ES2330532T3 - Procedimiento de extraccion rapida de antigenos. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para extraer antígenos que se van a analizar mediante metodología inmunocromatográfica que comprende las siguientes etapas: insertar una torunda (A), mediante la cual se ha tomado una muestra de sustancia química que se va a examinar, en un primer recipiente (2, 12) perteneciente a un tubo de ensayo (1) y que contiene un primer reactivo (R 2), siendo dicha torunda (A) que lleva dicha muestra de sustancia química capaz de absorber al menos parcialmente dicho primer reactivo (R2) en un periodo de tiempo predeterminado; aplicar presión con dicha torunda (A), después de la absorción al menos parcialmente de dicho primer reactivo (R 2) por dicha torunda (A) que lleva dicha muestra de sustancia química, contra la pared inferior (4, 14) de dicho primer recipiente (2, 12), causando dicha torunda (A) la rotura de dicha pared inferior (4, 14) y el paso a través de dicha pared inferior (4, 14); poner en contacto dicha torunda (A), que lleva dicha muestra de sustancia química y al menos una parte de dicho primer reactivo (R 2), con al menos un segundo reactivo (R 3) contenido en un segundo recipiente (3, 13) perteneciente a dicho tubo de ensayo (1), asegurando que dicho primer reactivo (R2) y dicho segundo reactivo (R3) se ponen en contacto entre sí y con dicha muestra de sustancia química sólo cuando está presente dicha torunda (A) que lleva dicha muestra de sustancia química para ser examinada; retirar dicha torunda (A) de dicho segundo recipiente (3, 13) perteneciente a dicho tubo de ensayo (1) después de un periodo de tiempo predeterminado y una vez que la reacción entre dicho primer reactivo (R2), dicho segundo reactivo (R3) y dicha muestra de sustancia química se completa, caracterizado porque dicha torunda (A) así como dicho primer recipiente (2) junto con su pared inferior perforada (4), pueden retirarse de dicho tubo de ensayo (1).
Description
Procedimiento de extracción rápida de
antígenos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para conservar dos o más reactivos usados en una
reacción química.
En el estado de la técnica se conocen diferentes
procedimientos para conservar dos o más reactivos, con el fin de
ponerlos en contacto sólo cuando tienen que usarse. Por ejemplo, en
preparaciones farmacéuticas, comúnmente se conserva un reactivo en
un estado sólido y se disuelve en un disolvente en estado líquido
justo antes del uso, perforando una pared de división mecánica.
Se han descrito también otros procedimientos de
conservación, en los que dos o más recipientes, cada uno de los
cuales contiene un reactivo, se introducen en un único recipiente
principal dentro del cual, después de la rotura de los recipientes
internos, tiene lugar la mezcla de reactivos.
Los procedimientos tradicionales de extracción
de antígenos sacáridos de estreptococos del grupo A proporcionan el
uso de reactivos líquidos (Lennett, E.H., Ed., Manual of Clinical
Microbiology, Cuarta Edición, American Society of Microbiology,
Washington, D.C., 1985, páginas 170-171).
Típicamente, se usan dos reactivos líquidos en la fase de
extracción: un ácido (ácido acético, clorhídrico o cítrico) y una
solución de nitrito de sodio. Los dos reactivos se mezclan en un
tubo de ensayo en el que se introduce el hisopo usado para tomar la
muestra biológica que se va a examinar.
En otros procedimientos conocidos, al menos uno
de los dos reactivos está en un estado sólido (patente
estadounidense nº 5.536.646), o los reactivos están contenidos en
tubos de ensayo o matraces con varios compartimentos separados,
cada uno de los cuales contiene un solo reactivo que se va a mezclar
inmediatamente antes de su uso (patente estadounidense nº
4.673.639).
Al mezclar los dos reactivos, se produce ácido
nitroso, que es un ácido relativamente inestable, requiriendo así
que los reactivos se mezclen inmediatamente antes de que comience el
procedimiento de extracción. En caso contrario, la inestabilidad de
la solución de ácido nitroso resultante puede reducir la eficacia de
la extracción. De hecho, si los reactivos se mezclan prematuramente
con respecto a la adición de la muestra biológica, según se
describe en la patente estadounidense nº 4.851.337, tiene lugar la
descomposición del ácido nitroso y la solución de extracción puede
perder su eficacia en un plazo muy corto.
Según el procedimiento descrito en la patente
estadounidense nº 5.415.994, la extracción tiene lugar en un
pocillo obtenido directamente en el cartucho que contiene la tira
inmunocromatográfica. Uno de los dos reactivos está contenido en un
matraz, que contiene a su vez un vial con el segundo reactivo. El
operador mezcla los dos reactivos rompiendo el vial y a
continuación vierte la mezcla en el pocillo en el que se coloca la
torunda. De este modo, el operador no tiene que contar el número de
gotas de cada reactivo. Sin embargo, también en este caso la
extracción tiene lugar después de que los dos reactivos se han
mezclado. Por otra parte, la introducción de la torunda en el
pocillo provoca a veces la oclusión aun parcial del conducto de
drenaje de líquido, y así el flujo se ralentiza o incluso se
bloquea. En caso contrario, si la torunda se introduce de una manera
tal que el líquido no fluye a través antes de alcanzar la cámara
inmunocromatográfica, el líquido de reacción puede alcanzar la
membrana inmunocromatográfica antes de que tenga lugar la
extracción.
Según otros procedimientos conocidos (patente
estadounidense nº 5.494.801), se añade un tercer reactivo a los dos
por omisión con el fin de neutralizar la solución antes de que tenga
lugar la fase cromatográfica. Sin embargo, en la actualidad el uso
de tres reactivos se considera demasiado complicado para el
operador, y se prefieren así los sistemas que proporcionan el uso
de sólo dos reactivos. Además, incluso estos procedimientos no
evitan el riesgo de reducción de la eficacia de la extracción debido
al tiempo transcurrido entre la mezcla del reactivo y la
introducción de la muestra.
Se han descrito también procedimientos que
proporcionan la introducción de la muestra, en la que tiene que
realizarse la extracción, en un dispositivo antes de añadir los
reactivos (patente estadounidense nº 6.168.956). En estos
procedimientos, el operador debe aplicar los reactivos según la
secuencia de tiempo óptima. Sin embargo, sigue existiendo la
necesidad de determinar el volumen de los reactivos (por ejemplo,
contando las gotas de reactivo), así como la posibilidad de usar el
mismo reactivo dos veces.
Los procedimientos tradicionales de extracción
de antígenos lipopolisacáridos a partir de Chlamydia trachomatis
proporcionan el uso de un reactivo alcalino capaz de extraer los
antígenos lipopolisacáridos, en el que se introduce un ácido o un
tampón para neutralizar la extracción. Según un procedimiento
tradicional, el reactivo alcalino consiste en hidróxido de sodio y
el reactivo ácido para neutralizar la solución de extracción es
ácido clorhídrico.
La torunda a través de la cual se ha tomado la
muestra biológica se introduce en un tubo de ensayo que contiene el
reactivo alcalino para la extracción y se agita durante un tiempo
predeterminado, después del cual se añade el reactivo de
neutralización.
La solicitud PCT WO-95/25.948,
la patente estadounidense 6.180.395, la solicitud de patente
japonesa
JP-07.059.555 y la solicitud PCT WO-2005/071.388 describen dispositivos de recogida de muestras y ensayo multicompartimento. Sin embargo, ninguno de estos documentos citados de la técnica anterior desvela o sugiere un procedimiento de extracción de antígenos según las reivindicaciones adjuntas.
JP-07.059.555 y la solicitud PCT WO-2005/071.388 describen dispositivos de recogida de muestras y ensayo multicompartimento. Sin embargo, ninguno de estos documentos citados de la técnica anterior desvela o sugiere un procedimiento de extracción de antígenos según las reivindicaciones adjuntas.
Así, un objeto de la presente invención es
superar los problemas del procedimiento y los dispositivos de la
técnica anterior anteriormente mencionados.
La presente invención puede aplicarse a todas
las situaciones en las que dos o más reactivos, que pueden iniciar
una reacción química junto con una muestra a tratar, no pueden
mezclarse juntos antes de añadir la muestra. Por ejemplo, es
posible que la muestra tenga que ponerse en contacto con un producto
de reacción inestable, o con más de un reactivo, en una secuencia
predeterminada.
Más específicamente, la presente invención puede
aplicarse a los procedimientos de extracción de antígenos
bacterianos realizada con torundas en muestras humanas o animales.
En particular, la presente invención puede usarse para la
extracción de antígenos sacáridos de estreptococos del grupo A y B,
así como de antígenos lipopolisacáridos de Chlamydia.
El objeto principal del procedimiento de
extracción rápida de antígenos según la presente invención es, así,
simplificar los procedimientos de extracción de la técnica anterior
mencionados anteriormente, en particular:
a) el operador no tiene que predeterminar y
verificar el volumen de reactivo, por ejemplo contando las gotas de
reactivo dispensadas;
b) no se requiere el tiempo necesario para
disolver uno o más reactivos en estado sólido;
c) el tiempo transcurrido entre la mezcla del
reactivo y la introducción de la torunda con la muestra biológica no
reduce la eficacia de la extracción, por ejemplo cuando se usa el
ácido nitroso altamente inestable.
\vskip1.000000\baselineskip
Se destacarán mejor las características y
ventajas adicionales del procedimiento de extracción rápida de
antígenos según la presente invención, y el dispositivo para
realizar dicho procedimiento, en la siguiente descripción de formas
de realización preferidas, dadas de un modo explicativo pero no
limitativo con referencia a las figuras de dibujos anexas, en las
que:
la fig. 1 es una vista esquemática en sección
transversal de una primera forma de realización de un dispositivo
para realizar el procedimiento de extracción rápida de antígenos
según la presente invención;
la fig. 2 es una vista esquemática en sección
transversal de un dispositivo para realizar un procedimiento
alternativo de extracción rápida de antígenos; y
la fig. 3 es una vista esquemática en sección
transversal de una forma de realización de un dispositivo de
extracción flexible introducido en un tubo rígido para la rotura de
la barrera mecánica entre los dos reactivos.
Con referencia a la fig. 1, según el
procedimiento de la invención, los dos reactivos se vierten en
volúmenes predeterminados en un tubo de ensayo 1 preferentemente
pero no necesariamente cilíndrico durante la fase de fabricación
del dispositivo para realizar dicho procedimiento, comprendiendo
dicho tubo de ensayo 1 un primer recipiente interior 2 apto para
ser introducido en un segundo recipiente exterior 3 que forma el
cuerpo principal del tubo de ensayo 1. El recipiente 2 está
configurado para formar una tapa para el recipiente 3. A
continuación se ensamblan los dos recipientes 2 y 3 de manera que
la torunda A (fig. 3) con la muestra que se va a someter a ensayo
pasa secuencialmente a través del reactivo R_{2}, colocado dentro
del recipiente 2, y el reactivo R_{3}, colocado dentro del
recipiente 3, respectivamente, rompiendo la barrera mecánica 4 que
forma la pared inferior de dicho recipiente 2 y separa dichos dos
reactivos R_{2} y R_{3}. Los recipientes 2 y 3 pueden
fabricarse con cualquier clase de material compatible con los
reactivos R_{2} y R_{3} contenidos en ellos, y pueden tener una
forma apropiada y un volumen suficiente para contener la torunda A,
estando a su vez dichos reactivos R_{2} y R_{3} en estado
líquido o sólido. El tubo de ensayo 1 se sella en su parte superior
usando cualquier sistema de sellado conocido, por ejemplo con una
lámina metálica (no mostrado).
En la fig. 2 se muestra un dispositivo para
realizar un procedimiento alternativo. Después de verter el reactivo
R_{3} en el tubo de ensayo 1, es posible formar una pared 14 de
división en dicho tubo de ensayo 1 que tenga la misma función que
la barrera mecánica 4 del recipiente 2, por ejemplo añadiendo
parafina sólida, calentándola hasta su fusión y dejándola así
enfriar hasta que se forme el elemento de división física apropiado
14 similar a dicha barrera mecánica 4, siendo así capaz de definir
dos recipientes separados, uno superior 12 y uno inferior 13,
dentro del mismo tubo de ensayo 1. En este punto es posible añadir
el segundo reactivo R_{2} en el recipiente superior 12 así
formado del tubo de ensayo 1. También en este caso el tubo de ensayo
1 se sella posteriormente en su parte superior usando un sistema de
sellado conocido.
El dispositivo consistente en el tubo de ensayo
1 para realizar el procedimiento según la invención es así capaz de
asegurar que los dos reactivos R_{2} y R_{3} se ponen en
contacto sólo cuando está presente la torunda A que lleva la
muestra. Por tanto, según el procedimiento de la invención, el
transporte del primer reactivo al segundo reactivo se realiza
mediante la torunda A en sí.
Según un aspecto preferido de la invención, la
muestra se toma con una torunda faríngea A siguiendo procedimientos
bien conocidos. A continuación se introduce la torunda A en el
primer recipiente 2 ó 12 del tubo de ensayo 1, después de la
retirada del sello, y a continuación se impulsa en el segundo
recipiente 3 ó 13, rompiendo la barrera 4 entre los recipientes 2 y
3 o la pared 14 de división entre los recipientes 12 y 13. Se inicia
así la extracción del antígeno por medio del ácido nitroso así
formado. Cuando transcurre el tiempo de extracción esperado, se
retira la torunda A, preferentemente con el primer recipiente 2 si
está presente, del tubo de ensayo 1 y puede verterse el líquido
directamente desde dicho tubo de ensayo 1 en el dispositivo
inmunocromatográfico para la detección de antígenos.
Por ejemplo, según el procedimiento de la
invención, el reactivo R_{2} contenido en el primer recipiente 2,
12 puede ser un ácido acético 0,4 M. El operador introduce la
torunda A en el primer recipiente 2, 12 del tubo de ensayo 1. El
reactivo R_{2} es absorbido casi completamente por la torunda A.
Empujando la torunda A contra el fondo 4, 14 del recipiente 2, 12,
dicho fondo 4, 14 se rompe, permitiendo que dicha torunda A pase a
través de él y alcance así el reactivo R_{3}, por ejemplo un
nitrito de sodio 2 M, en el segundo recipiente 3, 13. En este
punto, tiene lugar la reacción de formación de ácido nitroso, debido
a la presencia de antígeno en la torunda A. Por tanto, la
extracción de antígenos tiene lugar en las mejores condiciones para
la eficacia de dicha extracción. Una vez que transcurre el tiempo
esperado para la extracción de los antígenos bacterianos de la
torunda A, se retira la torunda A del tubo de ensayo 1 y puede
verterse el líquido en el pocillo del cartucho de la tira
inmunocromatográfica.
Otro ejemplo del procedimiento según la presente
invención permite extraer antígenos de Chlamydia de torundas
cervicales o uretrales. La muestra se toma con una torunda cervical
o uretral según procedimientos bien conocidos. A continuación se
introduce la torunda en el primer recipiente 2, 12 del tubo de
ensayo 1, después de la retirada del sello de dicho tubo de ensayo,
y se deja en contacto con el reactivo R_{2} durante el tiempo de
extracción requerido. Una vez que se termina la extracción, se
empuja la torunda al segundo recipiente 3 rompiendo la barrera 4, o
al segundo recipiente 13 rompiendo la pared 14 de división, y se
pone en contacto con el reactivo de neutralización R_{3}.
En este caso, los reactivos comprenden un
reactivo alcalino (R_{2}) y un reactivo de neutralización ácido
(R_{3}).
Según un procedimiento tradicional, la torunda
cervical o uretral se introduce en un tubo de ensayo que contiene 5
gotas de hidróxido de sodio 0,2 N, y se deja en la solución durante
2 minutos. Después de agitar la torunda, se añade un volumen
predeterminado de ácido clorhídrico 0,1 N para neutralizar la
solución de extracción. Después de agitar la torunda de nuevo,
dicha torunda se retira a continuación y se añade un cierto volumen
de la solución de extracción al cartucho de ensayo.
Con el fin de tomar muestras biológicas de
sitios concretos, por ejemplo de las cavidades nasales o de la
uretra, están disponibles comercialmente dispositivos que tienen una
estructura flexible y fina, lo que hace así difícil romper la pared
de división entre los dos reactivos con dichos dispositivos. En este
caso, el dispositivo de muestreo puede introducirse con antelación
en un ensamblaje provisto de las características de rigidez y
resistencia apropiadas para romper la pared de división. Por
ejemplo, después de la introducción de la torunda de muestreo A en
el tubo de ensayo 1, es posible rodear dicha torunda A con un tubo B
que tiene un diámetro apropiado. Empujando el tubo B, que rompe la
barrera 4, la torunda A es transportada al recipiente 3, 13 (véase
fig. 3).
Debe entenderse que podrían realizarse varias
modificaciones en el dispositivo, formado por el tubo de ensayo 1,
que realiza el procedimiento de extracción rápida de antígenos según
la presente invención, como se define también en las
reivindicaciones adjuntas. Por ejemplo, el sellado del tubo de
ensayo 1 puede obtenerse usando una tapa, o mediante sellado
térmico con una lámina de aluminio acoplada con polietileno. Además,
aunque en la descripción el sistema de recogida de muestras se
indica como "torunda", esta denominación se usa simplemente
por comodidad, ya que los sistemas más comunes para tomar
estreptococos del grupo A son las torundas faríngeas, mientras que
los sistemas más comunes para tomar la Chlamydia trachomatis son las
torundas cervicales o uretrales. Por tanto, debe ser evidente para
un experto en la técnica que es posible usar cualquier torunda
compatible con el formato de configuración inmunológica.
Claims (12)
1. Un procedimiento para extraer antígenos que
se van a analizar mediante metodología inmunocromatográfica que
comprende las siguientes etapas:
insertar una torunda (A), mediante la cual se ha
tomado una muestra de sustancia química que se va a examinar, en un
primer recipiente (2, 12) perteneciente a un tubo de ensayo (1) y
que contiene un primer reactivo (R_{2}), siendo dicha torunda (A)
que lleva dicha muestra de sustancia química capaz de absorber al
menos parcialmente dicho primer reactivo (R_{2}) en un periodo de
tiempo predeterminado;
aplicar presión con dicha torunda (A), después
de la absorción al menos parcialmente de dicho primer reactivo
(R_{2}) por dicha torunda (A) que lleva dicha muestra de sustancia
química, contra la pared inferior (4, 14) de dicho primer recipiente
(2, 12), causando dicha torunda (A) la rotura de dicha pared
inferior (4, 14) y el paso a través de dicha pared inferior (4,
14);
poner en contacto dicha torunda (A), que lleva
dicha muestra de sustancia química y al menos una parte de dicho
primer reactivo (R_{2}), con al menos un segundo reactivo
(R_{3}) contenido en un segundo recipiente (3, 13) perteneciente
a dicho tubo de ensayo (1), asegurando que dicho primer reactivo
(R_{2}) y dicho segundo reactivo (R_{3}) se ponen en contacto
entre sí y con dicha muestra de sustancia química sólo cuando está
presente dicha torunda (A) que lleva dicha muestra de sustancia
química para ser examinada;
retirar dicha torunda (A) de dicho segundo
recipiente (3, 13) perteneciente a dicho tubo de ensayo (1) después
de un periodo de tiempo predeterminado y una vez que la reacción
entre dicho primer reactivo (R_{2}), dicho segundo reactivo
(R_{3}) y dicha muestra de sustancia química se completa,
caracterizado porque
dicha torunda (A) así como dicho primer
recipiente (2) junto con su pared inferior perforada (4), pueden
retirarse de dicho tubo de ensayo (1).
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque dicho primer reactivo (R_{2}) y dicho
segundo reactivo (R_{3}) se vierten en volúmenes predeterminados
en dicho primer recipiente (2, 12) y en dicho segundo recipiente
(3, 13) respectivamente durante la fase de fabricación de dicho tubo
de ensayo (1).
3. El procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque dicha torunda (A) pasa secuencialmente
a través de dicho primer reactivo (R_{2}) y dicho segundo reactivo
(R_{3}).
4. El procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque dicho primer reactivo (R_{2}) y dicho
segundo reactivo (R_{3}) son capaces de formar ácido nitroso.
5. El procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque dicho segundo reactivo (R_{3}) está
en un estado sólido.
6. El procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque dicha torunda (A) es transportada a
través de dicha pared inferior (4) por medio de un dispositivo
rígido (B) capaz de romper dicha pared inferior (4).
7. El procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque dicha muestra de sustancia química que
se va a examinar debe permanecer en dicho primer reactivo (R_{2})
durante un periodo de tiempo predeterminado antes de ser
transferida a dicho segundo reactivo (R_{3}).
8. El procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque dicho primer reactivo (R_{2}) y dicho
segundo reactivo (R_{3}) son una base y una solución de
neutralización respectivamente.
9. El procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque dicho primer reactivo (R_{2}) y dicho
segundo reactivo (R_{3}) son un ácido y una solución de
neutralización respectivamente.
10. Uso del procedimiento según la
reivindicación 4 para la extracción de antígenos sacáridos de
estreptococos del grupo A y el grupo B, tomados con una torunda
(A).
11. Uso del procedimiento según las
reivindicaciones 8 ó 9 para la extracción de antígenos
lipopolisacáridos de Chlamydia trachomatis, tomados con una torunda
(A).
12. Uso del procedimiento según una o más de las
reivindicaciones 1 a 9 para la extracción de antígenos sacáridos de
estreptococos del grupo A y el grupo B y antígenos lipopolisacáridos
de Chlamydia trachomatis, tomados con una torunda (A).
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