposición de
la presente solicitud el contenido de la susodicha solicitud
anterior (WO 03/089933 A1) de la solicitante.
A continuación se aclaran más detalladamente la
determinación de CPS 1 y los resultados obtenidos en su
determinación en plasmas de pacientes tumorales y pacientes con M.C.
o C.U., haciéndose al respecto referencia a dos figuras.
Las figuras muestran lo siguiente:
La figura 1, los resultados de la medición de la
inmunorreactividad de CPS 1 en plasmas de personas normales sanas y
de pacientes con distintas afecciones tumorales clínicamente
diagnosticadas que se indican en la figura con el inmunoensayo que
se describe más detalladamente en la parte experimental, indicando
la línea de trazos el límite de detección inferior del ensayo (0,5
ng/ml).
La figura 2, correspondientes resultados en
plasmas de pacientes que padecen de un acceso agudo de su afección
intestinal inflamatoria crónica (M.C. o C.U.).
Se seleccionaron dos zonas sacadas de la
secuencia de aminoácidos conocida de la CPS 1 humana (Pos.
184-199: zona peptídica 1; ID SEC Nº: 1; Pos.
245-257: zona peptídica 2; ID SEC Nº: 2).
Respectivamente completadas con un residuo de cisteína
N-terminal, ambas zonas fueron según procedimientos
estándar sintetizadas como péptidos solubles, purificadas,
sometidas a control de calidad mediante espectrometría de masas y
HPLC (HPLC = cromatografía de líquidos de alta resolución) de fase
inversa y liofilizadas en partes alícuotas (firma JERINI AG,
Berlín, Alemania). Las secuencias de aminoácidos de los péptidos son
las siguientes:
Péptido PCEN17: CEFEGQPVDFVDPNKQN ID SEC
Nº:1
Péptido PCVD14: CVPWNHDFTKMEYD ID SEC Nº:2
El material patrón recombinante fue adquirido a
la firma InVivo GmbH (de Hennigsdorf, Alemania). Se trataba de un
extracto celular crudo de una cepa de E. coli que expresaba
la zona N-terminal recombinante de la CPS 1 humana,
completada con una cola de afinidad Strep-tag
N-terminal. Se le atribuyó al extracto una
concentración arbitraria de CPS 1.
Mediante MBS (éster de
m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida)
se conjugaron con la proteína portadora KLH (Keyhole limpet
hemocyanin = hemocianina de lapa californiana) (véanse las
instrucciones de trabajo
"NHS-Esters-Maleimide
Crosslinkers" de la firma PIERCE, de Rockford, IL, EE.UU.) los
péptidos PCEN17 y PCVD14 anteriormente mencionados. Con estos
conjugados se inmunizaron ovejas según el esquema siguiente: Cada
oveja recibió inicialmente 100 \mug de conjugado (estando el dato
de la masa referido a la parte peptídica del conjugado) y a
continuación cada 4 semanas 50 \mug de conjugado (estando el dato
de la masa referido a la parte peptídica del conjugado). Comenzando
al cuarto mes tras el comienzo de la inmunización se tomaron cada 4
semanas por cada oveja 700 ml de sangre, y de la misma se obtuvo
antisuero por centrifugación. Las conjugaciones, las inmunizaciones
y la obtención de antisueros fueron efectuadas por la firma
MicroPharm, de Carmartheshire, R.U.
En un procedimiento de 1 paso se prepararon a
partir de los antisueros que habían sido obtenidos comenzando en el
cuarto mes tras la inmunización los anticuerpos
peptido-específicos.
Para ello, los péptidos PCEN17 y PCVD14 fueron
primeramente acoplados a gel SulfoLink (véanse las instrucciones de
trabajo "Sulfolink Kit" de la firma PIERCE, de Rockford, IL,
EE.UU.). Se presentaron para el acoplamiento 5 mg de péptido por
cada 5 ml de gel.
La purificación por afinidad de anticuerpos
peptido-específicos de antisueros de oveja contra
ambos péptidos fue efectuada de la manera siguiente:
Las columnas para péptidos fueron en primer
lugar lavadas alternativamente tres veces con respectivamente 10 ml
de tampón de elución (ácido cítrico 50 mM, pH 2,2) y tampón de
fijación (fosfato sódico 10 mM, 0,1% de Tween, pH 6,8). 100 ml de
los antisueros fueron filtrados a través de un tamaño de poro de 0,2
\mum y mezclados con el material de columna existente. Para ello,
el gel fue barrido cuantitativamente de la columna con 10 ml de
tampón de fijación. La incubación se efectuó durante la noche a
temperatura ambiente con agitación. Las preparaciones se pasaron
cuantitativamente a columnas vacías (NAP 25, Pharmacia, vaciadas).
Se desecharon los filtrados. A continuación se efectuó lavado con
250 ml de tampón de fijación exento de proteína (contenido de
proteína del eluido de lavado < 0,02 A280 nm). Se aportó tampón
de elución a las columnas lavadas, y se recogieron fracciones de 1
ml. Se determinó el contenido de proteína de cada fracción mediante
el método BCA (véanse las instrucciones de trabajo de la firma
PIERCE, de Rockford, IL, EE.UU.). Fueron reunidas las fracciones
con concentraciones de proteína < 0,8 mg/ml. Tras determinación
de la proteína del pool mediante el método BCA, fueron obtenidas
unas producciones de 27 mg para el anticuerpo
anti-PCEN17 y de 33 mg para el anticuerpo
anti-PCVD14.
Por medio de una columna de filtración en gel
NAP-5 (Pharmacia), 500 \mul del anticuerpo
anti-PCEN17 purificado (véase lo indicado
anteriormente) se pasaron a 1 ml de tampón de fosfato de potasio 100
mM (pH 8,0) según las instrucciones de trabajo. La determinación de
la concentración de proteína de la solución de anticuerpo arrojó un
valor de 1,5 mg/ml.
Para la marcación por quimioluminiscencia del
anticuerpo 67 \mul de la solución de anticuerpo fueron mezclados
con 10 \mul de
MA70-acridinio-NHS-éster (1 mg/ml;
firma HOECHST Behring) y se incubaron durante 15 minutos a
temperatura ambiente. Entonces fueron añadidos 423 \mul de glicina
1M y se prosiguió la incubación por espacio de otros 10 minutos.
Por medio de una columna de filtración en gel NAP-5
(Pharmacia), la preparación de marcación se pasó a continuación a 1
ml de eluyente A (fosfato de potasio 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4)
según las instrucciones de trabajo, y fue además liberada de
componentes de bajo peso molecular. Para la separación de los
últimos residuos de etiquetas no fijadas a anticuerpos fue efectuada
una HPLC de filtración en gel (columna: Waters Protein Pak SW300).
La muestra fue aplicada y cromatografiada con eluyente A con un
caudal de 1 ml/min. Con un fotómetro de flujo fueron medidas las
longitudes de onda de 280 nm y 368 nm. La relación de absorción a
368 nm/280 nm como medida del grado de marcación del anticuerpo fue
en el pico de 0,10. Las fracciones con contenido de anticuerpos
monómeros (tiempo de reacción 8-10 min.) fueron
recogidas y reunidas en 3 ml de fosfato sódico 100 mM, NaCl 150 mM,
albúmina de suero bovino al 5%, azida sódica al 0,1%, pH 7,4.
Tubitos de poliestireno de 5 ml irradiados
(firma Greiner) fueron recubiertos con anticuerpo
anti-PCVD14 purificado de la manera siguiente: El
anticuerpo fue diluido en Tris 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,8, hasta una
concentración de 6,6 \mug/ml. Se pipetaron al interior de cada
tubito 300 \mul de esta solución. Los tubitos fueron incubados
durante 20 horas a 22ºC. Se aspiró la solución. Entonces se llenó
cada tubito con 4,2 ml de fosfato sódico 10 mM, Karion FP al 2%,
albúmina de suero bovino al 0,3%, pH 7,5. Tras 20 horas se aspiró la
solución. Los tubitos fueron finalmente secados en un secador al
vacío.
Se fabricó un tampón de ensayo que tenía la
composición siguiente:
Fosfato sódico 100 mM, NaCl 150 mM, albúmina de
suero bovino al 5%, IgG de oveja inespecífica al 0,1%, azida sódica
al 0,1%, pH 7,4.
Sirvió de material patrón CPS 1 humana
recombinante expresada en E. coli en forma de un extracto de
E. coli crudo que contenía toda la proteína intracelular
soluble. Este extracto fue diluido serialmente en suero normal de
caballo (firma SIGMA). A los patrones así fabricados les fueron
atribuidas concentraciones arbitrarias según su dilución.
a. Sirvieron de sueros de ensayo para las
determinaciones de CPS 1 por un lado 557 plasmas de distintos
pacientes con tumores clínicamente diagnosticados de distintos
órganos/tejidos. Para cada plasma de ensayo existía una precisa
documentación clínica que permitió un desglose de los plasmas usados
en la medición según la clase de tumor constatada en los
pacientes.
Más concretamente fueron medidos: 94 plasmas de
pacientes con cáncer de colon (en la figura 1: Ca Colon), 97
plasmas de pacientes con cáncer de hígado (Ca Hígado), 26 plasmas de
pacientes con cáncer de riñón (Ca Riñón), 152 plasmas de pacientes
con cáncer de páncreas (Ca Páncreas), 48 plasmas de pacientes con
cáncer de pulmón (Ca Pulmón) y 140 plasmas de pacientes con cáncer
de mama (Ca Mama).
Sirvieron de sueros de control 128 sueros de
sujetos aparentemente sanos.
b. Paralelamente a ello fueron también medidos
sueros de en total 78 pacientes a los cuales les había sido
efectuado un tratamiento de un acceso agudo de la enfermedad de
Crohn (M.C.) o de colitis ulcerosa (C.U.) (figura 2).
Se pipetaron al interior de los tubitos de
ensayo anteriormente mencionados respectivamente 50 \mul de
patrón o muestra y 200 \mul de tampón de ensayo. Se efectuó
incubación por espacio de 18 horas a 22ºC con sacudimiento.
Entonces se efectuaron 4 lavados con 1 ml de solución de lavado
(Tween 20 al 0,1%) en cada uno de ellos por tubito. Entonces se
pipetaron al interior de cada tubito 200 \mul de tampón de ensayo
que contenía 0,5 millones de RLU (RLU = unidades relativas de luz)
del anticuerpo trazador marcado con MA70. Se efectuó incubación por
espacio de dos horas a 22ºC con sacudimiento. Entonces se hicieron 4
lavados con 1 ml de solución de lavado (Tween 20 al 0,1%) para cada
uno por cada tubito, se dejaron escurrir los tubitos, y se midió la
quimioluminiscencia fijada al tubito en un luminómetro (firma
BERTHOLD, LB952T; reactivos básicos de la BRAHMS AG).
Usando el software MultiCalc (Spline Fit) se
efectuó la lectura de la concentración de inmunorreactividad de CPS
1. Los resultados para pacientes tumorales se muestran en la figura
1, y los resultados para pacientes con afecciones intestinales
inflamatorias crónicas (M.C.; C.U.) se muestran en la figura 2. Se
aprecia en cada caso una clara diferenciación entre los sujetos
sanos, en los cuales no se hallaron concentraciones de CPS 1
situadas por encima del límite de detección (0,5 ng/ml), y los
pacientes, siendo bastante distinta la sensibilidad de la detección
de CPS 1 para las distintas clases de tumor.
Concretamente se determinaron para las distintas
clases de cáncer las sensibilidades siguientes (véase la Fig.
1):
- Cáncer de colon
- 72%
- Cáncer de hígado
- 38%
- Cáncer de riñón
- 85%
- Cáncer de páncreas
- 48%
- Cáncer de pulmón
- 42%
- Cáncer de mama
- 24%
La sensibilidad en las afecciones intestinales
inflamatorias (enfermedad de Crohn/colitis ulcerosa) era de un 71%
para la M.C. y de un 50% para la C.U.
Mediante el inmunoensayo en sándwich descrito se
ha demostrado con ello que los plasmas de pacientes tumorales y de
pacientes en una fase aguda de una afección intestinal inflamatoria
crónica pueden presentar concentraciones marcadamente elevadas de
inmunorreactividad de CPS 1, mientras que en los plasmas de sujetos
sanos no se detectaba CPS 1. Se puso de manifiesto para distintos
pacientes tumorales un masivo incremento de la inmunorreactividad
de CPS 1 en el plasma. Dicho incremento no hay que ponerlo en clara
relación lógica con la ya anteriormente conocida aparición de CPS 1
en la sepsis. Es sabido que en la sepsis se produce una lesión de
las mitocondrias (Crouser ED et al.,
Endotoxin-induced mitochondrial damage correlates
with impaired respiratory activity; Crit Care Med. 2002 feb.;
30(2):276-84). Una lesión de este tipo en
combinación con necrosis o apoptosis podría ser causa del paso de
CPS 1 de la matriz mitocondrial a la circulación sanguínea en la
sepsis. Esta suposición para la aclaración de la aparición de CPS 1
en la sepsis no proporciona sin embargo una sencilla aclaración
plausible para la aparición en los sueros o plasmas de pacientes
tumorales, que no era previsible sobre la base de los conocimientos
del estado de la técnica.
Los conocimientos en los que se basa la presente
invención sobre la aparición de considerables concentraciones de
CPS 1 en la circulación de pacientes de cáncer y pacientes de M.C. y
de C.U. hacen que parezca posible que la CPS 1 incluso en forma
disuelta ha conservado al menos partes de su reactividad enzimática
y contribuye a la exacerbación de la afección y/o a determinadas
consecuencias morbosas indeseadas. Se sigue de ello que sustancias
en sí conocidas que inhiben la expresión o la acción enzimática de
la CPS 1 pueden ser adecuadas para influenciar positivamente la
morbilidad global. Tales sustancias están p. ej. descritas en J
Steroid Biochem Mol Bio 1991 mayo;
38(5):599-609; J Biol Chem 1977 mayo 25;
252(10):3558-60; J Biol Chem 1984 ene. 10;
259(1):323-31 y J Biol Chem 1981 nov. 10;
256(21):11160-5; J Biol Chem 1981 abr. 10;
256(7):3443-6. Pertenecen a las mismas en
particular los iones de Ca y otros iones metálicos y sustancias de
tipo esteroide. Se cuentan además entre las mismas también
anticuerpos u otros fijadores específicos que como bloqueadores o
inhibidores de la CPS 1 y mediante fijación a la CPS 1 pueden
anular o debilitar la acción de CPS 1 en la circulación.
Según ello, la administración de tales
inhibidores de CPS 1 a pacientes en los que es detectable CPS 1 en
la sangre constituye un medio para influenciar terapéuticamente la
morbilidad y mejorar significativamente el estado y/o el bienestar
de un paciente de cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet WO 03089933 A1 [0013] [0018] [0019] [0032]
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vol. 256 (7), 3443-6 [0052]
<110> B.R.A.H.M.S Aktiengesellschaft
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Uso de la carbamoilfosfato sintetasa
1 (CPS 1) como biomarcador humoral para la diagnosis de afecciones
tumorales y afecciones intestinales inflamatorias crónicas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 4467 PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DE 102004045705.0
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-09-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
Claims (6)
1. Uso de la carbamoilfosfato sintetasa (CPS 1)
y/o de sus fragmentos con inmunorreactividad de CPS 1 como
biomarcador humoral para la diagnosis in vitro y el control
evolutivo y terapéutico de afecciones tumorales.
2. Procedimiento in vitro para la
identificación anticipada y la identificación, para la prognosis
evolutiva y el enjuiciamiento del grado de gravedad, así como para
el enjuiciamiento evolutivo de acompañamiento a la terapia de
afecciones tumorales; caracterizado por el hecho de que se
determina en una muestra de suero o plasma de un paciente la
presencia y/o cantidad de CPS 1 y/o de sus fragmentos que se dan
fisiológicamente con inmunorreactividad de CPS 1, y de la detección
y/o de la cantidad de CPS 1 o de inmunorreactividad de CPS 1 se
sacan conclusiones con respecto a la presencia, a la previsible
evolución, al grado de gravedad o al éxito de una terapia de una
afección tumoral.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado por el hecho de que las secuencias de CPS 1
usadas para la determinación son secuencias de una parte
N-terminal de la CPS 1 que comprende los aminoácidos
1 a aprox. 630 de la secuencia completa de la CPS 1.
4. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 2 o 3, caracterizado por el hecho de que es
un procedimiento de determinación inmunodiagnóstica.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 2 o 3, caracterizado por el hecho de que es
un procedimiento de determinación de la actividad enzimática de CPS
1 o de una actividad enzimática residual de CPS 1 en una muestra de
sangre total, suero o plasma de un paciente de cáncer.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 2 a 5, caracterizado por el hecho de que se
ejecuta para la detección de un tumor seleccionado de entre los
miembros del grupo que consta de carcinoma de colon, carcinoma de
hígado, carcinoma de riñón, carcinoma de páncreas, carcinoma de
pulmón y carcinoma de mama y combinaciones de los mismos.
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