ES2330472T3

ES2330472T3 - Compuestos.

Info

Publication number: ES2330472T3
Application number: ES06791540T
Authority: ES
Inventors: Rachael Ann Ancliff; Mark James Bamford; Simon Teanby Hodgson; Christopher Allan Parr; Panayiotis Alexandrou Procopiou; David Matthew Wilson; Michael Woodrow
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2005-07-19
Filing date: 2006-07-17
Publication date: 2009-12-10
Anticipated expiration: 2026-07-17
Also published as: JP2009501744A; WO2007009739A1; EP1904484A1; ATE440836T1; EP1904484B1; DE602006008788D1; GB0514811D0; US20080207638A1

Abstract

Un compuesto de fórmula (I) que es 4-[(2,4-difluorofenil)carbonil]-1-[4-({3-[2-metil-1 -pirrolidinil]propil}oxi) fenil]-2-piperazinona **(Ver fórmula)** o una sal del mismo.

Description

Compuestos.

La presente invención se refiere a compuestos, a procedimientos para su preparación, a composiciones que los contienen y a su uso en el tratamiento de diversos trastornos, en particular trastornos inflamatorios y/o alérgicos del tracto respiratorio.

Rinitis alérgica, inflamación pulmonar y congestión son afecciones médicas que a menudo están asociadas con otras afecciones tales como asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), rinitis alérgica estacional y rinitis alérgica perenne. En general, estas afecciones están mediadas, al menos en parte, por inflamación asociada con la liberación de histamina de diversas células, en particular mastocitos.

La rinitis alérgica, conocida también como "fiebre del heno" afecta a una gran proporción de la población mundial. Hay dos tipos de rinitis alérgica, estacional y perenne. Los síntomas clínicos de la rinitis alérgica estacional, típicamente incluyen picor e irritación nasal, estornudos y rinorrea acuosa que a menudo va acompañada de congestión nasal. Los síntomas clínicos de la rinitis alérgica perenne son similares excepto que la obstrucción nasal puede ser más pronunciada. Cualquier tipo de rinitis alérgica puede causar también otros síntomas tales como picor de la garganta y/o los ojos, epífora y edema alrededor de los ojos. Los síntomas de rinitis alérgica pueden variar de intensidad de un nivel de molestia a debilitante.

La rinitis alérgica y otras afecciones alérgicas están asociadas con la liberación de histamina de diversos tipos de células aunque particularmente mastocitos. Los efectos fisiológicos de la histamina están mediados clásicamente por tres subtipos de receptor, denominados H1, H2 y H3. Los receptores H1 están ampliamente distribuidos por el SNC y el periférico, y están implicados en insomnio e inflamación aguda. Los receptores H2 median la secreción de ácido gástrico en respuesta a histamina. Los receptores H3 están presentes en las terminaciones nerviosas tanto en el SNC como en el periférico y median la inhibición de la liberación de neurotransmisores [Hill et al., Pharmacol. Rev. 49:253-278 (1997)]. Recientemente, se ha identificado un cuarto miembro de la familia de los receptores de histamina, denominado receptor H4 [Hough, Mol. Pharmacol. 59:415-419, (2001)]. Aunque la distribución del receptor H4 parece estar restringida a las células de los sistemas inmunitario e inflamatorio, sigue sin identificarse un papel fisiológico para este receptor.

La activación de los receptores H1 en vasos sanguíneos y terminaciones nerviosas son responsables de la mayoría de los síntomas de la rinitis alérgica, que incluyen picor, estornudos, y la producción de rinorrea acuosa. Los compuestos antihistamínicos, es decir, los fármacos que son antagonistas selectivos de los receptores H1 tales como clorfeniramina y cetirizina, son eficaces para tratar el picor, estornudos y rinorrea asociados con rinitis alérgica, pero no son eficaces contra los síntomas de la congestión nasal [Aaronson, Ann. Allergy, 67:541-547, (1991)].

Los receptores H3 de histamina se expresan ampliamente tanto en el SNC como en las terminaciones nerviosas periféricas y median la inhibición de la liberación de neurotransmisores. La estimulación eléctrica in vitro de los nervios simpáticos periféricos en vena safena humana aislada da como resultado un aumento en la liberación de noradrenalina y la contracción de músculo liso, que puede inhibirse mediante agonistas del receptor H3 de histamina [Molderings et al., Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol., 346:46-50, (1992); Valentine et al., Eur. J. Pharmacol., 366:73-78, (1999)]. Los agonistas del receptor H3 inhiben también el efecto de la activación del nervio simpático sobre el tono vascular en mucosa nasal porcina [Varty & Hey, Eur. J. Pharmacol., 452:339-345, (2002)]. In vivo, los agonistas del receptor H3 inhiben la disminución en la resistencia de las vías nasales producida por la activación del nervio simpático [Hay et al., Arzneim-Forsch Drug Res., 48:881-888 (1998)]. La activación de los receptores H3 de histamina en mucosa nasal humana inhibe la vasoconstricción simpática [Varty et al., Eur. J. Pharmacol., 484:83-89, (2004)]. Adicionalmente, se ha demostrado que los antagonistas del receptor H3 junto con los antagonistas del receptor H1 de histamina invierten los efectos de la activación de mastocitos en la resistencia de las vías nasales y el volumen de la cavidad nasal, un índice de congestión nasal [Mcleod et al., Am. J. Rhinol., 13: 391-399, (1999)], y otras evidencias para la contribución de los receptores H3 al bloqueo nasal inducido por histamina se proporciona mediante estudios de desafío nasal de histamina realizados en sujetos humanos normales [Tailor-Clark et al., Br. J. Pharmacol., 1-8(2005)].

El documento WO2004/035556 describe ciertas piperazinas sustituidas, (1,4)-diazepinas y 2,5-diazabiciclo [2.2.1]heptanos como antagonistas de H1 y/o H3 de histamina o antagonistas inversos de H3 de histamina.

La presente invención se refiere a compuestos (o las sales de los mismos) que son antagonistas y/o agonistas inversos de H3 de histamina. Estos compuestos (o las sales de los mismos) pueden ser útiles en el tratamiento de diversos trastornos en particular trastornos inflamatorios y/o alérgicos, tales como trastornos inflamatorios y/o alérgicos del tracto respiratorio, por ejemplo rinitis alérgica, que están asociados con la liberación de histamina de células tales como mastocitos. Además, los compuestos de la invención (o las sales de los mismos) pueden mostrar un perfil mejorado sobre los antagonistas/agonistas inversos de H3 conocidos, en el sentido de que poseen una o más de las siguientes propiedades:

(i): potente actividad antagonista/agonista inverso de H3;

(ii): al menos 100 veces más selectivo para el receptor H3 respecto al receptor H1;

(iii): baja penetración en el SNC;

(iv): biodisponibilidad mejorada; y

(v): menor eliminación y/o mayor semi-vida en sangre.

Los compuestos que tienen dicho perfil pueden ser eficaces por vía oral, y/o susceptibles de una administración diaria y/o adicionalmente pueden tener un perfil de efectos secundarios mejorado comparado con otras terapias existentes.

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De esta manera, la presente invención proporciona, en un primer aspecto, un compuesto de fórmula (I):

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o una sal del mismo, tal como una sal farmacéuticamente aceptable.

Se apreciará que los compuestos de fórmula (I) poseen un átomo de carbono asimétrico de manera que pueden formarse isómeros ópticos, por ejemplo, enantiómeros. La presente invención abarca todos los isómeros ópticos de los compuestos de fórmula (I) ya sean isómeros individuales aislados para estar sustancialmente libres del otro isómero (es decir, puros) o en forma de mezclas de los mismos. Un isómero individual aislado para que esté sustancialmente libre del otro isómero (es decir, puro) puede aislarse de manera que está presente menos de aproximadamente el 10%, particularmente menos de aproximadamente el 1%, por ejemplo menos de aproximadamente el 0,1% del otro
isómero.

De esta manera, la presente invención incluye el racemato 4-[(2,4-difluorofenil)carbonil]-1-[4-({3-[2-metil-1-pirrolidinil]propil}oxi)fenil]-2-piperazinona, el isómero R 4-[(2,4-difluorofenil)carbonil]-1-[4-({3-[(2R)-2-metil-1-
pirrolidinil]propil}oxi)fenil]-2-piperazinona y el isómero S 4-[(2,4-difluorofenil)carbonil]-1-[4-({3-[(2S)-2-metil-1-pirrolidinil]propil}oxi)fenil]-2-piperazinona y sales o solvatos de los mismos.

Se debe entender adicionalmente que la presente invención cubre los compuestos de fórmula (I) como la base libre y en forma de las sales de los mismos, tales como las sales farmacéuticamente aceptables.

Se debe entender adicionalmente que las referencias citadas posteriormente en este documento a un compuesto de fórmula (I) o el compuesto de la invención se refieren a un compuesto de fórmula (I) en forma de la base libre, o en forma de una sal, o en forma de un solvato.

Los compuestos de la presente invención pueden estar en forma de y/o pueden administrarse en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición ácidos. Para una revisión de las sales adecuados, véase Berge et al., J. Pharm. Sci., 66:1-19 (1977).

Una sal de adición de ácidos farmacéuticamente aceptable puede prepararse fácilmente usando un ácido deseado según sea apropiado. La sal puede precipitar en solución y puede recogerse por filtración o puede recuperarse por evaporación del disolvente. Típicamente, una sal de adición de ácidos farmacéuticamente aceptable puede formarse por reacción de un compuesto de fórmula (I) con un ácido inorgánico u orgánico adecuado (tal como ácido bromhídrico, clorhídrico, fórmico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, succínico, maleico, acético, fumárico, cítrico, tartárico, benzoico, p-toluenosulfónico, metanosulfónico o naftalenosulfónico), opcionalmente en un disolvente adecuado tal como un disolvente orgánico, dando la sal que normalmente se aísla, por ejemplo, por cristalización y filtración. De esta manera, una sal de adición de ácidos farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula (I) puede ser, por ejemplo, una sal bromhidrato, clorhidrato, formiato, sulfato, nitrato, fosfato, succinato, maleato, acetato, fumarato, citrato, tartrato, benzoato, p-toluenosulfonato, metanosulfonato o naftalenosulfonato.

Otras sales no farmacéuticamente aceptables, por ejemplo oxalatos o trifluoroacetatos, pueden usarse, por ejemplo en el aislamiento de los compuestos de la invención, y se incluyen dentro del alcance de la presente invención. La invención incluye dentro de su alcance todas las posibles formas estequiométricas y no estequiométricas de las sales de los compuestos de fórmula (I).

Se apreciará que muchos compuestos orgánicos pueden formar complejos con disolventes en los que se hacen reaccionar o en los que se precipitan o cristalizan. Estos complejos se conocen como "solvatos". Por ejemplo, un complejo con agua se conoce como un "hidrato". Los disolventes con altos puntos de ebullición y/o disolventes con una alta propensión a formar enlaces de hidrógeno tales como agua, xileno, N-metil pirrolidinona, metanol pueden usarse para formar solvatos. Los procedimientos para la identificación de los solvatos incluyen, aunque sin limitación, RMN y microanálisis. Los solvatos de los compuestos de la invención están dentro del alcance de la
invención.

Los compuestos de fórmula (I) pueden estar en forma cristalina o amorfa. Adicionalmente, algunas de las formas cristalinas de los compuestos de fórmula (I) pueden existir como polimorfos, que se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Las formas polimórficas más termodinámicamente estables de los compuestos de fórmula (I) son de particular interés.

Las formas polimórficas de los compuestos de fórmula (I) pueden caracterizarse y diferenciarse usando numerosas técnicas analíticas convencionales, incluyendo, aunque sin limitación, patrones de difracción de rayos X en polvo (XRPD), espectros de infrarrojo (IR), espectros Raman, calorimetría de exploración diferencial (DSC), análisis termogravimétrico (TGA) y resonancia magnética nuclear en estado sólido (RMN).

Ciertos compuestos de fórmula (I) pueden existir en una de las diversas formas tautoméricas. Se entenderá que la presente invención abarca todos los tautómeros de los compuestos de fórmula (I) tanto como tautómeros individuales o como mezclas de los mismos.

Se apreciará a partir de lo anterior que dentro del alcance de la invención se incluyen todos los solvatos, hidratos, complejos, tautómeros, isómeros ópticos y formas polimórficas de los compuestos de la invención y sales de los mismos.

La presente invención también proporciona procedimientos para la preparación de los compuestos de fórmula (I) o sales de los mismos.

De esta manera, de acuerdo con un primer procedimiento A, un compuesto de fórmula (I) puede prepararse haciendo reaccionar un compuesto de formula (II)

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o una sal del mismo con ácido 2,4-difuorobenzoico (que está disponible en el mercado en Aldrich, por ejemplo).

La reacción puede realizarse en presencia de una base adecuada tal como trietilamina y un agente de acoplamiento adecuado tal como tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TBTU), en un disolvente apropiado tal como diclorometano o N,N-dimetilformamida.

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Los compuestos de fórmula (II) pueden prepararse de acuerdo con el siguiente esquema de reacción o uno similar:

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Reactivos y condiciones: a) cloruro de cloroacetilo, carbonato potásico, tetrahidrofurano; b) etanolamina, 60ºC; c) Boc_{2}O diclorometano, 4-dimetilaminopiridina; d) cloruro de metanosulfonilo, trietilamina, diclorometano; e) NaH, dimetilformamida; f) H_{2}, paladio al 10% sobre carbono, etanol; g) 1-bromo-3-cloropropano, carbonato potásico, 2-butanona; h) 2-metilpirrolidina, 2(R)-metilpirrolidina o 2(S)-metilpirrolidina, carbonato potásico, yoduro potásico, 2-butanona; i) ácido trifluoroacético, diclorometano.

Las etapas d y e pueden realizarse en una etapa sin el aislamiento del compuesto (VII). Como alternativa, el compuesto (VII) puede aislarse y después usarse posteriormente para preparar el compuesto (VI).

Se apreciará que otros reactivos adecuados pueden sustituir a los disolventes, bases, grupos protectores etc. mencionados específicamente anteriormente. Se entenderá adicionalmente que las condiciones de reacción tales como la temperatura y los tiempos de reacción etc. pueden variarse de las condiciones específicas descritas en el presente documento, según sea apropiado, dependiendo de los reactivos elegidos.

De esta manera, el compuesto (IX), por ejemplo, puede protegerse con grupos benciloxicarbonilo o 2',2',2'-tricloroetoxicarbonilo. La activación del compuesto (VIII) puede conseguirse por reacción con cloruro de tosilo o anhídrido tríflico en piridina o en diclorometano y en presencia de una base tal como diisopropiletilamina proporcionando el p-toluenosulfonato éster o el trifluorometanosulfonato éster correspondiente. La ciclación del compuesto (VII) al compuesto (VI) puede conseguirse en presencia de otras bases cinéticas tales como bis(trimetilsilil)amida sódica en tetrahidrofurano. La escisión del grupo protector de (III) puede proporcionar una sal, por ejemplo sal del ácido trifluoroacético en el caso de la escisión del grupo protector BOC con ácido trifluoroacético. La base libre puede aislarse entonces después de la cromatografía de intercambio de iones en un cartucho SCX-2. Como alternativa, la sal puede usarse en la reacción de acilación en presencia de una base tal como trietilamina, diisopropiletilamina o diisopropiletilamina soportada en polímero.

De acuerdo con un segundo procedimiento B, una sal de un compuesto de fórmula (I) puede prepararse por intercambio de contra-iones, o precipitación de la sal deseada a partir de la base libre.

Los grupos protectores que pueden emplearse en las rutas sintéticas descritas en el presente documento y los medios para su retirada pueden encontrarse en T. W. Greene "Protective Groups in Organic Synthesis" (3ª edición, J. Wiley and Sons, 1999). Los grupos protectores de amina adecuados incluyen sulfonilo (por ejemplo, tosilo), acilo (por ejemplo, acetilo, 2',2',2'-tricloroetoxicarbonilo, benciloxicarbonilo o t-butoxicarbonilo) y arilalquilo (por ejemplo, bencilo), que pueden retirarse por hidrólisis (por ejemplo, usando un ácido tal como cloruro de hidrógeno en dioxano o ácido trifluoroacético en diclorometano) o reductoramente (por ejemplo, hidrogenólisis de un grupo bencilo o retirada reductora de un grupo 2',2',2'-tricloroetoxicarbonilo usando cinc en ácido acético) según sea apropiado. Otros grupos protectores de amina adecuados incluyen trifluoroacetilo (-COCF_{3}) que puede retirarse por hidrólisis catalizada por base o un grupo bencilo unido a una resina en fase sólida, tal como una resina de Merrifield unida al grupo 2,6-dimetoxibencilo (engarce de Ellman), que puede retirarse por hidrólisis catalizada por ácido, por ejemplo con ácido trifluoroacético.

Se apreciará adicionalmente que los enantiómeros R y S pueden aislarse del racemato por procedimientos convencional tales como HPLC preparativa que implica una fase estacionaria quiral, por resolución usando cristalización fraccionada de una sal de la base libre con un ácido quiral, por conversión química en un diastereoisómero usando un auxiliar quiral seguido de la separación cromatográfica de los isómeros y después la retirada del auxiliar quiral y regeneración del enantiómero puro, o por síntesis asimétrica total.

Se apreciará que todos los nuevos intermedios usados para preparar los compuestos de la invención forman aún otro aspecto más de la presente invención.

Los ejemplos de patologías en las que los compuestos de fórmula (I), o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos pueden tener efectos anti-inflamatorios y/o anti-alérgicos potencialmente beneficiosos incluyen enfermedades del tracto respiratorio tales como bronquitis (incluyendo bronquitis crónica), asma (incluyendo reacciones asmáticas inducidas por alergenos), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis quística, sinusitis y rinitis alérgica (estacional y perenne). Otras patologías incluyen enfermedades del tracto gastrointestinal tales como enfermedades intestinales inflamatorias incluyendo enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa) y enfermedades inflamatorias intestinales secundarias por exposición a radiación o exposición a alergenos.

Adicionalmente, los compuestos de la invención pueden usarse para tratar nefritis, enfermedades de la piel tales como psoriasis, eccema, dermatitis alérgica y reacciones de hipersensibilidad.

Los compuestos de la invención pueden usarse también en el tratamiento de poliposis nasal, conjuntivitis o pruritis.

Otras enfermedades incluyen enfermedades inflamatorias del tracto gastrointestinal tales como enfermedad inflamatoria del intestino.

Una enfermedad de particular interés es rinitis alérgica.

Los compuestos que son antagonistas y/o agonistas inversos del receptor H3 pueden usarse también en otras enfermedades en las que puede estar implicada la activación del receptor H3. Dichas enfermedades pueden incluir rinitis no alérgica.

Los especialistas en la técnica apreciarán que las referencias en el presente documento a tratamiento o terapia se extienden a profilaxis así como al tratamiento en condiciones establecidas.

Como se ha mencionado anteriormente, los compuestos de fórmula (I) son útiles como agentes terapéuticos. Por lo tanto se proporciona, como otro aspecto de la invención, un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso en terapia.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cualquiera de las enfermedades anteriores.

Los compuestos de fórmula (I) pueden usarse en un procedimiento para el tratamiento de cualquiera de las enfermedades anteriores, en un sujeto humano o animal que lo necesite, procedimiento que comprende administrar una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Cuando se usan en terapia, los compuestos de fórmula (I) normalmente se formulan en una composición farmacéutica adecuada. Dichas composiciones pueden prepararse usando procedimientos convencionales.

De esta manera, la presente invención proporciona adicionalmente una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo opcionalmente con uno o más vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Una composición de la invención, que puede prepararse por mezcla, adecuadamente a temperatura ambiente y presión atmosférica, normalmente se adapta para administración oral, parenteral o rectal y, como tal, puede estar en forma de comprimidos, cápsulas, preparaciones líquidas orales, polvos, gránulos, grageas, polvos reconstituibles, soluciones o suspensiones inyectables o infundibles o supositorios. Generalmente se prefieren las composiciones administrables por vía oral.

Los comprimidos y cápsulas para administración oral pueden estar en forma de una dosis unitaria, y pueden contener excipientes convencionales, tales como agentes aglutinantes, cargas, lubricantes para formación de comprimidos, disgregantes y agentes de humectación aceptables. Los comprimidos pueden recubrirse de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la práctica farmacéutica normal.

Las preparaciones líquidas orales pueden estar en forma de, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleosas, soluciones, emulsiones, jarabes o elixires, o pueden estar en forma de un producto seco para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Dichas preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspensión, agentes emulsionantes, vehículos no acuosos (que pueden incluir aceites comestibles), conservantes, y, si se desea, aromatizantes o colorantes convencionales.

Para administración parenteral, las formas de dosificación unitaria se preparan utilizando un compuesto de la invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un vehículo estéril. El compuesto, dependiendo del vehículo y concentración usados, puede suspenderse o disolverse en el vehículo. Al preparar soluciones, el compuesto puede disolverse para inyección y esterilizarse por filtrado antes de llenar con ello un vial o ampolla adecuados y sellarlos. Ventajosamente, adyuvantes tales como un anestésico local, conservantes y agentes tamponantes se disuelven en el vehículo. Para potenciar la estabilidad, la composición puede congelarse después de llenar con ella el vial y el agua se retira al vacío. Las suspensiones parenterales se preparan sustancialmente de la misma manera, excepto que el compuesto se suspende en el vehículo en lugar de disolverlo, y la esterilización no puede realizarse por filtración. El compuesto puede esterilizarse por exposición a óxido de etileno antes de la suspensión en un vehículo estéril. Un tensioactivo o agente humectante puede incluirse en la composición para facilitar la distribución uniforme del compuesto.

La composición puede contener de aproximadamente el 0,1% al 99% en peso, tal como de aproximadamente el 10 al 60% en peso, del material activo, dependiendo del procedimiento de administración. La dosis del compuesto usado en el tratamiento de los trastornos mencionados anteriormente variará de la manera habitual con la gravedad de los trastornos, el peso del enfermo, y otros factores similares. Sin embargo, como una guía general las dosis unitarias adecuadas pueden ser de aproximadamente 0,05 a 1000 mg, más adecuadamente de aproximadamente 1,0 a 200 mg, y dichas dosis unitarias pueden administrarse más de una vez al día, por ejemplo dos o tres al día. Dicha terapia puede prolongarse durante numerosas semanas o meses. En una realización, los compuestos y composiciones de acuerdo con la invención son adecuados para administración oral y/o son capaces de administración una vez al día.

Los compuestos y composiciones de acuerdo con la invención pueden usarse junto con o incluyen uno o más agentes terapéuticos distintos, por ejemplo seleccionados entre agentes anti-inflamatorios, agentes anticolinérgicos (particularmente un antagonista del receptor M_{1}/M_{2}/M_{3}), agonistas del adrenorreceptor \beta_{2}, agentes antiinfecciosos (por ejemplo, antibióticos, antivirales), o anti-histaminas. La invención proporciona por lo tanto, en otro aspecto más, una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con uno o más agentes terapéuticamente activos distintos, por ejemplo seleccionados entre un agente anti-inflamatorio (por ejemplo otro corticoesteroide o un AINE), un agente anticolinérgico, un agonista del adrenorreceptor \beta_{2}, un agente antiinfeccioso (por ejemplo, un antibiótico o un antiviral), o una antihistamina. Las combinaciones que comprenden un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con un agonista del adrenorreceptor \beta_{2}, y/o un anticolinérgico, y/o un inhibidor de PDE-4 forman otro aspecto adicional de la invención. Las combinaciones de la invención pueden comprender uno o dos agentes terapéuticos distintos, y pueden incluir opcionalmente uno o más vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables según se desee.

Quedará claro para una persona especialista en la técnica que, cuando sea apropiado, el otro u otros ingredientes terapéuticos pueden usarse en forma de sales, (por ejemplo, en forma de sales de metal alcalino o de amina o en forma de sales de adición de ácidos), o profármacos, o en forma de ésteres (por ejemplo, ésteres de alquilo inferior), o en forma de solvatos (por ejemplo, hidratos) para optimizar la actividad y/o estabilidad y/o características físicas (por ejemplo, solubilidad) del ingrediente terapéutico. Quedará claro también que, cuando sea apropiado, los ingredientes terapéuticos pueden usarse en una forma ópticamente pura.

Los ejemplos de agonistas del adrenorreceptor \beta_{2} incluyen salmeterol (por ejemplo, en forma de racemato o un enantiómero individual tal como el enantiómero R o el enantiómero S), salbutamol (por ejemplo, en forma de racemato o como un enantiómero individual tal como el enantiómero R), formoterol (por ejemplo, en forma de racemato o como un enantiómero individual tal como el enantiómero R), salmefamol, fenoterol carmoterol, etanterol, naminterol, clenbuterol, pirbuterol, flerbuterol, reproterol, bambuterol, indacaterol, terbutalina y sales de los mismos, por ejemplo la sal de salmeterol xinafoato (1-hidroxi-2-naftalenocarboxilato), la sal sulfato o la base libre de salbutamol o la sal fumarato de formoterol. Las combinaciones que comprenden un compuesto de la invención junto con un agonista del adrenorreceptor \beta_{2} de actuación más prolongada, que proporciona broncodilatación eficaz durante aproximadamente 12 horas o más, puede ser de particular interés.

Otros agonistas del adrenorreceptor \beta_{2} incluyen aquellos descritos en los documentos WO 02/066422, WO
02/070490, WO 02/076933, WO 03/024439, WO 03/072539, WO 03/091204, WO 04/016578, WO 2004/022547, WO 2004/037807, WO 2004/037773, WO 2004/037768, WO 2004/039762, WO 2004/039766, WO 01/42193 y WO 03/042160. Los agonistas del adrenorreceptor \beta_{2} ejemplares incluyen:

3-(4-{[6-({(2R)-2-hidroxi-2-[4-hidroxi-3-(hidroximetil)fenil]etil}amino)hexil]oxi}butil)bencenosulfonamida;

3-(3-{[7-({(2R)-2-hidroxi-2-[4-hidroxi-3-hidroximetil)fenil]etil}-amino)heptil]oxi}propil)bencenosulfonamida;

4-{(1R)-2-[(6-{2-[(2,6-diclorobencil)oxi]etoxi}hexil)amino]-1-hidroxietil}-2-(hidroximetil)fenol;

4-{(1R)-2-[(6-{4-[3-(ciclopentilsulfonil)fenil]butoxi}hexil)amino]-1-hidroxietil}-2-(hidroximetil)fenol;

N-[2-hidroxil-5-[(1R)-1-hidroxi-2-[[2-4-[[(2R)-2-hidroxi-2-feniletil]amino]fenil]etil]amino]etil]fenil]formamida;

N-2{2-[4-(3-fenil-4-metoxifenil)aminofenil]etil}-2-hidroxi-2-(8-hidroxi-2(1H)-quinolinon-5-il)etil-amina; y

5-[(R)-2-(2-{4-[4-(2-amino-2-metil-propoxi)-fenilamino]-fenil}-etilamino)-1-hidroxi-etil]-8-hidroxi-1H-quinolin-2-ona.

Los agentes anti-inflamatorios incluyen corticoesteroides. Los corticoesteroides que pueden usarse junto con los compuestos de la invención son aquellos corticoesteroides orales e inhalados y sus pro-fármacos que tienen actividad anti-inflamatoria. Los ejemplos incluyen metil prednisolona, prednisolona, dexametasona, propionato de fluticasona, éster S-fluorometílico del ácido 6\alpha,9\alpha-difluoro-11\beta-hidroxi-16\alphaa-metil-17\alpha-[(4-metil-1,3-tiazol-5-carbonil)oxi]-3-oxo-androsta-1,4-dieno-17\beta-carbotioico, éster S-fluorometílico del ácido 6\alpha,9\alpha-difluoro-17\alpha-[(2-furanilcarbonil)oxi]-11\beta-hidroxi-16\alpha-metil-3-oxo-androsta-1,4-dieno-17\beta-carbotioico, S-(2-oxo-tetrahidro-furan-3S-il) éster del ácido 6\alpha,9\alpha-difluoro-11\beta-hidroxi-16a-metil-3-oxo-17\alpha-propioniloxi-androsta-1,4-dieno-17\beta-carbotioico, éster S-cianometílico del ácido 6\alpha,9\alpha-difluoro-11\beta-hidroxi-16\alpha-metil-3-oxo-17\alpha-(2,2,3,3-tetrametilciclopropilcarbonil)oxi-androsta-1,4-dieno-17\beta-carbotioico, éster S-fluorometílico del ácido 6\alpha,9\alpha-difluoro-11\beta-hidroxi-16\alpha-metil-17\alpha-(1-metilciclopropilcarbonil)oxi-3-oxo-androsta-1,4-dieno-17\beta-carbotioico, ésteres de beclometasona (por ejemplo, el 17-propionato éster o el 17,21-dipropionato éster), budesonida, flunisolida, ésteres de mometasona (por ejemplo, el furoato éster), triamcinolona acetonida, rofleponida, ciclesonida (16\alpha,17-[[(R)-ciclohexilmetileno]bis(oxi)]-11\beta,21-dihidroxi-pregna-1,4-dieno-3,20-diona), propionato de butixocort, RPR-106541, y ST-126. Los corticoesteroides que pueden ser de interés incluyen propionato de fluticasona, éster S-fluorometílico del ácido 6\alpha,9\alpha-difluoro-11\beta-hidroxi-16\alpha-metil-17\alpha-[(4-metil-1,3-tiazol-5-carbonil)oxi]-3-oxo-androsta-1,4-dieno-17p-carbotioico y éster S-fluorometílico del ácido 6\alpha,9\alpha-difluoro-17\alpha-[(2-furanilcarbonil)oxi]-11\beta-hidroxi-16\alpha-metil-3-oxo-androsta-1,4-dieno-17\beta-carbotioico, éster S-cianometílico del ácido 6\alpha,9\alpha-difluoro-11\beta-hidroxi-16\alpha-metil-3-oxo-17\alpha-(2,2,3,3-tetrametilciclopropilcarbonil)oxi-androsta-1,4-dieno-17\beta-carbotioico y éster S-fluorometílico del ácido 6\alpha,9\alpha-difluoro-11\beta-hidroxi-16\alpha-metil-17\alpha-(1-metilciclopropilcarbonil)oxi-3-oxo-androsta-1,4-dieno-17\beta-carbotioico, especialmente éster S-fluorometílico del ácido 6\alpha,9\alpha-difluoro-17\alpha-[(2-furanilcarbonil)oxi]-11\beta-hidroxi-16\alpha-metil-3-oxo-androsta-1,4-dieno-17\beta-carbotioico.

Los compuestos no esteroideos que tienen agonismo de glucocorticoides que pueden poseer selectividad por la trans-represión sobre la trans-activación y que pueden ser útiles en terapia de combinación incluyen aquellos cubiertos en las siguientes patentes: WO 03/082827, WO 01/10143, WO 98/54159, WO 04/005229, WO 04/009016, WO 04/009017, WO 04/018429, WO 03/104195, WO 03/082787, WO 03/082280, WO 03/059899, WO 03/101932, WO 02/02565 WO 01/16128, WO 00/66590, WO 03/086294, WO 04/026248, WO 03/061651, WO 03/08277.

Los agentes anti-inflamatorios incluyen fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (AINE). Los AINE incluyen cromoglicato sódico, nedocromil sódico, inhibidores de fosfodiesterasa (PDE) (por ejemplo, teofilina, inhibidores de PDE4 o inhibidores mixtos de PDE3/PDE4), antagonistas de leucotrieno, inhibidores de de la síntesis de leucotrieno (por ejemplo, montelukast), inhibidores de iNOS, inhibidores de triptasa y elastasa, antagonistas de integrina beta-2 y agonistas o antagonistas del receptor de adenosina (por ejemplo, agonistas de adenosina 2a), antagonistas de citoquina (por ejemplo, antagonistas de quimioquina, tales como un antagonista de CCR3) o inhibidores de la síntesis de citoquina, o inhibidores de 5-lipooxigenasa. Los inhibidores de iNOS incluyen aquellos descritos en los documentos WO 93/13055, WO 98/30537, WO 02/50021, WO 95/34534 y WO 99/62875. Los inhibidores de CCR3 incluyen aquellos descritos en el documento WO 02/26722. Los agonistas de adenosina 2a incluyen aquellos descritos en el documento WO 2005/116037.

El inhibidor específico de PDE4 útil en combinaciones con los compuestos de la invención puede incluir cualquier compuesto que se sabe que inhibe la enzima PDE4 o que se ha descubierto que actúa como un inhibidor de PDE4, y que sólo son inhibidores de PDE4, no compuestos que inhiben otros miembros de la familia de PDE, tales como PDE3 y PDE5, así como PDE4.

Los inhibidores de PDE4 incluyen ácido cis-4-ciano-4-(3-ciclopentiloxi-4-metoxifenil)ciclohexan-1-carboxílico, 2-carbometoxi-4-ciano-4-(3-ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxifenil)ciclohexan-1-ona y cis-[4-ciano4-(3-ciclopropilmetoxi-4-difluorometoxifenil)ciclohexan-1-ol]. También, el ácido cis-4-ciano-4-[3-(ciclopentiloxi)-4-metoxifenil]ciclohexano-1-carboxílico (conocido como cilomilast) y sus sales, ésteres, pro-fármacos o formas físicas, que se describen en la patente de Estados Unidos 5.552.438 expedida el 03 de septiembre de 1996.

Otros inhibidores de PDE4 incluyen AWD-12-281 de Elbion (Hofgen, N. et al, 15º EFMC Int. Symp. Med. Chem. (6-10 sept., Edimburgo) 1998, Abst. P.98; Nº referencia CAS 247584020-9); un derivado de 9-benciladenina denominado NCS-613 (INSERM); D-4418 de Chiroscience y Schering-Plough; un inhibidor de PDE4 de benzodiazepina identificado como CI-1018 (PD-168787) y atribuido a Pfizer; un derivado de benzodioxol descrito por Kyowa Hakko en WO 99/16766; K-34 de Kyowa Hakko; V-11294A de Napp (Landells, L. J. et al., Eur. Resp. J. [Ann. Cong. Eur. Resp. Soc. (19-23 sept., Ginebra) 1998] 1998,12 (Suppl. 28): Abst P2393); roflumilast (Nº referencia CAS 162401-32-3) y aptalazinona (WO 99/47505) de Byk-Gulden; Pumafentrina, (-)-p-[(4aR*,10]bS*)-9-etoxi-1,2,3,4,4a,10b-hexahidro-8-metoxi-2-metilbenzo[c][1,6]naftiridin-6-il]-N,N-diisopropilbenzamida que es un inhibidor mixto de PDE3/PDE4 que se ha preparado y publicado en Byk-Gulden, ahora Altana; arofilina bajo el desarrollo de Almirall-Prodesfarma; VM554/UM565 de Vernalis; o T-440 (Tanabe Seiyaku; Fuji, K. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 284(1):162, 1998), y T2585.

Otros compuestos de interés se describen en la solicitud de patente internacional publicada WO 04/024728 (Glaxo Group Ltd), PCT/EP2003/014867 (Glaxo Group Ltd) y PCT/EP2004/005494 (Glaxo Group Ltd).

Los agentes anticolinérgicos son aquellos compuestos que actúan como antagonistas en los receptores muscarínicos, en particular aquellos compuestos que son antagonistas de los receptores M_{1} o M_{3}, antagonistas dobles de M_{1}/M_{3} o M_{2}/M_{3}, receptores o pan-antagonistas de los receptores M_{1}/M_{2}/M_{3}. Los compuestos ejemplares para la administración por inhalación incluyen ipratropio (por ejemplo, en forma del bromuro, CAS 22254-24-6, comercializado con el nombre Atrovent), oxitropio (por ejemplo, en forma del bromuro, CAS 30286-75-0) y tiotropio (por ejemplo, en forma del bromuro, CAS 136310-93-5, comercializado con el nombre Spiriva). También son de interés revatropato (por ejemplo, en forma del bromhidrato, CAS 262586-79-8) y LAS-34273 que se describe en el documento WO 01/04118. Los compuestos ejemplares para administración oral incluyen pirenzepina (CAS 28797-61-7), darifenacin (CAS 133099-04-4, o CAS 133099-07-7 para el bromhidrato comercializado con el nombre Enablex), oxibutinin (CAS 5633-20-5, comercializado con el nombre Ditropan), terodilina (CAS 15793-40-5), tolterodina (CAS 124937-51-5, o CAS 124937-52-6 para el tartrato, comercializado con el nombre Detrol), otilonium (por ejemplo, en forma del bromuro, CAS 26095-59-0, comercializado con el nombre Spasmomen), cloruro de trospio (CAS 10405-02-4) y solifenacin (CAS 242478-37-1, o CAS 242478-38-2 para el succinato conocido también como YM-905 y comercializado con el nombre Vesicare).

Otros agentes anticolinérgicos incluyen compuestos de fórmula (XXI), que se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos 60/487981:

4

en la que la orientación de la cadena de alquilo unida al anillo de tropano puede ser endo;

R^{31} y R^{32} se seleccionan, independientemente, entre el grupo constituido por grupos alquilo inferior de cadena lineal o ramificada que tienen, por ejemplo, de 1 a 6 átomos de carbono, grupos cicloalquilo que tienen de 5 a 6 átomos de carbono, cicloalquil-alquilo que tiene de 6 a 10 átomos de carbono, 2-tienilo, 2-piridilo, fenilo, fenilo sustituido con un grupo alquilo que no tiene más de 4 átomos de carbono y fenilo sustituido con un grupo alcoxi que no tiene más de 4 átomos de carbono;

X^{-} representa un anión asociado con la carga positiva del átomo de N. X^{-} puede ser, aunque sin limitación cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, benceno sulfonato, y tolueno sulfonato, incluyendo, por ejemplo:

bromuro de (3-endo)-3-(2,2-di-2-tieniletenil)-8,8-dimetil-8-azoniabiciclo[3.2.1]octano;

bromuro de (3-endo)-3-(2,2-difeniletenil)-8,8-dimetil-8-azoniabiciclo[3.2.1]octano;

4-metilbencenosulfonato de (3-endo)-3-(2,2-difeniletenil)-8,8-dimetil-8-azoniabiciclo[3.2.1]octano;

bromuro de (3-endo)-8,8-dimetil-3-[2-fenil-2-(2-tienil)etenil]-8-azoniabiciclo[3.2.1]octano; y/o

bromuro de (3-endo)-8,8-dimetil-3-[2-fenil-2-(2-piridinil)etenil]-8-azoniabiciclo[3.2.1]octano.

Otros agentes anticolinérgicos incluyen compuestos de fórmula (XXII) o (XXIII), que se describen en la solicitud de patente de Estados Unidos 60/511009:

5

en la que:

el átomo de H indicado está en la posición exo;

R^{41} representa un anión asociado con la carga positiva del átomo de N. R^{41} puede ser, aunque sin limitación, cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, benceno sulfonato y tolueno sulfonato;

R^{42} y R^{43} se seleccionan independientemente entre el grupo constituido por grupos alquilo inferior de cadena lineal o ramificada (que tienen, por ejemplo, de 1 a 6 átomos de carbono), grupos cicloalquilo (que tienen de 5 a 6 átomos de carbono), cicloalquil-alquilo (que tiene de 6 a 10 átomos de carbono), heterocicloalquilo (que tiene de 5 a 6 átomos de carbono) y N u O como el heteroátomo, heterocicloalquil-alquilo (que tiene de 6 a 10 átomos de carbono) y N u O como el heteroátomo, arilo, opcionalmente sustituido arilo, heteroarilo, y heteroarilo opcionalmente sustituido;

R^{44} se selecciona entre el grupo constituido por alquilo (C_{1}-C_{6}), cicloalquilo (C_{3}-C_{12}), heterocicloalquilo (C_{3}-C_{7}), alquil (C_{1}-C_{6}) cicloalquilo (C_{3}-C_{12}), alquil (C_{1}-C_{6}) heterocicloalquilo (C_{3}-C_{7}), arilo, heteroarilo, alquil (C_{1}-C_{6})-arilo, alquil (C_{1}-C_{6})-heteroarilo, -OR^{45}, -CH_{2}OR^{45}, -CH_{2}OH, -CN, -CF_{3}, -CH_{2}O(CO)R^{46}, -CO_{2R}^{47}, -CH_{2}NH_{2}, -CH_{2}N(R^{47})SO_{2R}^{45}, -SO_{2}N(R^{47})(R^{48}), -CON(R^{47})(R^{48}), -CH_{2}N(R^{48})CO(R^{46}), -CH_{2}N(R^{48})SO_{2}(R^{46}), -CH_{2}N(R^{48})CO_{2}(R^{45}), -CH_{2}N(R^{48})CONH(R^{47});

R^{45} se selecciona entre el grupo constituido por alquilo (C_{1}-C_{6}), alquil (C_{1}-C_{6}) cicloalquilo (C_{3}-C_{12}), alquil (C_{1}-C_{6}) heterocicloalquilo (C_{3}-C_{7}), alquil (C_{1}-C_{6})-arilo, alquil (C_{1}-C_{6}) heteroarilo;

R^{46} se selecciona entre el grupo constituido por alquilo (C_{1}-C_{6}), cicloalquilo (C_{3}-C_{12}), heterocicloalquilo (C_{3}-C_{7}), alquil (C_{1}-C_{6}) cicloalquilo (C_{3}-C_{12}), alquil (C_{1}-C_{6}) heterocicloalquilo (C_{3}-C_{7}), arilo, heteroarilo, alquil (C_{1}-C_{6}) arilo, alquil (C_{1}-C_{6}) heteroarilo;

R^{47} y R^{48} se seleccionan, independientemente, entre el grupo constituido por H, alquilo (C_{1}-C_{6}), cicloalquilo (C_{3}-C_{12}), heterocicloalquilo (C_{3}-C_{7}), alquil (C_{1}-C_{6}) cicloalquilo (C_{3}-C_{12}), alquil (C_{1}-C_{6}) heterocicloalquilo (C_{3}-C_{7}), alquil (C_{1}-C_{6}) arilo, y alquil (C_{1}-C_{6}) heteroarilo, incluyendo, por ejemplo:

Yoduro de (endo)-3-(2-metoxi-2,2-di-tiofen-2-il-etil)-8,8-dimetil-8-azoniabiciclo[3.2.1]octano;

3-((Endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propionitrilo;

(Endo)-8-metil-3-(2,2,2-trifenil-etil)-8-aza-biciclo[3.2.1]octano;

3-((Endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propionamida;

Ácido 3-((endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propiónico;

Yoduro de (endo)-3-(2-ciano-2,2-difenil-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano;

Bromuro de (endo)-3-(2-ciano-2,2-difenil-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano;

3-((Endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propan-1-ol;

N-Bencil-3-((endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propionamida;

Yoduro de (endo)-3-(2-carbamoil-2,2-difenil-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano;

1-Bencil-3-[3-((endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propil]-urea;

1-Etil-3-[3-((endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propil]-urea;

N-[3-((Endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propil]-acetamida;

N-[3-((Endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propil]-benzamida;

3-((Endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-di-tiofen-2-il-propionitrilo;

Yoduro de (endo)-3-(2-ciano-2,2-di-tiofen-2-il-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano;

N-[3-((Endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propil]-bencenosulfonamida;

[3-((Endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propil]-urea;

N-[3-((Endo)-8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-2,2-difenil-propil]-metanosulfonamida; y/o

Bromuro de (endo)-3-{2,2-difenil-3-[(1-fenil-metanoil)-amino]-propil}-8,8-dimetil-8-azoniabiciclo[3.2.1]octano.

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Los compuestos de particular interés que pueden ser útiles en las combinaciones de la invención incluyen:

Yoduro de (endo)-3-(2-metoxi-2,2-di-tiofen-2-il-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano;

Yoduro de (endo)-3-(2-ciano-2,2-di-tiofen-2-il-etil)-8,8-dimetil-8-azonia-biciclo[3.2.1]octano; y/o

Es de particular interés una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo junto con un antagonista de H1. Los antagonistas de H1 adecuados incluyen, sin limitación, amelexanox, astemizol, azatadina, azelastina, acrivastina, bromfeniramina, cetirizina, levocetirizina, efletirizina, clorfeniramina, clemastina, ciclizina, carebastina, ciproheptadina, carbinoxamina, descarboetoxiloratadina, doxilamina, dimetindeno, ebastina, epinastina, efletirizina, fexofenadina, hidroxizina, cetotifeno, loratadina, levocabastina, mizolastina, mequitazina, mianserina, noberastina, meclizina, norastemizol, olopatadina, picumast, pirilamina, prometazina, terfenadina, tripelennamina, temelastina, trimeprazina y triprolidina, particularmente cetirizina, levocetirizina, efletirizina y fexofenadina. Otros antagonistas del receptor de histamina que pueden usarse solos, o junto con un antagonista del receptor H3 incluyen antagonistas (y/o agonistas inversos) del receptor H4, por ejemplo, los compuestos descritos en Jablonowski et al., J. Med. Chem. 46:3957-3960 (2003).

La invención proporciona, por lo tanto, en otro aspecto más, una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con un inhibidor de PDE4.

La invención proporciona, por lo tanto, en otro aspecto más, una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con un agonista del adrenorreceptor \beta_{2}.

La invención proporciona, por lo tanto, en otro aspecto más, una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con un anticolinérgico.

La invención proporciona, por lo tanto, en otro aspecto más, una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con un antagonista del receptor H1.

La invención proporciona, por lo tanto, en otro aspecto más, una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con un corticoesteroide.

La invención proporciona, por lo tanto, en otro aspecto más, una combinación que comprende un compuesto de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con un agonista del receptor A2a.

Las combinaciones a las que se hace referencia anteriormente pueden presentarse convenientemente para usarlas en forma de una composición y, por lo tanto, las composiciones que comprenden una combinación como se ha definido anteriormente, opcionalmente junto con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable representan otro aspecto más de la invención.

Los compuestos individuales de dichas combinaciones pueden administrarse secuencial o simultáneamente en composiciones separadas o combinadas. Adecuadamente, los compuestos individuales se administrarán simultáneamente en una composición combinada. Las dosis apropiadas de agentes terapéuticos conocidos las apreciarán fácilmente los especialistas en la técnica.

Quedará claro para una persona especialista en la técnica que, cuando sea apropiado, el otro u otros ingredientes terapéuticos pueden usarse en forma de sales, por ejemplo en forma de sales de metal alcalino o de amina o en forma de sales de adición de ácidos, o profármacos, o en forma de ésteres, por ejemplo ésteres de alquilo inferior, o en forma de solvatos, por ejemplo hidratos, para optimizar la actividad y/o estabilidad y/o las características físicas, tales como la solubilidad, del ingrediente terapéutico. Quedará claro también que, cuando sea apropiado, los ingredientes terapéuticos pueden usarse en una forma ópticamente pura.

Los compuestos de la invención pueden prepararse por los procedimientos descritos a continuación o por procedimientos similares. De esta manera, las siguientes Descripciones y Ejemplos ilustran la preparación de los compuestos de la invención. No debe considerarse que los Ejemplos limitan el alcance de la invención de ninguna manera.

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Parte experimental general

En los ejemplos, se usan las siguientes abreviaturas:

DCM: diclorometano

DMF: N,N-dimetilformamida

EtOAc: acetato de etilo

h: hora(s)

CLEM: Cromatografía Líquida con Espectrometría de Masas

min: minuto(s)

MgSO_{4}: sulfato de magnesio

DIPEA-SP: diisopropiletilamina soportada en polímero

TR: tiempo de retención

TBTU: tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N,N-tetrametiluronio

Los cartuchos SCX son columnas de SPE de intercambio iónico donde la fase estacionaria es ácido bencenosulfónico polimérico. Éstos se usan para aislar aminas.

Los cartuchos SCX2 son columnas SPE de intercambio iónico donde la fase estacionaria es ácido propilsulfónico polimérico. Éstos se usan para aislar aminas.

Las soluciones orgánicas se secaron sobre magnesio o sobre sulfato sódico.

CLEM se realizó en una columna Supelcosil LCABZ+PLUS (3,3 cm x 4,6 mm de DI) eluyendo con ácido fórmico al 0,1% y acetato amónico 0,01 M en agua (disolvente A) y ácido fórmico al 0,05% en agua al 5% en acetonitrilo (disolvente B), usando el siguiente gradiente de elución 0,0 - 7 min 0% B, 0,7 - 4,2 min 100% B, 4,2 - 5,3 min 0% B, 5,3 - 5,5 min 0% B a un caudal de 3 mlmin^{-1}. Los espectros de masas se registraron en un espectrómetro Fisons VG Platform usando un modo de electronebulización positivo y negativo (EN+ve y EN-ve).

El Flashmaster II es un sistema automatizado multi-usuario de cromatografía ultrarrápida, disponible en Argonaut Technologies Ltd, que utiliza cartuchos SPE desechables, en fase normal, (de 2 g a 100 g). Proporciona la mezcla cuaternaria en línea del disolvente para posibilitar la realización de procedimientos en gradiente. Las muestras se ensayaron en fila usando el programa multi-funcional de acceso abierto, que gestiona disolventes, caudales, perfil de gradiente y condiciones de recogida. El sistema está equipado con un detector UV Knauer de longitud de onda variable y dos colectores de fracción Gilson FC_{2}O4 que posibilitan el corte de pico automatizado, recogida y seguimiento.

La HPLC autopreparativa dirigida por masas (MDAP) se realizó en un sistema Waters FractionLynx que comprende una bomba Waters 600 con cabezales de bombeo extendidos, un tomamuestras automático Waters 2700, una matriz de diodos Waters 996 y un colector de fracciones Gilson 202 en una columna de 10 cm X 2,54 cm de di ABZ+, eluyendo con ácido fórmico al 0,1% en agua (disolvente A) y ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo (disolvente B), usando según sea apropiado un gradiente de elución durante 15 min a un caudal de 20 mlmin^{-1} y detectando a 200 - 320 nm a temperatura ambiente. Los espectros de masas se registraron en un espectrómetro de masas Micromass ZMD usando electronebulización en modo positivo y negativo, con exploraciones alternas. El programa usado fue MassLynx3.5 con las opciones OpenLynx y FractionLynx.

Los compuestos se nombraron usando el programa de nomenclatura química ACD/Name PRO 6.02 de Advanced Chemistry Developments Inc.; Toronto, Ontario, M5H2L3, Canadá.

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Intermedio 1

N^{2}-(2-Hidroxietil)-N^{1}-{4-[(fenilmetil)oxi]fenil}glicinamida

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6

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Se agitó sal clorhidrato de 4-[(fenilmetil)oxi]anilina (disponible en Fisher por ejemplo) (10 g) en tetrahidrofurano seco (100 ml), y se enfrió en un baño de hielo/agua a aproximadamente 5ºC. Se añadió una solución de carbonato potásico (16,15 g) en agua (60 ml) a la mezcla anterior, seguido de la adición gota a gota de cloruro de cloroacetilo (4,22 ml) durante 30 min. La mezcla se dejó calentar hasta temperatura ambiente y la fase orgánica se separó. La fase orgánica se enfrió a aproximadamente 5ºC en un baño de hielo/agua y se añadió 2-aminoetanol (9 g). La mezcla se dejó calentar hasta temperatura ambiente y después se calentó a 60ºC durante 2 h, se dejó durante una noche a temperatura ambiente y se calentó a 60ºC durante 2 h más. La mezcla de reacción se repartió entre acetato de etilo y agua. La fase orgánica se separó, se lavó con agua, salmuera, se secó (MgSO_{4}) y se concentró. El residuo se recristalizó en cloroformo dando el compuesto del título (8,1 g). TR de CLEM = 2,17 min, EN+ve m/z 301 (M+H)^{+}.

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Intermedio 2

(2-Hidroxietil)[2-oxo-2-({4-[(fenilmetil)oxi]fenil}amino)etil]carbamato de 1,1-dimetiletilo

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7

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Se añadieron bis(1,1-dimetiletil)dicarbonato (disponible en Fisher por ejemplo) (14,5 g) y 4-dimetilaminopiridina (disponible en Aldrich por ejemplo) (150 mg) a una solución de N^{2}-(2-hidroxietil)-N^{1}-{4-[(fenilmetil) oxi]fenil}glicinamida (Intermedio 1) (8,1 g) en DCM (200 ml). La mezcla se agitó durante 30 min, y se añadió bicarbonato sódico acuoso saturado (150 ml). La fase orgánica se separó, se secó (MgSO_{4}) y se evaporó. El residuo se disolvió en metanol (150 ml) y se añadió carbonato potásico (14,5 g). La mezcla se calentó en un baño de vapor durante 15 min, se permitió que se enfriara a temperatura ambiente y se dejó reposar durante 18 h. La mezcla de reacción se evaporó y se repartió entre DCM y agua. La fase orgánica se separó, se lavó con salmuera, se secó (MgSO_{4}) y se evaporó. El residuo se pre-absorbió sobre sílice a presión y se purificó por cromatografía ultrarrápida, (cartucho de sílice de 100 g; gradiente de EtOAc del 0% al 100% - ciclohexano durante 30 min), dando el compuesto del título (5,0 g). TR de CLEM = 3,2 min, EN+ve m/z 401 (M+H)^{+}.

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Intermedio 3

3-Oxo-4-{4-[(fenilmetil)oxi]fenil}-1-piperazinacarboxilato de 1,1-dimetiletilo

8

Se añadió cloruro de metanosulfonilo (2,5 ml) a una solución de (2-hidroxietil)[2-oxo-2-({4-[(fenilmetil)oxi]fenil}amino)etil]carbamato de 1,1-dimetiletilo (Intermedio 2) (4,99 g) en DCM seco (50 ml) y trietilamina (20 ml) en atmósfera de nitrógeno. La mezcla se agitó durante 30 min, y después se repartió entre DCM y bicarbonato sódico acuoso saturado. La capa orgánica se separó y se concentró al vacío. El residuo se disolvió en DMF seca (20 ml) y se añadió hidruro sódico (dispersión en aceite al 60%, 0,6 g). La mezcla se agitó durante 2,5 h, se inactivó con bicarbonato sódico acuoso saturado y se extrajo con EtOAc x 3. Las fases orgánicas se combinaron, se secaron (MgSO_{4}) y se evaporaron. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida, (cartucho de sílice de 100 g; gradiente de EtOAc del 0% al 100% - ciclohexano durante 40 min), dando el compuesto del título (4,1 g). TR de CLEM = 3,2 min, EN+ve m/z 383 (M+H)^{+}.

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Intermedio 4

4-(4-Hidroxifenil)-3-oxo-1-piperazinacarboxilato de 1,1-dimetiletilo

9

Una solución de 3-oxo-4-{4-[(fenilmetil)oxi]fenil}-1-piperazinacarboxilato de 1,1-dimetiletilo (Intermedio 3) (3,1 g) en etanol (25 ml) y EtOAc (25 ml) se hidrogenó sobre paladio al 10% sobre carbono (1 g) durante 2 h. El catalizador se retiró por filtración a través de celite y se lavó con etanol. El filtrado combinado y los lavados se concentraron dando el compuesto del título (1,92 g). TR de CLEM = 2,5 min, EN+ve m/z 293 (M+H)^{+}.

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Intermedio 5

4-{4-[(3-Cloropropil)oxi]fenil}-3-oxo-1-piperazinacarboxilato de 1,1-dimetiletilo

10

A una solución de 4-(4-hidroxifenil)-3-oxo-1-piperazinacarboxilato de 1,1-dimetiletilo (Intermedio 4) (5,0 g) en 2-butanona (200 ml) se le añadió carbonato potásico (4,7 g) seguido de 1-bromo-3-cloropropano (4,0 g). La mezcla se calentó a reflujo en una atmósfera de nitrógeno durante el fin de semana (durante aproximadamente 72 h), se enfrió a temperatura ambiente y se añadió agua (200 ml). La fase orgánica se separó, y la capa acuosa se extrajo dos veces con DCM. Las fases orgánicas se combinaron, se secaron (MgSO_{4}) y se evaporaron. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida, (cartucho de sílice de 100 g; gradiente de EtOAc del 0% al 100% - ciclohexano durante 60 min), dando una mezcla del compuesto del título y 4-{4-[(3-bromopropil)oxi]fenil}-3-oxo-1-piperazinacarboxilato de 1,1-dimetiletilo (6,2 g; 9:1). TR de CLEM = 3,2 min, EN+ve m/z 369/371 (3:1) (M+H)^{+} para el cloruro y TA = 3,26 min, EN+ve m/z 413/415 (1:1) (M+H)^{+} para el bromuro.

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Intermedio 6

4-[4-({3-[(2R)-2-metil-1-pirrolidinil]propil}oxi)fenil]-3-oxo-1-piperazinacarboxilato de 1,1-dimetiletilo

11

Una mezcla de 4-{4-[(3-cloropropil)oxi]fenil}-3-oxo-1-piperazinacarboxilato de 1,1-dimetiletilo y 4-{4-[(3-bromopropil)oxi]fenil}-3-oxo-1-piperazinacarboxilato de 1,1-dimetiletilo (Intermedio 5) (9:1; 2,58 g) se disolvió en 2-butanona (50 ml). Se añadieron carbonato potásico (2,9 g), yoduro potásico (2,32 g) y clorhidrato de (2R)-2-metilpirrolidina (que puede prepararse como se describe en el documento US 20040171845, por ejemplo) (1,0 g). La mezcla se calentó a reflujo en una atmósfera de nitrógeno durante el fin de semana (durante aproximadamente 72 h). La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se repartió entre DCM y agua. La fase orgánica se secó (MgSO_{4}) y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida, [cartucho de sílice de 100 g; gradiente del 0% al 30% de trietilamina al 1% en metanol - DCM durante 60 min], dando el compuesto del título (1,87 g). TR de CLEM = 2,2 min, EN+ve m/z 418 (M+H)^{+}.

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Intermedio 7

1-[4-({3-[(2R)-2-Metil-1-pirrolidinil]propil}oxi)fenil]-2-piperazinona

12

Una solución de ácido trifluoroacético (4 ml) en DCM (6 ml) se añadió a 4-[4-({3-[(2fl)-2-metil-1-pirrolidinil]propil}oxi)fenil]-3-oxo-1-piperazinacarboxilato de 1,1-dimetiletilo (Intermedio 6) (1,87 g) en DCM (10 ml). La mezcla se agitó en una atmósfera de nitrógeno durante 2 h. Se añadió ácido trifluoroacético (4 ml) y la mezcla se agitó durante 18 h más. La mezcla se evaporó y el residuo se disolvió en metanol. La solución se aplicó a un cartucho SCX-2 (70 g). El cartucho se lavó con metanol y el producto se eluyó con amoniaco 0,880 al 10% en metanol. Las fracciones amoniacales apropiadas se combinaron y se concentraron dando el compuesto del título (1,39 g). TR de CLEM = 0,35 min, EN+ve m/z 318 (M+H)^{+}.

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Intermedio 8

4-(4-{[3-(2-Metil-1-pirrolidinil)propil]oxi}fenil)-3-oxo-1-piperazinacarboxilato de 1,1-dimetiletilo

13

Una solución de 1,1-dimetiletil 4-{4-[(3-cloropropil)oxi]fenil}-3-oxo-1-piperazinacarboxilato (Intermedio 5) (1,3 g) se disolvió en 2-butanona (50 ml). Se añadieron carbonato potásico (0,96 g), yoduro potásico (1,16 g) y 2-metil-pirrolidina (disponible en Fisher, por ejemplo) (1,5 g). La mezcla se calentó a 80ºC durante 24 h. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se repartió entre EtOAc (x 2) y agua. Las fases orgánicas se combinaron y se concentraron. El residuo se purificó mediante un Flashmaster II, [cartucho de sílice de 100 g; 0 gradiente del 0% al 15% (amoniaco 0,880 al 10% en metanol) - DCM durante 30 min]. Las fracciones apropiadas se combinaron y se concentraron dando el compuesto del título (0,85 g). TR de CLEM = 2,28 min, EN+ve m/z 418 (M+H)^{+}.

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Intermedio 9

1-(4-{[3-(2-Metil-1-pirrolidinil)propil]oxi}fenil)-2-piperazinona

14

4-[4-({3-[(2-metil-1-pirrolidinil]propil}oxi)fenil]-3-oxo-1-piperazinacarboxilato de 1,1-dimetiletilo (Intermedio 8) (0,85 g) se disolvió en DCM (10 ml) y se añadió una mezcla de ácido trifluoroacético - DCM mezcla (10 ml, 2:5). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 h. El disolvente se retiró al vacío. El residuo se disolvió en metanol y la solución se aplicó a un cartucho SCX-2 (70 g). El cartucho se lavó con metanol y el producto se eluyó con amoniaco 0,880 al 10% en metanol. Las fracciones amoniacales apropiadas se combinaron y se concentraron dando el compuesto del título (645 mg). TR de CLEM = 0,36 min, EN+ve m/z 318 (M+H)^{+}.

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Intermedio 10

1,1-Dimetiletil 4-[4-({3-[(2S)-2-metil-1-pirrolidinil]propil}oxi)fenil]-3-oxo-1-piperazinacarboxilato

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15

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Una solución de 4-{4-[(3-cloropropil)oxi]fenil}-3-oxo-1-piperazinacarboxilato de 1,1-dimetiletilo (Intermedio 5) (0,74 g) se disolvió en 2-butanona (25 ml). Se añadieron carbonato potásico (0,55 g), yoduro potásico (0,66 g) y clorhidrato de (2S)-2-metilpirrolidina (que puede prepararse por los procedimientos descritos en el documento US20040171845, por ejemplo) (0,2 g). La mezcla se calentó a 80ºC durante una noche (aproximadamente 18 horas). La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se repartió entre DCM y agua. La fase orgánica se secó y se concentró. El residuo se purificó en primer lugar por cromatografía FLashmaster II, [cartucho de sílice de 70 g; gradiente del 0% al 30% (trietilamina al 1% en metanol) - DCM durante 40 min]. Las fracciones amoniacales apropiadas se combinaron y se concentraron. El residuo se recogió en MeOH y se aplicó a un cartucho de intercambio de iones SCX-2 de 20 g y se eluyó con una solución de amoniaco 0,880 al 10% en metanol dando el compuesto del título (0,418 g). TR de CLEM = 2,2 min, EN+ve m/z 418 (M+H)^{+}.

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Intermedio 11

1-[4-({3-1(2S)-2-Metil-1-pirrolidinil]propil}oxi)fenil]-2-piperazinona

16

Se disolvió 4-[4-({3-[(2S)-2-metil-1-pirrolidinil]propil}oxi)fenil]-3-oxo-1-piperazinacarboxilato de 1,1-dimetiletilo (Intermedio 10) (0,418 g) en DCM (10 ml) y se añadió ácido trifluoroacético (2 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 a 3 h. El disolvente se retiró al vacío dando el compuesto del título (0,32 g). TR de CLEM = 0,37 min, EN+ve m/z 318 (M+H)^{+}.

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Ejemplo 1

4-[(2,4-Difluorofenil)carbonil]-1-[4-({3-[(2R)-2-metil-1-pirrolidinil]propil}oxi)fenil]-2-piperazinona, sal formiato

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17

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Una solución de 1-[4-({3-[(2R)-2-metil-1-pirrolidinil]propil}oxi)fenil]-2-piperazinona (Intermedio 7) (159 mg) en DMF seca (1 ml) y trietilamina (0,21 ml) se añadió a una mezcla de ácido 2,4-difluorobenzoico (79 mg) y TBTU (0,21 g) en DMF seca (2 ml). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 18 h, y después se diluyó con metanol. Esta solución se aplicó a un cartucho SCX-2 (20 g). El cartucho se lavó con metanol y el producto se eluyó con amoniaco 0,880 al 10% en metanol. Las fracciones amoniacales apropiadas se combinaron y se concentraron. El residuo se purificó por HPLC auto-preparativa dirigida por masa dando el compuesto del título (197 mg). TR de CLEM = 2,14 min, EN+ve m/z 458 (M+H)^{+}. ^{1}H RMN \delta (CD_{3}OD) 8,53 (1 H, s), 7,56 (1 H, m), 7,25 (2 H, m), 7,13 (2 H, m), 6,99 (2 H, m), 4,48 (55% 2 H, s), 4,18 - 4,07 [(45% 2 H) + 4H + (55% 1 H), t + m)], 3,85 - 2,95 (7 H + 45% 1 H, m), 2,30 - 2,10 (3 H, m), 2,08 - 1,98 (2 H, m), 1,75 -1,62 (1 H, m), 1,38 (3 H, d).

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Ejemplo 2

4-[(2,4-Difluorofenil)carbonil]-1-[4-({3-[2-metil-1-pirrolidinil]propil}oxi)fenil]-2-piperazinona, sal formiato

El compuesto se preparó en un procedimiento análogo al descrito para el Ejemplo 1, usando el Intermedio 9 y ácido 2,4-difluorobenzoico dando el compuesto del título. TR de CLEM = 2,03 min, EN+ve m/z 458 (M+H)^{+}.

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Ejemplo 3

4-[(2,4-Difluorofenil)carbonil]-1-[4-({3-[(2S)-2-metil-1-pirrolidinil]propil}oxi)fenil]-2-piperazinona, sal formiato

El compuesto se preparó en un procedimiento análogo al descrito para el Ejemplo 1 usando el Intermedio 11 y ácido 2,4-difluorobenzoico dando el compuesto del título. TR de CLEM = 2,14 min, EN+ve m/z 458 (M+H)^{+}.

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Datos Biológicos

Los compuestos de la invención pueden ensayarse para su actividad biológica in vitro de acuerdo con los siguientes ensayos o similares:

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Generación de la línea celular del receptor H1 y protocolo de ensayo FLIPR 1. Generación de la línea celular de histamina H1

El receptor H1 humano se clonó usando procedimientos conocidos descritos en la bibliografía [Biochem. Biophys. Res. Commun., 201 (2):894, (1994)]. Se generaron células de ovario de hámster chino que expresaban de forma estable el receptor H1 humano de acuerdo con procedimientos conocidos descritos en la bibliografía [Br. J. Pharmacol., 117(6):1071, (1996)].

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Ensayo del antagonista funcional de Histamina H1

La línea celular de histamina H1 se pipeteó en placas de cultivo tisular de 384 pocillos de fondo transparente, pared blanca, y no recubiertas, en un medio alfa mínimo esencial (Gibco/lnvitrogen, Nº cat. 22561-021), complementado con suero de ternera fetal dializado al 10% (Gibco/lnvitrogen Nº cat. 12480-021) y L-glutamina 2 mM (Gibco/lnvitrogen Nº cat. 25030-024) y se mantuvo durante una noche al 5% de CO_{2}, 37ºC.

Se retiró el exceso de medio de cada pocillo dando 10 \mul. Se añadieron 30 \mul de colorante de carga (Brilliant Black250 \muM, Fluo-4 2 \muM diluido en tampón Tyrodes + probenecid (NaCl 145 mM, KCl 2,5 mM, HEPES 10 mM, D-glucosa 10 mM, MgCl_{2} 1,2 mM, CaCl_{2} 1,5 mM, probenecid 2,5 mM, el pH se ajustó a 7,40 con NaOH 1,0 M)) a cada pocillo y las placas se incubaron durante 60 min al 5% de CO_{2}, 37ºC.

Se añadieron 10 \mul del compuesto de ensayo, diluidos a la concentración requerida en tampón Tyrodes + probenecid (o 10 \mul de tampón Tyrodes + probenecid como control) a cada pocillo y la placa se incubó durante 30 min a 37ºC, 5% de CO_{2}. Las placas se pusieron después en un FLIPR^{TM} (Molecular Devices, UK) para controlar la fluorescencia celular (\lambda_{ex} = 488 nm, \lambda_{EM} = 540 nm) de la manera descrita en Sullivan et al. (In: Lambert DG (ed.), Calcium Signaling Protocols, New Jersey: Humana Press, 1999, pág. 125-136) antes y después de la adición de 10 \mul de histamina a una concentración que da como resultado que la concentración final del ensayo de histamina sea la
CE_{80}.

El antagonismo funcional está indicado por una supresión del aumento de fluorescencia inducido por histamina, según se mide mediante el sistema FLIPR^{TM} (Molecular Devices). Mediante curvas de efecto de la concentración, se determinan las afinidades funcionales usando un análisis matemático farmacológico convencional.

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2. Generación de la línea celular del receptor H3, preparación de la membrana y protocolos de ensayo funcionales de GTP\gammaS Generación de la línea celular de histamina H3

Se aisló el ADNc de histamina H3 de su vector de soporte, pCDNA3.1 TOPO (InVitrogen), por digestión con restricción de ADN plasmídico con las enzimas BamH1 y Not-1 y ligadas en el vector de expresión inducible pGene (InVitrogen) digerido con las mismas enzimas. El sistema GeneSwitch^{TM} (un sistema donde la expresión transgénica se para en ausencia de un inductor y se activa en presencia de un inductor) se ejecutó como se describe en las patentes de Estados Unidos Nº: 5.364.791; 5.874.534; y 5.935.934. El ADN ligado se transformó en células bacterianas huésped de E. coli DH5\alpha competentes y se puso en agar Luria Broth (LB) que contenía Zeocin^{TM} (un antibiótico que permite la selección de las células que expresan el gen sh ble que está presente en pGene y pSwitch) a 50 \mugml^{-1}. Las colonias que contienen el plásmido re-ligado se identificaron por análisis de restricción. El ADN para transfección en células de mamífero se preparó a partir de cultivos de 250 ml de la bacteria huésped que contenía el plásmido pGeneH3 y se aisló usando un kit de preparación de ADN (Qiagen Midi-Prep) según las directrices del fabricante
(Qiagen).

Las células CHO K1 transfectadas previamente con el plásmido regulador pSwitch (InVitrogen) se sembraron a 2x10^{6} células por matraz T75 en Medio Completo, que contenía medio de Hams F12 (GIBCOBRL, Life Technologies) complementado con un 10% v/v de suero bovino fetal dializado, L-glutamina, e higromicina (100 \mugml^{-1}), 24 horas antes de su uso. El ADN del plásmido se transfectó en las células usando Lipofectamina plus de acuerdo con las directrices de los fabricantes (InVitrogen). 48 horas después de la transfección las células se pusieron en un medio completo complementado con 500 \mugml^{-1} de Zeocin^{TM}.

10-14 días después de la selección se añadió Mifepristone 10 nM (InVitrogen), al medio de cultivo para inducir la expresión del receptor. 18 horas después de la inducción las células se separaron del matraz usando ácido etilendiamina tetra-acético (EDTA; 1:5000; InVitrogen), después de varios lavados con solución salina tamponada con fosfato a pH 7,4 y se resuspendieron en Medio de Clasificación que contenía Medio Esencial Mínimo (MEM), sin rojo de fenol, y complementado con sales de Earles y Foetal Clone II al 3% (Hyclone). Se examinaron aproximadamente 1 x10^{7} células para la expresión del receptor por tinción con un anticuerpo policlonal de conejo, 4a, generado contra el dominio N-terminal del receptor H3 de histamina, se incubó en hielo durante 60 min, seguido de dos lavados en medio de clasificación. El anticuerpo unido al receptor se detectó por incubación de las células durante 60 min en hielo con un anticuerpo de cabra anti-conejo, conjugado con un marcador de fluorescencia Alexa 488 (Molecular Probes). Después de dos lavados más con Medio de Clasificación, las células se filtraron a través de un Filcon^{TM} de 50 \mum (BD Biosciences) y después se analizaron en un citómetro de flujo FACS Vantage SE equipado con una unidad de deposición celular automática. Las células de control eran células no inducidas tratadas de una manera similar. Las células teñidas positivamente se clasificaron como células individuales en placas de 96 pocillos, que contenían Medio Completo que contenía 500 \mugml^{-1} de Zeocin^{TM} y se permitió que se expandieran antes del reanálisis para la expresión del receptor mediante estudios de unión a anticuerpo y ligando. Un clon, 3H3, se seleccionó para la preparación de la membrana.

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Preparación de membrana a partir de células cultivadas

Todas las etapas del protocolo se realizan a 4ºC y con reactivos pre-enfriados. El sedimento celular se resuspende en 10 volúmenes de tampón de homogeneización (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etanosulfónico (HEPES) 50 mM, ácido etilendiamina tetra-acético (EDTA) 1 mM, pH 7,4 con KOH, complementado con leupeptina 10^{-6} M (acetil-leucil-leucil-arginal; Sigma L2884), 25 \mugml^{-1} de bacitracina (Sigma B0125), fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PEMF) y pepstaína A 2x10^{-6} M (Sigma)). Las células se homogeneizan después mediante ráfagas de 2 x 15 segundo en una mezcladora Waring con vaso de un 1 litro, seguido de centrifugación a 500 g durante 20 min. El sobrenadante se centrifuga después a 48.000 g durante 30 min. El sedimento se resuspende en tampón de homogeneización (4x el volumen del sedimento celular original) por formación de vórtice durante 5 segundos, seguido de homogeneización en un homogeneizador Dounce (10-15 pasadas). En este punto se toman alícuotas de la preparación en tubos de polipropileno y se almacenan a -80ºC.

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Ensayo del antagonista funcional de Histamina H3

Para cada compuesto a ensayar, en una placa de 384 pocillos blanca compacta, se añade:

(a): 0,5 \mul de compuesto de ensayo diluido hasta la concentración requerida en DEMO (o 0,5 \mul de DEMO como control);

(b): 30 \mul de la mezcla perla/membrana/GDP preparada mezclando perlas de Poliestireno con Aglutinina de Germen de Trigo LeadSeeker® (WGA PS LS) para ensayo de proximidad por centelleo (SPA) con membrana (preparada de acuerdo con la metodología descrita anteriormente) y diluyendo en tampón de ensayo (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico (HEPES) 20 mM + NaCl 100 mM + MgCl_{2} 10 mM, pH 7,4 NaOH) dando un volumen final de 30 \mul que contiene 5 \mug de proteína y 0,25 mg de perlas por pocillo, incubando a temperatura ambiente durante 60 min en un rodillo y, justo antes de la adición a la placa, añadiendo una concentración final de 10 \muM de guanosina 5'difosfato (GDP) (Sigma; diluida en tampón de ensayo);

(c): 15 \mul de [^{35}S]-GTP\gammaS 0,38 nM (Amersham; concentración de radiactividad = 37 MBqml^{-1}; actividad específica = 1160 Cimmol^{-1}), histamina (a una concentración que da como resultado que la concentración de ensayo final de histamina sea CE_{80}).

Después de 2-6 horas, la placa se centrifuga durante 5 min a 1500 rpm y se cuenta en un contador Viewlux usando un filtro 613/55 durante 5 minplaca^{-1}. Los datos se analizan usando una ecuación lógica de 4 parámetros. La actividad basal se usó como un mínimo, es decir, histamina no añadida al pocillo.

La biodisponibilidad y penetración en el SNC de los compuestos de la invención puede ensayarse en los siguientes ensayos, o similares.

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1. Procedimiento de Penetración en el SNC

Los compuestos se dosificaron por vía intravenosa a un nivel de dosis nominal de 1 mgkg^{-1} a ratas CD Sprague Dawley macho. Los compuestos se formularon en DEMO al 5%/PEG200 al 45%/agua al 50%. Se tomaron muestras de sangre bajo anestesia terminal con isoflurano a los 5 min después de la dosis y los cerebros se retiraron también para evaluar la penetración en el cerebro. Se tomaron muestras de sangre directamente en tubos heparinizados. Las muestras de sangre se prepararon para el análisis usando precipitación de proteínas y las muestras de cerebro se prepararon usando extracción de fármaco del cerebro por homogeneización y posterior precipitación de la proteína. La concentración del fármaco precursor en sangre y extractos de cerebro se determinó por análisis cuantitativo CL-EM/EM usando transiciones de masa específicas para el compuesto.

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2. Procedimiento Farmacocinético en Ratas

Los compuestos se dosificaron a ratas CD Sprague Dawley macho por administración intravenosa u oral sencilla a un nivel de dosis nominal de 1 mgkg^{-1} y 3 mgkg^{-1}, respectivamente. Los compuestos se formularon en DEMO al 5%/PEG200 al 45%/agua al 50%. Se obtuvo un perfil intravenoso tomando muestras de sangre en serie o terminales a las 0,083, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, y 7 h después de la dosis. Se obtuvo un perfil oral tomando muestras de sangre en serie o terminales a las 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 7 y 12 h después de la dosis. Se tomaron muestras de sangre directamente en tubos heparinizados. Se prepararon muestras de sangre por precipitación de proteínas y se sometieron a un análisis cuantitativo por CL-EM/EM usando transiciones de masa específicas para el compuesto. Se generaron perfiles de concentración de fármaco con el tiempo y se usó un análisis PK no compartimentado para generar estimaciones de semi-vida, eliminación, volumen de distribución y biodisponibilidad oral.

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3. Procedimiento Farmacocinético en Perros

Los compuestos se dosificaron a perros Beagle macho por administración intravenosa u oral sencilla a un nivel de dosis nominal de 1 mgkg^{-1} y 2 mgkg^{-1}, respectivamente. El estudio se realizó de acuerdo con un diseño cruzado de manera que se usó el mismo perro tanto para acontecimientos de dosificación como para los acontecimientos de dosificación ocurridos 1 semana después. Los compuestos se formularon en DEMO al 5%/Peg200 al 45%/agua al 50%. Se obtuvo un perfil intravenoso tomando muestras de sangre en serie a las 0,083, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 4, 6 y 12 h después de la dosis. Se obtuvo un perfil oral tomando muestras de sangre en serie a las 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 4, 6, 12 y 24 h después de la dosis. Se tomaron muestras de sangre directamente en tubos heparinizados. Las muestras de sangre se prepararon por precipitación de proteínas y se sometieron a un análisis cuantitativo por CL-EM/EM usando transiciones de masa específicas para el compuesto. Se generaron perfiles de concentración de fármaco con el tiempo y se usó un análisis PK no compartimentado para generar estimaciones de semi-vida, eliminación, volumen de distribución y biodisponibilidad oral.

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Resultados

En los ensayos anteriores o ensayos similares, los compuestos de fórmula (I) tenían un pKi promedio (pKb) en H3 mayor de aproximadamente 8,5 y en H1 menor de aproximadamente 5,7.

Además, el compuesto de E1 mostró una biodisponibilidad oral de aproximadamente el 48%F en ratas y de aproximadamente el 100%F en perros, con una penetración en el SNC de aproximadamente 57,5 ng/g.

Claims

1. Un compuesto de fórmula (I) que es 4-[(2,4-difluorofenil)carbonil]-1-[4-({3-[2-metil-1 -pirrolidinil]propil}oxi)fenil]-2-piperazinona

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o una sal del mismo.

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2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la sal es una sal farmacéuticamente aceptable.

3. 4-[(2,4-Difluorofenil)carbonil]-1-[4-({3-[(2R)-2-metil-1-pirrolidinil]propil}oxi)fenil]-2-piperazinona, o una sal de la misma.

4. Un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo, comprendiendo el procedimiento:

(a): hacer reaccionar un compuesto de Fórmula (II)

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o una sal del mismo, con ácido 2,4-difluorobenzoico;

(b): aislar los isómeros R y S individuales del racemato; o

(c): preparación de una sal de un compuesto de fórmula (I).

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5. Un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para uso en terapia.

6. Un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con la reivindicación 5 para uso en el tratamiento de trastornos inflamatorios y/o alérgicos.

7. Un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con la reivindicación 5 para uso en el tratamiento de rinitis, particularmente rinitis alérgica.

8. Una composición que comprende un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con uno o más vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.

9. Una composición de acuerdo con la reivindicación 8 que comprende adicionalmente un antagonista del receptor H1.

10. El uso de un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos inflamatorios y/o alérgicos.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 10 en el que el trastorno es rinitis alérgica.