ES2330411T3 - Virus sincitial respiratorio bovino atenuado. - Google Patents

Abstract

Vacuna para la protección de vacas contra la infección por BRSV, comprendiendo dicha vacuna un virus Sincitial Respiratorio Bovino que difiere del virus de tipo silvestre solamente porque es incapaz de expresar una proteína G de BRSV funcional, debido a una mutación en el gen que codifica dicha proteína, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Description

Virus Sincitial Respiratorio Bovino atenuado.

La presente invención se refiere a virus Sincitial Respiratorio Bovino (BRSV) atenuado, a vacunas basadas en el mismo, a métodos para la preparación de tales vacunas y a métodos para la discriminación entre mamíferos infectados en campo y mamíferos vacunados.

El virus Sincitial Respiratorio Bovino es un miembro de la familia paramyxoviridae y pertenece al género de los Pneumovirus. Los paramyxoviridae que pertenecen a este género son RSV humano, RSV bovino, RSV ovino, RSV caprino y virus de neumonía del ratón. Los RSV son un miembro del orden Mononegavirales, es decir, el virus es un virus ARN de cadena negativa no segmentado. La organización genómica global del ARN de sentido negativo no segmentado de los virus que pertenecen al género Pneumovirus es comparable. El ARN consiste en 10 genes, que codifican once proteínas, y tiene una longitud de aproximadamente 15,2 kilobases. Las proteínas de RSV incluyen dos proteínas no estructurales (NS1 y NS2), cuatro proteínas asociadas a ARN, la nucleoproteína N, fosfoproteína P, la subunidad L grande, catalítica de la ARN polimerasa, un factor de elongación de la transcripción codificado por la primera de dos fases de lectura abierta solapantes del gen M2 y tres proteínas asociadas a envuelta; la proteína de fusión F, la proteínas de unión G y la proteína hidrófoba pequeña SH. Una característica compartida por todos los pneumovirus es el hecho de que provocan infecciones en la vía respiratoria superior y (en la mayoría de los casos) inferior. El RSV humano tiene una distribución mundial y se ha observado que es el principal patógeno vírico pediátrico de las vías respiratorias. La infección de especies bovinas por BRSV es altamente comparable con la infección por HRSV en muchos aspectos, entre otros, en el sentido de que provoca principalmente enfermedad en animales jóvenes. (Para una revisión, véase Van der Poel et al.; J. Inf. 29: 215-228 (1994)). Aunque las re-infecciones tienen lugar frecuentemente en ambas especies, en vacas habitualmente no provocan signos clínicos (Kimman y Westenbrink, Archives of Virology 1990, 112, 1-25), lo que sugiere que una infección natural protege contra signos clínicos después de la reinfección. La mortalidad varía entre el 1% y el 30%, dependiendo de diversos parámetros, tales como la virulencia de la cepa infectante, dilatación, nivel de cuidado animal y aparición de infecciones secundarias (Stott et al., J. Hygiene 85: 251-261 (1980), Verhoeff, et al. Vet. Rec. 115: 488-492 (1984)). La morbilidad es muy alta (Baker et al., Am. J. Vet. Res. 46: 891-892 (1985), Baker et al., Vet. Clin. N. Am.: Food Animal Practice 1:259-275 (1985)). La mortalidad debida a infección por BRSV incluyendo los casos en los que la infección por BRSV viene seguida por la infección por otros patógenos es muy alta y, por tanto, las pérdidas económicas mundiales son por consiguiente muy altas.

Está claro que se desean en gran medida vacunas eficaces y fiables para la protección tanto contra el RSV humano como el RSV bovino, pero el desarrollo de vacunas se ha dificultado debido a que no se conoce cómo se puede inducir una respuesta inmune protectora sin provocar enfermedad. Los primeros intentos de vacunar niños con vacunas inactivadas con formalina condujeron a enfermedad aumentada después de infección natural, lo que sugiere que la vacunación incluso puede ser dañina (Anderson et al., Journal of Infectious Diseases 1995, 171, 1-7). Sin embargo, se conoce que los anticuerpos contra dos proteínas de superficie principales, F (una proteína de fusión) y G (una proteína de unión), desempeñan un papel clave en la protección (Kimman y Westenbrink, Archives of Virology 1990, 112, 1-25). Sin embargo, hasta ahora no se han descrito en la bibliografía vacunas basadas en la proteína F o G, es decir, vacunas de subunidades.

Un modo de imitar la infección natural, por ejemplo, para activar de forma eficaz el mecanismo de defensa del hospedador, es desarrollar una vacuna viva atenuada. Una vacuna de este tipo imita la activación natural del sistema inmune, mientras que debido a sus características atenuadas, no induce los signos clínicos graves provocados por el virus de tipo silvestre. El carácter atenuado se obtiene habitualmente mutando un gen que, por un lado, desempeña un papel en la virulencia, pero que, por otro lado, no es esencial para la infección y replicación viral y, además, no desempeña ningún papel en la inducción de inmunidad.

Las vacunas vivas atenuadas tienen que imitar, tan estrechamente como sea posible, el RSV nativo en cuanto a lo que concierne a su comportamiento de infección. Una de las características principales del Virus Sincitial Respiratorio nativo es que brevemente después de la infección provoca la formación de grandes sincitios. La formación de estos sincitios, el resultado de fusión celular a gran escala, requiere la presencia de la proteína F, la G y la SH (Heminway, B. R. et al., Virology 200: 801-805 (1994). La expresión de proteínas individuales F, SH o G no da como resultado la formación de sincitios. La co-expresión tanto del gen F como del SH o de los dos genes F y G proporciona un nivel solamente muy bajo de fusión celular (Pastey, M. K. y Samal, S. K, J. Gen. Virol. 78: 1885-1889 (1997)). Por lo tanto, se podría suponer que un virus atenuado adecuado para el uso como una vacuna que imita estrechamente la infección natural en principio debe expresar las proteínas F, G y SH. La deleción del gen que codifica la proteína G o SH da como resultado la ausencia de formación significativa de sincitio como se ha mencionado anteriormente. Además, la deleción de G, que se sabe que es un inmunógeno significativo, de cualquier modo sería indeseable para un virus vacunal. Por lo tanto, si se necesita un virus vacunal atenuado, un RSV mutante que carezca del gen G no es una elección lógica. Por estos motivos, está claro que un virus mutante que carece de la proteína G sería la elección menos atractiva para el uso en vacunas, debido a que:

1) no forma sincitios y, por tanto, carece de uno de los rasgos más caracterizantes de RSV nativo

2) carece de uno de los dos antígenos inmunodominantes.

Karron describió un RSV humano que carecía tanto del gen SH como del gen G (Karron et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 13861-13966 (1997)). Se ensayó en pacientes en cuanto a su idoneidad como un virus vacunal. Sin embargo, el virus no fue capaz de inducir una respuesta inmune en pacientes. Como se podría predecir basándose en los argumentos que se han proporcionado anteriormente, el hecho de que carece de estos dos genes hace que el virus se sobre-atenúe y, por lo tanto, sea inadecuado para propósitos de vacunación.

Ahora se ha observado sorprendentemente que el RSV bovino que tiene una deleción en el gen G todavía es capaz de inducir inmunidad protectora en animales. Por lo tanto, la presente invención abarca mutantes de BRSV con una mutación en el gen G.

Por tanto, una realización de la invención proporciona Virus Sincitial Respiratorio Bovino no capaz de expresar una proteína G funcional debido a una mutación en el gen que codifica esta proteína.

La mutación puede conducir a la expresión de una proteína G no funcional, o dependiendo de la naturaleza de la mutación, ninguna proteína G en absoluto. Se considera que una proteína G no funcional es una proteína que carece de algunas o todas las características de la proteína G como se expresa en un virus de tipo silvestre y/o se expresa a un nivel insuficiente para obtener niveles de tipo silvestre de proteína G. Una forma particular de un mutante de BRSV de acuerdo con la invención es, por ejemplo, un mutante que no es reactivo en un ensayo ELISA convencional con anticuerpos generados contra proteína G purificada.

Se entiende que una mutación es un cambio de la información genética en el gen G que se ha mencionado anteriormente en comparación con la información genética presente en este gen en el BRSV precursor.

Se entiende que un gen comprende la región codificante que codifica una (gluco)proteína así como los elementos que desempeñan un papel en la transcripción y traducción del gen, tales como sitios de unión a polimerasa, sitios de unión a ribosoma, potenciadores y similares.

La mutación es una sustitución, deleción, inserción o inversión de ácido nucleico o una combinación de los mismos. En principio, los mutantes de acuerdo con la invención se pueden seleccionar in vivo de animales en el campo, explorando para virus no capaces de expresar una proteína G funcional. Otra posibilidad es explorar para virus cultivados in vitro no capaces de expresar una proteína G funcional después de pases seriados de virus de tipo silvestre en células hospedadoras adecuadas. Tales métodos se conocen bien en la técnica y pertenecen a los modos clásicos de preparar virus atenuados. Sin embargo, tales métodos requieren tiempo.

Las mutaciones se pueden introducir de forma más sencilla y de manera deliberada mediante tecnología de ADN recombinante convencional. Las técnicas de ADN recombinante convencionales, tales como preparación de ADNc, clonación de ADNc en un plásmido, digestión del gen con una enzima de restricción, seguido de tratamiento con endonucleasa, re-ligación y recombinación homóloga en la cepa hospedadora, se conocen todas en la técnica y se describen, entre otros, en Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. et al. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6). Se pueden preparar mutaciones dirigidas, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida in vitro usando el kit Transformer® comercializado por Clontech. La secuencia del gen G a mutar también se conoce en la técnica: la secuencia de nucleótidos del gen G de RSV bovino se ha publicado por Lurch, R. A., K. Anderson y G. Wertz (J. Vrol. 64: 5559-5569 (1990)). El genoma completo de una cepa de BRSV típica (cepa ATue51908, como se depositó en la base de datos de GenBank con el Nº de acceso AF092942), se ha secuenciado por Buchholz, U. J., S. Finke y K. -K.Conzelmann. (J. Vrol. 73: 251-259 (1999)). El gen G se localiza entre el nucleótido 4690 y 5529 en el genoma de la cepa de BRSV ATue51908 y la secuencia codificante se localiza entre el nucleótido 4705 y 5478.

En teoría, las mutaciones de ácido nucleico tales como sustituciones, inversiones e incluso inserciones pueden conducir a la inversión de la secuencia de ácido nucleico nativa. Esto puede deberse a sustitución repetida, re-inversión o pérdida de la secuencia insertada. Por lo tanto, la mutación más segura es una mutación por deleción: un fragmento que se ha delecionado no se puede recuperar. Por tanto, en una realización preferida, la invención se refiere a virus Sincitial Respiratorio Bovino, que tiene como un rasgo característico que la mutación en el gen G es una mutación por deleción. El tamaño de la deleción puede variar de pequeño, por ejemplo, un nucleótido como resultado de lo cual se altera la fase de lectura cadena abajo, a una gran deleción que abarca todo el gen G. Los métodos para la preparación de virus ARN de sentido negativo no segmentados se han descrito en el documento EP 0702085. Se han publicado métodos para la preparación de BRSV recombinante, comenzando con plásmidos que albergan los diversos genes de BRSV, como, por ejemplo, copias de ADNc, entre otros, por Collins et al., en Proc. Natl. Acad. Sci 92: 11563-11567 (1995). Las mutaciones en los genes codificados por esos plásmidos se pueden realizar de forma sencilla como se ha analizado anteriormente.

Los mutantes de BRSV de acuerdo con la presente invención son muy adecuados como vehículos para secuencias de ARN heterólogo. Por lo tanto, se describen mutantes de BRSV que comprenden una secuencia de ARN heterólogo. Este ARN heterólogo se puede insertar en una región fuera del gen G, suponiendo que no se destruya la viabilidad del virus. Son regiones adecuadas, por ejemplo, regiones intergénicas o genes que no son esenciales para el virus.

Sin embargo, de forma más eficaz, el ARN heterólogo se inserta en una región que se delecionó del gen G. O incluso de forma aún más eficaz, también se puede insertar en algún lugar en toda la longitud del gen G, conduciendo a la producción de una proteína G no funcional o ninguna proteína G en absoluto. Una secuencia de ARN heterólogo es una secuencia que se origina de una fuente diferente de la cepa de BRSV precursora. Se puede obtener del ADN de otro organismo o se puede preparar sintéticamente. La secuencia de ARN heterólogo puede ser, por ejemplo, una secuencia que interfiere con la transcripción o traducción de G. Tales secuencias pueden ser señales de terminación de la transcripción o sitios de poli-adenilación, pero también pueden contener codones de terminación de la traducción.

En una forma incluso aún más preferida, la secuencia de ARN heterólogo codifica un polipéptido. Por lo tanto, una forma más preferida de la invención se refiere a un virus Sincitial Respiratorio Bovino de acuerdo con la invención que lleva un gen heterólogo insertado en el gen G. La secuencia de ARN heterólogo puede contener secuencias promotoras, de tal forma que la expresión está bajo el control de estas secuencias. Estas secuencias pueden ser las secuencias promotoras que se observa que están unidas al gen heterólogo que codifica el polipéptido, en su forma nativa, o pueden ser otras secuencias promotoras adecuadas para la expresión en células eucariotas. Es obvio para los especialistas en la técnica que la elección de un promotor se extiende a cualquier promotor eucariota, procariota, vírico o preparado sintéticamente capaz de dirigir la transcripción génica en células infectadas por el mutante de BRSV. Tales promotores pueden ser promotores de HRSV o BRSV, pero también son adecuados promotores obtenidos de otros virus ARN.

En una forma incluso todavía más preferida, la secuencia de ARN heterólogo codifica un antígeno de otro patógeno de mamífero, que es capaz de provocar una respuesta inmune protectora, por lo que el antígeno se expresa por el mutante de BRSV de acuerdo con la invención después de la replicación en la célula hospedadora. Esto tiene la ventaja de que se puede inmunizar un mamífero contra dos o más enfermedades: BRSV y otra enfermedad.

En la forma más preferida de esta realización, el gen heterólogo se selecciona entre el grupo de patógenos de vacas, que consisten en Rotavirus Bovino, virus de Diarrea Vírica Bovina, virus Parainfluenza de tipo 3, Paramixovirus Bovino, Herpesvirus Bovino, virus de la Glosopeda y Pasteurella haemolytica. Los genes de los virus y bacterias mencionados que están implicados en la activación de una respuesta inmunológica se conocen en la técnica.

Además, la secuencia de ARN heterólogo puede codificar una citocina. Se conoce que varias citocinas, por ejemplo, interferones, desempeñan un papel importante como inmunomoduladores. Por tanto, puede ser ventajoso incluir información genética para este tipo de molécula en dicha sección.

Un mutante de BRSV de acuerdo con la presente invención y, en particular, un BRSV vivo, que expresa opcionalmente uno o más polipéptidos heterólogos diferentes de patógenos específicos se puede usar, debido a su carácter atenuado, para vacunar mamíferos. La vacunación con una vacuna viva o vacuna de vector vivo de este tipo viene seguida por replicación del mutante de BRSV dentro del hospedador inoculado, que expresa los polipéptidos de BRSV in vivo junto con polipéptidos heterólogos si se insertan los genes codificantes, pero con la excepción de G funcional. Los polipéptidos expresados en el hospedador inoculado provocarán después una respuesta inmune tanto contra BRSV como contra el patógeno específico. Si el polipéptido heterólogo procedente del patógeno específico puede estimular una respuesta inmune protectora, entonces el mamífero al que se ha inoculado el mutante de BRSV de acuerdo con la invención será inmune a infección posterior por ese patógeno así como a infección por BRSV. Por tanto, una secuencia de ácido nucleico heteróloga incorporada en la región de inserción del genoma de BRSV de acuerdo con la invención se puede expresar in vivo durante varios ciclos de replicación, proporcionando una inmunidad sólida, segura y duradera contra el patógeno del que se obtuvo. Por lo tanto, otra realización de la invención se refiere a vacunas para la protección de mamíferos contra infección por virus Sincitial Respiratorio Bovino. Tales vacunas comprenden un virus Sincitial Respiratorio Bovino no capaz de expresar una proteína G funcional como resultado de una mutación en el gen G y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Un mutante de BRSV de acuerdo con la invención que contiene y que expresa uno o más polipéptidos heterólogos diferentes puede servir como una vacuna multivalente. Para la preparación de una vacuna, el mutante de BRSV de acuerdo con la presente invención se puede cultivar en células susceptibles, por ejemplo, en un cultivo celular de origen bovino. Los virus cultivados de este modo se pueden recoger recuperando los fluidos y/o células del cultivo de células de tejido. La vacuna viva se puede preparar en forma de una suspensión o se puede liofilizar. Además de una cantidad inmunogénicamente eficaz del mutante de BRSV de acuerdo con la invención, la vacuna comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables útiles en la presente invención incluyen, por ejemplo, materiales tan simples como agua estéril o solución salina fisiológica. Además, estabilizantes tales como SPGA, hidratos de carbono (por ejemplo, sorbitol, manitol, almidón, sacarosa, glucosa, dextrano), proteínas tales como albúmina o caseína, proteínas que contienen agentes tales como suero bovino o leche desnatada, hidrolizados vegetales y tampones (por ejemplo, tampón fosfato).

Opcionalmente, uno o más compuestos que tienen actividad de adyuvante se pueden añadir a la vacuna. Los adyuvantes adecuados son, por ejemplo, hidróxido, fosfato u óxido de aluminio, emulsiones de aceite, por ejemplo, de Bayol F^{(R)} o Marcol 52^{(R)}, saponinas o solubilizado de vitamina E. Estos adyuvantes tienen la ventaja de que ayudan a estimular el sistema inmune de un modo no específico, aumentando de este modo la respuesta inmune a la vacuna. Por lo tanto, en una forma preferida de esta realización, la vacuna comprende un adyuvante.

La cantidad eficaz útil a administrar variará dependiendo de la edad y el peso del animal, el modo de administración y el tipo de patógeno contra el que se pretende la vacunación. Sin embargo, ya que los virus vivos atenuados de acuerdo con la invención se auto-propagan, la cantidad de virus administrada inicialmente no es crítica. Una dosificación adecuada puede ser, por ejemplo, aproximadamente 10.^{3,0} - 10.^{7,0} ufp/mamífero.

Para la administración a mamíferos, el mutante de BRSV de acuerdo con la invención se puede administrar, entre otros, por vía intranasal, por vía intradérmica, por vía subcutánea o por vía intramuscular.

Existen varias maneras de almacenar organismos tanto inactivados como vivos. El almacenamiento en un refrigerador, por ejemplo, es un método bien conocido. También se usa a menudo el almacenamiento a -70ºC. Los virus también se pueden mantener en nitrógeno líquido. El secado por congelación es otro modo de conservación. Los virus secados por congelación se pueden almacenar y mantener viables durante muchos años. El secado por congelación se puede realizar de acuerdo con todos los procedimientos de secado por congelación convencionales bien conocidos. Se pueden añadir aditivos beneficiosos opcionales, tales como, por ejemplo, leche desnatada, trehalosa, gelatina o albúmina sérica bovina en el proceso de secado por congelación. Por lo tanto, en una realización más preferida, la vacuna de acuerdo con la presente invención está en una forma secada por congelación.

Otra realización de la presente invención se refiere a métodos para la preparación de una vacuna de acuerdo con la invención. En una forma simple, tales métodos comprenden mezclar un virus Sincitial Respiratorio Bovino atenuado de acuerdo con la invención y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En formas más complejas, tales métodos pueden comprender mezclar adyuvantes, secado por congelación y otras preparaciones conocidas en la técnica. Un problema reconocido generalmente en el campo de la vacunación es el siguiente: la presencia de anticuerpos contra un cierto patógeno en el suero de un mamífero hospedador indica que el hospedador se ha infectado con el patógeno, en una forma virulenta o atenuada. En el caso de BRSV, esto significa que se preparan grandes cantidades de anticuerpos contra, por ejemplo, la proteína F, SH y G. Sin embargo, es imposible discriminar entre mamíferos infectados en campo y mamíferos vacunados con una cepa vacunal, sin tener en cuenta si esta cepa vacunal está viva o inactivada, ya que en ambos casos estarán presentes de forma abundante anticuerpos contra el virus como tal.

El virus Sincitial Respiratorio de acuerdo con la presente invención ofrece sorprendentemente una solución a este problema del siguiente modo: El gen G se expresa in vivo en todas las cepas de campo del virus Sincitial Respiratorio. Esto implica que los mamíferos infectados por virus Sincitial Respiratorio de tipo silvestre tendrán anticuerpos anti-F y anti-G. El BRSV de acuerdo con la presente invención, sin embargo, no puede, debido a la ausencia de los determinantes antigénicos de la proteína G, seguir induciendo anticuerpos contra esta proteína. Por lo tanto, los mamíferos vacunados con una cepa de virus Sincitial Respiratorio de acuerdo con la invención en el que se han delecionado los determinantes antigénicos de la proteína G no tendrán anticuerpos contra esta proteína en su suero. En un ensayo comparativo, por lo tanto, los sueros generados contra la vacuna viva atenuada de BRSV de acuerdo con la invención reaccionarán con todas las proteínas del virus Sincitial Respiratorio inmunógenas excepto G. Los sueros de mamíferos infectados por una cepa de campo de virus Sincitial Respiratorio, sin embargo, reaccionarán con todas las proteínas de virus Sincitial Respiratorio inmunógenas, incluyendo G. Los ensayos basados en proteína F y G purificada muestran directamente la presencia o ausencia de anticuerpos anti-G. Por lo tanto, los virus Sincitiales Respiratorios de acuerdo con la presente invención acaban siendo una base muy adecuada para vacunas marcadoras, es decir, vacunas que se pueden discriminar serológicamente de una cepa de campo. Se pueden discriminar usando ensayos de diagnóstico específicos. Por lo tanto, otra realización más de la invención se refiere a kits de ensayo de diagnóstico para diferenciar mamíferos infectados por virus de campo de BRSV de mamíferos vacunados con BRSV vivo atenuado de acuerdo con la invención. Tales ensayos comprenden el ensayo de suero para la ausencia o presencia de anticuerpos anti-G.

Un kit de ensayo de diagnóstico para la discriminación entre cepas vacunales y cepas de campo puede comprender, por ejemplo, un ensayo ELISA de bloqueo simple en el que el virus de tipo silvestre se aplica como recubrimiento en la pared de una placa de microtitulación. Después, una placa de este tipo se incuba con suero del animal a ensayar. Posteriormente, la placa se incuba con un antisuero específico y marcado contra proteína G. Si el antisuero marcado reacciona con el virus aplicado como recubrimiento, es decir, no se bloquea por el antisuero del animal a ensayar, esto muestra que el antisuero no contiene anticuerpos contra proteína G.

Alternativamente, un kit de ensayo de diagnóstico de este tipo puede comprender un ensayo ELISA en el que proteína F o G posiblemente purificada se aplica como recubrimiento en la pared de pocillos separados de una placa ELISA. La incubación con suero de mamíferos a ensayar, seguido de, por ejemplo, la incubación con un anticuerpo marcado contra el anticuerpo de mamífero pertinente, puede poner de manifiesto entonces la presencia o ausencia de anticuerpos contra proteína F o G en los respectivos pocillos. Otro ejemplo de un sistema de ensayo de diagnóstico es, por ejemplo, la incubación de una transferencia de Western que comprende proteína F o G con suero de mamíferos a ensayar, seguido de análisis de la transferencia. La detección de anticuerpos específicos anti-F o anti-G indica que el mamífero ensayado se ha infectado con una cepa de campo o una cepa vacunal que tiene una mutación G única, mientras que la presencia de anticuerpos anti-F y la ausencia de reacción de anticuerpos con la banda de proteína G indica que el mamífero se ha vacunado con el mutante de BRSV de acuerdo con la presente invención.

El ensayo de diagnóstico está preferiblemente en forma de un kit, que comprende todo el virus de tipo silvestre o, alternativamente, los antígenos F o G separados en una forma purificada. Los antígenos se podrían purificar, por ejemplo, mediante técnicas de separación de proteína convencionales sobre una columna adecuada. Otra posibilidad es la separación en un gel PAGE seguido de transferencia de Western. En la transferencia de Western, la proteína F o G formará una banda específica, separada de las demás bandas de BRSV, y por tanto, también se considera que está purificada. En principio, el modo más sencillo de preparar un sistema de ensayo de diagnóstico de este tipo es usar proteína F o G purificada como se ha explicado anteriormente. Sin embargo, también es muy posible usar solamente parte de la proteína F o G. Esto con la condición de que el fragmento usado todavía comprenda un determinante antigénico de proteína F o G. Todos los determinantes antigénicos de proteína F o G del BRSV de tipo silvestre inducirán anticuerpos por definición. Por lo tanto, un fragmento de proteína F o G truncado que comprende incluso un único determinante antigénico de proteína F o G será capaz de unirse a anticuerpos anti-F, anti-SH o anti-G. Por lo tanto, se describe un kit de diagnóstico para la detección de anticuerpos contra BRSV, en el que el kit comprende proteína F o G purificada o fragmentos de la misma que todavía comprende un determinante antígeno. Como se ha mencionado anteriormente, la proteína F o G se puede obtener directamente de células infectadas por las partículas del virus. Sin embargo, también es posible usar sistemas de expresión convencionales, tales como sistemas de expresión bacterianos, de levadura, baculovirus o de mamífero, de los cuales se ha descrito una gran diversidad en la técnica, para la expresión del gen F o G. La proteína expresada de este modo se puede obtener de manera sencilla y, por definición, está libre de otras proteínas de BRSV. El grado de purificación no es crítico. La presencia de posibles proteínas adicionales, tales como proteínas del sistema de expresión, en general no altera en ensayos de diagnóstico, ya que no son proteínas F o G.

Alternativamente se puede usar un ensayo de diagnóstico para la detección del virus vacunal o antígeno vírico en el animal infectado. Un ensayo de diagnóstico para antígeno de virus sin G y, por lo tanto, adecuado para la detección de virus vacunal de acuerdo con la invención también puede ser, por ejemplo, un ensayo ELISA convencional, en el que los pocillos de una placa ELISA están recubiertos con anticuerpos dirigidos contra, respectivamente, la proteína F y la G. Los virus que se unen a los anticuerpos contra las tres proteínas son virus de tipo silvestre, mientras que los virus vacunales solamente se unirán a los pocillos que comprenden anticuerpos contra proteína F. Por lo tanto, se describen ensayos de diagnóstico que comprenden anticuerpos contra, respectivamente, la proteína F y la G. La proteína F y G se pueden usar para producir tales anticuerpos, que puede ser policlonales, monoespecíficos o monoclonales (o derivados de los mismos). Si se desean anticuerpos policlonales, en la técnica se conocen técnicas para producir y procesar sueros policlonales (por ejemplo, Mayer y Walter, eds. Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, London, 1987). Los anticuerpos monoclonales, reactivos contra la proteína F, SH y G, se pueden preparar inmunizando ratones endogámicos mediante técnicas conocidas en la técnica (Kohler y Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975).

Otra realización más de la presente invención se refiere a métodos para discriminar animales infectados por virus de campo Sincitial Respiratorio Bovino de animales vacunados con la vacuna de Virus Sincitial Respiratorio Bovino. Tales métodos comprenden la etapa de incubar un fluido corporal de un animal a ensayar con proteína F y G purificada o la etapa de incubar un tejido o un fluido corporal de un animal a ensayar con anticuerpos contra proteína F y G purificada.

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Breve descripción de las figuras

Figura 1: Construcción de mutantes de deleción de proteína de BRSV. El genoma de BRSV se dibuja a escala. La localización de las ORF se muestra como rectángulos sombreados. Los aumentos muestran las deleciones del gen SH y G, representándose las señales de final del gen por barras y mostrándose las señales de comienzo del gen como triángulos. La localización de sitios de restricción sintéticos se indica por puntas de flecha. El sitio SalI localizado en la región intergénica M/SH (entre paréntesis) solamente está presente en el plásmido precursor usado para la generación de los mutantes de deleción doble SH y SH/G y en los mutantes de deleción. La longitud del genoma de los virus recombinantes se indica a la izquierda entre paréntesis.

Figura 2: Demostración de sitios de restricción de marcador en los genomas de rBRSV y de los mutantes de deleción. Se realizó RT-PCR en el ARN total de células infectadas, los productos de PCR se sometieron a digestión por restricción y se analizaron en un gel de agarosa al 3%. M, marcador de 1-kb DNA ladder (Life Technologies) con el tamaño de algunos fragmentos indicado. Los productos de RT-PCR eran coherentes con los tamaños predichos de 2.353 pb (rBRSV), 1.845 pb (rBRSV\DeltaSH), 1.491 pb (rBRSV\DeltaG) o 983 pb (rBRSV\DeltaSHG). La digestión con SalI produjo los fragmentos esperados de 1291 pb y 1062 pb (rBRSV), 1291 pb y 554 (rBRSV\DeltaSH), 1491 pb y 1062 pb (rBRSV\DeltaG) o 554 pb y 429 pb (rBRSV\DeltaSHG); la digestión con SphI produjo fragmentos de 1928 y 425 pb (rBRSV) y 1420 y 425 pb (rBRSV\DeltaSHG). Como se esperaba, los fragmentos de PCR de rBRSV\DeltaG y rBRSV\DeltaSHG no se escindieron por SphI.

Figura 3: Demostración de transcritos por hibridación de Northern. El ARN total de células MDBK infectadas por los virus indicados se aisló 96 horas después de la infección y se analizó en un gel de agarosa al 1% en condiciones desnaturalizantes. Las transferencias replicadas se incubaron con sondas que hibridan con el gen N, SH, G o F de BRSV. Se indican los transcritos que se corresponden a los ARNm y ARNm bi-cistrónicos respectivos.

Figura 4: Cultivo multi-ciclo de rBRSV, rBRSV\DeltaSH, rBRSV\DeltaG y rBRSV\DeltaSHG en células MDBK. Las monocapas de células duplicadas en placas de 24 pocillos se infectaron con el virus indicado con una MOI de 0,1. Las monocapas se recogieron en los momentos indicados, se almacenaron a -70ºC y se titularon posteriormente por duplicado. Cada valor es el título medio de material de dos pocillos.

Figura 5: Inmunofluorescencia indirecta de células MDBK infectadas por rBRSV (a), rBRSV\DeltaSH (b), rBRSV\DeltaG (c) o rBRSV\DeltaSHG (d). Las células se infectaron con una MOI de 0,1, se fijaron con paraformaldehído 42 horas después de la infección, se permeabilizaron y se hicieron reaccionar con Mab F9, específico para la proteína F de BRSV.

Figura 6: Ensayo de neutralización: valores de DN_{50} para grupo I (inmunizado de forma simulada), grupo II (grupo inmunizado con rBRSV\DeltaG) y grupo III (grupo inmunizado con rBRSV) hasta 8 días después de la exposición.

Ejemplos Ejemplo 1

Clonación Molecular. El plásmido que contiene la secuencia antigenómica completa de la cepa de BRSV
ATue51908 (GenBank Nº de acceso AF 092942) como se describe por Buchholz, U. J., Finke, S., y K.-K. Conzelmann. (J. Virol. 73: 251-259 (1999)) se modificó para contener sitios de restricción en las regiones intergénicas SH/G (SalI, ATue51908 nt 4673), G/F (SphI, ATue51908 nt 5539) (Fig. 1) y F/M2 (XhoI, ATue51908 nt 7471 y ClaI, ATue51908 nt 7485) de BRSV. Los sitios de restricción SalI y SphI se usaron para escindir un fragmento de 862 pb que comprendía el gen G de BRSV completo. Después de tratamiento de Klenow y religación, el sitio SalI se reconstituyó. En una segunda construcción de rBRSV de longitud completa, se creó un segundo sitio SalI en la región intergénica M/SH (ATue51908 nt 4165). Este plásmido se usó para generar un mutante de deleción del gen SH de BRSV o un mutante de deleción doble que carecía tanto del gen SH como G de BRSV como se ilustra en la Fig. 1.

Generación y caracterización de BRSV recombinante. Se generaron BRSV recombinantes como se describe por Buchholz, U. J., H. Granzow, K. Schuldt, S. S. Whitehead, B. R. Murphy y P. L. Collins. (J. Virol. 74: 1187-1199 (2000)). En resumen, placas de 32 mm de células BHK T7/5 sub-confluyentes que expresaban de forma estable ARN polimerasa de T7 se transfectaron con 5 \mug de los respectivos plásmidos de longitud completa (pBRSV, pBRSV\DeltaSH, pBRSV\DeltaG o pBRSV\DeltaSHG) y un conjunto de cuatro plásmidos de refuerzo (2 \mug de pN, 2 \mug de pP, 1 \mug de pM2 y 1 \mug de pL), de los cuales se expresan las proteínas N, P, M2 y L de BRSV. Todas las construcciones de ADNc de BRSV estaban bajo el control de un promotor de T7. Cada dos o tres días, las células transfectadas se dividieron. Cuando el efecto citopático (cpe) fue amplio, las células se congelaron y se descongelaron tres veces y los sobrenadantes aclarados se usaron para la producción de soluciones madre de virus en células MDBK como se describe por Buchholz et al. (2000), véase anteriormente. La identidad de los virus recombinantes se verificó por RT PCR. En resumen, se preparó ARN total de placas de 32 mm de células MDBK 96 horas después de la infección a una MOI de 0,1. Se generó la primera cadena de ADNc a partir de 1 \mug de ARN usando un cebador complementario al gen M de BRSV (cebador Mc2b, ATue51908 nt 3612 hasta 3635). Se realizó la síntesis de la segunda cadena usando el cebador Mc2b y un cebador inverso BFr, que hibrida con el gen F de BRSV (ATue51908, nt 5964 hasta 5941). El producto de RT PCR purificado se sometió a digestión por restricción y se analizó en geles de agarosa.

Virus y células. El BRSV recombinante se propagó en células MDBK. Las células MDBK se infectaron a una MOI de 0,1. Después de 90 minutos de adsorción, se retiró el inóculo y las células se incubaron a 37ºC en MEM complementado con FCS al 3% en una atmósfera de CO_{2} al 5%. 8 días después de la infección, cuando se pudo observar un cpe amplio, el medio se ajustó a MgSO_{4} 100 mM y a HEPES 50 mM (pH 7,5) y el virus altamente asociado a células se liberó por congelación y descongelación. Los análisis de cultivo de rBRSV, rBRSV\DeltaSH, rBRSV\DeltaG o rBRSV\DeltaSHG se realizaron en células MDBK como se ha descrito (véase la anterior referencia: Buchholz et al., 2000). Las titulaciones se realizaron por duplicado en placas de micropocillos usando el método de dilución limitante. A 0,1 ml de diluciones de virus de factor diez seriadas por pocillo, se añadieron 10^{4} células BSR T7/5 en un volumen de 0,1 ml. Después de 48 horas, las células se fijaron en acetona al 80%. Se realizó un ensayo de inmunofluorescencia indirecta usando un suero bovino específico para BRSV y se contaron los focos de células infectadas.

Transferencia de Northern. Se realizaron transferencias de Northern como se describe por Buchholz (1999), véase anteriormente. El ARN total de células MDBK infectadas por los virus recombinantes se analizó por electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante, se transfirió sobre membranas de nylon y se retículo con UV y se hibridó con sondas de ADN. Las sondas se generaron usando fragmentos de PCR del gen N (ATue51908 nt 1429 hasta 2277), SH (ATue51908 nt 4268 hasta 4534), G (ATue51908 nt 4690 hasta 5431) o F (ATue51908 nt 6233 hasta 7459) de BRSV. Se marcaron con [P^{32}]dCTP (3.000 Ci/mmol; ICN) (kit de traslado de Mella, Amersham).

Resultados

Construcción y recuperación de mutantes de deleción de BRSV. Se usó un sistema dirigido por ARN polimerasa de T7 que permite la generación de BRSV recombinante de ADNc como se describe por Buchholz et al. (Véase referencia a Buchholz et al., 1999 anteriormente). Para generar BRSV que carece del gen SH, el G o tanto el SH como el G, el plásmido antigenoma de longitud completa usado para la recuperación de BRSV recombinante se modificó, dando como resultado la deleción de regiones que abarcaban el gen SH o gen G completo, incluyendo las señales de comienzo del gen y de final del gen, o el gen SH y G de forma conjunta, de la señal de comienzo del gen SH a la señal de final del gen G. Los antigenomas de BRSV expresados por los respectivos plásmidos tienen 14.632 nt (rBRSV\DeltaSH), 14.278 nt (rBRSV\DeltaG) o 13.770 nt (rBRSV\DeltaSHG) de longitud, en comparación con 15.140 nt del rBRSV precursor (Fig. 1). Las transfecciones se realizaron usando células BSR T7/5 (Buchholz et al., 1999) que expresaban de forma estable ARN polimerasa de T7. Después de la cotransfección de plásmidos de longitud completa y un conjunto de cuatro plásmidos de refuerzo que codifican N, P, L y M2 de BRSV, se recuperó BRSV recombinante viable de todas las construcciones de ADNc. Aproximadamente 7 días después de la transfección, se pudieron observar varios focos que mostraban el cpe de BRSV típico de grandes sincitios en todas las placas transfectadas, sin diferencia entre los respectivos virus recombinantes. Los mutantes de deleción y el virus recombinante precursor se propagaron por pase en células MDBK. Cinco días después de la infección de células MDBK con una MOI de 0,1, todos los aislados de virus produjeron un cpe comparablemente amplio. Para verificar la identidad de cada uno de los virus recombinantes, se aisló ARN total de células MDBK 5 días después de la infección y se procesó por RT-PCR. Los productos de RT-PCR se analizaron adicionalmente por digestión por restricción. Como se muestra en la Fig. 2, los productos de RT-PCR obtenidos con un par de cebador que hibrida con el gen M y el gen F de BRSV tienen los tamaños esperados de 2.353 pb (rBRSV), 1.845 pb (rBRSV\DeltaSH), 1.491 pb (rBRSV\DeltaG) o 983 pb (rBRSV\DeltaSHG). Los sitios de restricción del marcador sintético están presentes en los respectivos productos de RT-PCR, como se muestra en la Fig. 2.

Análisis de transcripción de los virus recombinantes. La expresión de ARN viral y de ARN mensajero se verificó en transferencias de Northern realizadas en ARN total de células infectadas (Figura 3). Los virus recombinantes muestran un patrón similar de transcritos de ARNm, que difieren en la ausencia de transcritos de los genes delecionados respectivos. Usando una sonda que hibrida con el gen SH de BRSV, se puede observar una señal fuerte de ARNm de M/SH bi-cistrónico, con una intensidad comparable con el ARNm de SH monocistrónico. La señal del final del gen M de BRSV difiere de la secuencia consenso de final del gen de RSV, que aparentemente da como resultado una capacidad de terminación de la transcripción incompleta. Por consiguiente, los mutantes de deleción que carecen de los genes SH o SH y G se caracterizan por un alto nivel de ultralectura de ARNm del gen M y el respectivo gen cadena abajo. En el caso de rBRSV\DeltaSH, una sonda que hibrida con el gen G produce una fuerte señal de ARNm de M/G bi-cistrónico, y el mutante de deleción doble de SH/G produce una señal fuerte de ARNm de M/F bi-cistrónico (Figura 3).

Los mutantes de deleción están ligeramente atenuados en cultivo celular. Se estudiaron las características de cultivo en células MDBK. Los virus recombinantes eran completamente viables en cultivo tisular con respecto a la competencia de cultivo multi-ciclo. El desarrollo de los mutantes de deleción de BRSV se redujo solamente de forma ligera, pero de manera reproducible, en comparación con el BRSV precursor, véase la figura 4.

Ejemplo 2

Producción de antisueros. Se inmunizaron cuatro conejos con 5 log_{10} UFP de rBRSV, rBRSV\DeltaSH, rBRSV\DeltaG o rBRSV\DeltaSHG en adyuvante completo de Freund. 6 semanas más tarde, se re-inmunizaron con la misma cantidad de los respectivos virus en adyuvante incompleto de Freund. Los sueros se recogieron diez días más tarde.

Ensayo de inmunofluorescencia indirecta. Se infectaron células MDBK con BRSV recombinante con una MOI de 0,1, se incubaron durante 42 horas, se fijaron con paraformaldehído al 4% y se permeabilizaron con Triton X100 al 1%. Después se incubaron con anticuerpo monoclonal (Mab) F9, dirigido contra F de BRSV o con Mab G66, dirigido contra G de BRSV, suministrados por cortesía de Geraldine Taylor, Compton, RU. Las células se tiñeron con una IgG de cabra anti-ratón conjugado con Alexa 488 (Molecular Probes, Eugene, Oregon). Los núcleos de las células se tiñeron con yoduro de propidio. La inmunofluorescencia se examinó por microscopia de exploración con láser confocal.

Neutralización de suero. 0,05 ml de diluciones de factor dos seriadas de antisueros de conejo inactivados por calor en MEM se incubaron durante 60 min a temperatura ambiente con un volumen igual que contenía 2 log_{10} unidades formadoras de placas (UFP) de rBRSV. Posteriormente, se añadieron 10^{4} células BSR T7/5 en un volumen de 0,1 ml. Después de 5 días, se determinó la DN_{50}. Se realizaron experimentos de control con sueros negativos recogidos antes de la inmunización de los conejos.

Resultados

Expresión de glucoproteínas. Se realizó un ensayo de inmunofluorescencia indirecta en células MDBK 42 horas post-infección con rBRSV o con los mutantes de deleción. La inmunotinción con anticuerpo F9, dirigido contra la proteína F de BRSV, produjo una tinción fluorescente típica, rodeándose las células infectadas por una "corona" intensamente teñida de partículas filamentosas largas (Figura 5), siendo los mutantes de deleción indistinguibles de rBRSV convencional. Por tanto, la formación de partículas y la incorporación de proteína F no están alteradas por la deleción de la proteína de unión o de la proteína hidrófoba pequeña asociada a envuelta. Como se esperaba, el Mab G66 dirigido contra G de BRSV no reaccionó con células infectadas por rBRSV\DeltaG o rBRSV\DeltaSHG (no mostrado).

Anticuerpos inducidos por los mutantes de deleción muestran actividad neutralizante dirigida contra rBRSV convencional. Como un primer ensayo de si los mutantes de deleción que carecen de las glucoproteínas SH y G eran capaces de inducir anticuerpos con actividad neutralizante contra rBRSV, se produjeron antisueros dirigidos contra rBRSV, rBRSV\DeltaSH, rBRSV\DeltaG y rBRSV\DeltaSHG en conejos. Los sueros recogidos después de la segunda inmunización se examinaron en un ensayo de inmunofluorescencia indirecta y en un ensayo de neutralización de suero. Después de la segunda inmunización, los sueros mostraron señales solamente débiles en un ensayo de inmunofluorescencia indirecta realizado en células Vero infectadas por rBRSV (no mostrado). Sin embargo, todos los sueros fueron capaces de neutralizar rBRSV convencional. El suero del animal inmunizado con rBRSV\DeltaSHG, que carecía tanto de los genes SH como G, tenía un título de DN_{50} contra rBRSV de 32. Los sueros de control recogidos de todos los animales antes de la inmunización no otorgaron ninguna actividad de neutralización contra BRSV. Conclusión: los anticuerpos neutralizantes inducidos por un BRSV\DeltaSHG recombinante que, por tanto, lleva de las proteínas asociadas a envuelta solamente la proteína de fusión F, pero ni la proteína G ni la proteína SH hidrófoba pequeña, son capaces y suficientes para neutralizar el virus BRS de tipo silvestre.

Ejemplo 3 El BRSV recombinante que carece de la glucoproteína de envuelta G protege contra exposición a BRSV de tipo silvestre Materiales y métodos

Virus y células. El virus sincitial respiratorio bovino recombinante (rBRSV) (1) y rBRSV con una deleción de la glucoproteína G (rBRSV\Delta\DeltaG) (2) se propagaron en células MDBK para obtener soluciones madre de virus para la inmunización de terneros. Noventa minutos después de la infección a una MOI de 0,1, se retiró el inóculo y las células se incubaron a 37ºC en MEM complementado con FCS al 3% en una atmósfera de CO_{2} al 5%. Ocho días post-infección, cuando se pudo observar un CPE amplio, el virus altamente asociado a células se liberó por congelación y descongelación y los restos celulares se retiraron por centrifugación a baja velocidad. Se preparó material para inmunización simulada de terneros a partir de células de MDBK no infectadas que se trataron idénticamente.

Diseño experimental, modelo de exposición. Se obtuvieron once terneros criados convencionalmente de una manada lechera local. Los terneros se alimentaron con calostro y se introdujeron en las instalaciones de aislamiento cuando tenían entre dos y ocho días de edad. Después del transporte, siete terneros mostraron descarga nasal mucopurulenta y se aisló Pasteurella multocida de los hisopos nasales. Para evitar neumonía, todos los terneros recibieron un tratamiento antibiótico singular. Los terneros se alimentaron con sustituto de leche, gránulos de heno y copos de cereales. Se demostró que los terneros estaban libres de BRSV, BVDV, IBR y BPIV-3. Sin embargo, tres terneros tenían bajos títulos de anticuerpos maternales contra BRSV, con títulos neutralizantes de 2 log2. A la edad de dos meses, los terneros se dividieron en lotes en tres grupos. El grupo I (vacunación simulada) consistía en tres terneros, el grupo II (vacunación con rBRSV\DeltaG) y el grupo III (vacunación con rBRSV) consistían cada uno en cuatro terneros. Cada uno de los tres terneros seropositivos se asignó a uno de los grupos y los terneros seronegativos se dividieron en lotes aleatoriamente. En el grupo I, cada ternero recibió una vacunación simulada que consistía en 8 ml de suspensión de cultivo celular de MDBK que se aplicó por vía intranasal. Los animales del grupo II se vacunaron por vía intranasal con el mismo volumen, que contenía 8 x 10^{6} UFP de rBRSV\DeltaG. Los terneros del grupo III se vacunaron por vía intranasal con 8 x 10^{6} UFP de rBRSV. Después de la inmunización, se realizaron evaluaciones clínicas (temperatura corporal, frecuencia cardiaca, frecuencia respiratoria, tos y sonidos pulmonares anormales, descarga nasal u ocular, depresión) diariamente durante diez días y se tomaron hisopos nasales diariamente. Después de diez días, los exámenes clínicos se realizaron dos veces por semana y se tomaron hisopos nasales semanalmente. El día ocho, 15, 29 y 35 se tomaron muestras de sangre. Seis semanas después de la inmunización, los terneros se expusieron a BRSV de tipo silvestre de bajo pase, cepa CA-1 (un obsequio generoso de Laurel Gershwin, Davis, CA), por aerosol. La suspensión de virus (5 x 10^{4} UFP en un volumen de 10 ml por ternero) se aerosolizó por un nebulizador ultrasónico (Nebutur 310, TUR Elektromedizin, Hohen Neuendorf) y se administró a los terneros usando un tubo flexible y una mascarilla. Después de la exposición se realizaron diariamente exámenes clínicos, como se ha descrito anteriormente, e hisopos nasales. Se tomaron muestras de sangre el día ocho después de la exposición. El día ocho después de la exposición, los terneros se necropsiaron.

Examen anatomopatológico. El tamaño relativo de área del pulmón neumónica se estimó para cada lóbulo y se registró en un diagrama de pulmón convencional. Las lesiones de hasta el 1% de todo el pulmón se indicaron con (+), + marcó un intervalo entre el 1% y el 10%, ++ entre el 11% y el 20%, +++ entre el 21% y el 50% y ++++ indicó lesiones neumónicas que superaban el 50% del pulmón. Los lóbulos usados para el muestreo tisular se pinzaron y se realizó un lavado pulmonar traqueobronquial. Se tomaron muestras tisulares para exámenes biológicos, histológicos y bacteriológicos. Además, se fijaron y procesaron muestras tisulares para tinción histológica (H.E.) y para caracterizaciones inmunohistológicas usando un anticuerpo monoclonal específico para la proteína F de BRSV.

Aislamiento de virus. La recuperación de BRSV se realizó de hisopos nasales y post-mortem a partir de fluido de lavado traqueobronquial, lóbulos pulmonares y de ganglios linfáticos mediastínicos. Los hisopos nasales se recogieron en 2 ml de MEM. El fluido de lavado se centrifugó y el sobrenadante se usó para el aislamiento del virus. Las muestras tisulares y los ganglios linfáticos se homogeneizaron en medio de Hank que contenía sacarosa (0,218 M) y antibióticos en un mortero, proporcionando una suspensión tisular al 20%.

Después de 1 h de incubación a temperatura ambiente, las suspensiones se congelaron y descongelaron una vez. Los restos se retiraron por centrifugación a baja velocidad. Se usaron células Kop-R (Kop-R, CCLVRIE244, una línea celular permanente generada a partir de tejido esofágico-faríngeo de un ternero recién nacido, obtenido de Roland Riebe, Insel Riems) se usaron para el aislamiento del virus. Se incubaron monocapas de células Kop-R con diluciones de factor diez seriadas de fluido de lavado, hisopos nasales o de sobrenadante de homogeneizado tisular. Después de 2 horas de adsorción, se retiró el inóculo, la monocapa se lavó una vez y se incubó durante siete días. Todos los cultivos celulares se realizaron con antibióticos añadidos al medio de cultivo celular. En el caso de CPE, las células se fijaron con acetona y se ensayaron para BRSV en un ensayo de inmunofluorescencia indirecta, usando un suero hiperinmune policlonal de conejo específico para la proteína de matriz de BRSV. Si no se pudo detectar CPE, los cultivos celulares se pasaron tres veces en intervalos de 7 días. Finalmente, se realizó un ensayo de inmunofluorescencia indirecta para confirmar los resultados negativos.

Ensayo de neutralización. Los sueros se inactivaron por calor y se incubaron en diluciones de factor dos seriadas con un volumen igual de rBRSV, que contenía 100 TCID_{50} de BRSV por 50 \mul, durante una hora a temperatura ambiente. Posteriormente, se añadieron 10^{4} células BSR T7/5 en un volumen de 0,1 ml. Después de cuatro días, se determinó la DN_{50} como la dilución sérica recíproca que da como resultado la inhibición de CPE en la mitad de los pocillos paralelos.

Ensayo de inmunofluorescencia indirecta. Se transfectaron de forma transitoria células BSR T7/5 (1) con plásmidos de expresión que contienen las fases de lectura abiertas de la proteína G o F de BRSV, respectivamente, bajo control del promotor de ARN de polimerasa de T7. Dos horas post-transfección, las células se dividieron y se sembraron en una placa de microtitulación. 24 horas post-transfección, las células se fijaron con acetona y se incubaron con sueros de ternero inactivados por calor diluidos 1:100 en PBS y se tiñeron posteriormente con anticuerpo secundario anti-IgG bovina de cabra conjugado con FITC. Los anticuerpos monoclonales específicos para proteína G o F de BRSV sirvieron como controles.

Resultados

Signos clínicos. Después de la inmunización intranasal, no se observaron signos clínicos en ninguno de los grupos, con la excepción de un ternero en el grupo de rBRSV que mostró rara vez una ligera tos (Tabla 1).

Después de la exposición, los terneros del grupo inmunizado de manera simulada mostraron enfermedad clínica de leve a grave (Tabla 1). Dos terneros tuvieron solamente una ligera elevación de la temperatura corporal, acompañada por tos leve. Un animal padeció dificultad respiratoria grave. La temperatura rectal estaba aumentada y la frecuencia respiratoria estaba aumentada más de dos veces. Se observaron tos espontánea frecuente y sonidos pulmonares anormales. Este ternero se eutanasió el día 7 debido a dificultad respiratoria grave. Los terneros del grupo de rBRSV\DeltaG mostraron post-exposición solamente tos leve y en tres de cuatro animales se observó una ligera elevación de la temperatura rectal. En el grupo de rBRSV, solamente un ternero mostró un aumento de la temperatura rectal y se observó tos infrecuente en dos terneros (Tabla 1).

Aislamiento de virus. Después de la inmunización con rBRSV, se pudo reaislar virus de hisopos nasales desde el día 2 hasta el día 8 (Tabla 2). Los títulos de virus de las muestras de hisopo nasal variaban entre 1,0 log10 y 4,1 log_{10} de UFP por ml. Después de la inmunización con rBRSV\DeltaG, la recuperación de virus de hisopos nasales no fue exitosa, incluso después del tercer pase. Como se esperaba, después de la inmunización simulada, no se pudo aislar virus de hisopos nasales. Después de la exposición, en el grupo inmunizado de forma simulada se recuperó virus de hisopos nasales desde el día 3 hasta el día 7 de todos los terneros, con títulos de 1,6 log_{10} a 3,4 log_{10} por ml. En los grupos vacunados, fue necesario al menos un pase de células inoculadas con material de hisopo nasal para detectar la replicación del virus, con la excepción del ternero 41 del grupo rBRSV\DeltaG, que mostró bajos títulos de hisopo nasal de hasta 1,6 log10, detectados en tres días consecutivos (Tabla 2).

Serología. Después de la vacunación intranasal, los sueros obtenidos de los terneros de los grupos rBRSV y rBRSV\DeltaG mostraron un aumento en la actividad neutralizante (Figura 1). Con detalle, en el grupo inmunizado con rBRSV, los títulos de DN_{50} aumentaron hasta valores entre 32 y 256, pareciéndose a un aumento que tiene lugar después de infecciones naturales. Los títulos de DN_{50} del grupo de rBRSV\DeltaG se mantuvieron en un nivel moderado de 8 a 24 hasta el día 35 después de la vacunación. Antes de la exposición, ninguno de los terneros del grupo inmunizado de manera simulada tenía títulos de anticuerpo neutralizante (DN_{50}) contra BRSV superiores a 4. Después de la exposición, los animales en el grupo rBRSV\DeltaG mostraron un aumento de cuatro a seis veces en la DN_{50} ocho días después de la exposición a BRSV, mientras que en el grupo rBRSV se observó un ligero aumento en la actividad neutralizante solamente en uno de cuatro terneros (Figura 6). Para caracterizar adicionalmente la respuesta serológica con respecto a su especificidad para G y F de BRSV, se realizó un ensayo de inmunofluorescencia indirecta en células BSR T7/5 24 horas después de la transfección con plásmidos de expresión para las proteínas G o F de BRSV, respectivamente. En el grupo inmunizado con rBRSV, se detectaron anticuerpos para G y F de BRSV el día 35 después de la inmunización, sin aumento de la señal de fluorescencia 8 días después de la exposición (Tabla 3). En el grupo inmunizado de manera simulada, no se pudieron detectar anticuerpos de la subclase IgG 8 días después de la exposición, ni contra G ni contra F de BRSV. Como se esperaba, los terneros inmunizados con rBRSV\DeltaG no desarrollaron anticuerpos específicos para G de BRSV. Sin embargo, a diferencia de los animales del grupo inmunizado de manera simulada, todos los animales del grupo rBRSV\DeltaG desarrollaron un nivel detectable de anticuerpos IgG específicos para F de BRSV, ocho días después de la exposición (Tabla 3). En conjunto, la reacción serológica post-exposición de los animales inmunizados con rBRSV\DeltaG se puede tomar como una prueba de un efecto de sensibilización anterior por rBRSV\DeltaG.

Hallazgos anatomopatológicos. En el grupo inmunizado de manera simulada, la cantidad relativa de área pulmonar atelectásica era mayor que la cantidad observada en el grupo rBRSV\DeltaG y en el grupo vacunado con rBRSV (Tabla 4). La evaluación de estos datos tiene que incluir los hallazgos histopatológicos. Mientras que en las áreas atelectásicas en el grupo rBRSV\DeltaG estaban presentes solamente lesiones crónicas sin células sincitiales, los cambios en el grupo inmunizado de manera simulada se caracterizaron como lesiones neumónicas agudas. Además, en el pulmón del ternero 26, que había mostrado la enfermedad clínica más grave y se había necropsiado el día 7 después de la exposición, se observaron células sincitiales. Estos resultados se confirmaron por los hallazgos inmunohistológicos. En dos de tres terneros del grupo inmunizado de manera simulada, el ensayo de inmunofluorescencia indirecta puso de manifiesto grandes áreas de células epiteliales alveolares que mostraban inmunofluorescencia específica para BRSV. Estas áreas estaban presentes en varios lóbulos pulmonares, mientras que en los grupos vacunados se pudieron observar solamente pocas células únicas teñidas específicamente.

Referencias

1. Buchholz, U. J., Finke, S. y K. -K. Conzelmann. 1999. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73: 251-259.

2. Karger, A., U. Schmidt y U. J. Buchholz. 2001. Recombinant bovine respiratory syncytial virus with deletions of the G or SH genes: G and F proteins bind heparin. J. Gen.Virol. 82: 631-640.

3. Taylor, G., E. J. Stott, J. Furze, J. Ford y P. Sopp. 1992. Protective epitopes on the fusion protein of respiratory syncytial virus recognized by murine and bovine monoclonal antibodies. J. Gen. Virol. 73: 217-2223.

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TABLA 1 Signos clínicos post-exposición

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TABLA 3 Anticuerpos dirigidos contra G y F de BRSV

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TABLA 4 Exámenes anatomopatológicos e histológicos

5

6

Claims (10)

1. Vacuna para la protección de vacas contra la infección por BRSV, comprendiendo dicha vacuna un virus Sincitial Respiratorio Bovino que difiere del virus de tipo silvestre solamente porque es incapaz de expresar una proteína G de BRSV funcional, debido a una mutación en el gen que codifica dicha proteína, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la mutación es una deleción.

3. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el mutante de BRSV no es reactivo con anticuerpos generados contra proteína G purificada en un ensayo ELISA convencional.

4. Vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el Virus Sincitial Respiratorio Bovino comprende una secuencia de ARN heterólogo, en una región del gen G de BRSV.

5. Vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la secuencia de ARN heterólogo codifica un antígeno de otro patógeno, seleccionándose dicho otro patógeno entre el grupo de patógenos de vacas, que consiste en Rotavirus Bovino, virus de Diarrea Vírica Bovina, virus de Parainfluenza de tipo 3, Paramixovirus Bovino, Herpesvirus Bovino, Virus de Glosopeda y Pasteurella haemolytica y/o una citocina.

6. Vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada por que comprende adicionalmente un adyuvante.

7. Vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada por que está en una forma secada por congelación.

8. Método para discriminar animales infectados por virus de campo Sincitial Respiratorio Bovino de animales vacunados con la vacuna de Virus Sincitial Respiratorio Bovino de acuerdo con la reivindicación 3, comprendiendo dicho método la etapa de incubar un fluido corporal de un animal a ensayar con proteína G.

9. Método para discriminar animales infectados por virus de campo Sincitial Respiratorio Bovino de animales vacunados con la vacuna de Virus Sincitial Respiratorio Bovino de acuerdo con la reivindicación 3, comprendiendo dicho método la etapa de incubar un tejido o fluido corporal de un animal a ensayar con anticuerpos contra proteína G purificada.

10. Método para la preparación de una vacuna para la protección de vacas contra infección por Virus Sincitial Respiratorio Bovino, comprendiendo dicho método la mezcla de virus Sincitial Respiratorio Bovino incapaz de expresar una proteína G de BRSV funcional debido a una mutación en el gen que codifica dicha proteína y un vehículo farmacéuticamente aceptable.