ES2330634T3 - Metodo in vitro para detectar carcinoma transicional de vejiga. - Google Patents
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Abstract
Método in vitro para detectar la presencia de un carcinoma transicional de vejiga en un individuo, para determinar el estadio o la severidad de dicho cáncer en un individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada al individuo con dicho cáncer, que comprende: a) la detección y/o cuantificación de la proteína FGFR3 en una muestra de un individuo, en el que la muestra es tejido de vejiga u orina, y b) la comparación de la cantidad de proteína FGFR3 en dicha muestra con sus valores normales de referencia, en el que los niveles aumentados de proteína FGFR3 relativos a los valores normales de referencia son indicativos de de carcinoma transicional de vejiga, y los valores normales de referencia son los valores en muestras de sujetos sin carcinoma transicional de vejiga.
Description
Método in vitro para detectar carcinoma
transicional de vejiga.
La presente invención se refiere a un método
in vitro para detectar la presencia de un carcinoma
transicional de vejiga en un individuo, para determinar el estadio
o la severidad de este cáncer en el individuo, o para monitorizar
el efecto de la terapia administrada a un individuo con este cáncer.
También se divulgan métodos para buscar, identificar, desarrollar
y evaluar la eficacia de compuestos terapéuticos para este cáncer en
un intento de desarrollar nuevos productos medicinales y agentes
que inhiben la expresión y/o actividad de la proteína FGFR3.
A pesar de todos los avances que se han
producido en los últimos 20 años, el cáncer es todavía una de las
principales causas de muerte en todo el mundo. El cáncer
transicional de vejiga es el cáncer más común del tracto urinario;
es también el cuarto tipo de cáncer más común en hombres y el octavo
en mujeres. Según datos de la Agencia Internacional para la
Investigación del Cáncer, GLOBOCAN, del año 2000, cada año se
diagnostican más de 136.000 nuevos casos en Europa, 13.000 en Japón
y 56.000 en América del Norte.
Un número de pacientes 3-4 veces
mayor son tratados y monitorizados en hospitales cada año; y más de
49.000, 4.500 y 12.000 muertes son causadas por el carcinoma
transicional de vejiga cada año en Europa, Japón y América del
Norte, respectivamente (de acuerdo con datos de la Agencia
Internacional para la Investigación del Cáncer, GLOBOCAN 2000).
El carcinoma transicional de (Transitional
cell carcinoma (TCC)) es el tipo más común de cáncer de vejiga;
comprende más del 90% de todos los casos. Los casos restantes son
carcinomas de células escamosas (7%), adenocarcinomas (2%), y
carcinomas indiferenciados (1%).
El grado y el estadio
clínico-patológico del tumor son los mejores
indicadores de pronóstico de carcinoma transicional de vejiga. Los
carcinomas de vejiga se gradúan citomorfológicamente desde G1 hasta
G3 según la OMS (Organización Mundial de la Salud), por estado
decreciente de diferenciación celular y creciente de agresividad de
la enfermedad. Respecto al estadio, o invasividad, los TCCs de
vejiga se clasifican en papilar superficial (Ta y T1), invasivo de
músculo (T2 a T4) y el poco común Carcinoma in situ o tumor
in situ (TIS).
Los tumores de bajo grado (G1) están normalmente
confinados a la mucosa o infiltran capas superficiales (estadio Ta
y T1). La mayoría de los tumores de grado alto se detectan al menos
en estadio T1 (invadiendo la lámina propria). Aproximadamente el
75% de los casos diagnosticados de cáncer de vejiga son
superficiales. El 25% restante son invasivos de músculo en el
momento del diagnóstico. La importancia clínica de distinguir los
tumores invasivos de los superficiales, viene dada por la necesidad
de realizar una cistectomía radical con linfadenectomía y
reconstrucción vesical en los casos de cánceres extendidos que
muestran infiltración más allá de la capa muscular. Los tumores que
se diagnostican en estadios Ta y T1 permiten una preservación del
órgano y pueden ser tratados mediante resección transuretral y en
ocasiones quimioterapia o inmunoterapia intravesical.
El pronóstico de los pacientes afectados de
carcinoma transicional de vejiga superficial es bueno, pero tienen
un riesgo de recidiva del 70%; estos pacientes tienen que ser
monitorizados para recidiva tras el tratamiento, siguiendo
protocolos variables según los hospitales, aunque el más común es
evaluación por el urólogo cada 3 meses durante los 2 primeros años,
cada 6 meses durante los 2 años siguientes y posteriormente cada
año. A pesar del alto riesgo de recidiva, los tumores Ta tienden a
ser de bajo grado y sólo el 10-15% progresa a
invasivo de músculo en 2 años; el porcentaje de tumores T1 que
progresa a estadio T2 es mayor (30-50%).
El pronóstico de los pacientes afectados de
carcinoma transicional de vejiga invasivo es malo; el 50% de estos
pacientes en estadio T2 o mayor, desarrolla metástasis distantes
durante los 2 años posteriores al diagnóstico, y el 69% muere en 5
años. Nuevos sistemas de diagnóstico precoz son necesarios dado que
el 80-90% de los pacientes en estadio T2 o mayor,
son diagnosticados de novo en ese estadio de gran
agresividad y no en estadios previos (de Vere White, R.W. and
Stapp, E., Oncology, 1998, 12:1717-1723).
A día de hoy, el mejor sistema de diagnóstico
del carcinoma transicional de vejiga en pacientes que presentan
síntomas como hematuria o disuria, en ausencia de infección, es la
cistoscopia. Se ha calculado, en base a datos estadísticos de
incidencia y recidiva, que en Estados Unidos se realizan más de
500.000 cistoscopias al año (van Rhijn, B.W.G., et al.,
Cancer Res., 2001, 61:1265-1268). Se utilizan
cistoscopios flexibles para hacer la técnica menos agresiva, pero
ésta sigue siendo invasiva, y requiere alguna forma de
anestesia.
La técnica no invasiva de elección para el
diagnóstico del cáncer transicional de vejiga, consiste en la
identificación de células neoplásicas, a través del examen
morfológico de las células en muestras de orina (Loh, C.S., et
al., Br. J. Urol., 1996, 77:655-658).
Actualmente, la citología se utiliza en el seguimiento de los
pacientes diagnosticados y tratados de cáncer de vejiga.
Por otro lado, la citología de orina es capaz de
detectar tumores in situ que no son detectables por
cistoscopía también como tumores localizados en el extremo superior
de la vejiga o en el tracto urinario superior, es decir, uréter y
pelvis renal, no fácilmente accesibles por endoscopía (Lotan, Y. and
Roehrborn, J. Urol., 2002, 167:75-79).
Sin embargo, numerosos estudios han demostrado
que la citología tiene una sensibilidad muy baja para diagnosis de
cáncer de vejiga y no identifica el 50% de los tumores (Boman, H.,
et al., J. Urol., 2002, 167:80-83); en la
actualidad no hay ningún método no invasivo disponible para detectar
el carcinoma transicional de vejiga con alta sensibilidad y
especificidad (Boman, H., et al., J. Urol., 2002,
167:80-83). Estos métodos no invasivos permitirían
procedimientos rutinarios de análisis, como la detección precoz de
cualquier tipo de carcinoma transicional, incluido el de tracto
urinario superior, bien sea de novo o en evaluación de
recidivas tras tratamiento, e incluso, podrían identificar los
tumores invasivos incipientes o aquellos con un mayor riesgo de
desarrollar enfermedad agresiva.
La alteración de los niveles de expresión génica
está íntimamente asociada al crecimiento celular descontrolado y a
la desdiferenciación, hechos comunes a todos los tipos de cáncer.
Los niveles de expresión de los llamados genes supresores de
tumores, que actúan impidiendo el crecimiento celular maligno,
están reprimidos en las células tumorales; y los niveles de
expresión de los llamados oncogenes, que actúan induciendo el
crecimiento maligno, están incrementados en las células tumorales.
Se ha asociado muchos de estos genes al desarrollo del cáncer
transicional de vejiga, entre ellos Rb, p53, p16, p14ARF, cyclin D1
(Fujimoto, K., et al., Cancer Res., 1998,
52:1393-1398; Grossman, B.H., et al., Clin.
Cancer Res., 1998, 8:829-834; Balazs, M., et
al., Genes Chromosomes Cancer, 1997, 19:84-89).
La alteración en la expresión de dichos genes puede ser utilizada
como un marcador de diagnóstico de carcinoma transicional de vejiga;
entre estos potenciales marcadores, se han propuesto la Proteína de
Matriz Nuclear NMP22 (Soloway, M.S., et al., J. Urol., 1996,
156:363-367; Casella, R., et al., J. Urol,
2000, 164:1926-1928), Acido hialurónico y
Hialuronidasa (Pham, H.T., et al., Cancer Res., 1997,
57:778-783; Hautmann, S.H., et al., J. Urol.,
2001, 165:2068-2074), Complejos de membrana basal
(BTA) (Pode, D., et al., J. Urol., 1999,
161:443-446; Thomas, L., et al., Clin. Chem,
1999, 45:472-477), Antígeno carcinoembrionario
(CEA) (Halim, A.B., et al., Int. J. Biol. Markers, 1992;
7:234-239), Uroplaquina II (Wu, X.R., et
al., Cancer Res., 1998; 58:1291-1297), Factor
Sérico de Crecimiento de Hepatocitos (SF/HGF) (Gohji, K., et
al., J. Clin. Oncol., 2000; 18:2963-2971),
Proteína de tumor de mama de 8 Kda (MAT-8)
(Morrison, B.W., et al., J. Biol. Chem., 1995,
270:2176-2182), Telomerasa (Neves, M., et
al., J. Urol., 2002, 167:1276-1281), Proteínas
de la familia de las Queratinas/Citoqueratinas, como la
Citoqueratina 20 (Buchumensky, V., et al., J. Urol., 1998,
160:1971-1974) y Citoqueratina 18
(Sánchez-Carbayo, M., et al., Clin. Cancer
Res., 2000, 6:3585-3594). Sin embargo, no hay
ningún marcador para diagnosticar precozmente el carcinoma
transicional de vejiga, que se haya demostrado útil en ensayos
clínicos (Miyake, H., et al., J. Urol., 2002;
167:1282-1287). Muchos de los genes implicados en
el inicio y la progresión del cáncer transicional de vejiga son
todavía desconocidos; la identificación de genes expresados
diferencialmente en el carcinoma transicional de vejiga, podría
conducir a la identificación de marcadores biológicos, que podrían
tener un gran valor para el diagnóstico, el pronóstico y el
tratamiento de esta enfermedad.
Una vez que el carcinoma transicional de vejiga
ha sido diagnosticado, se lleva a cabo una resección transuretral
para tratar los tumores papilares superficiales; los TIS y T1,
además de aplicar resección, son tratados con el Bacilo Calmette
Guerin (BCG) en forma de instilaciones intravesicales. Si el cáncer
es invasivo muscular, al paciente se le realiza una cistectomía
radical; si el paciente no tolera esta cirugía, se utiliza
radioterapia o quimioterapia.
El 69% de los pacientes afectados de carcinoma
transicional de vejiga invasivo muscular, mueren durante los 5 años
posteriores al diagnóstico, incluso habiendo recibido tratamiento.
Son necesarias aproximaciones terapéuticas alternativas para tratar
el carcinoma transicional de vejiga invasivo muscular con una mayor
eficiencia; también son necesarias aproximaciones terapéuticas
alternativas para tratar tumores de grado bajo de una forma más
eficiente que la cirugía, o para complementarla, con el fin de
evitar la recidiva y la progresión de tumores a estadios
invasivos.
Los factores de Crecimiento de Fibroblastos
(FGF) son una familia de más de 90 proteínas, implicadas en la
regulación de procesos biológicos, incluyendo proliferación celular,
diferenciación celular, crecimiento celular, migración celular,
morfogénesis, angiogénesis y remodelación tisular. Los FGFs se unen
con alta afinidad a receptores situados en la superficie celular
(Receptores de FGFs o FGFRs), que tienen actividad
tirosín-quinasa. Las quinasas son una familia de
proteínas que fosforilan otras proteínas y tienen un papel clave en
la regulación de muchos procesos celulares (Hanks S.K., et
al., Science, 1988, 241:42-52). Cuando el
ligando FGF se une al FGFR, el FGFR se convierte en una forma
dimérica activa que se autofosforila en el dominio quinasa;
entonces, el FGFR activado se une y fosforila otras proteínas
efectoras, comenzando así una cascada de transducción de señales
desde la superficie celular al núcleo (Crews, C.M., and Erikson,
R.L., Cell, 1993, 74:215-217). La pérdida de
regulación de la cascada de señalización de factores de crecimiento
es un hecho frecuente en procesos tumorales.
Cuatro FGFRs han sido identificados hasta el
momento: FGFR1, también llamado Flg, fms-like gene,
flt2, bFGFR, N-bFGFR o Cek1; FGFR2, también llamado
Bek, bacterial-expressed kinase, KGFR, Ksam, KsamI o
Cek3; FGFR3, también llamado Cek2; y FGFR4. Todos los FGFRs maduros
comparten una estructura común, que consiste en un péptido señal
amino terminal, 3 dominios extracelulares
immunoglobulin-like (dominio Ig I, dominio Ig
II, dominio Ig III), con una region acídica entre los dominios Ig I
e Ig II (el dominio acidic box), un dominio transmembrana, y
dominios quinasa intracelulares (Ullrich, A., and Schlessinger, J.,
Cell, 1990, 61:203-212; Jonson, D.E., and Williams,
L.T., Adv. Cancer Res, 1992, 60:1-41). Las distintas
isoformas de los FGFRs tienen diferentes afinidades por los
distintos ligandos; así, FGF8 (factor de crecimiento andrógeno
inducido) y FGF9 son los que parecen tener una selectividad
aumentada para FGFR3 (Chellaiah, A., et al., J. Biol. Chem.,
1999, 274:34785-34794).
Se han asociado mutaciones puntuales específicas
en FGFR3 que conducen a la activación de su actividad
tirosín-quinasa y a diferentes síndromes
relacionados con el desarrollo óseo (Chen, H., et al. J.
Clin. Invest., 1999, 104(11):1517-1525).
También se han detectado mutaciones en FGFR3 en mielomas múltiples
(10-25% de los tumores. Plowright, E.E., et
al., Blood, 2000, 95:992-998; Chesi, M., et
al., Blood, 2001; 97:729-736; Soverini, S.,
et al., Haematologica, 2002, 87:1036-1040;
Pollett, J.B., et al., Blood, 2002,
100:3819-3821), en carcinomas cervicales
(3,5-25% de los tumores. Sibley, K., et al.,
Oncogene, 2001, 20:4416-4418; Dai, H., et
al., Anal. Cell. Pathol., 2001, 23:45-49) y en
carcinoma transicional de vejiga (Cappellen, D., et al., Nat.
Genet., 1999, 23:18-20; Sibley, K., et al.,
Oncogene, 2001, 20:686-691; Sibley, K., et
al., Oncogene, 2001, 20:4416-4418; Billerey,
C., et al., Am. J. Pathol., 2001,
158:1955-1959). Se detectaron mutaciones activadoras
de la función de FGFR3 en 40-50% de los
carcinomas transicionales de vejiga; la incidencia era
significativamente mayor, 80%, en tumores superficiales, que en
tumores invasivos; y los porcentajes de recidiva eran
significativamente menores en tumores que presentaban una mutación
en FGFR3 (Kimura, T., et al., Cancer, 2001,
92:2555-2561; van Rhijn, B.W.G., et al.,
Cancer Res., 2001, 61:1265-1268).
Inesperadamente, los autores de la presente
invención han descubierto, tras laboriosa investigación, que la
expresión del gen FGFR3 y la concentración de la proteína
FGFR3 se ven incrementados en biopsias de carcinomas transicionales
de vejiga cuando se comparan con la expresión en tejido normal de
vejiga, y además, que el tratamiento de células de vejiga tumorales
que expresan elevados niveles de FGFR3, con un anticuerpo específico
contra la proteína FGFR3, produce la inhibición de la proliferación
celular de líneas celulares tumorales de vejiga.
Los autores de la presente invención también han
descubierto sorprendentemente que los niveles elevados de expresión
de proteína FGFR3 están predominantemente asociados a tumores
superficiales.
La presente invención proporciona por tanto un
método in vitro de alta sensibilidad para detectar la
presencia de un carcinoma transicional de vejiga en un individuo,
para determinar el estadio o la severidad de éste cáncer en el
individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a
un individuo que presente dicho cáncer.
Asimismo, la presente invención proporciona
dianas o herramientas para la búsqueda, identificación, desarrollo
y evaluación de la eficacia de compuestos para terapia del cáncer de
vejiga, particularmente para el tratamiento de los tumores, como
neoadyuvante, antes de la resección, o como adyuvante, después de la
resección, con el fin de disminuir las posibilidades de recidiva y
progresión. Finalmente, la invención proporciona agentes
caracterizados porque inhiben la expresión y/o la actividad de la
proteína FGFR3 para el tratamiento del carcinoma transicional de
vejiga.
La presente invención provee un método in
vitro para detectar la presencia de cáncer de vejiga en un
individuo, para determinar el estadio o la severidad de este cáncer
en el individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia
administrada a un individuo que presente éste cáncer.
También se divulga un método in vitro
para buscar, identificar, desarrollar y evaluar la eficacia de
compuestos para la terapia del carcinoma transicional de vejiga
También se discute la provisión de agentes caracterizados porque
inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína FGFR3. También
se discute la provisión de una composición farmacéutica que
comprenda una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un
agente que inhiba la expresión y/o actividad de la proteína FGFR3
junto con por lo menos un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
También se divulga un kit para llevar a cabo la
presente invención.
La Figura 1 muestra los resultados del análisis,
por transferencia de Western, de la expresión de la proteína FGFR3
en muestras de vejiga humana. Se analizaron tres muestras de vejiga
no neoplásica (muestras número 46, 55 y 63), seis muestras de
carcinoma transicional de vejiga de bajo grado, superficial (G1, Ta)
(muestras número 48, 49, 50, 53, 56 y 59), tres muestras de
carcinoma transicional de vejiga de alto grado con invasión de la
lámina propria (G3, T1) (muestras número 57, 61 y 67), cuatro
muestras de alto grado con invasión del músculo (G3, T2) (muestras
número 47, 51, 58 y 60) y dos muestras de grado desconocido
(muestras número 54 y 62). La cantidad de extracto total de
proteína cargado fue 20 \mug en todos los casos. Las membranas se
revelaron con anticuerpo anti-FGFR3 (A) y con
anti-actina como control de carga (B). El receptor
aparecía en forma de varias bandas inmunorreactivas de distinto
peso molecular: 135 kDa, que corresponde al receptor totalmente
glucosilado; 85 kDa, que corresponde a la forma intracelular no
glucosilada, y bandas de masa molecular intermedia
(100-110 kDa), que corresponden a distintos grados
de glucosilación de FGFR3. Además, se detectaban bandas
inmunorreactivas de peso molecular menor (50 kDa), procedentes
probablemente de su degradación proteolítica.
La Figura 2 muestra los resultados del análisis,
por transferencia de Western, de la expresión de la proteína FGFR3
en la línea celulares de carcinoma transicional de vejiga humano
RT-112. Se añadió como control negativo una muestra
de vejiga humana normal (muestra número 46), y como control positivo
una muestra de tumor de vejiga (muestra número 53). La cantidad de
proteína cargada fue 20 \mug en todos los casos.
La Figura 3 representa los efectos de los
anticuerpos anti-FGFR3 (barras azules) y
anti-\beta2 microglobulina (barras rojas) sobre
el crecimiento de las células de carcinoma transicional de vejiga
RT-112 en medio libre de suero. Las células se
sembraron en placas de 96 pocillos y se trataron con los anticuerpos
durante 24 o 48 h. El crecimiento se expresa en relación a los
controles (sin anticuerpo). Los puntos son la media de 6 réplicas,
las líneas verticales representan la desviación estándar.
La figura 4 muestra una matriz de tejido
mostrando secciones circulares a partir de biopsias de tejido de
vejiga después de teñido de rutina con hamatoxilina y eosina seguido
por teñido inmunohistoquímico para la proteína FGR.
La figura 5 muestra la detección
inmunohistoquímica de proteína FGR\cdot en muestras de de tejido
de tres estados de carcinoma transicional de vejiga, Ta (A y D), T1
(B), T2 (C) y control de vejiga sana. Teñido positivo de FGFR3 se
definió como una reactividad tosca de membrana citoplasmática.
Inmunohistoquímica fue considerada negativa en casos con débil
tinción de <5% de las células.
Para facilitar la comprensión de la presente
solicitud de patente, exponemos a continuación el significado de
algunos términos y expresiones en el contexto de la invención:
Los términos "sujeto" o "individuo" se
refieren a miembros de especies de animales mamíferos, e incluye,
pero no se limita, a animales domésticos, primates y humanos; el
sujeto es preferiblemente un ser humano, masculino o femenino, de
cualquier edad o raza.
El término "cáncer" se refiere a la
enfermedad que se caracteriza por una proliferación descontrolada de
células anormales capaces de invadir tejidos adyacentes y
diseminarse a órganos lejanos.
El término "carcinoma" se refiere al tejido
resultante del crecimiento anormal o no regulado de células.
El término "carcinoma transicional de
vejiga" se refiere a cualquier desorden proliferativo maligno de
células del epitelio de vejiga.
El término "tumor" se refiere a cualquier
masa anormal de tejido producto de un proceso neoplásico, benigno
(no canceroso) o maligno (canceroso).
El término "gen" se refiere a una cadena
molecular de desoxirribonucleótidos, que codifica una proteína y
puede representar una porción de una secuencia de codificación o una
secuencia de codificación completa.
El término "DNA" se refiere al ácido
desoxirribonucleico. Una secuencia de DNA es una secuencia de
desoxirribonucleótidos.
El término "cDNA" se refiere a una
secuencia de nucleótidos, complementaria de una secuencia de
mARN.
El término "ARN" se refiere al ácido
ribonucleico. Una secuencia de ARN es una secuencia de
ribonucleótidos.
El término "mARN" se refiere al ácido
ribonucleico mensajero, que es la fracción del ARN total que se
traduce a proteínas.
La frase "mARN transcrito de" se refiere a
la transcripción del gen (DNA) en mARN, como primer paso para que
el gen se exprese y traduzca a proteína.
El término "secuencia de nucleótidos" o
"secuencia nucleotídica" se refiere indistintamente a una
secuencia de ribonucleótidos (ARN) o de desoxirribonucleótidos
(DNA).
El término "proteína" se refiere a una
cadena molecular de aminoácidos unidos a través de uniones
covalentes o no covalentes. El término incluye todas las formas de
modificaciones de de proteínas post-translacionales,
por ejemplo, glucosilación, fosforilación o acetilación.
Los términos "péptido" y "polipéptido"
se refieren a cadenas moleculares de aminoácidos que representan un
fragmento proteico. Los términos "proteína" y "péptido",
se usan indistintamente.
La frase "niveles elevados" significa que
los niveles medidos en pacientes con carcinoma transicional de
vejiga son superiores a los niveles medidos en una población
control de sujetos sin historial de carcinoma transicional de
vejiga.
El término "sensibilidad" se refiere a la
detección de falsos negativos (diagnóstico negativo de carcinoma
transicional de vejiga, cuando el paciente está afectado de
carcinoma transicional de vejiga); una sensibilidad del 100%
significa que no hay falsos negativos.
El término "especificidad" se refiere a la
detección de falsos positivos (diagnóstico positivo de carcinoma
transicional de vejiga, cuando el paciente no está afectado de
Carcinoma transicional de vejiga); una especificidad del 100%
significa que no hay falsos positivos.
El término "anticuerpo" se refiere a una
glucoproteína que exhibe una actividad de unión específica por una
proteína particular, a la que se denomina "antígeno". El
término "anticuerpo" comprende anticuerpos monoclonales, o
anticuerpos policlonales, intactos, o fragmentos de ellos; e incluye
anticuerpos humanos, humanizados y de origen no humano. Los
"anticuerpos monoclonales" son poblaciones homogéneas de
anticuerpos, altamente específicos, que están dirigidas contra un
único sitio o "determinante" antigénico. Los "anticuerpos
policlonales" incluyen poblaciones heterogéneas de anticuerpos,
que están dirigidos contra diferentes determinantes antigénicos.
El término "epítopo", tal como se utiliza
en la presente invención, se refiere a un determinante antigénico
de una proteína, que es la secuencia de aminoácidos de la proteína
que un anticuerpo específico reconoce. Tales epítopos pueden estar
compuestos de un tramo de aminoácidos contiguo (epítope lineal) o de
aminoácidos no contiguos que son llevados a proximidad unos con
otros en virtud del plegamiento tridimensional de la cadena de
polipéptidos (epítopes discontinuos).
El término "fase sólida", tal como se
utiliza en la presente invención, se refiere a una matriz no acuosa
a la que se puede unir el anticuerpo. Ejemplos de materiales para
fase sólida incluyen pero no están limitados a vidrio,
polisacáridos, por ejemplo agarosa, poliacrilamida, poliestireno,
alcohol polivinílico y siliconas. Ejemplos de formas de fase sólida
son el pocillo de una placa de ensayo o una columna de
purificación.
El término "oligonucleótido cebador" y
"cebador" se usan de forma intercambiable en la presente
invención y se refieren a una secuencias de nucleotidos, que son
complementarias de secuencias de nucleotidos diana de los genes
FGFR3 o ribl10. Cada cebador hibrida con su secuencia nucleotídica
diana y actúa como un sitio de inicio para la polimerización de
nucleótidos catalizada por la DNA polimerasa o la transcriptasa
inversa.
El término "sonda", tal como se utiliza en
la presente invención, se refiere a una secuencia nucleotídica
complementaria de una secuencia nucleotídica derivada del gen FGFR3,
que se puede utilizar para detectar la secuencia nucleotídica
correspondiente derivada del gen FGFR3.
El término "diana terapéutica" se refiere a
secuencias nucleotídicas o peptídicas, contra las que se puede
diseñar y aplicar clínicamente un fármaco o compuesto
terapéutico.
El término "antagonista" se refiere a
cualquier molécula que inhibe la actividad biológica de la molécula
antagonizada. Ejemplos de moléculas antagonistas incluyen, entre
otros, proteínas, péptidos, variaciones de secuencia de péptidos
naturales y pequeñas moléculas orgánicas (de peso molecular inferior
a 500 daltons).
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que tanto la expresión génica de FGFR3,
como la concentración de la proteína FGFR3 se ven incrementadas en
el carcinoma transicional de vejiga, y en que la proliferación de
líneas celulares tumorales de vejiga se inhibe al tratarlas con un
anticuerpo específico contra la proteína FGFR3.
Por lo tanto, la presente invención proporciona
un método in vitro que se define en la reivindicación 1.
Dicho método in vitro se emplea para
detectar la presencia de un carcinoma transicional de vejiga en un
individuo, para determinar el estadio o la severidad de dicho
carcinoma en el individuo, o para monitorizar el efecto de la
terapia administrada a un individuo que presente dicho
carcinoma.
El método proporcionado por la presente
invención es de alta sensibilidad y especificidad, y se basa en que
sujetos o individuos diagnosticados de carcinoma transicional de
vejiga, presentan niveles elevados de mARN transcrito del gen FGFR3
(niveles elevados de expresión del gen FGFR3), o
concentraciones elevadas de la proteína codificada por el gen
FGFR3 (proteína FGFR3), en comparación con los
correspondientes niveles en muestras procedentes de sujetos sin
historial clínico de carcinoma transicional de vejiga.
El presente método comprende una etapa de
obtención de la muestra del individuo. La muestra puede ser de
orina. También puede consistir en vejiga que puede ser obtenida por
cualquier método convencional, preferentemente por cistoscopía.
Las muestras pueden ser obtenidas de sujetos
previamente diagnosticados, o no diagnosticados, de carcinoma
transicional de vejiga; o también de un sujeto en tratamiento, o que
ha sido tratado previamente contra un cáncer, especialmente contra
el carcinoma transicional de vejiga.
El presente método comprende además una etapa de
extracción de la muestra, ya sea para obtener el extracto de
proteínas de ésta, o bien para obtener el extracto de ARN total. Uno
de estos dos extractos representa el material de trabajo para la
siguiente fase. Los protocolos de extracción de la proteína total o
del ARN total son bien conocidos por el experto en la materia
(Chomczynski P. et al., Anal. Biochem., 1987, 162: 156;
Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15: 532. Cualquier ensayo
convencional se puede utilizar en el marco de la invención para
detectar carcinoma transicional de vejiga, siempre que mida in
vitro los niveles de mARN transcrito del gen FGFR3 o su
cDNA complementario,
o la concentración de proteína FGFR3, en muestras recogidas de los individuos a analizar y de individuos control.
o la concentración de proteína FGFR3, en muestras recogidas de los individuos a analizar y de individuos control.
Así pues, esta invención proporciona un método
para detectar la presencia de un carcinoma transicional de vejiga
en un individuo, para determinar el estadio o la severidad de este
cáncer en el individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia
administrada a un individuo que presente este cáncer basado, bien en
la medida de los niveles de la proteína FGFR3.
El método de la invención comprende una primera
etapa de puesta en contacto del extracto de proteínas de la muestra
con una composición de uno o más anticuerpos específicos contra uno
o más epítopos de la proteína FGFR3, y una segunda etapa de
cuantificación de los complejos formados por anticuerpos y la
proteína FGFR3.
Existe una amplia variedad de ensayos
inmunológicos disponibles para detectar y cuantificar la formación
de complejos específicos antígeno-anticuerpo;
numerosos ensayos de unión de proteínas, competitivos y no
competitivos, han sido previamente descritos, y un gran número de
estos ensayos está disponible comercialmente. Así, la proteína
FGFR3 se puede cuantificar con anticuerpos como, por ejemplo:
anticuerpos monoclonales, policlonales, intactos o fragmentos
recombinantes de ellos, combibodies y fragmentos Fab o scFv de
anticuerpos, específicos contra la proteína FGFR3; siendo estos
anticuerpos humanos, humanizados o de origen no humano. Los
anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar marcados o
no; los anticuerpos no marcados se pueden utilizar en ensayos de
aglutinación; los anticuerpos marcados se pueden utilizar en una
amplia variedad de ensayos. Las moléculas marcadoras que se pueden
utilizar para marcar los anticuerpos incluyen radionucleótidos,
enzimas, fluoróforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos
enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, partículas,
colorantes y derivados. Existe una amplia variedad de ensayos bien
conocidos, que se pueden utilizar en la presente invención, que
utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y anticuerpos
marcados (anticuerpo secundario); entre estas técnicas se incluyen
el Western-blot o transferencia Western, ELISA
(Enzyme-Linked immunosorbent assay o ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzima), RIA (Radioimmunoassay o
Radioinmunoensayo), EIA competitivo (Competitive enzyme immunoassay
o Inmunoensayo enzimático competitivo), DAS-ELISA
(Double antibody sandwich-ELISA o ensayo ELISA
sándwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e
inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el empleo de biochips o
microarrays de proteínas que incluyan anticuerpos específicos o
ensayos basados en precipitación coloidal en formatos tales como
dipsticks. Otras maneras para detectar y cuantificar la
proteína FGFR3, incluyen técnicas de cromatografía de afinidad,
ensayos de unión a ligando o ensayos de unión a lectina. El
inmunoensayo preferido en el método de la invención es un ensayo
ELISA sándwich con doble anticuerpo (DAS-ELISA). En
este inmunoensayo se puede utilizar cualquier anticuerpo o
combinación de anticuerpos, específicos contra uno o más epítopos
de la proteína FGFR3. Como ejemplo de uno de los muchos posibles
formatos de este ensayo, un anticuerpo, monoclonal o policlonal, o
un fragmento de este anticuerpo, o una combinación de estos
anticuerpos que reconocen uno o más epítopes de la proteína FGFR3,
se unen a la superficie de un soporte en fase sólida y se ponen en
contacto con la muestra a analizar, y se incuban durante un tiempo
específico y en condiciones apropiadas para formar los complejos
antígeno-anticuerpo. Después de un lavado en
condiciones apropiadas para eliminar los complejos no específicos,
se incuba con los complejos antígeno-anticuerpo, en
condiciones y tiempo apropiados, un reactivo indicador, que consiste
en un anticuerpo monoclonal o policlonal, o un fragmento de este
anticuerpo, o una combinación de estos anticuerpos que reconocen
uno o más epítopes de la proteína diana FGFR3, unidos a una molécula
generadora de una señal. La presencia de la proteína FGFR3 en la
muestra a analizar, se detecta y cuantifica, en caso de que exista,
midiendo la señal generada. La cantidad de proteína FGFR3 presente
en la muestra a analizar es proporcional a esa señal.
También se divulgan métodos para detectar y/o
cuantificar el mARN o el cADN correspondiente al gen FGFR3,
y no la proteína, para detectar la susceptibilidad de un individuo
in vitro. Así, una vez obtenida la muestra y extraído el
ARN total, el método para la detección del mARN o del
correspondiente cADN del gen FGFR3, comprende una primera
etapa de amplificación del extracto de ARN total o del
correspondiente cADN sintetizado por retrotranscripción a partir
del mARN, y una segunda etapa de cuantificación del producto de la
amplificación del mARN o del cADN del gen FGFR3. Un ejemplo
de amplificación del mARN, consiste en retrotranscribir el mARN en
cADN (RT), seguido de la Reacción en Cadena de la polimerasa (PCR),
usando oligonucleótidos cebadores, utilizando las secuencias de los
cebadores SEC ID NO.1 y SEC ID NO 2. La PCR es una técnica de
amplificación de una determinada secuencia nucleotídica (diana)
contenida en una mezcla de secuencias nucleotídicas. En la PCR, se
utiliza un exceso de una pareja de oligonucleótidos cebadores, que
hibridan con las hebras complementarias de la secuencia
nucleotídica diana. A continuación, una enzima con actividad
polimerasa (ADN Taq Polimerasa) extiende cada cebador, utilizando
como molde la secuencia nucleotídica diana. Los productos de la
extensión se convierten entonces en secuencias dianas, tras la
disociación de la hebra diana original. Nuevas moléculas de cebador
hibridan y la polimerasa las extiende; el ciclo se repite para
aumentar exponencialmente el número de secuencias diana. Esta
técnica está descrita en las patentes US 4683195 y US 4683202.
Para la detección de la expresión del gen FGFR3
el ARN total se obtuvo a partir de biopsias de resección transuretal
(TURB) a partir de sujetos control sin carcinoma transicional de
vejiga y a partir de pacientes que fueron clínicamente clasificados
después de la resección y presentaron carcinoma transicional de
vejiga. Después del tratamiento 1 \mug de cada muestra de ARN fue
retrotranscripto para dar la primera hebra de cADN utilizando
Superscript II Reverse transcriptase (Invitrogen, Plaisley, UK). Un
microlitro de una dilución 1:40 de esta reacción se usó para la
amplificación por PCR de un fragmento de 200 bp del gen de FGFR3
bajo las siguientes condiciones: 25 \mul de reacciones
conteniendo 1 \mul de una dilución 1:40 de cADN, 3 \mul de 6
\muM de cada cebador, 0,5 \mul de dnTPs 10 mM, 2,5 \mul de 10
X PCR tampón, 3 \mul de MgCl_{2} 25 mM y 1 unidad de Taq gold
polimerasa (applied biosystems, Foster City, CA, USA). Las
condiciones de amplificación usadas consistieron en : 94ºC por 10
min (desnaturalización), seguido por 40 ciclos de 94ºC por 30 seg.,
50ºC por seg., 72ºC por 1 min 30 seg., y una extensión final a 72ºC
por 10 min. Cualquier de los muchos métodos que han sido descritos
previamente para detectar y cuantificar productos de amplificación
por PCR pueden ser empleados. El producto amplificado puede ser
detectado por electroforesis en gel de agarosa de la manera
siguiente: cinco microlitros del producto de la amplificación se
someten a una separación por electroforesis en un gel de agarosa a
una concentración del 2%, en un tampón
tris-Borato-EDTA (TBE) a 100 volts
de corriente directa durante una hora. Tras la electroforesis, el
gel se tiñe con bromuro de etidio y el producto de la amplificación
se visualiza al iluminar el gel con luz ultravioleta (uv); como
alternativa a la tinción, un método preferido, consiste en
transferir el producto amplificado a una membrana de nailon por
técnicas de Southern blotting o transferencia Southern, para
ser detectado con una sonda específica del cADN del gen
FGFR3, convenientemente marcada. La detección de mARN puede
ser llevada a cabo siguiendo la separación electroforética de mARN
por transferencia de mARN a una membrana de nailon, mediante
técnicas de transferencia como por ejemplo
Northern-blot o transferencia Northern, y
detectándolo con sondas específicas del ARN o del correspondiente
cADN del gen FGFR3. La amplificación y cuantificación del
mARN correspondiente al gen de fGFR3 puede ser llevada a cabo por
mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real
(Q-PCR).
El paso final del método para detectar in
vitro la presencia de cáncer en una muestra de un individuo
comprende comparar la cantidad de proteína FGFR3 detectada en una
muestra de un individuo, con la cantidad de proteína FGFR3
detectada en las muestras de sujetos control o en muestras no
tumorales previas del mismo individuo o con valores de referencia
normales.
\vskip1.000000\baselineskip
También se divulga un método in vitro
para identificar y evaluar la eficacia de agentes terapéuticos
contra el carcinoma transicional de vejiga, que comprende:
a) poner en contacto un cultivo de células
tumorales de vejiga con el compuesto candidato, en las condiciones
apropiadas y durante el tiempo requerido para permitir que
interaccionen,
b) detectar y cuantificar los niveles de
expresión del gen FGFR3 o la proteína FGFR3 o ambos, y
c) comparar dichos niveles de expresión con los
de cultivos control de células tumorales no tratadas con el
compuesto candidato.
\vskip1.000000\baselineskip
La cuantificación de los niveles de expresión
del gen FGFR3 o la proteína FGFR3 se realizan de modo similar
a como se indica en el método para detectar in vitro la
presencia de un cáncer de páncreas, especialmente de un carcinoma
transicional de vejiga en un individuo.
Cuando un agente disminuye los niveles de
expresión del gen FGFR3 o revierte los efectos de la expresión
elevada de dicho gen, preferiblemente disminuyendo los niveles de
proliferación celular, este agente se convierte en candidato para
la terapia de cáncer, en particular para de carcinoma transicional
de vejiga.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto de la divulgación se refiere a
agentes caracterizados porque inhiben la expresión y/o la actividad
de la proteína FGFR3. Estos agentes, que se pueden identificar y
evaluar según la presente invención, pueden ser seleccionados del
grupo formado por:
a) un anticuerpo, o combinación de anticuerpos,
específicos contra uno o más epítopos presentes en la proteína
FGFR3, preferiblemente un anticuerpo monoclonal humano o humanizado
Estos pueden ser también un fragmento del anticuerpo, un anticuerpo
de cadena sencilla o un anticuerpo
anti-idiotipo,
b) agentes citotóxicos, tales como toxinas,
moléculas con átomos radiactivos, o agentes
quimio-terapéuticos, entre los que se incluyen, sin
limitación, pequeñas moléculas orgánicas e inorgánicas, péptidos,
fosfopéptidos, moléculas antisentido, ribozimas, siARNs moléculas
de triple hélice, etc., que inhiben la expresión y/o la actividad
de la proteína FGFR3, y
c) compuestos antagonistas de la proteína FGFR3,
que inhiben una o más de las funciones de la proteína FGFR3.
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Una composición farmacéutica puede incluir una
cantidad terapéuticamente eficaz de uno o varios agentes de los
mencionados anteriormente junto con uno o más excipientes y/o
sustancias transportadoras. Además dicha composición puede contener
cualquier otro ingrediente activo que inhiba la función de la
proteína FGFR3. Los excipientes, compuestos transportadores y
sustancias auxiliares deben ser farmacéuticamente y
farmacológicamente tolerables, de modo que puedan ser combinados
con otros componentes de la formulación o preparación y no ejerzan
efectos adversos en el organismo tratado. Las composiciones
farmacéuticas o formulaciones incluyen aquellas que son adecuadas
para la administración oral o parenteral (incluyendo subcutánea,
intradérmica, intramuscular e intravenosa), aunque la mejor vía de
administración depende del estado del paciente. Las formulaciones
pueden estar en forma de dosis sencillas. Las formulaciones se
preparan de acuerdo con métodos bien conocidos en el campo de la
farmacología. Las cantidades de sustancias activas para
administrarse pueden variar en función de las particularidades de
la terapia.
También se divulga un kit para llevar a cabo la
presente invención. Así, un kit puede comprender un anticuerpo
anti-FGFR3 y un transportador en un embalaje
adecuado. También se divulga un kit que comprende un par cebador
diseñado para amplificar específicamente un ácido nucleico que tiene
una secuencia que es específica del gen FGFR3. La secuencia del par
cebador puede estar determinada a partir de la secuencia del gen
FGFR3 correspondiente mediante el empleo de herramientas
bioinformáticas. La secuencia de dicho par cebador es
preferentemente seleccionada de SEC ID NO. 1 y SEC. ID NO.2. Estos
kits pueden ser empleados para detectar la presencia del carcinoma
transicional de vejiga en un individuo, para determinar el estado
de severidad de este cáncer en un individuo o para monitorizar el
efecto de la terapia administrada al individuo con este cáncer.
Los siguientes ejemplos ilustran la
invención.
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Microarrays. Se utilizaron los microarrays
GeneChip Test 3 (Affymetrix, Santa Clara), que permiten
testar la calidad del ARN, previamente al análisis de expresión con
el GeneChip Human Genome U95A array (Affymetrix, Santa
Clara), que representa 12.000 secuencias completas de genes
anotados; el gen FGFR3 está representado en el microarray por el
set de sondas 31805_at de Affymetrix, que son oligonucleótidos
sentido de 25 nucleótidos de longitud, diseñados en base a
la secuencia Hs.1420 de Unigene, o N. Acc. M64347 de GeneBank (Tabla
1).
Muestras. Las muestras estudiadas
procedían de biopsias, obtenidas por resección transuretral
(transurethral resection biopsies (TURB)), de sujetos
control no neoplásicos (7 casos, 2 conteniendo capa muscular y 5
sin capa muscular), y de biopsias de pacientes que fueron
clínicamente clasificados tras resección y que presentaban
carcinoma transicional de vejiga (22 casos) en uno de los siguientes
estadios: 9 casos eran tumores de bajo grado no invasivos (pTaG1),
7 casos eran carcinomas de alto grado que infiltran la lámina
propria (pT1G3) y 6 casos eran carcinomas de alto grado que invaden
tejido muscular (pT2G3). Todas las muestras fueron clasificadas
histológicamente (grado y estadio) en el Departamento de Anatomía
Patológica del Hospital Universitario Marqués de Valdecilla, el
mismo hospital donde las muestras habían sido recogidas, siguiendo
los preceptos de la Declaración de Helsinki. Los tejidos frescos se
congelaron en nitrógeno líquido tras su extracción y se mantuvieron
a -80ºC hasta el momento de su análisis.
Para cada estadio de tumor se analizaron las
siguientes muestras:
- Control de tejido sano sin estrato muscular: 5
muestras
- Control de tejido sano con estrato muscular: 2
muestras
- (TaG1): 9 muestras
- (T1G3): 7 muestras
- (T2G3): 6 muestras
El análisis se llevó a cabo con ARN total
procedente de sujetos individuales, y con mezclas equimolares
(pools) de ARNs totales procedentes de distintos sujetos
sanos, o afectados de carcinoma transicional de vejiga del mismo
estadio (Tabla 2).
El ARN total de cada una de las biopsias se
obtuvo homogenizando el tejido en TRIzal® Reagent (Life
Technologies), siguiendo las recomendaciones del proveedor. El ARN
total resultante se limpió con el kit Rneasy (QIAGEN) (Chomczynski
P. et al., Anal. Biochem., 1987, 162: 156; Chomczynski P.,
Biotechniques, 1993, 15: 532). De cada preparación de ARN total se
usaron 10 \mug como material de partida para la síntesis de la
primera hebra de cADN con la enzima transcriptasa inversa
SuperScript^{TM} II ARNse (Life Technologies), usando como
cebador un oligonucleótido oligo-dT que contenía la
secuencia del promotor de la ARN polimerasa del fago T7. La segunda
hebra de cADN se sintetizó utilizando los enzimas ADN polimerasa I
de E. coli (Invitrogen Life Technologies), ADN ligasa de
E. coli (Invitrogen Life Technologies), ARNsa H de E.
coli (Invitrogen Life Technologies), y ADN polimerasa del fago
T4 (Invitrogen Life Technologies). El cARN marcado con biotina se
sintetizó usando el kit ENZO BioArray^{TM} HighYield^{TM}
Transcript Labeling Kit (Enzo Diagnostics Inc). Después de la
transcripción in vitro, se eliminaron los nucleótidos no
incorporados usando las columnas Rneasy (QIAGEN).
Se fragmentaron 15 \mug de cada cARN
biotinilado a 94ºC durante 35 minutos en una solución tampón que
contenía 40 mM Tris-Acetato (pH 8.1), 100 mM de
acetato de potasio y 30 mM de acetato de magnesio. El cARN
fragmentado se mezcló con tampón de hibridación (100 mM MES, 1M
NaCl, 20 mM EDTA, 0.01% Tween 20) y se calentó a 99º durante 5
minutos y posteriormente a 45º durante 5 minutos, para a
continuación ser cargado en el array de Affymetrix. El primer array
en el que se realizó la hibridación fue el Test 3 de Affymetrix.
Este array permite testar la calidad del ARN previo al análisis de
expresión en el Affymetrix® GeneChip® Human Genome 95 A
(HG-U95A).
Para la hibridación, los arrays se incubaron en
un horno rotatorio a 45º durante 16 horas y con una rotación
constante de 60 rpm.
El lavado y tinción de cada array se llevó a
cabo en la Estación de Fluidos de Affymetrix®. Se usó un programa
de lavado y tinción que incluía:
- 10x2 ciclos de lavado con
SSPE-T 6x (0.9 m NaCl, 60 mM NaH_{2}PO4, 6 mM
EDTA, 0.01% Tween 20) a 25ºC,
- 4x15 ciclos con 0.1 mM MES, 0.1M NaCl, 0.01%
Tween 20 a 50ºC,
- Tinción del cARN biotinilado con un conjugado
estreptavidina-ficoeritrina (10 \mug/mlMolecular
Probes)
- 10x4 ciclos de lavado con
SSPE-T a 25ºC
- Tinción con un conjugado
estreptavidina-ficoeritrina (1 mg/ml, Molecular
Probes) durante 10 minutos
- 15x4 ciclos de lavado con
SSPE-T a 30º
Los arrays se escanearon a 560 nm usando un
microscopio confocal que utiliza emisión láser (Agilent GeneArray
Scanner). El análisis de las lecturas de intensidad se realizó con
el software Microarray Suite 5.0. Para la comparación de arrays,
éstos fueron escalados a una intensidad total de 100.
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El análisis diferencial de la expresión del gen
FGFR3 en muestras neoplásicas con respecto al control, se realizó a
partir de los datos de comparación de arrays obtenidos utilizando el
software de Affymetrix. Los siguientes parámetros se consideraron
en el análisis: i) Detección. (clasificación del gen en cada
muestra como: presente (P), ausente (A) o marginal (M), ii)
Cambio (indicando un incremento (I), Decrece (D), o No
Cambia (NC) para cada muestra), iii) Signal Log Ratio
(SLR indicando el nivel de cambio de expresión entre la
línea base (control) y cada muestra). Este cambio se expresa como el
logaritmo en base dos del ratio (fold change o número de
veces que la expresión del gen está incrementada o disminuida en la
muestra problema-tumoral comparada con la muestra
control no neoplásica). Se considera significativo un valor de SLR
de 1 ó -1 (representando respectivamente un incremento o una
disminución de 2 veces) para el cambio en la expresión del gen.
Comparados con los controles los niveles de
expresión de FGFR3 fueron incrementados más de 8 veces (SLR>3)
en carcinomas pTaG1 y pT1G3 y más de 4 veces (SLR>2) en
carcinomas T2G3 (Tabla 3).
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El análisis diferencial de la expresión del gen
FGFR3 confirmó que los niveles de expresión del gen FGFR3 estaban
elevados más de 8 veces (SLR>3) en carcinomas pTaG1 y pT1G3,
frente a los controles, mientras que el incremento de expresión era
mayor de 4 veces (SLR>2) en T2G3 (Tabla.3).
\vskip1.000000\baselineskip
Muestras: Las muestras fueron obtenidas
de biopsias de resección transuretral (transuretral resection
biopsies (TUBR)). En esta parte del estudio se analizaron tres
muestras de vejiga urinaria procedentes de individuos sanos
(muestras número 46, 55 y 63), seis muestras de carcinoma
superficial de vejiga de bajo grado, (pTaG1) (muestras número 48,
49, 50, 53, 56 y 59), tres muestras de carcinoma de alto grado,
invade lámina propria (pT1G3) (muestras número 57, 61, 67), cuatro
muestras de carcinoma de alto grado, invade músculo (pT2G3)
(muestras número 47, 51, 58, 60) y dos muestras de grado
desconocido (muestras número 54, 62). Las muestras procedían de
pacientes distintos a los analizados con microarrays. Los tejidos
frescos se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido después
de la extracción y se conservaron a -80ºC hasta su utilización para
la extracción de proteínas. Todos los tejidos empleados en este
estudio fueron muestras obtenidas por resección quirúrgica
transuretral en el Servicio de Urología del Hospital Universitario
Marqués de Valdecilla (Santander, España); las muestras se
clasificaron histológicamente en el servicio de Anatomía Patológica
del mismo hospital. Durante todo el proceso se cumplieron los
preceptos estipulados en la Declaración de Helsinki.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras congeladas se homogeneizaron en
morteros con nitrógeno líquido y al producto pulverizado se le
añadió tampón RIPA B [fosfato sódico 20 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM,
Tritón X-100 1%, EDTA 5 mM y un cóctel de
inhibidores de proteasas (Roche Diagnostics Inc., Mannheim,
RFA)].
A muestras de proteínas (20 \mug de proteína
total), se les añadió tampón de carga de SDS-PAGE
suplementado con un 5% de \beta-mercaptoetanol y
se incubaron a 100ºC durante 5 min para luego cargarlas en un gel al
6% de poliacrilamida. A continuación de la electroforesis las
proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Se
corrieron y revelaron geles duplicados. Una membrana se reveló con
anticuerpos dirigidos contra la proteína FGFR3\cdot(Santa
Cruz Biotech. Inc., Santa Cruz, CA, EE.UU.), en tanto la segunda
membrana se reveló con anticuerpos dirigidos contra actina
(Amersham, Little Chalfont, U) como control para carga de proteína.
Finalmente, las membranas se hibridaron con un anticuerpo
secundario conjugado con peroxidasa (Amersham) y se detectó la
señal quimoluminiscente con el sistema ECL (Amersham) con película
de alto rendimiento en quimoluminiscencia (Hyperfilm ECL,
Amersham).
La expresión de FGFR3 en muestras normales (n =
3) y tumorales (n = 15) se examinó por transferencia de Western.
Los resultados obtenidos se recogen en la Fig. 1 y en la tabla 4.
Como se puede observar, la proteína FGFR3 no era detectable en
ninguna de las muestras de tejido sano. En cuanto a las muestras
tumorales, estaba presente en 11 de las 15 analizadas (73%), siendo
mayor este porcentaje en los tumores de bajo grado (83%) y en los
tumores de alto grado que infiltran la lámina propria (100%).
El receptor aparecía en forma de varias bandas
inmunorreactivas de distinto peso molecular: 135 kDa, que
corresponde al receptor totalmente glucosilado; 85 kDa, que
corresponde a la forma intracelular no glucosilada, y bandas de
masa molecular intermedia (100-110 kDa), que
corresponden a distintos grados de glucosilación de FGFR3. Además,
se detectaban bandas inmunorreactivas de peso molecular menor (50
kDa), que pueden representar productos de degradación de la
proteína (Figura 1).
Los resultados obtenidos demuestran que la
proteína FGFR3, no detectable en tejido de vejiga normal, se expresa
en una mayoría de muestras de carcinomas transicionales de vejiga.
En algunos de estos tumores los niveles de FGFR3 son singularmente
elevados. La sensibilidad del sistema de detección es del 73% y la
especificidad del 100%.
La línea celular RT112 de carcinoma epitelial de
vejiga humana fue obtenida de la Colección Alemana de
Microorganismos y Cultivos Celulares (Braunschweig, RFA). La línea
RT-112 se hizo crecer en medio RPMI, suplementado
con 10% de suero fetal bovino (foetal bovine serum (FBS)) y
2 mM de glutamina, excepto en los casos en que se indica lo
contrario. Todos los reactivos para cultivo celular se obtuvieron de
Invitrogen (Paisley, RU).
Las células de una placa de 10 cm se lavaron dos
veces con tampón fosfato salino (phosphate buffered saline
(PBS)) frío y se recogieron en 0,5 mL de RIPA B. Las muestras se
centrifugaron entonces a 15000 xg durante 10 min a 4ºC para
eliminar los restos celulares, se recuperó el sobrenadante y se
estimó la concentración de proteínas mediante el ensayo de Bradford
(Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) (Molina, M. A. et
al., Cancer Res., 1999, 59: 4356-4362).
A muestras de proteínas (20 \mug de proteína
total), se les añadió tampón de carga de SDS-PAGE
con un 5% de \beta-mercaptoetanol y se incubaron
a 100ºC durante 5 min para luego cargarlas en un gel de
poliacrilamida al 6%. A continuación de la electroforesis las
proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Se
corrieron y revelaron geles duplicados. Una membrana se reveló con
un anticuerpo dirigido contra la proteína FGFR3 (Santa Cruz
Biotech. Inc., Santa Cruz, CA, USA.) en tanto la segunda membrana se
reveló con un anticuerpo contra actina (Amersham) como un control
para carga de proteína. Finalmente, las membranas se hibridaron con
un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (Amersham, Little
Chalfont, UK) y se detectó la señal quimioluminiscente con el
sistema ECL (Amersham) con película de alto rendimiento en
quimoluminiscencia (Hyperfilm ECL, Amersham).
Se efectuaron experimentos para evaluar el
efecto de un anticuerpo monoclonal de ratón contra FGFR3 humana
sobre la proliferación de células RT-112 comparando
la proporción de proliferación del crecimiento de células crecidas
en presencia del anticuerpo contra FGFR3 con la proliferación en
presencia de un anticuerpo control contra
\beta2-microglobulina (Santa Cruz). Los
anticuerpos se concentraron y lavaron tres veces con PBS empleando
un dispositivo de filtración Centricon de 10 kDa
(10-kDa MWCO, Millipore CO., Bedford, MA), para así
eliminar la azida sódica con la que se suministran. A continuación,
se esterilizaron pasándolos a través de un filtro de 0,2 \mum
previamente saturado con DMEM (Dubelcco's modified Eagle's
médium) y 10% FBS. Los anticuerpos se diluyeron en medio de
cultivo. Las células RT-112 se sembraron a una
densidad de 2000 células por pocillo (0,2 \mul) en placas de
cultivo de 96 pocillos en medio RPMI conteniendo 10% de FBS. Se
dejó que las células se adhiriesen durante 24 horas y posteriormente
se retiró el medio para sustituirlo por RPMI fresco con
concentraciones de anticuerpo de 0, 0,02, 0,2, 2 y 20 mg/mL.
Después de una incubación de 24 y 48 horas , se estimó la
proporción de crecimiento de células midiendo la reducción de MTT
(metiltiazoltetrazolio) (Sigma Chemical Co., St Louis, EE.UU.).
Después de la incubación de 1 y 2 días, se retiró el medio de los
pocillos y se reemplazó por 100 \mul de 1 mg/ml de MTT en medio
RPMI conteniendo 10% de FBS. Algunos pocillos con medio solamente
se usaron como blancos para la lectura de absorbancia. La placa se
incubó a 37º por 30 y 60 minutos. A continuación se retiró el medio
y añadieron 100 \mul de DMSO por pocillo. La viabilidad de las
células se determinó por absorbancia de MTT (550 nm) y extrapolación
de la intensidad de absorbancia a partir de una curva patrón.
La expresión de FGFR-3 se
estudió mediante transferencia de Western, detectándose elevados
niveles del receptor (Fig. 2). Este aparecía en forma de varias
bandas inmunorreactivas de distinto peso molecular: 135 kDa, que
corresponde al receptor totalmente glucosilado; 85 kDa, que
corresponde a la forma intracelular no glucosilada, y bandas de
masa molecular intermedia (100-110 kDa), que
corresponden a distintos grados de glucosilación de FGFR3. Además,
se detectaban bandas inmunorreactivas de peso molecular menor (50
kDa), procedentes probablemente de la degradación proteolítica de
la proteína.
Durante los últimos años, se han descrito
diversos anticuerpos dirigidos contra dominios extracelulares de
receptores de membrana con propiedades antiproliferativas. Por esta
razón, se decidió ensayar si un anticuerpo monoclonal
anti-FGFR3 era capaz de inhibir el crecimiento de
células de carcinoma transicional de vejiga en cultivo. Para los
ensayos, se eligió la línea RT-112, la única que
expresaba niveles detectables de receptor. Los ensayos se llevaron
a cabo en medio libre de suero o en un medio suplementado con un 10%
de FBS, y las células se incubaron en presencia del anticuerpo 24 y
48 h. Como control, se usó un anticuerp
anti-\beta2 microglobulina, también monoclonal de
ratón y suministrados por la misma casa comercial (Santa Cruz
Biotechnology). Tal y como se puede observar en la Fig 3, los
anticuerpos anti-FGFR3 inhibían la proliferación de
células RT-112 en medio libre de suero después de
48 horas, mientras que los anticuerpos anti-\beta2
microglobulina no tenían ningún efecto. En cambio, si los ensayos
se llevaban a cabo en
medio con un 10% de FBS, ningún anticuerpo tenía efectos significativos sobre la proliferación de las células RT-112.
medio con un 10% de FBS, ningún anticuerpo tenía efectos significativos sobre la proliferación de las células RT-112.
Los resultados que se presentan en este ejemplo
demuestran que los niveles de expresión de la proteína FGFR3, que
no es detectable en vejiga normal, son elevados en la línea de
carcinoma transicional humano RT-112. FGFR3 es una
glucoproteína de membrana que se une a factores de crecimiento de la
familia del FGF, lo que inicia una cascada de señales
intracelulares que estimula la proliferación celular (Keegan et
al., Oncogene, 1991, 6:2229-2236). Dicho
receptor podría pues tener un papel en la génesis y progresión del
carcinoma transicional de vejiga.
El tratamiento de células RT-112
con un anticuerpo monoclonal dirigido contra el dominio extracelular
del FGFR3 inhibe su crecimiento en un medio libre de suero. Varios
mecanismos, no excluyentes entre sí, podrían explicar este efecto:
el anticuerpo podría bloquear el lugar de unión para el factor de
crecimiento o impedir la dimerización del receptor (previa a su
activación) o provocar la depleción del mismo de la membrana
plasmática.
En resumen, la sobreexpresión de FGFR3 en
carcinoma transicional de vejiga humano y el hecho de que un
anticuerpo monoclonal contra el mismo inhiba la proliferación de la
línea celular RT-112 de carcinoma transicional,
sugiere que esta proteína es candidato prometedor como diana
terapéutica para desarrollar fármacos contra el carcinoma
transicional de vejiga; estos mismos resultados demuestran que el
principio activo de uno de esos fármacos podría ser un anticuerpo
específico contra FGFR3.
\vskip1.000000\baselineskip
Muestras de tumor fijadas en parafina de los
archivos de patología del Hospital Universitario Marqués de
Valdecilla se seccionaron y dispusieron en placas de vidrio. En
total 209 casos de carcinoma transicional de vejiga provenientes de
biopsias de resección transuretral y especímenes de cistectomía y 20
muestras de vejiga sana (total 229) se examinaron por tinción
inmunohistoquímica. Todos los bloques de tejidos de donantes
embebidos en parafina fueron muestreados con sacabocados de 0,6 mm
usando un instrumento Beecher para microarrays de tejidos (Beecher
Instruments Inc. Sun Prairie, WI, USA).
Un array de bloques de cilindros conteniendo
cilindros de 37 pTa, 100 pT1, 72 pT2 y 20 muestras de vejiga sana
se sometieron a tinción de rutina con hematoxilina y eosina seguido
por tinción inmunihistoquímica para la proteína. Para inmunotinción
se utilizó un anticuerpo monoclonal contra FGFR3 (dilución 1:25;
Santa Cruz Biotech. Inc. Santa Cruz, CA, USA).
En síntesis, la recuperación del anticuerpo se
realizó por ebullición de las secciones en tampón de ácido cítrico
en un recipiente a presión por 90 segundos. Se empleó Dako
EnVisionTM +kit (Dakio, Glostrup Denmark) como sistema de
visualización de acuerdo con las instrucciones del fabricante, en un
equipo de inmunotinción automatizado (Biotek, Santa bárbara, CA,
USA). Se utilizo diaminobencidina como cromógeno (Figura 4). Para
reducir la variabilidad entre observadores en la evaluación
histopatológica de los especímenes-anticuerpo
teñidos tres patólogos del Departamento de Anatomía Patológica del
Hospital universitario de Valdecilla evaluaron los patrones de
tinción y su criterio de puntuación fue convenido. La tinción
positiva de FGFR3 fue definida como una reactividad de membrana
citoplasmática tosca.(Figura 5). La inmunihistoquímica se consideró
negativa en los casos en los que la tinción estuvo ausente o
mostraron un tinción débil (<5% de la células en una sección
dada).
De las secciones de carcinoma transicional de
vejiga que fueron analizadas inmunohistoquímicamente una reacción
positiva con el anticuerpo específico para FGFR3 fue positiva en un
71.4% de las secciones Ta, 72% de las secciones T1 y 49,2% de las
secciones T2 (Tabla 5) comparado con el 5% de las muestras sanas
positivas. De manera consistente con los datos previos de las
secciones T1 clasificadas como de alto grado mostraron un
porcentaje más bajo de las secciones positivas (tabla 6) que las
secciones correspondientes a grados más bajos de carcinoma
transicional de vejiga.
Los resultados presentados en este ejemplo
proveen evidencia para la expresión de FGFR3 en un gran número de
carcinomas transicionales de vejiga (209). Elevados niveles de
expresión de FGRF3 en células de membrana fueron asociados
predominantemente con los estados Ta y T1 (principalmente tumores
superficiales) de carcinomas transicionales de vejiga. Los
porcentajes positivos de Ta, T1 y T2 correlacionan bien con los
resultados previos obtenidos en análisis de transferencia de
Western de expresión de FGFR3 en muestras de biopsias de carcinoma
transicional de vejiga.
<110> Medplant Genetics, S.L.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método In vitro para
detectar carcinoma transicional de vejiga
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Version PatentIn 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda directa diseñada para
amplificar, en combinación con SEC ID NO:2, cADN del gen fgfr3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacggtttcc agggaggggc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda inversa diseñada para
amplificar, en combinación con SEC ID NO:1, cADN del gen fgfr3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaacagtac agaacgaacc aactg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del conjunto de sondas
3185 de Affymetrix, siendo la posición de dicha sonda en la
secuencia de mARN del gen fgfr3 3227
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccaagccta aaaggttgtt aatag
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del conjunto de sondas
3185 de Affymetrix, siendo la posición de dicha sonda en la
secuencia de mARN del gen fgfr3 3340
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattttttgga cttcaaagca agctg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del conjunto de sondas
3185 de Affymetrix, siendo la posición de dicha sonda en la
secuencia de mARN del gen fgfr3 3348
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacttcaaag caagctggta ttttc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del conjunto de sondas
3185 de Affymetrix, siendo la posición de dicha sonda en la
secuencia de mARN del gen fgfr3 3378
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattcttcta attgctgtgt gtccc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del conjunto de sondas
3185 de Affymetrix, siendo la posición de dicha sonda en la
secuencia de mARN del gen fgfr3 3399
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcccaggcag ggagacggtt tccag
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del conjunto de sondas
3185 de Affymetrix, siendo la posición de dicha sonda en la
secuencia de mARN del gen fgfr3 3431
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccggccctgt gtgcaggttc cgatg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del conjunto de sondas
3185 de Affymetrix, siendo la posición de dicha sonda en la
secuencia de mARN del gen fgfr3 3437
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgtgtgcag gttccgatgt tatta
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del conjunto de sondas
3185 de Affymetrix, siendo la posición de dicha sonda en la
secuencia de mARN del gen fgfr3 3536
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacttcttac gcaatgcttc tagag
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del conjunto de sondas
3185 de Affymetrix, siendo la posición de dicha sonda en la
secuencia de mARN del gen fgfr3 3540
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttacgcaa tgcttctaga gtttt
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del conjunto de sondas
3185 de Affymetrix, siendo la posición de dicha sonda en la
secuencia de mARN del gen fgfr3 3546
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaatgcttc tagagtttta tagcc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del conjunto de sondas
3185 de Affymetrix, siendo la posición de dicha sonda en la
secuencia de mARN del gen fgfr3 3576
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctaccttt caaagcttgg aggga
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del conjunto de sondas
3185 de Affymetrix, siendo la posición de dicha sonda en la
secuencia de mARN del gen fgfr3 3588
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagcttggag ggaagccgtg aattc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del conjunto de sondas
3185 de Affymetrix, siendo la posición de dicha sonda en la
secuencia de mARN del gen fgfr3 3606
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaattcagt tggttcgttc tgtac
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del conjunto de sondas
3185 de Affymetrix, siendo la posición de dicha sonda en la
secuencia de mARN del gen fgfr3 3618
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttcgttctg tactgttact gggcc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del conjunto de sondas
3185 de Affymetrix, siendo la posición de dicha sonda en la
secuencia de mARN del gen fgfr3 3648
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 17
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\hskip-.1em\dddseqskiptctgggcagc tgtcccttgc ttgcc
\hfill25
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<210> 18
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<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia del conjunto de sondas
3185 de Affymetrix, siendo la posición de dicha sonda en la
secuencia de mARN del gen fgfr3 3720
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggccagag gtgtcaccca aaccg
\hfill25
Claims (9)
1. Método in vitro para detectar la
presencia de un carcinoma transicional de vejiga en un individuo,
para determinar el estadio o la severidad de dicho cáncer en un
individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada
al individuo con dicho cáncer, que comprende:
a) la detección y/o cuantificación de la
proteína FGFR3 en una muestra de un individuo, en el que la muestra
es tejido de vejiga u orina, y
b) la comparación de la cantidad de proteína
FGFR3 en dicha muestra con sus valores normales de referencia,
en el que
los niveles aumentados de proteína FGFR3
relativos a los valores normales de referencia son indicativos de
de carcinoma transicional de vejiga, y los valores normales de
referencia son los valores en muestras de sujetos sin carcinoma
transicional de vejiga.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1 en el que
dicha muestra de tejido de vejiga se obtiene por cualquier método
convencional, preferentemente por cistoscopía.
3. Método según la reivindicación 1 en el que
dicha muestra a analizar se obtiene de un individuo al que no se le
ha diagnosticado previamente carcinoma transicional de vejiga.
4. Método según la reivindicación 1 en el que
dicha muestra a analizar se obtiene de un individuo al que se le ha
diagnosticado previamente carcinoma transicional de vejiga.
5. Método según las reivindicación 1, en el que
la muestra a analizar se obtiene de un individuo en tratamiento, o
que ha sido tratado previamente, contra carcinoma transicional de
vejiga.
6. Método según la reivindicación 1 que
comprende la extracción de la muestra para obtener un extracto de
proteínas.
7. Método según la reivindicación 1 en el que la
detección y cuantificación de la proteína FGFR3 comprende una
primera etapa en la cual el extracto de proteína de la muestra se
pone en contacto con una composición de uno o más anticuerpos
específicos contra uno o más epítopos de la proteína FGFR3, y una
segunda etapa en la cual se cuantifican los complejos formados por
los anticuerpos y la proteína FGFR3.
8. Método según la reivindicación 7 en el que
dichos anticuerpos son anticuerpos monoclonales o policlonales,
intactos o fragmentos recombinantes de anticuerpos, combibodies y
fragmentos Fab o scFv de anticuerpos, específicos contra la
proteína FGFR3; siendo estos anticuerpos humanos, humanizados o de
origen no humano.
9. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 7 ó 8 en el que las técnicas utilizadas en la
detección y cuantificación de los complejos formados por los
anticuerpos y la proteína FGFR3 se seleccionan del grupo formado
por: Western-blot, ELISA
(Enzyme-Linked Inmunosorbent Assay o ensayo de
inmunosorbente ligado a enzima), RIA (Radioinmunoassay o
Radioinmunoensayo), EIA Competitivo (Competitive Enzyme Immunoassay
o Inmunoensayo Enzimático Competitivo), DAS-ELISA
(Double antibody Sandwich-ELISA o ensayo ELISA
Sándwich con Doble Anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e
inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el empleo de biochips o
microarrays de proteínas que incluyan anticuerpos específicos,
ensayos basados en precipitación con oro coloidal en formatos tales
como dipsticks; o mediante técnicas de cromatografía de
afinidad, ensayos de unión a ligando o ensayos de unión a
lectina.
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