ES2330441T3 - Deposito de metal catalizado por una enzima para la deteccion in situ mejorada de epitopos inmunohistoquimicos y secuencias de acido nucleico. - Google Patents
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Abstract
Un método de detección in situ de un epítopo inmunohistoquímico o una secuencia de ácido nucleico de interés en una muestra biológica, que comprende unir una molécula conjugada marcada con una enzima al epítopo o secuencia de interés en presencia de una especie reductora sin actividad redox y un ión metálico soluble, en el que dicha especie reductora sin actividad redox es un sustrato para dicha molécula conjugada marcada con una enzima y en el que dicha enzima de dicha molécula conjugada marcada con una enzima cataliza la transformación de la especie reductora sin actividad redox en un agente reductor, reduciendo de este modo el ión metálico a partículas metálicas insolubles en estado de oxidación 0, en o alrededor del punto en el que se ancla la enzima.
Description
Depósito de metal catalizado por una enzima para
la detección in situ mejorada de epítopos inmunohistoquímicos
y secuencias de ácido nucleico.
Esta invención se refiere a en general al campo
de la química, y en particular se refiere a un nuevo método de
detección in situ de epítopos inmunohistoquímicos y
secuencias de ácido nucleico usando una reacción mediada por una
enzima para el depósito localizado de átomos metálicos.
La tinción tisular es una técnica antigua según
los patrones modernos que se remonta a más de cien años atrás.
Recientemente, se han realizado esfuerzos para automatizar el
procedimiento de aplicación de diferentes tipos de colorantes
químicos y bioquímicos a secciones de tejido. Los instrumentos que
se han inventado para este fin incluyen la línea de instrumentos de
Ventana Medical de instrumentos basados en doble transportador
continuo (o carrusel) tales como los 320, ES®, NexES®, BECHMARK® y
el BENCHMARK® XT. Las patentes que describen estos sistemas
incluyen US 5595707, 5654199, 6093574 y 6296809. Otro tipo de
teñidor automatizado es la línea de teñidores TechMate®, descrita
en los documentos US 5355439 y 5737499.
Se han desarrollado diversos procedimientos
químicos de detección manual para histoquímica a lo largo de los
años. Generalmente, una vez que un marcador molecular o diana de
interés se ha identificado a través de estudios moleculares, es
necesario hacerle visible en el microscopio óptico para que un
patólogo u otro especialista médico pueda interpretarlo. La primera
etapa de detección implica un anticuerpo primario
anti-diana marcado de forma detectable con biotina,
digoxigenina, fluoresceína u otro hapteno que se está usando para
localizar a la diana biológica de interés. A continuación, se usa
un anticuerpo secundario anti-hapteno conjugado a
una enzima u otra molécula informadora para localizar al anticuerpo
primario. Los sistemas enzimáticos típicos los conocen los expertos
en la materia e incluyen peroxidasa de rábano rusticano y fosfatasa
alcalina. Estas enzimas catalizan a continuación la precipitación
de un sustrato cromogénico en las proximidades inmediatas del
complejo anticuerpo primario-secundario. Los
cromógenos tales como nitroazul de tetrazolio (NBT/BCIP);
tetraclorhidrato de 3,3'-diaminobencidina (DAB); y
3-amino-9-etilcarbazol
(AEC) se conocen bien. Como alternativa, interacciones
enzima-sustrato pueden producir señales
quimioluminiscentes, que pueden capturarse en una película
fotográfica.
Otras marcas incluyen marcado con
^{125}-I del anticuerpo secundario, que puede
detectarse usando una película fotográfica; anticuerpo secundario
marcado con isocianato de fluoresceína, que puede detectarse usando
luz UV; Proteína A marcada con ^{125}-I, que
puede usarse en lugar de un anticuerpo secundario, puesto que se
unirá a la región Fc de moléculas de IgG; anticuerpo secundario
marcado con oro, que es visible directamente como un color rojo
cuando se une con el anticuerpo secundario al anticuerpo primario;
Anticuerpo secundario biotinilado, que cuando se incuba con el
anticuerpo secundario, y se incuba a continuación con avidina
conjugada a enzima que se une fuertemente a la biotina, dará una
señal mejorada, puesto que múltiples moléculas de biotina pueden
unirse a una única molécula de anticuerpo. Las enzimas usadas
típicamente incluyen fosfatasa alcalina ("AP") o peroxidasa de
rábano rusticano ("HRP").
La mejora metálica de la detección
inmunohistoquímica se divulga en la Patente de Estados Unidos Nº
5.116.734 (Higgs et al.). La patente '734 se refiere a una
composición de materia y a un proceso para detectar la presencia de
un catalizador oxidativo en una muestra biológica. La composición
comprende un precipitado formado mediante oxidación de un sustrato
cromogénico en presencia del catalizador, junto con dos o más
metales reducidos co-precipitados. Se forma una
señal fuerte con la que detectar un catalizador de oxidación que se
localiza en una molécula diana. Las moléculas diana pueden ser
ácidos nucleicos, anticuerpos o antígenos de la superficie celular.
En particular, Higgs et al., confían en un precipitado
cromogénico y dos o más metales, con el fin de detectar un
catalizador oxidativo. Merchanthaler et al., J. Histoch. And
Cytochem., 37: 10 1563-65 (1989) divulgan la
intensificación con plata de DAB polimerizado de forma oxidativa
mediante el pre-tratamiento del DAB con iones de
níquel.
Un ejemplo más reciente de mejora metálica de la
detección inmunohistoquímica incluye la Patente de Estados Unidos
Nº 6.670.113 (Hainfeld). La patente '113 se refiere a un método de
producción de metal en un estado de oxidación cero a partir de
iones metálicos, que comprende: proporcionar iones metálicos de al
menos un metal seleccionado entre cesio, grupo de la tabla
periódica 1b, 2a, 4a y 8, un agente oxidante que contiene oxígeno y
un agente reductor seleccionado entre al menos uno de hidroquinona,
un derivado de hidroquinona o galato de n-propilo;
proporcionar una enzima oxido-reductasa; combinar la
enzima con los iones metálicos, el agente oxidante y el agente
reductor; y reducir al menos algunos de los iones metálicos a metal
en un estado de oxidación cero. En particular, se divulga la
reducción de ión plata a plata metálica en las proximidades de
peroxidasa de rábano rusticano cuando se expone a peróxido de
hidrógeno e hidroquinona.
Además, el documento US 2002/0142411 describe
métodos y materiales para utilizar enzimas para actuar sobre iones
metálicos en solución, de modo que los iones se reduzcan a
metal.
Además, el documento US 5.073.483 describe un
método de tinción de una secuencia de ácido nucleico que se fija
sobre un soporte sólido, en el que se emplea un sistema enzimático
que fija a esta secuencia para detectarla mediante marcado no
radiactivo, haciéndose reaccionar posteriormente al sistema
enzimático con un sustrato cromogénico para producir un producto
coloreado.
Sigue existiendo una necesidad de mejores
técnicas bioquímicas para identificar visualmente epítopos
inmunohistoquímicos y dianas de ADN de interés mediante microscopio
óptico de campo claro.
La invención se refiere a nuevos métodos de
detección in situ de un epítopo inmunohistoquímico o una
secuencia de ácido nucleico de interés en una muestra biológica,
que comprenden unir una molécula conjugada marcada con una enzima
al epítopo o secuencia de interés en presencia de una especie
reductora sin actividad redox y un ión metálico soluble, en los que
dicha especie reductora sin actividad redox es un sustrato para
dicha molécula conjugada marcada con una enzima y en los que dicha
enzima de dicha molécula conjugada marcada con una enzima cataliza
la transformación de la especie reductora sin actividad redox en un
agente reductor, catalizando de este modo la reducción del ión
metálico a un metal en estado de oxidación 0 en o alrededor del
punto en el que se ancla la enzima. Se describen nuevos derivados
de fosfato de agentes reductores que, cuando se exponen a una
enzima fosfatasa se activan a su forma reductora, reduciendo de este
modo iones metálicos a partículas metálicas insolubles en estado de
oxidación 0.
La invención utiliza un compuesto que tiene la
estructura general (IV) que se muestra a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
- R_{1}
- puede ser H, alquilo, arilo, carboxilo, carboxialquilo, NH_{2}, (CH_{2})_{n}-COOH-, nitro, éter, tioéter y sulfonato;
- R_{2}
- puede ser H, alquilo, arilo, carboxilo, carboxialquilo, NH_{2} o CH_{2})_{n}-COOH-, nitro, éter, tioéter y sulfonato; y
- Z
- puede ser PO_{3}^{2-}, H, \alpha-galactosa, \beta-galactosa, \alpha-glucosa, \beta-glucosa, éster y \beta-lactama; pero ambos Z no pueden ser H. Un compuesto preferido tiene ambos Z = fosfato.
La invención también utiliza un compuesto que
tiene la estructura general (V):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
- R_{1}
- puede ser H, alquilo, arilo, carboxilo, carboxialquilo, NH_{2}, (CH_{2})_{n}-COOH-, nitro, éter, tioéter y sulfonato; y
- Z
- puede ser PO_{3}^{2-}, \alpha-galactosa, \beta-galactosa, \alpha-glucosa, \beta-glucosa, éster y \beta-lactama. Un compuesto particularmente preferido tiene ambos Z = fosfato.
\newpage
La invención también utiliza un compuesto que
tiene la estructura general (VI):
en la
que
- R_{1}
- puede ser H, alquilo, arilo, carboxilo, carboxialquilo, NH_{2}, (CH_{2})_{n}-COOH-, nitro, éter, tioéter o sulfonato; y
- Z
- puede ser PO_{3}^{2-}, \alpha-galactosa, \beta-galactosa, \alpha-glucosa, \beta-glucosa, éster y \beta-lactama. Un compuesto particularmente preferido tiene ambos Z = fosfato.
La invención también utiliza un compuesto que
tiene la fórmula general (VII):
en la
que
- R_{1}
- puede ser H, alquilo, arilo, carboxilo, carboxialquilo, NH_{2}, (CH_{2})_{n}-COOH-, nitro, éter, tioéter y sulfonato; y
- Z
- puede ser PO_{3}^{2-}, \alpha-galactosa, \beta-galactosa, \alpha-glucosa, \beta-glucosa, éster y \beta-lactama. Dos compuestos particularmente preferidos tienen R_{1} = metilo o CH_{2}-(CH_{2}-CH_{2}-CH(CH_{3})-CH_{2})_{3}-H y Z = fosfato.
La invención también se refiere a un método de
tinción in situ de una muestra biológica que tiene un epítopo
o una secuencia de nucleótidos de interés, que comprende las etapas
de:
- \quad
- a) poner en contacto a dicha muestra biológica con una molécula conjugada que tiene un hapteno; b) poner en contacto a dicho hapteno con una molécula conjugada marcada con una enzima; y c) poner en contacto a dicha muestra biológica con una especie reductora sin actividad redox que es un sustrato para dicha marca enzimática en presencia de un ión metálico soluble, donde dicha enzima de dicha molécula conjugada marcada con una enzima cataliza la transformación de la especie reductora sin actividad redox en un agente reductor, reduciendo de este modo al ión metálico a partículas metálicas insolubles en estado de oxidación 0, en o alrededor del punto en el que se ancla la enzima. En una realización preferida de este método, la molécula conjugada que tiene un hapteno en la etapa a) es un anticuerpo primario biotinilado, la molécula conjugada marcada con una enzima en la etapa b) es estreptavidina-fosfatasa alcalina, y la especie reductora sin actividad redox en la etapa c) es fosfato de ácido ascórbico en presencia de ión de plata a un pH mayor de 7. También puede aplicarse una etapa opcional de pre-tratamiento con ión de oro para mejorar el depósito de plata.
La figura 1 es una fotografía de ocho pocillos
de microvaloración dispuestos en dos columnas de cuatro. La columna
A es la columna de control que contiene 100 \mul de nitrato de
plata 50 mM y 100 \mul de fosfato sustrato 50 mM en tris 100 mM,
pH 9,0. La columna B contiene los mismos componentes con la adición
de 5 \mul de 0,2 mg/ml de fosfatasa alcalina intestinal de
ternero (Pierce) en Tris 100 mM, pH 7,0. La columna B demuestra la
acción de la liberación del sustrato reductor mediada por fosfatasa
alcalina (es decir, ácido
ascórbico-2-fosfato a ácido
ascórbico) y la reducción concomitante de nitrato de plata a
partículas de plata metálica por el sustrato reductor liberado.
La figura 2 es una fotografía de cuatro puntos
en papel de nitrocelulosa que se trataron con 5 \mul de 0,2 mg/ml
de fosfatasa alcalina intestinal de ternero (Pierce) en Tris 100 mM,
pH 7,0, 5 \mul de una solución 50 mM de los fosfatos del Ejemplo 1
en tris 100 mM, pH 9,0 y 5 \mul de nitrato de plata 50 mM. ácido
ascórbico-2-fosfato (AAP), fosfato
de sesamol (SP),
hidroquinona-1,4-difosfato (HQP),
fosfato de
2,2,5,7,8-pentametil-6-cromanol
(PMCP).
La figura 3 es una microfotografía en escala de
grises de tejido de amígdala normal teñido usando conjugado de
AP-SA, pre-tratamiento con oro y
reducción de plata usando fosfato de ácido ascórbico (AAP).
La figura 4 es una microfotografía en escala de
grises de tejido de amígdala normal teñido usando conjugado de
AP-SA, pre-tratamiento con oro y
reducción de plata usando AAP, siendo la única diferencia el
completo desarrollo en línea de la señal de plata.
La figura 5 es una microfotografía en escala de
grises del control positivo para las figuras
3-4.
La figura 6 es una microfotografía de anticuerpo
anti-Desmina en músculo esquelético detectado con
pre-tratamiento con oro, AAP y AgNO_{3}, 20
minutos de incubación.
La figura 7 es una microfotografía de
anti-S100 en el cerebro, detectado con
pre-tratamiento con oro, AAP y AgNO_{3}, 20
minutos de incubación.
La figura 8 es una microfotografía de Control
Negativo de Conejo en Cerebro detectado con
pre-tratamiento con oro, AAP y AgNO_{3}, 20
minutos de incubación.
La figura 9 es una microfotografía de anticuerpo
anti-S100 en tejido cerebral, usando la detección
con VRed de Ventana.
La figura 10 es una microfotografía de
anticuerpo anti-Desmina en músculo esquelético,
pre-tratamiento con oro, AAP y AgNO_{3}, 10
minutos de incubación y 10 minutos de amplificación con
4-metilaminofenol.
La figura 11 es una microfotografía de
anticuerpo anti-Desmina en músculo esquelético sin
amplificación no enzimática alguna. Las mismas condiciones que en la
figura 9, excepto que no hay etapa de amplificación.
La invención se refiere a un método de detección
de un epítopo inmunohistoquímico o una secuencia de ácido nucleico
de interés uniendo en primer lugar una molécula conjugada al epítopo
o secuencia de interés. La molécula conjugada se marca con una
enzima que cataliza la transformación de una especie reductora sin
actividad redox en un agente reductor, permitiendo de este modo la
reducción de un metal detectable cromogénicamente en o alrededor
del punto en el que la enzima se ancla. Más específicamente, se basa
en un nuevo método de uso de fosfatasa alcalina y otras enzimas, es
decir glucosidasas, esterasas,
\beta-galactosidasas como marcas capaces de
catalizar la desfosforilación de un sustrato(s)
enzimático(s) sin actividad redox, por ejemplo fosfato de
ácido ascórbico, que después de la desfosforilación catalizada por
la enzima se convierte en un agente reductor extremadamente eficaz
capaz de reducir iones de plata y/o oro a átomos metálicos de plata
y/o oro. Puesto que la reducción se produce cerca de o en el
epítopo o secuencia de nucleótidos de interés, la plata/oro
metálica precipitada en estado de oxidación 0 se acumula en las
proximidades del epítopo o secuencia, mejorando enormemente la
detectabilidad visual del epítopo en los procedimientos de
diagnóstico microscópico.
La invención utiliza nuevos compuestos que se
han sintetizado específicamente para su uso en el método anterior.
El más preferido es el fosfato de ácido ascórbico (véase la fórmula
general I en la que Z es el sustrato PO_{3}^{-2}, que cuando es
desfosforilado por su enzima fosfatasa alcalina, da como resultado
ión ascorbato, un buen reductor de cationes de plata y oro.
Generalmente, los compuestos que tienen las fórmulas (I)-(VII) que
se muestran a continuación son excelentes sustratos.
Para las estructuras generales
I-VII, Z puede ser PO_{3}^{2-}, galactosilo,
glucosilo, éster o beta-lactama. Para las
estructuras generales II-IV, uno de los dos Z
también puede ser H.
Para las estructuras generales
II-IV, al menos un Z debe ser PO_{3}^{2-},
galactosilo, glucosilo, éster o beta-lactama.
Para la estructura general II, R puede ser H,
alquilo, arilo, carboxilo, carboxialquilo, NH_{2},
(CH_{2})_{n}-COOH-, nitro, éter, tioéter
o sulfonato.
Para las estructuras generales
III-VII, R_{1} puede ser H, alquilo, arilo,
carboxilo, carboxialquilo, NH_{2},
(CH_{2})_{n}-COOH-, nitro, éter, tioéter
o sulfonato.
Para las estructuras generales
III-IV, R_{2} puede ser H, alquilo, arilo,
carboxilo, carboxialquilo, NH_{2},
(CH_{2})_{n}-COOH-, nitro, éter, tioéter
o sulfonato.
Los términos usados en este documento son
conocidos por el químico experto en la materia. Sin embargo, para
proporcionar una comprensión clara y consecuente de la memoria
descriptiva, de las reivindicaciones y del alcance que se da a
dichos términos, se proporcionan las siguientes definiciones:
Detectar in situ significa ser capaz de
visualizar la característica biológica de interés en muestras de
tejido o celulares intactas. El tejido es por ejemplo, secciones de
tejido de 4-8 \mum de grosor fijadas e incluidas
en parafina tales como las que se montan habitualmente en
portaobjetos de microscopio de vidrio y después se preparan y se
tiñen para inmunohistoquímica o hibridación in situ usando
sondas de oligonucleótidos. Las células intactas incluyen
citospinas, ThinPreps^{TM} (Cytyc, Inc., Boxborough, MA) y otros
métodos de preparación de células intactas para tinción. In
situ solamente puede referirse a matrices de tejidos montadas
en portaobjetos de microscopio de vidrio.
Cromógeno: Sustrato enzimático que produce un
producto de reacción detectable que habitualmente está teñido. Los
ejemplos de cromógenos típicos incluyen Nuclear Fast Red;
nitroazul de tetrazolio (NBT/BCIP); tetraclorhidrato de
3,3'-diaminobencidina (DAB); y
3-amino-9-etilcarbazol
(AEC). Muchos más se conocen y están disponibles a través de
proveedores tales como Pierce Chemical, Rockford, IL.
Molécula conjugada: puede ser cualquier molécula
que tiene una porción de unión complementaria que, cuando se sitúa
en las proximidades de su punto de unión complementario, se une al
punto. Anticuerpos y oligómeros de ARN/ADN que tienen secuencias
capaces de hibridar con su ARN o ADN diana, son dos ejemplos de
moléculas conjugadas. Otro par conjugado más es el par de
estreptavidina-biotina, también llamados "socios
de afinidad" en este documento. La proteína conjugada
estreptavidina tiene una afinidad natural por biotina. La biotina
se usa de forma dominante en el laboratorio de patología anatómica
como socio de unión a estreptavidina. Casi todos los anticuerpos
primarios disponibles en el mercado están marcados con biotina de
modo que pueden usarse conjugados de estreptavidina para localizar
el anticuerpo primario. En la presente invención, el motivo de
unión biotina-estreptavidina se usa para
co-localizar estreptavidina con AP los anticuerpos
secundarios marcados con biotina se dirigen al sitio de unión en el
tejido, y el conjugado de estreptavidina-AP lleva a
AP a la misma ubicación a través de la unión de estreptavidina a
biotina.
Kit: una combinación envasada de dos o más
contenedores, recipientes, dispositivos o similares que contiene
los reactivos necesarios para detectar un biomarcador de interés.
Junto con el kit se suministran instrucciones por escrito para la
realización del método. El kit puede contener un anticuerpo, ácido
nucleico, ligando o similar marcado con AP. El kit para detectar un
biomarcador de interés en una muestra biológica comprende uno o más
recipientes, cada recipiente adaptado para contener una molécula
conjugada marcada con una enzima, una especie reductora sin
actividad redox y un ión metálico soluble.
La marca enzimática puede ser fosfatasa alcalina
u otra enzima conjugada a un anticuerpo, ácido nucleico o proteína
conjugada tal como estreptavidina. La función de la marca enzimática
es catalizar la creación de una especie reductora con actividad
redox a partir de un precursor reductor sin actividad redox. Otras
enzimas pueden ser alfa- y beta-galactosidasas,
alfa- y beta-glucosidasas, esterasas en general, y
beta-lactamasas, específicamente cafalosporinasas y
penicilinasas.
La especie reductora sin actividad redox es la
precursora de la especie reductora/agente reductor tal como dianión
ascorbato o hidroquinona, que, en las condiciones apropiadas,
reducirá iones metálicos solubles tales como plata(+) u
oro(3+) a un átomo de plata o de oro de modo que se vuelva
visible en un microscopio óptico de campo claro al ojo como un
punto específico. Una especie reductora sin actividad redox
preferida de la presente invención es fosfato de ascorbato, aunque
en este documento se divulgan muchas más.
Otros agentes reductores que pueden usarse para
amplificar la señal de plata son hidroquinona, ácido ascórbico,
2-aminofenol y 4-aminofenol. Estos
actúan para reducir adicionalmente iones metálicos al estado de
oxidación metálica 0, y se usan típicamente para suplementar o
amplificar la señal. Otros agentes reductores los conocen bien los
expertos en la materia, y pueden sustituirse por los que se divulgan
en este documento.
La invención descrita en este documento utiliza
una nueva serie de fosfatos y difosfatos y derivados relacionados
que, aunque completamente inactivos como agentes reductores, se
vuelven reactivos y capaces de reducir iones metálicos a estado de
oxidación (0) después de la hidrólisis catalizada con fosfatasa
alcalina de los grupos fosfato. El agente reductor precursor
inactivo mostrado en las estructuras a continuación es fosfato de
ácido ascórbico, un compuesto particularmente preferido. En
presencia de fosfatasa alcalina, se hidroliza al agente reductor
activo ácido ascórbico, que es capaz de reducir oro, plata y otros
cationes metálicos a metal (0):
Otros nuevos precursores de agente reductor
orgánico más incluyen fosfato de \alpha-tocoferol,
fosfato de sesamol y fosfato de eugenol, mostrados en las
estructuras generales V-VII, en las que Z =
PO_{3}^{-2}; y R puede ser H, alquilo, arilo, carboxilo,
carboxialquilo, NH_{2},
(CH_{2})_{n}-COOH-, nitro, éter, tioéter
o sulfonato.
Existen varias ventajas del uso de fosfatasa
alcalina como marca y fosfato de ascorbato como sustrato en la
presente invención:
- 1)
- La fosfatasa alcalina es una de las enzimas perfectamente evolucionadas con un Kcat/Km que se aproxima al límite controlado por difusión de 1 x 10^{9} litros/mol-seg.
- 2)
- El pH óptimo de la fosfatasa alcalina es 9-10, coincidiendo con los potenciales más rápidos de reducción de las hidroquinonas liberadas por la desfosforilación de los sustratos.
- 3)
- Los fosfatos y difosfatos de arilo y de alquilo pueden sintetizarse de forma razonablemente económica.
- 4)
- Los fosfatos y difosfatos de arilo y de alquilo son excelentes sustratos de fosfatasa alcalina.
- 5)
- Los fosfatos y difosfatos de arilo y de alquilo son generalmente razonablemente estables y pueden formularse para resistir la descomposición durante periodos prolongados.
- 6)
- Las fosfatasas alcalinas son enzimas muy estables que resisten a la degradación térmica y química mejor que la mayoría de las enzimas.
- 7)
- Las fosfatasas alcalinas son razonablemente pequeñas y se han desarrollado métodos de conjugación a otras moléculas biológicas.
- 8)
- El fosfato de ácido ascórbico es un excelente sustrato de AP y el ascorbato tiene un potencial de reducción muy alto, es decir reduce Ag+ y Au3+ cuantitativa y rápidamente, con deshidroascorbato como único sub-producto.
Otro excelente agente reductor es el dianión
hidroquinona. Las estructuras a continuación muestran las
estructuras en equilibrio de
hidroquinona-benzoquinona, a un pH a partir de
9-10, en presencia de un aceptor de electrones como
catión plata. El dianión hidroquinona es la auténtica especie
responsable de reducir cationes de plata a metal insoluble. La
formación de benzoquinona se favorece a pH alto:
\vskip1.000000\baselineskip
Las estructuras generales II-TV
son algunos derivados de hidroquinona que también son útiles en esta
invención. El difosfato de hidroquinona (estructura general II con
ambos Z = fosfato) es un sustrato preferido para la
desfosforilación mediante la enzima fosfatasa alcalina, que a pH
7-11 se desfosforila a dianión hidroquinona, un
agente reductor preferido para el catión plata. Otros derivados
similares a hidroquinona se representan en las estructuras
generales III-IV, y son naftohidroquinona (III) y
antrahidroquinona (IV). Estos pueden sustituirse como se muestra en
los anillos arilo en cualquier posición con R_{1} y R_{2}, y en
los oxígenos con Z. Los sustituyentes R_{1} y R_{2} pueden ser
casi cualquier resto que pueda reaccionar en estos puntos, que
siguen conservando la capacidad de generar un dianión al pH deseado.
En este documento no se incluye una lista exhaustiva de
sustituyentes orgánicos, pero algunos sustituyentes probables
incluyen los siguientes: H, alquilo, arilo, carboxilo,
carboxialquilo, NH_{2},
(CH_{2})_{n}-COOH-, nitro, éter, tioéter
y sulfonato.
En la presente invención pueden usarse diversas
marcas enzimáticas, dependiendo del par de
marca-sustrato seleccionado, como se muestra en las
estructuras a continuación. Por ejemplo, pueden usarse esterasas
junto con mono- y diésteres. También pueden emplearse
galactosidasas y glucosidasas para la desprotección de los
sustratos mono- y di-galactósidos y mono- y
di-glucósidos. Los grupos "Z" que se muestran a
continuación incluyen fosfato, galactosilo, glucosilo, ésteres y
beta-lactamas. Una beta-lactama
preferida es la cefalosporina. Los sacáridos que entran dentro del
alcance de la invención incluyen cualquiera con extremo reductor
conjugado al oxígeno de la especie reductora. Los grupos R pueden
ser H, alquilo, arilo, carboxilo, carboxialquilo, NH_{2},
(CH_{2})_{n}-COOH-, nitro, éter, tioéter
o sulfonato.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La última estructura, una C3'
beta-lactama (es decir, cefalosporinas) también
puede usarse junto con las beta-lactamasas como
marcas enzimáticas. El grupo R de las beta-lactamas
puede ser un alquil arilo, es decir tiofeno, metilo o bencilo.
De particular valor e interés son galactosilo,
glucosilo y otros derivados sacarídicos de hidroquinona y ascorbato
en los que el metabolismo enzimático del sustrato inactivo produce
DOS agentes reductores, concretamente hidroquinona o ascorbato y el
carbohidrato con su extremo reductor también capaz de reducir el ión
plata a plata metálica:
Además de la fosfatasa alcalina, también puede
usarse fosfatasa ácida como marca, en cuyo caso la desprotección de
los grupos fosfato en los sustratos debe realizarse a pH < 7. El
ácido ascórbico liberado en dichas reacciones sigue conservando
excelentes capacidades reductoras a pH < 7.
Puede utilizarse una etapa de
pre-tratamiento con oro para "sembrar" el área
inmediatamente adyacente a la fosfatasa alcalina inmovilizada,
aprovechando de este modo la bien conocida propensión de la plata
metálica a depositarse en un punto de nucleación tal como partículas
de oro ("metalografía"). Como se ha demostrado en los ejemplos
en este documento, una vez que el conjugado SA-AP
estaba unido a la molécula conjugada biotinilada, el ión oro en
forma de AuCl_{3} se co-depositó junto con fosfato
de ascorbato. La AP desfosforilaba el fosfato de ascorbato dando
como resultado la producción del agente reductor ascorbato, que
después reducía los iones oro a oro metálico. El oro metálico servía
después como punto de nucleación para una amplificación adicional
de la señal mediante reducción de iones plata a plata metálica.
Los siguientes ejemplos se incluyen con el fin
de ilustrar algunos aspectos de la invención y no deben considerarse
limitantes.
Se depositaron alícuotas de nitrato de plata
(100 \mul de AgNO_{3} 50 mM) en los pocillos de una placa de
microvaloración (véase la figura 1). La adición de 100 \mul de una
solución 50 mM de ácido
ascórbico-2-fosfato (pocillos A1,
B1), fosfato de sesamol (pocillos A2, B2),
hidroquinona-1,4-difosfato (pocillos
A3, B3) o fosfato de
2,2,5,7,8-pentametil-6-cromanol
(pocillos A4, B4) a la solución de plata no produjo ninguna
reacción. Si se añadía fosfatasa alcalina intestinal de ternero (5
\mul de 0,2 mg/ml) a los pocillos de la columna B, cada solución
formaba plata metálica (0) como un precipitado fino, negro o un baño
de plata en las paredes del recipiente. A: 100 \mul de AgNO_{3}
50 mM y 100 \mul de fosfato sustrato 50 mM, B: 100 \mul de
AgNO_{3} 50 mM, 100 \mul de fosfato sustrato 50 mM y 5 \mul de
fosfatasa alcalina intestinal de ternero 0,2 mg/ml (Pierce
Chemical, Rockford, IL) en Tris 100 mM, pH 7,0.
Se añadió fosfatasa alcalina (5 \mul de 0,2
mg/ml) a papel de nitrocelulosa y se secó (véase la figura 2). Cada
uno de los fosfatos se depositaba en un punto de la nitrocelulosa
como 5 \mul de solución 0,05 M en Tris 1,0 M, pH 9. Cuando se
añadían 5 \mul de AgNO_{3} 0,05 M a cada punto seco, se
observaba un precipitado negro solamente en el punto en el que se
aplicaba fosfatasa alcalina.
La preparación de los portaobjetos para el
análisis se realizó en un instrumento de señalización automatizado
Benchmark® de Ventana (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ).
Los portaobjetos se extrajeron para el desarrollo manual de la
señal. El uso del término "tampón" en este ejemplo se refiere a
tampón Tris 0,1 M (Trizma base (Sigma-Aldrich) en
H_{2}O desionizada pH a 9 usando ácido acético glacial
(Sigma-Aldrich). El siguiente es el procedimiento
adaptado a partir del instrumento: el tejido recubierto de parafina
en el portaobjetos se calentó a 75ºC durante 4 minutos y se trató
dos veces con EZPrep^{TM} (Ventana, Tucson, AZ) volumen ajustado a
75ºC antes de la aplicación del cubreobjetos líquido con ajuste de
volumen de EZPrep. Después de 4 minutos a 75ºC, el portaobjetos se
aclaró y se añadió un ajuste de volumen de desparafinización
automatizada junto con cubreobjetos líquido para desparafinar el
tejido a 76ºC durante 4 minutos. El portaobjetos se enfrío a 40ºC y
se aclaró 3 veces antes de la adición de anticuerpo
Anti-CD20 (clon L26, Ventana, Tucson, AZ) seguido
de cubreobjetos líquido e incubación a 40ºC durante 16 minutos.
Después de aclarar el portaobjetos, el tejido se trató con el
cóctel Universal Secondary Antibody biotinilado (Ventana
Medical Systems, Nº de componente 760-4205) para
co-localizar biotina con el anticuerpo
Anti-CD20, seguido de cubreobjetos líquido e
incubación a 40ºC durante 8 minutos. El portaobjetos se aclaró dos
veces y se extrajo del instrumento y se almacenó en 1x Tampón de
Reacción (Ventana, Tucson, AZ) hasta que estaban preparados para el
desarrollo.
El portaobjetos se extrajo de 1x Tampón de
Reacción y se aclaró 10 veces con tampón seguido de la adición de
300 \mul de tampón al portaobjetos así como 100 \mul de
conjugado de AP-SA (0,14 mg/ml en tampón,
Sigma-Aldrich). El portaobjetos se incubó a 37ºC
durante 15 minutos seguido de aclarado diez veces con tampón. El
portaobjetos se trató con 300 \mul del tampón seguido de 50 \mul
de AuCl_{3} (Sigma-Aldrich) (2,5 \mug/ml en
tampón) y 50 \mul de fosfato de ácido ascórbico
(Sigma-Aldrich) (0,1 M en tampón). El portaobjetos
se incubó a 37ºC durante 20 minutos y seguidamente se aclaró 10
veces con tampón. El portaobjetos se trató con 300 \mul de tampón
seguido de 50 \mul de acetato de plata
(Sigma-Aldrich) (0,1 M en tampón) y 50 \mul de la
solución de fosfato de ácido ascórbico y se incubó a 37ºC durante
20 minutos. El portaobjetos se aclaró de nuevo 10 veces con tampón
seguido de la aplicación de ISH Red Counterstain (Ventana,
Tucson, AZ) como contra-colorante. El portaobjetos
se incubó con el contra-colorante durante 3 minutos
y se aclaró con tampón. La deshidratación del portaobjetos con
etanol y xileno precedía a la aplicación del cubreobjetos, después
de lo cual los portaobjetos se observaban al microscopio.
Como se muestra mediante las fotografías en
escala de grises en la figura 3, la tinción está presente en la
membrana plasmática y en regiones citoplasmáticas de células B
normales en amígdala normal. La intensidad de la tinción es
comparable a un control positivo (figura 5) detectado con el kit
Enhanced V-Red Detection Kit (Ventana,
Tucson, AZ).
La principal diferencia entre este ejemplo y el
ejemplo 3 es que este ejemplo muestra una automatización completa
de las etapas de tinción, mientras que en el ejemplo 3 el
portaobjetos se extraía del instrumento antes del desarrollo con
AP-SA. La preparación de los portaobjetos para el
análisis se realizó en un Instrumento Benchmark de Ventana. El uso
del término "tampón" en este ejemplo se refiere a tampón Tris
0,1 M (Trizma base-Sigma-Aldrich)
en H_{2}O desionizada pH a 9 usando ácido acético glacial
(Sigma-Aldrich). El siguiente es el procedimiento
adaptado a partir del instrumento: el tejido recubierto de parafina
en el portaobjetos se calentó a 75ºC durante 4 minutos y se trató
dos veces con ajuste de volumen de EZPrep a 75ºC antes de la
aplicación del cubreobjetos líquido con ajuste de volumen de
EZPrep. Después de 4 minutos a 75ºC, el portaobjetos se aclaró y se
añadió un ajuste de volumen de desparafinización automatizada junto
con cubreobjetos líquido para desparafinar el tejido a 76ºC durante
4 minutos. El portaobjetos se enfrío a 40ºC y se aclaró tres veces
antes de la adición de anticuerpo Anti-CD20 (clon
L26, Ventana, Tucson, AZ) seguido de cubreobjetos líquido e
incubación a 40ºC durante 16 minutos. Después de aclarar el
portaobjetos, el tejido se trató con cóctel Universal Secondary
Antibody biotinilado (Ventana Medical Systems, Nº de componente
760-4205) para co-localizar biotina
con el anticuerpo Anti-CD20, seguido de cubreobjetos
líquido e incubación a 40ºC durante 8 minutos. El portaobjetos se
aclaró dos veces con tampón seguido de la aplicación de cubreobjetos
líquido y la adición de conjugado de AP-SA
(Sigma-Aldrich, 100 \mul, 0,14 mg/ml en tampón) e
incubación a 37ºC durante 16 minutos. El portaobjetos se aclaró con
tampón, se aplicó el cubreobjetos líquido y a esto le seguía la
adición de 100 \mul de una solución 1:1 de AuCl_{3}
(Sigma-Aldrich) (1,25 \mug/ml) y fosfato de ácido
ascórbico (Sigma-Aldrich) (0,05 M) en tampón. El
portaobjetos se incubó a 37ºC durante 20 minutos, se aclaró con
tampón y se recubrió con cubreobjetos líquido. Un total de 100
\mul de una solución 1:1 de acetato de plata
(Sigma-Aldrich) (0,05 M) y fosfato de ácido
ascórbico (0,05 M) se añadieron al portaobjetos, y el portaobjetos
se incubó durante 20 minutos a 37ºC. El portaobjetos se aclaró tres
veces con tampón y se trató con un lavado con detergente antes de
la deshidratación con etanol y xileno y la posterior aplicación de
un cubreobjetos al portaobjetos, después de lo cual el portaobjetos
se observó a través de un microscopio.
Como se muestra mediante las fotografías en
escala de grises en la figura 4, la tinción está presente en la
membrana plasmática y en regiones citoplasmáticas de células B
normales en amígdala normal. La intensidad de la tinción es
comparable a un control positivo (figura 5) detectado con el kit
Enhanced V-Red Detection Kit (Ventana,
Tucson, AZ).
Músculo esquelético incluido en parafina y
fijado con formalina se seccionó y se colocó en portaobjetos de
vidrio para microscopio óptico. Las secciones se desparafinaron en
un teñidor de portaobjetos Benchmark de Ventana Medical Systems.
Mientras permanecía en el Benchmark, la sección se trataba con
Proteasa 1 (Ventana) durante 4 minutos. Las secciones se incubaron a
continuación con anticuerpo monoclonal Anti-Desmina
(Ventana Nº de cat. 760-2513) durante 16 minutos a
37ºC. Después del lavado con Tampón de Reacción en el instrumento,
se incubó un anticuerpo anti-ratón de conejo durante
8 minutos a 37ºC. Las secciones se aclararon a continuación con
Tampón de Reacción y se incubaron con un anticuerpo
anti-conejo de ratón durante 8 minutos a 37ºC
(Amplification Kit, Ventana Nº de cat.
760-080). Seguidamente, las secciones se aclararon
con Tampón de Reacción y se incubaron con un cóctel de anticuerpos
secundarios biotinilados Universal Secondary Antibody
biotinilado (Ventana Medical Systems, Nº de componente
760-4205) durante 8 minutos a 37ºC. Las secciones se
aclararon y una solución de
estreptavidina-fosfatasa alcalina (Enhanced
SA-/ALK Phos/V Red Ventana Nº de cat. 253-2181)
se incubó durante 16 minutos a 37ºC. Las secciones se extrajeron
después del teñidor de portaobjetos Benchmark. Los portaobjetos se
lavaron después con H_{2}O desionizada y se incubaron con 500
\mul de 2,5 \mug/ml de tetrabromoaurato (III) de hidrógeno
hidrato (Aldrich Nº de cat. 44.212) durante 4 minutos a 37ºC. La
solución se aclaró con H_{2}O desionizada y 250 \mul de
AgNO_{3} 50 mM (Sigma Nº S-0139) en Tampón Tris
0,5 M a pH 9,0 y 250 \mul de fosfato de ácido ascórbico 100 mM
(Sigma A-8960) en un tampón DEA 0,5 M a pH 10,0 con
PVA al 5% (peso molecular medio 70.000 a 100.000 Sigma Nº
P-1763) se aplicaron a cada sección. Se dejó
incubar a los portaobjetos durante 20 minutos a 37ºC. Los
portaobjetos se aclararon con H_{2}O desionizada y se cubrieron
sin contra-colorante. Los resultados se muestran en
la figura 6.
Tejido cerebral incluido en parafina y fijado
con formalina se seccionó y se colocó en portaobjetos de vidrio
para microscopio óptico. Las secciones se desparafinaron en un
teñidor de portaobjetos Benchmark de Ventana. Las secciones se
incubaron después con anticuerpo policlonal Anti-S
100 (Ventana Nº de cat. 760-2523) durante 16
minutos a 37ºC. Seguidamente, las secciones se aclararon con Tampón
de Reacción y se incubaron con un cóctel de anticuerpos secundarios
biotinilados Universal Secondary Antibody biotinilado
(Ventana Medical Systems, Nº de componente
760-4205) durante 8 minutos a 37ºC. Las secciones se
aclararon y una solución de estreptavidina-fosfatasa
alcalina (Enhanced SA-/ALK Phos/V Red Ventana Nº de cat.
253-2181) se incubó durante 16 minutos a 37ºC. Las
secciones se extrajeron después del teñidor de portaobjetos
BenchMark. Los portaobjetos se lavaron después con H_{2}O
desionizada y se incubaron con 500 \mul de 2,5 \mug/ml de
tetrabromoaurato (III) de hidrógeno hidrato (Aldrich Nº 44.212)
durante 4 minutos a 37ºC. La solución se aclaró con H_{2}O
desionizada y 250 \mul de AgNO_{3} 50 mM (Sigma Nº
S-0139) en Tampón Tris 0,5 M a pH 9,0 y 250 \mul
de fosfato de ácido ascórbico 100 mM (Sigma A-8960)
en un tampón DEA 0,5 M a pH 10,0 con PVA al 5% (peso molecular
medio 70.000 a 100.000 Sigma Nº P-1763) se
aplicaron a cada sección. Se dejó incubar a los portaobjetos durante
20 minutos a 37ºC. Los portaobjetos se contratiñeron con Nuclear
Fast Red y se cubrieron. Los resultados se muestran en la
figura 7.
Músculo esquelético incluido en parafina y
fijado con formalina se seccionó y se colocó en portaobjetos de
vidrio para microscopio óptico. Las secciones se desparafinaron en
un teñidor de portaobjetos Benchmark de Ventana. Las secciones se
incubaron después con Control Negativo de Conejo (Ventana Nº de cat.
760-2023) durante 16 minutos a 37ºC. Seguidamente,
las secciones se aclararon con Tampón de Reacción y se incubaron con
un cóctel de anticuerpos secundarios biotinilados Universal
Secondary Antibody biotinilado (Ventana Medical Systems, Nº de
componente 760-4205) durante 8 minutos a 37ºC. Las
secciones se aclararon y una solución de
estreptavidina-fosfatasa alcalina (Enhanced
SA-/ALK Phos/V Red Ventana Nº de cat. 253-2181)
se incubó durante 16 minutos a 37ºC. Las secciones se extrajeron
después del teñidor de portaobjetos BenchMark. Los portaobjetos se
lavaron después con H_{2}O desionizada y se incubaron con 500
\mul de 2,5 \mug/ml de tetrabromoaurato (III) de hidrógeno
hidrato (Aldrich Nº 44.212) durante 4 minutos a 37ºC. La solución se
aclaró con H_{2}O desionizada y 250 \mul de AgNO_{3} 50 mM
(Sigma Nº S-0139) en Tampón Tris 0,5 M a pH 9,0 y
250 \mul de fosfato de ácido ascórbico 100 mM (Sigma
A-8960) en un tampón DEA 0,5 M a pH 10,0 con PVA al
5% (peso molecular medio 70.000 a 100.000 Sigma Nº
P-1763) se aplicaron a cada sección. Se dejó incubar
a los portaobjetos durante 20 minutos a 37ºC. Los portaobjetos se
contratiñeron con Nuclear Fast Red y se cubrieron. Los
resultados se muestran en la figura 8.
La tinción gris-negra observada
con la figura 7 en comparación con la falta de tinción
gris-negra observada con la figura 8 demuestra que
el patrón de tinción de la figura 7 es específico para el antígeno,
puesto que la figura 8 se realizó con Control Negativo de Conejo.
La figura 9 es el mismo caso de tejido cerebral realizado con
Anti-S100 pero detectado utilizando el kit
Enhanced V-Red Detection Kit de Ventana.
Obsérvese que el patrón de tinción es el mismo que el descubierto
en la figura 7.
Este ejemplo muestra que la amplificación
química de la señal de plata puede usarse para amplificar la plata
depositada original en función de la reducción mediante ascorbato.
Músculo esquelético incluido en parafina y fijado con formalina se
seccionó y se colocó en portaobjetos de vidrio para microscopio
óptico. Las secciones se desparafinaron en un teñidor de
portaobjetos BenchMark de Ventana. Mientras permanecía en el
BenchMark, la sección se trataba con Proteasa 1 (Ventana) durante 4
minutos. Las secciones se incubaron a continuación con anticuerpo
monoclonal Anti-Desmina (Ventana Nº de cat.
760-2513) durante 16 minutos a 37ºC. Después del
lavado con Tampón de Reacción en el instrumento, se incubó un
anticuerpo anti-ratón de conejo durante 8 minutos a
37ºC. Las secciones se aclararon a continuación con Tampón de
Reacción y se incubaron con un anticuerpo
anti-conejo de ratón durante 8 minutos a 37ºC
(Amplification Kit, Ventana Nº de cat.
760-080). Seguidamente, las secciones se aclararon
con Tampón de Reacción y se incubaron con un cóctel de anticuerpos
secundarios biotinilados Universal Secondary Antibody
biotinilado (Ventana Medical Systems, Nº de componente
760-4205) durante 8 minutos a 37ºC. Las secciones
se aclararon y una solución de
estreptavidina-fosfatasa alcalina (Enhanced
SA-/ALK Phos/V Red Ventana Nº de cat. 253-2181)
se incubó durante 16 minutos a 37ºC. Las secciones se extrajeron
después del teñidor de portaobjetos BenchMark. Los portaobjetos se
lavaron después con H_{2}O desionizada y se incubaron con 500
\mul de 2,5 \mug/ml de tetrabromoaurato (III) de hidrógeno
hidrato (Aldrich Nº 44.212) durante 4 minutos a 37ºC. La solución
se aclaró con H_{2}O desionizada y 250 \mul de AgNO_{3} 50 mM
(Sigma Nº S-0139) en Tampón Tris 0,5 M a pH 9,0 y
250 \mul de fosfato de ácido ascórbico 100 mM (Sigma
A-8960) en un tampón DEA 0,5 M a pH 10,0 con PVA al
5% (peso molecular medio 70.000 a 100.000 Sigma Nº
P-1763) se aplicaron a cada sección. Se dejó
incubar a los portaobjetos durante 10 minutos a 37ºC. Los
portaobjetos se aclararon con H_{2}O desionizada. La señal se
amplificó después incubando durante 10 minutos a 37ºC en una
solución de 4-metil aminofenol 25 mM (Aldrich Nº
129720), AgNO_{3} 12 mM en un Tampón Citrato 0,1 M a pH 3,8. La
figura 10 demuestra la señal con la amplificación en comparación con
el ejemplo 9 (figura 11), que es sin amplificación no enzimática
alguna.
Músculo esquelético incluido en parafina y
fijado con formalina se seccionó y se colocó en portaobjetos de
vidrio para microscopio óptico. Las secciones se desparafinaron en
un teñidor de portaobjetos BenchMark de Ventana Medical Systems.
Mientras permanecía en el BenchMark, la sección se trataba con
Proteasa 1 durante 4 minutos. Las secciones se incubaron a
continuación con anticuerpo monoclonal Anti-Desmina
durante 16 minutos a 37ºC. Después del lavado con Tampón de
Reacción, en el instrumento, se incubó un anticuerpo
anti-ratón de conejo durante 8 minutos a 37ºC. Las
secciones se aclararon a continuación con Tampón de Reacción y se
incubaron con un anticuerpo anti-conejo de ratón
durante 8 minutos a 37ºC. Seguidamente, las secciones se aclararon
con Tampón de Reacción y se incubaron con un cóctel de anticuerpos
secundarios biotinilados. Las secciones se aclararon y una solución
de estreptavidina-fosfatasa alcalina se incubó
durante 16 minutos. Las secciones se extrajeron después del teñidor
automatizado de portaobjetos Benchmark. Los portaobjetos se lavaron
después con H_{2}O desionizada y se incubaron con 500 \mul de
2,5 \mug/ml de tetrabromoaurato (III) de hidrógeno hidrato
durante 4 minutos a 37ºC. La solución se aclaró con H_{2}O
desionizada y 250 \mul de AgNO_{3} 50 mM en Tampón Tris 0,5 M a
pH 9,0 y 250 \mul de fosfato de ácido ascórbico 100 mM en un
tampón DEA 0,5 M a pH 10,0 con PVA al 5% (peso molecular medio
70.000 a 100.000) se aplicaron a cada sección. Se dejó incubar a
los portaobjetos durante 10 minutos a 37ºC. Los portaobjetos se
aclararon con H_{2}O desionizada. La figura 11 demuestra la señal
sin la amplificación en comparación con el ejemplo 8 (figura
10).
Se hizo reaccionar hidroquinona con dos
equivalentes de oxicloruro de fósforo y dos equivalentes de piridina
anhidra en tolueno anhidro (a 0,1 M) durante 30 minutos. La mezcla
se llevó a la temperatura de reflujo durante 30 minutos adicionales
y se dejó enfriar a temperatura ambiente. El cloruro de piridinio se
retiró por filtración a través de un filtro de tierra de diatomeas
y se aclaró con un pequeño volumen de tolueno seco. El filtrado se
concentró al vacío a 40ºC y el residuo se hidrolizó con carbonato de
amonio acuoso a pH 7. El producto se purificó mediante separación
en fase inversa en columna de gel de sílice C18
ultra-rápida para dar el producto deseado como se
demuestra mediante Espectrometría de Masas (MS), ^{1}H y
^{13}C-RMN.
Se realiza el procedimiento del ejemplo 10 con
la excepción del uso de antrahidroquinona o naftohidroquinona como
materiales de partida.
POCl_{3} (89,5 mmoles) se transfirió a un
matraz de fondo redondo de 500 ml seco en una atmósfera de
nitrógeno. Una solución de sesamol (35,8 mmoles, 1 eq.) y
trietilamina (71,7 mmoles) en 200 ml de diclorometano seco se
añadió gota a gota durante cuatro horas a la solución de POCl_{3}.
Después de agitar a temperatura ambiente durante una noche, el
disolvente se retiró mediante evaporación rotatoria. El residuo se
disolvió en 100 ml de diclorometano y las sales se retiraron
filtrando a través de Celite. El producto se separó en agua
enfriando rápidamente con 100 ml de carbonato de amonio saturado.
La capa orgánica se desechó y la fase acuosa se secó mediante
evaporación rotatoria para dar 8,2 gramos (rendimiento del 90%) del
fosfato deseado. La identidad del producto se confirmó mediante MS,
y el análisis mediante HPLC a 214 nm mostraba que el producto era
puro a más del 99%.
Se realiza el procedimiento del ejemplo 12 con
la excepción del uso de eugenol o PMCP
(2,2,5,7,8-pentametil-6-cromanol)
como materiales de partida.
Claims (19)
1. Un método de detección in situ de un
epítopo inmunohistoquímico o una secuencia de ácido nucleico de
interés en una muestra biológica, que comprende unir una molécula
conjugada marcada con una enzima al epítopo o secuencia de interés
en presencia de una especie reductora sin actividad redox y un ión
metálico soluble,
en el que dicha especie reductora sin actividad
redox es un sustrato para dicha molécula conjugada marcada con una
enzima y
en el que dicha enzima de dicha molécula
conjugada marcada con una enzima cataliza la transformación de la
especie reductora sin actividad redox en un agente reductor,
reduciendo de este modo el ión metálico a partículas metálicas
insolubles en estado de oxidación 0, en o alrededor del punto en el
que se ancla la enzima.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dicha molécula conjugada marcada con una enzima comprende
un anticuerpo, avidina, estreptavidina o una secuencia de
nucleótidos.
3. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicha enzima se selecciona
entre el grupo constituido por fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida,
alfa- y beta-galactosidasas, alfa- y
beta-glucosidasas, esterasas en general y
beta-lactamasas.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha especie reductora sin
actividad redox se selecciona entre el grupo constituido por mono- y
di-fosfatos de hidroquinona, mono- y
di-fosfatos de naftohidroquinona, mono- y
di-fosfatos de antrahidroquinona, fosfato de
sesamol, fosfato de eugenol y fosfato de
alfa-tocoferol o un derivado de los mismos.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 3,
en el que dicha enzima es fosfatasa alcalina y dicho sustrato se
selecciona entre el grupo constituido por fosfato de ácido ascórbico
y un derivado de fosfato de hidroquinona.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho metal se selecciona
entre el grupo constituido por plata y oro.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en el que la etapa de
pre-tratamiento de la muestra biológica con oro se
realiza antes de la reducción de plata metálica.
8. Un kit para detectar un biomarcador de
interés en una muestra biológica, que comprende uno o más
\hbox{recipiente(s),} comprendiendo
el(los) recipiente(s) una molécula conjugada marcada
con una enzima, una especie reductora sin actividad redox y un ión
metálico soluble,en el que dicha especie reductora sin actividad
redox es un sustrato para dicha enzima, y
en el que dicha enzima de dicha molécula
conjugada marcada con una enzima cataliza la transformación de la
especie reductora sin actividad redox en un agente reductor,
reduciendo de este modo el ión metálico a partículas metálicas
insolubles en estado de oxidación 0, en o alrededor del punto en el
que se ancla la enzima.
9. El kit de acuerdo con la reivindicación 8, en
el que dicha molécula conjugada marcada con una enzima se
selecciona entre el grupo constituido por un anticuerpo o una
secuencia de oligonucleótidos.
10. El kit de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 8 ó 9, en el que dicha enzima es una fosfatasa.
11. El kit de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, en el que dicha especie reductora sin
actividad redox es fosfato de ácido ascórbico.
12. Un método de tinción in situ de una
muestra biológica que tiene un epítopo o una secuencia de
nucleótidos de interés, que comprende las etapas de:
- a)
- poner en contacto a dicha muestra biológica con una molécula conjugada que tiene un hapteno;
- b)
- poner en contacto a dicho hapteno con una molécula conjugada marcada con una enzima, molécula conjugada marcada con una enzima que es un socio de unión al hapteno; y
- c)
- poner en contacto a dicha muestra biológica con una especie reductora sin actividad redox que es un sustrato para dicha marca enzimática en presencia de un ión metálico soluble,
en el que dicha enzima de dicha
molécula conjugada marcada con una enzima cataliza la transformación
de la especie reductora sin actividad redox en un agente reductor,
reduciendo de este modo el ión metálico a partículas metálicas
insolubles en estado de oxidación 0, en o alrededor del punto en el
que se ancla la
enzima.
13. El método de acuerdo con la reivindicación
12, en el que la molécula conjugada de la etapa a) se selecciona
entre el grupo constituido por anticuerpos, secuencias de
nucleótidos y socios de afinidad.
14. El método de acuerdo con la reivindicación
12 ó 13, en el que dicho hapteno se selecciona entre el grupo
constituido por fluoresceína, biotina, digoxigenina y
dinitrofenol.
15. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 12 a 14, en el que dicha enzima es una
fosfatasa.
16. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 12 a 15, en el que dicha especie reductora sin
actividad redox se selecciona entre el grupo constituido por mono- y
di-fosfatos de hidroquinona, mono- y
di-fosfatos de naftohidroquinona, mono- y
di-fosfatos de antrahidroquinona, fosfato de
sesamol, fosfato de eugenol y fosfato de
alfa-tocoferol o un derivado de los mismos.
17. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 12 a 16, en el que dicho metal se selecciona
entre el grupo constituido por plata y oro.
18. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 12 a 16, en el que la etapa de
pre-tratamiento de la muestra biológica con oro se
realiza antes de la reducción de plata metálica.
19. El método de acuerdo con la reivindicación
12, en el que la molécula conjugada que tiene un hapteno en la etapa
a) es un anticuerpo primario biotinilado, la molécula conjugada
marcada con una enzima en la etapa b) es
estreptavidina-fosfatasa alcalina, y la especie
reductora sin actividad redox en la etapa c) es fosfato de ácido
ascórbico en presencia de ión plata a un pH mayor de 7.
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