ES2330362T3 - Proteinas de union a gag. - Google Patents

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Abstract

Una proteína interleuquina-8 (IL-8) modificada que se caracteriza por que al menos un residuo aminoacídico en la posición 70 y/o 71 de IL-8 de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la tabla 2 está sustituido por Arg, Lys y/o His, y por que los 6 aminoácidos N-terminales de dicha proteína están delecionados.

Description

Proteínas de unión a GAG.
La presente invención está relacionada con los métodos y herramientas utilizados para la inhibición de la interacción de quimioquinas y sus receptores de elevada afinidad sobre los leucocitos, y con los métodos para el tratamiento terapéutico de las enfermedades inflamatorias.
Las quimioquinas, originalmente denominadas citoquinas quimioatrayentes, realmente comprenden más de 50 miembros y representan una familia de proteínas pequeñas, inducibles, de bajo peso molecular (6-12 kDa en su forma monomérica) y secretadas que juegan un papel decisivo durante los procesos inmunovigilancia e inflamatorios. Dependiendo de su función en la inmunidad y la inflamación, pueden distinguirse dos clases. Las quimioquinas inflamatorias son producidas por muchas células de tejidos diferentes así como por los leucocitos que migran en respuesta a las toxinas bacterianas y las citoquinas inflamatorias como IL-1, TNF y los interferones. Su función principal es la de reclutar leucocitos para la defensa del huésped y en el proceso de la inflamación. Las quimioquinas localizadoras, por otro lado, se expresan constitutivamente en áreas definidas de los tejidos linfoides. Estas dirigen el tráfico y localización de los linfocitos y las células dendríticas dentro del sistema inmune. Estas quimioquinas, como se ilustra mediante BCA-1, SDF-1 o SLC, controlan la relocalización y recirculación de los linfocitos en el contexto de su maduración, diferenciación, activación y aseguran su correcta localización dentro de los órganos secundarios linfoides.
A pesar del gran número de representantes, las quimioquinas muestran un plegamiento estructural notablemente similar aunque la homología de secuencia varía entre un 20 y un 70 por ciento. Las quimioquinas consisten aproximadamente en 70-130 aminoácidos con cuatro residuos cisteína conservados. Las cisteínas forman dos puentes disulfuro (Cys 1-Cys 3, Cys 2-Cys 4) que son responsables de su estructura tridimensional característica. Las citoquinas quimiotácticas constan de un pequeño dominio amino-terminal (3-10 aminoácidos) que precede al primer residuo cisteína, un núcleo compuesto de láminas \beta y bucles de conexión que se encuentran entre el segundo y el cuarto residuo de cisteína, así como una hélice \alpha carboxi-terminal de 20-60 aminoácidos. El núcleo de la proteína posee una estructura bien ordenada mientras que las partes N- y C-terminal están desordenadas. Como proteínas de secreción se sintetizan con una secuencia líder de 20-25 aminoácidos que se escinde antes de su liberación.
Las quimioquinas se han subdividido en cuatro familias en base a la posición relativa de sus residuos cisteína en la proteína madura. En la subfamilia de \alpha-quimioquinas, los dos primeros de las cuatro cisteínas están separadas por un único aminoácido (CXC), mientras en las \beta-quimioquinas los residuos de cisteína correspondientes se encuentran adyacentes entre ellos (CC). Las \alpha-quimioquinas pueden además clasificarse según si contienen la secuencia ELR en N-terminal, lo que las hace quimiotácticas para los neutrófilos (por ejemplo IL-8), y las que carecen del motivo ELR y actúan sobre los linfocitos (por ejemplo I-TAC). Estructuralmente las \beta-quimioquinas pueden subdividirse en dos familias: la familia de la proteína quimioatrayente de los monocitos eotaxina, que se compone de las cinco proteínas quimioatrayentes de los monocitos (o MCP) y de la eotaxina que son idénticas entre ellas aproximadamente en un 65 por ciento, y el resto de \beta-quimioquinas. Como en la familia CXC, los aminoácidos N-terminales que preceden los residuos CC son componentes críticos para la actividad biológica y la selectividad por los leucocitos de las quimioquinas. Las \beta-quimioquinas, en general, no actúan sobre los neutrófilos pero atraen los monocitos, eosinófilos, basófilos y linfocitos con selectividad variable.
Sólo algunas quimioquinas no encajan en la familia CC o CXC. La linfotactina es de hecho la única quimioquina que muestra sólo dos en lugar de las cuatro cisteínas características en su estructura primaria, y por lo tanto se clasifican como quimioquinas \gamma o C. Por otro lado, concluyendo con esta clasificación, debe mencionarse la fractalquina como el único representante de la subfamilia \delta o CXXXC con tres aminoácidos separando las primeras dos cisteínas. Tanto la linfotaxina como la fractalquina, inducen la quimiotaxis de las células T y las células asesinas naturales.
Las quimioquinas inducen la migración y la activación celular mediante su unión a receptores específicos de la superficie celular, con siete dominios transmembranales (7TM) acoplados a proteína G sobre las células diana. Hasta el momento se han clonado dieciocho receptores quimioquina, lo que incluye seis receptores de CXC, diez de CC, uno de CX3C y uno de XC. Los receptores de quimioquinas se expresan sobre diferentes tipos de leucocitos, algunos de ellos están restringidos a ciertas células (por ejemplo CXCR1 se restringe a los neutrófilos) mientras otros se expresan de forma más amplia (por ejemplo CCR2 se expresa en monocitos, células T, células asesinas naturales y basófilos). De forma similar a las quimioquinas, los receptores puede expresarse constitutivamente en ciertas células, mientras otros son inducibles. Algunos de ellos incluso pueden regularse negativamente haciendo que las células no respondan a una determinada quimioquina pero mantienen la respuesta a otras. La mayoría de receptores reconocen más de una quimioquina y viceversa, pero el reconocimiento se restringe a las quimioquinas de la correspondiente subfamilia (véase la Tabla 1).
TABLA 1
1
Las quimioquinas poseen dos puntos principales de interacción con sus receptores, uno en el dominio amino-terminal y el otro con un bucle expuesto del armazón que se extiende entre el segundo y tercer residuo de cisteína. Ambos puntos se mantienen en gran proximidad mediante puentes disulfuro. El receptor reconoce primero el lugar de unión de la región del bucle que parece funcionar como dominio de anclaje. Esta interacción restringe la movilidad de la quimioquina facilitando así la correcta orientación del dominio aminoterminal. Se han realizado estudios con quimioquinas mutantes que aún se unen de forma efectiva a sus receptores pero no resultan en una señalización. Estos mutantes se obtuvieron mediante la deleción o modificación de aminoácidos del extremo N-terminal de, por ejemplo, IL-8, RANTES y MCP-1.
Tras la activación del receptor se da lugar a múltiples vías de señalización intracelular como resultado de la unión de la quimioquina. Las quimioquinas también interaccionan con dos tipos de moléculas no señalizadoras. Una es el receptor DARC que se expresa en los eritrocitos y en las células endoteliales y que se une a CC, así como a las quimioquinas CXC, y evitan su circulación. El segundo tipo son los glucosaminoglucanos (GAG) de heparán sulfato que forman parte de los proteoglucanos y que sirven como coreceptores de las quimioquinas. Estos capturan y presentan las quimioquinas sobre la superficie del tejido diana (por ejemplo las células endoteliales) para establecer un gradiente de concentración local. En una respuesta inflamatoria, como en la artritis reumatoide, los leucocitos ruedan en el endotelio en un proceso mediado por selectinas y se ponen en contacto con las quimioquinas presentadas por los proteoglucanos de la superficie celular. Así, las integrinas de los leucocitos se activan y se da lugar a una adherencia firme y extravasación. Los leucocitos reclutados se activan a través de citoquinas inflamatorias locales y pueden desensibilizarse a otras señalizaciones de quimioquinas a causa de la elevada concentración local de quimioquinas. Para mantener un gradiente de quimioquinas del torrente sanguíneo al tejido, el receptor DARC funciona como un sumidero de quimioquinas extra.
Los proteoglucanos de heparán sulfato (HS), que consisten en una proteína núcleo con cadenas laterales de glucosaminoglucanos (GAG) unidas covalentemente, se encuentran en la mayoría de células y tejidos de mamíferos. Mientras la parte proteica determina la localización del proteoglucano en la membrana celular o en la matriz extracelular, el componente glucosaminoglucano media las interacciones con una serie de ligandos extracelulares, como los factores de crecimiento, quimioquinas y moléculas de adhesión. La biosíntesis de proteoglucanos se ha revisado extensivamente con anterioridad. Los grupos principales de proteoglucanos de la superficie celular son de la familia sindecán de proteínas transmembranales (cuatro miembros en mamíferos) y de la familia glupicán de proteínas unidas a la membrana celular mediante una cola de glucosilfosfatidilinositol (GPI) (seis miembros en mamíferos). Mientras los glipicanos se expresan ampliamente en el sistema nervioso, riñones y en menor medida en músculo esquelético y liso, el sindecán-1 es el principal HSPG en las células epiteliales, el sindecán-2 predomina en los fibroblastos y células endoteliales, el sindecán-3 abunda en las células neuronales y el sindecán-4 se expresa ampliamente. La mayoría de las cadenas de GAG añadidas al núcleo de proteínas sindecán a través de una región de unión tetrasacárido en serinas concretas son cadenas HS. Aunque las secuencias aminoacídicas de los dominios extracelulares de los tipos sindecán específicos no están conservadas entre especies diferentes, al contrario que los dominios transmembranales y citoplasmáticos, el número y las posiciones de las cadenas de GAG están altamente conservadas. La estructura de los GAG, sin embargo, es específico de especie y además depende de la naturaleza del tejido que expresa el HSPG.
El heparán sulfato (HS) es el miembro más abundante de la familia de los glucosaminoglucanos (GAG) de polisacáridos lineales, que también incluye la heparina, condroitín sulfato, dermatán sulfato y queratán sulfato. El HS que aparece de forma natural se caracteriza por una cadena lineal de 20-100 unidades disacárido compuestas por N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) y ácido D-glucurónico (GlcA) que pueden modificarse para que incluyan N- y O-sulfatación (6-O y 3-O sulfatación de la glucosamina y 2-O sulfatación del ácido urónico) así como epimerización del ácido \beta-D-glurónico a ácido \alpha-L-idurónico (IdoA).
Los grupos de residuos azúcar N- y O-sulfatados, separados por regiones de baja sulfatación, se asumen como los principales responsables de la importante unión de proteínas y las propiedades regulatorias del HS. Además de las interacciones electrostáticas de los grupos sulfato del HS con los aminoácidos básicos, también se cree que están involucradas en la unión de proteínas las fuerzas de van der Waals y las interacciones hidrofóbicas. Además, la presencia de residuos iduronato conformacionalmente flexibles parece favorecer la unión de GAG a las proteínas. Otros factores como el espaciado entre los puntos de unión de proteínas también juegan un papel crítico en las interacciones de unión proteína-GAG: por ejemplo la dimerización del interferón \gamma inducida por HS requiere de cadenas GAG con dos secuencias de unión de proteínas separadas por una región de 7 kDa con baja sulfatación. En ocasiones son necesarias secuencias adicionales para una actividad biológica completa de algunos ligandos: para permitir la transducción de señales de FGF-2, HS debe poseer tanto la secuencia de unión mínima como residuos adicionales que se supone interaccionan con el receptor FGF.
Las proteínas de unión a heparina a menudo contienen secuencias consenso que consisten en grupos de residuos aminoacídicos básicos. La lisina, arginina, asparagina, histidina y glutamina están frecuentemente involucradas en los contactos electrostáticos con los grupos sulfato y carboxilo del GAG. Se cree que el espaciado de los aminoácidos básicos, en ocasiones determinado por la estructura 3D de las proteínas, controla la especificidad de unión y afinidad de los GAG. La actividad biológica del ligando también puede verse afectada por la cinética de la interacción HS-proteína. Reducir la dimensión de la difusión de los factores de crecimiento es una de las funciones sugeridas del HSPG, para la cual es ideal el carácter fuertemente repetitivo de las cadenas de GAG así como sus tasas de unión y disociación de proteínas relativamente rápida. En algunos casos, la cinética en lugar de la termodinámica dirige la función fisiológica de la unión HS-proteína. La mayoría de ligandos de HS requieren secuencias GAG de longitud y estructura bien definidas. La heparina, que se produce por mastocitos, es estructuralmente muy similar al heparán sulfato pero se caracteriza por niveles mayores de modificaciones post-polimerización que resulta en un alto grado uniforme de sulfatación con un grado relativamente pequeño de diversidad estructural. Así, los bloques altamente modificados en heparán sulfato se refieren algunas veces como "similares a heparina". Por esa razón, la heparina puede utilizarse como un análogo perfecto de HS para los estudios fisiológicos de proteína como, además, está disponible en mayores cantidades y por lo tanto más barato que el HS. Los diferentes tipos de células han mostrado sintetizar proteoglucanos con diferentes estructuras de glucosaminoglucanos que cambia durante la patogénesis, durante el desarrollo o en respuesta a señales extracelulares como factores de crecimiento. Esta diversidad estructural de HSPG conduce a una alta versatilidad de unión que enfatiza la gran importancia de los proteoglucanos.
Desde la demostración de que los proteoglucanos de heparán sulfato son críticos para la señalización de FGF, se realizaron varias investigaciones que muestran la importancia de la unión quimioquina-GAG para promover la actividad de quimioquina. Primero, casi todas las quimioquinas estudiadas hasta la fecha parece que se unen a HS in vitro, lo que sugiere que esto representa una propiedad fundamental de estas proteínas. Segundo, el hallazgo que los linfocitos T in vivo secretan CC-quimioquinas como complejos con glucosaminoglucanos indica que esta forma de interacción es fisiológicamente relevante. Además, se sabe que la asociación de quimioquinas con HS ayuda a estabilizar los gradientes de concentración a lo largo de la superficie endotelial, proporcionando así información direccional para los leucocitos migradores. También se piensa que el HS protege a las quimioquinas de la degradación proteolítica y que induce su oligomerización promoviendo así altas concentraciones locales en la proximidad de los receptores de señalización acoplados a G. La relevancia funcional de la oligomerización, no obstante, es controvertida aunque todas las quimioquinas presentan una clara base estructural para la multimerización. La dimerización a través de la asociación de las láminas \beta se observa para todas las quimioquinas de la familia de CXC (por ejemplo IL-8), contrariamente, la mayoría de
miembros de la familia CC-quimioquina (por ejemplo RANTES), dimerizan a través de sus cadenas N-terminales.
Se han acumulado muchos datos sobre la inhibición de la interacción de quimioquinas y su alta afinidad de receptores en los leucocitos mediante compuestos de bajo peso molecular. No obstante, no ha habido un avance en el tratamiento terapéutico de las enfermedades inflamatorias mediante esta aproximación.
La interleuquina-8 (IL-8) es una molécula clave involucrada en la atracción de neutrófilos durante la inflamación aguda y crónica. Se han llevado a cabo muchas aproximaciones para bloquear la acción de IL-8, empezando con la inhibición de la producción de IL-8 mediante por ejemplo glucocorticoides, Vitamina D3, ciclosporina A, factor de crecimiento transformante \beta, interferones etc., todos ellos inhiben la actividad de IL-8 a nivel de producción de mRNA de IL-8. Otra aproximación utilizada previamente es inhibir la unión de IL-8 a sus receptores utilizando anticuerpos específicos tanto contra el receptor en el leucocito o frente a IL-8 en sí, para actuar como antagonistas específicos inhibiendo así la actividad IL-8.
El objetivo de la presente invención es proporcionar así una estrategia alternativa para la inhibición o entorpecimiento de la interacción de quimioquinas/receptores en los leucocitos. Específicamente la acción de IL-8 será el objetivo de dicha estrategia.
La presente invención está relacionada con una proteína interleuquina-8 (IL-8) modificada, un ácido polinucleico aislado, un vector, una célula recombinante, una preparación farmacéutica y un uso como se define en las reivindicaciones.
Se describe aquí un método para producir nuevas proteínas de unión a GAG así como proteínas de unión a GAG alternativas que muestran una mayor afinidad al coreceptor de GAG (más que el tipo salvaje). Dichas proteínas de unión a GAG modificadas pueden actuar como competidoras con las proteínas de unión a GAG y son capaces de inhibir o regular negativamente la actividad de la proteína de unión a GAG salvaje, no obstante sin los efectos secundarios que aparecen en las proteínas recombinantes conocidas que se usan en la actualidad. Las moléculas IL-8 de acuerdo con la presente invención no muestran las desventajas mencionadas anteriormente. Las proteínas de unión a GAG modificadas pueden utilizarse en fármacos para varios usos terapéuticos, en particular -en el caso de las quimioquinas- para el tratamiento de enfermedades inflamatorias sin las desventajas conocidas que aparecen en las quimioquinas recombinantes conocidas en la actualidad. La modificación del sitio de unión a GAG de acuerdo con dicho método pasó a ser una estrategia ampliamente aplicable para todas las proteínas cuya actividad se basa en el evento de unión a este sitio, especialmente quimioquinas con sitios GAG. Las moléculas IL-8 de acuerdo con la presente invención con una mayor afinidad de unión a GAG son específicamente ventajosas con respecto
a sus efectos biológicos, especialmente con respecto a su actividad antiinflamatoria mediante su competición con las moléculas de tipo salvaje para el sitio GAG.
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Un método para introducir un sitio de unión a GAG en una proteína que se caracteriza porque comprende los pasos de:
- identificar una región en una proteína que no es esencial para el mantenimiento de la estructura
- introducir al menos un aminoácido básico en dicho sitio y/o delecionar al menos un aminoácido de relleno y/o acídico en dicho sitio, en la que dicho sitio de unión a GAG posee una afinidad de unión a GAG de Kd \leq 10 \muM, preferiblemente \leq 1 \muM, más preferiblemente \leq 0,1 \muM. Introduciendo al menos un aminoácido básico y/o delecionando al menos un aminoácido de relleno y/o acídico en dicha región, se introduce en dicha proteína un nuevo sitio de unión a GAG "artificial" mejorado. Esto comprende la nueva introducción completa de un sitio de unión a GAG en una proteína que no muestra una actividad de unión a GAG antes de esta modificación. Esto también comprende la introducción de un sitio de unión a GAG en una proteína que ya muestra actividad de unión a GAG. El nuevo sitio de unión a GAG puede introducirse en una región de la proteína que no muestra afinidad de unión a GAG así como una región que muestra afinidad de unión a GAG. No obstante, se proporciona una modificación de la afinidad de unión a GAG de una proteína de unión a GAG determinada, dicha capacidad de unión a GAG de la proteína modificada aumenta en comparación con la proteína salvaje. La presente invención está relacionada con un IL-8 modificado así como a una molécula de DNA aislada, un vector, una célula recombinante, una composición farmacéutica y el uso de dicha proteína modificada.
El término "introducir al menos un aminoácido básico" se refiere a la introducción de aminoácidos adicionales así como a la sustitución de aminoácidos. El propósito principal es aumentar la cantidad relativa de los aminoácidos básicos, preferiblemente Arg, Lys, His, Asn y/o Gln, en comparación con la cantidad total de aminoácidos en dicho sitio, mientras que el sitio de unión a GAG resultante preferiblemente comprenderá al menos 3 aminoácidos básicos, aún preferiblemente 4, más preferiblemente 5 aminoácidos.
El sitio de unión a GAG está preferiblemente en una posición expuesta al solvente, por ejemplo en un bucle. Esto asegurará una modificación efectiva.
Puede analizarse si una región de una proteína es esencial o no para el mantenimiento de la estructura, por ejemplo mediante métodos computacionales con programas específicos conocidos por los expertos en la materia. Tras la modificación de la proteína, la estabilidad conformacional se analiza preferiblemente in silico.
El término "aminoácido de relleno" se refiere a aminoácidos con cadenas laterales largas o estéricamente interferentes; estos son en particular Trp, Ile, Leu, Phe, Tyr. Los aminoácidos acídicos son en particular Glu y Asp. Preferiblemente, el sitio de unión a GAG resultante está libre de aminoácidos acídicos y de relleno, indicando que se han eliminado todos los aminoácidos acídicos y de relleno.
La afinidad de unión a GAG se determina -para el alcance de la protección de la presente solicitud- sobre la constante de disociación K_{d}. Una posibilidad es determinar los valores de la constante de disociación (K_{d}) de cualquier proteína dada por el cambio estructural en la unión de ligandos. Varias técnicas son conocidas por los expertos en la materia, por ejemplo las titulaciones de la fluorescencia isotérmicas, calorimetría de titulaciones isotérmicas, resonancia de plasmón en superficie, ensayo de movilidad en gel, e indirectamente mediante experimentos de competición con ligandos de GAG radiactivamente marcados. Otra posibilidad es predecir las regiones de unión mediante el cálculo con
métodos computacionales también conocidos por los expertos en la materia, en el que se pueden usar varios programas.
Un protocolo para introducir un sitio de unión a GAG en una proteína es por ejemplo el siguiente:
- Identificar una región de la proteína que no es esencial para el mantenimiento estructural general y que puede ser adecuado para la unión a GAG.
- Diseñar un nuevo sitio de unión a GAG mediante la introducción (sustitución o inserción) de un residuo básico Arg, Lys, His, Asp y Gln en cualquier posición o eliminando aminoácidos que interfieren en la unión a GAG.
- Comprobar la estabilidad conformacional de la proteína mutante resultante in silico.
- Clonar el cDNA de la proteína de tipo salvaje (alternativamente: comprar el cDNA).
- Utilizarlo como molde para la mutagénesis asistida por PCR para introducir los cambios mencionados anteriormente en la secuencia de aminoácidos.
- Subclonar el gen mutante en un sistema de expresión adecuado (procariota o eucariota dependiendo de las modificaciones post-traduccionales biológicamente requeridas).
- Expresión, purificación y caracterización de las proteínas mutantes in vitro.
- Criterios para introducir una afinidad de unión a GAG: K_{d} ^{GAG}(mutante) < 10 \muM.
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Ejemplos de dichas proteínas diseñadas con un nuevo sitio de unión a GAG son por ejemplo la parte Fc de la IgG así como los factores del complemento C3 y C4 modificados como sigue:
Fc: (439) KSLSLS (444) -> KSKKLS
C3: (1297)WIASHT(1302)-> WKAKHK
C4: (1)MLDAERLK(8)-> MKKAKRLK
La proteína de la invención IL-8 comprende un nuevo sitio de unión a GAG -en comparación con la proteína salvaje- como se ha definido antes y actuará por lo tanto como competidor con proteínas de unión a GAG naturales, en particular ya que la afinidad de unión a GAG de la proteína de la invención IL-8 es muy alta, por ejemplo K_{d} \leq 10 \muM.
La región de unión a GAG en una proteína unión a GAG modificada se modifica mediante sustitución, inserción, y/o deleción de al menos un aminoácido para aumentar la cantidad relativa de aminoácidos básicos en dicha región de unión a GAG, y/o reducir la cantidad de aminoácidos de relleno y/o acídicos en dicha región de unión a GAG, preferiblemente en una posición expuesta al solvente, y en la que la afinidad de unión a GAG de dicha proteína está aumentada en comparación con la afinidad de unión a GAG de la correspondiente proteína salvaje.
Se ha visto sorprendentemente que aumentando la cantidad relativa de aminoácidos básicos, en particular Arg, Lys y His, en la región de unión a GAG, la proteína de unión a GAG modificada muestra un aumento de la afinidad de unión a GAG en comparación con las proteínas salvajes, en particular cuando la cantidad relativa de aminoácidos básicos aumenta en una posición expuesta al solvente, ya que un área cargada positivamente en la superficie de la proteína ha demostrado aumentar la afinidad de unión. Preferiblemente, al menos 3, preferiblemente 4, más preferiblemente 5 aminoácidos básicos están presentes en la región de unión a GAG.
El término "proteína de unión a GAG" se refiere a cualquier proteína que se une a un coreceptor de GAG. Tanto si una proteína se une o no a un coreceptor de GAG, puede analizarse con la ayuda de protocolos conocidos tal como se ha mencionado antes. Hileman et al. (BioEssays 20 (1998), 156-167) describe sitios consenso en las proteínas de unión a glucosaminoglucano. La información descrita en este artículo es también útil como información de partida para la presente invención.
En el alcance de la presente solicitud, el término "región de unión a GAG" se define como una región que se une a GAG con una constante de disociación (valor K_{d}) inferior a 100 \muM, preferiblemente inferior a 50 \muM, más preferiblemente inferior a 20 \muM, como se ha determinado mediante titulación de la fluorescencia isotérmica (véanse los ejemplos más adelante).
Cualquier modificación mencionada en la presente solicitud puede llevarse a cabo con métodos bioquímicos conocidos, por ejemplo mutagénesis dirigida al sitio. Deberá también notarse que el clonaje molecular del sitio de unión a GAG es, por lo tanto, una técnica previa (véase por ejemplo WO96/34965 A, WO 92/07935 A, Jayaraman et al. (FEBS Letters 482 (2000), 154-158), WO02/20715 A, Yang et al. (J. Cell. Biochem. 56 (1994), 455-468), en las que el barajado molecular o la síntesis de novo de las regiones GAG se describen en; Butcher et al., (FEBS Letters 4009 (1997), 183-187) (se refiere a péptidos artificiales, no proteínas); Jinno- Oue et al, (J. Virol. 75 (2001), 12439-12445) síntesis de novo)).
La región de unión a GAG puede modificarse mediante sustitución, inserción y/o deleción. Esto quiere decir que un aminoácido no básico puede sustituirse mediante un aminoácido básico, un aminoácido básico puede insertarse en la región de unión a GAG o un aminoácido no básico puede delecionarse. Además, se deleciona un aminoácido que interfiere con la unión a GAG, preferiblemente todos los aminoácidos que interfieren la unión se delecionan. Dichos aminoácidos son en particular aminoácidos de relleno como se han descrito antes así como aminoácidos acídicos, por ejemplo Glu y Asp. Tanto si un aminoácido interfiere o no con la unión a GAG puede examinarse con métodos por ejemplo matemáticos o computacionales. El resultado de cualquiera de estas modificaciones es que aumenta la cantidad relativa de aminoácidos básicos en dicha región de unión a GAG, en la que "relativa" se refiere a la cantidad de aminoácidos básicos en dicha región de unión a GAG en comparación con el número total de aminoácidos en dicha región de unión a GAG. Además, los aminoácidos que interfieren de forma estérica o electroestáticamente con la unión a GAG se eliminan.
Tanto si un aminoácido está presente o no en una posición expuesta al solvente, puede determinarse por ejemplo con la ayuda de la estructura tridimensional conocida de la proteína o con la ayuda de métodos computacionales como se ha mencionado antes.
Tanto si la afinidad de unión a GAG de dicha proteína modificada aumenta o no en comparación con la afinidad de unión a GAG de las correspondientes proteínas salvajes, se puede determinar como se ha mencionado antes con la ayuda de, por ejemplo, experimentos de titulación por fluorescencia que determinan las constantes de disociación. Los criterios para la mejora de la afinidad de unión a GAG será K_{d} (mutante) < K_{d} (salvaje), preferiblemente en al menos 100%. Específicamente las proteínas modificadas mejoradas poseen una afinidad de unión a GAG -en comparación con la K_{d} salvaje- mayor en un factor como mínimo de 5, preferiblemente como mínimo de 10, más preferiblemente como mínimo de 100. El aumento de la afinidad de unión a GAG mostrará por lo tanto preferiblemente una K_{d} inferior a 10 \muM, preferiblemente inferior a 1 \muM, más preferiblemente inferior a 0,1 \muM.
Al aumentar la afinidad de unión a GAG, la proteína modificada actuará como un antagonista específico y competirá con la proteína de unión a GAG salvaje por la unión a GAG.
Se inserta al menos un aminoácido básico seleccionado del grupo que consiste en Arg, Lys, y His en dicha región de unión a GAG. Estos aminoácidos se insertan fácilmente en dicha región de unión a GAG, en la que el término "insertado" se refiere a una inserción, así como una sustitución de cualquier aminoácido no básico por arginina, lisina o histidina. Por supuesto, es posible insertar más de un aminoácido básico en el que el mismo aminoácido básico puede insertarse o también una combinación de dos o tres de los aminoácidos anteriormente mencionados.
La proteína es la quimioquina IL-8. Se sabe que las quimioquinas tienen un sitio de interacción con el co-receptor GAG mientras que esta unión de quimioquina es a menudo una condición para la posterior activación del receptor como se ha mencionado antes. Ya que las quimioquinas se encuentran a menudo en enfermedades inflamatorias, es de gran interés bloquear la activación del receptor de quimioquina. Dichas quimioquinas son IL-8, RANTES o MCP-1, que son moléculas bien caracterizadas y cuya región de unión a GAG es bien conocida (véase, por ejemplo, Lortat-Jacob et al., PNAS 99 (3) (2002), 1229-1234). Al aumentar la cantidad de aminoácidos básicos en la región de unión a GAG de IL-8, su afinidad de unión aumenta y por lo tanto las quimioquinas salvajes se unirán menos frecuentemente o no se unirán, dependiendo de la concentración de la proteína modificada respecto a la concentración de la proteína salvaje.
De acuerdo con un aspecto ventajoso, dicha región de unión a GAG es una hélice \alpha en C terminal. Un monómero químico típico se organiza alrededor de una lámina \beta de triple cadena antiparalela cubierta por una hélice \alpha de C-terminal. Se ha visto que en las quimioquinas, esta hélice \alpha de C-terminal está involucrada principalmente en la unión a GAG, por lo que la modificación de esta hélice \alpha de C-terminal, para poder aumentar la cantidad de aminoácidos básicos resulta en una quimioquina modificada con una afinidad de unión a GAG aumentada.
De forma ventajosa, las posiciones 17, 21, 70, y/o 71 en la IL-8 está sustituidas por Arg, Lys y/o His. Aquí es posible que sólo uno de estos sitios esté modificado. No obstante, también más de uno de estos sitios puede estar modificado así como todos, mientras que todas las modificaciones pueden ser Arg o Lys o His o una mezcla de estas. En IL-8 se ha visto que estas posiciones aumentan fuertemente la afinidad de unión a GAG de IL-8 y por lo tanto estas posiciones son particularmente adecuadas para las modificaciones.
Preferiblemente el aumento de la afinidad de unión es un aumento de la afinidad de unión a heparán sulfato y/o heparina. El heparán sulfato es el miembro más abundante de la familia GAG de polisacáridos lineales que también incluye la heparina. La heparina es estructuralmente muy similar al heparán sulfato que se caracteriza por niveles superiores de modificaciones post polimerización que resulta en un alto grado de sulfatación uniforme con un grado relativamente pequeño de diversidad estructural. Por lo tanto, los bloques altamente modificados en el heparán sulfato se refieren algunas veces como similares a heparina y puede utilizarse la heparina como un análogo de heparán sulfato para los estudios biofísicos de proteína. En cualquier caso, ambos, el heparán sulfato y la heparina, son particularmente adecuados.
Aún preferiblemente, se modifica otra región biológicamente activa inhibiendo así o regulando negativamente otra actividad biológica de dicha proteína. Esta otra actividad biológica se conoce para la mayoría de proteínas de unión a GAG, por ejemplo para las quimioquinas. Esta puede ser la región de unión a un receptor, por ejemplo al receptor 7TM. El término "otra" define una región biológicamente activa que no es la región de unión a GAG que, no obstante, se une a otras moléculas, células o receptores y/o las activa. Al modificar esta otra región biológicamente activa la otra actividad biológica de esta proteína se inhibe o regula negativamente y por lo tanto se proporciona una proteína modificada que es un antagonista fuerte de la proteína salvaje. Esto indica que por otro lado, la afinidad de unión a GAG es mayor que la unión a GAG de la proteína salvaje, por lo que la proteína modificada se unirá en mayor medida a GAG en lugar que a la proteína salvaje. Por otro lado, la otra actividad de la proteína salvaje que principalmente ocurre cuando la proteína se une a GAG, está inhibida o regulada negativamente, ya que la proteína modificada no llevará esta actividad específica o llevará esta actividad en un menor grado. Con esta proteína modificada se proporciona un antagonista efectivo para las proteínas de unión a GAG salvajes que no muestran los efectos secundarios conocidos de las otras proteínas recombinantes como se describe en el estado de la técnica. Esta otra región biológicamente activa puede por ejemplo determinarse in vitro mediante ensayos de competición de receptor (utilizando quimioquinas salvajes marcadas con fluorescencia, influjo de calcio, y migración celular (realizado en leucocitos nativos o en líneas celulares transfectadas de forma estable con 7TM). Ejemplos de dichas otras regiones biológicamente activas son, además de otros sitios de unión a receptor (como en la familia de factores de crecimiento), sitios enzimáticos (como en las hidrolasas, liasas, sulfotransferasas, N-deacetilasas, y copolimerasas), sitios de interacción de proteínas (como en la antitrombina III), y dominios de unión a membrana (como en la proteína gD del virus herpes simplex). Con esta realización preferible de proteínas IL-8 doblemente modificadas, se proporcionan por lo tanto mutantes dominantes (refiriéndose a la unión a GAG) negativos (en referencia al receptor) que son específicamente ventajosos respecto a los objetivos establecidos para la presente invención.
Aún preferiblemente, dicha otra región biológicamente activa se modifica mediante deleción, inserción, y/o sustitución, preferiblemente con alanina, un residuo estéricamente y/o electrostáticamente similar. Es posible, por supuesto, delecionar o insertar o sustituir al menos un aminoácido en dicha otra región biológicamente activa. No obstante, es también posible proporcionar una combinación de al menos dos de estas modificaciones o las tres. Sustituyendo un aminoácido determinado con alanina o un residuo estéricamente y/o electrostáticamente similar -"similar" significa similar al aminoácido que se sustituye- la proteína modificada no se modificará o lo hará sólo estéricamente/electrostáticamente en menor medida. Esto es particularmente ventajoso, ya que otras actividades de la proteína modificada, en particular la afinidad a la región de unión a GAG, no cambian.
De forma ventajosa, dicha proteína es IL-8 y dicha otra actividad biológica es la activación de leucocitos. Como se ha mencionado antes, las quimioquinas están involucradas en la atracción de leucocitos durante la inflamación crónica y aguda. Por lo tanto, al inhibir o regular negativamente la activación de leucocitos, disminuye o se inhibe la inflamación que hace de esta proteína modificada particular, una herramienta importante para estudiar, diagnosticar y tratar enfermedades inflamatorias.
De acuerdo con un aspecto ventajoso, dicha proteína es IL-8 y dicha otra región biológicamente activa está localizada dentro de los primeros 10 aminoácidos de N-terminal. Los primeros aminoácidos en N-terminal están involucrados en la activación de leucocitos, mientras que en particular Glu-4, Leu-5 y Arg-6 se identifican como esenciales para la unión y activación del receptor. Por lo tanto, estos tres o incluso todos los primeros 10 aminoácidos de N-terminal pueden sustituirse o delecionarse para inhibir o regular negativamente la unión y activación del receptor.
Otra proteína ventajosa es un mutante de IL-8 con los primeros 6 aminoácidos de N-terminal del mutante de IL-8 de la presente invención delecionados. Como se ha dicho antes, este mutante no se unirá ni activará o lo hará en menor medida a leucocitos, por lo que es particularmente adecuado para estudiar, diagnosticar y tratar enfermedades inflamatorias.
Preferiblemente, dicha proteína es un mutante de IL-8 seleccionado de entre el grupo que consiste en
del6F17RE70KN71R, del6F17RE70RN71K y del6E70KN71K. Estos mutantes han demostrado ser particularmente ventajosos, ya que la deleción de los primeros 6 aminoácidos de N-terminal inhibe o regula negativamente la unión y activación del receptor. Además, se sabe que las dos fenilalaninas en la posición 17 y 21 hacen el primer contacto con el receptor en su dominio N-terminal extracelular para facilitar la posterior activación del receptor. Para poder prevenir cualquier contacto con neutrófilos, estos dos aminoácidos 17 y 21 se intercambian, por lo que se intercambian por aminoácidos básicos, ya que están muy cercanos al motivo de unión a GAG de la hélice \alpha de C-terminal como puede verse en el modelo tridimensional de la proteína. Al intercambiar la posición 17 y/o 21 con una arginina o lisina, la afinidad de unión a GAG aumenta.
Otro aspecto de la presente invención es una molécula de ácido polinucleico aislada que codifica la proteína de la invención como se ha descrito antes. El ácido polinucleico puede ser DNA o RNA. Por lo tanto las modificaciones que conducen a la proteína modificada de la invención, se llevan a cabo a nivel de DNA o RNA. Esta molécula de ácido polinucleico aislada de la invención es adecuada para los métodos de diagnóstico así como para la terapia génica y la producción de proteína modificada de la invención a gran escala.
Dependiendo de las condiciones de hibridación, se forman dúplex complementarios entre las dos moléculas de DNA o RNA, tanto por emparejamiento perfecto o también mediante bases desemparejadas (véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor, N.Y. 1989). Las sondas mayores de 50 nucleótidos de longitud, pueden acumular hasta un 25 o 30% de bases desemparejadas. Las sondas más pequeñas acumulan menos desemparejamientos. La tendencia de una diana y una sonda para formar dúplex que contienen pares de base desemparejadas está controlada por la astringencia de las condiciones de hibridación que en sí es una función de factores, como la concentración de sal o formamida en el tampón de hibridación, la temperatura de hibridación y las condiciones de lavado tras la hibridación. Al aplicar los principios bien conocidos que suceden en la formación de dúplex híbridos, pueden lograrse, por un experto en la materia, las condiciones de astringencia deseada, al seleccionar entre una serie de tampones de hibridación, temperaturas y condiciones de lavado. Así, las condiciones pueden seleccionarse de forma que permitan la detección de dúplex híbridos perfectamente emparejados o parcialmente desemparejados. La temperatura de fusión (Tm) de un dúplex es útil para seleccionar condiciones de hibridación apropiadas. Las condiciones de hibridación astringentes para las moléculas de polinucleótidos superiores a 200 nucleótidos de longitud normalmente implica hibridar a una temperatura 15-25ºC por debajo de la temperatura de fusión del dúplex esperado. Para las sondas de oligonucleótido de más de 30 nucleótidos que forman dúplex menos estables que las sondas más largas, se logra una hibridación astringente al hibridar entre 5 y 10ºC por debajo de la Tm. La Tm de un dúplex de ácido nucleico puede calcularse utilizando una fórmula basada en el porcentaje de G+C contenido en los ácidos nucleicos y que tiene en cuenta las longitudes de las cadenas, como la fórmula Tm = 81,5-16,6 (log [Na^{+})]) + 0,41 (% G+C) -(600/N), en la que N = longitud de cadena.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un vector que comprende una molécula de DNA aislada de acuerdo con la presente invención como se ha definido anteriormente. El vector comprende todos los elementos regulatorios necesarios para la transfección eficiente así como la expresión eficiente de proteínas. Dichos vectores son bien conocidos en la técnica y cualquier vector adecuado puede seleccionarse con este propósito.
Otro aspecto de la presente solicitud se refiere a una célula recombinante que está transfectada de forma estable con un vector de la invención como se ha descrito anteriormente. Dicha célula recombinante así como cualquier célula que descienda de ella comprende el vector. Así, se proporciona una línea celular que expresa la proteína modificada de forma continua o tras la activación dependiendo del vector.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una proteína, un ácido polinucleico o un vector de acuerdo con la presente invención como se ha definido antes y un transportador farmacéuticamente aceptable. Por supuesto, la composición farmacéutica puede comprender sustancias adicionales que están normalmente presentes en las composiciones farmacéuticas, como sales, tampones, emulsificantes, colorantes, etc.
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Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de la proteína modificada, un ácido polinucleico o un vector de acuerdo con la presente invención como se ha definido antes en un método para inhibir o suprimir la actividad biológica de la correspondiente proteína salvaje. Como se ha mencionado antes, la proteína modificada actuará como un antagonista en el que los efectos secundarios que aparecen con las proteínas recombinantes conocidas no aparecerán con la proteína modificada de la invención. En el caso de las quimioquinas esta será en particular la actividad biológica involucrada en las reacciones inflamatorias.
Por lo tanto, otro uso de la proteína modificada, ácido polinucleico o vector de acuerdo con la presente invención es un método para producir un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria. En particular, si la proteína modificada es una quimioquina, actuará como antagonista sin efectos secundarios y será particularmente adecuada para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria. Por lo tanto, otro aspecto de la presente solicitud es también un método para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria, en la que una proteína modificada de acuerdo con la presente invención, la molécula de ácido polinucleico aislada o vector de acuerdo con la presente invención o una farmacéutica composición de acuerdo con la presente invención se administra a un paciente.
Preferiblemente, la enfermedad inflamatoria se selecciona de un grupo que comprende artritis reumatoide, psoriasis, osteoartritis, asma, enfermedad de Alzheimer, y esclerosis múltiple. Ya que la activación a través de quimioquinas puede inhibirse con una proteína modificada de acuerdo con la presente invención, las reacciones inflamatorias pueden inhibirse o regularse negativamente por lo que las condiciones inflamatorias anteriormente mencionadas pueden prevenirse o tratarse.
La presente invención se describe en más detalle con la ayuda de los siguientes ejemplos y figuras a los que, no obstante, no se limita la invención, en la que la Fig. 1 es un espectro del DC; la Fig. 2 muestra el contenido de la estructura secundaria de varios mutantes; las Fig. 3 y 4 muestran las gráficas de resultados de los ensayos de anisotropía de fluorescencia de varios mutantes; la Fig. 5 muestra la gráfica de los resultados de las titulaciones de la fluorescencia isotérmica; la Fig. 6 muestra la gráfica de los resultados de los experimentos de desplegamiento de varios mutantes, la Fig. 7 muestra el índice de quimiotaxis de los mutantes de IL-8, y la Fig. 8 muestra los resultados del ensayo de quimiotaxis de RANTES.
Ejemplos Ejemplo 1 Generación de genes recombinantes de IL-8 y clonaje de los mutantes
Se utilizó la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para generar los cDNA deseados para los mutantes introduciendo las mutaciones utilizando cebadores sentido y antisentido para mutagénesis. Un plásmido sintético que contiene el cDNA de la IL-8 salvaje se utilizó como molde, se añadió mezcla con polimerasa de DNA Clontech Advantage®2 Polymerase Mix y se realizó la reacción de PCR utilizando un Mastergradient Cycler de Eppendorf. Los cebadores de mutagénesis utilizados se resumen en la tabla a continuación, que se inicia con las secuencias directas (de 5' a 3'):
\bullet CACC ATG TGT CAG TGT ATA AAG ACA TAC TCC (cebador para la mutación \Delta6)
\bullet CACC ATG TGT CAG TGT ATA AAG ACA TAC TCC AAA CCT AGG CAC CCC AAA AGG ATA (cebador
{}\hskip0.7cm para la mutación \Delta6 F17R F21R)
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Las secuencias reversas son (de 5' a 3'):
\bullet TTA TGA ATT CCT AGC CCT CTT (cebador para la mutación E70R)
\bullet TTA TGA ATT CTT AGC CCT CTT (cebador para la mutación E70K)
\bullet TTA TGA CTT CTC AGC CCT CTT (cebador para la mutación N71K)
\bullet TTA TGA CTT CTT AGC CCT CTT (cebador para la mutación E70K N71K)
\bullet TTA TGA CTT CCT AGC CCT CTT (cebador para la mutación E70R N71K)
\bullet TTA TGA CCT CTT AGC CCT CTT (cebador para la mutación E70K N71R)
\bullet TTA TGA CCT CCT AGC CCT CTT (cebador para la mutación E70R N71R)
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Los productos de PCR se purificaron, se clonaron en el vector pCR.T7/NT-TOPO.TA (Invitrogen) y se transformaron en competentes de E. coli TOP10F (Invitrogen). En el siguiente paso se llevó a cabo una confirmación de la secuencia mediante la secuenciación del DNA de doble cadena utilizando un secuenciador ABI PRISM CE1.
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Ejemplo 2 Expresión y purificación de las proteínas recombinantes
Una vez confirmadas las secuencias, las construcciones se transformaron en competentes por calcio de E. coli BL21(DE3) para su expresión. Las células se cultivaron en agitación en 1 L de medio Lennox Broth (Sigma) que contiene 100 mg/ml de ampicilina a 37ºC hasta que se alcanzó una DO600 de alrededor de 0,8. La inducción de expresión proteica se consiguió mediante la adición de isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) hasta una concentración final de 1 mM. Cuatro horas después, las células se recogieron mediante centrifugación a 6000 g durante 20 minutos. El botón celular se resuspendió entonces en un tampón que contenía TRIS/HCl 20 mM, NaCl 50 mM, pH 8, se sonicó a 100 vatios durante 5 x 20 s y finalmente se centrifugó de nuevo durante 20 min a 10.000 g. Ya que la fracción principal de proteínas IL-8 recombinantes se encontró en cuerpos de inclusión, se eligieron condiciones desnaturalizantes para la posterior purificación. El botón celular se resuspendió en un tampón de Gua/HCl 6 M y MES 50 mM, pH 6,5. La suspensión se agitó entonces a 4ºC durante 4 horas, seguido de un paso de diálisis contra MES 50 mM, pH 6,5. La suspensión resultante se centrifugó entonces y se filtró para cargarse en una columna de intercambio de cationes fuertes (SP Sepharose® de Pharmacia Biotech). La elución se consiguió mediante un gradiente lineal de NaCl de 0 M a 1 M en un tampón MES 50 mM, pH 6,5 a lo largo de 60 minutos. Tras la liofilización de las fracciones que contienen la proteína deseada, se realizó un segundo paso de purificación mediante HPLC de fase reversa utilizando una columna C18. En este caso se escogió un gradiente no lineal de acetonitrilo del 10% al 90% para eluir la proteína deseada. El plegamiento de la proteína desnaturalizada se consiguió finalmente mediante la misma columna de intercambio de cationes y bajo las mismas condiciones descritas anteriormente.
Entonces se comprobó la pureza e identidad de la proteína mediante un análisis de tinción de plata en el primer caso y análisis de Western Blot, utilizando un anticuerpo monoclonal específico contra la IL-8 salvaje, en el segundo. El plegamiento de las proteínas también se confirmó mediante medidas de dicroismo circular (DC).
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Ejemplo 3 Caracterización Biofísica de los Mutantes 3.1 Medidas y análisis de dicroismo circular
Para investigar los cambios de estructura secundaria de la proteína mutante en presencia y ausencia de heparán sulfato (HS), se realizó una espectroscopía de DC. Las medidas se registraron en un espectropolarímetro Jasco J-710 a lo largo del rango de 195 a 250 nm, y se utilizó una célula de 0,1 cm de longitud de paso. El espectro de las soluciones de proteína con una concentración de 5 mM se registraron con un tiempo de respuesta de 1 s, resolución de paso de 0,2 nm, velocidad de 50 nm/min, ancho de banda de 1 nm y una sensibilidad de 20 mdeg. Se promediaron tres escaneos para conseguir un espectro más uniforme. Se corrigió el ruido de fondo de los espectros de las proteínas relacionado con la señal de DC del propio tampón o del tampón/HS. El análisis de la estructura secundaria de la proteína en presencia y ausencia de HS se realizó finalmente utilizando el programa SELCON.
Como se cambiaron una gran número de aminoácidos en una serie de nuevas combinaciones, se intento averiguar la dimensión de los cambios en las estructura secundaria resultante mediante métodos de dicroismo circular.
Se obtuvieron diferentes estructuras dependiendo de las mutaciones introducidas. Excepto por un mutante expresado (\Delta6 F17R F21R E70K N71R) que no mostró ninguna estructura, todos los mutantes mostraron hélices \alpha, láminas \beta y bucles medibles. Comparado con la IL-8 salvaje sólo un mutante (\Delta6 E70R) mostró una estructura bastante similar mientras el resto diferían principalmente en su hélice \alpha que oscila entre el 17,2% al 45,2% del total de la estructura. Sin embargo, este hecho sugiere que la estructura global de la IL-8 salvaje se mantenía a pesar de los muchos cambios de la secuencia proteica. Esto no podría haberse previsto con anterioridad. Al conocer ya que sólo los oligosacáridos de heparán sulfato, y no de heparina, son capaces de afectar la estructura secundaria de la IL-8 salvaje, se centró la atención en los efectos inducidos mediante el heparán sulfato no fraccionado. Todos los mutantes examinados mostraron cambios estructurales tras la unión de HS que pueden interpretarse como una evidencia de formación de comple-
jos.
Para demostrar los cambios estructurales tras las mutaciones introducidas y la adición de heparán sulfato, se resumen algunos de los datos obtenidos en las gráficas anteriores y a continuación.
3.2 Medidas de fluorescencia
Para estudiar la concentración y los cambios en la estructura cuaternaria dependiente de ligando se realizó una espectroscopía de fluorescencia. Debido a su elevada sensibilidad, que requiere sólo cantidades en nanógramos de proteína, la técnica fluorescente fue el método elegido para realizar las investigaciones deseadas. Las medidas se llevaron a cabo utilizando un fluorímetro LS50B de Perkin-Elmer (Beaconsfield, England).
3.3 Anisotropía de fluorescencia
Registrando la anisotropía de fluorescencia dependiente de concentración de la quimioquina resultante del cromóforo extrínseco bisANS se pretende encontrar la constante de dimerización de los mutantes. Las medidas se realizaron en PBS, empezando con concentraciones elevadas (de hasta 4 mM de proteína) seguido de una dilución paso a paso. Para cada punto de lectura, se registró la señal de anisotropía (r) a 507 nm promediada a lo largo de 60 s.
Se ha descrito que la oligomerización de IL-8 tiene una influencia relevante sobre las propiedades de unión de las proteínas a GAG. A una concentración monomérica, IL-8 se une a oligosacáridos de un tamaño definido 1000 veces más fuerte que a una concentración dimérica. Por lo tanto, las propiedades de oligomerización de los mutantes de IL-8 se investigaron mediante anisotropía de fluorescencia. Como el fluoróforo intrínseco de IL-8 (Trp57) no era suficientemente sensible para todos los mutantes, se utilizó el fluoróforo extrínseco bis-ANS para estas medidas. De nuevo, como ya se había detectado para la estructura secundaria, el mutante \Delta6 E70R también mostró un gran parecido de la constante de oligomerización (k_{oligo} = 350 nM) con la de la IL-8 salvaje (k_{oligo} = 379 nM). El mutante con la mayor k_{oligo} (k_{oligo} = 460 nM), que por lo tanto es el que peor dimeriza fue \Delta6 F17R F21R E70R N71K. Estudios previos identificaron que las láminas \beta están principalmente involucradas en el proceso de dimerización, un hecho que se correlaciona con los resultados de estructura secundaria de estos mutantes, que mostró un parecido muy bajo en las láminas \beta de sólo un 11,4%. El mutante con la menor k_{oligo} (k_{oligo} = 147 nM), se detctó que es \Delta6 F17R F21R E70K, que de nuevo mostró el mayor parecido en la estructura de láminas \beta (29,8%) de todos los mutantes investigados. También se observó el impacto de la adición del heparán sulfato. Como en el caso de la IL-8 salvaje, en la que el heparán sulfato causó un cambio en la constante de oligomerización a niveles mucho más elevados (k_{oligo} = 1.075 mM), se detectó también en los mutantes de IL-8 investigados, donde \Delta6 F17R F21R E70K cambió de 0,147 mM a 1.162 mM, y el mutante \Delta6 E70R de 0,350 mM a 1.505 mM en presencia de heparán sulfato. Algunos de los resultados obtenidos se muestran en las Fig. 3 y 4, en las que la Fig. 3 muestra la dependencia de la anisotropía de fluorescencia de los mutantes de IL-8 en PBS de la concentración de quimioquina y la Fig. 4 muestra la dependencia de la anisotropía de fluorescencia de \Delta6 F17R F21R E70K en PBS de la concentración de quimioquina en presencia (exceso de diez veces) y ausencia de HS (concentración de proteína (Cp = exceso 10 xy).
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3.4 Experimentos de Titulación de la fluorescencia isotérmica (TFI)
Las constantes de disociación (valores de Kd) son una medida de la afinidad de unión de un ligando a una proteína y por lo tanto el cambio dependiente de la concentración en las propiedades de emisión de fluorescencia de la proteína (bloqueo de la fluorescencia) tras la unión del ligando se utilizó para la determinación de la Kd. Como estos mutantes contienen un cromóforo de triptófano intrínseco que está situado cercano o en el sitio de unión a GAG propuesto y por lo tanto podría ser sensible a cambios estructurales tras la unión del ligando, los experimentos de TFI parecen adecuados para este tipo de investigación. La titulación de la intensidad de fluorescencia se realizó en PBS utilizando una concentración de proteína de 700 nM. La emisión de la solución de proteína tras una excitación a 282 nm se registró a lo largo de un rango de 300-400 nm tras la adición de una alícuota del respectivo ligando GAG y un periodo de equilibrado de 60 s.
Se investigó la unión a heparina no fraccionada y a heparán sulfato. Los mutantes se situaron a una concentración dimérica para asegurar una sensibilidad suficiente. Un bloqueo de la intensidad de fluorescencia del Trp57 tras la unión de GAG se registró en un rango del 25-35%. Se observó una mejora significativa de la unión del ligando, especialmente para la unión de heparina. \Delta6 F17R N71R E70K (Kd = 14 nM) y \Delta6 F17R F21R N71K (Kd = 14,6 nM) mostraron una unión 2600 veces mayor, y \Delta6 E70K N71K (Kd = 74 nM) una unión 1760 veces mayor comparado con la IL-8 salvaje (Kd = 37 mM). También se obtuvieron buenos resultados de unión de heparán sulfato. Para \Delta6 F17R N71R E70K se encontró una Kd de 107 nM, para \Delta6 F17RF 21R N71K la Kd fue de 95 nM y el mutante \Delta6 E70K N71K mostró una Kd de 34 nM. Como la IL-8 salvaje se une con una Kd de 4,2 mM, las Kd encontradas en los mutantes representan una extraordinaria mejora de la unión, véase la Fig.5.
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3.5 Experimentos de desplegamiento
Para obtener información de la estabilidad de las proteínas y si esta estabilidad podría cambiarse tras la unión del ligando GAG, se realizaron experimentos de desplegamiento. Como se ha mencionado anteriormente las técnicas de fluorescencia son muy sensibles para observar cambios en la estructura cuaternaria y por lo tanto también son el método de elección para investigar los cambios estructurales térmicos de la proteína. Las medidas se realizaron como se describe para la TFI, pero en lugar de cambiar la concentración de ligando, se cambia la temperatura. La estructura de la proteína se observó a una concentración de 0,7 mM a temperaturas de entre 15 y 85ºC en ausencia y presencia de un exceso de 10 veces de heparán sulfato o heparina.
El máximo de emisión de las proteínas osciló entre 340 nm y 357 nm, los valores típicos de un residuo de triptófano expuesto a solvente. Empezando con los experimentos de desplegamiento a 15ºC, el máximo de emisión de los mutantes varió entre 340 nm y 351 nm. Comparado con la IL-8 salvaje, cuyo máximo de emisión se observó a 340 nm, es decir valores ligeramente mayores. Tras el aumento de la temperatura, la intensidad del máximo de emisión disminuyó, acompañada de una modificación en el máximo a una longitud de onda mayor o menor. El máximo de emisión de \Delta6 E70R y \Delta6 E70K N71K cambió de 352,5 nm a 357 nm y de 343 nm a 345 nm, que es típico de una mayor exposición del residuo Trp57 al solvente a medida que la temperatura aumenta, pero de forma interesante los mutantes \Delta6 F17R N71R E70K y \Delta6 F17R F21R E70R N71K mostraron un viraje azul, oscilando de 350 nm a 343 nm y, de forma menos pronunciada, de 350 nm a 348 nm (véase la Fig.6). Al reducir lentamente la temperatura, el proceso de desplegamiento es parcialmente reversible en relación al cambio de longitud de onda y a los cambios en la intensidad. La adición de un exceso de 5 veces de heparán sulfato dio lugar a un aumento de la estabilidad de las proteínas, probablemente a través de la formación de complejos. Esto podría observarse por un lado mediante un cambio de la temperatura de fusión a una temperatura mayor, y por otro lado mediante un cambio del máximo de emisión significativamente menos pronunciado tras el aumento de la temperatura.
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Ejemplo 4 Ensayo basado en células de la función "negativa" en el receptor de los mutantes de IL-8 dominantes negativos
Para caracterizar la función anómala del receptor de los mutantes de IL-8 con respecto a la atracción de neutrófilos, se analizó la quimiotaxis a través de un filtro d los neutrófilos en respuesta a los mutantes de IL-8 en una cámara de microquimiotaxis equipada con una membrana de policarbonato sin PVP de 5 mm.
Preparado celular
Brevemente, se obtuvo una fracción de neutrófilos a partir de sangre humana recién recogida. Esto se consiguió añadiendo una solución de dextrano al 6% a sangre tratada con heparina (1:2) que luego se dejó sedimentar durante 45 min. Se recogió la solución clara superior que contiene las células y se lavó dos veces con HBSS sin Ca y Mg. Las células se contaron y finalmente se diluyeron con HBSS a 2 Mio/ml de suspensión celular, teniendo en cuenta que sólo el 60% de las células contadas son neutrófilos.
Ensayo de quimiotaxis
Los mutantes de IL-8 se diluyeron a concentraciones de 10 mg/ml, 1 mg/ml y 0,1 mg/ml y se situaron en triplicados en el compartimento inferior de la cámara (26 ml por pocillo). Los neutrófilos recién preparados se sembraron en la cámara superior (50 ml por pocillo) y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC en un incubador humidificado con CO_{2} al 5%. Tras la incubación, la cámara se desensambló, el lado superior del filtró se lavó y rascó y las células unidas a la cara inferior se fijaron con metanol y se tiñeron con soluciones Hemacolor (Merck). Las células se contaron entonces a 400 aumentos en 4 campos microscópicos seleccionados al azar por pocillo. Finalmente, se representó la media de los tres experimentos independientes frente a la concentración de quimioquina. En la Figura 7, se muestra el índice de quimiotaxis de varios mutantes de IL-8. Como era esperable, todos los mutantes mostraron una actividad de unión al receptor significativamente reducida.
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Ejemplo 5 Generación de genes RANTES recombinantes, y caracterización de la expresión, biofísica y actividad de los mutantes
El concepto de mutantes de quimioquina "que enmascaran los GAG" dominante negativo también se utilizó con RANTES, una quimioquina involucrada en las reacciones de hipersensibilidad de tipo IV como el rechazo de transplantes, dermatitis atópica así como otros trastornos inflamatorios como la artritis, la glomerulonefritis progresiva y la enfermedad inflamatoria pulmonar.
La capacidad de unión al receptor se vio afectada al introducir en la proteína salvaje un residuo de iniciación metionina. La expresión del RANTES salvaje en E. Coli dio lugar a la retención de este residuo de metionina, lo que convierte el RANTES salvaje en un potente inhibidor de la migración de monocitos, el denominado Met-RANTES. Se introdujeron diferentes mutaciones que potencian la afinidad de unión de GAG mediante métodos de mutagénesis dirigida por basados en PCR.
Mediante estos métodos se han clonado, expresado y purificado 9 mutantes RANTES hasta el momento, Met-RANTES A22K, Met-RANTES H23K, Met-RANTES T43K, Met-RANTES N46R, Met-RANTES N46K, Met-RANTES Q48K, Met-RANTES A22K/N46R, Met-RANTES V49R/E66S y Met-RANTES 15LSLA18 V49R/E66S.
Se realizaron experimentos de titulación de la fluorescencia isotérmica para medir las constantes de afinidad relativas (valores de K_{d}) de los mutantes RANTES para una heparina de tamaño definido. Como puede observarse en la tabla, todas las proteínas mutantes RANTES mostraron una mayor afinidad por esta heparina, mostrando Met-RANTES A22K, Met-RANTES H23K, Met-RANTES T43K y Met-RANTES A22K/N46R los resultados más prometedores.
\newpage
\quad
Kd en nM
Rantes salvaje
456,2 \pm 8,5
Met-Rantes V49R/E66S
345,5 \pm 21,7
Rantes 15LSLA18 V49R/66S
297,3 \pm 14,1
Rantes N46R
367,7 \pm 11,7
Rantes N46K
257,4 \pm 10,2
Rantes H23K
202,5 \pm 12,8
Rantes Q48K
383,4 \pm 39,6
Rantes T43K
139,2 \pm 30,1
Rantes A22K
202,1 \pm 9,8
Rantes A22K/N46R
164,0 \pm 16,6
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Ensayo de quimiotaxis de RANTES
Se analizó la migración celular dirigida por RANTES mutante utilizando el sistema de cámara Boyden de 48 pocillos equipado con membranas de policarbonato recubierto de PVP de 5 \mum. Se colocaron en los pocillos inferiores de la cámara por triplicado las diluciones de RANTES y mutante de RANTES en RPMI 1640 que contenía HEPES 20 mM pH 7,3 y BSA 1 mg/ml. Se colocaron en los pocillos superiores 50 \mul de suspensiones celulares de THP-1 (línea celular promonocítica de los cultivos celulares de la colección Europea) en el mismo medio a 2 x 10^{6} células/ ml. Tras un periodo de incubación de 2 h a 37ºC en CO_{2} al 5% se lavó la superficie superior del filtro en solución de HBSS. Las células migradas se fijaron en metanol y se tiñeron con solución de Hemacolor (Merck). Se contaron cinco magnificaciones a 400 x por pocillo y la media de tres experimentos independientes se representó frente a la concentración de quimioquina en la Figura 8. Las barras de error representa el error estándar de la media de los tres experimentos. De nuevo, como en el caso de los mutantes de IL-8, todos los mutantes de RANTES mostraron una actividad de unión al receptor significativamente reducida.
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Ejemplo 6 Proteínas con región de unión a GAG
Se caracterizaron las proteínas de unión a GAG por medios bioinformáticos y proteómicos junto con su región de unión a GAG. En las siguientes tablas 2 y 3, se muestran las quimioquinas con su región de unión a GAG (tabla 2) y ejemplos de otras proteínas se dan también con su región de unión a GAG (tabla 3).
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 2 Quimioquinas y sus dominios de unión a GAG
3
4
TABLA 3
Factor de biogénesis del peroxisoma 1
181 TRRAKE 186
367 QKKIRS 372
1263 PKRRKN 1268
181 TRRAKE 186
367 QKKIRS 372
1263 PKRRKN 1268
MLTK-beta
415 SKRRGKKV 422
312 ERRLKM 317
416 KRRGKK 421
312 ERRLKM 317
416 KRRGKK 421
Factor BHLH Hes4
43 EKRRRARI 50
43 EKRRRA 48
43 EKRRRA 48
Protocadherina 11
867 MKKKKKKK 874
867 MKKKKK 872
867 MKKKKK 872
899 MKKKKKKK 906
TABLA 3 (continuación)
899 MKKKKK 904
899 MKKKKK 904
catenina (proteína asociada a cadherina), delta 1
315 RRRLRS 320
404 VRKLKG 409
460 LRKARD 465
545 RRKLRE 550
621 AKKGKG 626
787 AKKLRE 792
315 RRRLRS 320
404 VRKLKG 409
460 LRKARD 465
545 RRKLRE 550
621 AKKGKG 626
787 AKKLRE 792
Receptor muscarínica de acetilcolina M5
221 EKRTKD 226
427 TKRKRV 432
514 WKKKKV 519
221 EKRTKD 226
427 TKRKRV 432
514 WKKKKV 519
Receptor adrenérgico alfa-2A
147 PRRIKA 152
224 KRRTRV 229
147 PRRIKA 152
224 KRRTRV 229
proteína de unión a la región REII del promotor de IL-5
440 TKKKTRRR 447
569 GKRRRRRG 576
38 ARKGKR 43
437 GKKTKK 442
444 TRRRRA 449
TABLA 3 (continuación)
569 GKRRRR 574
38 ARKGKR 43
437 GKKTKK 442
444 TRRRRA 449
569 GKRRRR 574
Mitofusina 1
291 ARKQKA 296
395 KKKIKE 400
291 ARKQKA 296
395 KKKIKE 400
Proteína N-cym
71 VRRCKI 76
71 VRRCKI 76
Factor regulador de la ubiqüitinación Smad 1
672 ERRARL 677
672 ERRARL 677
Factor similar a CUG-BP y ETR-3 5
468 MKRLKV 473
475 LKRPKD 480
468 MKRLKV 473
475 LKRPKD 480
EWS-Fli1 del sarcoma de Ewings
347 QRKSKP 352
347 QRKSKP 352
NUF2R
455 LKRKMFKM 462
331 LKKLKT 336
347 VKKEKL 352
331 LKKLKT 336
347 VKKEKL 352
proteína en dedos de zinc similar a Kruppel GLIS2
22 EKRERT 27
22 EKRERT 27
TABLA 3 (continuación)
FKSG32
15 LKRVRE 20
431 VRRGRI 436
15 LKRVRE 20
431 VRRGRI 436
Proteína similar a BARH 1
175 LKKPRK 180
228 NRRTKW 233
175 LKKPRK 180
228 NRRTKW 233
Proteína de unión a GTP nucleolar 1
393 SRKKRERD 400
624 GKRKAGKK 631
48 MRKVKF 53
141 IKRQKQ 146
383 ARRKRM 388
393 SRKKRE 398
490 KKKLKI 495
543 ARRSRS 548
550 TRKRKR 555
586 VKKAKT 591
629 GKKDRR 634
48 MRKVKF 53
141 IKRQKQ 146
383 ARRKRM 388
393 SRKKRE 398
490 KKKLKI 495
543 ARRSRS 548
550 TRKRKR 555
586 VKKAKT 591
629 GKKDRR 634
\newpage
TABLA 3 (continuación)
EVG1
17 RRRPKT 22
138 ERKRKA 143
17 RRRPKT 22
138 ERKRKA 143
ASPL
282 PKKSKS 287
282 PKKSKS 287
Transportador de Zinc 1
477 EKKPRR 482
477 EKKPRR 482
Autoantígeno uveal
603 EKKGRK 608
995 ERKFKA 1000
1023 VKKNKQ 1028
603 EKKGRK 608
995 ERKFKA 1000
1023 VKKNKQ 1028
RAB39
7 VRRDRV 12
7 VRRDRV 12
Molécula de adhesión celular del síndrome de Down
320 PRKVKS 325
387 VRKDKL 392
320 PRKVKS 325
387 VRKDKL 392
Fosfatasa de proteínas-tirosinas, no receptor tipo 12
139 GRKKCERY 146
59 VKKNRY 64
59 VKKNRY 64
Proteína con repetición WD 11
752 VRKIRF 757
752 VRKIRF 757
TABLA 3 (continuación)
Proteína relacionada con el cáncer gástrico VRG107
20 SRKRQTRR 27
25 TRRRRN 30
25 TRRRRN 30
Proteína de respuesta a crecimiento temprano 4
356 ARRKGRRG 363
452 EKKRHSKV 459
357 RRKGRR 362
357 RRKGRR 362
Proteína relacionada con el transporte de vesículas
309 PKRKNKKS 316
226 DKKLRE 231
310 KRKNKK 315
355 VKRLKS 360
226 DKKLRE 231
310 KRKNKK 315
355 VKRLKS 360
UPF3X
140 AKKKTKKR 147
141 KKKTKK 146
217 ERRRRE 222
225 RKRQRE 230
233 RRKWKE 238
240 EKRKRK 245
296 DKREKA 301
373 RRRQKE 378
393 MKKEKD 398
426 VKRDRI 431
140 AKKKTKKRD 148
141 KKKTKK 146
217 ERRRRE 222
225 RKRQRE 230
233 RRKWKE 238
TABLA 3 (continuación)
240 EKRKRK 245
296 DKREKA 301
373 RRRQKE 378
393 MKKEKD 398
426 VKRDRI 431
Proteína CGI-201, tipo IV
49 ARRTRS 54
49 ARRTRS 54
Proteína en dedo RING 23
98 KRKIRD 103
98 KRKIRD 103
FKSG17
72 EKKARK 77
95 IRKSKN 100
72 EKKARK 77
95 IRKSKN 100
P83
681 ARKERE 686
681 ARKERE 686
Proteína relacionada con el cáncer de ovario 1
62 LKRDRF 67
62 LKRDRF 67
Transactivator del MHC de clase II CIITA
407 HRRPRE 412
741 PRKKRP 746
783 DRKQKV 788
407 HRRPRE 412
741 PRKKRP 746
783 DRKQKV 788
Glucoproteína de las plaquetas VI-2
275 SRRKRLRH 282
275 SRRKRL 280
275 SRRKRL 280
TABLA 3 (continuación) 
\global\parskip0.960000\baselineskip
Proteína similar a ubiqüitina 5
11 GKKVRV 16
11 GKKVRV 16
Quinasa de proteínas D2
191 ARKRRL 196
191 ARKRRL 196
Proteína de la Homeobox GSH-2
202 GKRMRT 207
252 NRRVKH 257
202 GKRMRT 207
252 NRRVKH 257
Proteína ULBP3
166 ARRMKE 171
201 HRKKRL 206
166 ARRMKE 171
201 HRKKRL 206
deyodinasa de yodotironinas tipo II
87 SKKEKV 92
87 SKKEKV 92
299 SKRCKK 304
299 SKRCKK 304
Antígeno espermático
160 LKKYKE 165
478 IKRLKE 483
160 LKKYKEKRT 168
160 LKKYKE 165
478 IKRLKE 483
UDP-GaINAc: N-acetilgalactosaminiltransferasa de polipéptidos
4 ARKIRT 9
44 DRRVRS 49
138 PRKCRQ 143
4 ARKIRT 9
44 DRRVRS 49
138 PRKCRQ 143
\global\parskip1.000000\baselineskip
TABLA 3 (continuación)
NCBE
62 HRRHRH 67
73 RKRDRE 78
1012 SKKKKL 1017
62 HRRHRH 67
73 RKRDRE 78
1012 SKKKKL 1017
Proteína con repeticiones WD
372 LKKKEERL 379
384 EKKQRR 389
400 AKKMRP 405
384 EKKQRR 389
400 AKKMRP 405
Fosfodiesterasa 11A
27 MRKGKQ 32
27 MRKGKQ 32
ATPase probable transportadora de cationes 2
891 ERRRRPRD 898
306 SRKWRP 311
891 ERRRRP 896
306 SRKWRP 311
891 ERRRRP 896
Factor de transcripción de la HMG-box TCF-3
420 GKKKKRKR 427
399 ARKERQ 404
420 GKKKKR 425
420 GKKKKRKRE 428
399 ARKERQ 404
420 GKKKKR 425
HVPS11
793 VRRYRE 798
793 VRRYRE 798
\newpage
TABLA 3 (continuación)
PIST
165 NKKEKM 170
165 NKKEKM 170
Proteína de unión a FYN
473 KKREKE 478
501 KKKFKL 506
682 LKKLKK 687
696 RKKFKY 701
473 KKREKE 478
501 KKKFKL 506
682 LKKLKK 687
696 RKKFKY 701
C1orf25
620 GKKQKT 625
620 GKKQKT 625
C1orf14
441 LRRRKGKR 448
70 LRRWRR 75
441 LRRRKG 446
70 LRRWRR 75
441 LRRRKG 446
Factor de transcripción T-box TBX3
144 DKKAKY 149
309 GRREKR 314
144 DKKAKY 149
309 GRREKR 314
Proteína ribosomal mitocondrial 39S L47
121 AKRQRL 126
216 EKRARI 221
230 RKKAKI 235
121 AKRQRL 126
216 EKRARI 221
230 RKKAKI 235
\newpage
TABLA 3 (continuación)
CGI-203
33 VRRIRD 38
33 VRRIRD 38
Jagged1
1093 LRKRRK 1098
1093 LRKRRK 1098
Proteína de la membrana asociada a transportador secretor 1
102 DRRERE 107
102 DRRERE 107
Componente del complejo de proteínas que interacciona con el receptor de la vitamina D DRIP205
673 KKKKSSRL 680
672 TKKKKS 677
954 QKRVKE 959
978 GKRSRT 983
995 PKRKKA 1000
1338 GKREKS 1343
1482 HKKHKK 1487
1489 KKKVKD 1494
672 TKKKKS 677
954 QKRVKE 959
978 GKRSRT 983
995 PKRKKA 1000
1338 GKREKS 1343
1482 HKKHKK 1487
1489 KKKVKD 1494
Proteína de la membrana asociada a trasportador secretor 2
100 ERKERE 105
100 ERKERE 105
Receptor Nogo
420 SRKNRT 425
420 SRKNRT 425
\newpage
TABLA 3 (continuación)
FLAMINGO 1
169 GRRKRN 174
2231 ARRQRR 2236
169 GRRKRN 174
2231 ARRQRR 2236
Receptor de quimioquina CC
58 CKRLKS 63
58 CKRLKS 63
Proteína de unión al elemento regulador de la prolactina
271 HKRLRQ 276
271 HKRLRQ 276
Proteínas de unión a las secuencias señal de recombinación Kappa B y V(D)J
17 PRKRLTKG 24
713 RKRRKEKS 720
903 PKKKRLRL 910
180 HKKERK 185
629 TKKTKK 634
712 LRKRRK 717
903 PKKKRL 908
1447 QKRVKE 1452
1680 SRKPRM 1685
180 HKKERK 185
629 TKKTKK 634
712 LRKRRK 717
903 PKKKRL 908
1447 QKRVKE 1452
1680 SRKPRM 1685
Supresor de la metástasis de cáncer de mama 1
200 SKRKKA 205
229 IKKARA 234
200 SKRKKA 205
229 IKKARA 234
TABLA 3 (continuación)
Proteína Forkhead box P3
414 RKKRSQRP 421
413 FRKKRS 418
413 FRKKRS 418
Proteína de unión a FAS
228 LKRKLIRL 235
391 RKKRRARL 398
358 ARRLRE 363
390 ERKKRR 395
629 CKKSRK 634
358 ARRLRE 363
390 ERKKRR 395
629 CKKSRK 634
Hidrolasa carboxiterminal de la ubiqüitina 12
228 HKRMKV 233
244 LKRFKY 249
228 HKRMKV 233
244 LKRFKY 249
Proteína KIAA0472
110 HRKPKL 115
110 HRKPKL 115
PNAS-101
68 LKRSRP 73
106 PRKSRR 111
68 LKRSRP 73
106 PRKSRR 111
PNAS-26
118 DRRTRL 123
118 DRRTRL 123
Factor de transcripción de la mielina 2
176 GRRKSERQ 183
Cadena gamma de la ATPasa de transporte de sodio/potasio
47 SRRFRC 52
TABLA 3 (continuación)
55 NKKRRQ 60
47 SRRFRC 52
55 NKKRRQ 60
Proteína Mdm4
441 EKRPRD 446
464 ARRLKK 469
441 EKRPRD 446
464 ARRLKK 469
Proteína de la familia del antígeno G D 2
87 QKKIRI 92
87 QKKIRI 92
Proteína NipSnap2
153 FRKARS 158
153 FRKARS 158
Stannina
73 ERKAKL 78
73 ERKAKL 78
Cotransportador de bicarbonato sódico
973 EKKKKKKK 980
165 LRKHRH 170
666 LKKFKT 671
966 DKKKKE 971
973 EKKKKK 978
165 LRKHRH 170
666 LKKFKT 671
966 DKKKKE 971
973 EKKKKK 978
Miosina X
683 YKRYKV 688
828 EKKKRE 833
1653 LKRIRE 1658
1676 LKKTKC 1681
683 YKRYKV 688
TABLA 3 (continuación)
828 EKKKRE 833
1653 LKRIRE 1658
1676 LKKTKC 1681
PNAS-20
21 RKRKSVRG 28
20 ERKRKS 25
20 ERKRKS 25
Pellino
36 RRKSRF 41
44 FKRPKA 49
36 RRKSRF 41
44 FKRPKA 49
Receptor de movilidad mediado por hialuronano
66 ARKVKS 71
66 ARKVKS 71
canal potencial del receptor corto transitorio 7
753 FKKTRY 758
753 FKKTRY 758
Liprina alfa2
825 PKKKGIKS 832
575 IRRPRR 580
748 LRKHRR 753
839 GKKEKA 844
875 DRRLKK 880
575 IRRPRR 580
748 LRKHRR 753
839 GKKEKA 844
875 DRRLKK 880
Factor intermediario de la transcripción 1 alfa
904 DKRKCERL 911
1035 PRKKRLKS 1042
321 NKKGKA 326
1035 PRKKRL 1040
TABLA 3 (continuación)
321 NKKGKA 326
1035 PRKKRL 1040
Proteína de la capa intermedia del cartílago
719 QRRNKR 724
719 QRRNKR 724
UBX dominio-que contiene proteína 1
194 YRKIKL 199
194 YRKIKL 199
Lipoxigenasa de araquidonato 12, tipo 12R
166 VRRHRN 171
233 WKRLKD 238
166 VRRHRN 171
233 WKRLKD 238
Proteína de interacción con PBX hematopoyético
159 LRRRRGRE 166
698 LKKRSGKK 705
159 LRRRRG 164
703 GKKDKH 708
159 LRRRRG 164
703 GKKDKH 708
NAG18
28 LKKKKK 33
28 LKKKKK 33
Proteína del dominio POU 5
222 ARKRKR 227
222 ARKRKR 227
Proteína NRCAM
2 PKKKRL 7
887 SKRNRR 892
1185 IRRNKG 1190
1273 GKKEKE 1278
2 PKKKRL 7
887 SKRNRR 892
TABLA 3 (continuación)
1185 IRRNKG 1190
1273 GKKEKE 1278
Grupo gamma de protocadherina
11 TRRSRA 16
11 TRRSRA 16
Proteína SKD1
288 IRRRFEKR 295
251 ARRIKT 256
362 FKKVRG 367
251 ARRIKT 256
362 FKKVRG 367
Proteína anti-muerte
58 HRKRSRRV 65
59 RKRSRR 64
59 RKRSRR 64
Centrina 3
14 TKRKKRRE 21
14 TKRKKR 19
14 TKRKKR 19
Difosfohidrolasa de ectonucleósidos trifosfato 3
512 TRRKRH 517
512 TRRKRH 517
Proteína de la homeobox profeta de PIT-1
12 PKKGRV 17
69 RRRHRT 74
119 NRRAKQ 124
12 PKKGRV 17
69 RRRHRT 74
119 NRRAKQ 124
Receptor EP3 de prostaglandinas
77 YRRRESKR 84
389 MRKRRLRE 396
82 SKRKKS 87
TABLA 3 (continuación)
389 MRKRRL 394
82 SKRKKS 87
389 MRKRRL 394
Homeobox pituitaria 3
58 LKKKQRRQ 65
59 KKKQRR 64
112 NRRAKW 117
118 RKRERS 123
59 KKKQRR 64
112 NRRAKW 117
118 RKRERS 123
HPRL-3
136 KRRGRI 141
136 KRRGRI 141
Advilina
812 MKKEKG 817
812 MKKEKG 817
Factor de interacción con el interactor nuclear LIM 1
32 GRRARP 37
109 LKKQRS 114
32 GRRARP 37
109 LKKQRS 114
Nucleo de histona macro-H2A,1
5 GKKKSTKT 12
114 AKKRGSKG 121
70 NKKGRV 75
132 AKKAKS 137
154 ARKSKK 159
302 DKKLKS 307
70 NKKGRV 75
132 AKKAKS 137
154 ARKSKK 159
302 DKKLKS 307
TABLA 3 (continuación) 
\global\parskip0.960000\baselineskip
Proteína similar a vilina
180 KRRRNQKL 187
179 EKRRRN 184
179 EKRRRN 184
Beta-filamina
254 PKKARA 259
2002 ARRAKV 2007
254 PKKARA 259
2002 ARRAKV 2007
Proteína con motivo tripartito TRIM31 alfa
290 LKKFKD 295
290 LKKFKD 295
co-represor del receptor nuclear 1
106 SKRPRL 111
299 ARKQRE 304
330 RRKAKE 335
349 IRKQRE 354
412 QRRVKF 417
497 KRRGRN 502
580 RRKGRI 585
687 SRKPRE 692
2332 SRKSKS 2337
106 SKRPRL 111
299 ARKQRE 304
330 RRKAKE 335
349 IRKQRE 354
412 QRRVKF 417
497 KRRGRN 502
580 RRKGRI 585
687 SRKPRE 692
2332 SRKSKS 2337
Proteína en dedos RING expresada en cerebro
432 KRRVKS 437
432 KRRVKS 437
\global\parskip1.000000\baselineskip
TABLA 3 (continuación)
PB39
231 TKKIKL 236
231 TKKIKL 236
Proteína acrosomal espermática
48 FRKRMEKE 55
24 RRKARE 29
135 KRKLKE 140
213 KKRLRQ 218
24 RRKARE 29
135 KRKLKE 140
213 KKRLRQ 218
Proteína del tráfico de vesículas SEC22B
177 SKKYRQ 182
177 SKKYRQ 182
Factor de transcripción nucleolar 1
79 VRKFRT 84
102 GKKLKK 107
125 EKRAKY 130
147 SKKYKE 152
156 KKKMKY 161
240 KKRLKW 245
451 KKKAKY 456
523 EKKEKL 528
558 SKKMKF 563
79 VRKFRT 84
102 GKKLKK 107
125 EKRAKY 130
147 SKKYKE 152
156 KKKMKY 161
240 KKRLKW 245
451 KKKAKY 456
523 EKKEKL 528
558 SKKMKF 563
TABLA 3 (continuación)
Plexina-B3
248 FRRRGARA 255
Junctofilina tipo 3
626 QKRRYSKG 633
Proteína quinasa de linaje mixto plausible
773 YRKKPHRP 780
312 ERRLKM 317
312 ERRLKM 317
Proteína de unión a ácidos grasos 4, adipocitos
78 DRKVKS 83
105 IKRKRE 110
78 DRKVKS 83
105 IKRKRE 110
exostosis (múltiple) 1
78 SKKGRK 83
78 SKKGRK 83
Proteína rica en cisteínas que coniene el dominio DHHC
64 HRRPRG 69
64 HRRPRG 69
Proteína del proto-oncogén Myb
2 ARRPRH 7
292 EKRIKE 297
523 LKKIKQ 528
2 ARRPRH 7
292 EKRIKE 297
523 LKKIKQ 528
Ligasa de ácidos grasos de cadena larga-CoA 2
259 RRKPKP 264
259 RRKPKP 264
sintaxina 1 B2
260 ARRKKI 265
260 ARRKKI 265
TABLA 3 (continuación) 
\global\parskip0.960000\baselineskip
Dachshund 2
162 ARRKRQ 167
516 QKRLKK 521
522 EKKTKR 527
162 ARRKRQ 167
516 QKRLKK 521
522 EKKTKR 527
Helicasa DEAD/DEXH DDX31
344 EKRKSEKA 351
760 TRKKRK 765
760 TRKKRK 765
Receptor de andrógenos
628 ARKLKK 633
628 ARKLKK 633
Receptor del ácido retinoico alfa
364 RKRRPSRP 371
163 NKKKKE 168
363 VRKRRP 368
163 NKKKKE 168
363 VRKRRP 368
Cadena pesada de la quinesina
340 WKKKYEKE 347
605 VKRCKQ 610
864 EKRLRA 869
605 VKRCKQ 610
864 EKRLRA 869
Diubiqüitina
30 VKKIKE 35
30 VKKIKE 35
Proteína BING1
519 NKKFKM 524
564 ERRHRL 569
519 NKKFKM 524
564 ERRHRL 569
TABLA 3 (continuación)
Quinasa de adhesión focal 1
664 SRRPRF 669
664 SRRPRF 669
Proteína EBN2
20 TKRKKPRR 27
13 PKKDKL 18
20 TKRKKP 25
47 NKKNRE 52
64 LKKSRI 69
76 PKKPRE 81
493 SRKQRQ 498
566 VKRKRK 571
13 PKKDKL 18
20 TKRKKP 25
47 NKKNRE 52
64 LKKSRI 69
76 PKKPRE 81
493 SRKQRQ 498
566 VKRKRK 571
Proteína CO16
33 ARRLRR 38
115 PRRCKW 120
33 ARRLRR 38
115 PRRCKW 120
Monooxigenasa de la quinurenina 3
178 MKKPRF 183
178 MKKPRF 183
Proteína MLN 51
4 RRRQRA 9
255 PRRIRK 260
407 ARRTRT 412
4 RRRQRA 9
255 PRRIRK 260
407 ARRTRT 412
\global\parskip1.000000\baselineskip
TABLA 3 (continuación)
Antígeno del MHC clase II
99 QKRGRV 104
Antígeno del MHC class II
99 QKRGRV 104
Proteína que contiene una hélice superenrrollada acídica transformante 1
225 SRRSKL 230
455 PKKAKS 460
225 SRRSKL 230
455 PKKAKS 460
Proteína específica neuroendocrina VGF
479 EKRNRK 484
479 EKRNRK 484
Transportador de cationes orgánicos
230 GRRYRR 235
535 PRKNKE 540
230 GRRYRR 235
535 PRKNKE 540
Polimerasa de DNA theta
215 KRRKHLKR 222
214 WKRRKH 219
220 LKRSRD 225
1340 GRKLRL 1345
1689 SRKRKL 1694
214 WKRRKH 219
220 LKRSRD 225
1340 GRKLRL 1345
1689 SRKRKL 1694
Proteína relacionada con CDC45
169 MRRRQRRE 176
155 EKRTRL 160
170 RRRQRR 175
483 NRRCKL 488
155 EKRTRL 160
TABLA 3 (continuación) 
\global\parskip0.960000\baselineskip
170 RRRQRR 175
483 NRRCKL 488
Proteína del canal intracelular de cloruro 2
197 AKKYRD 202
197 AKKYRD 202
Proteína de unión a metil-CpG
85 KRKKPSRP 92
83 SKKRKK 88
318 QKRQKC 323
354 YRRRKR 359
83 SKKRKK 88
318 QKRQKC 323
354 YRRRKR 359
Quinasa de proteínas C, tipo eta
155 RKRQRA 160
155 RKRQRA 160
Ribonucleoproteína nuclear heterogénea H
71 LKKDRE 76
169 LKKHKE 174
71 LKKDRE 76
169 LKKH KE 174
ORF2
11 SRRTRW 16
155 ERRRKF 160
185 LRRCRA 190
530 SRRSRS 535
537 GRRRKS 542
742 ERRAKQ 747
11 SRRTRW 16
155 ERRRKF 160
185 LRRCRA 190
530 SRRSRS 535
537 GRRRKS 542
742 ERRAKQ 747
\global\parskip1.000000\baselineskip
TABLA 3 (continuación)
Proteína única de la F-box 24
9 LRRRRVKR 16
9 LRRRRV 14
29 EKRGKG 34
9 LRRRRV14
29 EKRGKG 34
Proteína neuronal rica en leucinas
51 NRRLKH 56
51 NRRLKH 56
Proteína RER1
181 KRRYRG 186
181 KRRYRG 186
Nefrocistina
3 ARRQRD 8
430 PKKPKT 435
557 NRRSRN 562
641 EKRDKE 646
3 ARRQRD 8
430 PKKPKT 435
557 NRRSRN 562
641 EKRDKE 646
Isoenzima de la quinasa de adenilato 2, mitocondrial
60 GKKLKA 65
116 KRKEKL 121
60 GKKLKA 65
116 KRKEKL 121
Reductasa de clordecona
245 AKKHKR 250
245 AKKHKR 250
Metaxina 2
166 KRKMKA 171
166 KRKMKA 171
TABLA 3 (continuación)
Proteína de la homeobox de mesodermo emparejada 1
89 KKKRKQRR 96
88 EKKKRK 93
94 QRRNRT 99
144 NRRAKF 149
88 EKKKRK 93
94 QRRNRT 99
144 NRRAKF 149
Proteína con dedos Ring
174 LKRKWIRC 181
8 TRKIKL 13
95 MRKQRE 100
8 TRKIKL 13
95 MRKQRE 100
Ataxina 7
55 PRRTRP 60
377 GRRKRF 382
704 GKKRKN 709
834 GKKRKC 839
55 PRRTRP 60
377 GRRKRF 382
704 GKKRKN 709
834 GKKRKC 839
Proteína específica de parada del crecimiento 1
169 ARRRCDRD 176
Proteína SKAP55
115 EKKSKD 120
115 EKKSKD 120
Palmitoiltransferasa de serinas 1
232 PRKARV 237
232 PRKARV 237
Palmitoiltransferasa de serinas 2
334 KKKYKA 339
TABLA 3 (continuación)
450 RRRLKE 455
334 KKKYKA 339
450 RRRLKE 455
Sinaptopodina
405 KRRQRD 410
405 KRRQRD 410
Alfa-tectorina
1446 TRRCRC 1451
2080 IRRKRL 2085
1446 TRRCRC 1451
2080 IRRKRL 2085
Factor de transcripción C-MAF forma larga
291 QKRRTLKN 298
Proteína tipo IIa del síndrome de Usher
1285 MRRLRS 1290
1285 MRRLRS 1290
polipéptido p30 asociado a MSin3A
95 QKKVKI 100
124 NRRKRK 129
158 LRRYKR 163
95 QKKVKI 100
124 NRRKRK 129
158 LRRYKR 163
Región C de la cadena delta de las Ig
142 KKKEKE 147
142 KKKEKE 147
Componente TRAP100 del complejo proteico asociado al receptor de la hormona tiroidea
383 AKRKADRE 390
833 KKRHRE 838
833 KKRHRE 838
catanina P60
369 LRRRLEKR 376
326 SRRVKA 331
TABLA 3 (continuación) 
\vskip1.000000\baselineskip
326 SRRVKA 331
Factor de transcripción jun-D
286 RKRKLERI 293
273 RKRLRN 278
285 CRKRKL 290
273 RKRLRN 278
285 CRKRKL 290
Deshidrogenasa de esterol/retinol
152 VRKARG 157
152 VRKARG 157
Sintasa de glucógeno [almidón], hígado
554 DRRFRS 559
578 SRRQRI 583
554 DRRFRS 559
578 SRRQRI 583
Receptor relacionado con el estrógeno gamma
173 TKRRRK 178
353 VKKYKS 358
173 TKRRRK 178
353 VKKYKS 358
Proteína con cremallera de leucina específica de retina neural
162 QRRRTLKN 169
Fosfolipasa citosólica A2-gamma
514 NKKKILRE 521
31 LKKLRI 36
218 FKKGRL 223
428 CRRHKI 433
31 LKKLRI 36
Fosfolipasa citosólica A2-gamma
218 FKKGRL 223
428 CRRHKI 433
\newpage
TABLA 3 (continuación)
GLE1
415 AKKIKM 420
415 AKKIKM 420
Proteína de exostosis múltiple tipo II EXT2.I
296 VRKRCHKH 303
659 RKKFKC 664
659 RKKFKC 664
Factor de transcripción dependiente de AMP cíclic ATF-7
86 EKKARS 91
332 GRRRRT 337
344 ERRQRF 349
86 EKKARS 91
332 GRRRRT 337
344 ERRQRF 349
Quinasa de proteínas/endoribonucleasa
886 LRKFRT 891
886 LRKFRT 891
Factor de transcripción E2F6
23 RRRCRD 28
59 VKRPRF 64
98 VRKRRV 103
117 EKKSKN 122
23 RRRCRD 28
59 VKRPRF 64
98 VRKRRV 103
117 EKKSKN 122
Proteína con un dominio muerte activadora de MAP quinasa
1333 IRKKVRRL 1340
160 KRRAKA 165
943 MKKVRR 948
1034 DKRKRS 1039
1334 RKKVRR 1339
1453 TKKCRE 1458
TABLA 3 (continuación)
160 KRRAKA 165
943 MKKVRR 948
1034 DKRKRS 1039
1334 RKKVRR 1339
1453 TKKCRE 1458
Receptor nuclear huérfano PXR
126 KRKKSERT 133
87 TRKTRR 92
125 IKRKKS 130
87 TRKTRR 92
125 IKRKKS 130
Factor de crecimiento derivado del epitelio de la lente
149 RKRKAEKQ 156
286 KKRKGGRN 293
145 ARRGRK 150
178 PKRGRP 183
285 EKKRKG 290
313 DRKRKQ 318
400 LKKIRR 405
337 VKKVEKKRE 345
145 ARRGRK 150
178 PKRGRP 183
285 EKKRKG 290
313 DRKRKQ 318
400 LKKIRR 405
Cofactor de la proteína homeobox LIM
255 TKRRKRKN 262
255 TKRRKR 260
255 TKRRKR 260
Receptor que se extiende en múltiples membranas TRC8
229 WKRIRF 234
229 WKRIRF 234
TABLA 3 (continuación)
Factor de transcripción SUPT3H
172 DKKKLRRL 179
169 MRKDKK 174
213 NKRQKI 218
169 MRKDKK 174
213 NKRQKI 218
Geminina
50 KRKHRN 55
104 EKRRKA 109
50 KRKHRN 55
104 EKRRKA 109
Factor regulado por el ciclo celular p78
165 EKKKVSKA 172
124 IKRKKF 129
188 TKRVKK 193
381 DRRQKR 386
124 IKRKKF 129
188 TKRVKK 193
381 DRRQKR 386
Complejo del antígeno 6 de linfocitos, locus D
61 QRKGRK 66
85 ARRLRA 90
61 QRKGRK 66
85 ARRLRA 90
Sintetasa de 1-pirrolin-5-carboxilato Delta
455 LRRTRI 460
455 LRRTRI 460
Proteína enlazante de células B BLNK
36 IKKLKV 41
36 IKKLKV 41
Proteína enlazante de células B BLNK-S
36 IKKLKV 41
36 IKKLKV 41
TABLA 3 (continuación)
Antígeno del Alzheimer fetal
5 ARRRRKRR 12
16 PRRRRRRT 23
93 WKKKTSRP 100
5 ARRRRK 10
16 PRRRRR 21
26 PRRPRI 31
35 TRRMRW 40
5 ARRRRK 10
16 PRRRRR 21
26 PRRPRI 31
35 TRRMRW 40
Variante de corte y empalme del canal de potencial del receptor transitorio 4 zeta
505 CKKKMRRK 512
506 KKKMRR 511
676 HRRSKQ 681
506 KKKMRR 511
676 HRRSKQ 681
Regulador de a miofibrilogénesis MR-2
65 RKRGKN 70
65 RKRGKN 70
Proteína de anclaje a fosfatasa que contiene un dominio SH2 2c de la superfamilia inmunoglobulina, miembro 3
269 IKKRSLRS 276
394 SKRPKN 399
394 SKRPKN 399
Homólogo de Meis (mouse) 3
112 PRRSRR 117
120 WRRTRG 125
112 PRRSRR 117
120 WRRTRG 125
Delecionada en la azoospermia 2
105 GKKLKL 110
114 IRKQKL 119
TABLA 3 (continuación)
105 GKKLKL 110
114 IRKQKL 119
Centaurina gamma3
543 NRKKHRRK 550
544 RKKHRR 549
544 RKKHRR 549
Factor de transcripción de la leucemia de pre-células B 1
233 ARRKRR 238
286 NKRIRY 291
233 ARRKRR 238
286 NKRIRY 291
Proteína ribosomal 60S L13a
112 DKKKRM 117
158 KRKEKA 163
167 YRKKKQ 172
112 DKKKRM 117
158 KRKEKA 163
167 YRKKKQ 172
Proteína que contiene el dominio WD40 y FYVE 3
388 IKRLKI 393
388 IKRLKI 393
Proteína LENG1
34 RKRRGLRS 41
84 SRKKTRRM 91
1 MRRSRA 6
33 ERKRRG 38
85 RKKTRR 90
1 MRRSRA 6
33 ERKRRG 38
85 RKKTRR 90
MRIP2
375 NKKKHLKK 382
TABLA 3 (continuación)
Receptor acoplado a proteína G
430 EKKKLKRH 437
290 WKKKRA 295
395 RKKAKF 400
431 KKKLKR 436
290 WKKKRA 295
395 RKKAKF 400
431 KKKLKR 436
143 LKKFRQ 148
228 LRKIRT 233
143 LKKFRQ 148
228 LRKIRT 233
232 QKRRRHRA 239
232 QKRRRH 237
232 QKRRRH 237
Canal de iones espermático
402 QKRKTGRL 409
Proteína de anclaje a la quinasa A
2232 KRKKLVRD 2239
2601 EKRRRERE 2608
2788 EKKKKNKT 2795
370 RKKNKG 375
1763 SKKSKE 1768
2200 EKKVRL 2205
2231 LKRKKL 2236
2601 EKRRRE 2606
2785 EKKEKK 2790
1992 QKKDWKRQ 2000
370 RKKNKG 375
1763 SKKSKE 1768
2200 EKKVRL 2205
2231 LKRKKL 2236
2601 EKRRRE 2606
TABLA 3 (continuación)
2785 EKKEKK 2790
Proteína específica de linfocitos LSP1
315 GKRYKF 320
315 GKRYKF 320
Similar a la molécula de activación de la señalización linfocítica (H. sapiens)
261 RRRGKT 266
261 RRRGKT 266
Dermatan-4-sulfotransferasa-1
242 VRRYRA 247
242 VRRYRA 247
Moesina
291 MRRRKP 296
325 EKKKRE 330
291 MRRRKP 296
325 EKKKRE 330
Quinasa de serina/treonina-proteínas proto-oncogén A-Raf
288 KKKVKN 293
358 LRKTRH 363
288 KKKVKN 293
358 LRKTRH 363
Citocromo P450 2C18
117 GKRWKE 122
117 GKRWKE 122
117 GKRWKE 122
156 LRKTKA 161
117 GKRWKE 122
156 LRKTKA 161
Fosfatasa de tirosina proteínas, no receptor tipo 3
594 IRRRAVRS 601
263 FKRKKF 268
388 IRKPRH 393
874 VRKMRD 879
263 FKRKKF 268
TABLA 3 (continuación)
388 IRKPRH 393
874 VRKMRD 879
similar a la calicreína 7 (quimiotríptica, estrato corneo)
15 VKKVRL 20
15 VKKVRL 20
Lipasa sensible a las hormonas
703 ARRLRN 708
703 ARRLRN 708
Proteína ribosomal 40S S30
25 KKKKTGRA 32
23 EKKKKK 28
23 EKKKKK 28
Proteína con dedos de Zinc 91
617 LRRHKR 622
617 LRRHKR 622
Proteína NNP-1
320 NRKRLYKV 327
387 ERKRSRRR 394
432 QRRRTPRP 439
454 EKKKKRRE 461
29 VRKLRK 34
355 GRRQKK 360
361 TKKQKR 366
388 RKRSRR 393
454 EKKKKR 459
29 VRKLRK 34
355 GRRQKK 360
361 TKKQKR 366
388 RKRSRR 393
454 EKKKKR 459
Sintetasa de metionil-tRNA
725 WKRIKG 730
725 WKRIKG 730
TABLA 3 (continuación)
ELMO2
560 NRRRQERF 567
Antígeno expresado en meningioma 6/11
432 RKRAKD 437
432 RKRAKD 437
Fosfatasa de Inositol polifosfato 4 tipo 1-beta
375 LRKKLHKF 382
829 ARKNKN 834
829 ARKNKN 834
815 SKKRKN 820
815 SKKRKN 820
C7ORF1
40 SRRYRG 45
338 HRKNKP 343
40 SRRYRG 45
338 HRKNKP 343
Factor de intercambio de nucleótidos guanina Rap
138 SRRRFRKI 145
1071 QRKKRWRS 1078
1099 HKKRARRS 1106
139 RRRFRK 144
661 SKKVKA 666
930 LKRMKI 935
1071 QRKKRW 1076
1100 KKRARR 1105
1121 ARKVKQ 1126
139 RRRFRK 144
661 SKKVKA 666
930 LKRMKI 935
1071 QRKKRW 1076
1100 KKRARR 1105
1121 ARKVKQ 1126
TABLA 3 (continuación)
Adaptina sigma 1 C
27 ERKKITRE 34
Alsina
883 GRKRKE 888
883 GRKRKE 888
NOPAR2
14 LKRPRL 19
720 VKREKP 725
14 LKRPRL 19
720 VKREKP 725
Factor de transcripción de unión a AT 1
294 SKRPKT 299
961 EKKNKL 966
1231 NKRPRT 1236
1727 DKRLRT 1732
2032 QKRFRT 2037
2087 EKKSKL 2092
2317 QRKDKD 2322
2343 PKKEKG 2348
294 SKRPKT 299
961 EKKNKL 966
1231 NKRPRT 1236
1727 DKRLRT 1732
2032 QKRFRT 2037
2087 EKKSKL 2092
2317 QRKDKD 2322
2343 PKKEKG 2348
Supresina
232 YKRRKK 237
232 YKRRKK 237
Proteína de la línea media 1
100 TRRERA 105
494 HRKLKV 499
TABLA 3 (continuación)
100 TRRERA 105
494 HRKLKV 499
Proteína del grupo de elevada movilidad 2a
6 PKKPKG 11
84 GKKKKD 89
6 PKKPKG 11
84 GKKKKD 89

Claims (16)

1. Una proteína interleuquina-8 (IL-8) modificada que se caracteriza por que al menos un residuo aminoacídico en la posición 70 y/o 71 de IL-8 de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la tabla 2 está sustituido por Arg, Lys y/o His, y por que los 6 aminoácidos N-terminales de dicha proteína están delecionados.
2. Una proteína IL-8 modificada de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza por que al menos un residuo aminoacídico adicional en la posición 17 y/o 21 de IL-8 está sustituido por Arg, Lys y/o His.
3. Una proteína IL-8 modificada, que se caracteriza por que todos los residuos aminoacídicos en las posiciones 17, 21, 70 y 71 de IL-8 están sustituidos por Arg, Lys y/o His.
4. Una proteína IL-8 modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, que se caracteriza por que la afinidad de unión a GAG aumenta en un factor de al menos 5, preferiblemente en un mínimo de 10, más preferiblemente en un mínimo de 100, comparado con la IL-8 salvaje.
5. Una proteína IL-8 modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, que se caracteriza por que la afinidad de unión a GAG aumentada es un aumento de la afinidad de unión a heparán sulfato y/o heparina.
6. Una proteína IL-8 modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, que se caracteriza por que una región biológicamente activa adicional de la proteína IL-8 está modificada inhibienso así o regulando negativamente otra actividad biológica de dicha proteína.
7. Una proteína IL-8 modificada de acuerdo con la reivindicación 6, que se caracteriza por que la unión al receptor está inhibida o regulada negativamente.
8. Una proteína IL-8 modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 3 a 7, que se caracteriza por que dicha proteína es una IL-8 mutada con los primeros 6 aminoácidos N-terminales delecionados.
9. Una proteína IL-8 modificada de acuerdo con la reivindicación 6, que se caracteriza por que dicha región biológicamente activa adicional está localizada en los primeros 10 aminoácidos N-terminales.
10. Una proteína IL-8 modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 9, que se caracteriza por que dicha proteína es una IL-8 mutante seleccionada de entre el grupo que consiste en del6F17RE70KN71R, de16F17RE70RN71K y de16E70KN71K.
11. Una molécula de ácido polinucleico aislado que codifica para una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10.
12. Un vector que comprende una molécula de DNA aislada de acuerdo con la reivindicación 11.
13. Una célula recombinante que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 12, cuya célula recombinante no está comprendida en el organismo humano.
14. Una composición farmacéutica, que se caracteriza por que comprende una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10, un ácido polinucleico de acuerdo con la reivindicación 11 o un vector de acuerdo con la reivindicación 12 y un transportador farmacéuticamente aceptable.
15. La utilización de la proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10, un ácido polinucleico de acuerdo con la reivindicación 11 o un vector de acuerdo con la reivindicación 12 en un método para producir un medicamento para el tratamiento de un estado inflamatorio.
16. La utilización de acuerdo con la reivindicación 15, que se caracteriza por que el estado inflamatorio se selecciona de entre un grupo que comprende la artritis reumatoide, psoriasis, osteoartritis, asma, enfermedad de Alzheimer y esclerosis múltiple.
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