ES2330465T3 - Procedimiento para realizar un inmunoensayo desnaturalizante. - Google Patents
Procedimiento para realizar un inmunoensayo desnaturalizante. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2330465T3 ES2330465T3 ES06101298T ES06101298T ES2330465T3 ES 2330465 T3 ES2330465 T3 ES 2330465T3 ES 06101298 T ES06101298 T ES 06101298T ES 06101298 T ES06101298 T ES 06101298T ES 2330465 T3 ES2330465 T3 ES 2330465T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- sample
- samples
- denaturing
- minutes
- period
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
Abstract
Un procedimiento para ejecutar un inmunoensayo desnaturalizante de uno o más analitos en disolución comprendiendo las etapas de i) solubilizar una muestra corporal obtenida de un sujeto mamífero en un medio de muestra que comprende SDS de 0,1% a 1% como agente desnaturalizante; ii) calentar posteriormente el medio de muestra que contiene dicha muestra hasta una temperatura superior a 70ºC durante un periodo de tiempo; iii) almacenar la muestra en el medio de muestra, y iv) ejecutar un inmunoensayo sobre dicha muestra en el medio de muestra, en el que la etapa del antígeno de captura se realiza directamente a partir de dicho medio de muestra que contiene el analito y el SDS 0,1%-1%.
Description
Procedimiento para realizar un inmunoensayo
desnaturalizante.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de inmunoensayo desnaturalizante de proteínas en
disolución, El procedimiento comprende las etapas de solubilizar
una muestra corporal obtenida de un sujeto mamífero en un medio de
muestra que comprende del 0,1% al 1% de SDS como agente
desnaturalizante; ii) posteriormente calentar dicho medio de
muestra que contiene una muestra hasta una temperatura superior a
al menos 70ºC durante un periodo de tiempo; iii) almacenar los uno
o más analitos calentados en el medio de muestra; y iv) llevar a
cabo un inmunoensayo desnaturalizante, en el que la etapa de
captura de antígeno se lleva a cabo en el medio de muestra que
contiene el uno o más analitos y de 0,1 a 1% de SDS.
En el diagnóstico médico una etapa crucial con
influencia en los resultados de un procedimiento diagnóstico
aplicado es el almacenamiento y trasporte de la muestra. Esto es
especialmente cierto debido al hecho de que los analitos a detectar
en una muestra corporal pueden estar sometidos a degradación o a
otro tipo de influencias durante el trasporte y almacenamiento. Con
el fin de asegurar una determinación precisa de los analitos
relevantes para el diagnóstico, se debe mantener la integridad de
dichos analitos en las muestras hasta la realización del
análisis.
En la técnica, una solución para superar los
problemas de estabilidad de los analitos busca evitar cualquier
trasporte y almacenamiento de las muestras implementando puntos
para sistemas de ensayos cuidadosos que permitan el análisis de
muestras corporales directamente en el sitio dónde se presta
atención al paciente, en dónde se ha obtenido la muestra. Sin
embargo, estas soluciones se ven limitadas respectivamente por las
tecnologías analíticas a utilizar. En el caso de procedimientos
analíticos complejos que necesiten instrumental de laboratorio, se
deben encontrar formas que permitan el transporte y almacenamiento
de las muestras sin interferencias sobre la integridad de los
analitos.
Una forma de permitir el trasporte de muestras
corporales es conservar las células contenidas en las muestras y
permitir de esta forma el examen citológico o histológico basado en
células de la muestra material. Ejemplos de disoluciones de
conservación para exámenes citológicos comprenden el Medio
Universal de Recogida de Digene (documento WO9931273), la
Disolución PreservCyt® de Cytyc® (documento EP0511930), o la
disolución Surepath® Cytorich®. Estos medios están diseñados para
conservar tanto la morfología coma la integridad de las proteínas
celulares para permitir el examen citológico de las muestras
celulares conservadas. Todas estas disoluciones de conservación
comprenden alcoholes como fijadores. Hablando en general, la
conservación de los analitos en dichos procedimientos se consigue
por adición de sustancias químicas conservantes. En los casos en
los que la integridad celular deja de ser necesaria para el
procedimiento de diagnóstico, la integridad de los analitos en
disolución puede conseguirse de forma análoga por adición de
sustancias químicas conservantes. La desventaja principal de esta
solución es que los conservantes son a menudos sustancias tóxicas
que perjudican a los laborantes y pueden dañar el medio ambiente en
caso de vertido. Adicionalmente, las necesidades de eliminación de
residuos, así como el coste de dicha eliminación de residuos
aumentan cuando se usan aditivos químicos para la estabilización de
muestras.
Una solución adicional para resolver el problema
de la estabilidad de analitos en muestras corporales es la
refrigeración o congelación de las muestras corporales durante el
transporte y almacenamiento. Se sabe que las sustancias biológicas
se pueden conservar mediante refrigeración durante un cierto
periodo de tiempo, y que i se puede aplicar la congelación de
material biológico por debajo de -20ºC para la conservación en
almacenamientos a largo plazo. Esta solución, sin embargo, presenta
la desventaja del consumo de energía y representa un inconveniente
para el transporte. No siempre se puede asegurar durante el
transporte el mantenimiento de la refrigeración o las temperaturas
inferiores a -20ºC. Esto se convierte en un problema grave en los
casos en los que la estabilidad de un analito no se ha demostrado
bajo determinadas condiciones de temperatura. Por tanto, el
procedimiento de la presente invención implica una etapa de
calentamiento que proporciona una manera sencilla para estabilizar
muestras para transporte y almacenamiento sin la necesidad de
añadir conservantes o necesitar refrigeración.
El documento EP 0 185 870 enseña un
procedimiento para llevar a cabo un inmunoensayo desnaturalizante,
en el que se usa docecilsulfato de sodio como agente
desnaturalizante. El documento también enseña combinaciones de
agentes desnaturalizantes y calefacción de disoluciones de la
muestra durante la etapa de desnaturalización.
Adicionalmente, si la etapa de calentamiento se
lleva a cabo en un medio que comprende agentes desnaturalizantes
puede contribuir a la reproducibilidad y precisión de las etapas
analíticas posteriores. Si la etapa de calentamiento se lleva a
cabo por ejemplo en presencia de docecilsulfato de sodio que
interactúa con las proteínas de la muestra respectiva, se obtiene
una estructura desnaturalizada de las proteínas. Esta estructura
desnaturalizada puede en algunos casos ser una ventaja para una
determinación reproducible y cuantitativa de las proteínas en
disolución.
En la técnica, se usan procedimientos de
bioensayo para desnaturalizar proteínas en el caso del Sistema
Laemmli en la electroforesis en gel de poliacrilamida con
desnaturalización en presencia de SDS (conocido como SDS PAGE). En
este caso, las muestras que contienen proteínas también se
calientan en presencia de SDS para permitir la desnaturalización de
las proteínas y posteriormente se separan por tamaños en una etapa
electroforética. El objetivo de la desnaturalización en este
procedimiento es la desnaturalizar la proteína para permitir una
linealización completa de las proteínas junto con la carga
homogénea de las proteínas con iones SDS. Esto asegura que las
proteínas, a diferencia de sus formas nativas, muestran una carga
eléctrica que es proporcional al tamaño global de las moléculas. El
procedimiento global permite la separación de las moléculas por
tamaños.
La presente invención se basa en los hallazgos
del inventor de que se pueden estabilizar analitos en muestras
corporales solubilizadas calentando la disolución de la muestra
durante un periodo de tiempo determinado permitiendo de esta manera
el uso directo de la muestra en el inmunoensayo. Según la presente
invención el calentamiento puede por ejemplo llevarse a cabo en un
medio de muestra adecuado. El procedimiento según la presente
invención supera los inconvenientes de los procedimientos conocidos
en la técnica. El procedimiento encontrado por los inventores no
utiliza conservantes químicos que puedan perjudicar a los
animales, a los seres humanos o al medio ambiente, y no impone la
necesidad de refrigeración o mantenimiento de otras condiciones
consumidoras de energía en el procedimiento global de transporte y
almacenamiento.
El efecto de la desnaturalización de las
proteínas durante la etapa de calentamiento permite una
determinación precisa de las proteínas contenidas en las muestras
usando los bioensayos desnaturalizantes. A diferencia de los
procedimientos conocidos en la técnica el inmunoensayo
desnaturalizante es detección inmunoquímica directamente desde la
disolución de la muestra empleando una sonda de detección fijada en
fase sólida que se une de manera específica a la proteína
contenida en la muestra. En el procedimiento global no está
necesariamente comprendida una etapa electroforética. El objetivo y
efecto de la desnaturalización en el contexto de este procedimiento
no se debe por tanto a la generación de una carga eléctrica
homogénea dependiente del tamaño de las proteínas, sino que en
parte se debe a la linealización y por tanto a la accesibilidad
mejorada de los epitopos antigénicos contenidos en las
proteínas.
La presente invención se basa en los hallazgos
de los inventores mostrados en la siguiente memoria descriptiva de
la invención y ejemplificados en los ejemplos proporcionados en el
presente documento de que los analitos en disoluciones de muestras
corporales que se habían desnaturalizado por tratamiento con SDS
pueden someterse directamente a inmunoensayo sin dilución
posterior.
Un aspecto de la presente invención es un
procedimiento para inmunoensayo desnaturalizante de proteínas en
disolución, en el que al menos una etapa del inmunoensayo se lleva
a cabo en presencia del agente desnaturalizante en una
concentración que permite mantener el estado desnaturalizado de una
analito.
Figura
1
Representación gráfica de los niveles de
pl61NK4a determinados en muestras procedentes de cérvix de útero
humano usando un ELISA. Las muestras cervicales se i solubilizaron
en un medio de muestra y posteriormente se incubaron durante varios
días a temperatura ambiente. Se tomaron alícuotas de cada muestra
para determinación de los niveles de p16^{INK4a} en el día 1
(inmediatamente tras el tratamiento térmico), día 2, día 3 y día 7.
El gráfico 1 muestra los niveles de p16^{INK4a} determinados en 7
muestras en diferentes momentos temporales y muestra por tanto la
inestabilidad de p16^{INK4a} contenida en las muestras del
paciente en particular bajo las condiciones dadas. Para detalles
adicionales, véase el Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
2
Representación gráfica de los niveles de
p16^{INK4a} determinados en muestras procedentes de cérvix de
útero humano usando un ELISA. Las muestras cervicales
solubilizaron en un medio de muestra, se trataron térmicamente en
un baño de agua durante 15 min a 95ºC y posteriormente se incubaron
durante varios días a temperatura ambiente. Se tomaron alícuotas de
cada muestra para determinación de los niveles de p16^{INK4a} en
el día 1 (inmediatamente tras el tratamiento térmico), día 2, día
5 y día 8. El gráfico muestra los niveles de p16^{INK4a}
determinados en muestras de 11 pacientes distintos y muestra la
estabilidad de p16^{INK4a} tras el tratamiento térmico. Para
detalles adicionales, véase el
Ejemplo 1.
Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
3
Representación gráfica de las concentraciones de
p16^{INK4a} determinadas en muestras procedentes de cérvix de
útero humano usando un ELISA. Se incubaron 14 muestras cervicales
diferentes hasta 45 min por encima de 95ºC, Se tomaron 4 alícuotas
consecutivas tras 15 min, 25 min, 35 min y 45 min desde el inicio
del tratamiento térmico, Las concentraciones de p16^{INK4a} se
determinaron por duplicado a i partir de cada alícuota por separado,
usando el ELISA de p16^{INK4a}, Se muestran tanto la
concentración promedio, incluyendo las barras de error de 7
determinaciones como el coeficiente de variación entre 4
determinaciones. Para detalles adicionales, véase el Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
4
Representación gráfica de los niveles de
p16^{INK4a} determinados en muestras procedentes de cérvix de
útero humano usando un ELISA. Una combinación mezclada de varias
muestras que dieron positivo para p16^{INKa} se dividió en 4
alícuotas que bien se dejaron sin tratamiento o bien se incubaron
durante 10 min a 80ºC, 90ºC, 99ºC, respectivamente. Se tomaron
alícuotas el día 1 (inmediatamente tras el tratamiento térmico),
día 3, día 6 y día 8. Para detalles adicionales, véase el Ejemplo
1.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
5
Representación gráfica de los niveles de
gCatenina determinados en muestras procedentes de cérvix de útero
humano usando un ELISA, 3 muestras cervicales se solubilizaron en
medio de muestra inmediatamente tras la obtención de las muestras y
posteriormente se incubaron durante varios días a temperatura
ambiente. Se tomaron alícuotas en el día 1 (inmediatamente tras el
tratamiento térmico), día 2, día 5 y día 6. Se representan
gráficamente los niveles de gCatenina determinados en cada muestra
usando un ELISA. Para detalles adicionales, véase el Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
6
Representación gráfica de los niveles de
gCatenina determinados en muestras procedentes de cérvix de útero
humano usando un ELISA. Se solubilizaron 7 muestras cervicales en
medio de muestra inmediatamente tras la obtención de las muestras,
se trataron térmicamente en un baño de agua durante 15 min a 95ºC y
posteriormente se incubaron durante varios días a temperatura
ambiente. Se tomaron alícuotas en el día 1 (inmediatamente tras el
tratamiento térmico), día 2, día 4, día 8, día 10 y día 15. Para
detalles adicionales, véase el Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
7
Representación gráfica de los niveles de
Ep-CAM determinados en muestras procedentes de
cérvix de útero humano usando un ELISA. Se solubilizaron 6 muestras
cervicales en medio de muestra inmediatamente tras la obtención de
las muestras, y posteriormente se incubaron durante varios días a
temperatura ambiente. Se tomaron alícuotas en el día 1
(inmediatamente tras el tratamiento térmico), día 3, día 5 y día 7.
Para detalles adicionales, véase el Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
8
Representación gráfica de los niveles de
Ep-CAM determinados en muestras procedentes de
cérvix de útero humano usando un ELISA. Se solubilizaron 7 muestras
cervicales en medio de muestra inmediatamente tras la obtención de
las muestras, se trataron térmicamente en un baño de agua durante
15 min a 95ºC y posteriormente se incubaron durante varios días a
temperatura ambiente. Se tomaron alícuotas en el día 1
(inmediatamente tras el tratamiento térmico), día 2, día 5 y día 6.
Para detalles adicionales, véase el Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
9
Representación de los niveles de p16^{INK4a}
medidos en un ELISA procedente de muestras que contienen Triton
X100 al 3% y SDS al 0,5%. Se aplicó a muestras con anormalidades
en el epitelio del cérvix uterino informadas citológicamente. El
gráfico muestra la DO medida en el ELISA correlacionada con el
diagnóstico citológico disponible. Para detalles adicionales, véase
el Ejemplo 1a.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
10
Representación gráfica de los niveles de
p16^{INK4a} determinados en muestras procedentes de cérvix de
útero humano usando los inmunoensayos ELISA y LIA. Los
inmunoensayos se llevaron a cabo en presencia de SDS al 0,3% para
ambos tipos de ensayos. 12 muestras cervicales se solubilizaron
inmediatamente en medio de muestra que comprendía SDS al 0,3%. Las
muestras contendidas en el medio de muestra se aplicaron
directamente al inmunoensayo. Ambos tipos de inmunoensayo
demostraron la detección niveles de proteína p16^{INK4a} en
presencia de una concentración elevada de SDS. Para detalles
adicionales, véase el Ejemplo 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
11
Tabla que representa los datos obtenidos en
especímenes citológicos e histológicos procedentes de pacientes en
correlación con la representación de los resultados obtenidos
cuando se aplica la disolución de muestra que comprende SDS al 0,3%
y Triton X100 al 1% directamente a la tira reactiva de flujo
lateral. Puede verse que en el formato de ensayo de tira reactiva
puede detectarse la correspondencia entre p16^{INK4a} y varias
lesiones displasias en pacientes por la generación de una banda
específica. Esto demuestra que el formato de tira reactiva se puede
aplicar según la presente invención en presencia de agentes
desnaturalizantes. Para detalles adicionales, véase el Ejemplo
3.
Los procedimientos de examen médico van
acompañados o apoyados por lo general en el ensayo de analitos
contenidos en muestras corporales. Dichos analitos pueden por
ejemplo ensayarse mediante procedimientos químicos en un
laboratorio clínico.
La expresión analito tal como se usa en el
contexto de la presente invención se referirá a moléculas que se
pueden detectar en el transcurso de un procedimiento de ensayo
analítico. En algunas realizaciones de la presente invención los
analitos son por ejemplo ácidos nucleicos así como moléculas de
(poli)péptido. Dichos analitos comprenden por tanto por
ejemplo ARN (ARNm, ARNhn, etc.), ADN (ADNc, ADN genómico, etc.),
proteínas, polipéptidos, proteoglicanos, glicoproteínas y los
respectivos fragmentos de estas moléculas.
En algunas realizaciones de la presente
invención los analitos son moléculas de especial relevancia para la
detección de enfermedades en mamíferos. Enfermedades según la
presente invención pueden comprenden cualquier tipo de dolencias
médicamente relevantes que comprenden, pero que no se limitan a
dolencias neoplásicas, inflamatorias, infecciosas, degenerativas,
genéticas, proliferativas y vasculares así como dolencias
cancerosas premalignas y malignas. En algunas realizaciones de la
invención las dolencias cancerosas premalignas y malignas pueden
comprender trastornos neoplásicos como tumores. Los tumores pueden
comprender tumores de cabeza y cuello, tumores del tracto
respiratorio, tumores del tracto anogenital, tumores del tracto
gastrointestinal, tumores del sistema urinario, tumores del sistema
reproductor, tumores del sistema endocrino, tumores del sistema
central y periférico, tumores de la piel y sus apéndices, tumores
de los tejidos blandos y huesos, tumores del sistema linfopoyético
y hematopoyético. Los tumores pueden comprender por ejemplo
neoplasmas tales como tumores benignos y malignos, carcinomas,
sarcomas, leucemias, linfomas o displasias. En una realización
particular, el tumor es por ejemplo cáncer de la cabeza y el
cuello, cáncer del tracto respiratorio, cáncer del tracto
anogenital, cáncer del tracto gastrointestinal, cáncer del sistema
urinario, cáncer del sistema reproductor, cáncer del sistema
endocrino, cáncer del sistema central y periférico, cáncer de la
piel y sus apéndices, cáncer de los tejidos blandos y huesos,
cáncer del sistema linfopoyético y hematopoyético.
Los tumores del tracto anogenital pueden
comprender cáncer de la piel perineal y escrotal, cáncer cervical,
cáncer de la vulva, cáncer de la vagina, cáncer del pene, cáncer
del ano, etc. El cáncer cervical puede comprender lesiones
escamosas, lesiones glandulares u otros tumores epiteliales. Las
lesiones escamosas comprenden, por ejemplo, neoplasias cervicales
intraepiteliales (displasia leve, moderada y grave), carcinoma
in-situ, carcinoma de células escamosas (por
ejemplo, queratinizante, no queratinizante, verrucoso, verrugoso,
papilar, tipo linfoepitelioma). Las lesiones glandulares pueden
comprender hiperplasias atípicas, adenocarcinoma
in-situ, adenocarcinoma (tal como, por
ejemplo, mucinoso, endometroide, de células trasparentes, adenoma
maligno, papilar, adenocarcinoma seroso o mesonéfrico). Otros
tumores epiteliales pueden comprender carcinoma adenoescamoso,
carcinoma con células tipo vidrio esmerilado, carcinoma adenoide
quístico, carcinoma adenoide basal, tumor carcinoide, carcinoma de
células pequeñas y carcinoma no diferenciado. Para una información
más detallada, consultar "Kurman, R., Norris, H., y col., Tumors
of the Cervix, Vagina, and Vulva, Atlas of Tumor Pathology, 1992,
AFIP", cuyo contenido se incorporaría al presente documento por
referencia.
Los tumores gastrointestinales pueden comprender
cáncer de colon, cáncer del colon ascendente, del colon
descendente, del colon transversal, del sigmoideo, del recto,
cáncer del intestino delgado, cáncer del yeyuno, cáncer del
duodeno, cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer de hígado,
cáncer de la vesícula, cáncer del sistema biliar, cáncer
pancreático, etc. Una revisión comprehensiva de las lesiones
gastrointestinales se proporciona en "Hamilton Sr, Aaltonen LA
(Eds.): World Health Organization Classification of Tumors,
Pathology and Genetics of Tumors of the Digestive System, IARC
Press: Lyon 2000", que se incorporaría al presente documento por
referencia.
Los tumores del tracto respiratorio pueden
comprender cualquier dolencia maligna del tracto respiratorio tales
como, por ejemplo, cáncer de pulmón, los alvéolos, los bronquiolos,
el árbol bronquial y el bronquio, el espacio nasofaríngeo, la
cavidad oral, la faringe, la cavidad nasal y el seno paranasal,
Cáncer de pulmón tal como cáncer de pulmón de células pequeñas,
cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de pulmón de
células escamosas, carcinoma de pulmón de células pequeñas,
adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células grandes,
carcinoma de pulmón adenoescamoso, tumor carcinoide del pulmón,
tumor del mesotelioma de la glándula bronquial (malignante). Una
revisión de los tumores del tracto respiratorio se puede encontrar
en Colby TV, y col.: Tumors of the Lower Respiratory Tract, Atlas of
Tumor Pathology, Serie Tercera, Fascículo 13, AFIP: Washington
1995'', que se incorporaría al presente documento por
referencia.
Los tumores del sistema urinario pueden
comprender cáncer de vejiga, cáncer de riñón, de la pelvis renal,
cáncer de los uréteres y cáncer de la uretra, etc. Los tumores del
sistema reproductor pueden comprender cáncer y etapas precursoras
del mismo en ovarios, útero, testículo, próstata, epidídimo,
etc.
Las moléculas de especial relevancia para la
enfermedad que se pueden usara como analitos según la presente
invención pueden ser moléculas que se pueden usar para la detección
de la presencia o ausencia de dicha enfermedad. Las moléculas
pueden ser indicadoras de la presencia o ausencia de de la
enfermedad de diferentes maneras. Dichas maneras pueden comprender
niveles de expresión alterados (por ejemplo disminuidos,
aumentados, alterados local o temporalmente) así como expresión de
moléculas con características alteradas. Dichas características
alteradas pueden comprender cualquier tipo de moléculas
modificadas. Dichas modificaciones comprenden modificaciones de la
secuencia de las moléculas (tales como mutaciones, delecciones,
inserciones, etc.) así como otro tipo de modificaciones de las
moléculas (tales como por ejemplo modificaciones químicas,
fosforilaciones, glicosilaciones, derivatización, defosforilación
etc.).
En algunas realizaciones de la presente
invención los analitos pueden por ejemplo ser moléculas marcadoras
del cáncer o marcadores tumorales. Los analitos se pueden
seleccionar entre un grupo que comprende marcadores de la
proliferación celular, marcadores característicos de la apoptosis,
marcadores de epitopos de la superficie celular, marcadores
asociados con una infección vírica o actividad vírica en células
(por ejemplo marcadores de la infección por el virus del papiloma
humano de alto riesgo seleccionados entre un grupo que comprende
HPV16, HPV18, HPV31, HPV 33, HPV35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 52,
HPV56, HPV 58, HPV 59, HPV 66 y HPV 68), marcadores
característicos de la diferenciación celular etc. En algunas
realizaciones preferidas los analitos son inhibidores de la quinasa
dependiente de ciclina.
Los analitos pueden por ejemplo comprender
moléculas derivadas de proteínas seleccionadas entre un grupo que
comprende p13.5, p14, p15, p16 (también denominada como
p16^{INK4a}), p19, p21, p27, p53, pRb, p14ARF, ciclina A, ciclina
B, ciclina E, MDM-2, CDC2, Id1, osteopontina, GRP,
dipeptidasa renal, her2/neu, receptor de TGFbII, Citoqueratinas,
(por ejemplo citoqueratina 8, citoqueratina 10, citoqueratina 18),
antígenos de mucina (MUC1, MUC2, Tn, STn), EpCAM y gCatenina,
receptor de concanavalina A, GalNac-transferasa,
oligosacariltransferasa, lectinas (ConA, WGA, PNA, UEA I, DBA, SBA,
SNA), placofilina, vimentina, antígenos CD (por ejemplo CD3, CD16,
CD18, CD4, CD8, CD56, CD19, CD20), marcadores asociados a HPV por
ejemplo derivados de los genes de HPV L1, L2, E1, E2, E4, E5, E6 o
E7, CDC6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, proteína quinasa
CDC7, Dbf4, proteína fosfatasa CDC14, CDC45 y MCM10, Ki67,
Ki-S2, PCNA, una helicasa, una topoisomerasa,
Topo2alpha, factores de transcripción, miembros de la familia de
E2F, Brn-3a, Brn-3b o POLD etc.
Los analitos pueden ser moléculas que se han
detectado en forma cualitativa, semicuantitativa e igualmente
cuantitativa. Un valor cuantitativo puede por ejemplo representarse
en términos de una concentración. Un valor semicuantitativo se
puede expresar en términos de una escala de niveles, por ejemplo
niveles indetectables, niveles bajos, niveles intermedios, niveles
elevados, o de cualquier otro modo adecuado. El nivel de analito se
puede también representar en términos de un parámetro dependiente
tal como la intensidad de una señal generada en un formato de
ensayo en respuesta a la presencia de una molécula marcadora. Para
la expresión de la intensidad de la señal en ensayos tanto
semicuantitativos como cuantitativos se pueden usar unidades
relativas para la expresión de las cantidades de analito
determinadas. Las unidades relativas usadas se pueden denominar de
cualquier manera tal como por ejemplo unidades por ml de muestra
(U/ml). Dichas unidades pueden estar directamente relacionadas con
la concentración molar real de los analitos según se mide en una
disolución pero también pueden ser unidades arbitrarias aplicables
en el formato de ensayo respectivo.
Los analitos se detectan mediante inmunoensayo
según la presente invención. Inmunoensayo según la presente
invención es cualquier detección inmunoquímica de un analito. Dicha
detección inmunoquímica puede comprender en algunas realizaciones
ensayos en los que se usan uno o más sondas o anticuerpos para
capturar las moléculas de analito y posterior detección del
complejo sonda/anticuerpo con analito. Dicha reacción puede tanto
llevarse a cabo en disolución o fijada a una fase sólida. Los
expertos en la técnica conocen inmunoensayos adecuados. Dichos
ensayos pueden comprender ELISA y diferentes tipos de otros
inmunoensayos. Dichos inmunoensayos pueden comprender pero no
limitarse a por ejemplo inmunoprecipitación o ensayos
inmunológicos, tales como EIA, ELISA, RIA, ECLIA, LIA, ensayos de
flujo lateral, ensayos de flujo en pistón, tiras
inmunocromatográficas, etc. Los inmunoensayos para uso en la
invención pueden ser inmunoensayos tanto competitivos como no
competitivos. En algunas realizaciones en los inmunoensayos se
pueden emplear anticuerpos o sondas fijados a fases sólidas. Las
fases sólidas pueden comprender diferentes realizaciones de
sustancias sólidas tales como superficies planares, partículas
(incluyendo micro y nanopartículas, o partículas incluso más
pequeñas). En algunas realizaciones, las partículas se pueden
proporcionar en forma de esferas, perlas, coloides, o
similares.
La fijación de los reactivos a la fase sólida en
un kit de ensayo y otro dispositivo para diagnóstico in
vitro se puede llevar a cabo mediante fijación directa o
mediante fijación indirecta. La fijación directa se puede llevar a
cabo mediante enlace covalente, enlace no covalente, asociación o
adsorción a las superficies. La fijación indirecta se puede llevar
a cabo enlazando el anticuerpo a agentes que están directamente
ligados a fases sólidas. Entre los agentes ligantes se incluyen
avidina, estreptavidina, biotina, digoxigenina, anticuerpos, o
similares.
El inmunoensayo puede comprender una o más
reacciones adicionales con agentes detectores que bien reconozcan
los analitos o preferiblemente reconozcan las sondas usadas para
reconocer a los analitos. La reacción de detección puede comprender
además una reacción indicadora que indique el nivel de los
analitos.
Los sistemas de detección pueden ser por ejemplo
sistemas cromogénicos, sistemas por luminiscencia
(electroluminescencia, bioluminescencia, fotoluminescencia,
radioluminescencia, quimioluminescencia,
electroquimioluminescencia), sistemas basados en fluorescencia,
sistemas de detección basados en conductividad, radiación (luz, UV,
rayos X, gamma etc.), resonancia de plasmón (por ejemplo resonancia
de plasmón superficial SPR) o cualquier otro procedimiento
conocido.
Según la presente invención, la muestra corporal
solubilizada contenida en el medio de muestra puede aplicarse
directamente como espécimen para la realización del inmunoensayo.
En algunas realizaciones de la presente invención durante el
inmunoensayo pueden estar presentes elevadas concentraciones de
detergentes. Por tanto, en algunas realizaciones de la presente
invención, el inmunoensayo puede ser un inmunoensayo que sea
específicamente tolerante a las condiciones de desnaturalización. En
algunas realizaciones de la invención los inmunoensayos son
tolerantes a concentraciones de SDS superiores al 0,1%, en una
realización preferida los inmunoensayos son tolerantes a
concentraciones de SDS superiores al 0,3%. En otra realización
preferida los inmunoensayos son tolerantes a concentraciones de SDS
superiores al 1%.
La detección de los analitos se lleva a cabo
preferentemente usando una o más "sondas" (que se usa de forma
intercambiable con el término "agentes ligantes" en la
presente invención) para la detección del analito. La sonda puede
ser por ejemplo un anticuerpo que se una específicamente con el
analito. El término "anticuerpo" en todas sus formas
gramaticales hace referencia en el contexto de la presente
invención a moléculas de unión con antígeno incluyendo, pero sin
limitarse a anticuerpos monoclonales y policlonales, fragmentos de
anticuerpos, epitopos de unión con antígeno,
mini-anticuerpos, peptidomiméticos con propiedades
de unión con antígeno, anticalinas y anticuerpos bioespecíficos. En
general, la detección del analito debe comprender la detección de
la presencia o ausencia o el nivel de los analitos.
La expresión "muestra corporal" tal como se
usa en el presente documento comprende cualquier muestra corporal
de cualquier tipo y naturaleza. Ejemplos de dichas muestras
corporales son secreciones, frotis, lavados, fluidos corporales,
semen, muestras celulares y tisulares, sangre, moco cervical,
esputo, orina, heces. líquido cerebroespinal (denominado brevemente
"líquido" en el presente documento), bilis, secreciones
gastrointestinales, linfa, médula ósea, aspirados y biopsias de
órganos tales como biopsias de aguja o con 5 sacabocados y aspirados
con aguja (fina). En particular, el moco cervical, frotis y
biopsias están indicados cuando se trata de la detección de
cánceres anogenitales, por ejemplo cánceres cervicales. El término
biopsias tal como se usa en todo este documento comprenderá todo
tipo de biopsias conocidas de los expertos en la técnica. Así, las
biopsias usadas en el contexto de la presente invención pueden
comprender por ejemplo muestras resecadas de tumores, muestras
tisulares preparadas por medios endoscópicos o biopsias de órganos
con sacabocados o con aguja. Las biopsias comprenden especímenes
obtenidos mediante varias procedimientos diferentes tales como
biopsias con bisturí, LEEP (escisión electroquirúrgica con asa, por
sus siglas en inglés) biopsias, etc. Las muestras corporales según
la presente invención en algunas realizaciones de la invención
pueden referirse a especímenes que comprenden material celular
obtenido del cuerpo humano. Dichas muestras pueden por ejemplo
comprender especímenes que son adecuados para uso en examen
citológico. Los ejemplos son muestras de frotis, muestras para
citología de líquido y moco cervical.
Las muestras para citología de líquidos pueden
comprender cualquier tipo de muestra para citología de líquidos que
comprenda por ejemplo muestras celulares o tisulares conservadas en
cualquier medio estandarizado para recogida, almacenamiento o
transporte de muestras, conocido de las personas expertas en la
técnica tales como por ejemplo medios de conservación
comercialmente disponibles (disolución de formalina,
"PreservCyt" o "CytoLyt" de Cytyc, "Medio Universal de
Recogida" de Digene, "Cytorich" de Tripath Imaging, etc.).
Alternativamente, los medios de conservación de células para
citología de muestras líquidas pueden contener una mezcla de uno o
más compuestos seleccionados entre un i grupo que comprende
alcoholes, aldehídos, cetonas, ácidos, iones o sublimados
metálicos, éteres, etc. Para la conservación de componentes
celulares. Los alcoholes incluyen metanol, etanol, (n- o i-)
propanol, (n-, i- o t-) butanol o alcoholes superiores ramificados
o no 1 ramificados. Los aldehídos incluyen formaldehido,
acetaldehído, glutaraldehído, etc. Se pueden usar cetonas como
acetona. Los ácidos para uso en medios normalizados para muestras
incluyen ácidos orgánicos (ácido acético, ácido tricloroacético,
ácido salicílico, ácido pícrico) o ácidos inorgánicos tales como
por ejemplo ácido crómico. Las disoluciones estándar de muestra
pueden comprender metales tales como plata, cobre, cromo, mercurio,
osmio, uranio. Las disoluciones de sales tales como acetato de
uranilo, cromato de potasio, sulfato de amonio, etc. pueden también
ser componentes de los medios de conservación. En las realizaciones
preferidas, los especímenes para citología líquida son
especialmente adecuados para detección inmunoquímica posterior de
analitos de proteína en las muestras.
En algunas realizaciones de la presente
invención la muestra corporal se puede obtener a partir de un
dispositivo usado para obtener un espécimen de ensayo en otro
procedimiento antes de desechar dicho dispositivo. Los dispositivos
pueden por ejemplo comprender cualquier tipo de cepillo, escobilla,
espátula, hisopo, etc. Dichos dispositivos comprenden por ejemplo
los hisopos fabricados en Dacron®, algodón, o cualquier otra fibra
adecuada, cepillos tales como el cepillo endocervical, sistema
Medscand para muestreo cervical, CervexBrush®, CervexBrush
Combi^{TM} de Rovers Medical Systems, N.V., Cytobrush@ de Medscand
Medical AB y el Cervical Cell Sampler^{TM} de Digene Corp.
En algunas realizaciones la muestra corporal
según la presente invención se obtiene de los dispositivos tras
obtener material de muestra para otro procedimiento de ensayo. Por
ejemplo, se puede usar el dispositivo de muestreo para preparación
de una muestra convencional de moco cervical y posteriormente puede
ponerse en contacto con un medio de muestra según la presente
invención. Alternativamente, el dispositivo de muestreo puede
usarse también para la preparación de cualquier tipo de muestra
para citología de líquido y puede ponerse en contacto con el medio
de muestra según la presente invención con posterioridad. En el
caso de muestras para citología de líquido los inventores pretenden
también que parte de la muestra para citología de líquido también
se pueda usar para ponerse en contacto con el medio de muestra y
solubilizarse para el análisis mediante un inmunoensayo
desnaturalizante.
Poner en contacto el dispositivo de muestreo con
un medio de muestra puede comprender sumergir el dispositivo de
muestreo en un vial que contiene el medio de muestra. En algunas
realizaciones, el dispositivo de muestreo se sumerge en el medio
hasta cubrir completamente con el medio de muestra la parte del
dispositivo de muestreo que se ha puesto en contacto con el cuerpo
humano. Tras sumergir el dispositivo de muestreo en el medio de
muestra, el dispositivo se puede hacer girar en el medio.
Alternativamente, el medio junto con el dispositivo de muestreo se
pueden agitar o someterse a vortización. En algunos casos, el
dispositivo de muestreo puede ponerse en contacto con el medio de
muestra de manera que el dispositivo o parte del dispositivo se
guarde o permanezca dentro del medio de muestra durante un periodo
de tiempo para permitir la disolución completa de las células o
restos celulares. En algunos casos, el dispositivo de muestreo
puede por ejemplo calentarse junto con el medio de muestra.
En general, la ejecución del inmunoensayo puede
tener lugar inmediatamente después de que la muestra corporal haya
entrado en contacto con el medio de muestra o puede tener lugar
tras un cierto periodo de tiempo. En algunas realizaciones de la
invención el inmunoensayo se ejecuta directamente cuando se ha
completado, o se cree que se ha completado, la lisis de la muestra
corporal. En algunas realizaciones adicionales de la invención,
tras completarse la lisis de la muestra corporal la disolución de
muestra se almacena durante un periodo de tiempo que puede oscilar
entre minutos y semanas. En una realización preferida, el tiempo
entre la lisis de la muestra corporal en el medio de muestra y la
ejecución del inmunoensayo es un periodo de tiempo no inferior a 1
minuto y no superior a 90 días, en una realización aún más
preferida, el periodo de tiempo no es inferior a 1 hora y no es
superior a 14 días y en otra realización preferida el periodo de
tiempo no es superior a 7 días. En algunas realizaciones el tiempo
puede ser incluso del orden de años.
Las muestras corporales según la presente
invención pueden ponerse en contacto con un medio de muestra
inmediatamente tras -la obtención de las muestras o incluso después
de transcurrir un determinado lapso de tiempo. Durante ese tiempo,
las muestras corporales pueden por ejemplo refrigerarse, congelarse
o conservarse en una disolución conservante celular. Los
procedimientos para dicha conservación celular mediante congelación
o refrigeración son conocidos por las personas expertas en la
técnica.
Según la presente invención se puede usar una
muestra corporal para la detección de uno o más analitos mediante
análisis inmunoquímico. La detección de los analitos se puede
ejecutar en un único ensayo o en múltiples ensayos diferentes. En
algunas realizaciones de la invención según esto únicamente se usa
una alícuota de la muestra corporal completa para la determinación
de un único analito a partir de la muestra corporal.
Los términos "solubilizado" o
"solubilización" tal como se usan en el contexto de la
presente invención significan que los componentes de una muestra
corporal se han puesto en contacto con un medio de muestra y se han
disuelto al menos en parte en el medio de muestra y posteriormente
los componentes de la muestra corporal están representados al menos
en parte por los componentes de la disolución.
El término "medio de muestra" tal como se
usa en el contexto de la presente invención puede ser cualquier
líquido conocido de los expertos en la técnica adecuado para la
solubilización de componentes celulares o de células completas. El
medio de muestra puede, por ejemplo, ser disoluciones orgánicas o
acuosas de agentes caotrópicos tales como por ejemplo urea, GuaSCN,
formamida, o detergentes tales como detergentes aniónicos (por
ejemplo SDS, N-lauril sarcosina, desoxicolato de
sodio, alquil-aril sulfonatos, sulfatos de alcohol
(graso) de cadena larga, sulfatos y sulfonatos de olefina, sulfatos
y sulfonatos de alfaolefina, monoglicéridos sulfatados, éteres
sulfatados, sulfosuccinatos, sulfonatos de alcano, ésteres de
fosfato, isetionatos de alquilo, ésteres de sacarosa), detergentes
catiónicos (por ejemplo cloruro de cetil trimetilamonio),
detergentes no fónicos (por ejemplo Tween 20, Nonidet
P-40, Triton X-100,
NP-40, Igepal CA-630,
N-Octil-Glucósido) detergentes no
iónicos o anfóteros (por ejemplo CHAPS,
3-dodecildimetilamoniopropano-1-sulfonato,
óxido de laurildimetilamina) y/o hidróxidos alcalinos tales como
por ejemplo NaOH o KOH. En algunas realizaciones el medio de
muestra puede comprender también ácidos inorgánicos o ácidos
orgánicos como componentes tales como ácido fórmico, ácido acético,
ácido fosfórico etc. En algunas realizaciones, cuando la lisis de
las células se puede conseguir sin usar detergentes, se pueden usar
como disolventes disoluciones hiper o hipotónicas o tampones o
simplemente agua o un líquido orgánico. Cualquier líquido que sea
adecuado para solubilizar los componentes celulares de las muestras
corporales en todo o en parte puede considerarse como un medio de
muestra según se usa en el presente documento. De esta manera, el
medio de muestra según se usa en el presente documento puede
necesitar o no contener sustancias tamponantes o tener capacidad
tampón.
En general, se puede usar cualquier líquido
adecuado como medio de muestra de la presente invención. El
líquido puede ser orgánico o inorgánico y puede ser un líquido
puro, una mezcla de líquidos o una disolución de sustancias en el
líquido y puede contener sustancias adicionales para potenciar las
propiedades del disolvente. En algunas realizaciones, cuando la
lisis de las células se puede conseguir sin usar detergentes, se
pueden usar como disolventes disoluciones hiper o hipotónicas o
tampones o simplemente agua o un líquido orgánico. Cualquier
líquido que sea adecuado para solubilizar los componentes celulares
de las muestras corporales en todo o en parte puede considerarse
como un medio de muestra según se usa en el presente documento. De
esta manera, el medio de muestra según se usa en el presente
documento no necesita contener sustancias tamponantes o tener
capacidad tampón. Sin embargo, en algunas realizaciones de la
invención la muestra media puede tener capacidad tampón y puede
contener sustancias tamponantes.
En una realización, el medio de muestra se
diseña de manera que se solubilicen las células, restos celulares,
ácidos nucleicos, polipéptidos, lípidos y el resto de biomoléculas
potencialmente presentes en la mezcla bruta. En realizaciones
adicionales de la presente invención, el disolvente se puede
diseñar para asegurar la solubilización diferencial de componentes
específicos de la muestra corporal, dejando sin solubilizar otros
componentes.
El medio de muestra para solubilizar la muestra
corporal según la presente invención puede comprender
adicionalmente uno o más agentes para evitar la degradación de los
componentes contenidos en las muestras brutas. Dichos componentes
pueden por ejemplo comprender inhibidores de enzimas tales como
inhibidores de la proteinasa, inhibidores de la ARNsa, inhibidores
de la ADNsa, etc. En una realización de la presente invención, la
muestra se lisa directamente en la forma obtenida de los ensayos
individuales. Los inhibidores de la proteinasa pueden comprender,
por ejemplo, inhibidores de las serina proteinasas, inhibidores de
las cisteína proteinasas, inhibidores de las aspártico proteinasas,
inhibidores de las metaloproteinasas, inhibidores de las
proteinasas ácidas, inhibidores de las proteinasas alcalinas, o
inhibidores de las proteinasas neutras. En algunas realizaciones de
la presente invención se puede conseguir la inhibición de enzimas
por medios químicos tales desnaturalización de las enzimas mediante
concentración de sal, pH, agentes caotrópicos, o similares.
En algunas realizaciones de la invención, con el
fin de obtener resultados óptimos en el ensayo, el pH de un medio
de muestra a aplicar directamente al sistema de ensayo es
prácticamente neutro. En realizaciones adicionales el pH del medio
de muestra está comprendido en el intervalo entre 4 y 10. En
algunas otras realizaciones, el pH está comprendido entre 5 y 9. En
una realización preferida, el pH está comprendido entre 6 y 8. En
una realización más preferida, el pH está comprendido entre 6,5 y
7,5.
Los ejemplos de agentes desnaturalizantes para
medios de muestra y/o para desnaturalizar analitos según la
presente invención se pueden seleccionar por ejemplo entre las
sustancias dadas en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Todas las concentraciones dadas en porcentaje
(%) en toda la memoria descriptiva de esta invención se refieren a
peso porcentual en volumen (%p/v).
El medio de muestra según la presente invención
comprende en realizaciones preferidas un agente desnaturalizante.
Dicho agente desnaturalizante puede seleccionarse entre un grupo
que comprende detergentes o agentes caotrópicos.
En algunas situaciones, los analitos se pueden
degradar en las muestras solubilizadas y por tanto no se pueden
detectar. Esto es particularmente cierto si las muestras se
transfieren directamente a un medio de lisis y se almacenan en el
mismo durante un determinado periodo de tiempo antes de una
preparación adicional. Para evitar la degradación, el medio de
muestra puede comprender adicionalmente uno o más agentes que
evitan la degradación de los componentes contenidos en las muestras
brutas. Dichos componentes puede comprender por ejemplo
inhibidores de enzimas tales como inhibidores de la proteinasa,
inhibidores de la ARNsa, inhibidores de la ADNsa, etc. Los
inhibidores pueden por ejemplo comprender inhibidores de la
proteinasa seleccionados entre las composiciones dadas en la Tabla
2.
A efectos de estabilización, el medio de muestra
puede también comprender proteína voluminosa (por ejemplo albúmina
tal como albúmina de suero bovino o albúmina de suero de ternera,
lecitina de soja, u otras proteínas voluminosas) para competir en
la degradación con las proteínas de la muestra. Las proteínas
voluminosas pueden por ejemplo estar presentes en combinación con
inhibidores de la proteinasa o se pueden añadir en lugar de los
inhibidores de la proteinasa. En algunas realizaciones el medio de
muestra se puede seleccionar para que sea compatible con el
rendimiento del ensayo (por ejemplo ELISA), de manera que las
muestras solubilizadas puedan aplicarse directamente al ensayo. En
algunas realizaciones, el medio de muestra puede igualmente
comprender sustancias que inhiban la actividad microbiana. Dichas
sustancias pueden comprender por ejemplo sustancias microbicidas o
microestáticas. Dichas sustancias comprenden por ejemplo azida de
sodio, proclina,
5-Bromo-5-Nitro-1,3-Dioxano,
2-Metil-4-Isotiazolin-3-ona,
5-Cloro-2-Metil-4-Isotiazolin-3-ona
y compuestos que contienen mercurio (por ejemplo timerosal). Para
la estabilización global de los analitos en el medio de muestra
según la presente invención se aplica una etapa de calentamiento.
Un medio de muestra según la presente invención en algunas
realizaciones puede también comprender uno o más agentes
desnaturalizantes. Dichas combinaciones pueden comprender los
agentes desnaturalizantes desvelados en el presente documento en
cualquier combinación adecuada.
Calentar, tal como se usa en el contexto de la
presente invención se referirá a un procedimiento de someter el
medio de muestra que contiene la muestra corporal solubilizada a
temperaturas elevadas en relación a la temperatura ambiente y puede
corresponder a calentar a cualquier temperatura por debajo o por
encima del punto de ebullición de un medio de muestra particular.
Calentar puede por ejemplo comprender someter a temperaturas de 30
a 150º C. En algunas realizaciones calentar comprende someter a
temperaturas superiores a 50ºC. En una realización preferida de la
invención calentar se referirá a someter a temperaturas entre 70ºC
y 130ºC. En otra realización preferida, calentar comprende someter
a temperaturas entre 95 y 110ºC.
En el contexto de la presente invención el
calentamiento se lleva a cabo durante un periodo de tiempo que
permita que los analitos contenidos en la muestra corporal se
estabilicen de manera óptima en el medio de muestra. El periodo de
tiempo necesario para esto puede variar, y depende del tipo de
muestras. Los tiempos de calentamiento (tiempos eficaces de
incubación) a una temperatura dada se pueden elegir para que estén
comprendidos entre 5 y 30 minutos. En una realización preferida de
la invención el tiempo de incubación está entre 10 y 27 minutos. En
otra realización preferida, el tiempo de incubación está entre 15 y
25 minutos. El tiempo total de calefacción a una temperatura dada
debe diferenciarse del tiempo para la incubación de la disolución
de la muestra a una temperatura dada. El tiempo de calentamiento
(tiempo eficaz de incubación) anteriormente proporcionado se
referirá al tiempo en el que la disolución de la muestra se
caliente en un dispositivo de calentamiento que comprende el
periodo de tiempo durante el cual la temperatura de la disolución
de la muestra se equilibra con la temperatura de incubación final.
Éste es por lo general más largo que el periodo de tiempo para
incubación a la temperatura de incubación deseada una vez que la
disolución de la muestra se ha equilibrado con la temperatura de
incubación. Para una mera incubación a la temperatura de destino se
considera suficiente un periodo de tiempo entre 1 minuto y 30
minutos para los procedimientos según la presente invención. En una
realización preferida de la presente invención se usa para calentar
un periodo de tiempo de 3 a 15 minutos. En algunas realizaciones de
la invención son suficientes periodos de tiempo entre 5 y 12
minutos. Los tiempos de incubación dados son fuertemente
dependientes del dispositivo de calentamiento usado así como del
tipo de vial y del medio de muestra usado. Por tanto, el periodo de
tiempo necesario para la incubación puede exceder o ser más corto
que el periodo de tiempo dado anteriormente. Las personas expertas
en la técnica saben determinar el periodo de tiempo necesario para
incubar una disolución de muestra incubada a temperatura ambiente
que se ha introducido en un dispositivo de calentamiento ya
caliente para permitir una incubación de la disolución de la
muestra a la temperatura de incubación deseada durante el periodo
de tiempo planificado. Los dispositivos de calentamiento para
ejecutar el procedimiento de la presente invención pueden ser
cualquier dispositivo de calentamiento que se pueda aplicar para
calentar una disolución de muestra en un laboratorio durante un
periodo de tiempo fijo. En general, los dispositivos de
calentamiento están equipados con un termostato que se puede ajustar
para mantener una temperatura preseleccionada. Dichos dispositivos
de calentamiento pueden por ejemplo comprender baños de agua,
hornos de microondas y bloques calefactores. En algunas
realizaciones de la invención el dispositivo de calentamiento está
equipado con un temporizador que permite al usuario controlar
fácilmente el tiempo de incubación. De otra manera, el usuario
puede usar un temporizador externo (tal como por ejemplo un
despertador) para controlar el tiempo de incubación.
Desnaturalizar un analito o la desnaturalización
de un analito tal como se usan en el contexto de la presente
invención se referirán a cualquier tipo de alteración del analito o
a la alteración del analito respecto de su estado nativo. En
algunas realizaciones de la invención dicha alteración respecto de
su estado nativo puede comprender cualquier tipo de perturbación de
la estructura nativa o natural primaria, secundaria, terciaria o
cuaternaria de un analito (proteína).
Un aspecto de la presente invención corresponde
a un bioensayo desnaturalizante. Un bioensayo desnaturalizante en
el contexto de la presente invención es un ensayo inmunoquímico que
está diseñado para detectar la presencia o ausencia y/o el nivel de
un analito contenido en una disolución de muestra. Dicho bioensayo
es preferiblemente un ensayo en el que la detección del analito se
lleva a cabo en una fase líquida o usando reactivos fijados a una
fase sólida. En cualquier caso, un bioensayo desnaturalizante según
la presente invención se caracteriza por al menos una etapa de la
reacción inmunoquímica que se lleva a cabo en la presencia de
agentes desnaturalizantes. A diferencia de la situación en un
bioensayo desnaturalizante según la presente invención, en
SDS-PAGE únicamente se lleva a cabo la
electroforesis en gel bajo condiciones desnaturalizantes y se lleva
a cabo posteriormente la detección inmunoquímica, una vez que los
agentes desnaturalizantes se han eliminado por lavado. Un ejemplo
de un bioensayo desnaturalizante según la presente invención es por
ejemplo un ELISA en sándwich en el que la etapa de captura del
antígeno se lleva a cabo directamente a partir de la disolución de
la muestra que contiene el analito y el agente desnaturalizante. En
este caso la disolución de la muestra que comprende un agente
desnaturalizante se pone en contacto con una fase sólida fijada
directamente sobre un analito particular. Se lleva a cabo La
captura del analito por el anticuerpo de captura y el agente
desnaturalizante se elimina por lavado únicamente tras dicha etapa.
La ventaja de dicho procedimiento es que los cambios
conformacionales presentes en el analito desnaturalizado se
mantienen durante la etapa de captura y de esta manera puede tener
lugar la interacción de la sonda o el anticuerpo con el analito
desnaturalizado. Esto puede conducir en algunos casos a una
precisión mejorada de la detección del analito. Especialmente
cuando se han empleado epitopos lineales de un analito para la
generación de sondas o anticuerpos, se puede mejorar la detección
de dichos analitos mediante dichos anticuerpos si la reacción
inmunoquímica se lleva a cabo en condiciones
desnaturalizantes.
desnaturalizantes.
Sin embargo, en la técnica existe el prejuicio
de que altas concentraciones de agentes desnaturalizantes
interfieren con la reacción inmunoquímica y por tanto no puede
tener lugar la unión con el antígeno de una manera adecuada, si por
ejemplo está presente SDS en la disolución en incubación. Los
inventores han encontrado ahora que dichas concentraciones elevadas
de agentes desnaturalizantes pueden tener un impacto positivo sobre
la ejecución de una reacción de detección inmunoquímica bajo
determinadas circunstancias según se ha descrito anteriormente.
Los inmunoensayos desnaturalizantes según la
presente invención pueden comprender pero no limitarse a por
ejemplo inmunoprecipitación o ensayos inmunológicos, tales como EIA,
ELISA, RIA, ECLIA, LIA, ensayos de flujo lateral, ensayos de flujo
pistón, tiras inmunocromatográficas, ensayos de aglutinación en
látex etc.
Los inmunoensayos para uso como inmunoensayos
desnaturalizantes en la invención pueden comprender inmunoensayos
tanto competitivos como no competitivos. En algunas realizaciones
se pueden emplear en los inmunoensayos anticuerpos o sondas fijados
a fases sólidas. Las fases sólidas pueden comprender diferentes
realizaciones de sustancias sólidas, tales como superficies
planares, partículas (incluyendo micro y nanopartículas o incluso
partículas más pequeñas). En algunas realizaciones, las partículas
se pueden proporcionar en forma de esferas, perlas, coloides o
similar.
La fijación de los reactivos a la fase sólida en
un kit de ensayo o en un dispositivo para diagnóstico in vitro se
puede llevar a cabo mediante fijación directa o mediante fijación
indirecta. La fijación directa se puede llevar a cabo mediante
enlace covalente, enlace no covalente, asociación o adsorción a
superficies. La fijación indirecta se puede llevar a cabo mediante
el enlace del anticuerpo a agentes que están ellos mismos
directamente fijados a fases sólidas. Los agentes ligantes
incluyen, por ejemplo, avidina, estreptavidina, biotina,
digioxingenina, anticuerpos o similares.
Los inmunoensayos pueden comprender una o más
reacciones con agentes de detección que bien reconocen los analitos
o preferiblemente reconocen las sondas usadas para reconocer los
analitos. La reacción de detección puede comprender además una
reacción indicadora que indique el nivel de los analitos.
Los sistemas de detección puede ser por ejemplo
sistemas cromogénicos, sistemas luminiscentes, sistemas
(electroluminescencia, bioluminescencia, fotoluminescencia,
radioluminescencia, quimioluminescencia,
electroquimioluminescencia), sistemas basados en fluorescencia,
sistemas de detección basados en conductividad, radiación (luz, UV,
rayos X. gamma etc.), resonancia de plasmón (poro ejemplo
resonancia de plasmón superficial SPR) o cualquier otro
procedimiento conocido.
Los agentes desnaturalizantes usados para dicho
bioensayo desnaturalizante pueden en algunas realizaciones de la
invención formar parte del medio de muestra en el que se introduce
la muestra corporal para almacenamiento y transporte antes del
análisis. En otras realizaciones, el agente desnaturalizante se
pone en contacto con las proteínas del analito en una muestra
justo antes de la etapa de desnaturalización. Los agentes
desnaturalizantes usados para el bioensayo desnaturalizante que se
desvelan en el presente documento pueden comprender por ejemplo
agentes caotrópicos tales como por ejemplo urea, GuaSCN, formamida,
detergentes tales como detergentes aniónicos (por ejemplo SDS,
N-lauril sarcosina, deoxicolato de sodio,
alquil-aril sulfonatos, sulfatos de alcohol (graso)
de cadena larga, sulfatos y sulfonatos de olefina, sulfatos y
sulfonatos de alfaolefina, monoglicéridos sulfatados, éteres
sulfatados, sulfosuccinatos, alcanosulfonatos, ésteres fosfato,
isetionatos de alquilo, ésteres de sacarosa), detergentes
catiónicos (por ejemplo cloruro de cetil trimetilamonio),
detergentes no fónicos (por ejemplo Tween 20, Nonidet
P-40, Triton X-100,
NP-40, Igepal CA-630,
N-Octil-glucósido) o detergentes
anfóteros (por ejemplo CHAPS,
3-Dodecil-dimetilamonio-propane-1-sulfonato,
óxido de laurildimetilamina) e hidróxidos alcalinos tales como por
ejemplo NaOH o KOH. En algunas realizaciones los agentes
desnaturalizantes pueden comprender también ácidos inorgánicos u
orgánicos coma componentes tales como ácido fórmico, ácido acético,
ácido fosfórico, etc.
Según la presente invención pueden estar
presentes concentraciones elevadas de detergentes durante el l
inmunoensayo. En algunas realizaciones de la invención los
inmunoensayos toleran concentraciones de SDS superiores al 0,1%, en
una realización preferida los inmunoensayos toleran concentraciones
de SDS superiores al 0,3%. En otra realización preferida los
inmunoensayos toleran concentraciones de SDS superiores al 1%. En
algunas realizaciones de la invención el inmunoensayo puede tolerar
una concentración de Triton X 100 de menos del 0,1% hasta al menos
el 3%.
Los ejemplos proporcionados a continuación son
indicados para ilustrar la materia sujeto de la invención y no se
pretende que limiten el alcance de la invención. Los expertos en la
técnica pueden realizar algunas variaciones de los ejemplos según
se han proporcionado. Los ejemplos por tanto proporcionan un
alcance limitado de las realizaciones de los procedimientos de la
invención detallada aquí. Basándose en los ensayos comprehensivos
realizados por los inventores, los inventores creen que los
procedimientos desvelados se pueden transferir con facilidad a
otros analitos y otros agentes desnaturalizantes sin alterar los
efectos positivos de los procedimientos inventivos tal como se
detallan en el presente documento.
Se determinaron los niveles de la proteína
p16^{INK4a} en especímenes cervicales que se habían obtenido con
un dispositivo de muestreo cervical estándar. Se sometieron 11
muestras a una etapa de calentamiento según la invención desvelada
en el presente documento, y se analizaron para los niveles de
p16^{INK4a} tras almacenamiento tras un determinado periodo de
tiempo tras lo anterior; otras 7 muestras se usaron directamente
para análisis de la muestras para los niveles de proteína
p16^{IN14a} mediante la técnica de ELISA.
Para los presentes ejemplos, las muestras de la
paciente fueron recogidas por ginecólogos usando un cepillo
endocervical o un Cervex-Brush Combi (Rovers
Medical Devices). Tras preparación de los especímenes procedentes
del cepillo endocervical para PAP-moco cervical
convencional, el cepillo endocervical que contenía material
residual de muestra se insertó en un vial de recogida de muestra
(por ejemplo Vial PP de Sarstedt) conteniendo 5 ml de tampón PST
(tampón PST: Triton X100 al 1%, SDS al 0,3%, y solución salina
tamponada con fosfato; la solución salina tamponada con fosfato
contenía Proclin300 como conservante para la estabilización del
tampón antes del uso). Se retiró el mango del cepillo, y la punta
del cepillo se dejó dentro del vial de recogida de la muestra. El
vial de recogida de la muestra con material de muestra y el cepillo
de recogida se trató térmicamente durante un periodo de tiempo de
2 horas tras la recogida de la muestra, durante 15 min a 95ºC en un
baño de agua, alternativamente se puede usar para la etapa de
tratamiento térmico 25 min a 100ºC en un bloque de calefacción.
Se usó un bloque de calefacción con termostato y
orificios del tamaño adecuado para viales NeoLab Cat. Nº
2-2503). La muestra se almacenó sin otra
manipulación adicional (sin centrifugación, cepillo dentro del
vial) a temperatura ambiente durante hasta 14 días hasta el
análisis de la muestra mediante ELISA como sigue:
Los niveles y/o concentraciones de p16^{INK4a}
se determinaron por medidas duplicadas tomando 100 \mul de
muestra/determinación. Se midieron los niveles de p16^{INK4a} por
ejemplo a 1 día, 2 días, 5 días y 6 días tras el i inicio del
almacenamiento de las muestras a temperatura ambiente. Cada punto
de datos es un promedio de 2 medidas (coeficientes de variación
inferior al 10%).
Se usaron placas ELISA revestidas con un
anticuerpo clonado mtm E6H4 específico de p16^{INK4a} para la
detección por ELISA de p16^{INK4a}, se añadieron a cada pocillo
100 \mul de la muestra de células lisadas. A efectos de
calibración del ensayo, se incluyeron diferentes concentraciones de
la proteína recombinante p16^{INK4a} (0 \mug/ml, 50 \mug/ml,
100 \mug/ml, 200 \mug/ml, 400 \mug/ml, 800 \mug/ml) en el
ensayo. Las muestras se incubaron durante 1 h a temperatura
ambiente.
Después se realizaron 3 etapas de lavado usando
un lavador ELISA automático. Se usó un anticuerpo clonado secundario
mtm D7D7 específico de la proteína p16^{INK4a} conjugado con
peroxidasa de rábano picante (HRP) para la detección en el sistema
de sándwich ELISA. Se añadieron 100 \mul de la disolución de
D7D7-HRP a cada pocillo y se incubaron durante 1 h a
temperatura ambiente. A continuación se realizaron 3 etapas de
lavado usando un lavador ELISA automático. Se añadieron a cada
pocillo 100 \mul de TMB-substrato. Las placas
ELISA se incubaron a 25ºC durante exactamente 15 min en la
oscuridad. A continuación la reacción se detuvo por adición de 80
\mul de H_{2}SO_{4} 2,5 M. En los 5 min siguientes a la
detención de la reacción, se determinó la DO a 450 nm, Tras la
evaluación de los resultados, cada muestra devolvió un valor para la
DO. Usando una curva de calibración basada en las muestras de
calibración incluidas en el ensayo, la DO se transformó en unidades
relativas/ml.
Se determinaron Ep-CAM y
gCatenina procedentes de muestras análogas usando un sándwich ELISA
específico basado en las siguientes parejas de anticuerpos:
HEA-125 (German Cáncer Research Center) y
MK1-410 (BioVendor) para Ep-CAM,
10F8 (mtm laboratories) y 4C12 (mtm laboratories) para
gCatenina.
Los niveles de p16^{INK4a} medidos en los
especímenes cervicales se recogen tanto en forma de DO (todos los
datos de una muestra se obtuvieron por tanto usando una sola placa
ELISA) o en unidades/ml. Los niveles medidos en una muestra
respectiva en diferentes puntos temporales se muestran en la fig. 1
para muestras no tratadas con calor y en la fig. 2 para muestras
tratadas con calor.
Los datos mostrados en la fig. 1 demuestran que
hay una pérdida significativa de la señal de p16^{INK4a}
detectable en el ELISA si la muestra se almacena a temperatura
ambiente durante un periodo de varios días. Esto indica que se
produce una degradación de la proteína analito p16^{INK4a} en la
muestra. En la fig. 2 se puede ver que no hay pérdida de la señal
durante el periodo de tiempo completo ensayado para las muestras
que se habían sometido al tratamiento térmico. Por tanto, el nivel
de p16^{INK4a} procedente de especímenes de muestras cervicales
que se habían obtenido tras tratamiento térmico queda estabilizado
durante el tiempo de almacenamiento total.
Con el fin de determinar si el nivel de
p16^{INK4a} en los especímenes de muestras se ve afectado por la
variación del procedimiento de tratamiento térmico, se tomaron 4
alícuotas consecutivas de 14 muestras diferentes incubadas como
sigue:
- Alícuota 1 tomada tras 15 min a 100ºC
- Alícuota 2 tomada tras 25 min a 100ºC
- Alícuota 3 tomada tras 35 min a 100ºC
- Alícuota 4 tomada tras otros 10 min a 105ºC
(la duración total del tratamiento térmico fue de 45 min).
La concentración de p16^{INK4a} se determinó
por duplicado en cada alícuota separadamente usando la
p16-ELISA. La concentración promedio, incluyendo las
barras de error de 4 determinaciones, así como el coeficiente de
variación entre 4 determinaciones, se proporcionan en la fig. 3. Se
establece 4 U/ml como límite de detección en las presentes
circunstancias. Los resultados de este experimento no muestran
diferencias visibles en los niveles de p16^{INK4a} medidos
dependiendo del tiempo de incubación aplicado para el tratamiento
térmico respecto del intervalo de periodos de tiempo aplicado. Esto
demuestra que se puede aplicar un amplio intervalo de periodos de
tiempo. El aumento en la duración o incluso el aumento en la
temperatura de tratamiento térmico de las muestras no interfiere
con la determinación del analito usando la
p16-ELISA.
Usando una combinación de muestras de varios
pacientes, y realizando el tratamiento térmico durante 10 min a
80ºC, 90ºC o 99ºC, se puede demostrar que la estabilización es
dependiente de la temperatura de tratamiento térmico. Una alícuota
de estas muestras combinadas se dejó sin tratar y se usó como
control. Como se muestra en la fig, 4, la combinación de muestras
de pacientes es inestable cuando no se somete a tratamiento
térmico y queda estabilizada a las temperaturas de tratamiento. La
estabilización observada es mejor cuando el tratamiento térmico se
realiza a una temperatura superior a 90ºC.
Los resultados de la determinación de los
niveles de gCatenina en 3 muestras de pacientes no sometidas a
tratamiento térmico y 7 muestras de pacientes sometidas a
tratamiento térmico se muestran en las figs. 5 y 6,
respectivamente. De los resultados de los inventores se puede ver
que la gCatenina queda estabilizada en el tampón PST tras el
tratamiento térmico.
Se muestran en las figs. 7 y 8, respectivamente,
resultados análogos para la determinación de los niveles de
Ep-CAM en 6 muestras de pacientes no sometidas a
tratamiento térmico y 7 muestras de pacientes sometidas a
tratamiento térmico. Los resultados de los inventores indican que
Ep-CAM también queda estabilizada en el tampón PST
tras el tratamiento térmico.
Se llevó a cabo la determinación de
p16^{INK4a} a partir de alícuotas tomadas de las mismas muestras
de pacientes en las que se determinaron Ep-Cam y
gCatenina. La determinación en el caso presente se llevó a cabo
usando diferentes placas ELISA para cada analito. Sin embargo, es
posible generar placas ELISA en las que se pueda llevar a cabo la
determinación de dos o más analitos en una única placa.
En resumen, los resultados de los experimentos
detallados muestran que una temperatura aplicada durante el
tratamiento térmico es bien tolerada por encima de 90ºC durante al
menos 5 min en las condiciones dadas. La extensión adicional de la
duración del tratamiento hasta 45 min no altera los analitos.
Además, los resultados muestran que se puede conseguir la
estabilidad de los analitos p16, gCatenina y Ep-CAM
para almacenamiento a temperatura ambiente durante al menos 6 días.
La estabilización observada no es específica de la proteína, como
se observa para 3 proteínas diferentes.
Los resultados también demuestran que todos los
analitos ensayados en el experimento se pueden detectar en un
inmunoensayo, en el que la primera etapa de incubación se lleva a
cabo en presencia de SDS al 0,3% y Triton X100 al 1%.
Puede reseñarse adicionalmente que el
procedimiento de tratamiento térmico da como resultado una
normalización del procedimiento de extracción de p16^{INK4a}
procedente de células presentes en la muestra del paciente. Debido
a la presencia del cepillo, que se deja en el vial durante el
tratamiento térmico, se consigue una lisis eficaz de las células y
una solubilización homogénea de los analitos. El riesgo de pérdida
de material dejado en el cepillo se reduce en gran medida.
Ejemplo
1a
En una variación del protocolo anteriormente
mostrado los inventores llevaron a cabo varios experimentos con
diferentes tiempos de calentamiento y diferentes composiciones del
medio de muestra. Se introdujo un dispositivo de muestreo cervical
(Cytobrush) que contenía un hisopo cervical en un tubo de ensayo de
1,5 ml que contenía 700 \mul de tampón de lisis (PBS con Triton
X100 al 3%; SDS al 0,5%). Se cortó el mango y el tubo cerrado se
sometió a vortización durante 30 s a temperatura ambiente. A
continuación, se retiró el cepillo. El tubo de ensayo se calentó
durante 30 min a 95ºC. Se pipetearon 100 \mul de lisado por
pocillo en una placa de 96 pocillos revestida de anticuerpo (clon
E6H4) p16^{INK4a} de captura. La detección se llevó a cabo con
anticuerpo biotinilado para detección específica de p16^{INK4a} y
conjugado estreptavidina-HRP. Se usó DAB como
sustrato. Los resultados se muestran en la fig. 9. Puede verse que
p16^{INK4a} se detectó en un ensayo ELISA en presencia de
concentraciones de agentes desnaturalizantes (SDS al 0,5% y Triton
X100 L 3%). Adicionalmente, hay una correlación entre los valores
elevados de p16^{INK4a} (indicadores de una sobreexpresión de
p16^{INK4a}) y la presencia de una anormalidad en el tejido
ensayado citológicamente confirmada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinaron los niveles de la proteína
p16^{INK4a} en especímenes cervicales que se habían obtenido
mediante un dispositivo estandarizado de muestreo cervical. 12
muestras se sometieron a una etapa de calentamiento según la
invención desvelada en el presente documento, y se analizaron para
los niveles de p16^{INK4a} mediante las técnicas ELISA y LIA en
presencia de elevadas concentraciones de detergente.
La preparación y estabilización de la muestra y
el ELISA se realizaron como se ha mostrado en el Ejemplo 1.
Se revistieron Dynabeads M-280
usando el procedimiento normalizado de revestimiento de Dynal con
el clon mtm E6H4 de anticuerpo especifico de p16^{INK4a} y se
almacenó a una concentración de 5 mg/ml en tampón de
almacenamiento. El clon de anticuerpo mtm D7D7 especifico de
p16^{INK4a} se marcó con isoluminol mediante un procedimiento
normalizado. El ensayo se ejecutó con el analizador DiaSorin
Liaison®. Se añadieron 200 \mul de muestra de la muestra de
células lisadas a 100 \mul de solución de trazador (anticuerpo
monoclonal D7D7 anti-p16^{INK4a} marcado con
isoluminol en PBS 10 mM pH 7,4. 1% BSA) y 20 \mul de partículas
magnéticas revestidas de anticuerpo. Tras 10 min de incubación a
37ºC, las partículas se separaron con un imán y se lavaron tres
veces con el sistema® Wash/System Liquid de Liaison. Tras la
tercera etapa de lavado, las partículas se separaron de nuevo, y se
eliminó el sobrenadante. Se generó la señal quimioluminiscente por
inyección de dos soluciones de estímulo listas para uso (kit de
iniciación de Liaison®). A efectos de calibración del ensayo, se
incluyeron en el ensayo diferentes concentraciones de proteína
recombinante p16^{INK4a} (0 \mug/ml, 50 \mug/ml, 100
\mug/ml, 200 \mug/ml, 400 \mug/ml. 800 \mug/ml).
Los niveles de p16^{INK4a} medidos en los
especímenes cervicales se muestran en Unidades/ml.
Los datos mostrados en la fig. 10 muestran
únicamente diferencias menores en los niveles de p16^{INK4a}
medidos en ambos tipos de ensayo. El experimento prueba de esta
manera que las técnicas ELISA y LIA se pueden usar para detectar el
analito en presencia del agente desnaturalizante en una
concentración (SDS al 0,3%) que permita soportar el estado
desnaturalizado de la proteína analito.
Los inventores demostrarían en experimentos
adicionales (no se muestran los datos) que tanto el ensayo ELISA
como el ensayo LIA pueden ejecutarse igualmente para la detección
de varios analitos (incluyendo p16m4a gCatenina,
Ep-Cam. HPV E7, CA19-9,
MCM-2 y CDC-6) que incluso pueden
detectarse de forma reproducible en presencia de concentraciones
significativamente mayores de agentes desnaturalizantes. Por
ejemplo se podría realizar con éxito un ensayo en presencia de SDS
al 1%. Alternativamente, se usó con éxito una concentración de
Triton X100 al 3% en un formato ELISA para la detección de
analitos. En estos casos, los inventores observarían una mejora en
la reproducibilidad de los resultados generados en el análisis de
las muestras en el inmunoensayo en caso de que un agente
desnaturalizante esté presente durante el ensayo, en comparación
con los casos en que se omitieron los agentes desnaturalizantes.
Esto indica que los agentes desnaturalizantes en el intervalo de
concentraciones detallado en el presente documento son adecuados
para potenciar el rendimiento y especialmente la reproducibilidad de
los procedimientos de detección inmunoquímica.
\vskip1.000000\baselineskip
9 hisopos cervicales (las condiciones de lisis
fueron similares a las del Ejemplo 1) se sometieron a ensayo PAP
convencional y a lisis en una detección posterior basada en flujo
lateral de la sobreexpresión del inhibidor de la quinasa
dependiente de ciclina p16^{INK4a} en disoluciones preparadas a
partir de las células contenidas en los hisopos. El ensayo de flujo
lateral se ejecutó como sigue:
Las muestras de hisopos cervicales se
transfirieron a un vial de recogida de muestra (SCV) contendiendo 5
ml de tampón PST. El vial de recogida de muestra se incubó en el
baño de agua durante 15 min a 95ºC. El vial de recogida de muestra
se enfrió hasta temperatura ambiente, y 4 ml del sobrenadante se
transfirieron sin centrifugación a un tubo nuevo. Según el caso, el
sobrenadante se puede almacenar a -20ºC.
Disoluciones de almacenamiento del clon mtm E6H4
específico de p16^{INK4a} y proteína recombinante p16^{INK4a}
se diluyeron en TBS (conteniendo albúmina de suero bovino al 1%)
para dar una disolución de manchado lista para uso con una
concentración final de anticuerpo de 1 mg/ml y una concentración de
p16^{INK4a} recombinante de 10 \mug/ml. Las disoluciones listas
para uso se mancharon sobre una membrana de nitrocelulosa a 30
\mul/30 cm. Se unieron mechas Schleicher&Schuell a un extremo
de la nitrocelulosa, y las tiras reactivas se secaron durante 15
min a 37ºC. A continuación se dejaron equilibrar a temperatura
ambiente y se cortaron en tiras reactivas de 4 mm de anchura.
Se añadieron 2 \mul de anticuerpo específico
de p16^{INK4a} (clon mtm D7D7), conjugado con oro coloidal
(tamaño de partícula de 40 nm; DO 44) 44) a 100 \mul de cada
lisato de muestra (comprendiendo SDS al 0,3% y Triton al 1%), se
mezclaron bien y se transfirieron a un pocillo de microvaloración.
Las tiras reactivas, revestidas con el anticuerpo de captura clon
E6H4 como el anticuerpo de captura y p16^{INK4a} recombinante
como línea de control positivo se añadieron al pocillo, se
humedeció la muestra y ejecutó hasta finalización. La señal se lee
mientras la tira reactiva sigue estando húmeda.
Los resultados se muestran en la fig. 11. Es
visible que en el formato de ensayo de los inventores las 3
muestras clasificadas como PAP IVa mediante manchado PAP del
correspondiente espécimen citológico y representando por tanto
células displásicas, produjeron bandas claramente visibles en la
zona del anticuerpo de captura manchado. Por el contrario, no se
pudieron detectar bandas en 6 muestras residuales, clasificadas
como PAP II-IIw mediante manchado PAP y por tanto
representando células normales. Las líneas de control positivo
indicaron componentes funcionales del ensayo. El control negativo
(Co) sin muestra no mostró manchado no específico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron en el presente ejemplo 20 muestras LBC
de células de orina en CytoLyt^{TM}. El análisis de proteína se
llevó a cabo en un formato ELISA según se da en el Ejemplo 1 usando
pares de anticuerpos comercialmente disponibles dirigidos contra las
respectivas proteínas analito. En ambos casos se usaron anticuerpos
monoclonales como anticuerpos de captura revestidos en las placas
ELISA, y se usaron anticuerpos policlonales como anticuerpos de
detección. Los procedimientos experimentales se ejecutaron como se
ha indicado en el presente documento. En este ejemplo, las muestras
corporales se analizaron para los analitos inmediatamente tras la
lisis y el calentamiento de las muestras.
Podría demostrarse que tanto
MCM-5 como MCM-2 se pueden detectar
fácilmente en lisados LBC procedentes de muestras de orina tras la
lisis de dichas muestras en el medio de muestra según se desvela en
el Ejemplo 1 y tras calentamiento de la disoluciones de las
muestras. Los resultados obtenidos mediante el ensayo inmunoquímico
sobre MCM-2 y MCM-5 corresponden
bastante bien con los resultados obtenidos mediante el análisis
inmunoquímico de la muestras para las proteínas respectivas. En la
citología, se usó el manchado inmunocitológico para la proteína
MCM-5 como ayuda en la evaluación del
diagnóstico.
Los experimentos anteriores demuestran que los
procedimientos desvelados en el presente documento son adecuados
para la estabilización de un amplio conjunto de analitos para
almacenamiento y trasporte y posterior análisis mediante
inmunoensayo sin necesidad de añadir conservante. Además, los
experimentos demuestran que los inmunoensayos desnaturalizantes se
aplican a un amplio conjunto de analitos y pueden ayudar a mejorar
la detección inmunoquímica de los mismos.
La presente invención facilita una conservación
sencilla y eficaz frente al coste de analitos obtenidos a partir de
un cuerpo de un mamífero para análisis posterior mediante análisis
inmunoquímico. La invención proporciona un procedimiento que obvia
el uso de ingredientes tóxicos y peligrosos que por otra parte se
pueden usar para la conservación de los analitos en las muestras.
Además, la presente invención permite una mayor precisión y
reproducibilidad de la determinación de analitos en muestras y por
tanto una mayor fiabilidad de los procedimientos de detección
inmunoquímica. Por tanto, la invención contribuye por ejemplo a
procedimientos inmunoquímicos mejorados que pueden contribuir a
resultados de ensayos que apoyen la evaluación del diagnóstico de
enfermedades en seres humanos.
Claims (13)
1. Un procedimiento para ejecutar un
inmunoensayo desnaturalizante de uno o más analitos en disolución
comprendiendo las etapas de
i) solubilizar una muestra corporal obtenida de
un sujeto mamífero en un medio de muestra que comprende SDS de
0,1% a 1% como agente desnaturalizante;
ii) calentar posteriormente el medio de muestra
que contiene dicha muestra hasta una temperatura superior a 70ºC
durante un periodo de tiempo;
iii) almacenar la muestra en el medio de
muestra, y
iv) ejecutar un inmunoensayo sobre dicha muestra
en el medio de muestra, en el que la etapa del antígeno de captura
se realiza directamente a partir de dicho medio de muestra que
contiene el analito y el SDS 0,1%-1%.
2. El procedimiento según la reivindicación 1 en
el que la temperatura superior a 70ºC es una temperatura entre
90ºC y 110ºC.
3. El procedimiento según la reivindicación 2,
en el que la temperatura entre 90ºC y 110ºC es una temperatura
entre 95ºC y 99ºC.
4. El procedimiento según cualquier
reivindicación anterior, en el que el periodo de tiempo es un
periodo de tiempo superior a 5 minutos.
5. El procedimiento según la reivindicación 4,
en el que el periodo de tiempo superior a 5 minutos es un periodo
de tiempo entre 7 minutos y 30 minutos.
6. El procedimiento según la reivindicación 5,
en el que el periodo de tiempo entre 7 minutos y 30 minutos es un
periodo de tiempo entre 10 minutos y 27 minutos.
7. El procedimiento de la reivindicación 6 en el
que el periodo de tiempo entre 10 minutos y 27 minutos es un
periodo de tiempo entre 20 y 25 minutos.
8. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que la etapa de calentamiento se
ejecuta en un dispositivo de calentamiento seleccionado entre el
grupo que comprende un baño de agua, una olla a presión, un horno
de microondas, un dispositivo de calentamiento por UV y un bloque
de calefacción.
9. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que la muestra corporal se
selecciona entre un grupo que comprende secreciones, hisopos,
lavados, fluidos corporales, semen, muestras celulares y tisulares,
muestras para citología líquida, sangre, mocos cervicales, esputo,
orina, heces, líquido cerebroespinal, bilis, secreciones
gastrointestinales, linfa, médula ósea, aspirados y biopsias de
órganos tales como biopsias de aguja o sacabocados y aspirados con
aguja (fina).
10. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que uno o más analitos se
seleccionan entre un grupo que comprende p13.5, p14, p15, p16
(también denominado como p16^{INK4a}), p19, p21, p27, p53, pRb,
p14ARF, ciclina A, ciclina B, ciclina E, MDM-2,
CDC2, Id1, osteopontina, GRP, dipeptidasa renal, her2/neu, receptor
de TGFbII, Citoqueratinas, (por ejemplo citoqueratina 8,
citoqueratina 10, citoqueratina 18), antígenos de mucina (MUC1,
MUC2, Tn, STn), EpCAM y gCatenina, receptor de concanavalina A,
GalNacTransferasa, oligosacariltransferasa, lectinas (ConA, WGA,
PNA, UEA I. DBA, SBA, SNA), placofilina, vimentina, antígenos de CD
(por ejemplo CD3, CD16, CD18, CD4, CD8, CD56, CD19, CD20),
marcadores asociados con HPV por ejemplo derivados de los genes de
HPV L1, L2, E1, E2. E4, E5, E6 o E7, CDC6, MCM2, MCM3, MCM4, MCM5,
MCM6, MCM7, proteína quinasa CDC7, Dbf4, proteína fosfatasa CDC14.
CDC45 y MCM10, Ki67, Ki-S2, PCNA, helicasa, una
topoisomerasa, Topo2alpha, factores de transcripción, miembros de
la familia E2F, Bm-3a, Bm-3b o
POLD.
11. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el almacenamiento se lleva
a cabo durante hasta 14 días.
12. El inmunoensayo desnaturalizante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que al menos una
detección inmunoquímica es un inmunoensayo seleccionado entre un
grupo que comprende inmunoprecipitación o ensayos inmunológicos,
EIA, ELISA, RIA, ensayos de flujo lateral, ensayos de flujo pistón,
tiras inmunocromatográficas y ensayos de aglutinación en
látex.
13. El inmunoensayo desnaturalizante según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que al menos un
agente desnaturalizante está presente en una concentración del 0,3%
o superior en la disolución de la muestra aplicada al ensayo.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP06101298A EP1816460B1 (en) | 2006-02-03 | 2006-02-03 | Method of performing a denaturing immunassay |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2330465T3 true ES2330465T3 (es) | 2009-12-10 |
Family
ID=36636328
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES06101298T Expired - Lifetime ES2330465T3 (es) | 2006-02-03 | 2006-02-03 | Procedimiento para realizar un inmunoensayo desnaturalizante. |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7745145B2 (es) |
| EP (1) | EP1816460B1 (es) |
| JP (2) | JP5599964B2 (es) |
| AT (1) | ATE437355T1 (es) |
| DE (1) | DE602006007942D1 (es) |
| ES (1) | ES2330465T3 (es) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4832378B2 (ja) | 2007-08-08 | 2011-12-07 | 株式会社椿本チエイン | サイレントチェーン |
| EP2773390B1 (en) | 2011-11-03 | 2020-12-30 | Tripath Imaging, Inc. | Methods and compositions for preparing samples for immunostaining |
| US20150216977A1 (en) | 2012-09-18 | 2015-08-06 | Adocia | Stable pharmaceutical composition, comprising an aqueous solution of an antibody-derived therapeutically active protein |
| WO2014045081A1 (en) * | 2012-09-18 | 2014-03-27 | Adocia | Stable pharmaceutical composition, comprising an aqueous solution of an antibody-derived therapeutically active protein |
| JP6091158B2 (ja) * | 2012-10-23 | 2017-03-08 | デンカ生研株式会社 | 尿を変性剤で前処理することによる免疫測定系の感度を上げる方法 |
| EP3304084B1 (en) | 2015-06-08 | 2022-03-23 | Arquer Diagnostics Limited | Methods and kits |
| JP6854246B2 (ja) | 2015-06-08 | 2021-04-07 | アーケア ダイアグノスティクス リミテッド | 尿サンプルの分析方法 |
| EP3511713B1 (en) * | 2016-09-06 | 2021-10-27 | Fujirebio Inc. | Tumor marker measurement method and measurement reagent |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1388734U (es) * | ||||
| CA1339952C (en) | 1984-10-29 | 1998-07-14 | William J. Knowles | Immunoassays for denatured protein analytes, particularly hb alc, and monoclonal antibodies thereto |
| US5686073A (en) * | 1990-05-23 | 1997-11-11 | The University Of Iowa Research Foundation | Polyclonal and monoclonal antibodies against a 43 KDA dystrophin associated protein |
| DE4239232A1 (de) * | 1992-11-21 | 1994-05-26 | Schubert Werner | Vorrichtung und Verfahren für die Wärmedenaturierung frischen Gewebes im histologischen Labor |
| US5965454A (en) * | 1993-02-03 | 1999-10-12 | Histaggen Incorporated | Automated histo-cytochemistry apparatus and encapsulation system for processing biological materials |
| JP3283327B2 (ja) * | 1993-04-16 | 2002-05-20 | 協和メデックス株式会社 | 固相免疫測定法 |
| US5654145A (en) * | 1994-10-04 | 1997-08-05 | La Jolla Cancer Research Foundation | Trophinin and trophinin-assisting nucleic acids and methods of detection thereof |
| US6110668A (en) * | 1996-10-07 | 2000-08-29 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Gene synthesis method |
| US7306926B2 (en) | 1998-07-01 | 2007-12-11 | Mtm Laboratories Ag | Method for detecting carcinomas in a solubilized cervical body sample |
| US20020039583A1 (en) * | 1999-09-30 | 2002-04-04 | Subjeck John R. | Stress protein compositions and methods for prevention and treatment of cancer and infectious disease |
| WO2001068817A1 (fr) * | 2000-03-16 | 2001-09-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Facteur de reparation du rein |
| GB0106051D0 (en) * | 2001-03-12 | 2001-05-02 | Isis Innovation | Diagnostic screens for alzheimer's disease |
| JP3532537B2 (ja) * | 2001-07-05 | 2004-05-31 | 株式会社テムコジャパン | 骨伝導ヘッドセット |
| DE60200248T2 (de) | 2002-08-01 | 2005-01-27 | Mtm Laboratories Ag | Verfahren für Lösung-basierte Diagnose |
| EP1607742B1 (en) * | 2003-03-24 | 2011-11-23 | Mitsubishi Chemical Medience Corporation | Latex reagent for adiponectin analysis and method of adiponectin analysis |
| JP2004333229A (ja) * | 2003-05-02 | 2004-11-25 | Sysmex Corp | タンパク質の定量方法および定量キット |
| US7326577B2 (en) * | 2003-10-20 | 2008-02-05 | Esoterix, Inc. | Cell fixation and use in phospho-proteome screening |
| US7588890B2 (en) * | 2004-04-16 | 2009-09-15 | Wei-Sing Chu | Device for extracting biological molecules from tissue specimens and methods for preparing the same |
| JP3944499B2 (ja) * | 2004-08-30 | 2007-07-11 | 株式会社エスアールエル | タンパク質に結合した糖化最終産物の測定方法 |
-
2006
- 2006-02-03 EP EP06101298A patent/EP1816460B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2006-02-03 ES ES06101298T patent/ES2330465T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2006-02-03 AT AT06101298T patent/ATE437355T1/de not_active IP Right Cessation
- 2006-02-03 DE DE602006007942T patent/DE602006007942D1/de not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-01-31 US US11/701,522 patent/US7745145B2/en active Active
- 2007-02-01 JP JP2007023582A patent/JP5599964B2/ja active Active
-
2010
- 2010-02-23 US US12/710,997 patent/US7927819B2/en active Active
-
2012
- 2012-12-18 JP JP2012275557A patent/JP2013083660A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2013083660A (ja) | 2013-05-09 |
| DE602006007942D1 (de) | 2009-09-03 |
| EP1816460A1 (en) | 2007-08-08 |
| US7745145B2 (en) | 2010-06-29 |
| JP2007206077A (ja) | 2007-08-16 |
| US20070184505A1 (en) | 2007-08-09 |
| US20100167323A1 (en) | 2010-07-01 |
| ATE437355T1 (de) | 2009-08-15 |
| US7927819B2 (en) | 2011-04-19 |
| JP5599964B2 (ja) | 2014-10-01 |
| EP1816460B1 (en) | 2009-07-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2342535T3 (es) | Procedimientol para detectar afecciones de relevancia medica en una muestra de lbc solubilizada. | |
| RU2315312C2 (ru) | Способ диагностики на основе раствора | |
| US20230133528A1 (en) | Method for prediction of the progression risk of tumors | |
| US7927819B2 (en) | Method for stabilization of proteins in solution | |
| Raffone et al. | BAG 3 expression correlates with the grade of dysplasia in squamous intraepithelial lesions of the uterine cervix | |
| Agarwal et al. | Immunostaining as an adjunct to cytology for diagnosis of pancreatic adenocarcinoma | |
| Tsuji et al. | Uterine cervical carcinomas associated with lobular endocervical glandular hyperplasia | |
| CN107271672B (zh) | 外泌体p-ERK在制备结直肠癌诊断产品中的应用 | |
| Ding et al. | The value of p63 and CK5/6 expression in the differential diagnosis of ductal lesions of breast | |
| Angeles et al. | Pathologic quiz case: an incidentally detected mass of the uterine cervix | |
| Naik et al. | I. Normal Vulvar Epithelium and Epithelium Adjacent to Vulvar Intraepithelial Neoplasia and Squamous Cell Carcinoma | |
| Briese et al. | Expression of the high-mobility group protein HMGI (Y) in gestational trophoblastic diseases | |
| Raspollini et al. | In situ adenocarcinoma and squamous carcinoma of uterine cervix: Pathological and immunohistochemical analysis with cytokeratin 13 | |
| Tang et al. | Modern Methods in Cytology |