ES2330277T3 - Nueva composicion para permeabilizar las paredes de microorganismos, que comprende la combinacion de acido eilendiaminotetraacetico (edta) y polietilenimina (pei). - Google Patents
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Abstract
Una composición para permeabilizar las paredes de microorganismos, caracterizada porque comprende la combinación de polietilenimina (PEI) y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), siendo la concentración final de PEI mayor de 100 µg/ml y siendo la concentración final de EDTA mayor de 50 mM en dicha composición.
Description
Nueva composición para permeabilizar las paredes
de microorganismos, que comprende la combinación de ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) y polietilenimina (PEI).
La presente invención se refiere a una nueva
composición para permeabilizar las paredes de los microorganismos,
que comprende una combinación de ácido etilendiaminotetraacético
(EDTA) y polietilenimina (PEI), y a sus usos, en particular en un
método para el recuento dirigido y/o la identificación de
microorganismos en un medio líquido o gaseoso.
La invención se aplica más concretamente al
control de la calidad microbiológica de un medio líquido y gaseoso
que entra, por ejemplo, en líneas de producción para productos
alimenticios y farmacéuticos.
En este campo, los microorganismos a detectar a
menudo escasean puesto que están diluidos en grandes volúmenes de
agua o gas. No obstante, su identidad debe ser determinada con
certeza. De hecho, el control llevado a cabo debe hacer posible la
detección, en tan poco tiempo como sea posible, de cualquier
contaminación de los fluidos que forman parte de la composición de
un producto manufacturado, con el fin de poder detener, cuando sea
apropiado, la fabricación del producto o su distribución, y adoptar
las etapas de descontaminación necesarias.
Se han desarrollado muchos métodos para detectar
microorganismos con el fin de minimizar el tiempo de cultivo para
dichos microorganismos.
Semejante método para detectar microorganismos,
que comprende la filtración del líquido a través de una membrana,
se describe, por ejemplo, en la solicitud WO 01/59157. De acuerdo
con este método, los microorganismos contenidos en una muestra
líquida son retenidos en la superficie de una membrana haciendo
pasar el líquido a través de la última. Los microorganismos se
cultivan en la superficie de la membrana de contacto con un medio de
cultivo de agar, durante el período de tiempo requerido para formar
una microcolonia que no es visible a simple vista. Las células que
forman la microcolonia se lisan después con el fin de liberar su
contenido de adenosin-trifosfato (ATP) y de ácidos
nucleicos. El ATP liberado se utiliza como marcador para identificar
y cuantificar las células vivas mediante bioluminiscencia del ATP.
El ATP sirve como sustrato para una enzima que produce una reacción
de quimioluminiscencia por medio de la cual se obtiene una señal
luminosa, y después se detecta utilizando una interfaz de vídeo
apropiada (por ejemplo: cámara LCD). La señal obtenida,
proporcionada en forma de imagen, hace posible visualizar in
situ el sitio de la membrana en el que se ha desarrollado el
microorganismo, de una manera similar a un recuento convencional
llevado a cabo sobre una placa Petri en medio agar. En este caso,
se dice que la detección es universal puesto que el ATP es un
marcador que está presente en todos los microorganismos vivos. Esto
no hace posible la diferenciación de las diversas especies de
microorganismos.
El sistema "Milliflex rapìd®", vendido por
la compañía Millipore, funciona con el principio descrito antes.
Fue diseñado para llevar a cabo las etapas de filtración y detección
sobre una y la misma membrana, que es sostenida sobre un soporte de
plástico. Este soporte se diseña con el fin de que encaje en los
diversos dispositivos utilizados par la filtración, el cultivo de
los microorganismos, y la detección.
Este sistema miniaturizado hace posible ganar
una cantidad notable de tiempo en comparación con los ensayos
convencionales sobre placas de Petri. Además, hace posible almacenar
las imágenes obtenidas en un medio digital, lo que resulta
ventajoso en términos de la trazabilidad de los productos
analizados.
Este sistema sin embargo tiene ciertos límites
relacionados con el hecho de que, en la práctica, el recuento de
microorganismos presentes en la superficie de la membrana se lleva a
cabo después de la lisis de las células. Esta lisis es necesaria
con el fin de extraer de las células los productos que reaccionan
con los reactivos quimioluminiscentes, por ejemplo el ATP, para
producir la señal luminiscente que es detectada. No obstante, una
vez que la membrana ha sido tratada, es difícil reutilizarla con el
fin de llevar a cabo otros análisis que pueden dar como resultado,
por ejemplo, una identificación precisa de los microorganismos
detectados.
Es posible determinar la identidad de los
microorganismos, por ejemplo, utilizando sondas que hibridan
específicamente con los ácidos nucleicos (ADN o ARN) contenidos en
los microorganismos. Las sondas más comunes de este tipo comprenden
un fragmento oligonucleotídico que tiene generalmente entre 10 y 40
nucleótidos de longitud, formando una secuencia complementaria a la
del ADN o el ARN del microorganismo.
También se puede demostrar que las sondas de PNA
(ácido péptidonucleico) son ventajosas en este tipo de detección,
puesto que tienen un esqueleto peptídico que es menos sensible a las
enzimas degradantes presentes en los microorganismos y ofrecen
diferentes posibilidades de marcaje.
En la solicitud WO 2004/050902 se describe un
sistema de detección de membrana que hace posible detectar la
presencia de microorganismos que contaminan muestras de sangre sin
causar lisis alguna de los microorganismos. La particularidad de
este sistema se encuentra en el hecho de que los microorganismos son
detectados por medio de la penetración de agentes de marcaje en los
microorganismos a través de su pared. Los agentes de marcaje
utilizados son molécula de pequeñas dimensiones, en particular
compuestos que se intercalan en los ácidos nucleicos (ADN, ARN),
tales como derivados de cianina, yoduro de propidio, naranja de
acridina o bromuro de etidio. Estos pequeños compuestos penetran
relativamente fácilmente a través de la membrana en los
microorganismos, utilizando agentes permeabilizantes conocidos de
la técnica anterior, tales como polietilenimina PEI), digitonina,
nonensina, hexametafosfato de sodio o cloruro de benzalconio. La
muestra líquida que contiene los microorganismos que se va a
someter a ensayo se diluye primero en una solución permeabilizante
que comprende el agente de marcaje en presencia de un reactivo de
permeabilización celular, y después los microorganismos se filtran
a través de una membrana con el fin de detectarlos en ella. Esto da
como resultado una detección de los microorganismos que ofrece una
mejor resolución.
Sin embargo, debido al hecho de que las marcas
son marcas universales, esto es no específicas para los
microorganismos, este sistema no hace posible determinar
exactamente la naturaleza de los microorganismos detectados.
Además, en semejante sistema, la manipulación de
los microorganismos (incubación de la solución permeabilizante)
tiene lugar en solución, lo que requiere precauciones específicas y
un equipamiento complejo. Se debe observar que la incubación de
células vivas en solución antes de la filtración también tiene la
desventaja de que las células pueden continuar creciendo y
dividiéndose, antes de ser fijadas sobre la membrana, lo que crea,
de facto, una incertidumbre respecto al resultado final del
ensayo.
Otra dificultad unida a este tipo de análisis es
la cantidad de reactivos permeabilizantes que se deben utilizar en
la solución permeabilizante. Esta cantidad de hecho varía de acuerdo
con los tipos de microorganismos que se van a detectar.
Dependiendo, por ejemplo, de si los microorganismos (en el caso de
las bacterias) son de tipo gram-positivo o
gram-negativo, el reactivo permeabilizante no tendrá
un efecto a la misma concentración, o peor, causará la lisis de los
microorganismos presentes.
De este modo, las bacterias
gram-positivas tienen una única membrana que tiene
una capa externa gruesa de peptidoglicano (un polímero hecho de
cadenas peptídicas y polisacáridas), haciendo de ese modo más
difícil su permeabilización que la de las bacterias
gram-negativas, en las que la pared consiste en una
doble membrana entre la cual los peptidoglicanos son menos
abundantes y más dispersos.
Se ha descrito que la polietilenimina (PEI), que
es un polímero alifático policatiónico y débilmente alcalino,
vuelve las paredes de ciertas bacterias
gram-negativas permeables a diversas moléculas de
antibiótico [Helander, I.M. et al., Polyethylenimine is an
effective permeabilizer of gram-negative bacteria,
Microbiology (1997), 143:3193-3199]. La
concentración de PEI utilizada para este fin con el objetivo de
obtener una bacteria tal como E. coli está entre 20 y 30
\mug/ml.
El ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, de
fórmula C_{10}H_{16}N_{2}O_{8}) es un agente quelante bien
conocido que se utiliza comúnmente en bioquímica como agente
estabilizante, en particular como inhibidor de las reacciones
enzimáticas o antioxidantes. El EDTA está presente en ciertas
composiciones, para este fin. Sin embargo, se ha demostrado que el
EDTA tomado solo no permite una permeabilización satisfactoria de
las paredes de los microorganismos con el propósito de obtener el
marcaje de los ácidos nucleicos, en particular en lo que se refiere
a bacterias gram-positivas (documento WO
04/050902).
Una lisozima es un producto que se utiliza para
permeabilizar las paredes de las bacterias
gram-positivas en muchos protocolos para
transfectar células con ácidos nucleicos. Actúa en particular
hidrolizando ciertos enlaces entre la
N-acetilglucosamina y los ácidos
N-acetilmurámicos de los peptidoglicanos presentes
en las paredes bacterianas.
El propósito de la presente invención es
responder a las limitaciones de los sistemas de detección existentes
mencionadas antes, en particular en lo que se refiere a las
bacterias gram-positivas, que tienen la reputación
de ser más difíciles de tratar.
Sorprendentemente, los autores de la invención
han observado que la combinación de EDTA y PEI hace posible
permeabilizar las paredes de los microorganismos más eficazmente que
las composiciones descritas en la técnica anterior, en particular
aquellas que contienen solamente PEI o EDTA.
De este modo ha sido posible establecer que las
composiciones que combinan al menos PEI y EDTA son particularmente
adecuadas para la permeabilización de microorganismos, en particular
de bacterias gram-positivas.
Estas composiciones hacen posible en particular,
de acuerdo con la invención, implementar un método para marcar
dichos microorganismos utilizando sondas oligonucleotídicas que
pueden ser utilizadas para detectar específicamente los
microorganismos. Este método comprende poner en contacto un
microorganismo con una composición de acuerdo con la invención, que
comprende la combinación de PEI y EDTA, en presencia de
macromoléculas marcadas tales como sondas oligonucleotídicas o de
tipo PNA, de manera que el último pueda penetrar en el
microorganismo a través de su pared con el fin de unirse allí.
Además, parece que los microorganismos tratados
de este modo toleraban elevadas concentraciones de PEI, mayores
que las utilizadas normalmente, sin causar una lisis marcada de las
células.
En la presente invención, el término
"microorganismo" indica cualquier célula viva (eucariótica o
procariótica), organismo unicelular, gameto o virus que comprende
una herencia genética contenida en una envoltura formada por una
pared única o múltiple.
Una composición como la definida antes permite
la penetración de macromoléculas en los microorganismos, mientras
que al mismo tiempo limita la destrucción de sus paredes.
Una macromolécula se define como una molécula
resultante de la asociación de un gran número de moléculas simples,
tales como polipéptidos, proteínas, glicoproteínas,
oligonucleótidos, polisacáridos, ácidos nucleicos (ADN o ARN),
anticuerpos, o sus derivados. Las macromoléculas para las cuales es
adecuada la invención son generalmente moléculas cuyo peso
molecular es mayor de 1000 dalton (1 kDa), preferiblemente mayor de
2.000 dalton (2 kDa), y más preferiblemente mayor de 5.000 dalton
(5 kDa).
La polietilenimina (PEI) es un producto soluble
que es asequible de varias formas. La forma monomérica polimerizada,
que tiene una masa molecular de aproximadamente 750 kDa, es una
forma preferida de acuerdo con la invención (Núm. CAS
9002-98-6). La PEI se utiliza en
muchos campos, en concreto como agente para la floculación de
proteínas y ácidos nucleicos en solución en varios procedimientos
de purificación. También se utiliza como agente permeabilizante
debido al hecho de que tiene la propiedad de desestructurar
reversiblemente los fosfolípidos presentes en las paredes
celulares, volviendo de este modo permeables estas paredes a agentes
que normalmente no son capaces de penetrar en las células.
De este modo, un primer sujeto de la invención
es una composición para permeabilizar las paredes de
microorganismos, que comprende la combinación de PEI y EDTA.
La concentración de PEI en la composición
permeabilizante puede estar entre 100 y 1.000 \mug/ml,
preferiblemente entre 150 y 900 \mug/ml, y más preferiblemente
entre 200 y 800 \mug/ml.
De acuerdo con la invención, el EDTA está
generalmente presente en la composición permeabilizante a una
concentración final entre 1 y 200 mM, preferiblemente entre 5 y 100
mM. De acuerdo con un aspecto preferido, la concentración final de
EDTA es mayor de 50 mM, más preferiblemente entre 50 mM y 100
mM.
Preferiblemente, esta composición también
comprende lisozima a una concentración generalmente entre 0,5 y 5
mg/ml, preferiblemente entre 1 y 4 mg/ml.
Otro sujeto de la invención hace referencia al
uso de una composición de acuerdo con la invención, y más
concretamente a un método para detectar microorganismos sobre una
membrana, que comprende una etapa que consiste en la penetración de
macromoléculas marcadas en los microorganismos.
Por razones que todavía no se conocen bien, esta
combinación de PEI y EDTA facilita la penetración de macromoléculas,
tales como sondas nucleotídicas, en los microorganismos, mientras
el uso de lisozima es útil para fragmentar los peptidoglicanos
presentes en las paredes de dichos microorganismos.
Preferiblemente, la composición de acuerdo con
la invención no comprende ningún detergente, proporcionando por lo
tanto varias ventajas desde el punto de vista del método para
detectar microorganismos detallado más adelante. La ausencia de
detergente hace posible evitar, por ejemplo, la destrucción de
ciertas proteínas requerida para la implementación del método, tal
como la lisozima y las enzimas que participan en la producción de
la señal para la detección mediante luminiscencia. La ausencia de
detergente hace posible poder llevar a cabo la fijación de los
microorganismos sobre la membrana mediante entrecruzamiento, más
eficazmente.
\vskip1.000000\baselineskip
Las sondas específicas que participan en la
detección de los microorganismos son preferiblemente sondas
oligonucleotídicas que pueden hibridar con los ARN ribosómicos de
dichos microorganismos. Estas sondas comprenden preferiblemente una
de las siguientes secuencias:
SEQ ID NO: 1: 5' TCTACCGCGTCACTTACGTGACACC
3'
SEQ ID NO: 2: 5' TTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCG
3'
SEQ ID NO: 3: 5' GCTTCTCGTCCGTTCGCTCGAC 3'
SEQ ID NO: 4: 5' ACTTTACTCCCTTCCTCCCCGCTG 3'
SEQ ID NO: 5: 5' AAATCACTTCACCTACGTGTCAGCG
3'
\vskip1.000000\baselineskip
Estas secuencias permiten la detección de
Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus,
Escherichia coli y Salmonella enterica arizonae,
respectivamente.
Las macromoléculas que se pueden utilizar en el
método para detectar microorganismos, de acuerdo con la invención,
no están limitadas a sondas oligonucleotídicas y pueden consistir,
por ejemplo, en antígenos, anticuerpos o aptámeros dirigidos contra
constituyentes internos de los microorganismos, que se pueden
utilizar también para detectar los microorganismos de acuerdo con
la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 ilustra las diferentes etapas del
método para detectar específicamente microorganismos de acuerdo con
la invención como se lleva a cabo en el ejemplo 1.
La Figura 2 compara (A) los resultados obtenidos
de acuerdo con el método de detección universal mediante
bioluminiscencia de ATP y (B) los resultados obtenidos utilizando la
composición permeabilizante Núm. 7 que comprende, como reactivo, 1
mg/ml de lisozima, 100 mM de EDTA, 374,5 \mug/ml de PEI y un
inhibidor de ARNasa (concentrado 1x), para detectar específicamente
B. subtilis de acuerdo con el método de la invención
utilizando una sonda de hibridación, cuya secuencia corresponde al
SEQ ID NO: 2. Los métodos de acuerdo con (A) y (B) se llevan a cabo
sobre la misma membrana, sobre las cuales se depositan células de la
bacteria gram-positiva B. subtilis. La parte
izquierda muestra, en una imagen generada por ordenador, la posición
de las microcolonias de bacterias detectadas mediante luminiscencia
sobre la membrana, la parte derecha representa la misma membrana
sobre un plano inclinado con una indicación en relieve que
representa la intensidad de la señal luminosa emitida por cada una
de las microcolonias detectadas. El número de microcolonias que
producen una señal luminosa significativa se indica en la parte
superior derecha de la imagen generada por ordenador. El número de
microcolonias contadas es virtualmente el mismo en (A) y (B), con
una señal, sin embargo, que produce una mejor discriminación para
(B).
La Figura 3 representa las imágenes generadas
por ordenador obtenidas cuando se utiliza una sonda específica para
B. subtilis de acuerdo con la invención con respecto a las
colonias bacterianas de (A) B. subtilis, (B) S.
aureus, (C) P. aeruginosa, (D) E. coli, y (E)
S. enterica subesp. arizonae. Esta figura demuestra que el
método de acuerdo con la invención hace posible obtener una
detección específica de los microorganismos.
Las Figuras 4 a 9 representan las imágenes
generadas por ordenador obtenidas de acuerdo con el protocolo
descrito en el ejemplo 1 utilizando B. subtilis como
microorganismo diana. Cada figura corresponde al uso de una
composición permeabilizante elegida como diana en el ejemplo 1. En
estas figuras, (A) la permeabilización se lleva a cabo a la
temperatura ambiente, (B) la permeabilización se lleva a cabo a
37ºC. La parte izquierda muestra, como una imagen generada por
ordenador, la posición de las microcolonias de bacterias detectadas
mediante luminiscencia sobre la membrana, la parte derecha
representa la misma membrana sobre un plano inclinado con una
indicación en relieve que representa la intensidad de la señal
luminosa emitida por cada una de las microcolonias detectadas.
La Figura 4 corresponde al uso de una
composición permeabilizante que contiene 4 mg/ml de lisozima
(composición Núm. 1) como reactivo permeabilizante.
La Figura 5 corresponde al uso de una
composición que comprende 4 mg/ml de lisozima y 5 mM de EDTA
(composición Núm. 2) como reactivo permeabilizante.
La Figura 6 corresponde al uso de una
composición que comprende 4 mg/ml de lisozima y 100 mM de EDTA
(composición Núm. 3) como reactivo permeabilizante.
La Figura 7 corresponde al uso de una
composición que comprende 4 mg/ml de lisozima y 374,5 \mug/ml de
PEI (composición Núm. 4) como reactivo permeabilizante.
La Figura 8 corresponde al uso de una
composición que comprende 4 mg/ml de lisozima, 5 mM de EDTA y 374,5
\mug/ml de PEI (composición Núm. 5 de acuerdo con la invención)
como reactivo permeabilizante.
La Figura 9 corresponde al uso de una
composición que comprende 4 mg/ml de lisozima, 100 mM de EDTA y
374,5 \mug/ml de PEI (composición Núm. 6 de acuerdo con la
invención) como reactivo permeabilizante.
La Figura 10 representa la imagen generada por
ordenador obtenida cuando la bacteria gram-negativa
Pseudomonas aeruginosa es detectada específicamente de
acuerdo con el método de la invención utilizando una composición
permeabilizante que comprende 4 mg/ml de lisozima, 100 mM de EDTA y
374,5 \mug/ml de PEI como reactivo. La parte izquierda muestra,
como una imagen generada por ordenador, la posición de las
microcolonias de bacterias detectadas mediante luminiscencia sobre
la membrana. La parte derecha representa la misma membrana sobre un
plano inclinado con una indicación en relieve que representa la
intensidad de la señal de luz emitida por cada una de las
microcolonias detectadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Un sujeto de la invención es más concretamente
el uso de la composición permeabilizante descrita antes, en un
método para contar y/o identificar, sobre una membrana, los
microorganismos presentes inicialmente en un medio líquido o
gaseoso.
De acuerdo con una realización específica de la
invención, el método se caracteriza por comprender las siguientes
etapas:
- (a)
- el medio líquido o gaseoso se filtra a través de una membrana de manera que los microorganismos presentes en este medio son retenidos sobre o en la membrana;
- (b)
- la membrana y los microorganismos se ponen en contacto con una composición permeabilizante como se ha descrito antes, que comprende PEI, EDTA y lisozima;
- (c)
- las células se fijan sobre la membrana utilizando un agente de entrecruzamiento;
- (d)
- los microorganismos se ponen en contacto con una o más macromoléculas opcionalmente marcadas capaces de cruzar la pared del microorganismos; y
- (e)
- las macromoléculas que han penetrado en los microorganismos son detectadas.
Los microorganismos elegidos como diana mediante
el método de la invención son elegidos más concretamente entre
bacterias patógenas gram-positivas o
gram-negativas de los géneros Pseudomonas,
Escherichia, Legionella, Salmonella, Listeria, Bacillus,
Streptococcus, Vibrio, Yersinia, Staphylococcus, Mycobacterium,
Shigella, Clostridium, Campylobacter o Aeromonas;
protozoos de los géneros Giardia, Entamoeba, Cryptosporidium
o Cyclospora; micoplasmas de los géneros Mycoplasma y
Ureaplasma, hongos de los géneros Aspergillus, Candida o
Penicillium, y virus de la hepatitis A a E, que son
microorganismos de naturaleza patógena y se encuentran comúnmente
en el entorno.
Este método, en principio, también es aplicable
a la detección de algas unicelulares tales como cianobacterias, a
formas unicelulares de organismos parásitos tales como amebas o
nematodos, trematodos o huevos de áscaris, o más gametos vegetales
o animales tales como pólenes y espermatozoides.
El propósito de este método es el recuento de
los microorganismos presentes en un medio líquido tal como agua, o
un medio gaseoso tal como el aire, mientras al mismo tiempo se
determina, en la medida de lo posible, su identidad (familia,
género, especie, etc.). Se pretende que el término "medio líquido
o gaseoso" represente cualquier fluido que pueda ser filtrado
aplicando una diferencia de presión a través de una membrana que
tiene poros con un diámetro medio generalmente entre 0,1 y 1,5
micras, preferiblemente entre 0,15 y 0,8 micras, más
preferiblemente entre 0,2 y 0,6 micras. Semejante fluido puede
consistir en soluciones puras implicadas en la fabricación de
productos estériles, pero también
en soluciones complejas tales como el agua potable, bebidas, fluidos médicos (suero, orina, fluido amniótico, etc.).
en soluciones complejas tales como el agua potable, bebidas, fluidos médicos (suero, orina, fluido amniótico, etc.).
El presente método posibilita, por otra parte,
aplicaciones en el campo diagnóstico para el análisis de muestras
líquidas que se originan en animales o en pacientes.
El término "membrana" indica, en la
presente solicitud, un soporte técnico que tiene dos caras, cuyos
poros tienen un diámetro medio conocido.
La membrana utilizada en el contexto de la
presente invención tiene, en general, una razón superficie/volumen
elevada y un grosor constante preferiblemente entre 90 y 200
micras.
Semejante membrana puede ser monocapa o
multicapa. En general, consiste en uno o más materiales
seleccionados entre politetrafluoroetileno, poli(fluoruro de
vinilideno) (PVDF), policarbonato, poliamida, poliéster,
polietersulfona, acetilcelulosa y nitrocelulosa.
Los materiales se seleccionan preferiblemente
para que sean compatibles con los disolventes utilizados, en
particular, los alcoholes y aldehídos que pueden ser utilizados en
las diferentes etapas del método.
La membrana sobre la cual se detectan los
microorganismos consiste preferiblemente en PVDF
(poli(fluoruro de vinilideno)) o Nailon®. Más
preferiblemente, es una membrana de filtración de PVDF, del tipo
comercializado por la compañía Millipore® con el nombre de fábrica
Milliflex y las referencias MXHVWP124 o RMHVMFX24.
La etapa a) del método de acuerdo con la
invención consiste en filtrar el medio líquido o gaseoso que se va
a analizar a través de una membrana como se ha definido antes con el
fin de retener, en la superficie de esta membrana, los
microorganismos contenidos en dicho medio.
Una vez que los microorganismos han sido
filtrados y retenidos en la membrana, se puede incluir en el método
una etapa opcional de cultivo de los microorganismos en contacto con
un medio de cultivo apropiado, entre las etapas a) y b). Este medio
de cultivo es preferiblemente un medio de agar sobre el cual se
coloca la membrana después de la filtración. Esta etapa, que es
opcional, hace posible obtener colonias de cada uno de los
microorganismos filtrados inicialmente, con el fin de posibilitar
su detección más rápidamente.
De acuerdo con la invención, los microorganismos
se incuban después, en la etapa b), en una composición
permeabilizante de acuerdo con la invención.
Esta etapa de incubación se lleva a cabo en un
pequeño volumen de solución que forma una película en la superficie
de la membrana. Ventajosamente, la composición permeabilizante puede
estar contenida en un soporte sólido sobre el cual se colocará la
membrana, tal como, por ejemplo, un lecho impregnado, limitando de
ese modo cualquier posible movimiento de líquido en la superficie
de la membrana, y por lo tanto mezcla de los microorganismos.
Esta se lleva a cabo a una temperatura entre
20ºC y 37ºC durante un período de 5 a 20 minutos.
El método de acuerdo con la invención es cada
vez más eficaz puesto que comprende una etapa (c) por medio de la
cual las células se fijan sobre la membrana utilizando un agente que
sirve como agente de entrecruzamiento.
Esta etapa hace posible fijar las células sobre
el soporte que constituye la membrana. Un agente de entrecruzamiento
preferido de acuerdo con la invención se selecciona entre
glutaraldehído, formaldehído y paraformaldehído, definiéndose el
paraformaldehído como una molécula compuesta por al menos seis
unidades de formaldehído. Ventajosamente, la composición fijadora
puede estar contenida en un soporte sólido sobre el cual se colocará
la membrana, tal como, por ejemplo, un lecho impregnado, limitando
de ese modo cualquier posible movimiento de líquido en la
superficie de la membrana, y por lo tanto mezcla de los
microorganismos. Preferiblemente, de acuerdo con la invención, la
etapa de fijación se lleva a cabo a una temperatura entre 20ºC y
35ºC durante un período de 5 a 20 minutos.
Esta etapa de fijación también se puede llevar a
cabo mediante irradiación de los microorganismos sobre la membrana
utilizando radiación UV. La membrana en ese caso consiste
preferiblemente en Nailon®.
La etapa d) de puesta en contacto de los
microorganismos con una o más macromoléculas opcionalmente marcadas,
que penetran a través de la pared de los microorganismos, se lleva
a cabo preferiblemente al final de las respectivas etapas de
incubación y fijación b) y c), puesto que es en este preciso momento
en el que se observaba que las paredes del microorganismo eran más
permeables a las macromoléculas.
De acuerdo con una realización preferida de la
invención, las macromoléculas se marcan y se utilizan como
sondas.
Se pretende que el término "sonda"
represente, en la presente memoria, macromoléculas capaces de
reconocer y de asociarse con un elemento biológico que es un
constituyente del microorganismo, permitiendo así que dicho
microorganismo sea marcado.
De acuerdo con un aspecto preferido de la
invención, la sonda es una macromolécula capaz de hibridar con
secuencias de ADN o ARN presentes en el microorganismo y que tienen
un cierto grado de especificidad con respecto a dichos ácidos
nucleicos. La invención proporciona cualquier tipo de sonda conocida
por los expertos en la técnica que puede dar lugar a hibridación
con ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, oligonucleótidos
simples, oligonucleótidos de tipo
2'-O-metil-ARN,
sondas de tipo PNA (sondas que consisten en una cadena polipeptídica
sustituida con bases de purina o pirimidina) [Nielssen P.E. et
al. Science (1991) 254:1497-1500] o sondas de
tipo LNA [oligonucleótidos que comprenden uno o más monómeros de
2'-O-4'-C-metilen-\beta-D-furanosilo)
como se describe en la patente EP 1.013.661.
Los autores de la invención han sido capaces de
observar que las sondas capaces de hibridar con los ARN ribosómicos
de los microorganismos son particularmente útiles para llevar a cabo
la invención.
Un aspecto de la invención por lo tanto consiste
en sondas que comprenden una secuencia idéntica al SEQ ID NO: 1, al
SEQ ID NO: 2, al SEQ ID NO: 3, al SEQ ID NO: 4 o al SEQ ID NO: 5, o
más sondas con una secuencia que muestra una identidad de al menos
80%, preferiblemente, 90%, más preferiblemente 95%, con las
secuencias indicadas antes. Tales sondas están particularmente
indicadas para la implementación de un método de recuento y/o
identificación de acuerdo con la invención. De acuerdo con otro
aspecto de la invención, las macromoléculas que se elaboran para
penetrar en los microorganismos, y que pueden ser de la misma
naturaleza que las sondas descritas antes, se utilizan como
cebadores para llevar a cabo una etapa adicional de amplificación
específica para los ácidos nucleicos contenidos en los
microorganismos. Si se utilizan semejantes macromoléculas en el
método de acuerdo con la invención, se introduce una etapa
adicional, pero sin embargo opcional, en el método entre las etapas
c) y e), preferiblemente entre las etapas d) y e).
Se puede demostrar que semejante etapa de
amplificación es útil para la detección óptima de los
microorganismos, al aumentar la cantidad de ácidos nucleicos
disponibles para la detección. Si esta etapa de amplificación es
muy específica, también hace posible identificar los microorganismos
con mayor selectividad y de este modo disminuir el número de falsos
positivos. La amplificación es preferiblemente una amplificación de
tipo TMA o NASBA [Compton, J., Nature (1991)
350:91-92] o de tipo LAMP [Notomi T., Nucleic
Acids Research (2000), 28(12):e63].
Las sondas o cebadores descritos antes se pueden
diseñar con el fin de detectar un único tipo o varios tipos de
microorganismos. Con respecto a esto, pueden tener un grado variable
de especificidad con respecto a los elementos biológicos presentes
en los microorganismos. Por ejemplo, si los cebadores o sondas son
ácidos nucleicos, seleccionados para hibridar con los ácidos
nucleicos cuya secuencia está conservada en muchas especies de
microorganismos, la identificación será relativamente no específica;
si, por otra parte, su secuencia se selecciona para reconocer
solamente secuencias específicas para un pequeño número de especies,
la especificidad será mayor.
De acuerdo con otra realización específica más
de la invención, y ventajosamente, se puede llevar a cabo una etapa
de hibridación específica de las sondas de ácido nucleico o de los
cebadores con los ácidos nucleicos de dichos microorganismos
después de la etapa d) y antes de la etapa de detección e)
siguiente.
Esta etapa de hibridación de las sondas o
cebadores de ácido nucleico se lleva a cabo en condiciones de
hibridación convencionales conocidas por los expertos en la
técnica. También puede comprender una etapa de lavado para eliminar
las sondas o cebadores de ácido nucleico que han producido
hibridaciones no específicas.
Para la detección, preferiblemente las sondas o
cebadores de ácido nucleico de acuerdo con la invención son
marcados fluorescentemente o acoplados a enzimas para llevar a cabo
una reacción quimioluminiscente.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La etapa de detección de microorganismos (e) se
lleva a cabo detectando la señal luminosa que se origina a partir
de la reacción quimioluminiscente o de la emisión de fluorescencia
obtenida, correspondiente al marcaje de la sonda o del cebador,
utilizando una interfaz apropiada.
De acuerdo con un aspecto más preferido de la
invención, las sondas de ácido nucleico, tales como
oligonucleótidos, son acopladas a peroxidasa. Cuando se coloca
peroxidasa en presencia de luminol (sustrato de la peroxidasa),
dicha peroxidasa emite fotones (reacción de bioluminiscencia). Los
fotones emitidos por las microcolonias en la superficie de la
membrana pueden ser capturados por medio de una fibra óptica para
alcanzar un fotocátodo que los convierte en electrones. Cada
electrón generará una nube de electrones que, cuando alcanza una
pantalla de fósforo, se convierte en fotones. La cámara CCD
registra la luz emitida 30 veces por segundo durante la integración
y la imagen es transmitida al analizador de imágenes.
De acuerdo con otro aspecto, se puede utilizar
una composición permeabilizante como se ha descrito antes de
acuerdo con la invención para llevar a cabo un ensayo diagnóstico
in vitro. Las propiedades específicas de una composición de
acuerdo con la invención pueden ser utilizadas de hecho para hacer
que las sondas nucleotídicas o cualquier otro complejo molecular
penetren en células obtenidas de seres humanos o animales, o
mantenidas en cultivo, para llevar a cabo la detección in
situ.
La composición permeabilizante de acuerdo con la
invención también puede encontrar muchas aplicaciones en el campo
médico, por ejemplo como fármaco coadyuvante para incrementar la
permeabilidad de la pared a ingredientes activos tales como
antibióticos o antivirales que no podrían penetrar fácilmente
naturalmente en las células.
Más concretamente, se puede utilizar una
composición de acuerdo con la invención para hacer que ácidos
nucleicos antisentido, concretamente ARN antisentido (iARN)
penetren en las células en las cuales se busca inhibir la expresión
de ciertos genes, en particular en el tratamiento de enfermedades
genéticas o de ciertos cánceres.
Se pretende que la presente invención incluya un
kit para detectar y contar microorganismos en un medio líquido o
gaseoso, que comprende al menos:
- -
- una membrana para filtrar un medio líquido o gaseoso; y
- -
- una composición permeabilizante como se describe en la presente invención.
Preferiblemente, la membrana contenida en este
kit consiste principalmente en PVDF o es de Nailon®.
Ventajosamente, semejante kit también comprende
una composición que comprende un agente de entrecruzamiento
seleccionado entre glutaraladehído, formaldehído y paraformaldehído.
Esta segunda composición permite fijar los microorganismos sobre la
membrana, haciendo posible, llevando a cabo el método de acuerdo con
la invención, obtener una mejor resolución de la detección.
Un kit de acuerdo con la invención también puede
comprender una sonda para la detección específica de los
microorganismos que se están tratando de encontrar, en particular
una sonda como se ha definido antes que comprende una secuencia que
muestra una identidad de al menos 80% con el SEQ ID NO: 1, el SEQ ID
NO: 2, el SEQ ID NO: 3, el SEQ ID NO: 4 o el SEQ ID NO: 5.
El propósito de los siguientes ejemplos es
ilustrar la invención sin limitarla.
Las cepas sometidas a ensayo se conservan en
criotubos (Dutscher, ref. 028049) congeladas a -80ºC, preparadas a
partir de cepas liofilizadas referenciadas de la ATCC, DSMZ y
NCTC.
Para producir los criotubos, se inocula un
matraz de 100 ml de caldo TS (Biomérieux, ref. 41146) el día que se
preparan los tubos, y se incuban a 35-37ºC. Durante
el crecimiento, se llevan a cabo mediciones de la DO a 600 nm a
intervalos regulares utilizando un espectrofotómetro (Eppendorf,
Biophotometer ref. 6131 000.012). El crecimiento se detiene cuando
la DO alcanza 0,5. Se dispensan 600 \mul de crioprotector (Sigma,
congelación celular con glicerol), ref. C6039) y 600 \mul del
cultivo en cada criotubo. Los tubos se mezclan y después se colocan
a -80ºC.
El recuento se realiza sobre el caldo y sobre un
criotubo no congelado, cultivando en placa diluciones de 10^{-5}
y 10^{-6}. Estas diluciones se preparan en matraces de 9 ml de
agua con peptona (Biomérieux, ref. 42111). Se cultivan en placa 100
\mul de cada dilución con un propagador sobre agar TSA
(Biomérieux, ref. 43011) incubado durante 24 horas a 35ºC. El
procedimiento se repite tres veces. Al día siguiente, se descongela
un criotubo y se cuenta de la misma manera. Una galería API
(Biomérieux) hace posible identificar y confirmar la pureza de los
criotubos preparados.
Para todos los ensayos, las cepas bacterianas se
diluyen en tubos de agua con peptona (Biomérieux, ref. 42111). Se
prepara una dilución en cascada añadiendo 1 ml del criotubo de la
cepa utilizada a 9 ml del tubo de agua con peptona hasta obtener la
dilución deseada.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La filtración se lleva a cabo utilizando la
bomba Milliflex Plus Vaccum (Millipore, ref. MXP PLUS01) en embudos
Milliflex Rapid con una membrana de PVDF de 0,45 \mum con un
patrón de cuadrícula hidrófoba (Millipore, ref. RM HVMFX24). Las
bacterias se añaden a 50-100 ml de solución salina
fisiológica que contiene NaCl al 0,9% (B. Braun, ref. 0066570
E).
Las membranas se incuban sobre agar
Tryptic-soya de Milliflex (Millipore, ref. MXSM
CTS48) o en casetes con medio sólido R2A (Millipore, ref. MXSM CRA
48) en una incubadora a 32,5ºC +/- 2,5ºC.
Tras la incubación, cuya duración depende de la
bacteria utilizada, se aplican los reactivos de lisis y
bioluminiscencia (Millipore, ref. MXRP BLRST) a la membrana por
medio de "Milliflex Rapid Autospray Station" (Millipore, ref.
MXRP SPRKT), que distribuye 35 \mul de cada reactivo uniformemente
en la superficie de la membrana. Después las membranas se leen por
medio del sistema Milliflex Rapìd (Millipore, ref. MXRP KT230) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El sistema Milliflex Rapid es un sistema
complejo que detecta, amplifica y registra, utilizando una cámara
CCD, la luz emitida durante la reacción de bioluminiscencia. Está
compuesto por una torre de detección con una cámara CCD, un
amplificador, un analizador de la imagen y un soporte lógico para
recoger, procesar y registrar los datos.
El analizador sustrae el ruido de fondo de la
señal emitida y genera una imagen que es transmitida al ordenador.
Después aparece una representación de la membrana en la pantalla y
el sistema cuenta las colonias presentes sobre la membrana, como se
representa en las figuras 2 a 10.
En cuanto al sistema Milliflex Rapid, las
filtraciones se llevan a cabo utilizando la bomba Milliflex Plus
Vacuum en embudos con una membrana de PVDF de 0,45 \mum
(Millipore, ref. MX HVWP 124). Las células de las cepas bacterianas
que se van a detectar se añaden a 50-100 ml de
solución salina fisiológica que contiene NaCl al 0,9%. Las
membranas se incuban a 32,5ºC +/- 2,5ºC sobre casetes Milliflex de
medio TSA (Millipore, ref. MXSM CTS48), durante la cantidad de
tiempo necesaria para que los microorganismos formen
microcolonias.
Las membranas se separan del medio de agar y se
ponen en contacto con 2 ml de solución permeabilizante sobre un
soporte estanco (almohadillas absorbentes de casetes con medio
líquido Millipore, ref. MXLM CO120) durante 5 a 20 minutos a la
temperatura ambiente o a 37ºC (dependiendo de la naturaleza de los
microorganismos que se van a detectar). Se sometieron a ensayo las
siguientes soluciones permeabilizantes:
Una vez que las membranas han sido tratadas con
la solución permeabilizante, se ponen en contacto, durante 10
minutos a la temperatura ambiente, con 2 ml de una solución fijadora
que comprende:
Las membranas se transfieren después sobre una
casete de hibridación, con el fin de ponerlas en contacto con 1,5
ml de una solución de prehibridación que comprende:
Después se incuban a 50ºC durante 15 minutos con
agitación suave (10 rpm). Después se sustituye la solución de
prehibridación por 1,5 ml de la misma solución que comprende 100 mM
de la sonda, para formar una película en la superficie de la
membrana.
La membrana se incuba de este modo en la
solución de hibridación a 50ºC durante 60 minutos con agitación
suave (10 rpm).
Después se lava la membrana con 20 ml de una
solución de lavado que comprende (pH = 10):
Esta solución de lavado se diluye en 1 litro de
agua precalentada a 50ºC. La membrana se introduce en la solución
de lavado con agitación (30 rpm), tres veces.
Las casetes de hibridación específicas y un
tanque de lavado específico son asequibles con las referencias de
Millipore® MXREXPEND y MXRPWASHR.
Después se trata la membrana utilizando una
pulverización que comprende los reactivos de luminiscencia que
actúan sobre las moléculas de peroxidasa acopladas a las sondas
oligonucleotídicas (luminol y después peróxido de hidrógeno -
Millipore, ref. WBKL S0050), utilizando una estación de
pulverización (Milliflex Rapid Autospray Station), y después se
analiza por medio de la formación de imágenes de acuerdo con el
programa Milliflex Rapid® R-pseudo de la misma
manera que para la detección universal.
Los diferentes productos químicos sometidos a
ensayo en los análisis de permeabilización proceden de la compañía
Sigma-Aldrich®: lisozima (ref. L6876), EDTA (ref.
E5134), polietilenimina (ref. P3143), digluconato de clorhexidina
(ref. C9394), éster etílico de arginina (ref. A2883), proteinasa K
(ref. P4850), inhibidor de ARNasa (ref. R7397). Las soluciones se
preparan en PBS (Gibco, ref. 20012-019) y se aplican
a las membranas utilizando las casetes con medio líquido.
Los resultados obtenidos utilizando las
diferentes soluciones permeabilizantes 1 a 6 mencionadas antes, con
el fin de detectar específicamente la bacteria
gram-positiva Bacillus subtilis, se ilustran
en las figuras 4 a 9.
Para verificar que todas las bacterias presentes
sobre la membrana han sido permeabilizadas eficazmente, se calculó
la razón del número de colonias detectadas de acuerdo con el
protocolo de permeabilización e hibridación (utilizando una sonda
oligonucleotídica de secuencia SEQ ID NO: 2) de acuerdo con la
invención, con respecto al número de colonias detectadas mediante
recuento convencional sobre medio de agar (grado de cobertura). Los
resultados obtenidos y el correspondiente grado de cobertura han
sido referidos en la siguiente tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de la tabla 1 se revela que la solución
permeabilizante más eficaz es la composición Núm. 6 que comprende
lisozima (4 mg/ml), EDTA (100 mM) y PEI (374,5 \mug/ml), en
particular cuando se utiliza a 37ºC. Con posterioridad, se
sometieron a ensayo dos concentraciones de lisozima con respecto a
esta composición Núm. 6 (1 y 4 mg/ml) para determinar cuál hacía
posible obtener la mejor cobertura. La comparación de estas dos
concentraciones se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo de
detección específico descrito antes, tomando B. subtilis
como diana de la detección. Los resultados de la cobertura se
presentan en la tabla 2.
Estos resultados demuestran que la concentración
de lisozima de 1 mg/ml hace posible obtener mejores resultados de
acuerdo con la invención que una concentración superior de 4
mg/ml.
Se sometió a ensayo una composición
permeabilizante "optimizada" Núm. 7 que comprendía:
en busca de B. subtilis de acuerdo con el
protocolo elegido como diana antes, y en paralelo, de acuerdo con
el método de detección universal. El resultado se representa en la
Figura 2. Los valores de cobertura calculados a partir del número
de colonias contadas por medio de analizador de imágenes
R-Pseudo son del orden del 100%.
Se obtuvieron resultados similares con la
bacteria gram-positiva Staphylococcus aureus
(Tabla 3) utilizando una sonda oligonucleotídica de secuencia SEQ
ID NO: 3.
Los ensayos dirigidos a la validación de la
especificidad de la detección de B. subtilis de acuerdo con
el método de detección específica descrito en la invención se
llevaron a cabo utilizando 5 microorganismos: B. subtilis, S.
aureus, P. aeruginosa, E. coli y S. enterica subesp.
arizonae. El ensayo se llevó a cabo después de incubar durante
la noche a 25ºC en medio TSA para permitir el crecimiento de todos
los microorganismos. El resultado obtenido utilizando la sonda
específica para B. subtilis (SEQ ID NO: 2) se representa en
la Figura 3.
Se utilizó la composición permeabilizante Núm. 6
(4 mg/ml de Lisozima + EDTA 100 mM + PEI 374,5 \mug/ml) de
acuerdo con la invención sobre una almohadilla impregnada durante 20
minutos a 37ºC para detectar específicamente la bacteria
gram-negativa Pseudomonas aeruginosa de la
misma manera que para B. subtilis. A este efecto, se utilizó
una sonda oligonucleotídica correspondiente a la secuencia SEQ ID
NO: 1 como sonda de hibridación. La imagen obtenida al final de
este protocolo, por medio del analizador de imágenes, se representa
en la figura 10. Se puede observar que el método de acuerdo con la
invención permite una buena discriminación de las microcolonias
bacterianas detectadas.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> MILLIPORE CORPORATION
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nueva composición para permeabilizar
las paredes de microorganismos que comprende la combinación de
ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y polietilenimina (PEI)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> B1F117190FR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2007-04-20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ARN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_misc.
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de hibridación para la
detección específica de ARN de Pseudomonas aeruginosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_misc.
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de hibridación para la
detección específica de ARN de Bacillus subtilis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_misc.
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de hibridación para la
detección específica de ARN de Staphylococcus aureus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_misc.
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de hibridación para la
detección específica de ARN de Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADN artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_misc.
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda de hibridación para la
detección específica de ARN de Salmonella enterica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm8
Claims (24)
1. Una composición para permeabilizar las
paredes de microorganismos, caracterizada porque comprende la
combinación de polietilenimina (PEI) y ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA), siendo la concentración final de
PEI mayor de 100 \mug/ml y siendo la concentración final de EDTA
mayor de 50 mM en dicha composición.
2. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizada por comprender adicionalmente
lisozima.
3. Una composición de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque la
concentración de EDTA en la composición final está entre más de 50
y 150 mM, preferiblemente entre más de 50 y 100 mM.
4. Una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la
concentración de PEI en dicha composición está entre más de 100 y
900 \mug/ml, preferiblemente entre 200 y 800 \mug/ml.
5. Una composición de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque no
comprende ningún detergente.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Un método para contar y/o identificar, sobre
una membrana, microorganismos inicialmente presentes en un medio
líquido o gaseoso, caracterizado porque comprende las
siguientes etapas:
- (a)
- el medio líquido o gaseoso se filtra a través de una membrana de manera que los microorganismos presentes en este medio son retenidos sobre o en la membrana;
- b)
- la membrana y los microorganismos se ponen en contacto con una composición para permeabilizar las paredes de los microorganismos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5;
- (c)
- las células se fijan sobre la membrana utilizando un agente de entrecruzamiento;
- (d)
- los microorganismos se ponen en contacto con una o más macromoléculas opcionalmente marcadas capaces de cruzar la pared del microorganismo; y
- (e)
- se detectan las macromoléculas que han penetrado en los microorganismos.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6,
caracterizado porque comprende, entre la etapa a) y la etapa
b), una etapa adicional de cultivo de los microorganismos.
8. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 6 y 7, caracterizado porque el agente que
sirve como agente de entrecruzamiento en la etapa c) se selecciona
entre glutaraldehído, formaldehído y paraformaldehído.
9. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque, en la etapa
d), la macromolécula utilizada es una sonda de hibridación,
preferiblemente una sonda de hibridación oligonucleotídica o de
tipo PNA.
10. Un método de acuerdo con la reivindicación
9, caracterizado porque la sonda de hibridación hibrida con
los ARN de dichos microorganismos.
11. Un método de acuerdo con la reivindicación
10, caracterizado porque la sonda de hibridación hibrida con
el ARN ribosómico de dichos microorganismos.
12. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque la sonda
de hibridación utilizada en la etapa d) comprende una secuencia
oligonucleotídica que muestra una identidad de al menos 80% con una
secuencia seleccionada entre los SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 y 5.
13. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 6 a 12, caracterizado porque, en la
etapa d) las macromoléculas se marcan mediante acoplamiento con una
enzima que permite la emisión de una señal luminosa o
fluorescente.
14. Un método de acuerdo con la reivindicación
13, caracterizado porque la detección de los microorganismos
en la etapa e) se lleva a cabo por medio de una reacción de
quimioluminiscencia o fluorescencia y reconocimiento de la señal
luminosa emitida utilizando una interfaz apropiada.
15. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 6 a 14, caracterizado porque comprende,
entre la etapa d) y la etapa e), una etapa adicional de hibridación
específica de las sondas o cebadores con los ácidos nucleicos de
dichos microorganismos.
16. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 6 a 15, caracterizado porque comprende,
entre la etapa c) y la etapa e), una etapa adicional de
amplificación específica de los ácidos nucleicos presentes en los
microorganismos.
17. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 6 a 16, caracterizado porque la membrana
sobre la cual se detectan los microorganismos consiste
principalmente en PVDF o nailon®.
18. El uso de una composición permeabilizante de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, con el
fin de hacer que las macromoléculas penetren en una célula aislada o
microorganismo.
19. El uso de una composición permeabilizante de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en un
método para el recuento y/o la identificación de
microorganismos.
\vskip1.000000\baselineskip
20. Un Kit para detectar y contar
microorganismos, caracterizado porque comprende:
- -
- al menos una macromolécula marcada; y
- -
- una composición para permeabilizar las paredes de los microorganismos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
\vskip1.000000\baselineskip
21. Un kit de acuerdo con la reivindicación 20,
caracterizado porque también comprende una composición que
comprende un agente de entrecruzamiento seleccionado entre
glutaraldehído, formaldehído y paraformaldehído.
22. Un kit de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 20 o 21, caracterizado porque dicha
macromolécula marcada consiste en una sonda de hibridación.
23. Un kit de acuerdo con la reivindicación 22,
caracterizado porque la macromolécula marcada consiste en
una sonda de hibridación que comprende una secuencia que muestra una
identidad de al menos 80% con una de las secuencias de los SEQ ID
NO: 1 a 5.
24. Un kit de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 23, caracterizado porque también
comprende una membrana de filtración preferiblemente una membrana
de PVDF o nailon®.
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