ES2330834T3 - Proteinas bcl-2 mutantes y utilizaciones correspondientes. - Google Patents
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Abstract
Una proteína mutante derivada de una proteína Bcl-2 humana de tipo salvaje y que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº:2, en la cual una secuencia de residuos de aminoácidos que codifica un bucle flexible de dicha proteína Bcl-2 humana de tipo salvaje que comprende los aminoácidos 35-91 de dicha proteína Bcl-2 humana, está sustituida por una secuencia de aminoácidos de sustitución que comprende la secuencia de la SEC ID Nº:1.
Description
Proteínas Bcl-2 mutantes y
utilizaciones correspondientes.
La presente invención se refiere a proteínas
Bcl-2 mutantes derivadas de la Bcl-2
humana de tipo salvaje. Las proteínas de la presente invención
pueden ser utilizadas en ensayos biológicos para identificar
sustancias que bloqueen la capacidad de Bcl-2 para
inhibir la muerte celular programada.
La apoptosis o muerte celular programada (de
aquí en adelante "PCD") es una característica altamente
conservada y esencial del desarrollo y la homeostasis en los
organismos superiores. Kelekar y col., Molecular and Cellular
Biology, 17(12):7040-7046 (1997). La
apoptosis es un mecanismo mediante el cual el organismo sustituye
las células más viejas por células nuevas sanas, o mediante el cual
una célula se destruye a sí misma para impedir la transmisión de
errores genéticos a su progenie. En algunos cánceres, por ejemplo,
se acepta de manera general que una alteración del crecimiento
celular y/o de la muerte celular es debida a la acumulación de
varias mutaciones en genes "clave" que regulan estos procesos.
El sistema normal es incapaz de eliminar las células que contienen
estos genes mutados y tiene como resultado un crecimiento celular
incontrolado. Por tanto, la naturaleza aberrante del crecimiento
celular o de la apoptosis que se observan en el cáncer y en otras
enfermedades, es la consecuencia de un mal funcionamiento de las
rutas reguladoras que controlan el equilibrio entre el crecimiento
celular y la muerte celular.
Un grupo de moléculas que está implicado en la
estimulación o en la supresión de las respuestas apoptóticas es la
familia de proteínas Bcl-2. La familia
Bcl-2 contiene proteínas que estimulan o inhiben la
muerte celular. Algunas de las inhibidoras, referidas
frecuentemente como proteínas anti-apoptóticas,
incluyen: Bcl-2, Bcl-x_{L},
Mcl-1, E1B 19K de adenovirus, BHRF1 del virus de
Epstein-Barr y Ced-9 de
Caenorhabditis elegans. Las promotoras de la muerte celular,
referidas frecuentemente como proteínas
pre-apoptóticas, incluyen, por ejemplo: Bax, Bak,
Bad, Bik, Bid y Bcl-x_{S}. Una característica
importante de la familia Bcl-2 es que sus miembros
pueden interaccionar (esto es, dimerizar) consigo mismos o con
otros miembros de la familia. (Kelekar, supra. Ver también
Ottilie, S. y col., J. of Biol. Chem.,
272(49):30866-30872 (1997)). Se cree que
estas interacciones proteína-proteína son
críticamente importantes para determinar la respuesta de una célula
a una señal de muerte (Kelekar, supra, ver también Yang y
col., Cell, 80:285-291 (1995)).
Se ha elucidado la estructura tridimensional del
miembro Bcl-x_{L} de la familia
Bcl-2 (Muchmore y col., Nature,
381:335-341 (1996)). La estructura de
Bcl-x_{L} contiene dos hélices hidrofóbicas
centrales rodeadas por hélices anfifáticas. Un bolsillo de unión
hidrofóbico es creado por la proximidad espacial de tres dominios
particulares, conocidos como BH1, BH2 y BH3, y proporciona un sitio
de unión para las proteínas que estimulan la muerte. Sattler M. y
col., Science, 275:983-986 (1997). Se sabe también
que las proteínas que estimulan la muerte interaccionan con este
sitio de unión a través de sus dominios BH3. Id.
Se conoce en la técnica que la sobreexpresión de
proteínas anti-apoptóticas, tales como
Bcl-2 y Bcl-x_{L}, que están
presentes a menudo en células cancerosas y en otras células
enfermas, tiene como resultado el bloqueo de las señales
apoptóticas y permite que dichas células proliferen. Por ejemplo, se
encuentran niveles elevados de expresión del gen de
Bcl-2 en una amplia variedad de cánceres humanos.
Además, se cree que bloqueando Bcl-2 y
Bcl-x_{L}, puede inducirse la apoptosis en células
enfermas y puede proporcionar una terapia eficaz para el cáncer y
otras enfermedades causadas por el deterioro del proceso apoptótico.
Por tanto, existe en la técnica la necesidad de un ensayo que pueda
ser utilizado para identificar compuestos que desencadenen o
induzcan la apoptosis mediante la inhibición de las interacciones
entre la familia de proteínas Bcl-2.
Se sabe también en la técnica que la
Bcl-2 existente en la naturaleza o de tipo salvaje
se comporta mal y se agrega cuando es puesta en solución. Tal
agregación hace difícil que los investigadores utilicen
Bcl-2 en estudios estructurales, tales como
cristalografía de rayos X o RMN, que pueden ayudar al diseño de
fármacos que bloqueen la capacidad de Bcl-2 para
inhibir la muerte celular programada. Adicionalmente, la agregación
de Bcl-2 en solución hace también difícil utilizar
la proteína Bcl-2 existente en la naturaleza o de
tipo salvaje en ensayos para identificar sustancias que bloqueen la
capacidad de Bcl-2 para inhibir la muerte celular
programada. Por tanto, existe la necesidad en la técnica de
desarrollar una forma alterada o mutada de Bcl-2
que no se agregue en solución y que pueda ser utilizada en estudios
estructurales. Sin embargo, hasta ahora, los esfuerzos para
desarrollar tal proteína alterada o mutada no han tenido éxito. Por
ejemplo, Anderson y col. en Protein Expression and Purification,
15:162-170 (1999), describen el clonaje y la
expresión de una Bcl-2 humana recombinante referida
como "rhBcl-2". En esta forma mutante de
Bcl-2, el supuesto bucle flexible de
Bcl-2 ha sido truncado y sustituido por un adaptador
flexible que consta de cuatro (4) residuos de alanina. Además, el
extremo carboxi hidrofóbico de Bcl-2 está sustituido
por seis (6) residuos de histidina. Específicamente, el mutante de
Bcl-2 por deleción de Anderson y col. puede ser
resumido según sigue:
Bcl-2_{(632)}-AAAA-Bcl-2_{(56-206)}-HHHHHH.
Aunque Anderson y col. pudieron expresar con éxito su mutante en
E. coli y purificarlo, observaron que el límite de
solubilidad de su proteína expresada era menor que el ideal para
estudios estructurales basados en rayos X o en RMN bajo las
condiciones examinadas. Por ello, existe actualmente la necesidad en
la técnica de una forma alterada o mutante de Bcl-2
que pueda ser utilizada en estudios estructurales basados en rayos
X o en RMN. Existe también la necesidad de ensayos de selección para
identificar compuestos que sean capaces de unirse a
Bcl-2. Tales ensayos de selección pueden ser
conseguidos con un mutante de Bcl-2 soluble
en agua.
en agua.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a una proteína
mutante derivada de una proteína Bcl-2 humana de
tipo salvaje. Más específicamente, en las proteínas mutantes de la
presente invención, una secuencia de residuos de aminoácidos que
comprende un bucle flexible de la proteína Bcl-2
humana de tipo salvaje ha sido sustituida por una secuencia
diferente (esto es, por una secuencia de aminoácidos de sustitución)
que contiene al menos dos aminoácidos ácidos. Los aminoácidos
ácidos pueden ser ácido glutámico o ácido aspártico o una
combinación de ambos. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos
de sustitución comprende una secuencia de al menos una porción de un
bucle flexible de la proteína Bcl-x_{L} humana.
Más preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de sustitución
comprende la secuencia de la SEC ID Nº:1. Una proteína mutante
particularmente preferida tiene la secuencia de aminoácidos de la
SEC ID Nº:2.
En una realización de la invención, la secuencia
de aminoácidos de sustitución de la proteína mutante comprende una
secuencia de al menos 4 a 50 residuos de aminoácidos
aproximadamente. Más preferiblemente, la secuencia de aminoácidos
de sustitución comprende una secuencia de al menos 16 a 25 residuos
de aminoácidos aproximada-
mente.
mente.
Las proteínas mutantes de la invención tienen un
punto isoeléctrico menor que el de la Bcl-2 de tipo
salvaje. Preferiblemente, el punto isoeléctrico es de 4,5 a 6,0
aproximadamente y, más preferiblemente, de 5,0 a 5,5
aproximadamente. Un punto isoeléctrico particularmente preferido es
5,0.
La presente invención se refiere también a un
ensayo para identificar sustancias que se unan a una proteína
Bcl-2, comprendiendo el ensayo las etapas de (a) la
provisión de una sustancia candidato para ser analizada; (b) la
provisión de un péptido marcado que es capaz de unirse estrechamente
a una proteína mutante de la invención; (c) la formación de un
complejo del péptido marcado con la proteína mutante; (d) la
formación de una mezcla de reacción mediante la puesta en contacto
de la sustancia candidato con el complejo péptido marcado/proteína
mutante; (e) la incubación de la mezcla de reacción bajo condiciones
suficientes para permitir que la sustancia candidato reaccione y
desplace al péptido marcado y (f) la determinación de la cantidad de
péptido marcado que ha sido desplazada de la unión a dicha proteína
mutante. Preferiblemente, el péptido es marcado con un
radioisótopo, con un resto fluorescente, con un enzima, con una
molécula de unión específica o con una partícula. Más
preferiblemente, el péptido es marcado con un compuesto de
fluoresceína. Muy preferiblemente, el péptido es marcado con
isotiocianato de fluoresceína o con
5-carboxi-fluoresceína.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 muestras las secuencias de
aminoácidos de tipo salvaje para las isoformas 1, 2 y 3 de
Bcl-2 (de aquí en adelante
Bcl-2/iso1, Bcl-2/iso2 y
Bcl-3/iso3, respectivamente) y la secuencia de tipo
salvaje de la proteína Bcl-x_{L}. Las diferencias
entre Bcl-2/iso1, Bcl-2/iso2 y
Bcl-3/iso3 están resaltadas en negrita. El bucle
putativo amorfo (residuos de aminoácidos 35-91) está
subrayado.
La Figura 2 muestra una representación en forma
de cintas de la Bcl-x_{L} humana de tipo salvaje.
El bucle amorfo está mostrado como la cinta desenrollada que se
proyecta a la izquierda en la Figura.
La Figura 3 muestra una representación en forma
de cintas de la estructura derivada de RMN de (A)
Bcl-2/iso1 y (B) Bcl-2/iso2.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a proteínas
Bcl-2 mutantes que no se agregan en solución y que
pueden ser utilizadas en ensayos para identificar sustancias que se
unan a una proteína Bcl-2.
\newpage
La presente solicitud contiene también un
listado de secuencias. Para las secuencias de nucleótidos, los pares
de bases están representados por los códigos de bases
siguientes:
\underbar{Símbolo \hskip1.5cm Significado
\hskip3.3cm}
- A
- A; adenina
- C
- C; citosina
- G
- G; guanina
- T
- T; timina
- U
- U; uracilo
- M
- A o C
- R
- A o G
- W
- A o T/U
- S
- C o G
- Y
- C o T/U
- K
- G o T/U
- V
- A o C o G; no T/U
- H
- A o C o T/U; no G
- D
- A o G o T/U; no C
- B
- C o G o T/U; no A
- N
- (A o C o G o T/U)
\vskip1.000000\baselineskip
Los aminoácidos mostrados en la solicitud están
en la forma L y están representados por las abreviaturas de
aminoácidos de tres letras siguientes:
\underbar{Abreviatura \hskip1cm Nombre del
aminoácido \hskip2cm}
- Ala
- L-Alanina
- Arg
- L-Arginina
- Asn
- L-Asparragina
- Asp
- L-Ácido Aspártico
- Asx
- L-Ácido Aspártico o Asparragina
- Cys
- L-Cisteína
- Glu
- L-Ácido Glutámico
- Gln
- L-Glutamina
- Glx
- L-Glutamina o Ácido Glutámico
- Gly
- L-Glicina
- His
- L-Histidina
\underbar{Abreviatura \hskip1cm Nombre del
aminoácido \hskip2cm}
- Ile
- L-Isoleucina
- Leu
- L-Leucina
- Lys
- L-Lisina
- Met
- L-Metionina
- Phe
- L-Fenilalanina
- Pro
- L-Prolina
- Ser
- L-Serina
- Thr
- L-Treonina
- Trp
- L-Triptófano
- Tyr
- L-Tirosina
- Val
- L-Valina
- Xaa
- L-Desconocido u otro
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a proteínas
Bcl-2 mutantes derivadas de la proteína
Bcl-2 humana existente en la naturaleza o de tipo
salvaje. Más específicamente, las proteínas mutantes de la presente
invención son proteínas quiméricas que contienen residuos de
aminoácidos derivados de la proteína Bcl-2 humana de
tipo salvaje, pero que presentan un menor punto isoeléctrico que la
proteína de tipo salvaje. Por consiguiente, a diferencia de la
proteína Bcl-2 humana existente en la naturaleza o
de tipo salvaje, las proteínas Bcl-2 mutantes de la
presente invención no se agregan en solución. En una realización
preferida, las proteínas mutantes de la presente invención
contienen residuos de aminoácidos derivados de la proteína
Bcl-x_{L} humana de tipo salvaje así como de la
proteína Bcl-2 humana existente en la naturaleza o
de tipo salvaje. Como las proteínas Bcl-2 mutantes
de la presente invención no se agregan cuando son colocadas en
solución, estas proteínas pueden ser utilizadas en estudios
estructurales de cristalografía de rayos X y de RMN, así como en
ensayos para identificar compuestos candidato que bloqueen la
capacidad de Bcl-2 para inhibir la muerte celular
programada.
Según se utiliza en la presente, el término
"punto isoeléctrico" o (pI) se refiere al pH al cual la
proteína no lleva carga neta. Los puntos isoeléctricos de
Bcl-2/iso1, Bcl-2/iso2 y
Bcl-2/iso3 son 7,0, 7,2 y 7,2 aproximadamente,
respectivamente. Las proteínas mutantes de la presente invención
tienen un punto isoeléctrico menor que el de la
Bcl-2 de tipo salvaje y, preferiblemente, en el
rango de 4,5 a 6,0 aproximadamente. Más preferiblemente, el punto
isoeléctrico de una proteína mutante de la invención es de 4,5 a 5,5
aproximadamente. Un punto isoeléctrico más preferido es de 5,0
aproximadamente a 5,5 aproximadamente. Un punto isoeléctrico muy
preferido es 5,0. Los medios para determinar el punto isoeléctrico
de una proteína son bien conocidos por las personas con experiencia
habitual en la técnica.
Según se utiliza en la presente, el término
proteína Bcl-2 humana "existente en la
naturaleza" o "de tipo salvaje", se refiere a cualquiera de
las tres proteínas que son isoformas de la Bcl-2
humana. Estas isoformas están mostradas como SEC ID N^{os}:3, 4 y
5. La proteína mostrada en la SEC ID Nº:3 es referida como
"isoforma 1" (Bcl-2/iso1) y está descrita en
Tsujimoto, Y. y col., Science, 226:1097-1099 (1984)
y Tsujimoto, Y. y col., PNAS, 83:5214-5218 (1986).
La proteína mostrada en la SEC ID Nº:4 es referida como "isoforma
2" (Bcl-2/iso2) y está descrita en Cleary, M. y
Sklar, K., PNAS, 82:7439-7443 (1985) y Cleary, M. y
col., Cell, 47:19-28 (1986). La proteína mostrada
en la SEC ID Nº:5 es referida como "isoforma 3"
(Bcl-2/iso3) y está descrita en Bakshi, A. y col.,
Cell, 41:899-906 (1985) y Seto, M. y col., EMBO J.,
7:123-131 (1988). Como puede observarse en la Fig.
1, Bcl-2/iso3 difiere de Bcl-2/iso1
y Bcl-2/iso2 en el residuo en posición 48 (F en
lugar de I). Bcl-2/iso1 difiere de las otras dos
isoformas en los residuos en posición 96 y 110 (A y G en lugar de T
y R, respectivamente).
Según se utiliza en la presente, el término
proteína Bcl-x_{L} humana "existente en la
naturaleza" o de "tipo salvaje", se refiere a la proteína
mostrada en la SEC ID Nº:6 y descrita en Cell,
74:597-608 (1993).
Según se utiliza en la presente, el término
"aproximadamente", cuando se utiliza para modificar un punto
isoeléctrico, significa \pm5%. Cuando se utiliza para modificar
la longitud de una secuencia de aminoácidos, "aproximadamente"
significa \pm 2 aminoácidos.
La proteína Bcl-x_{L} humana
existente en la naturaleza o de tipo salvaje contiene un bucle
flexible amorfo (significando que no presenta una estructura
secundaria regular tal como una hélice \alpha o una lámina
\beta) que no es requerido para mantener la integridad de la
proteína en solución (Muchmore y col., Nature,
381:335-341 (1996)). Este bucle se encuentra en los
residuos de aminoácidos 35-91 (ver la Figura 1 y la
SEC ID Nº:6). Se conoce en la técnica que la proteína
Bcl-x_{L} conserva su función como proteína
anti-apoptótica incluso cuando se elimina este
bucle de la proteína. Sobre la base de la homología de secuencias
entre Bcl-x_{L} y Bcl-2, se
supone que los residuos 35-91 de
Bcl-2 son también amorfos e innecesarios para
mantener la integridad de la proteína. Estos bucles amorfos son
puntos de modificación post-traduccional tal como
fosforilación.
Las proteínas mutantes de la presente invención
derivan de la proteína Bcl-2 humana.
Específicamente, las proteínas Bcl-2 humanas
mutantes de la presente invención tienen los residuos de aminoácidos
que forman su bucle flexible amorfo sustituidos por al menos de 4 a
50 residuos de aminoácidos aproximadamente, de los cuales al menos
dos son aminoácidos ácidos, esto es, ácido glutámico (Glu) o ácido
aspártico (Asp). Los aminoácidos ácidos pueden estar situados en
cualquier posición dentro de la secuencia de sustitución. Además, la
secuencia de sustitución puede contener sólo un tipo de aminoácido
ácido (esto es, dos o más Glus o dos o más Asps) o una combinación
de ambos. Según se desea en esta descripción, no existe ningún
límite sobre el tipo o sobre el número total de aminoácidos ácidos
que comprende la secuencia de sustitución (siempre que contenga al
menos dos aminoácidos ácidos).
En una realización preferida, el bucle flexible,
amorfo, de la proteína Bcl-2 humana es sustituido
por una secuencia de al menos desde 4 a 50 residuos de aminoácidos
aproximadamente, correspondientes a una secuencia contigua de
residuos de aminoácidos procedente del bucle amorfo de
Bcl-x_{L}, en la que al menos dos de los residuos
son aminoácidos ácidos. Más preferiblemente, los residuos de
aminoácidos del bucle flexible, amorfo, de Bcl-2
están sustituidos por al menos de 16 a 25 residuos de aminoácidos
aproximadamente (de los cuales al menos dos son aminoácidos ácidos)
procedentes del bucle flexible, amorfo, correspondiente de la
proteína Bcl-X_{L} humana. Incluso más
preferiblemente, la secuencia completa del bucle flexible, amorfo
de Bcl-2, que tiene los residuos de aminoácidos
35-91, está sustituida por la secuencia
DVEENRTEAPEGTESE (SEC ID Nº:1) que codifica una porción del bucle
flexible de la proteína Bcl-x_{L} humana existente
en la naturaleza o de tipo salvaje.
Las proteínas Bcl-2 mutantes de
la presente invención pueden contener de 150 aproximadamente a 180
residuos de aminoácidos aproximadamente.
Un ejemplo de una proteína Bcl-2
mutante preferida de la presente invención incluye, pero no se
limita a:
Según se discutió previamente, las proteínas
Bcl-2 mutantes de la presente invención no se
agregan en solución, a diferencia de la proteína
Bcl-2 existente en la naturaleza o de tipo salvaje.
Aunque sin desear estar ligados a ninguna teoría, los inventores de
la presente invención creen que la sustitución del bucle flexible,
amorfo, completo de Bcl-2 por una porción del bucle
flexible, amorfo de la proteína Bcl-x_{L} humana,
hace que las proteínas Bcl-2 mutantes de la
presente invención sean más ácidas y reduce por tanto el punto
isoeléctrico de las proteínas Bcl-2 mutantes en
comparación con la proteína Bcl-2 existente en la
naturaleza o de tipo salvaje. Más específicamente, los inventores
encontraron que cuando se eliminaban los residuos de aminoácidos
49-91 del bucle flexible amorfo de
Bcl-x_{L}, esta proteína acortada se comportaba
bien en solución y no se agregaba. Se determinó que el punto
isoeléctrico de esta proteína Bcl-x_{L} acortada
era de 4,9 aproximadamente. Los inventores eliminaron
posteriormente los mismos residuos de aminoácidos
(49-91) del bucle flexible, amorfo de
Bcl-2. Sorprendentemente, esta proteína acortada no
se comportaba bien en solución y mostraba agregación. Se determinó
que el punto isoeléctrico de esta proteína Bcl-2
acortada era de 6,4 aproximadamente. Los inventores compararon los
bucles acortados de las proteínas Bcl-x_{L} y
Bcl-2 y se dieron cuenta que el bucle acortado de
Bcl-x_{L} contenía más residuos de aminoácidos
ácidos que el bucle acortado de Bcl-2, dando así a
la proteína Bcl-x_{L} acortada un punto
isoeléctrico más bajo que a la proteína Bcl-2
acortada. Los inventores creen que la diferencia entre los puntos
isoeléctricos explica la diferencia en el comportamiento de las dos
proteínas.
Las proteínas mutantes de la presente invención
tienen un punto isoeléctrico menor de 6,0 aproximadamente,
preferiblemente menor de 5,5 aproximadamente. Más específicamente,
los inventores encontraron que cuando la secuencia completa del
bucle flexible, amorfo de Bcl-2, que tiene los
residuos de aminoácidos 35-91, es sustituida por
los residuos de aminoácidos DVEENRTEAPEGTESE (SEC ID Nº:1) (que
representan una porción del bucle flexible de la proteína
Bcl-x_{L} humana existente en la naturaleza o de
tipo salvaje), el punto isoeléctrico de esta proteína
Bcl-2 mutante es 5,0 aproximadamente. Los inventores
creen que esta reducción del punto isoeléctrico de la proteína
Bcl-2 mutante de la presente invención, cuando se
compara con la proteína Bcl-2 de tipo salvaje,
explicaría el porqué las proteínas Bcl-2 mutantes no
se agregan en solución.
\newpage
Las proteínas mutantes de la presente invención
pueden ser preparadas utilizando técnicas conocidas en el oficio,
tales como las técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, una
secuencia de nucleótidos que codifique una proteína
Bcl-2 mutante como la descrita anteriormente, puede
ser insertada en un vector de ADN adecuado, tal como un plásmido.
Más específicamente, la secuencia de nucleótidos puede ser insertada
en un vector de ADN adecuado utilizando técnicas conocidas en el
oficio, incluyendo, pero sin limitarse a, extremos romos o extremos
escalonados para la ligadura, digestión con enzimas de restricción
para proporcionar extremos apropiados, relleno de los extremos
cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina
para evitar una unión indeseable y ligadura con ligasas apropiadas.
Las técnicas para tales manipulaciones están descritas en Sambrook,
J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y. (1989). Una vez que
ha sido preparada la secuencia de nucleótidos, es insertada en el
vector de ADN y el vector es utilizado para transformar un huésped
adecuado. La proteína mutante recombinante es producida en el
huésped mediante expresión. El huésped transformado puede ser una
célula procariótica o eucariótica.
Una vez que las proteínas de la presente
invención han sido preparadas, pueden ser sustancialmente
purificadas mediante varios procedimientos cromatográficos,
incluyendo intercambio iónico, afinidad, exclusión de tamaños o
interacción hidrofóbica (ver, Crighton, T., Proteins, Structures and
Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, N.Y. (1983)).
La composición de cualquiera de las proteínas sintéticas de la
presente invención puede ser confirmada mediante análisis de
aminoácidos o secuenciación (utilizando el procedimiento de
degradación de Edman). Las proteínas mutantes de la presente
invención pueden ser utilizadas en ensayos de selección. Más
específicamente, las proteínas mutantes de la presente invención
pueden ser utilizadas para identificar moléculas pequeñas que
bloqueen la capacidad de Bcl-2 para inhibir la
muerte celular programada.
La presente invención se refiere también a una
variedad de ensayos de selección para identificar compuestos
candidato que sean capaces de unirse a las proteínas
Bcl-2 mutantes de la presente invención e inhibir
así la muerte celular programada. El ensayo de la presente
invención se centra en la capacidad o incapacidad de los compuestos
candidato para unirse a las proteínas Bcl-2 mutantes
de la presente invención y desplazar una molécula sonda marcada tal
como un péptido.
Los ensayos de selección de la presente
invención pueden ser utilizados para someter a selección un gran
número de compuestos con el fin de identificar aquellos compuestos
que sean capaces de unirse a Bcl-2. Los compuestos
que sean identificados como que se unen a Bcl-2
pueden ser utilizados clínicamente como agentes anticancerosos.
Específicamente, estos compuestos pueden ser utilizados para
estimular la apoptosis en células cancerosas que sobreexpresen
Bcl-2 en el tratamiento de ciertos cánceres. Los
compuestos que no tengan actividad en los ensayos de selección,
pueden ser eliminados de una consideración posterior como compuestos
candidato.
Los compuestos candidato que van a ser sometidos
a selección pueden incluir numerosas clases químicas. Sin embargo,
los compuestos candidato son típicamente moléculas orgánicas,
preferiblemente compuestos orgánicos pequeños con un peso molecular
de 150 aproximadamente a 800 daltons aproximadamente. Tales
compuestos candidato contendrán grupos funcionales necesarios para
una interacción estructural con proteínas, particularmente enlaces
de hidrógeno, y típicamente incluirán al menos un grupo amina,
carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferiblemente al menos dos de
los grupos químicos funcionales. Los compuestos candidato contienen
a menudo un carbono cíclico o estructuras heterocíclicas y/o
estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de
los grupos funcionales anteriores. Pueden encontrarse también
compuestos candidato entre las biomoléculas, incluyendo péptidos,
sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas,
derivados, análogos estructurales o combinaciones de los
mismos.
Los compuestos candidato puede ser obtenidos de
una amplia variedad de fuentes tales como bibliotecas de compuestos
sintéticos o naturales. Por ejemplo, están disponibles numerosos
medios para la síntesis aleatoria y dirigida de una amplia variedad
de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluyendo la expresión de
oligonucleótidos y oligopéptidos aleatorizados. Alternativamente,
están disponibles, o son producidas fácilmente, bibliotecas de
compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos,
vegetales y animales. Adicionalmente, las bibliotecas y compuestos
naturales o producidos sintéticamente son fácilmente modificados
mediante medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales, y
pueden ser utilizados para producir bibliotecas combinatorias.
Agentes farmacológicos conocidos pueden ser sometidos a
modificaciones químicas dirigidas o aleatorias, tales como
acilación, alquilación, esterificación, amidación, etc., para
producir análogos estructurales.
En los ensayos de unión competitiva, el
compuesto candidato puede competir con un analito marcado por la
unión específica a lugares en un agente de unión unido a una
superficie sólida. En tal ensayo, el analito marcado puede ser un
péptido marcado y el agente de unión puede ser la proteína
Bcl-2 mutante de la presente invención unida a la
fase sólida. La concentración de analito marcado unido al agente de
unión es inversamente proporcional a la capacidad del compuesto
candidato para competir en el ensayo de unión. La tasa de inhibición
del analito marcado por el compuesto candidato depende las
condiciones del ensayo de unión y de las concentraciones del agente
de unión, del analito marcado y del compuesto candidato que son
utilizadas. Bajo condiciones de ensayo especificadas, se dice que
un compuesto candidato es capaz de unirse a la proteína
Bcl-2 mutante de la presente invención en un ensayo
de unión competitiva, si la tasa de unión del analito marcado al
agente de unión disminuye un diez por ciento (10%) o más. En un
ensayo de unión directa, un compuesto candidato se une a la proteína
Bcl-2 mutante de la presente invención cuando la
señal medida es dos veces el nivel de fondo o superior.
En un ensayo de unión competitiva, el compuesto
candidato compite con los analitos marcados para unirse a la
proteína Bcl-2 mutante de la presente invención.
Según se describe en la presente, el agente de unión puede estar
unido a una superficie sólida para llevar a cabo la separación del
analito marcado unido del analito marcado no unido.
Alternativamente, la unión competitiva puede ser llevada a cabo en
una fase líquida, y puede utilizarse cualquiera de una variedad de
técnicas conocidas en el oficio para detectar la liberación del
analito marcado unido o para separar el analito marcado unido del
analito marcado no unido. Después de la separación, se determina la
cantidad de analito marcado unido. La cantidad de proteína presente
en la muestra es inversamente proporcional a la cantidad de analito
marcado unido.
Alternativamente, puede llevarse a cabo un
ensayo de unión homogéneo, en el cual no es necesaria una etapa de
separación. En estos tipos de ensayo, la unión de compuesto
candidato a la proteína Bcl-2 mutante tiene como
resultado el desplazamiento de un analito marcado y el cambio
posterior de la señal emitida por el analito.
Un ejemplo de un ensayo de unión competitiva
para detectar compuestos candidato capaces de unirse a las proteínas
Bcl-2 mutantes de la presente invención está
descrito en el Ejemplo 2 de la presente.
Según se discutió aquí anteriormente, los
ensayos de selección descritos en la presente emplean una o más
moléculas marcadas. La marca utilizada en el ensayo de la presente
invención puede proporcionar directamente o indirectamente una
señal detectable. Las diferentes marcas que pueden ser utilizadas
incluyen radioisótopos, compuestos fluorescentes, compuestos
quimioluminiscentes, compuestos bioluminiscentes, enzimas, moléculas
de unión específica, partículas, por ejemplo partículas magnéticas,
etcétera. Las moléculas de unión específica incluyen pares tales
como biotina y estreptavidina, digoxina y antidigoxina, etc. Para
los miembros de unión específica, el miembro complementario está
normalmente marcado con una molécula que facilita la detección, de
acuerdo con procedimientos conocidos. Además, la unión de estas
marcas a las proteínas mutantes de la presente invención se lleva a
cabo utilizando técnicas estándar conocidas en el oficio.
Una variedad de otros reactivos puede estar
también incluida en el ensayo de selección. Éstos incluyen reactivos
como sales, proteínas neutras, por ejemplo albúmina, detergentes,
etc., que son utilizados para facilitar la unión óptima
proteína-proteína y/o reducir interacciones no
específicas o de fondo. Pueden utilizarse reactivos que mejoren la
eficacia del ensayo, tales como inhibidores de proteasas,
inhibidores de nucleasas, agentes antimicrobianos, etc. La mezcla
de componentes es añadida en cualquier orden que proporcione la
unión requerida. Las incubaciones se realizan a cualquier
temperatura adecuada, típicamente entre 0 aproximadamente y 40ºC
aproximadamente. Los periodos de incubación son seleccionados para
conseguir una actividad óptima. Típicamente, serán suficientes
incubaciones de 0,05 y 10 horas aproximadamente.
A manera de ejemplo, y no de limitación, se
presentarán a continuación ejemplos de la presente invención.
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Construcción de plásmidos. Se prepararon
construcciones de ácido nucleico para producir proteínas
Bcl-2 mutantes que fueron posteriormente evaluadas
con el fin de determinar su idoneidad para estudios estructurales de
RMN. Todos los reactivos utilizados en la producción de estas
construcciones fueron obtenidos de fuentes comercialmente
disponibles. De manera general, se prepararon fragmentos de ácido
nucleico mediante técnicas estándar de PCR y se clonaron en
vectores comerciales mediante medios bien conocidos en la técnica.
Todas las secuencias fueron confirmadas mediante análisis en un
secuenciador de ADN ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Foster
City, CA). Los cebadores directos e inversos utilizados para
amplificar los fragmentos de la PCR están mostrados en la Tabla 1
siguiente.
Se preparó en primer lugar un fragmento que
codificaba los aminoácidos 1-218 de
Bcl-2 mediante reacción en cadena de la polimerasa
con transcriptasa inversa (RT-PCR), utilizando un
kit de RT-PCR de
BOEHRINGER-MANNHEIM, Corp. (Indianapolis, IN). El
fragmento fue generado utilizando las secuencias de cebadores SEC ID
Nº:7 y SEC ID Nº:8 y ARNm Daudi (CLONTECH, Palo Alto, CA) como
molde, bajo las condiciones sugeridas por el fabricante. El
fragmento fue clonado inicialmente en los sitios de NdeI y XhoI del
plásmido pET30b (Novagen, Madison, WI) para su expresión. El
plásmido resultante fue denominado plásmido A.
Se generó posteriormente un segundo plásmido
(plásmido B) que contenía fragmentos que codificaban los aminoácidos
1-34 de la SEC ID Nº:3
(Bcl-2/iso1), los aminoácidos 29-44
de la SEC ID Nº:6 (bucle de Bcl-x_{L}) y
92-218 de la SEC ID Nº:3
(Bcl-2/iso1). Los fragmentos fueron generados con un
kit de PCR ExpandLong (BOEHRINGER-MANNHEIM, Corp.,
Indianapolis, IN) utilizando como cebadores las SEC ID N^{os}:9 y
10, el plásmido A como molde y las siguientes condiciones de los
ciclos: un ciclo a 94ºC, 4 minutos, un ciclo a 94ºC, 40 segundos, 15
ciclos a 55ºC, 45 segundos; 68ºC, 6 minutos y 1 ciclo a 72ºC, 10
minutos. Las secuencias de los cebadores fueron diseñadas de tal
manera que (1) amplificaran en dirección "hacia atrás" con el
fin de omitir la secuencia intermedia del plásmido A (que contiene
los nucleótidos que codifican los aminoácidos 35-91
de la SEC ID Nº:3) y (2) contengan nucleótidos que codifiquen el
bucle de Bcl-x_{L} (aminoácidos
29-44 de la SEC ID Nº:6). La ligadura posterior del
fragmento amplificado tuvo como resultado el plásmido B.
Se construyó un tercer plásmido (plásmido C) que
contenía un fragmento que codificaba los aminoácidos
1-34 de la SEC ID Nº:3
(Bcl-2/iso1), los aminoácidos 29-44
de la SEC ID Nº:6 (bucle de Bcl-x_{L}) y
92-207 de la SEC ID Nº:3
(Bcl-2/iso1). Se generó un fragmento a partir del
plásmido B (como molde) utilizando reactivos estándar para PCR, ADN
polimerasa Pfu y las SEC ID N^{os}:11 y 12 como cebadores, con las
siguientes condiciones de ciclos: un ciclo a 94ºC, 4 minutos,
treinta ciclos a 94ºC, 30 segundos; 55ºC, 45 segundos; 72ºC, 2
minutos; un ciclo a 72ºC, 10 minutos. El fragmento resultante fue
clonado en los sitios de NdeI y XhoI de pET28b (Novagen, Madison,
WI), formándose el plásmido C.
Para la construcción del plásmido para
Bcl-2/iso2 (plásmido D), se utilizó el plásmido C
como molde de ADN. La alanina 96 y la glicina 110 fueron cambiadas
a treonina 96 y arginina 110, respectivamente, utilizando dos
conjuntos de cebadores: SEC ID N^{os}:13 y 14 (para la mutación de
Ala96 a Thr96) y las SEC ID N^{os}:15 y 16 (para la mutación de
Gly110 a Arg110). Las secuencias mutadas fueron obtenidas utilizando
el kit "Quick Change kit" de Stratagene® (Stratagene®, La
Jolla, CA) de acuerdo con las indicaciones del fabricante.
Expresión y purificación de la muteína
Bcl-2. Las muteínas Bcl-2 fueron
expresadas en células de E. coli BL21(DE3) cultivadas
en medio M9 que contenía ^{15}NH_{4}Cl, ^{15}NH_{4}Cl más
[U-^{13}C]glucosa o ^{15}NH_{4}Cl,
[U-^{13}C]glucosa y un 75% de
^{2}H_{2}O. Las células fueron inducidas con
isopropil-D-tiogalactopiranósido 1
mM durante 3 horas a 30ºC durante la fase logarítmica media. Las
células fueron resuspendidas en Tris-Cl 20 mM, pH
7,8, NaCl 1,5 M, 2-mercaptoetanol 5 mM, y lisadas
posteriormente en un Prensa Francesa. La fracción soluble fue
cargada sobre una columna de Ni^{2+}-agarosa,
lavada con el mismo tampón de la columna, lavada posteriormente con
imidazol 20 mM, Tris-Cl 20 mM, pH 7,8, NaCl 1,5 M,
2-mercaptoetanol 5 mM y, finalmente, eluida con
imidazol 500 mM, Tris-Cl 20 mM, pH 7,8,
2-mercaptoetanol 5 mM.
La fracción de Bcl-2 eluida fue
tratada con trombina biotinilada de acuerdo con el protocolo
sugerido por el fabricante (Novagen, Madison, WI). Se utilizó
trombina biotinilada (0,5 unidades) para cortar 1 mg de proteína
durante 16 horas a temperatura ambiente. La reacción de corte fue
parada mediante la adición de Estreptavidina Agarosa (Novagen,
Madison, WI), diluida tres veces con Tris-Cl 20 mM,
pH 7,5, y pasada sobre otra columna de Ni^{2+} preequilibrada. Se
recogió la fracción de Bcl-2 no marcada con his que
fluía a través de la columna. La muteína Bcl-2
purificada fue concentrada y almacenada a 4ºC. Se llevó a cabo la
secuenciación proteica N-terminal de la muteína
Bcl-2 purificada en un Secuenciador de Proteínas
477A (PE Applied Biosystems, Forster City, CA). La concentración de
proteínas fue determinada utilizando un kit para el análisis de
proteínas mediante Coomasie de Pierce (Rockford, IL) y UV.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó un ensayo de polarización de
fluorescencia competitivo para medir la afinidad de diferentes
péptidos por Bcl-2/iso1 (ver la Tabla 2) o
Bcl-2/iso2 (ver la Tabla 3). Los ensayos
competitivos se llevaron a cabo utilizando como sonda uno de los
tres péptidos marcados con fluoresceína siguientes:
- (1)
- (5-FAM)-AAAAAQRYGRELRRMSDEFVDSFKK (SEC ID Nº:17), obtenido de Synpep Corporation, Dublin, CA,
- (2)
- (5-FAM)-AAAAAQRYGRELRRMSDEFVDSKK (SEC ID Nº:18) o
- (3)
- (FITC)-AAQRYGRELRRMSDEFVR (SEC ID Nº:19). Las constantes de disociación de estos péptidos de Bcl-2/iso1 marcados con fluoresceína son \sim20 nM, \sim50 nM y \sim100 nM, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las valoraciones fueron automatizadas por
medio de un instrumento de diagnóstico clínico de Abbott (IMx, modo
FPIA) modificado con un protocolo especial para llevar a cabo las
valoraciones. Se obtuvo una serie completa de diluciones de dos
veces, compuesta por veinte muestras de 2 ml separadas, mediante la
administración de la alícuotas individuales apropiadas a los
primeros siete tubos, de alícuotas procedentes de una solución
madre diluida intermedia para los siguientes siete tubos y una
dilución intermedia más para los seis tubos finales. El tampón de
dilución para todas las soluciones madre y muestras fue fosfato de
sodio 120 mM a pH 7,55 con un 0,01% de gamma globulina bovina y un
0,1% de azida de sodio. Las concentraciones de las soluciones madre
del péptido en DMSO eran 1-4 mM, según se determinó
mediante la absorbancia de Trp (D.O. 280 nm), la absorbancia de
Tyr (D.O. 293) o mediante análisis de aminoácidos. La concentración
final de DMSO para todas las muestras no fue nunca superior al 1%.
Se prepararon veinte muestras de 1,8 \mul sin péptido marcado con
fluoresceína y se leyeron como blancos. A cada tubo se añadieron 0,2
\mul de una mezcla de Bcl-2, péptido marcado con
fluoresceína; los tubos fueron incubados durante 5 minutos a 35ºC y
leídos posteriormente para determinar la intensidad total y la
polarización. Los valores obtenidos para el péptido marcado con
fluoresceína libre y unido fueron constantes dentro de un rango de
\pm 5 mP. La concentración final de Bcl-2 era de
340 nM. Se realizaron comparaciones con otras concentraciones más
bajas de Bcl-2 para el péptido de
Bcl-2 de tipo salvaje. Controles adicionales
utilizando un tampón que carecía de BGG mostraron que la unión no
específica a BGG era despreciable.
Los datos de polarización en estado estacionario
pueden ser analizados para extraer las fracciones de ligando
fluorescente unido y libre debidas a la aditividad lineal de sus
valores de anisotropía, ponderados por sus intensidades
fraccionarias respectivas (Lakowicz, J.R., Principles of
Fluorescence Spectroscopy, New York, NY: Plenum Press (1983)). El
ajuste no lineal de curvas por mínimos cuadrados de los datos de
valoración a un modelo para la unión en equilibrio simple del
péptido marcado con fluoresceína a Bcl-2, fue
llevado a cabo mediante ecuaciones de unión estándar programadas,
resueltas en términos de unido, libre y valores observados de
anisotropía, en el programa de desarrollo de modelos MINSQ (V. 4.03,
Micromath Scientific Software). Para determinar las afinidades de
péptidos no fluorescentes, se utilizó el procedimiento analítico
para la unión por competición en equilibrio tomado de Dandliker y
colaboradores, empleando de nuevo MINSQ para el ajuste de las
curvas de valoración (Dandliker y col., Methods in Enzymology
74:3-28 (1981)). La confirmación de la validez de
estos procedimientos experimentales y de ajuste fue obtenida
comparando los resultados después de realizar la unión del péptido
marcado con fluoresceína y las valoraciones de la unión competitiva
a diferentes concentraciones fijadas de Bcl-2 o de
los péptidos marcados con fluoresceína.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Según muestran las Tablas 2 y 3, las proteínas
mutantes de la invención pueden ser utilizadas para identificar
compuestos que se unan estrechamente a un miembro de la familia
Bcl-2.
\vskip1.000000\baselineskip
Espectroscopía de RMN. Las estructuras de
Bcl-2/iso1 y Bcl-2/iso2 solubles
fueron determinadas mediante espectroscopía de RMN (ver la Figura
3). Todos lo experimentos de RMN fueron adquiridos a 298 K en un
espectrómetro de RMN Bruker DRX500, DRX600 o DRX800. Las
asignaciones de resonancia de ^{1}H, ^{13}C y ^{15}N del
esqueleto se consiguieron con [^{15}N, ^{13}C, ^{2}H (75%)]
Bcl-2 utilizando una serie de experimentos de
resonancia triple, desacoplada con deuterio (HNCA,
HN(CO)CA, HN(CA)CB,
HN(COCA)CB, HNCO y HN(CA)CO) (Yamazaki,
T., Lee, W., Arrowsmith, C.H., Muhandiram, D.R. y Kay, L.E. (1994)
J. Am. Chem. Soc. 116, 11655-11666). Las señales de
RMN de ^{1}H y ^{13}C de las cadenas laterales fueron asignadas
a partir de experimentos HCCH-TOCSY (Clore, G.M. y
Gronenborn, A.M. (1994) Methods Enzymol., 239,
349-63), y las asignaciones estereoespecíficas de
los grupos metilo de la valina y de la leucina fueron obtenidas de
un análisis de los patrones de acoplamiento
^{13}C-^{13}C observados para la
Bcl-2 marcada con ^{13}C fraccionalmente, dirigida
biosintéticamente (Neri, D., Szyperski, T., Otting, G., Senn, H. y
Wüthrich, K. (1989) Biochemistry, 28, 7510-7516).
Las restricciones de la distancia NOE fueron obtenidas a partir de
espectros tridimensionales NOESY editados con ^{15}N y ^{13}C
(Fesik, S.W. y Zuiderweg, E.R.P. (1988) J. Magn. Reson. 78,
588-593, Marion, D., Driscoll, P.C., Kay, L.E.,
Wingfield, P.T., Bax, A., Gronenborn, A.M. y Clore, G.M. (1989)
Biochemistry, 29, 6150-6156) adquiridos con un
tiempo de mezclado de 80 ms. Los protones de amidas que se
intercambiaban lentamente fueron identificados en un espectro de
^{15}N-NSQC registrado inmediatamente después del
intercambio de la proteína en un tampón preparado con D_{2}O. Los
acoplamientos dipolares residuales (NH-N y
C'-C^{\alpha}) fueron medidos utilizando
versiones no desacopladas del experimento de HNCO en [^{15}N,
^{13}C, ^{2}H (75%)] Bcl-2 en presencia de 17
mg ml^{-1} del fago Pfl (Tjandra, N. (1999) Structure, 7,
R205-R211, Hansen, M.R., Mueller, L. y Pardi, A.
(1998) Nature Struc. Biol., 5, 1065-1074, Clore,
G.M., Starich, M.R. y Gronenborn, A.M. (1998) J. Am. Chem. Soc.,
120, 10571-10572).
Cálculos de la Estructura: Las
estructuras de Bcl-2 fueron calculadas utilizando un
protocolo de hibridación simulada (Brunger, A.T. (1992)
X-PLOR Versión 3.1 (Yale University Press, New Haven
y London) con el programa CNX (MSI, San Diego). Se empleó un
potencial de pozo cuadrado (F_{NOE} = 50 kcal mol^{-1}) para
estrechar las distancias derivadas de NOE. Sobre la base de las
intensidades máximas cruzadas, a las restricciones de las
distancias derivadas de NOE se les asignaron límites superiores de
3,0, 4,0, 5,0 ó 6,0 \ring{A}. Las restricciones de los ángulos de
torsión se generaron \Phi, \Psi a partir del análisis de los
desplazamientos químicos de N, C, C', C^{\alpha} y H^{\alpha}
utilizando el programa TALOS (Cornilescu, G., Delaglio, F. y Bax,
A. (1999) J. Biomol. NMR13, 289-302). Se aplicó una
constante de fuerza de 200 kcal mol^{-1} rad^{-2} a todas las
restricciones torsionales. Se incluyeron enlaces de hidrógeno
explícitos en las hélices \alpha solamente para aquellos residuos
que se observó que tenían un intercambio lento de protones de amida.
Se empleó el programa PROCHECK para analizar la calidad geométrica
de las estructuras calculadas en el conjunto (Laskowski, R.A.,
MacArthur, M.W., Moss, D.S. y Thornton, J.M. (1993) J. Appl. Cryst.,
26, 283-291).
La presente invención está ilustrada por medio
de la descripción y los ejemplos precedentes. La descripción
precedente tiene la intención de ser una ilustración no limitante,
ya que muchas variaciones serán obvias a las personas expertas en
la técnica a la vista de la misma. Se tiene la intención de que
tales variaciones dentro del ámbito y el espíritu de las
reivindicaciones adjuntas estén abarcadas todas ellas por las
mismas.
Pueden realizarse cambios en la composición, en
la operación y en la disposición del método de la presente
invención descritas en la presente sin alejarse del concepto y del
ámbito de la invención según está definida en las reivindicaciones
siguientes.
Cualquier referencia mencionada en la presente
es incorporada por referencia.
<110> Abbott Laboratories
\hskip1cmFesik, Steven W
\hskip1cmPetros, Andrew M.
\hskip1cmYoon, Ho Sup
\hskip1cmNettescheim, David G.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PÉPTIDOS DE BCL-2
MUTANTES Y UTILIZACIONES DE LOS MISMOS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 6752.US.01
\vskip0.400000\baselineskip
<140> US 09/716.395
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
20-11-2000
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 239
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 239
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 239
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 237
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcactcaccat atggctcacg ctgggagaac ggggtacgac aac
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgagctctc gagcttcaga gacagccagg agaaatcaaa cag
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccccagaag ggactgaatc ggaggtggtc cacctggccc tccgccaa
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcagtacgg ttctcttcca catcatctcc cgcatcccac tcgtagcc
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcactcaccat atggctcacg ctgggagaac ggggtacgac aac
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgaagctct cgagctatca atcaaacaga ggccgcatgc tggggccgta
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggtggtcc acctgaccct ccgccaagcc g
\hfill31
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador
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\hfill31
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador
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<400> 15
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\hskip-.1em\dddseqskipgccgctaccg ccgcgacttc gccgag
\hfill26
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 16
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\hfill26
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<210> 17
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<211> 25
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido
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<213> Secuencia artificial
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<223> Péptido
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<223> Péptido
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<223> Péptido
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\hskip1cm
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido
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<400> 27
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<213> Secuencia artificial
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<223> Péptido
\newpage
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\hskip1cm
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<210> 29
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido
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<400> 29
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido
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<400> 30
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
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<211> 25
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Péptido
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 34
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\hskip1cm
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<210> 36
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido
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<400> 36
\hskip1cm
\hskip1cm
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<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\hskip1cm
Claims (4)
1. Una proteína mutante derivada de una proteína
Bcl-2 humana de tipo salvaje y que tiene una
secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID Nº:2, en la cual
una secuencia de residuos de aminoácidos que codifica un bucle
flexible de dicha proteína Bcl-2 humana de tipo
salvaje que comprende los aminoácidos 35-91 de dicha
proteína Bcl-2 humana, está sustituida por una
secuencia de aminoácidos de sustitución que comprende la secuencia
de la SEC ID Nº:1.
2. La proteína mutante de la Reivindicación 1,
que tiene un punto isoeléctrico menor que el de la
Bcl-2 de tipo salvaje.
3. Un ensayo para identificar sustancias que se
unan a una proteína Bcl-2, comprendiendo dicho
ensayo las etapas de:
- (a)
- la provisión de una sustancia candidato para ser analizada;
- (b)
- la provisión de un péptido marcado que es capaz de unirse estrechamente a dicha proteína mutante de la Reivindicación 1;
- (c)
- la formación de un complejo del péptido marcado con dicha proteína mutante;
- (d)
- la formación de una mezcla de reacción mediante la puesta en contacto de la sustancia candidato con el complejo péptido marcado/proteína mutante;
- (e)
- la incubación de la mezcla de reacción bajo condiciones suficientes para permitir que la sustancia candidato reaccione y desplace al péptido marcado; y
- (f)
- la determinación de la cantidad de péptido marcado que ha sido desplazado de la unión con dicha proteína mutante.
4. El ensayo de la Reivindicación 3, en el que
el péptido está marcado con radioisótopos, restos fluorescentes,
enzimas, moléculas de unión específica o partículas.
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