ES2330868T3 - Proteina que contiene dominio mam. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que está formado por la secuencia de aminoácido tal y como se indica en la SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 4, y que actúa como un inhibidor de linfocitos.

Description

Proteína que contiene dominio MAM.

Esta invención hace referencia a una nueva proteína, denominada INSP152, aquí definida como proteína segregada, en particular, como un dominio MAM que contiene proteína a al uso de esta proteína y la secuencia de ácido nucleico del gen codificador en el diagnóstico, prevención y tratamiento de enfermedad.

Contexto

El proceso de descubrimiento de fármacos está sufriendo hoy en día una revolución fundamental a medida que se desarrolla la era de genómica funcional. El término "genómica funcional" se aplica a la ciencia que utiliza herramientas bioinformáticas para atribuir función a secuencias proteicas de interés. Dichas herramientas se están convirtiendo en muy necesarias a medida que la velocidad de generación de datos de secuencia está rápidamente dejando atrás la habilidad de los laboratorios de investigación para asignar funciones a estas secuencias de proteínas.

Según aumentan las herramientas bioinformáticas en potencia y en precisión, estas herramientas están rápidamente sustituyendo las técnicas convencionales de caracterización bioquímica. De hecho, las herramientas bioinformáticas avanzadas empleadas en la identificación de la presente invención ahora son capaces de dar resultados en los cuales se puede confiar en un alto grado.

Varias instituciones y organizaciones comerciales están examinando datos de secuencia a medida que se van haciendo disponibles y se están llevando a cabo importantes descubrimientos sobre una base que sigue vigente. Sin embargo, aún existe una necesidad de identificar y caracterizar más genes y los polipéptidos que los codifican, como objetivos de investigación y para el descubrimiento de fármacos.

Introducción Proteínas Segregadas

La habilidad de las células para hacer y segregar proteínas extracelulares es central para muchos procesos biológicos. Las células segregan enzimas, los factores de crecimiento, las proteínas con matriz extracelular y las moléculas señalizadoras. Esto se realiza a través de fusión de una vesícula segregadora con la membrana de plasma. En la mayoría de los casos, pero no en todos, las proteínas se dirigen al retículo endoplásmico y a las vesículas segregadoras a través de un péptido señalizador. Los péptidos señalizadores son secuencias que actúan con cis que afectan al transporte de cadenas de polipéptidos desde el citoplasma a un compartimiento unido a la membrana como una vesícula de secreción. Los polipéptidos que se dirigen a las vesículas de secreción son segregadas a la matriz extracelular o se retienen en la membrana de plasma. Los polipéptidos que se retienen en la membrana de plasma tendrán uno o más dominios transmembránicos. Ejemplos de proteínas segregadas que juegan un papel central en el funcionamiento de una célula son citoquinas, hormonas, proteínas con matriz extracelular (moléculas de adhesión), proteasas, y factores de crecimiento y diferenciación. La descripción de algunas de las propiedades de estas proteínas sigue a continuación.

Proteínas que contienen dominio MAM

Los dominios MAM (meprina, proteína A-5, receptor proteína-tirosina fosfatasa \mu) están formados por 60 aminoácidos. Se encuentran presentes en proteínas transmembránicas como las meprinas, y fosfatasas de receptor proteína-tirosina, donde parece que funcionan en las interacciones célula/célula.

Las meprinas pertenecen a la familia astacina de metaloendopeptidasas y la "superfamilia metzincina". Tienen proteasas oligoméricas y con múltiples dominios que son segregadas o expresadas en membranas de borde en cepillos del intestino o riñón. Las meprinas son proteasas complejas y estructuralmente únicas: glicoproteínas homo- o heterotetraméricas que contienen dominios catalíticos del estilo de estaciona y dímeros con puente de disulfuro. Son capaces de degradar proteínas como colágeno y gelatina, hormonas como la hormona paratiroidea, hormona liberadora de hormona luteirizante, y hormona estimuladora de melanocito, y pequeños péptidos como bradiquina, angiotensinas, y gastrina.

Todas las fosfatasas proteína-tirosina del tipo receptor (RPTPs) del tipo II contienen un dominio MAM. Estas proteínas regulan muchas funciones celulares importantes que incluyen la transducción de señal, crecimiento, diferenciación y adhesión celular y guía de axones. Los dominios MAM también han demostrado tener relación con la adhesión de esperma. Por lo tanto, el dominio juega un papel en el reconocimiento y/o señalización de gametos.

El creciente conocimiento de estos dominios es por lo tanto de extrema importancia en el incremento del conocimiento de las rutas subyacentes dirigidas a los estados de la enfermedad y a los estados de enfermedades asociadas tal y como se ha mencionado anteriormente, y en el desarrollo de genes efectivos y/o terapias con fármacos para tratar estos desórdenes.

La invención

La invención se base en el descubrimiento de que el polipéptido INSP152 es una proteína que contiene el dominio MAM. En particular, la invención se base en los sorprendentes descubrimientos en los que los polipéptidos de la presente invención:

a)

muestran una expresión restringida inesperada en muestras de biopsia en el intestino delgado, en lupus y en la enfermedad de Crohn derivadas de biopsias ileales y

b)

son inhibidores de proteínas de linfocitos, preferiblemente de células T, y

c)

son polipéptidos del estilo CTLA4-Ig.

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En una realización del primer aspecto de la invención, se proporciona un péptido el cual:

(i)

comprende la secuencia de aminoácido tal y como se cita en SEQ ID NO:2 y/o SEQ ID NO:4, y que actúa como un inhibidor de linfocitos T.

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Preferiblemente, el polipéptido de acuerdo con el primer aspecto de la invención se selecciona del grupo consistente en:

(i)

la secuencia de aminoácido tal y como se cita en SEQ ID NO:6;

(ii)

la secuencia de aminoácido tal y como se cita en SEQ ID NO:8;

(iii)

la secuencia de aminoácido tal y como se cita en SEQ ID NO:10;

(iv)

la secuencia de aminoácido tal y como se cita en SEQ ID NO:12;

(v)

la secuencia de aminoácido tal y como se cita en SEQ ID NO:14;

(vi)

la secuencia de aminoácido tal y como se cita en SEQ ID NO:16; o

(vii)

la secuencia de aminoácido tal y como se cita en SEQ ID NO:18.

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El polipéptido que tiene la secuencia citada en SEQ ID NO:6 es referido a partir de ahora como "polipéptido clonado INSP152-D1-SV1". El polipéptido que tiene la secuencia citada en SEQ ID NO:12 es referido a partir de ahora como "polipéptido extracelular INSP152-SV1". El polipéptido que tiene la secuencia citada en SEQ ID NO:18 es referido a partir de ahora como "polipéptido INSP152-SV1". El polipéptido que tiene la secuencia citada en SEQ ID NO:20 es referido a partir de ahora como "polipéptido de fragmento INSP152-D1". El polipéptido que tiene la secuencia citada en SEQ ID NO:22 es referido a partir de ahora como "polipéptido totalmente clonado INSP152-D1-SV1". El polipéptido que tiene la secuencia citada en SEQ ID NO:24 es referido a partir de ahora como "polipéptido extracelular INSP152". El polipéptido que tiene la secuencia citada en SEQ ID NO:26 es referido a partir de ahora como "polipéptido completo INSP152". El polipéptido que tiene la secuencia citada en SEQ ID NO:28 es referido a partir de ahora como "polipéptido completo INSP152-SV1".

Un polipéptido de acuerdo con el primer aspecto de la invención puede estar formado por un péptido señalizador y/o etiqueta de histidina. Preferiblemente, la etiqueta de histidina se encuentra en la terminal C del polipéptidos. Preferiblemente, la tarjeta de histidina está formada por 1-10 residuos de histidina (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos). Más preferiblemente, la tarjeta de histidina está formada pro 6 residuos de histidina. Aunque el Solicitante no desea basarse en esta teoría, se postula que los primeros 19 aminoácidos del polipéptido INSP152 forman un péptido señalizador.

La secuencia de polipéptido maduro con fragmento INSP152DI sin esta secuencia de señal postulada se cita en la SEQ ID NO: 2. La secuencia de polipéptido clonado INSP152-D1-SVI sin esta secuencia de señal postulada se cita en la SEQ ID NO: 4. La secuencia de polipéptido extracelular INSP152 sin esta secuencia de señal postulada se cita en la SEQ ID NO:8. La secuencia de polipéptido extracelular INSP152-SV1 sin esta secuencia de señal postulada se cita en la SEQ ID NO:10. La secuencia de polipéptido INSP152 sin esta secuencia de señal postulada se cita en la SEQ ID NO:14. La secuencia de polipéptido INSP152-SV1 sin esta secuencia de señal postulada se cita en la SEQ ID NO:16.

El polipéptido que tiene la secuencia citada en SEQ ID NO:2 es referido a partir de ahora como "polipéptido de fragmento maduro INSP152-D1". El polipéptido que tiene la secuencia citada en SEQ ID NO:4 es referido a partir de ahora como "polipéptido clonado maduro INSP152-D1-SV1". El polipéptido que tiene la secuencia citada en SEQ ID NO:8 es referido a partir de ahora como "polipéptido extracelular maduro INSP152". El polipéptido que tiene la secuencia citada en SEQ ID NO:10 es referido a partir de ahora como "polipéptido extracelular maduro INSP1 52-SV1". El polipéptido que tiene la secuencia citada en SEQ ID NO:14 es referido a partir de ahora como "polipéptido maduro INSP152". El polipéptido que tiene la secuencia citada en SEQ ID NO:16 es referido a partir de ahora como "polipéptido maduro INSP152-SV1".

El término "polipéptidos INSP152" tal y como aquí se emplea incluye polipéptidos que incluyen el polipéptido de fragmento maduro INSP152-D1, el polipéptido clonado maduro INSP152-D1-SVI, el polipéptido clonado INSP152-D1-SV1, el polipéptido extracelular maduro INSP152, el polipéptido extracelular maduro INSP152-SV1, el polipéptido extracelular INSP152-SV1, el polipéptido maduro INSP152, el polipéptido maduro INSP152-SV1, el polipéptido fragmento, el polipéptido INSP152-SV1, el polipéptido fragmento INSP152-D1, el polipéptido completo clonado INSP152-SVI, el polipéptido extracelular INSP152, el polipéptido completo INSP152 y el polipéptido completo INSP152-SV1.

El término "proteína que contiene dominio MAM" hace referencia a una molécula que contiene al menos un dominio MAM.

Preferiblemente, la "proteína que contiene un dominio MAM" puede ser una molécula que contiene un dominio MAM detectado con un valor e inferior a 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 0.0002, 0.00001, 0.000001 0 0.0000001.

Preferiblemente, un polipéptido de acuerdo con cualquiera de los aspectos arriba descritos de la invención funciona como un polipéptido que contiene dominio MAM y/o que contiene dominio LDL.

Por "funciona como una proteína que contiene el dominio MAM" hacemos referencia a los polipéptidos que están formados por una secuencia de aminoácido o características estructurales que pueden identificarse como características conservadas en el interior de los polipéptidos de la familia proteica que contiene el dominio MAM, como que la interacción del polipéptido con la proteasa se mantiene intacta. En particular, hacemos referencia a la presencia de residuos de cisteína en posiciones específicas en el interior del polipéptido que permite la formación de enlaces de disulfuro.

El llamado dominio MAM es un dominio de aproximadamente 170 aminoácidos que se ha reconocido en la región extracelular de proteínas funcionalmente diversas. Estas proteínas tienen una arquitectura modular y del tipo receptor que está constituida por un péptido señalizador, un dominio extracelular N-terminal, un dominio transmembránico sencillo y un dominio intracelular. Dichas proteínas incluyen meprina (una glicoproteína con superficie celular); antígeno A5 (una proteína con base celular desarrolladamente regulado); y fosfatasas proteicas de tirosina del tipo receptor. Se piensa que el dominio MAM tiene una función adhesiva. Contiene cuatro residuos de cisteína conservados, que probablemente forman puentes de disulfuro. Las mutaciones en el dominio MAM meprina afectan a las asociaciones no covalentes en el interior de los oligómeros de meprina. En moléculas del tipo p de fosfatasa tirosina receptora el dominio MAM es importante para interacciones hemofílicas célula-célula.

Las proteínas que contienen MAM incluyen

Meprina. Esta glicoproteína con superficie celular contiene un dominio zinc-metaloproteasa capaz de degradar una variedad de polipéptidos. La meprina está compuesta por dos subunidades estructuralmente relacionadas (alpha y beta) que forman horno- o heterotetrámeros por la asociación no covalente de dos dímeros unidos de disulfuro. En ambas subunidades, el dominio MAM está localizado después del dominio catalítico. El dominio MAM en meprina está incluido en la oligomerización.

Neuropilina (antígeno A5), una molécula de adhesión celular independiente del calcio que funciona durante la formación de circulitos neuronales. La secuencia contiene dos dominios CUB (2 dominios FA58C) y un dominio MAM.

Fosfatasas de proteína tirosina del estilo receptor Mu, Kappa y PCP-2 (EC 3.1.3.48). Estas PTPasas tienen una región celular que consiste en un dominio MAM seguido de un dominio del tipo lg y cuatro dominios de fibronectina-tipo III. La familia de PTPs consiste en PTPs solubles y del tipo receptor (RPTPS). La región extracelular de PTP\mu provoca la agregación célula-célula (el dominio MAM de PTP\mu es una molécula de enlace hemofílico de la región extracelular). El enlace hemofílico en el ectodominio de PTP_{K} y PTP\lambda sugieren en gran medida la participación de RPTPs en la transducción de señal a través del contacto célula a célula. El dominio MAM de PTP\mu tiene propiedades de enlace hemofílico a través de cuatro residuos de cisteína conservada que forman dos puentes de disulfuro intramolecular (interacciones PTP\mu cis (lateral)) (ver Cismaisu et al. J Biol Chem. 2004 279 (26):26922-31).

RPTPs han participado durante el desarrollo, en el crecimiento y guía de axón, resultado de neurita, como moléculas de adhesión celular (CAMs) y mediadores de adhesión celular, como señalización celular, en la selección y reconocimiento de objetivos a través de axón retinal, y diferenciación celular hematopoyética (ver Beltran y Bixby, Front Biosci. 2003 8:d87-99). CAMs participan en homeostasis, respuesta inmune, inflamación, axonogénesis, y embriogénesis. El deterioro de los resultados de CAM es el inicio de enfermedades tales como Pemphigus vulgaris, deficiencia -1 y -2 de adhesión de leucocitos, trombastemia de Glanzmann, arteriosclerosis, vasculopatía diabética y metástasis en cáncer.

Enteropeptidasa de vertebrado (EC 3.4.21.9), una proteína de membrana del tipo II del borde en cepillo intestinal, que activa el tripsinógeno. Consiste al menos en una cadena ligera catalítica y una cadena pesada con multidominio que tiene dominios receptores clase A 2 LDL, un dominio MAM, un dominio SRCR y un dominio CUB.

Glicoproteína endosomal apical de rata, una proteína probablemente participante de la clasificación y transporte selectivo de receptores y ligandos a través de epitelios polarizados. Esta proteína contiene 6 dominios MAM. La Figura 9 muestra la homología estructural entre INSP152 y la glicoproteína endosomal apical

Hormona tiroide xenopus laevis inducida por proteína B. Esta proteína contiene 4 dominios MAM. Una alineación de aminoácidos entre hormona tiroide xenopus lavéis provocada por proteína B e INSP152 se muestra en la Figura 2.

Zonadhesin de cerdo, una proteína que se enlaza de una manera específica a la especie a la zona pellucida del huevo.

Un polipéptido de acuerdo con la invención también puede funcionar como un polipéptido que contiene un dominio LDL. Por "funciona como una proteína que contiene el dominio LDL" nos referimos a los polipéptidos que están formados por secuencias de aminoácidos o características estructurales que pueden identificarse como características conservadas dentro de los polipéptidos de la familia proteica que contiene el dominio LDL, de tal modo que la interacción del polipéptido con sus compañeros proteicos biológicos se mantiene. En particular, nos referimos a la presencia de residuos de cisteína en posiciones específicas dentro del polipéptido que permiten la formación de enlaces de disulfuro.

La repetición rica en cisteína en el receptor de lipoproteína con baja densidad (LDL) juega un papel central en el metabolismo del colesterol en mamíferos. Las repeticiones del tipo A de la terminal N en el receptor LDL se enlazan con las lipoproteínas. Otros dominios homólogos ocurren en receptores relacionados, incluyendo el receptor de lipoproteína de muy baja densidad y receptor 2-macroglobulina proteína/alpha relacionado con el receptor LDL, y en proteínas con las que no se relacionan funcionalmente, como el componente C9 del complemento. Mutaciones en el gen receptor LDL provocan hipercolesterolemia familiar.

El dominio de clase A del receptor LDL contiene 6 cisteínas enlazadas con disulfuro y un grupo de aminoácidos negativamente cargados, de los cuales muchos se agrupan sobre una cara del módulo. Una representación esquemática de este dominio se muestra a continuación:

1

"C": cisteína conservada incluida en el enlace de disulfuro

"x": cualquier residuo.

En dominios de clase A de receptores LDL forman el punto de enlace para LDL y calcio. Los residuos ácidos entre la cuarta y la sexta cisteína son importantes para enlaces de elevada afinidad de secuencias con carga positiva en ligandos de LDLR. La repetición ha demostrado consistir en una estructura beta-horquilla seguida de una serie de giros beta. El enlace de calcio parece no inducir ningún cambio conformacional significativo.

Después de estas repeticiones se encuentra un dominio con 350 residuos que se parece a una parte del precursor del factor de crecimiento epidérmico (EFG) (que se ha identificado en INSP152, ver Figura 9).

Se han encontrado dominios similares en otras proteínas extracelulares y de la membrana que se enumeran a continuación:

Receptor de lipoproteína de muy baja densidad en vertebrados (VLDL), que se enlaza y transporta VLDL. Su dominio extracelular está compuesto por 8 dominios LDLRA, 3 dominios del tipo EGF y 6 dominios de clase B del receptor LDL (LDLRB).

Proteína 1 relacionada con el receptor de lipoproteína de muy baja densidad en vertebrados (LRP1), que puede actuar como un receptor para la endocitosis de ligandos extracelulares. LRP1 contiene 31 dominios LDLRA y 22 dominios del tipo EGF.

Proteína 2 relacionada con el receptor de lipoproteína de muy baja densidad en vertebrados (LRP2) (también conocida como gp330 o megalina). LRP2 contiene 36 dominios LDLRA y 17 dominios del tipo EGF.

Un homólogo de LRP de Caenorhabditis elegans, que contiene 35 dominios LDLRA y 17 dominios del tipo EGF.

Receptor de Drosophila putativa vitelogenina, con 13 copias de dominios LDLRA y 17 repeticiones del tipo EGF.

Factor complemento I, que es el responsable de la partición de cadenas alpha de C4b y C3b. Consiste en un dominio FIMAC (Factor I/MAC proteínas C6/C7), un dominio del estilo receptor rescatador, 2 copias de LDLRA y un dominio de serina proteasa en terminal C.

Componentes complementos C6, C7, C8 y C9. Cada uno contiene un dominio LDLRA.

Perlecano, un proteoglicano de heparán sulfato con membrana base y múltiples dominios compuesto por 4 dominios LDLRA, 3 dominios LamB, 12 dominios del tipo laminina EGF, 14-21 dominios del tipo IG, 3 dominios LamG, y 4 dominios del tipo EGF. Un proteoglicano similar pero más corto (UNC52) se encuentra en Caenorhabditis elegans que tiene 3 repeticiones de LDLRA.

Cadenas con conector de hemoglobina extracelular de invertebrado gigante, que permite a las cadenas que contienen heme construir hemoglobina gigante (1 dominio LDLRA).

Receptor GR1101 enganchado a la proteína G del caracol Lymnaea stagnalis, que puede directamente hace un proceso de conversión de señales transportadas por grandes proteínas extracelulares.

Enteroquinasa de vertebrados (EC 3.3.21.9), una proteína de membrana del tipo II del borde del cepillo intestinal, que activa el tripsinógeno. Consiste al menos en una cadena ligera catalítica y en una cadena pesada multidominio que tiene 2 dominios LDLRA, un dominio MAM, un dominio SRCR y un dominio CUB.

Proteína 1 de enfermedad autosómica dominante del hígado policístico en humanos (PKD1), que está incluida en interacciones adhesivas proteína-proteína y proteína-carbohidrato. El punto de enlace con calcio potencial de su único dominio LDLRA falta.

Proteína DGC2/IDD de membrana integral en vertebrados, un receptor de adhesión potencial con un dominio LDLRA, una lectina de tipo C y un dominio VWFC.

Nudel proteasa serina drosophila (EC 3.4.21.), que participa en la inducción de polaridad dorsoventral del embrión. Tiene 11 dominios LDLRA, 3 de los cuales no tienen el primer enlace de disulfuro (C1-C3).

Receptor del virus sarcoma rous subgrupo A aviar (1 copia de LDLRA).

Sco-Espondina bovina, que es segregada por el órgano subcomisural en embriones y tomar parte en la modulación de agregación neuronal. Contiene al menos 2 dominios del tipo EGF y 3 dominios del LDLRA.

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Preferiblemente, la actividad de un polipéptido de la presente invención puede confirmarse en al menos uno de los siguientes ensayos:

a)

en el modelo de ratón de enfermedad inflamatoria en el intestino provocada por dextrán sulfato sódico (DSS) tal y como se describe en Okayasu et al. Un nuevo método en inducción de colitis severa experimental y ulcerativa crónica en ratones. Gastroenterología 1990. Vol. 98, pgs. 694-702), o

b)

En los ensayos in vitro e in vivo así como modelos de animales de enfermedades inflamatorios del intestino tal y como lo estudiaron Boro y Gouma (Drug Discovery Today: Disease Models; Vol. 1, N°. 4, 2004, pgs. 437-443), o

c)

En modelos de lupus eritematoso isquémico tal y como lo estudiaron Rugby y Vyse (Drug Discovery Today: Disease Models; Vol. 1, N°. 4, 2004, pgs. 445-449), o

d)

En el ensayo humano MLR tal y como se describe en el Ejemplo 7.

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Un "determinante antigénico" de la presente invención puede ser una parte de un polipéptido de la presente invención, que se enlaza con un punto en combinación con el anticuerpo o con un receptor de célula T (TCR). De modo alternativo, un "determinante antigénico" puede ser un punto sobre la superficie de un polipéptido de la presente invención con el que una molécula con anticuerpo sencillo se enlaza. Generalmente, un antígeno tiene varios y muy diferentes determinantes antigénicos y reacciona con anticuerpos de muy diferentes características. Preferiblemente, el anticuerpo es inmunoespecífico a un polipéptido de la invención. Preferiblemente, el anticuerpo es inmunoespecífico a un polipéptido de la invención que no es parte de una proteína de fusión. Preferiblemente, el anticuerpo es inmunoespecífico a cualquiera de los polipéptidos INSP152 aquí descritos, como INSP152 o un fragmento del mismo. Los determinantes antigénicos normalmente consisten en grupos de moléculas con superficie químicamente activa, como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y pueden tener tres características estructurales dimensionales específicas, así como específicas características de carga. Preferiblemente, el "determinante antigénico" hace referencia a un grupo químico en particular sobre un polipéptido de la presente invención que es antigénico, es decir, que provoca una respuesta específica inmune.

Los polipéptidos Q5VYJ5_HUMAN y CAH71834 (AL354695) y sus secuencias codificadoras de ácido nucleico se excluyen específicamente del alcance de esta invención.

En un segundo aspecto, la invención proporciona una molécula purificada de ácido nucleico que codifica el polipéptido del primer aspecto de la invención.

El término "molécula purificada de ácido nucleico" preferiblemente hace referencia a una molécula de ácido nucleico de la invención que (1) ha sido separada de al menos el 50 por ciento de proteínas, lípidos, carbohidratos, u otros materiales con los que se encuentra de manera natural cuando el ácido nucleido se aísla de las células fuente, (2) no está unida a todo o parte de un polinucleótido con el cual "la molécula purificada de ácido nucleido" se une por naturaleza, (3) se une de manera operativa con un polinucleótido con el que n o está unido por naturaleza, o (4) no ocurre en la naturaleza como parte de una secuencia de un polinucleótido más grande. Preferiblemente, la molécula aislada de ácido nucleico de la presente invención se encuentra sustancialmente libre de otras moléculas contaminantes de ácido nucleido u otros contaminantes que se encuentran en su ambiente natural que podrían interferir en su uso en la producción de polipéptidos o su uso terapéutico, diagnóstico, profiláctico o en investigación. En una realización preferente, el ADN genómico se excluye específicamente del alcance de la invención. Preferiblemente, ADN genómico más grande de 10 kbp (pares kilobase), 50 kbp, 100 kbp, 150 kbp, 200 kbp, 250 kbp o 300 kbp se excluyen específicamente del alcance de la invención. Preferiblemente, la "molécula purificada de ácido nucleico" solamente consiste en cADN.

Preferiblemente, la molécula purificada de ácido nucleico está formada por la secuencia de ácido nucleico como la citada en SEQ ID NO:1 (codificadora de la secuencia de polinucleótido con fragmento maduro INSP152-D1), SEQ ID NO:3 (codificadora de la secuencia de polinucleótido clonado maduro INSP152-D1-SV1), SEQ ID NO:5 (codificadora de la secuencia de polinucleótido clonado INSP152-Dl-SV1), SEQ ID NO:7 (codificadora de la secuencia de polinucleótido extracelular maduro INSP152), SEQ ID NO:9 (codificadora de la secuencia de polinucleótido extracelular maduro INSP152-SV1), SEQ ID NO:11 (codificadora de la secuencia de polinucleótido extracelular INSP152-SV1), SEQ ID NO:13 (codificadora de la secuencia de polinucleótido maduro INSP152), SEQ ID NO:15 (codificadora de la secuencia de polinucleótido r maduro INSP152-SV1), SEQ ID NO:17 (codificadora de la secuencia de polinucleótido INSP152-SV1), SEQ ID NO:19 (codificadora de la secuencia de polinucleótido con fragmento INSP152-D1), SEQ ID NO:21 (codificadora de la secuencia de polinucleótido clonado INSP152-D1-SV1), SEQ ID NO:23 (codificadora de la secuencia de polinucleótido extracelular INSP152), SEQ ID NO:25 (codificadora de la secuencia de polinucleótido completa INSP152), SEQ ID NO:27 (codificadora de la secuencia de polinucleótido completa INSP152-SV1).

La invención proporciona además la molécula purificada de ácido nucleico que consiste en la citada en SEQ ID NO:1 (codificadora de la secuencia de polinucleótido con fragmento maduro INSP152-D1), SEQ ID NO:3 (codificadora de la secuencia de polinucleótido clonado maduro INSP152-D1-SV1), SEQ ID NO:5 (codificadora de la secuencia de polinucleótido clonado INSP152-D1-SV1), SEQ ID NO:7 (codificadora de la secuencia de polinucleótido extracelular maduro INSP152), SEQ ID NO:9 (codificadora de la secuencia de polinucleótido extracelular maduro INSP152-SV1), SEQ ID NO:11 (codificadora de la secuencia de polinucleótido extracelular INSP152-SV1), SEQ ID NO:13 (codificadora de la secuencia de polinucleótido maduro INSP152), SEQ ID NO:15 (codificadora de la secuencia de polinucleótido r maduro INSP152-SV1), SEQ ID NO:17 (codificadora de la secuencia de polinucleótido INSP152-SV1), SEQ ID NO:19 (codificadora de la secuencia de polinucleótido con fragmento INSP152-D1), SEQ ID NO:21 (codificadora de la secuencia de polinucleótido clonado INSP152-D1-SV1), SEQ ID NO:23 (codificadora de la secuencia de polinucleótido extracelular INSP152), SEQ ID NO:25 (codificadora de la secuencia de polinucleótido completa INSP152), SEQ ID NO:27 (codificadora de la secuencia de polinucleótido completa INSP152-SV1).

En un tercer aspecto, la descripción proporciona una molécula purificada de ácido nucleico que hibridiza bajo condiciones de elevado rigor con una molécula de ácido nucleico del segundo aspecto de la invención. Las condiciones de hibridización con elevado rigor son definidas como incubación durante la noche a una temperatura de 42°C en una solución formada por 50% formadida, 5XSSC (150 mM NaCl, 15 mM citrato de trisodio), 50 mM fosfato sódico (pH 7.6), 5x solución Denhardts, 10% sulfato dextrano, y 20 microgramo/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, seguido de un lavado de filtros en 0.1X SSC a aproximadamente 65°C.

En un cuarto aspecto, la invención proporciona un vector, como un vector de expresión, que contiene una molécula de ácido nucleico del segundo o tercer aspecto de la invención.

En un quinto aspecto, la invención proporciona una célula huésped aislada transformada con un vector del cuarto aspecto de la invención.

En un sexto aspecto, la invención proporciona una ligando que se enlaza específicamente con los miembros proteicos de la familia de proteína que contiene el dominio MAM del primer aspecto de la invención, que es un anticuerpo. Preferiblemente, el ligando inhibe la función de un polipéptido del primer aspecto de la invención que es una proteína que es una proteína que contiene el dominio MAM.

Es importante el hecho de que la función de los polipéptidos INSP152 permite el diseño de métodos de análisis capaces de identificar compuestos que sean efectivos en el tratamiento y/o diagnóstico de enfermedades. Los ligandos de acuerdo con el sexto aspecto de la invención pueden identificarse empleando tales métodos. Estos métodos son incluidos como aspectos de la presente invención.

Otro aspecto de esta invención reside en el uso de un gen INSP152 o polipéptido como un objetivo para el análisis de candidatos moduladores de fármacos.

Otro aspecto adicional de la invención reside en métodos de análisis de compuestos para terapia, que consisten en la determinación de la habilidad de un compuesto para enlazarse con un gen o polipéptido INSP152.

Otro aspecto adicional de esta invención reside en métodos de análisis de compuestos para terapia, que consisten en la comprobación de la modulación de la actividad de un gen o polipéptido INSP152.

En un séptimo aspecto, la invención proporciona un polipéptido del primer aspecto de la invención, o una molécula de ácido nucleido del segundo o tercer aspecto de la invención, o un vector del cuarto aspecto de la invención, o una célula huésped del quinto aspecto de la invención, o un ligando del sexto aspecto de la invención, par uso en terapia o diagnóstico de enfermedades. Dichas enfermedades pueden incluir enfermedad intestinal inflamatoria, artritis, soriasis, rechazo a transplante de órganos y enfermedad de Crohn. Estas moléculas también pueden usarse en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tales enfermedades.

Más en particular, enfermedades en la que están implicadas proteínas que contiene el dominio MAM seleccionadas a partir de enfermedad de Crohn, enfermedad intestinal inflamatoria, lupus. Tal y como aquí se describe, los resultados de un análisis Taqman muestran la expresión restringida inesperada de INSP152 en el intestino delgado (ver Tabla 5 y Figura 10), en una muestra de lupus (ver Tabla 6 y Figura 11), en las muestras de biopsia de enfermedad de Crohn 12/22 (ver Tabla 7 y Figura 12). Este patrón específico de expresión lleva a la conclusión de la participación de INSP152, en particular INSP152-D1-V1, en enfermedades en el intestino delgado, incluyendo enfermedad de Crohn, enfermedad intestinal inflamatoria, lupus. Estas sorprendentes propiedades que caracterizan los polinucleótidos o los polipéptidos correspondientes de la presente invención los hacen particularmente adecuados para la preparación de un fármaco o una composición farmacéutica. Los polinucleótidos o los polipéptidos correspondientes de la presente invención muestran por lo tanto el hallazgo inesperado de una expresión restringida en tejidos específicos.

Resultados adicionales (ver Figura 13) muestran sorprendentemente que el polipéptido INSP152-D1-V1 es un potente inhibidor de linfocitos, preferiblemente células T. Por consiguiente, inferimos que los polipéptidos de acuerdo con la presente invención, y en particular INSP152-D1-V1, son útiles para el tratamiento de enfermedades relacionadas con CTLA4-Ig. Dichos polipéptidos son útiles solos, como un componente de proteínas de fusión como fusión Fc, y/o en combinación con otro agente.

Los polipéptidos de la presente invención, y en particular INSP152-D1-V1, son también útiles en injertos contra enfermedad huésped o en el bloqueo de injerto alogénico y xenoinjerto.

En un octavo aspecto, la invención proporciona un método de diagnóstico de una enfermedad en un paciente, que consiste en analizar el nivel de expresión de un gen natural codificador de un polipéptido del primer aspecto de la invención o la actividad de un polipéptido del primer aspecto de la invención en tejido de dicho paciente y comparar dicho nivel de expresión o actividad con un nivel control, donde un nivel que es diferente a dicho nivel control es indicador de enfermedad. Tal método de diagnóstico se llevará a cabo preferentemente in vitro. Pueden usarse métodos similares para controlar el tratamiento terapéutico de enfermedad en el paciente, donde la alteración del nivel de expresión o actividad de un polipéptido o molécula de ácido nucleico durante un periodo de tiempo hacia un nivel control es indicador de regresión de enfermedad.

Un método preferente para la detección de polipéptidos del primer aspecto de la invención consiste en los siguientes pasos: (a) contactar un ligando, como un anticuerpo, del sexto aspecto de la invención con una muestra biológica bajo condiciones adecuadas para la formación de un complejo ligando-polipéptido; y (b) detectar dicho complejo.

Existen un número de diferentes métodos de acuerdo con el octavo aspecto de la invención, tal y como el lector especializado en la técnica apreciará, como métodos de hibridización de ácido nucleico con sondas cortas, análisis de mutación punta, amplificación de reacción en cadena de polimerasa (PCR) y métodos que usan anticuerpos para detectar niveles anómalos de proteínas. Pueden usarse métodos similares durante un corto o largo plazo para permitir el control del tratamiento terapéutico de la enfermedad en un paciente. La invención también proporciona kits que son útiles en estos métodos de diagnóstico de enfermedades.

En un noveno aspecto, la invención proporciona el uso de un polipéptido del primer aspecto de la invención como una proteína que contiene el dominio MAM.

En un décimo aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que incluye un polipéptido del primer aspecto de la invención, o una molécula de ácido nucleico del segundo o tercer aspecto de la invención, o un vector del cuarto aspecto de la invención, o una célula huésped del quinto aspecto de la invención, o un ligando del sexto aspecto de la invención, junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

En un undécimo aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido del primer aspecto de la invención, o una molécula de ácido nucleico del segundo o tercer aspecto de la invención, o un vector del cuarto aspecto de la invención, o una célula huésped del quinto aspecto de la invención, o un ligando del sexto aspecto de la invención, para uso en la fabricación de un medicamento para diagnosticar o tratar una enfermedad, que incluye enfermedad intestinal inflamatoria, artritis, soriasis, rechazo a transplante de órganos y enfermedad de Crohn.

En un duodécimo aspecto, la invención proporciona un método para tratar una enfermedad en un paciente que consiste en la administración al paciente de un polipéptido del primer aspecto de la invención, o una molécula de ácido nucleico del segundo o tercer aspecto de la invención, o un vector del cuarto aspecto de la invención, o una célula huésped del quinto aspecto de la invención, o un ligando del sexto aspecto de la invención.

Para enfermedades en las que la expresión de un gen natural codificador de un polipéptido del primer aspecto de la invención, o en el que la actividad de un polipéptido del primer aspecto de la invención, es inferior en un paciente enfermo cuando se compara con el nivel de expresión o actividad en un paciente sano, el polipéptido, molécula de ácido nucleico, ligando o compuesto administrado al paciente deberían ser un agonista. Sin embargo, para enfermedades en las que la expresión del gen natural o la actividad del polipéptido es superior en un paciente enfermo cuando se compara con el nivel de expresión o actividad en un paciente sano, el polipéptido, molécula de ácido nucleico o ligando administrado al paciente deberían ser un antagonista. Ejemplos de tales antagonistas incluyen moléculas de ácido nucleico antisentido, ribozimas y ligandos, como anticuerpos.

Los polipéptidos INSP152 son proteínas que contiene el dominio MAM y por lo tanto juegan papeles en muchos estados enfermos. Los antagonistas de los polipéptidos INSP152 son de particular interés ya que proporcionan un modo de modular estos estados enfermos.

En un decimotercero aspecto, la invención proporciona animales transgénicos o animales no humanos knock-out que se han transformado para expresar niveles más altos, más bajos o niveles ausentes de un polipéptido del primer aspecto de la invención. Tales animales transgénicos son modelos muy útiles para el estudio de enfermedades y también pueden usarse en regímenes de análisis en la identificación de compuestos que sean efectivos en el tratamiento o diagnóstico de tal enfermedad.

Tal y como aquí se emplea, "equivalente funcional" hace referencia a una proteína o molécula de ácido nucleico que posee características funcionales o estructurales que son sustancialmente similares a las de un polipéptido o molécula de ácido nucleico de la presente invención. Un equivalente funcional de una proteína puede contener modificaciones dependiendo de la necesidad de dichas modificaciones para la actuación de una función específica. El término "equivalente funcional" pretende incluir fragmentos, mutantes, híbridos, variantes, análogos, o derivados químicos de una molécula.

Preferiblemente, el "equivalente funcional" puede ser una proteína o una molécula de ácido nucleico que muestra una o más actividades funcionales de los polipéptidos de la presente invención.

Preferiblemente, el "equivalente funcional" puede ser una proteína o una molécula de ácido nucleico que sustancialmente muestra una actividad similar en comparación con INSP152 o fragmentos del mismo en un ensayo adecuado para la medición de actividad biológica o función. Preferiblemente, el "equivalente funcional" puede ser una proteína o una molécula de ácido nucleico que muestra una actividad idéntica o superior en comparación con INSP152 o fragmentos del mismo en un ensayo adecuado para la medición de actividad biológica o función. Preferiblemente, el "equivalente funcional" puede ser una proteína o una molécula de ácido nucleico que muestra 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% o más actividad en comparación con INSP152 o fragmentos del mismo en un ensayo adecuado para la medición de actividad biológica o función.

Preferiblemente, el "equivalente funcional" puede ser una proteína o polipéptido capaz de mostrar una actividad sustancialmente similar in vivo o in vitro como los polipéptidos de la invención. Preferiblemente, el "equivalente funcional" puede ser una proteína o polipéptido capaz de interactuar con otras moléculas celulares o extracelulares de un modo sustancialmente similar al modo con el que la parte correspondiente de los polipéptidos de la invención lo haría. Por ejemplo, un "equivalente funcional" sería capaz, en un inmunoensayo, de reducir o disminuir el enlace de un anticuerpo con el péptido correspondiente (es decir, el péptido cuya secuencia de aminoácido se modificó para conseguir el "equivalente funcional") del polipéptido de la invención, o con el polipéptido de la propia invención, donde el anticuerpo fue ascendido contra el péptido correspondiente del polipéptido de la invención. Una concentración equimolar del equivalente funcional disminuirá el enlace del péptido correspondiente al menos aproximadamente 15%, preferiblemente entre 5% y 10%, más preferiblemente entre aproximadamente 10% y 25%, incluso más preferentemente entre aproximadamente 25% y 50%, y más preferentemente entre aproximadamente 40% y 50%.

Por ejemplo, los equivalentes funcionales pueden ser completamente funcionales o pueden no tener función en una o más actividades. Por consiguiente, en la presente invención, variaciones puede afectar la función, por ejemplo, de las actividades del polipéptido que refleja su posesión de un dominio MAM.

Un resumen de técnicas y procedimientos estándar que pueden emplearse con el fin de utilizar en esta invención se da a continuación. Se entenderá que esta invención no está limitada a la metodología, protocolos, líneas celulares, vectores y reagentes particulares aquí descritos. También se entenderá que la terminología aquí empleada tiene el fin de describir solamente realizaciones particulares y no se pretende que esta terminología se limite al alcance de la presente invención. La extensión de la invención solamente está limitada por lo términos de las reivindicaciones adjuntas.

En esta descripción se utilizan abreviaturas estándar para nucleótidos y aminoácidos.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, tecnología de ADN recombinante e inmunología, que pertenecen al conocimiento de aquellos expertos en la técnica.

Tales técnicas se explican con detalle en la siguiente bibliografía. Ejemplos de textos particularmente adecuados para consulta incluyen los siguientes: Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especialmente vols. 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayor and Walker, eds. 1987, Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer Verlag, N.Y.); and Handbook of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D.M. Weir and C. C. Blackwell eds. 1986).

Tal y como aquí se emplea, el término "polipéptido" incluye cualquier péptido o proteína formada pro dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces de péptido o enlaces de péptido modificado, es decir, isósteros de péptido. Este término hace referencia tanto a cadenas cortas (péptidos y oligopéptidos) como a cadenas largas (proteínas).

El polipéptido de la presente invención puede tener la forma de una proteína madura o puede ser pre-, pro- o prepro- proteína que puede activarse por división de pre-, pro- o prepro- porción para producir un polipéptido maduro activo. En tales polipéptidos, la pre-, pro- o prepro- secuencia puede ser una secuencia líder o segregadora o puede ser una secuencia que se emplea para purificación de al secuencia de polipéptido maduro.

El polipéptido del primer aspecto de la invención puede formar parte de una proteína de fusión. Por ejemplo, a menudo es ventajoso incluir una o más secuencias adicionales de aminoácido que pueden contener secuencia líderes o segregadoras, pro- secuencias, secuencias que ayudan en la purificación, o secuencias que confieren mayor estabilidad proteica, por ejemplo durante la producción recombinante. De manera alternativa o adicional, el polipéptido maduro puede fusionarse con otro compuesto, como un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido (por ejemplo, glicol de polietileno).

Estas proteínas de fusión pueden obtenerse clonando un polinucleótido codificador de un polipéptido en correspondencia con las secuencias codificadoras para una secuencia de proteína heteróloga. Una proteína de fusión preferida de acuerdo con la invención comprende INSP152-D1-SV1. INSP152-D1-SV1 es útil por sí misma, como un componente de proteínas de fusión como fusión Fc, y/o en combinación con otro agente.

El término "heterólogo", cuando se usa aquí, pretende designar cualquier polipéptido diferente a un polipéptido humano INSP152.

Ejemplos de secuencias heterólogas, que pueden estar incluidas en las proteínas de fusión solubles bien en la terminal N o en la C, son las siguientes: dominios extracelulares de proteína enlazada a la membrana, regiones constantes de inmunoglobulina (región Fc), dominios de multimerización, dominios de proteínas extracelulares, secuencias de señal, secuencias de exportación, o secuencias que permiten la purificación por cromatografía de afinidad.

Muchas de estas secuencias heterólogas se encuentran disponibles en el mercado en plásmidos de expresión ya que estas secuencias se incluyen de modo común en las proteínas de fusión con el fin de proporcionar proteínas adicionales sin perjudicar la actividad biológica específica de la proteína con la que se fusionan (Terpe K, 2003. Appl Microbiol Biotechnol, 60: 52-33). Ejemplos de tales propiedades adicionales son una vida media más larga en fluidos corporales, la localización extracelular, o una procedimiento más sencillo de purificación tal y como lo permite el estiramiento de histidinas que forman la llamada "etiqueta histidina" (Gentz et al., 1989 Proc Natl Sci USA, 86: 821-4) o por la etiqueta "HA", un epítope derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson et al, 1994 Cell, 37: 767-78). Si es necesario, la secuencia heteróloga puede eliminarse por una división proteolítica, por ejemplo, insertando un punto de división proteolítica entre la proteína y la secuencia heteróloga, y exponiendo la proteína de fusión purificada a la proteasa apropiada. Estas características son de particular importancia para las proteínas de fusión ya que facilitan su producción y uso en la preparación de composiciones farmacéuticas. Cuando la proteína de fusión está formada por una región de inmunoglobulina, la fusión puede ser directa, o por medio de un péptido enlazador corto que puede ser tan corto como de 1 a 3 residuos de aminoácidos en longitud o más largo, por ejemplo, 13 residuos de aminoácido en longitud. Dicho enlace puede ser un tripéptido de la secuencia E-F-M (Glu-Phe-Met), por ejemplo, o una secuencia enlace de 13 aminoácidos formada por Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met (SEQ ID NO: 29) introducida entre la secuencia de sustancias de la invención y la secuencia de inmunoglobulina. La proteína de fusión resultante tiene propiedades mejoradas, como un mayor tiempo de resistencia en fluidos corporales (vida media), mayor actividad específica, mayor nivel de expresión, o se facilita la purificación de la proteína de fusión.

En una realización preferente, la proteína se fusiona con la región constante de una molécula Ig. Preferiblemente, se fusiona con las regiones de cadena pesada como dominios CH2 y CH3 de IgG1 humano, por ejemplo. Otras isoformas de moléculas Ig son también adecuadas para la generación de proteínas de fusión de acuerdo con la presente invención, como isoformas IgG2 o IgG4, u otras clases Ig, como IgM o IgA, por ejemplo. Las partículas moleculares que poseen actividad ADCC son normalmente del isotipo IgG1 o IgG3. Las proteínas de fusión pueden ser monoméricas o multiméricas, hetero- o homonuméricas.

En una realización adicional preferente, el derivado funcional está formado por al menos un radical unido a uno o más grupos funcionales, que aparecen como una o más cadenas laterales sobre los residuos de aminoácidos. Preferiblemente, el radical es un radical de polietileno (PEG). La pegilación puede llevarse a cabo por medio de métodos conocidos, como los descritos en WO99/55377, por ejemplo.

Los polipéptidos pueden contener aminoácidos diferentes a los 20 aminoácidos codificados por el gen, modificados bien por procesos naturales, como por procesos post-translacionales o por técnicas de modificaciones químicas que son bien conocidas en la técnica. Entre las modificaciones conocidas que pueden presentarse de manera común en los polipéptidos de la presente invención se encuentra la glicosilación, unión lípida, sulfación, carboxilación gamma, para el caso de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ribosilación ADP. Otras modificaciones potenciales incluyen acetilación, acilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de radical haeme, unión covalente de nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, enlace cruzado, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, formación de ancla GPI, yodinación, mutilación, miristoilación, oxidación, proceso proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, adición mediada por transferencia de ARN de aminoácidos a proteínas como arginilación y ubiquitina-
ción.

Las modificaciones pueden aparecer en cualquier sitio en un polipéptido, incluyendo el eje del péptido, las cadenas laterales de aminoácido y los terminales de amino o carboxilo. De hecho, el bloqueo de la terminal amino o carboxilo en un polipéptido, o ambos, por una modificación covalente es común en polipéptidos que aparecen de manera natural o polipéptidos sintéticos y tales modificaciones pueden estar presentes en polipéptidos de la presente invención.

Las modificaciones que ocurren en un polipéptido a menudo serán una función de cómo el polipéptido está hecho. Para polipéptidos que están hechos de manera recombinante, la naturaleza y extensión de las modificaciones en gran parte será determinada por la capacidad de modificación post-translacional de la célula huésped en particular y las señales de modificación que se encuentran presentes en la secuencia de aminoácido del polipéptido en cuestión. Por ejemplo, los patrones de glicosilación varían entre diferentes tipos de célula huésped.

Los polipéptidos de la presente invención pueden prepararse de cualquier modo adecuado. Tales polipéptidos incluyen polipéptidos aislados que aparecen de manera natural (por ejemplo purificados del cultivo celular), polipéptidos producidos de manera recombinante (incluyendo proteínas de fusión), polipéptidos producidos sintéticamente o polipéptidos que se producen por una combinación de estos métodos.

Los polipéptidos de la presente invención o sus fragmentos inmunogénicos (que están formados al menos por un determinante antigénico) pueden usarse para generar ligandos, como anticuerpos policlonales o monoclonales, que son inmunoespecíficos para los polipéptidos. Tales anticuerpos pueden emplearse para aislar o para identificar clones que expresan los polipéptidos de la invención o para purificar los polipéptidos por cromatografía de afinidad. Los anticuerpos también pueden emplearse como ayudas de diagnóstico o terapia, entre otras aplicaciones, como resultará aparente para aquellos lectores expertos.

El término "inmunoespecífico" significa que los anticuerpos tienen afinidad sustancialmente mayor para los polipéptidos de la invención que para otros polipéptidos relacionados en la técnica anterior. Tal y como aquí se emplea, el término "anticuerpo" hace referencia a moléculas intacta así como a fragmentos de las mismas, como Fab, F(ab')2 y Fv, que son capaces de enlazarse con el determinante antigénico en cuestión. Por lo tanto, tales anticuerpos se enlazan con los polipéptidos del primer aspecto de la invención.

Por "afinidad sustancialmente mayor" queremos decir que es un aumento apreciable en la afinidad para un polipéptido de la invención en comparación con la afinidad para proteínas segregadas conocidas.

Preferiblemente, la afinidad es al menos 1.5-veces, 2-veces, 5- veces, 10- veces, 100- veces, 10^{3}- veces, 10^{4}- veces, 10^{5}- veces, 10^{6}- veces o mayor para un polipéptido de la invención en comparación con las proteínas segregadas conocidas como las proteínas que contienen el dominio MAM.

Preferiblemente, existe un aumento apreciable en la afinidad para un polipéptido de la invención en comparación con las proteínas conocidas que contienen el dominio MAM.

Si se desean anticuerpos policlonales, un mamífero seleccionado, como un ratón, conejo, cabra o caballo, puede inmunizarse con un polipéptido del primer aspecto de la invención. El polipéptido usado para inmunizar el animal puede derivarse de tecnología de ADN recombinante o puede sintetizarse químicamente. Si se desea, el polipéptido puede estar conjugado con una proteína portadora. Los portadores comúnmente empleados con los que los polipéptidos se unen químicamente incluyen albúmina de suero bovino, tiroglobulina y hemocianina de lapa. A continuación, el polipéptido se usa para inmunizar el animal. Se recoge el suero del animal inmunizado y se trata de acuerdo con los procedimientos conocidos, por ejemplo, con cromatografía de inmunoafinidad.

Los anticuerpos monoclonales de los polipéptidos del primer aspecto de la invención también pueden producirse fácilmente por un especializado en la técnica. La metodología general para hacer anticuerpos monoclonales usando tecnología hibridoma es bien conocida (ver, por ejemplo, Kohler, G. y Milstein, C. Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., 77-96 en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985).

Los paneles de anticuerpos monoclonales producidos contra los polipéptidos del primer aspecto de la invención pueden analizarse para varias propiedades, es decir, isotipo, epítope, afinidad, etc.

Los anticuerpos monoclonales son particularmente útiles en la purificación de los polipéptidos individuales contra los que están dirigidos. De modo alternativo, los genes que codifican los anticuerpos monoclonales de interés pueden aislarse de hibridomas, por ejemplo por medio de técnicas PCR conocidas en el campo, y clonarse y expresarse en los vectores apropiados.

Los anticuerpos quiméricos, en los que las regiones variables no humanas se unen o fusionan con las regiones humanas constantes (ver, por ejemplo, Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3439 (1987)), también pueden utilizarse.

El anticuerpo puede modificarse para hacerlo menos inmunogénico en un individuo, por ejemplo, por humanización. (ver Jones et al., Nature, 321, 522 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239, 1534 (1988); Kabat et al., J. Immunol., 147, 1709 (1991); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci: USA, 86, 10029 (1989); Gorman et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88, 34181 (1991); and Hodgson et al., Bio/Technology, 9, 421 (1991)). El término "anticuerpo humanizado", tal y como aquí se emplea, hace referencia a moléculas de anticuerpo en las que los aminoácidos CDR y otros aminoácidos seleccionados en los dominios variables de las cadenas ligeras y/o pesadas de un donante no humano han sido sustituidas en el lugar de los aminoácidos equivalentes en el anticuerpo humano. El anticuerpo humanizado por lo tanto se parece al anticuerpo humano pero tiene la habilidad de enlace del anticuerpo donante.

En una alternativa adicional, el anticuerpo puede ser un anticuerpo "biespecífico", es decir, un anticuerpo que tiene dos dominios diferentes de enlace con antígeno, estando cada uno de los dominios dirigido a un epítope diferente.

La tecnología de exposición de bacteriófagos puede utilizarse para seleccionar genes que codifican anticuerpos con actividades de enlace hacia polipéptidos de la invención bien a partir de genes V amplificados por PCR de linfocitos de humanos analizados para la posesión de anticuerpos relevantes, o de bibliotecas simples (McCafferty, J. et al., (1990), Nature 348, 552-554; Marks, J. et al., (1992) Biotechnology 10, 779-783). La afinidad de estos anticuerpos puede también mejorarse a través del cambio de cadena (Clackson et al., (1991) Nature 352, 624-628).

Los anticuerpos generados pro las técnicas mencionadas, ya sean policlonales o monoclonales, tienen una utilidad adicional ya que pueden emplearse como reagentes in inmunoensayos, radioinmunoensayos (RIA) o ensayos inmunoabsorbentes relacionados con enzimas (ELISA). En estas aplicaciones, los anticuerpos pueden etiquetarse con un reagentes analíticamente detectables como un radioisótopo, una molécula fluorescente o una enzima.

Las moléculas de ácido nucleico preferentes del segundo y tercer aspecto de la invención son aquellas que codifican una secuencia de polipéptido tal y como se cita en: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:28. Estas moléculas de ácido nucleico pueden usarse en los métodos y aplicaciones aquí descritas.

Las moléculas de ácido nucleido de la invención también incluyen secuencias que son moléculas de ácido nucleico complementarias a las aquí descritas (pro ejemplo, para fines de antisentido o sondas).

Las moléculas de ácido nucleido de la presente invención pueden tener la forma de ARN, como mARN, o en la forma de ADN, incluyendo, por ejemplo cADN, ADN sintético o ADN genómico. Tales moléculas de ácido nucleico pueden obtenerse por donación, por técnicas sintéticas químicas o por combinación de las mismas. Las moléculas de ácido nucleido pueden prepararse, por ejemplo, por síntesis química usando técnicas como síntesis química de fosforamidita en fase sólida, de bibliotecas genómicas o cADN o por separación de un organismo. Las moléculas ARN pueden generarse de modo general por transcripción in vitro o in vivo de secuencias de ADN.

Las moléculas de ácido nucleido pueden ser de cadena doble o cadena sencilla. El ADN de cadena sencilla puede ser la cadena codificadora, también conocida como la cadena del sentido, o puede ser la cadena no codificadora, también referida como cadena anti-sentido.

El término "molécula de ácido nucleico" también incluye análogos de ADN y ARN, como aquellos que contienen ejes modificados, y ácidos nucleicos péptidos (PNA). El término "molécula de ácido nucleico" también incluye análogos de ADN y ARN, como aquellas que contienen ejes modificados, y ácidos nucleicos péptidos (PNA). El término "PNA", tal y como aquí se usa, hace referencia a una molécula antisentido o un agente anti-gen que está formado por un oligonucleótido de al menos cinco nucleótidos de longitud unido a una eje de péptido de residuos de aminoácidos, que preferiblemente acaba en lisina. La lisina terminal confiere solubilidad a la composición. PNAs pueden ser pegilados para extender su periodo de vida en una célula, donde se enlazan preferentemente y complementariamente con ADN y ARN de cadena sencilla y frenan el alargamiento de transcripción (Nielsen, P.E. et al. (1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63).

Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de esta invención puede ser idéntica a la secuencia codificadora de una o más moléculas de ácido nucleico aquí descritas.

Estas moléculas también pueden tener una secuencia diferente que, como resultado de la degeneración del código genético, codifica un polipéptido SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:28. Estas moléculas de ácido nucleico pueden incluir, aunque no se limitan a, la secuencia codificadora para el polipéptido maduro por sí mismo; la secuencia codificadora para el polipéptido maduro y secuencias codificadoras adicionales, como aquellas que codifican una secuencia líder o segregadoras, como una secuencia de pro-, pre-, o prepro- polipéptido; la secuencia codificadora del polipéptido maduro, con o sin las secuencias codificadoras adicionales anteriormente mencionadas, junto con secuencias no codificadoras adicionales, incluyendo las secuencias 5' y 3' no codificadoras, como las secuencias transcritas y no traducidas que juegan un papel en la transcripción (incluyendo señales de terminación), enlace de ribosoma y estabilidad de mARN. Las moléculas de ácido nucleico también pueden incluir secuencias adicionales que codifican aminoácidos adicionales, como aquellos que proporcionan funcionalidades adicionales.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención también pueden fabricarse, usando métodos generalmente conocidos en la técnica, por una variedad de razones, incluyendo la modificación de la clonación, el proceso y/o expresión del producto gen (el polipéptido). La mezcla de ADN por fragmentación al azar y reensamblaje de fragmentos de gen y oligonucleótidos sintéticos se incluyen como técnicas que pueden usarse para producir secuencias de nucleótidos. La mutagénesis dirigida al punto puede usarse para insertar nuevos puntos de restricción, alterar los patrones de glicosilación, cambiar la preferencia de codones, producir variantes de empalmes, introducir mutaciones y demás.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido del primer aspecto de la invención pueden estar ligadas a una secuencia heteróloga para que la molécula de ácido nucleico combinada codifique una proteína de fusión. Las moléculas de ácido nucleico combinadas se incluyen en el segundo o tercer aspecto de la invención. Por ejemplo, para analizar bibliotecas de péptidos en busca de inhibidores de la actividad del polipéptido, puede ser útil expresar, usando una molécula de ácido nucleico combinada, una proteína de fusión que puede reconocerse por un anticuerpo disponible en el mercado. Una proteína de fusión puede también producirse para contener un punto de división localizado entre la secuencia del polipéptido de la invención y la secuencia de una proteína heteróloga de modo que el polipéptido puede dividirse y purificarse de la proteína heteróloga.

Las moléculas de ácido nucleico también incluyen moléculas antisentido que son parcialmente complementarias a las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de la presente invención y que por lo tanto hibridizan las moléculas de ácido nucleico codificadoras (hibridización). Tales moléculas antisentido, como oligonucleótidos, pueden diseñarse para reconocer, enlazarse específicamente y prevenir la transcripción de un ácido nucleico objetivo codificador de un polipéptido de la invención, tal y como lo conocerán aquellos expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Cohen, J.S., Trends in Pharm. Sci., 10, 435 (1989), Okano, J. Neurochem. 56, 560 (1991); O'Connor, J. Neurochem 56, 560 (1991); Lee et al., Nucleic Acids Res 6,3073 (1979); Cooney et al., Science 241, 456 (1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1991).

El término "hibridización" tal y como aquí se emplea hace referencia a la asociación de dos moléculas de ácido nucleico entre sí por medio de un enlace de hidrógeno. Normalmente, una molécula se fijará a un soporte sólido y la otra quedará libre en la solución. Entonces, las dos moléculas pueden colocarse en contacto una con la otra bajo condiciones que favorecen el enlace de hidrógeno. Los factores que afectan a este enlace incluyen: el tipo y volumen del disolvente; la temperatura de reacción; el tiempo de hibridización; la agitación; agentes que bloquean la unión antisentido de la molécula en fase líquida al soporte sólido (Reagente de Denhardt o BLOTTO); la concentración de las moléculas; el uso de compuestos para aumentar la velocidad de asociación de moléculas (sulfato de dextrano o glicol de polietileno); y el rigor de las condicione de lavado tras la hibridización (ver Sambrook et al. [supra]).

La inhibición de hibridización de una molécula completamente complementaria a una molécula objetivo puede examinarse usando un ensayo de hibridización, tal y como se conoce en la técnica (por ejemplo, Sambrook et al. [supra]). Una molécula sustancialmente homóloga competirá a continuación e inhibirá el enlace de una molécula completamente homóloga a la molécula objetivo bajo condiciones de rigidez tal y como lo explica Wahl, G.M. and S.L. Berger(1987; Methods Enzymol. 152:399-407) y Kimmel, A.R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511).

"Rigidez" hace referencia a condiciones en una reacción de hibridización que favorecen la asociación de moléculas muy similares en relación con moléculas que difieren. Las condiciones de hibridización con elevada rigidez se definen como una incubación durante la noche a 42°C en una solución formada por 50% formadida, 5XSSC (150 mM NaCl, 15 mM citrato de trisodio), 50 mM fosfato sódico (pH 7.6), 5x solución de Denhardt, 10% sulfato de dextrano y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, seguido de un lavado en filtros en 0.1 X SSC a aproximadamente 65°C. Las condiciones de bajo rigor incluyen que la reacción de hibridización se lleve a cabo a 35°C (ver Sambrook et al. [supra]). Preferiblemente, las condiciones empeladas para hibridización son las de elevada rigidez.

La invención también proporciona un proceso para detectar una molécula de ácido nucleico de la invención que consiste en los siguientes pasos: (a) poner en contacto una sonda nucleica de acuerdo con la invención con una muestra biológica bajo condiciones de hibridización para formar bloques de dos; y (b) detectar los bloques de dos que se formen.

Tal y como se describe adicionalmente a continuación con ensayazo que pueden utilizarse de acuerdo con la invención, una molécula de ácido nucleico tal y como se ha descrito anteriormente puede usarse como una sonda de hibridización para ARN, cADN, ADN genómico, con el fin de aislar clones genómicos y de cADN con longitud completa codificadores de los polipéptidos INSP152 y para aislar cADN y clones genómicos de genes homólogos y ortólogos que tiene una elevada similitud de secuencia con el gen codificador de este polipéptido.

En este aspecto, las siguientes técnicas, entre otras conocidas por aquellos expertos en la técnica, pueden utilizarse y se describen a continuación con fines ilustrativos. Métodos para secuenciar ADN y análisis son bien conocidos y generalmente disponibles en la técnica pueden usarse para poner en práctica muchas de las realizaciones de la invención aquí descritas. Tales métodos pueden emplear enzimas como el fragmento Klenow de polimerasa I de ADN, Sequenasa (US Biochemical Corp, Cleveland, OH), polimerasa Taq (Perkin Elmer), polimerasa termoestable T7 (Amersham, Chicago, IL), o combinaciones de polimerasas y exonucleasas con corrección de pruebas como las encontradas en el Sistema de Amplificación ELONGEASE comercializadas por Gibco/BRL (Gaithersburg, MD. Preferiblemente, el proceso de secuencias puede automatizarse usando máquinas como Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, NV), el Peltier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Watertown, MA) y el Catalizador ABI y Secuenciadotes 373 y 377 de ADN (Perkin Elmer).

Un método para aislar una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido con una función equivalente a la del polipéptido INSP152 es la introducción de una sonda a una biblioteca genómica o cADN con una sonda natural o artificialmente diseñada usando procedimientos estándar que son reconocidos en la técnica (ver, por ejemplo, "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al. (eds.). Greene Publishing Association y John Wiley Interscience, New York, 1989, 1992). Las sondas que están formadas por al menos 15, preferiblemente al menos 30, y más preferiblemente al menos 50, bases contiguas que corresponden a, o son complementarias a, secuencias de ácido nucleico del gen codificador apropiado SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 y SEQ ID NO:27) son particularmente sondas útiles. Tales sondas pueden etiquetarse con un reagente analíticamente detectables para facilitar su identificación. Los reagentes útiles incluye, pero sin limitar a, radioisótopos, tintes fluorescentes y enzimas que son capaces de catalizar la formación de un producto detectable. Usando estas sondas, el experto en la técnica será capaz de aislar copias complementarias de polinucleótidos genómicos de ADN, cADN o ARN que codifican proteínas de interés de fuentes humanas, mamíferas de otras fuentes animales y analizará tales fuentes para encontrar fuentes relacionadas, por ejemplo, miembros adicionales de la familia, tipo y/o subtipo.

En muchos casos, las secuencias aisladas de cADN estarán incompletas, en el sentido de que la región que codifica el polipéptido estará cortada, normalmente en el extremo 5'. Hay varios métodos disponibles para obtener cADNs de longitud completa, para extender cADNs cortos. Tales secuencias pueden extenderse utilizando una secuencia parcial de nucleótido y empleando varios métodos conocidos en la técnica para detectar secuencias ascendentes como elementos impulsores y reguladores. Por ejemplo, un método que puede emplearse está basado en el método de Amplificación Rápida de Extremos de cADN (RACE; ver, por ejemplo, Frohman et al., PNAS USA 85, 8998-9002), 1988). Modificaciones recientes de esta técnica, ejemplificadas por la tecnología Maratón^{TM} (Clontech Laboratorios, Inc.), por ejemplo, han simplificado de modo significativo la búsqueda de cADNs más largos. Una técnica ligeramente diferente, denominada PCR "restricción-lugar", usa sondas universales para recuperar una secuencia desconocida de ácido nucleico adyacente a un lugar conocido (Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322). PCR inverso también puede emplearse para amplificar o para extender secuencias usando sondas divergentes basadas en una región conocida (Triglia, T. et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:8186). Otro método que puede emplearse es PCR de captura que incluye amplificación PCR de fragmentos de ADN adyacentes a una secuencia conocida en ADN de cromosoma humano y artificial de levadura (Lagerstrom, M. et al. (1991) PCR Methods Applic., 1, 111-119). Otro método que puede usarse para recuperar las secuencias conocidas es el de Parker, J. D. et al. (1991); Nucleic Acids Res. 19:3055-3060). Además, se puede usar PCR, sondas anidadas, y bibliotecas PromoterFinder^{TM} para sacar ADN genómico (Clontech, Palo Alto, CA). Este proceso evita la necesidad de analizar bibliotecas y es útil para encontrar uniones intrón/exón.

Cuando se analizan cADNs de longitud completa, es preferible usar bibliotecas que hayan sido seleccionadas por tamaño para incluir cADNs más grandes. Así mismo, son preferibles las bibliotecas que han sido sondadas al azar, por el hecho de que contendrán más secuencias que las regiones de 5' de genes. El uso de bibliotecas sondadas al azar puede resultar especialmente preferible para situaciones en las que una biblioteca de oligo d(T) no produce cADN de longitud completa. Las bibliotecas genómicas pueden ser útiles para la extensión de secuencia a regiones reguladoras no-transcritas de 5'.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden utilizarse para localización de cromosomas. En esta técnica, una molécula de ácido nucleico se dirige específicamente, y puede hibridizarse con, una localización particular sobre un cromosoma humano individual. El mapeo de secuencias relevantes para cromosomas de acuerdo con la presente invención es un importante paso en la correlación confirmatoria de aquellas secuencias con la enfermedad asociada al gen. Una vez que la secuencia ha sido localizada en un preciso punto cromosomal, la posición física de la secuencia sobre el cromosoma puede correlacionarse con los datos del mapa genético. Tales datos se encuentran en, por ejemplo, V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponible en línea a través de la Biblioteca Médica Galesa de la Universidad Johns Hopkins). La relación entre genes y enfermedades que han sido localizadas en la misma región cromosomal se identifica a continuación por medio de un análisis de enlace o conexión (co-herencia de genes físicamente adyacentes). Esto proporciona información valiosa para investigadores que buscan genes de enfermedades usando clonación posicional u otras técnicas para descubrimiento de genes. Una vez que la enfermedad o síndrome se ha localizado de modo rudimentario por conexión genética a una región genómica particular, cualquier mapeo secuencial al área puede representar genes asociados o reguladores para llevar a cabo más investigaciones. La molécula de ácido nucleico también puede usarse para detectar diferencias en la localización cromosomal debido a la translocación, inversión, etc, entre individuos normales, afectados o portadores.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención también son valiosas para localización de tejidos. Tales técnicas permiten la determinación de patrones de expresión del polipéptido en tejidos mediante la detección de los mARNs que los codifican. Estas técnicas incluyen técnicas de hibridización in vitro y técnicas de amplificación de nucleótidos, como PCR. Los resultados de estos estudios proporcionan una indicación de las funciones normales del polipéptido en el organismo. Además, estudios comparativos del patrón de expresión normal de mARNs con el de mARNs codificados por gen mutante proporcionan visiones valiosas en el papel de polipéptidos mutantes en la enfermedad. Tal expresión inapropiada puede ser de naturaleza temporal, espacial o cuantitativa.

Las técnicas para silenciar genes también pueden emplearse para disminuir la expresión endógena de un gen codificador de un polipéptido de la invención. La interferencia de ARN (RNAi) (Elbashir, SM et al. Nature 2001, 411, 494-498) es un método que puede emplearse para silenciar gen post-transcripcional específico de secuencia. Los oligonucleótidos cortos de dsARN pueden sintetizarse in vitro e introducirse en una célula. El enlace específico de secuencia de estos oligonucleótidos dsARN provoca la degradación de mARN objetivo, reduciendo o eliminando la expresión de proteína objetivo.

La eficacia de las técnicas silenciadoras de genes anteriormente examinada puede analizarse a través de la medición de expresión de polipéptidos (pro ejemplo, por Western Blot), y en el nivel de ARN usando metodologías basadas en Taíman.

Los vectores de la presente invención comprenden moléculas de ácido nucleico de la invención y pueden ser vectores de clonación o expresión. Las células huésped de la invención, que pueden transformarse, transfectarse con los vectores de la invención pueden ser procarióticas o eucarióticas.

Los polipéptidos de la presente invención pueden prepararse en forma recombinante por expresión de sus moléculas de ácido nucleico codificadoras en vectores contenidos en una célula huésped. Tales métodos de expresión son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica y muchos se describen con detalles en Sambrook et al. (supra) y Fernandez & Hoeffler (1998, eds. "Gene expresión systems. Using nature for the art of expresión". Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto).

En general, puede usarse cualquier sistema o vector que sea adecuado para mantener, propagar o expresar moléculas de ácido nucleico para producir un polipéptido en el huésped requerido. La secuencia apropiada de nucleótido puede insertarse en un sistema de expresión empleando cualquiera de las técnicas conocidas y rutinarias como, por ejemplo, las descritas en Sambrook et al. (supra). En general, el gen codificador puede colocarse bajo el control de un elemento de control como lo puede ser un impulsor, punto de enlace de ribosoma (para expresión bacteriana) y, opcionalmente, un operador, de modo que la secuencia de ADN codificadora del polipéptido deseado se transcribe al ARN en la célula huésped transformada.

Ejemplos de sistemas adecuados de expresión incluye, por ejemplo, sistemas cromosomales, episomales y derivados de virus, incluyendo, por ejemplo, vectores derivados de: plásmidos bacterianos, bacteriófago, transposones, episomas de levadura, elementos de inserción, elementos cromosomales de levaduras, virus como baculovirus, virus papota como SV40, virus de vacunas, adenovirus, virus de peste aviar, virus de pseudorrabia y retrovirus, o combinaciones de los mismos, como los derivados de plásmido y elementos genéticos bacteriófagos, incluyendo cósmidos y fagémidos. Los cromosomas artificiales humanos (HACs) también pueden emplearse para enviar fragmentos más grandes de ADN que pueden estar contenidos y expresados en un plásmido. El vector TOPO y el vector pEAK12d-PAC_INSP152-D1-SV1-6HIS-V1 son ejemplos preferentes de un vector adecuado para uso de acuerdo con los aspectos de esta invención en relación con INSP152.

Particularmente, los sistemas adecuados de expresión incluyen microorganismos como bacterias transformadas con bacteriófago recombinante, plásmido o vectores de expresión cósmida de ADN; levadura transformada con vector de expresión de levadura; sistemas celulares de insectos transformados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas celulares de plantas transformados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus de mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacteriana (por ejemplo, Ti o plásmidos pBR322); o sistemas celulares animales. Los sistemas de translación libres de células también pueden emplearse para producir los polipéptidos de la invención.

La introducción de moléculas de ácido nucleico codificadoras de un polipéptido de la presente invención en células huésped puede estar afectada por métodos descritos en numerosos manuales estándar de laboratorio, como en Davis et al., Basic Method in Molecular Biology (1986) y Sambrook et al., (supra). En particular, métodos adecuados incluyen transfección de fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección, microinyección, transfección mediada por lípido catiónico, electroporación, transducción, carga de roce, introducción balística o infección (ver Sambrook et al. 1989 (supra); Ausubel et al., 1991 (supra); Spector, Goldman & Leinwald, 1998). En célula eucarióticas, los sistemas de expresión pueden ser pasajeros (por ejemplo, episomal) o permanentes (integración cromosomal) de acuerdo con las necesidades del sistema.

La molécula de ácido nucleico puede o no incluir una secuencia codificadora de una secuencia control, como un péptido señalizador o una secuencia líder, si se desea, por ejemplo, para la segregación del polipéptido trasladado al lumen del retículo endoplásmico, al espacio periplásimo o al ambiente extracelular. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas. Las secuencias líderes pueden retirarse por acción del huésped bacteriano en el proceso post-translacional.

Además de las secuencias de control, puede desearse añadir secuencias reguladoras para permitir la regulación de la expresión del polipéptido en relación con el crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de secuencias reguladoras son aquellos que provocan la expresión de un gen que aumenta o disminuye en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador o a varias condiciones de temperatura o metabolismo. Las secuencias reguladoras son aquellas regiones no traducidas del vector, como procesadores, impulsores y regiones no traducidas 5' y 3'. Estas regiones interactúan con las proteínas celulares del huésped para llevar a cabo la transcripción o traslación. Tales secuencias reguladoras pueden variar en fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema vector y del huésped utilizado, puede usarse cualquier número de elementos adecuados de transcripción y traslación, entre los que se incluyen promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se realiza clonación en sistemas bacterianos, promotores inducibles como promotor híbrido lacZ de fagémido Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA) o plásmido Sportl^{TM}(Gibco BRL) y similares pueden usarse. El promotor baculovirus polihedrin puede usarse en células de insectos. Los promotores o aumentadores derivados de genomas de células de plantas (por ejemplo, genes de impacto al calor, RUBISCO y proteína de almacenaje) o de virus de plantas (por ejemplo, promotores virales o secuencias líderes) pueden clonarse a un vector. En sistemas celulares de mamíferos, los promotores de genes mamíferos o de virus mamíferos son preferibles. Si es necesario generar una línea celular que contenga múltiples copias de la secuencia, los vectores basados en SV40 o EBV pueden usarse con un marcador seleccionable
adecuado.

Un vector de expresión se construye para que el ácido nucleico particular que codifica la secuencia se localice en el vector con las secuencias reguladoras apropiadas, estando el posicionamiento y la orientación de la secuencia codificadora con respecto a las secuencias reguladoras de tal modo que la secuencia codificadoras se transcriba bajo el "control" de las secuencias reguladoras, es decir, la polimerasa de ARN que se enlaza con la molécula de ADN en las secuencias de control se transcribe con la secuencia codificadora. En algunos casos, puede ser necesario modificar la secuencia para que se una a las secuencias de control con la apropiada orientación, es decir, para mantener el marco de lectura.

Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras pueden ligarse a la secuencia codificadora del ácido nucleico antes de la inserción en el vector. De modo alternativo, la secuencia codificadora puede clonarse directamente en un vector de expresión que ya contiene las secuencias de control y un lugar de restricción apropiado.

Para producción a largo plazo y a gran escala de un polipéptido recombinante, es preferible la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de manera estable el polipéptido de interés pueden transformarse usando vectores de expresión que contengan orígenes virales de réplica y/o elementos de expresión endógena y un gen marcador seleccionable en el mismo vector o en un vector separado. Tras la introducción del vector, se puede dejar que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de que se cambien a un medio selectivo. El fin del marcador selectivo es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de células que expresan de manera correcta las secuencias introducidas. Los clones resistentes de las células establemente transformadas pueden proliferar usando técnicas de cultivo de tejido apropiadas para el tipo de célula.

Las líneas celulares mamíferas disponibles como huéspedes para expresión son conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la Colección de Cultivo de Tipo Americano (ATCC) incluyendo, aunque sin limitar, células de ovario de hámster chino (CHO), HeLa, riñón de hámster bebé (BHK), riñón de mono (COS), C127, 3T3, BHK, HEK 293, melanoma Bowes y carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2) y un número de otras líneas celulares.

En el sistema baculovirus, los materiales para los sistemas de expresión baculovirus/célula de insecto se encuentran disponibles en le mercado en forma de kit de, entre otros, Invitrogen, San Diego CA (el kit "MaxBac"). Estas técnicas son generalmente conocidas por los expertos en la técnica y se describen por completo en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). En particular, las células huésped adecuadas en este sistema incluyen células de insectos como células Drosophila S2 y Spodoptera Sf9.

Hay muchos sistemas de expresión genéticos de cultivos celulares de plantas y de plantas enteras conocidos en la técnica. Ejemplos de adecuados sistemas de expresión genéticos celulares de plantas incluyen los descritos en US 5,693,506; US 5,659,122; y US 5,608,143. Ejemplos adicionales de expresión genética en cultivo celular en plantas se han descrito en Zenk, Phytochemistry 30, 3861-3863 (1991).

En particular, todas las plantas cuyo protoplasto se puede aislar y cultivar para dar plantas completas regeneradas pueden utilizarse, de modo que se recuperar plantas completas que contienen el gen transferido. En la práctica, todas las plantas pueden regenerarse a partir de células o tejidos cultivados, incluyendo pero sin limitar todas las especies principales de caña de azúcar, remolacha azucarera, algodón, árboles frutales y otros árboles, legumbres y vegetales.

Ejemplos de células huéspedes bacteriales particularmente preferentes incluyen células de streptococci, staphylococci, E. Coli, Streptomyces y Bacillus subtilis.

Ejemplos de células huéspedes particularmente preferentes para expresión micótica incluyen células de levadura (por ejemplo, S. Cerevisiae) y células Aspergillus.

Cualquier número de sistemas de selección son conocidos en la técnica para recuperar líneas celulares transformadas. Ejemplos incluyen genes de timidina quinasa vírica de virus simple (Wigler, M. et al. (1977) Cell 11:223-32) y de adenina fosforibositransferasa (Lowy, I. et al. (1980) Cell 22:817-23) que pueden emplearse en células tk^{-} o aprt^{\pm}, respectivamente.

Así mismo, la resistencia a los antimetabolitos, antibióticos y herbicidas puede usarse como base para la selección; por ejemplo, dihidrofolato reductasa (DHFR) que da resistencia a metotrexato (Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natls. Acad. Sci. 77:3567-70); npt, que da resistencia a aminoglicósidos neomicina y G-418 (Colbere-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14) como als o pat, que da resistencia a clorosulfuro y fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente. Se han descrito genes seleccionables adicionales, cuyos ejemplos serán claros para aquellos expertos en la técnica.

A pesar de que la presencia o ausencia de expresión de gen marcador sugiere que el gen de interés está también presente, su presencia y expresión necesita confirmarse. Por ejemplo, si las secuencia relevante se inserta en el interior de la secuencia de gen marcador, las células transformadas que contienen las secuencias apropiadas pueden identificarse por la ausencia de gen marcador. De manera alternativa, un gen marcador puede colocarse junto con una secuencia codificadora de un polipéptido de la invención bajo el control de un único promotor. La expresión del gen marcador en respuesta a la inducción o selección normalmente también indica la expresión del gen tándem.

Alternativamente, las células huésped que contienen una secuencia de ácido nucleico codificadora del polipéptido de la invención y que expresa dicho polipéptido pueden ser identificadas por medio de una variedad de procedimientos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, aunque no se limitan a, hibridizaciones ADN-ADN o ADN-ARN y bioensayos con proteínas, pro ejemplo, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o técnicas de inmnoensayos (como el ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas (ELISA) y radioinmunoensayo (RIA)), que incluyen tecnologías con base de membrana, solución o chips para la detección y/o cuantificación de ácido nucleico o proteínas (ver Hampton, R. et al., (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, MN) y Maddox, D.E. et al., (1983) J. Exp. Med., 158, 1211-1216).

Los expertos en la técnica conocen una amplia variedad de técnicas de etiquetas y conjugación y pueden emplearse en varios ensayos con ácidos nucleicos y aminoácidos. Medios para producir hibridización etiquetada o sondas PCR para la detección de secuencias relacionadas co moléculas de ácidos nucleicos codificadoras de los polipéptidos de la presente invención incluyen el oligoetiquetado, la traslación nick, el etiquetado final y la amplificación PCR usando un polinucleótido etiquetado. De modo alternativo, las secuencias codificadoras del polipéptido de la invención pueden clonarse en un vector para la producción de una sonda mARN. Tales vectores son conocidos en la técnica, se encuentran disponibles en el mercado y pueden usarse para sintetizar sondas ARN in vitro mediante la adición de una polimerasa apropiadaza de ARN como T7, T3 o SP6 y nucleótidos etiquetados. Estos procedimientos pueden llevarse a cabo usando una gran variedad de kits disponibles en el mercado (Pharmacia & UPjohh, (Calmazo, MI); Promega (Madison WI); y U.S. Biochemical Corp. (Cleveland, OH)).

Entre las moléculas informadoras adecuadas o etiquetas que pueden usarse para facilitar la detección se incluyen radionucléotidos, enzimas y fluorescentes, agentes quimioluminiscentes o cromogénicos así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares.

Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención también pueden usarse para crear animales transgénicos, en particular animales roedores. Tales animales transgénicos forman un aspecto adicional de la presente invención. Esto puede hacerse localmente modificando células somáticas, o mediante terapia de línea de germen para incorporar modificaciones heredables. Dichos animales transgénicos pueden ser particularmente útiles en la generación de modelos animales para moléculas de fármacos efectivas como moduladoras de los polipéptidos de la presente invención.

El polipéptido puede recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes mediante métodos bien conocidos que incluyen precipitación de sulfato de amonio o etanol, extracción de ácido, cromatografía de intercambio de anión o catión, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. La cromatografía líquida de elevada actuación es particularmente útil para purificación. Pueden emplearse técnicas bien conocidas para repliegue de proteínas con el fin de regenerar una conformación activa cuando el polipéptido se desnaturaliza durante aislamiento o purifica-
ción.

Las construcciones de vectores especializados pueden también utilizarse para facilitar la purificación de proteínas, tal y como se desee, uniendo secuencias codificadoras del polipéptido de la invención con una secuencia de nucleótido que codifica un dominio del polipéptido que facilitará la purificación de proteínas solubles. Ejemplos de tales dominios que facilitan la purificación incluyen péptidos quelantes de metal, como módulos histidina-triptófano que permiten la purificación de metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación de inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema extensión FLAGS/purificación por afinidad (Immunex Corp., Seattle, WA). La inclusión de secuencias de unión divisible como aquellas específicas para el Factor XA o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre el dominio de purificación y el polipéptido de la invención puede usarse para facilitar la purificación. El mencionado vector de expresión proporciona una proteína de fusión que contiene el polipéptido de la invención fusionado con varios residuos de histidina que preceden a un punto de división de una tioredoxina o enteroquinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación por IMAC (cromatografía de afinidad con ión metálico inmovilizado, tal y como se describe en Porta, J. et al., (1992), Prot. Exp. Purif. 3: 263-281) mientras que el punto de división de una tioredoxina o enteroquinasa proporciona un medio para purificar el polipéptido desde la proteína de fusión. Una discusión de vectores que contienen proteínas de fusión se presenta en Kroll, D.J., et al., (1993; DNA Cell Biol. 12:441-453).

Si el polipéptido se va a expresar para uso en ensayos de análisis, generalmente es preferible que se produzca en la superficie de la célula huésped en la que se va a expresar. En este caso, las células huéspedes pueden cultivarse antes de su uso en el ensayo de análisis, por ejemplo usando técnicas de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o técnicas de inmunoafinidad. Si el polipéptido es segregado en el medio, el medio puede recuperarse con el fin de recuperar y purificar el polipéptido expresado. Si el polipéptido se produce intracelularmente, las células deben lisarse en primer lugar antes de que se recupere el polipéptido.

El polipéptido de la invención puede usarse para analizar bibliotecas de compuestos en cualquiera de las varias técnicas de análisis de fármacos. Tales compuestos pueden activar (agonizar) o inhibir (antagonizar) el nivel de expresión del gen o actividad del polipéptido de la invención y formar un aspecto adicional de la invención. Los compuestos preferentes son efectivos para alterar la expresión de un gen natural que codifica un polipéptido del primer aspecto de la invención y para regular la actividad de un polipéptido del primer aspecto de la invención.

Los compuestos agonistas o antagonistas pueden aislarse de, por ejemplo, células, preparaciones sin células, bibliotecas químicas o mezclas con productos naturales. Estos agonistas y antagonistas pueden ser sustratos, ligandos, enzimas, receptores naturales o modificados o miméticos estructurales o funcionales. Para documentación de tales técnicas de análisis, ver Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): Capítulo 5 (1991).

Los compuestos que tienen más posibilidades de ser buenos antagonistas son las moléculas que se enlazan con el polipéptido de la invención sin provocar los efectos biológicos del polipéptido con el que se enlazan. Antagonistas potenciales incluyen pequeñas moléculas orgánicas, péptidos o polipéptidos y anticuerpos que se enlazan con el polipéptido de la invención y de ese modo inhiben o extinguen su actividad. De este modo, en enlace del polipéptido con moléculas de enlace celular normal puede inhibirse, de modo que se previene la actividad normal biológica del polipéptido.

El polipéptido de la invención que se emplea en tales técnicas de análisis puede estar solo en una solución, fijado a un soporte sólido, unido a una superficie celular o localizado intracelularmente. En general, tales procedimientos de análisis pueden incluir el uso de células o membranas celulares adecuadas que expresan el polipéptido que están en contacto con un compuesto de test para observar el enlace, la estimulación o inhibición de una respuesta funcional. La respuesta funcional de las células en contacto con el compuesto del test se compara a continuación con las células control que no tuvieron contacto con el compuesto del test. Dicho ensayo puede evaluar si el compuesto del test da como resultado una señal generada por la activación del polipéptido, usando un apropiado sistema de detección. Los inhibidores de la activación generalmente se analizan en presencia de un agonista conocido y el efecto sobre la activación por el agonista se observa en presencia del compuesto del test.

Los métodos para generar señales detectables en los tipos de ensayos aquí descritos serán conocidos por aquellos expertos en la técnica. Un ejemplo particular es la co-transfección de una construcción que expresa un polipéptido de acuerdo con la invención o un fragmento que es responsable del enlace con el objetivo, en la fusión con el dominio del enlace GAL4 ADN, con una célula junto con un plásmido reportero, como por ejemplo pFR-Luc (Stratagene Europe, Amsterdam, The Netherlands). Este plásmido en particular contiene un impulsor sintético con cinco repeticiones tándem de puntos de enlace GAL4 que controlan la expresión del gen luciferasa. Cuando un objetivo potencial o ligando se añade a las células, enlazará con la fusión de polipéptido GAL4 y provocará la transcripción del gen luciferasa. El nivel de la expresión de luciferasa puede controlarse mediante su actividad usando un lector de luminiscencia (ver, por ejemplo, Lehman et al., JBC 270, 12953, 1995; Pawar et al., JBC, 277, 39243, 2002).

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Un método adicional preferente para identificar un agonista o antagonista de un polipéptido de la invención consiste en:

(a)

poner en contacto un compuesto etiquetado o no etiquetado con el polipéptido inmovilizado sobre un soporte sólido (por ejemplo, gotas, placas, soporte de matriz, chip) y detectar el compuesto midiendo la etiqueta o la presencia del compuesto por sí mismo; o

(b)

poner en contacto una célula expresiva sobre la superficie del polipéptido, por medio de un anclaje artificial con la membrana celular, o construyendo un receptor quimérico asociado con un segundo componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta al enlace de un compuesto con el polipéptido, con un compuesto que se analice bajo condiciones que permitan el enlace con el polipéptido; y

(c)

determinar si el compuesto se enlaza con y activa o inhibe el polipéptido en comparación con el nivel de una señal generada a partir de la interacción del compuesto con el polipéptido con el nivel de una señal en ausencia del compuesto.

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Por ejemplo, podría usarse un método como la detección FRET de un ligando unido al polipéptido en presencia de co-activadores de péptido (Norris et al., Science, 285, 744, 1999).

En realizaciones más preferentes, los métodos generales que se han descrito anteriormente pueden además incluir el proceso de identificación de agonista o antagonista en presencia de un ligando etiquetado o no etiquetado para el polipéptido.

En otra realización del método para identificar agonista o antagonista de un polipéptido de la presente invención se observan los siguientes pasos:

Determinar la inhibición del enlace de un ligando con el polipéptido de la invención sobre cualquier superficie sólida o celular del mismo, en presencia de un compuesto candidato bajo condiciones que permiten el enlace con el polipéptido, y determinar la cantidad de ligando que se ha enlazado con el polipéptido. Un compuesto capaz de provocar reducción de enlace de un ligando es considerado como competidor que puede actuar como un agonista o antagonista. Preferiblemente, se etiqueta el ligando.

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Más en particular, un método para analizar un polipéptido antagonista o un compuesto agonista consiste en los siguientes pasos:

(a)

incubar un ligando etiquetado con un polipéptido de acuerdo con la invención sobre un soporte sólido o la superficie celular, o una membrana celular que contenga un polipéptido de la invención;

(b)

medir la cantidad de ligando etiquetado enlazado con el polipéptido sobre el soporte sólido, la célula completa o la membrana celular;

(c)

añadir un compuesto candidato a la mezcla de ligando etiquetado y polipéptido inmovilizado sobre el soporte sólido, la célula completa o la membrana celular del paso (a) y dejar que la mezcla consiga equilibrio;

(d)

medir la cantidad de ligando etiquetado enlazado con el polipéptido o la célula completa o la membrana celular después del paso (c); y

(e)

comparar la diferencia en el ligando etiquetado enlazado en el paso (b) y (d), de modo que el compuesto que provoca la reducción en el enlace en el paso (d) es considerado agonista o antagonista.

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Los polipéptidos pueden encontrarse para modular una variedad de procesos fisiológicos y patológicos de un modo dependiente de dosis en los ensayos anteriormente descritos. Por lo tanto, los "equivalentes funcionales" de los polipéptidos de la invención incluyen polipéptidos que muestran las mismas actividades modulares en los ensayos anteriormente descritos de un modo dependiente de dosis. A pesar de que el grado de actividad dependiente de dosis no necesita ser idéntico al de los polipéptido de la invención, preferiblemente los "equivalentes funcionales" mostrarán una dependencia de dosis sustancialmente similar en un ensayo determinado en comparación con los polipéptidos de la invención.

En ciertas de las realizaciones arriba descritas, pueden emplearse ensayos simples de enlace, en los cuales la adherencia de un compuesto de test a la superficie que sostiene el polipéptido se detecta por medio de una etiqueta directamente o indirectamente asociada con el compuesto del test o en un ensayo que implica la competencia con un competidor etiquetado. En otra realización, pueden emplearse ensayos de análisis de fármacos competitivos, en los cuales anticuerpos neutralizadores que son capaces de enlazarse con el polipéptido compiten específicamente con un compuesto de test para lograr el enlace. De esta manera, los anticuerpos pueden emplearse para detectar la presencia de cualquier compuesto de test que posea afinidad específica de enlace con el polipéptido.

También pueden diseñarse ensayos para detectar el efecto de compuesto de test añadidos sobre la producción de mARN codificador de polipéptidos en células. Por ejemplo, puede construirse un ELISA que mida niveles segregados o asociados con las células de un polipéptido usando anticuerpos monoclonales o policlonales por medio de métodos estándar conocidos en la técnica, y esto puede usarse para buscar compuestos que inhiban o incrementen la producción del polipéptido a partir de células o tejidos adecuadamente manipulados. La formación de complejos de enlace entre el polipéptido y el compuesto que está siendo analizado puede medirse posteriormente.

Métodos de análisis que también se incluyen en los límites de la presente invención son aquellos que implican el uso de genes y polipéptidos de la invención en ensayos de sobre expresión y ablación. Tales ensayos consisten en la manipulación de niveles de estos genes/polipéptidos en célula y la evaluación del impacto de esta manipulación sobre la fisiología de las células manipuladas. Por ejemplo, tales experimentos revelan detalles de rutas señalizadoras y metabólicas en las que se encuentran implicados los genes/polipéptidos particulares, generan información relativa a las identidades de polipéptidos con los que los polipéptidos estudiados interactúan y proporcionan claves sobre los métodos por los que los gentes y proteínas relacionadas de regulan.

Otra técnica para analizar fármacos que puede emplearse proporciona un análisis de elevado rendimiento de compuesto que poseen la adecuada afinidad de enlace con el polipéptido de interés (ver la Solicitud de Patente Internacional WO84/03564). En este método, un gran número de diferentes pequeños compuestos de test se sintetizan sobre un sustrato sólido, que a continuación reaccionan con el polipéptido de la invención y se lavan. Un modo de inmovilizar el polipéptido es el uso de anticuerpos no neutralizadores. El polipéptido enlazado puede a continuación detectarse usando métodos que son bien conocidos en la técnica. El polipéptido purificado puede también cubrirse directamente sobre palcas para uso en las técnicas de análisis de fármacos ya mencionadas.

El polipéptido de la invención puede emplearse para identificar receptores unidos a la membrana o solubles, a través de técnicas estándar de enlace con receptores que son conocidas en la técnica, como ensayos de enlace de ligando y enlace cruzado en los que el polipéptido se etiqueta con un isótopo radioactivo, se modificas químicamente o se fusiona con una secuencia péptida que facilita su detección o purificación, y se incuba con una fuente del receptor putativo (por ejemplo, una composición de células, membranas celulares, sobrenadantes celulares, extractos de tejido, o fluidos corporales). La eficacia del enlace puede medirse usando técnicas biofísicas como resonancia de plasmón superficial y espectroscopia. Los ensayos de enlaces pueden usarse para la purificación y clonación del receptor, pero también pueden identificar agonistas y antagonistas del polipéptido, que compiten con el enlace del polipéptido con su receptor. Métodos estándar para llevar a cabo ensayos de análisis son bien conocidos en la técnica.

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Esta invención describe el uso de un polipéptido INSP152 para aislar y generar un agonista o estimulador del polipéptido INSP152 para el tratamiento de un desorden inmune relacionado, donde dicho agonista o estimulador se selecciona del grupo consistente en:

1.

un anticuerpo específico o fragmento del mismo que incluye: a) un anticuerpo quimérico; b) humanizado o c) completamente humano, así como;

2.

un anticuerpo bi-específico o multiespecífico,

3.

una cadena sencilla (por ejemplo, scFv) o

4.

un anticuerpo con dominio sencillo, o

5.

un elemento mimético péptido no no-péptido derivado de dichos anticuerpos o

6.

un anticuerpo-elemento mimético como a) una anticalina o b) molécula de enlace basada en fibronectina (p. ej., trinectina o adnectina).

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La generación de elementos miméticos péptidos o no péptidos a partir de anticuerpos es conocida en la técnica (Saragovi et al., 1991 y Saragovi et al., 1992).

Las anticalinas también son conocidas en la técnica (Vogt et al., 2004). Las moléculas de enlace basadas en fibronectina se describen en US 6818418 y WO 2004029224.

Además, el compuesto del test puede tener varios orígenes, naturalezas y composiciones, como cualquier molécula pequeña, ácido nucleico, lípido, péptido, polipéptido incluyendo un anticuerpo como un quimérico, humanizado o un anticuerpo completamente humano o un fragmento de anticuerpo, elemento mimético péptido o no-péptido derivado de los mismos así como un anticuerpo biespecífico o multiespecífico, una cadena sencilla (por ejemplo, scFv) o un anticuerpo de dominio sencillo o un anticuerpo-elemento mimético como una anticalina o una molécula de enlace con base fibronectina (por ejemplo, trinectina o adnectina), etc, en forma aislada o en mezcla o en combinaciones.

La invención también incluye un kit de análisis útil en los métodos para identificar agonistas, antagonistas, ligandos, receptores, sustratos, enzimas que se han descrito previamente.

La invención incluye los agonistas, antagonistas, ligandos, receptores, sustratos y enzimas, y otros compuestos que modulan la actividad o antigenicidad del polipéptido de la invención descubierta por métodos que previamente se han descrito.

Tal y como se ha mencionado anteriormente, se prevé que varios radicales de la invención (por ejemplo, los polipéptidos del primer aspecto de la invención, una molécula de ácido nucleico del segundo o tercer aspecto de la invención, un vector del cuarto aspecto de la invención, una célula huésped del quinto aspecto de la invención, un ligando del sexto aspecto de la invención) pueden ser útiles en la terapia o diagnóstico de enfermedades. Par evaluar la utilidad de los radicales de la invención para tratar y diagnosticar una enfermedad pueden llevarse a cabo uno o varios de los siguientes ensayos. Hay que tener en cuenta que aunque algunos de los siguientes ensayos hacen referencia al compuesto del test que es una proteína/polipéptido, un experto en la técnica fácilmente será capaz de adaptar los siguientes ensayos para que otros radicales de la invención puedan también usarse como "compuesto del test".

La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que están formadas por un polipéptido, ácido nucleico, ligando o compuesto de la invención en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones pueden ser adecuadas como reagentes terapéuticos o en diagnósticos, vacunas, o como composiciones inmunogénicas, tal y como se detalla a continuación.

De acuerdo con la terminología aquí usada, una composición que contiene un polipéptido, ácido nucleico, ligando o compuesto [X] está "sustancialmente libre de" impurezas [aquí, Y] cuando al menos el 85% por peso del total X+Y en la composición es X. Preferiblemente, X está formado por al menos aproximadamente 90% por peso del total X+Y en la composición, más preferiblemente al menos aproximadamente 95%, 98% o incluso 99% por peso.

La composición farmacéutica debería estar formada preferiblemente por una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido, ácido nucleico, ligando o compuesto de la invención. El término "cantidad terapéuticamente efectiva", tal y como aquí se emplea, hace referencia a una cantidad de un agente terapéutico necesario para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o condición, o para mostrar un efecto terapéutico o preventivo detectable. Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente en ensayos de cultivo celular, pro ejemplo, de células neoplásticas, o en modelos animales, usando ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal puede usare para determinar el índice de concentración adecuada y la ruta de administración. A continuación, tal información puede usarse para determinar dosis y rutas útiles para administración en humanos.

La cantidad efectiva precisa para un sujeto humano dependerá de la severidad del estado de enfermedad, la salud general del sujeto, edad, peso y género del sujeto, dieta, tiempo y frecuencia de administración, combinaciones con otros fármacos, sensibilidad a la reacción, y tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad puede determinarse mediante experimentación rutinaria y bajo el juicio del doctor. Generalmente, una dosis efectiva será desde 0.01 mg/kg a 50 mg/kg, preferiblemente de 0.05 mg/kg a 10 mg/kg. Las composiciones pueden administrarse de manera individual a un paciente o pueden administrarse en combinación con otros agentes, fármaco u hormonas.

Una composición farmacéutica también puede contener un portador farmacéuticamente aceptable para administración de un agente terapéutico. Tales portadores incluyen anticuerpos y otros polipéptidos, genes y otros agentes terapéuticos como liposomas, siempre y cuando el portador no provoque por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que está recibiendo la composición, y que puedan administrarse sin excesiva toxicidad. Portadores adecuados pueden ser macromoléculas que se metabolizan de manera lenta como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido y partículas inactivas de virus.

Pueden usarse sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácido mineral como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, y similares. En Remington's Pharmaceutical Science (Mack Pub. Co., NJ, 1991) encontramos una profunda descripción de portadores farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención pueden además contener uno o más agentes activos adicionales. Preferiblemente, el agente activo adicional se selecciona de ciclofosfamida (CTX), CLT4-Ig, rapamicina, ácido micofenólico, metilprednisona, FTY720, un agente bloqueador LFA-1, ICOS-Ig, un agente anti-apoptótico, un antagonista de función celular citolítica T, TACI-Ig o metotrexato.

Los portadores farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos como agua, salina, glicerol y etanol. Además, sustancias auxiliares como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias de búfer de ph y similares pueden estar presentes en dichas composiciones. Los portadores hacen posible que las composiciones farmacéuticas se formulen como pastillas, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, compuestos acuosos, suspensiones y demás para que el paciente las ingiera.

Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden administrarse directamente al sujeto. Los sujetos a ser tratados pueden ser animales; en particular, pueden tratarse sujetos humanos.

Las composiciones farmacéuticas utilizadas en esta invención pueden administrarse a través de varias rutas entre las que se incluye, aunque sin limitar, las aplicaciones orales, intravenosas, intramusculares, intraarteriales, intramedulares, intratraqueales, intraventriculares, intradérmicas o transcutáneas (ver, por ejemplo, WO 98/20734), medios subcutáneos, intraperitoneales, intranasales, enterales, tópicos, sublinguales, intravaginales o rectales. Pistolas de gen o hiposprays también pueden usarse para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Normalmente, las composiciones terapéuticas pueden prepararse como inyectables, ya sean como soluciones líquidas o como suspensiones; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para la solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección.

El envío directo de las composiciones se llevará a cabo generalmente a través de inyección, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o se enviará al espacio intersticio de un tejido. Las composiciones también pueden administrarse a una lesión. El tratamiento de la dosis puede consistir en un programa con una única dosis o en un programa con múltiples dosis.

Si la actividad del polipéptido de la invención es excesiva en un estado particular de la enfermedad varias técnicas se encuentran disponibles. Una técnica consiste en la administración a un sujeto de un compuesto inhibidor (antagonista) como se ha descrito anteriormente, junto con un portador farmacéuticamente aceptable en una cantidad efectiva para inhibir la función del polipéptido, para bloquear el enlace de ligandos, sustratos, enzimas, receptores, o inhibir una segunda señal, y paliar de este modo la condición anormal. Preferiblemente, tales antagonistas son anticuerpos. Más preferiblemente, tales anticuerpos son quiméricos y/o humanizados para minimizar su inmunogenicidad, tal y como se ha descrito previamente.

En otra técnica, pueden administrase formas solubles del polipéptido que retienen la afinidad de enlace para el ligando, sustrato, enzima, receptor en cuestión. Normalmente, el polipéptido puede administrarse en la forma de fragmentos que retienen las porciones relevantes.

En una técnica alternativa, la expresión del gen que codifica el polipéptido puede inhibirse usando técnicas bloqueadoras de expresión, como el uso de moléculas de ácido nucleico antisentido (descritas anteriormente), generadas internamente o administradas por separado. Las modificaciones de las expresiones del gen pueden obtenerse diseñando secuencias complementarias o moléculas antisentido (ADN, ARN, o APN) para las regiones control. 5', o reguladora (secuencia de señal, promotora, aumentadora e intrones) del gen que codifica el polipéptido. De manera similar, la inhibición puede llevarse a cabo usando la metodología con parejas de base "triple hélice". El emparejamiento triple hélice es útil porque provoca la inhibición de la habilidad de la doble hélice para abrirse lo suficiente como para enlazarse con las polimerasas, factores de transcripción, o moléculas reguladoras. Los avances terapéuticos recientes que han empleado ADN triple se han descrito en la diferente bibliografía (Gee, J. E. et al., (1994) In: Huber, B. E. y B. I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches; Futura Publishing Co, Mt. Kisco, NY). La secuencia complementaria o molécula antisentido también puede diseñarse para bloquear la translación de mARN evitando que la transcripción se enlace con los
ribosomas. Tales oligonucleótidos pueden administrarse o pueden generarse in situ a partir de la expresión in vivo.

Además, la expresión del polipéptido de la invención puede prevenirse usando ribozimas específicos a sus secuencia codificadora de mARN. Los ribozimas son ARNs catalíticamente activos que pueden ser naturales o sintéticos (ver por ejemplo, Usman, N. et al., Curr, Opin. Struct. Biol (1996) 6(4), 527-33). Los ribozimas sintéticos pueden diseñarse para dividir específicamente los mARNs en posiciones seleccionadas evitando de este modo la translación de los mARNs al polipéptido funcional. Los ribozimas pueden sintetizarse con un eje de fosfato de ribosa natural y bases naturales, y normalmente se encuentran en moléculas de ARN. De modo alternativo, los ribozimas pueden sintetizarse con ejes no naturales, por ejemplo, 2'-O-metil ARN, para proporcionar protección frente a la degradación de ribonucleasa y pueden contener bases modificadas.

Las moléculas de ARN pueden modificarse para aumentar la estabilidad celular y la vida media. Posibles modificaciones incluyendo, pero sin limitar, la adición de secuencias flanqueantes en los extremos 5' y/o 3' de la molécula y el uso de fosforotioato o 2'-O-metilo en lugar de uniones de fosfodiesterasa en el interior del eje de la molécula. Este concepto es inherente en la producción de APNs y puede extenderse a todas las moléculas mediante la inclusión de bases no tradicionales como inopina, quenosina y butosina, así como acetil-, metil-, tio- y formas similarmente modificadas de adenina, citidina, guanina, timina y uridina que no se reconocen fácilmente por parte de las edonucleasas endógenas.

Para tratar condiciones anormales relacionadas con la sub-expresión del polipéptido de la invención y su actividad, varias técnicas se encuentran disponibles. Una técnica consiste administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que active el polipéptido, es decir, un agonista como el descrito previamente, para disminuir la condición anormal. De modo alternativo, puede administrarse una cantidad terapéutica del polipéptido en combinación con un portador farmacéutico adecuado para reestablecer el equilibrio fisiológico relevante del polipéptido.

La terapia de genes puede emplease para efectuar la producción endógena del polipéptido por la acción de las células relevantes en el sujeto. La terapia de genes se usa para tratar permanentemente la producción inapropiada del polipéptido sustituyendo un gen defectuoso por un gen terapéutico corregido.

La terapia de genes puede darse in vivo o ex vivo. La terapia de genes ex vivo requiere el aislamiento y purificación de las células del paciente, la introducción de un gen terapéutico y la introducción de célula genéticamente alteradas de nuevo en el paciente. Sin embargo, la terapia de genes in vivo no requiere el aislamiento y purificación de las células del paciente.

El gen terapéutico normalmente se "empaqueta" para su administración al paciente. Los vehículos para envío de genes pueden ser no virales, como liposomas, o virus deficientes de réplica, como adenovirus tal y como lo describe Berkner, K. L, en Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 39-66 (1992) y vectores de virus asociados con adeno (AAV) tal y como los describe Muzyczka, N. en Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129 (1992) y la Patente de Estados Unidos N° 5,252,479. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la invención puede construirse para su expresión en un vector retroviral defectivo de réplica. Esta construcción expresiva puede a continuación aislarse e introducirse en una célula empaquetadoras transducida con un vector de plásmido retroviral que contiene ARN codificador del polipéptido, de tal modo que ahora la célula empaquetadora produce partículas virales infecciosas que contienen el gen de interés.

Estas células productoras pueden administrarse a un sujeto para la producción de células in vivo y expresión del polipéptido in vivo (ver Capítulo 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, (y referencias aquí citadas) en Human Molecular Genetics (1996), T Strachan y A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd).

Otra técnica es la administración de "ADN desnudo" en el que el gen terapéutico se inyecta directamente en el torrente sanguíneo o tejido muscular.

En situaciones en las que los polipéptidos o moléculas de ácido nucleico de la invención son agentes causantes de enfermedades, la invención establece que pueden usarse en vacunas para crear anticuerpos contra el agente que causa la enfermedad.

Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser profilácticas (es decir, previenen la infección) o terapéuticas (es decir, tratan la enfermedad después de la infección). Tales vacunas están formadas por antígenos inmunizadores, inmunogenes, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos, normalmente en combinación con portadores farmacéuticamente aceptables tal y como se ha descrito anteriormente, que incluyen cualquier portadora que no provoque por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición. Además, estos portadores pueden funcionar como agentes inmunoestimuladores ("adyuvantes"). Además, el antígeno o inmunogen puede conjugarse con un toxoide bacterial, como un toxoide de difteria, tétano, cólera, H. pyroli, y otros patóge-
nos.

Debido a que los polipéptidos pueden descomponerse en el estómago, la vacunas formadas por polipéptidos se administran preferentemente por vía parenteral (por ejemplo, mediante inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica). Formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones estériles acuosas o no acuosas para inyección que pueden contener antioxidantes, búferes, bacteriostatos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor, y suspensiones estériles acuosas o no acuosas que pueden incluir agentes suspensores o agentes espesantes.

Las formulaciones para vacuna de la invención pueden presentarse en envases de única dosis o múltiples dosis. Por ejemplo, ampollas selladas y viales y pueden almacenarse en condiciones de liofilización requiriendo solamente la adición del portador líquido inmediatamente antes de su uso. La dosis dependerá de la actividad específica de la vacuna y fácilmente se puede calcular mediante experimentos rutinarios.

El envío genético de anticuerpos que se enlazan con los polipéptidos de acuerdo con la invención puede también efectuarse, por ejemplo, tal y como se describe en la Solicitud de Patente Internacional WO 98/55607.

La tecnología referida como inyección con reactor (ver, por ejemplo, www.powderjet.com) puede también ser útil en la formulación de composiciones para vacunas.

La Solicitud de Patente Internacional WO 00/29428 describe un número de métodos adecuados de vacunación y sistemas de envío de vacunas.

Esta invención también hace referencia al uso de moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención como reagentes de diagnóstico. La detección de una forma mutada del gen caracterizado por las moléculas de ácido nucleico de la invención que se asocian con una disfunción proporcionará una herramienta de diagnóstico que puede añadir o definir un diagnóstico de una enfermedad, o propensión a una enfermedad, que da como resultado de una sub-expresión, sobre-expresión o expresión espacial o temporal alterada del gen. Los individuos que llevan a cabo mutaciones en el gen pueden detectarse en el nivel ADN a través de una variedad de técnicas.

Las moléculas de ácido nucleico para diagnóstico pueden obtenerse a partir de células de un sujeto, como de sangre, orina, saliva, biopsia de un tejido o material de autopsia. El ADN genómico puede usarse directamente para la detección o puede amplificarse enzimáticamente usando PCR, reacción en cadena de ligasa (LCR), amplificación con desplazamiento de cadena (SD), u otras técnicas de amplificación (ver Saiki et al., Nature, 324, 163-166 (1986); Bej, et al., Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol., 26, 301-334 (1991); Birkenmeyer et al., J. Virol. Meth., 35, 117-126 (1991); Van Brunt; J. Bio/Technology, 8, 291-294 (1990)) antes del análisis.

En una realización, este aspecto de la invención proporciona un método in vitro para diagnosticar una enfermedad en un paciente, que consiste en evaluar el nivel de expresión de un gen natural codificador de un polipéptido de acuerdo con la invención y en comparar dicho nivel de expresión con un nivel de control, donde un nivel diferente a dicho nivel de control es indicativo de enfermedad. El método puede constar de los siguientes pasos:

a)

poner en contacto una muestra de tejido de un paciente con una sonda de ácido nucleico bajo condiciones rigurosas que permitan la formación de un complejo híbrido entre una molécula de ácido nucleico de la invención y la sonda;

b)

poner en contacto una muestra de control con dicha sonda bajo las mismas condiciones usadas en el paso a);

c)

y detectar la presencia de complejos híbridos en dichas muestras;

donde la detección de niveles del complejo híbrido en la muestra del paciente que difieren de los niveles de complejo híbrido en la muestra de control es indicativo de enfermedad.

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Un aspecto adicional de la invención consiste en el método de diagnóstico que consiste en los siguientes pasos:

a)

obtener una muestra de tejido de un paciente que está siendo examinado por enfermedad;

b)

aislar una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención procedente de dicha muestra de tejido; y

c)

diagnosticar al paciente la enfermedad detectando la presencia de una mutación en la molécula de ácido nucleico que se asocia con la enfermedad.

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Para ayudar a la detección de moléculas de ácido nucleico en los métodos anteriormente descritos, puede incluirse un paso de amplificación, por ejemplo usando PCR.

Las eliminaciones y adiciones pueden detectarse por un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Las mutaciones de punto pueden identificarse sometiendo a hibridización ADN amplificado hasta ARN etiquetado de la invención o alternativamente, secuencias ADN antisentido etiquetadas de la invención. Las secuencias que encajan perfectamente pueden distinguirse a partir de las parejas que no encajan por digestión Rnasa o evaluando diferencias en la temperaturas de fundición. La presencia o ausencia de la mutación en la paciente puede detectarse poniendo en contacto ADN con una sonda de ácido nucleico que hibridiza con ADN bajo condiciones rigurosas para formar una molécula híbrida de doble cadena, teniendo la molécula híbrida de doble cadena una parte sin hibridizar de la cadena de sonda de ácido nucleico en un punto correspondiente a una mutación asociada con la enfermedad; y detectando al presencia o ausencia de una porción no hibridizada de la cadena de sonda como una indicación de la presencia o ausencia de una mutación asociada con la enfermedad en la parte correspondiente de la cadena de ADN.

Tales diagnósticos son particularmente útiles para pruebas prenatales o incluso neonatales.

Las mutaciones de punto y otras diferencias de secuencia entre el gen referencia y los genes "mutantes" pueden identificarse mediante otras técnicas bien conocidas, como secuencias directas de ADN o polimorfismo conformacional de cadena sencilla, (ver Orita et al., Genomics, 5, 874-879 (1989)). Por ejemplo, puede usarse una sonda secuenciadora con producto PCR de doble cadena o una molécula con plantilla de cadena sencilla generada por un PCR modificado. La determinación de secuencia se lleva a cabo mediante procedimientos convencionales con nucleótidos radioetiquetados o mediante procedimientos de secuencias automáticas con etiquetas fluorescentes. Los segmentos de ADN clonados pueden también usarse como sondas para detectar segmentos específicos de ADN. La sensibilidad de este método aumenta en gran medida cuando se combina con PCR. Además, las mutaciones de punto y otras variaciones secuenciales, como polimorfismos, pueden detectarse como se ha descrito previamente, por ejemplo, por medio del uso de oligonucleótidos específicos de alelos para amplificación PCR de secuencias que difieren en nucleótidos sencillos.

Las diferencias en secuencia de ADN también pueden detectarse mediante alteraciones en la movilidad electroforética de fragmentos de ADN en geles, con o sin agentes desnaturalizantes, o mediante secuencia directa de ADN (por ejemplo, Myers et al., Science (1985) 230:1242). Los cambios secuenciales en localizaciones específicas también pueden revelarse a través de ensayos con protección de nucleasa, como protección Rnasa o S1 o el método de división química (ver Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85: 4297-4401).

Además de electroforesis con gel convencional y secuenciación de ADN, mutaciones como microeliminaciones, aneuploidias, translocaciones, inversiones, también pueden detectarse a través de análisis in situ (ver, por ejemplo, Keller et al., DNA Probes, 2^{a} ed., Stockon Press, New York, N.Y, USA (1993)), es decir, las secuencias de ADN y ARN en células pueden analizarse para mutaciones sin la necesidad de sus aislamiento y/o inmovilización en una membrana. La hibridización con fluorescencia in situ (FISH) es en el presente el método más comúnmente aplicado y han aparecido numerosas críticas sobre FISH (ver, por ejemplo, Trachuck et al., Science, 250, 559-562 (1990), y Trask et al., Trenes, Genet., 7, 149-154 (1991)).

En otra realización de la invención, puede construirse un conjunto de sondas de oligonucleótido formadas pro una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención para llevar a cabo eficientes análisis de variantes genéticas, mutaciones y polimorfismos. Los métodos con tecnología se selección son bien conocidos y presentan una aplicación general para dirigirse a una variedad de cuestiones en genética molecular entre las que se incluyen expresión de gen, unión genética, y variabilidad genética (ver por ejemplo: M. Chee et al., Science (1996), Vol. 274, páginas 610-
613).

En una realización, la selección se prepara y usa de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud PCT WO 95/11995 (Chee et al.); Lockhart, D. J. et al. (1996) Nat. Biotech. 14: 1675-1680); y Schena, M. et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619). Las parejas de oligonucleótidos pueden ser desde dos hasta más de un millón. Los oligómeros se sintetizan en áreas designadas sobre un sustrato que utiliza un proceso químico dirigido a la luz. El sustrato puede ser papel, nylon u otro tipo de membrana, filtro, chip, portaobjetos de cristal o cualquier otro soporte sólido adecuado. En otro aspecto, un oligonucleótido puede sintetizarse sobre la superficie o sustrato usando un procedimiento de enlace químico y un aparato para aplicación con chorro de tinta, tal y como se describe en la Solicitud PCT WO 95/25116 (Baldeschweiler et al.). En otro aspecto, una selección "cuadriculada" análoga a una mancha con punto (o ranura) puede usarse para disponer y unir fragmentos de cADN u oligonucleótidos con la superficie de un sustrato usando un sistema de vacío, procedimientos con enlaces termales, UV, mecánicos o químicos. Una elección, como las descritas previamente, puede producirse manualmente o usando dispositivos disponibles (aparato con mancha de punto o mancha de ranura), materiales (cualquier soporte sólido adecuados), y máquinas (incluyendo instrumentos robóticas), y pueden contener 8, 24, 96, 384, 1536 o 6144 oligonucleótidos, o cualquier otro número entre dos y más de un millón que haga posible por sí mismo el uso de instrumentos disponibles en el mercado.

Además de los métodos anteriormente descritos, las enfermedades pueden diagnosticarse usando métodos que consisten en determinar, a partir de una muestra derivada de un sujeto, un nivel anormalmente superior o inferior de polipéptido o mARN. La mayor o menor expresión puede medirse en el nivel de ARN usando cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica para la cuantificación de nucleótidos, como, por ejemplo, amplificación de ácido nucleico, por ejemplo, PCR, RT-PCR, protección Rnasa, Northern blot y otros métodos de hibridización.

Técnicas de ensayo que pueden usarse para determinar los niveles de un polipéptido de la presente invención en una neutra derivada de un huésped son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica y se describen con más detalle a continuación (incluyendo radioinmunoensayos, ensayos de enlace competitivo, análisis de Western Blot y ensayos ELISA). Este aspecto de la invención se describe más tarde con una muestra biológica bajo condiciones adecuadas para la formación de un complejo ligando-polipéptido; y (b) detectando dicho complejo.

Los protocolos tales como ELISA, RIA, y FACS para medir los niveles de polipéptido pueden proporcionar además una base para el diagnóstico de niveles alterados o normales de expresión de polipéptido. Los valores normales o estándar para expresión del polipéptido se establecen combinando fluidos corporales o extractos celulares de sujetos mamíferos normales, preferiblemente humanos, con anticuerpo al polipéptido bajo condiciones adecuadas para la formación del complejo. La cantidad de formación del complejo estándar puede cuantificarse a través de varios métodos, como pueden ser los medios fotométricos.

Los anticuerpos que específicamente se enlazan con un polipéptido de la invención pueden usarse para el diagnóstico de condiciones o enfermedades caracterizadas por la expresión del polipéptido, o en ensayos para controlar a pacientes tratados con los polipéptidos, moléculas de ácido nucleico, ligandos y otros compuestos de la invención. Los anticuerpos útiles para fines de diagnóstico pueden prepararse de la misma manera que los descritos anteriormente para fines terapéuticos. Los ensayos de diagnóstico para el polipéptido incluyen métodos que utilizan el anticuerpo y una etiqueta para detectar el polipéptido en fluidos corporales humanos o en extractos de células o tejidos. Los anticuerpos pueden usarse con o sin modificación, y pueden etiquetarse uniéndolos, bien covalentemente o no covalentemente, con una molécula reportera. Pueden usarse una amplia variedad de moléculas reporteras conocidas en la técnica, muchas de las cuales se han descrito anteriormente.

Las cantidades del polipéptido expresado en las muestras del sujeto, control y enfermedad de los tejidos biopsiados se comparan con los valores estándar. La desviación entre los valores estándar y los del sujeto establece los parámetros para el diagnóstico de la enfermedad. Los ensayos de diagnóstico pueden usarse para distinguir entre ausencia, presencia y exceso de expresión de polipéptido y para controlar la regulación de los niveles de polipéptido durante la intervención terapéutica. Tales ensayos también pueden usarse para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento terapéutico particular en estudios animales, en ensayos clínicos o en el control del tratamiento de un paciente individual.

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Un kit de diagnóstico de la presente invención puede estar formado por:

(a)

una molécula de ácido nucleico de la presente invención;

(b)

un polipéptido de la presente invención; o

(c)

un ligando de la presente invención.

En un aspecto de la invención, un kit de diagnóstico puede estar formado por un envase que contiene una sonda de ácido nucleico que se hibridiza bajo rigurosas condiciones con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención; un segundo envase que contiene cebadores útiles para amplificar la molécula de ácido nucleico; e instrucciones para uso de la sonda y los cebadores para facilitar el diagnóstico de la enfermedad. El kit puede además incluir un tercer envase para sujetar un agente que digiera el ARN no hibridizado.

En un aspecto alternativo de la invención, un kit de diagnóstico puede estar formado por una selección de moléculas de ácido nucleico, donde al menos una puede ser una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención.

Para detectar el polipéptido de acuerdo con la invención, un kit de diagnóstico puede incluir uno o más anticuerpos que se enlazan con un polipéptido de la invención; y un reagente útil para la detección de una reacción de enlace entre el anticuerpo y el polipéptido.

Varios aspectos y realizaciones de la presente invención se describirán a continuación con más detalle a modo de ejemplo, con particular referencia a los polipéptidos INSP152.

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Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Diez principales resultados de BLASTp para secuencia de polipéptido INSP152 (SEQ ID NO: 26) contra base de datos NCB1-nr.

Figura 2: Alineación entre secuencia de polipéptido INSP152 (SEQ ID NO: 26) y precursor de proteína B inducida por hormona tiroide, una proteína de dominio MAM.

Figura 3: Predicción de péptido señalizador (SignalP V 2.0) para secuencia de polipéptido INSP152 (SEQ ID NO: 26).

Figura 4: INSP152 (SEQ ID NO: 80) mostrando los 9 dominios MAM y el dominio de la transmembrana. (Los 9 dominios MAM predichos en ncbi-CDD están sombreados. La región de transmembrana predicha está en negrita).

Figura 5: ADN y secuencia de proteína INSP152. El dominio 1 MAM predicho está subrayado. La posición y el sentido de los cebadores PCR (INSP152-CP1/INSP152-CP2 e INSP152-CP3/INSP152-CP4) están indicados por las flechas.

Figura 6: La secuencia de ADN del producto PCR INSP152-D1-SV1 clonado usando cebadores INSP152-CP3 e INSP152-CP4 y la translación de proteína. La posición y el sentido de los cebadores PCR están indicados por las flechas.

Figura 7: Alineación de las secuencias de proteínas INSP152-D1 e INSP152-D1-SV1.

Figura 8: Representación esquemática de los hechos de ensamblaje que llevan al montaje de las secuencias de proteínas INSP152-D1 e INSP152-D1-SV1.

Figura 9: Alineación de dominio esquemática de dominios LDL y MAM que contienen proteínas: precursor de glicoproteína endosomal apical de rata (AEGP, SwissProt Acc. No. Q63191), UNQ3001 humano (SwissProt Acc. No. AAQ88785) junto con INSP152 de longitud completa y el INSP152-D1 (INSP152-D1-SV1) clonado.

Figura 10: Expresión de INSP152 en tejidos humanos principales.

Figura 11: Expresión de INSP152 en tejidos humanos comparativos.

Figura 12: Expresión de INSP152 en colon e íleon humanos enfermos.

Figura 13: Resultados de ensayo de proliferación hMLR para INSP152-D1-SV1.

TABLA 1

2

TABLA 2

4

Ejemplos Ejemplo 1 Resultados de BLAST con Proteína INSP152

La secuencia de polipéptido INSP152 (SEQ ID NO: 26) se usó como secuencia de petición de BLAST proteína contra la base de datos de secuencia no redundante NCBI. La Figura 1 muestra los diez resultados principales para la petición BLAST, y la Figura 2 muestra la alineación de precursor de proteína B inducido por la hormona tiroides, una proteína de dominio MAM con INSP152 (SEQ ID NO: 26).

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Ejemplo 2 Secuencia señalizadora INSP152

La Figura 3 muestra que se predice INSP152 por poseer un péptido señalizador en el inicio de la proteína. Como muestra claramente los datos de la SeñalP en la Figura 3, se cree que el punto de división del péptido señalizador se encuentra entre los residuos 19 y 20 de la secuencia de polipéptido parcial INSP152 (Nielsen, H. et al., 1997, Protein Engineering, 10, 1-6; Nielsen H., y Krogh, A: Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden Markov model. En Proceedings of the Sixth Conference of Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AAAI Press, Menlo Park, California, páginas 122-130 (1998).

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Ejemplo 3 Localización de dominio

La Figura 4 muestra la localización del dominio de transmembrana tal y como lo predijo CDD así como la localización de los dominios 9 MAM.

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Ejemplo 4 Clonación de INSP152-D1-SV1 4.1 Preparación de muestra humanas cADN

La primera cadena de cADN se preparó a partir de una variedad de muestra de ARN de tejido humano (Clontech, Stratagene, Ambion, Biochain Institute y preparaciones internas) usando Superscript II o Superscript III ARNasa H Transcriptasa Inversa (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Para Superscript II: Cebador Oligo (dt)_{15} (1 \mul a 500 \mug/ml) (Promega), 2 \mug ARN humano total, 1 \mul 10 mM mezcla dNTP (10 mM individualmente de dATP, dGTP, dCTP y dTTP en pH neutro) y agua estéril destilada hasta un volumen final de 12 \mul se combinaron en un tubo Eppendorf de 1.5 ml, se calentó a 65°C durante 5 minutos y se enfrió en hielo. Los contenidos se recogieron mediante una centrifugación breve y se añadieron 4 \mul de Búfer 5X First-Srand, 2 \mul 0.1 M DTT, y 1 \mul Inhibidor Ribonucleasa Recombinante Rnasa OUT^{TM} (40 unidades/\mul, Invitrogen). Los contenidos del tubo se mezclaron con cuidado y se incubaron a 42°C durante 2 minutos, a continuación se añadieron 1 pl (200 unidades) de enzima Superscript II^{TM} y se mezcló con cuidado por medio de pipetas. La mezcla se incubó a 42°C y a continuación se inactivó calentando a 70°C durante 15 minutos. Para retirar el ARN complementario al cADN, se añadió 1 \mul (2 unidades) de Rnasa H \muE. coli\mu (Invitrogen) y la mezcla de reacción se incubó a 37°C durante 20 minutos.

Para Superscript III: CebadorOligo (dt)_{20} (50 \muM, Invitrogen), 2 \mug ARN humano total, 1 \mul 10 mM mezcla dNTP (10 mM individualmente de dATP, dGTP, dCTP y dTTP en pH neutro) y agua estéril destilada hasta un volumen final de 10 \mul se combinaron en un tubo Eppendorf de 1.5 ml, se calentó a 65°C durante 5 minutos y se enfrió en hielo. Para cada reacción RT se preparó una mezcla con síntesis cADN del siguiente modo: 2 \mul búfer 10X RT, 4 \mul 25 mM MgCl_{2}, 2 \mul 0.1 M DTT, 1 \mul Rnasa OUT^{TM} (40 unidades/\mul) y 1 \mul enzima RT Superscript II Tm se combinaron en un tubo separada y a continuación 10 \mul de esta mezcla se añadió al tubo que contenía la mezcla ARN/cebador. Los contenidos del tubo se mezclaron con cuidado, se recogieron mediante una breve centrifugación, y se incubaron a 50°C durante 50 minutos. La reacción finalizó con una incubación a 80°C durante 5 minutos y la mezcla de la reacción se enfrió a continuación sobre hielo y se recogió con centrifugación breve. Para retirar el ARN complementario al cADN, se añadió 1 \mul (2 unidades) de Rnasa H E. coli (Invitrogen) y la mezcla de reacción se incubó a 37°C durante 20 minutos.

La mezcla de la reacción final 2 \mul se diluyó añadiendo 179 \mul agua estéril para dar un volumen total de 200 \mul. Las muestras de ARN se combinaron en recipientes de tal como que cada recipiente contenía hasta cinco muestras diferentes de cADN. Se usaron 5 \mul de cada pozo de cADN como una plantilla para PCR en un volumen de reacción final de 50 \mul y ésta consistió en 1 \mul de cada muestra de cADN en el pozo. Esto representó aproximadamente 20 ng de cada plantilla individual de cADN.

4.2 Cebadores clonadores específicos de INSP152-D1 para PCR

Se diseñaron dos pares de cebadores PCR con una longitud de entre 18 y 30 bases para amplificar un fragmento de 595 bp del INSP152 predicho (INSP152-D1 (Dominio 1), desde el inicio del predicción hasta el final de primer dominio MAM predicho, usando Primer Designer Software (Scientific & Educational Software, PO Box 72045, Dirham, NC 27722-2045, USA). Los cebadores PCR se optimizaron para que tuvieran un Tm cercano a 55±10°C y un contenido GC de 40-60%. Los cebadores se seleccionaron con una elevada selectividad para la secuencia objetivo (INSP152) con muy poca o ninguna cebadura. Los cebadores se diseñaron para formar dos pares anidados de modo que los cebadores INSP152-CP3/INSP152-CP4 se encuentren posicionados ligeramente internos a los cebadores INSP152-CP1/ INSP152-CP2.

4.3 Amplificación PCR de INSP152-D1 de plantillas de cADN humano

Los cebadores clonadores específicos de gen INSP152-CP1 e INSP152-CP2 (Tabla 3, Figura 5) se diseñaron para amplificar un fragmento de 595 bp que contenía la secuencia completa INSP152 del dominio 1. La pareja cebadora se usó con los pozos de las muestras de cADN humano descritas anteriormente como plantillas de PCR. Este PCRI se llevó a cabo en un volumen final de 50 \mul que contenía búfer IX AmpliTaq^{TM}, 200 \muM dNTPs, 50 pmoles de INSP152-CP1, 50 pmoles de INSP152-CP2, 2.5 unidades de AmpliTaq^{TM} (Applied Biosystems) y aproximadamente 100 ng de cADN de Pozo usando un Motor de ADN de Investigación MJ, programado del siguiente modo: 94°C, 2 minutos; 40 ciclos de 94°C, 1 minuto, 60°C, 1 minuto, y 72°C, 1 minuto; le siguió un ciclo a 72°C durante 7 minutos y un ciclo de mantenimiento a 4°C.

A continuación, cada producto PCR se usó como plantilla para PCR2 usando los cebadores de amplificación INSP152-CP3 e INSP152-CP4 (Tabla 3, Figura 5, Figura 6, Figura 7) diseñados para amplificar un fragmento cADN de 546 bp en el interior del producto INSP152-CPI/INSP152-CP2. PCR2 se llevó a cabo en un volumen final de 50 \mul que contenía búfer 1X AmpliTaq^{TM}, 200 pM dNTPs, 50 pmoles de INSP152-CP3, 50 pmoles de INSP152-CP4, 2.5 unidades de AmpliTaq^{TM} (Applied Biosystems) y 1 \mul de producto PCR1. Los ciclos se llevaron a cabo usando un Motor de ADN de Investigación MJ, programado del siguiente modo: 94°C, 2 minutos; 40 ciclos de 94°C, 1 minuto, 57°C, 1 minuto, y 72°C, 1 minuto; le siguió un ciclo a 72°C durante 7 minutos y un ciclo de mantenimiento a 4°C.

30 \mul de cada producto de amplificación PCR1 y PCR2 se visualizó sobre un gel de agarosa 0.8% en búfer 1X TAE (Invitrogen). Los productos del peso molecular aproximadamente esperado se purificaron del gel usando Wizard PCR DNA Purification System (Promega) y se eluyó en 50 \mul de agua, o el MinElute DNA Purification System (Qiagen) y se eluyó en 10 \mul de búfer EB (10 mM Tris, CI, pH 8.5). Los productos purificados se suclonaron directamente.

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4.4 Subclonación de Productos PCR

Los productos PCR se subclonaron en el vector de clonación modificado topoisomerasa I (pCR4-TOPO) usando el kit de clonación TA adquirido en la Corporación Invitrogen usando las condiciones específicas por el fabricante. En resumen, 4 \mul de producto PCR gel purificado se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente con 1 \mul de vector TOPO y 1 \mul de solución salina. La mezcla de la reacción se transformó a continuación en cepa TOP10 E. coli (Invitrogen) del siguiente modo: una alícuota de 50 \mul de células One Shot TOP10 se derritió en hielo y se añadió 2 \mul de reacción TOPO. La mezcla se incubó durante 15 minutos en hielo y a continuación se golpeó con calor mediante incubación a 42°C durante exactamente 30 segundos. Las muestras se devolvieron al hielo y se añadieron 250 \mul de medio SOC templado (a temperatura ambiente). Las muestras se incubaron con agitación (220 rpm) durante 1 hora a 37°C. La mezcla de la transformación se emplató a continuación sobre placas L-broth (LB) que contenían ampicilina (100 \mug/ml) y se incubaron durante la noche a 37°C.

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4.5 PCR de Colonia

Las colonias fueron inoculadas en 50 \mul de agua estéril usando un palillo estéril. Una alícuota de 10 \mul del inóculo se sometió a continuación a PCR en una volumen total de reacción de 20 \mul que contenían búfer IX AmpliTaq^{TM}, 200 \muM dNTPs, 20 pmoles de cebadores T7, 20 pmoles del cebador T3, 1 unidad de AmpliTaq^{TM} (Applied Biosystems) usando un Motor de ADN de Investigación MJ. Las condiciones del ciclo fueron las siguientes: 94°C, 2 minutos; 30 ciclos de 94°C, 30 segundos, 48°C, 30 segundos y 72°C, 1 minuto. Las muestras se mantuvieron a 4°C (ciclo de mantenimiento) antes de realizar más análisis.

Los productos PCR se analizaron en geles de agarosa 1% en búfer IX TAE. Las cotonas que dieron productos PCR con el peso molecular aproximadamente esperado (595 bp o 546 bp + 105 bp debido al punto de clonación múltiple (MCS)) crecieron durante la noche a 37°C en 5 ml de L-Broth (LB) que contenía ampicilina (100 \mug/ml) con agitación a 220 rpm.

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4.6 Preparación y Secuencia de ADN Plásmido

El ADN plásmido miniprep se preparó a partir de 5 ml de cultivos usando el sistema robótico Biorobot 8000 (Qiagen) o el kit Wizard Plus Sv Minipreps (Promega, número de catálogo 1460) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN plásmido se eluyó en 80 \mul de agua estéril. La concentración de ADN se midió usando un fotómetro Eppendorf BO o fotómetro Spectramax 190 (Molecular Devices). El ADN plásmido (200-500 ng) se sometió a secuenciación de ADN con los cebadores de secuencia T7 y T3 (Tabla 3) usando el sistema BigDye Terminador (Applied Biosystems, número 4390246) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones de la secuencia se purificaron usando columnas Dye-Ex (Qiagen) o placas de limpieza Montage SEQ 96 (Millipore número LSK09624) y a continuación se analizaron sobre un secuenciador 3700 de Applied Biosystems.

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TABLA 3 INSPI52-D1 donación y cebadores de secuencia

5

TABLA 3 (continuación)

6

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Ejemplo 5 Expresión y Purificación de INSP152

A continuación pueden llevarse a cabo más experimentos para determinar la distribución del tejido y los niveles de expresión del polipéptido INSP152 in vivo, en base a nucleótido y secuencia de aminoácido aquí descrita.

La presencia de las transcripciones para INSP152 puede investigarse con PCR de cADN de diferentes tejidos humanos. Las transcripciones INSP152 pueden estar presentes en niveles muy bajos en las muestras testadas. Por lo tanto, es preciso extremar el cuidado en el diseño de experimentos para establecer la presencia de una transcripción en varios tejidos humanos ya que una pequeña cantidad de contaminación genómica en la preparación de ARN proporcionará un resultado falso negativo. Por consiguiente, todos los ARN deberían tratarse con ADNasa antes de su uso para transcripción inversa. Además, para cada tejido puede establecerse una reacción de control en la que no se lleve a cabo transcripción inversa (un control -ve RT).

Por ejemplo, 1 \mul de ARN total de cada tejido puede usarse para generar cADN usado transcriptasa inversa Multiscript (ABI) y cebadores hexámeros aleatorios. Para cada tejido, se establece una reacción de control en la que se añaden todos los constituyentes excepto la transcriptasa inversa (control -ve RT). Las reacciones PCR se establecen para cada tejido sobre las muestras de ARN transcritas inversas y los controles menos RT. Cebadores específicos de INSP152 pueden diseñarse de manera sencilla en base a la información de secuencia aquí provista. La presencia de un producto de peso molecular correcto en la muestra transcrita inversa junto con la ausencia de un producto en el control menos RT puede considerase como evidencia de la presencia de una transcripción en el tejido. Puede emplearse cualquier biblioteca adecuada de cADN para analizar las transcripciones INSP152, no solo las generadas como se ha descrito previamente.

El patrón de distribución en el tejido de los polipéptidos INSP152 proporcionará información útil adicional en relación con la función de los polipéptidos.

Además, ahora pueden llevarse a cabo más experimentos usando vectores de expresión. La transfección de líneas celulares de mamíferos con tales vectores puede posibilitar la expresión de elevado nivel de los polipéptidos INSP152 y de este modo permitir la continua investigación de las características funcionales de los polipéptidos INSP152. Los siguientes materiales y métodos son un ejemplo de los adecuados en tales experimentos:

Cultivo Celular

293 células de riñón embriónico humano que expresan el antígeno nuclear del virus Epstein-Barr (HEK293-EBNA, Invitrogen) se mantienen en suspensión en un medio libre de suero Ex - cell VPRO (reserva de semillas, medio de mantenimiento, JRH). De 16 a 20 horas antes de la transfección (Día -1) las células se cultivan en frascos 2 x T225 (50 ml por frasco en DMEM/F12 (1:1) que contienen 2% FBS medio de cultivo (JRH) en una densidad de 2x10^{5} células/ml). Al siguiente día (día de transfección), tiene lugar la transfección usando el reagente JetPEITM (2 \mul/ \mug de ADN plásmido, transfección Poly-Plus). Para cada frasco, el ADN plásmido es transfectado con ADN de GFP (gen fluorescente reportero). La mezcla de la transfección se añade a continuación a los frascos 2 x T225 y se incuba a 37°C (5%CO_{2}) durante 6 días.

La confirmación de transfección positiva puede llevarse a cabo con un examen cualitativo de fluorescencia el Día 1 y el Día 6 (Axiovert 10 Zeiss).

El día 6 (Día de la Cosecha), los sobrenadantes de los dos frascos se colocan en pozos y se centrifugan (por ejemplo, 4°C, 400 g.) y se colocan en un recipiente que sostiene un único identificador. Se mantiene una alícuota (500 \mul) para QC de la proteína etiquetada 6 His (bioproceso interno QC).

Los lotes a gran escala pueden producirse mediante el siguiente protocolo llamado "transfección PEI de células en suspensión", cuya referencia es BP/PEI/HH/02/04 con Polietileneimina de Polysciences como agente de transfección.

Proceso de Purificación

La muestra en el medio de cultivo que contiene la proteína recombinante con una etiqueta 6His en la terminal C se diluye con búfer frío A (50 mM NaH2PO_{4}; 600 mM NaCl; 8.7% (w/v) glicerol, pH 7.5). La muestra se filtra a través de un filtro estéril (Millipore) y se mantiene a 4°C en una botella cuadrada en un medio estéril (Nalgene).

La purificación se lleva a cabo a 4°C sobre la terminal de trabajo (Applied Biosystems) conectada a un cargador automático de muestras (Labomatic). El procedimiento de purificación está compuesto por dos pasos secuénciales, la cromatografía por afinidad metálica sobre una columna Poros 20 MC (Applied Biosystems) cargada con iones Ni (4.6 x 50 mm, 0.83 ml), seguida de filtración de gel sobre una columna en medio Sephadex G-25 (Amersham Pharmacia) (1.0 x 10 cm).

Para el primer paso de cromatografía, la columna de afinidad metálica se regenera con 30 volúmenes de columna de solución EDTA (100 mM EDTA; 1 M NaCl; pH 8.0), se recarga con iones Ni a través de un lavado con 15 volúmenes de columna de una solución 100 mM NiSO_{4}, se lava con 10 volúmenes de columna de búfer A, seguido de 7 volúmenes de columna de búfer B (50 mM NaH_{2}PO_{4}; 600 mM NaCl; 8.7% (w/v) glicerol, 400 mM; imidazola, pH 7.5) y finalmente se equilibra con 15 volúmenes de columna de búfer A que contiene 15 mM imidazola. La muestra se transfiere, mediante el cargador de muestra Labomatic, a un circuito cerrado para muestra y a continuación se carga en la columna de afinidad metálica Ni a una velocidad de flujo de 10 ml/min. La columna se lava con 12 volúmenes de columna de búfer A, seguido de 28 volúmenes de columna de búfer A que contiene 20 mM de imidazola. Durante el lavado con 20 mM de imidazola, las proteínas contaminantes ligeramente unidas se eluyen de la columna. La proteína recombinante con etiqueta His se eluye finalmente con 10 volúmenes de columna de búfer B a una velocidad de flujo de 2 ml/min, y se recoge la proteína eluida.

Para el segundo paso de cromatografía, la columna Sephadex G-25 con filtración de gel se regenera con 2 ml de búfer D (1.137 M NaCl; 2.7 mM KCl; 1.5 mM KH_{2}PO_{4}; 8 mM Na_{2}HPO_{4}; pH 7.2), y a continuación se equilibró con 4 volúmenes de columna de búfer C (137 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 1.5 mM KH_{2}PO_{4}; 8 mM Na_{2}HPO_{4}; 20% (w/v) glicerol; pH 7.4). La fracción del pico eluida de la columna N se carga automáticamente en la columna Sephadex G-25 por medio de el cargador integrado de muestra sobre VISION y la proteína se eluye con el búfer C a una velocidad de flujo de 2 ml/min. La fracción se filtra a través de un filtro de centrifugación estéril (Millipore), se congela y almacena a -80°C. Una alícuota de la muestra se analiza en Western Blot SDS-PAGE (4-12% gel NuPAGE; Novex) con anticuerpos anti-His. El gel NuPAGE puede estar teñido en un 0.1% azul de coomassie R250 tintando la solución (30% metanol, 10% ácido acético) a temperatura ambiente durante una hora y a continuación se destiñe en 20% metanol, 7.5% ácido acético hasta que el fondo está claro y las bandas de proteínas sean claramente visibles.

Tras la electroforesis, las proteínas se electro-transfieren del gel a una membrana de nitrocelulosas. La membrana se bloquea con 5% polvo de leche en búfer E (137 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 1.5 mM KH_{2}PO_{4}; 8 mM Na_{2}HPO_{4}; 0.1% Tween 20; pH 7.4) durante una hora a temperatura ambiente, y a continuación se incuba con una mezcla de 2 anticuerpos anti-His policlonales de conejo (G-18 y H15, 0.2 \mug/ml cada uno; Santa Cruz) en 2.5% polvo de leche en búfer E durante la noche a 4°C. Tras una hora adicional de incubación a temperatura ambiente, la membrana se lava con búfer E (3 x 10 min.) y a continuación se incuba con un anticuerpo secundario conjugado con HRP y anti-conejo (DAKO, HRP 0399) diluido 1/3000 en búfer E que contiene 2.5% polvo de leche durante 2 horas a temperatura ambiente. Tras un lavado con búfer E (3 x 10 minutos), la membrana se desarrolla con el kit ECL (Amersham Pharmacia) durante un minuto. La membrana se expone a continuación a una Hipercapa(Amersham Pharmaci), la capa se desarrolla y la imagen del western blot se analiza visualmente.

Para muestras que demostraron bandas proteicas detectables por la tinción con Coomassie, la concentración de proteica puede determinarse usando el kit de ensayo de proteína BCA (Pierce) con albúmina de suero bovino como estándar.

Además, la sobreexpresión o la caída de la expresión de los polipéptidos en líneas celulares puede usarse para determinar el efecto sobre la activación transcripcional del genoma de la célula huésped. Los patrones de dimerisación, los co-activadores y co-represores de los polipéptidos INSP152 pueden identificarse mediante inmunoprecipitación combinada con Western Blot e inmunoprecipitación combinada con espectroscopia de masa.

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Ejemplo 6 Análisis de niveles de expresión de gen INSP152 por análisis Taíman

El ARN total de cada muestra se transcribió de manera inversa usando el sistema de síntesis Supercript III First-Strand para RT-PCR (Invitrogen, Número Cat. 18080-051) en un volumen final de reacción de 20 \mul. 2 \mug del ARN total se recombinaron con 50 ng de cebadores hexámeros aleatorios, 10 mM cada uno de dATP, dGTP, dCTP, y dTTP, y agua tratada con DEPC en un volumen de 10 \mul. La mezcla se incubó a 65°C durante 5 minutos y a continuación se congeló en hielo durante 1 minutos. La siguiente mezcla de síntesis con 10 \mul de ADN se preparó en un tubo separado: 2 \mul 10X búfer RT, 4 \mul 25 mM MgCl2; 2 \mul 0.1M DTT, 1 \mul RnaseOUT^{TM} (40 unidades/\mul), y 1 \mul Superscript^{TM} III enzima RT (200 unidades/\mul). La mezcla con la síntesis de ADN se añadió a la mezcla ARN/cebador, se mezcló cuidadosamente y se incubó a 25°C durante 10 minutos y a continuación a 50°C durante 50 minutos. La enzima RT se inactivó a continuación con incubación a 85°C durante 5 minutos. La mezcla se enfrió en hielo y a continuación se añadió 1 \mul de E. coli Rnase H (2 unidades/\mul) y la mezcla se incubó a 37°C durante 20 minutos. La mezcla se enfrió en hielo y a continuación se diluyó 1/250 con agua estéril. Las diluciones de la reacción con transcriptasa inversa se sometieron a continuación a análisis PCR a tiempo real sobre un instrumento Taíman (PE Biosystems 7700).

Los cebadores PCR para INSP152 humano y el control del gen gliceraldehído 3-fosfato dehidrogenasa (GAPDH) se diseñaron usando el software Primer Express (PE Biosystems). Los cebadores PCR para INSP152 se diseñaron con el cebador adelantado en el exón 4 y el cebador inverso en el exón 5. Estos cebadores no distinguirán entre INSP152 de la predicción y el INSP152-SV1-D1 clonado. Las consecuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 4. La especificidad y la concentración óptima del cebador que se usa en el análisis Taíman se determinaron testando los cebadores específicos del gen INSP152 sobre una serie de diluciones de plásmido EAK12 d-PAC_INSP 152-D1-SV1-6HIS-V1. La contaminación de ADN genómico potencial del cADN se excluyó llevando a cabo reacciones PCR usando cebadores específicos para secuencia intrónica GAPDH. La ausencia de amplificación no específica se controló analizando los productos PCR sobre 4% geles de agarosa para asegurar la producción de una sola banda del peso molecular esperado.

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TABLA 4 Secuencias de Cebador PCR TaqMan

7

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Las reacciones PCR a tiempo real de SYBR Verde se llevaron a cabo en un volumen de reacción de 50 \mul que contenía 25 \mul de una mezcla maestra de SYBR Verde PCR (PE Biosystems) (a la cual se habían añadido previamente 0.5 unidades de AmpErase Uracil N-Glicosilasa (UNG, PE Biosystems)), 300 nM individualmente de cebador de amplificación y 5 \mul de producto RT-PCR. Los ciclos se llevaron a cabo usando el sistema de detección ABI PRISM 7700 (Taíman) programado del siguiente modo: 1 ciclo de 50°C durante 2 minutos; 1 ciclo de 90°C durante 10 minutos; 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos, 60°C durante 1 minuto. Cada reacción se realizó por duplicado y se calculó un promedio con los resultados.

Las regiones específicas del cebador de las muestras de cADN transcritas a la inversa se amplificaron a continuación y sus valores de umbral o límite de ciclo (Ct) fueron determinados. El valor Ct para cada muestra de cADN fue normalizado con el del gen GAPDH de organización de la siguiente manera. La diferencia en el nivel de expresión entre el gen GAPDH y el gen INSP152 en cada muestra de cADN se expresó como una diferencia en el valor Ct, es decir, Delta (\delta) Ct=Ct(GAPDH) - Ct (INSP152). Los resultados de cada muestra se expresaron como una diferencia de pliegue en el número de ciclos requeridos para la expresión de gen detectable INSP152 en relación con los de GAPDH, de acuerdo con la fórmula Diferencia de Pliegue = 2^{(-\delta ct)}. Finalmente, el nivel de expresión del gen INSP152 en cada muestra de cADN fue mostrada en relación con el nivel de expresión del gen GAPDH, donde el nivel de expresión de GAPDH = 100% dividiendo 100 entre la Diferencia de Pliegue para INSP152.

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Resultados

Los cebadores de INSP152 fueron testados sobre un panel de muestras normales y enfermas de tejido humano que contenían 23 órganos principales; 21 tejidos segregadores e inmunes; 43 células primarias y líneas celulares de origen no-leucoítico, inmunes y CNS y biopsias de colon e íleo de enfermedad de Crohn (CD) (22 muestras), colitis de úlcera (UC) (7 muestras) y colon e íleo normal (N) procedentes de pacientes que fueron sometidos a operación de intestino (13 muestras). Los resultados se muestran en las tablas 5, 6 y 7 y se representan gráficamente en las figuras 10, 11 y 12. INSP152 se encontró bajo el límite de detección en todas las muestras testadas excepto en el intestino delgado (3.94% de GAPDH) (Figura 10), un única muestra de pulmón con lupus (3.06% de GAPDH) (Figura 11) y en 12/22 muestras de biopsia de enfermedad de Crohn (Figura 12). Las 12 muestras CD positivas fueron todas de biopsias ileales.

Conclusión

Los resultados de la expresión muestran una inesperada expresión restringida de INSP152 en el intestino delgado (tabla 5 y figura 10), en una única muestra de lupus (tabla 6 y figura 11), y en 12/22 muestras de biopsia de enfermedad de Crohn (tabla 7 y figura 12). Excepto en una muestra normal (5.09% de GAPDH), todas las biopsias de colon e íleo normales estuvieron por debajo del 0.8% de GAPDH.

Este patrón específico de expresión lleva a la conclusión de que la participación de INSP152, preferiblemente INSP152-D1-SV1, en enfermedades del intestino delgado, preferiblemente enfermedad de Crohn, enfermedad del intestino delgado, enfermedad inflamatorio de intestino, enfermedad celiaca, enfermedad de Whipple, neoplasia y diarrea. Estas propiedades sorprendentes que caracterizan los polinucleótidos o los correspondientes polipéptido de la presente invención son particularmente útiles para la preparación de un fármaco o una composición farmacéutica. Los polinucleótido o los correspondientes polipéptidos de la presente invención muestran por lo tanto el inesperado hallazgo de una expresión restringida en tejidos específicos.

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TABLA 5 Expresión de INSP152 tejidos humanos principales medida por RT-PCR (TaqMan)

8

TABLA 6 Expresión de INSP152 en tejidos humanos comparatives medida por RT-PCR (TaqMan)

10

TABLA 7 Expresión de INSP152 en colon e íleo dañado medida por RT-PCR (TaqMan)

12

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Ejemplo 7 Reacción con Linfocito Mezclado Humano (hMLR): proliferación y secreción de citoquinas

Este ensayo con base celular está dirigido a una célula T específica de antígeno y al antígeno que presenta funciones celulares tras la estimulación por PBMC de otro donante (aloreactividad). Estas respuestas celulares son cruciales en enfermedades inflamatorias y autoinmunes. Este ensayo permite la identificación de compuestos que tienen un efecto sobre la proliferación de linfocitos y/o secreción de citoquinas.

Analizando la secreción de citoquinas en este ensayo, podemos revelar si un compuesto es capaz de mover la proliferación de los linfocitos T a un fenotipo TH-1 o TH-2.

Como ejemplo, la esclerosis múltiple se asocia con un perfil de citoquina Th-1 (por ejemplo, \gamma-IFN, IL-2, TNF-\alpha). Con este ensayo, sería posible identificar los compuestos, que podrían inhibir la producción de citoquina pro-inflamatoria TH-1 o las citoquinas anti-inflamatorias provocadas TH-2.

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Ensayo de Proliferación hMLR para determinación de respuesta en dosis - diseño experimental

Se añadieron 10^{5} células estimuladas (S), 2x10^{5} células de respuesta (R) y la proteína diluida de interés, es decir, INSP152-D1-SV1 o CTLA4-Ig como un control positivo, (comenzando con una dilución 2% glicerol hasta un máximo después de siete diluciones 1/3) en un medio completo (DMEM F12, GIBCO, Invitrogen Corporation, complementado con 10% FCS, CANSERA inactivado 50' a 56°C, 10% L-Glutamina GIBCO, Invitrogen Corporation, 10% \beta-mercapoetanol, FLUKA y 10% Penicilina/Estreptomicina, GIBCO, Invitrogen Corporation) a una placa con 96 pozos, con fondo redondo (COSTAR). Se llevaron a cabo cuatro controles. El control positivo consistió en la mezcla de célula S y R, el control de inhibición en mezcla de células S y R con Ciclosporina A 10_{-6} M (ALEXIS) y los dos últimos controles en solamente células S y solamente células R (control negativo).

Las células fueron puestas en cultivo (37°C) durante cuatro días. El día 3 se añadió 1 \muCi/pozo de ^{3}H-Timidina (AMERSHAM). El día 4, las placas fueron cosechadas (OptiPhase "Hisafe"2, cocktail de escintilación líquida, Perkin Elmer Life Sciences 1295-004 y cosechador de 96 pozos Betaplate^{TM}, Wallac) y se contabilizaron las radiaciones \beta (contador de escintilación líquida 1205 Betaplate^{TM}, Wallac). Como alternativa, 1 \muCi/pozo de ^{3}H-Timidina (AMERSHAM) se añadió el día 4 durante 6 horas.

Formato de la Placa

14

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Conclusión

Los resultados (Figura 13) muestran de manera sorprendente que INSP152-D1-SV1 es un potente inhibidor de linfocitos, preferiblemente de células T. Como tal, INSP152-D1-SV1 muestra una actividad funcional similar a la de CTLA4-Ig. Estas propiedades sorprendentes que caracterizan los polinucleótidos o los correspondientes polipéptido de la presente invención son particularmente útiles para la preparación de un fármaco o una composición farmacéutica.

CTLA4Ig es una proteína quimérica soluble que consiste en el dominio extracelular de CTLA4 humano y un fragmento de la porción Fc de IgG1 humano. Se enlaza con las moléculas B7-1 y B7-2 o células presentes en el antígeno (APCs) y bloquea de este modo la señal co-estimuladora mediada por CD28 para la activación de célula T suprime así mismo la respuesta de la célula B.

La actividad biológica de CTLA4-Ig ha sido demostrada en una variedad de modelos animales para transplante y auto-inmunidad. CTLA4-Ig también ha estado implicado o se ha usado en muchas enfermedades (ver por ejemplo Davidson et al., Block and Tackle: CTLA4-Ig en lupus. Lupus. 2005; 14(3):197-203). Por ejemplo, Bristol-Mayer Squibb desarrolló abatacept para el tratamiento de esclerosis múltiple, soriasis, artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso, rechazo al transplante, enfermedad del huésped frente al injerto. Repligen Corp desarrolló RG-1046 para el tratamiento de púrpura trombocitopénica, esclerosis mútliples, artritis reumatoide y enfermedad de huésped frente a injerto.

Como tales, los polipéptidos de la presente invención, preferiblemente INSP152-D1-SV1 son útiles para el tratamiento de enfermedades relacionadas con CTLA4-Ig. INSP152-D1-SV1 es útil por sí mismo, como componente de proteínas de fusión como fusión Fc, y/o en combinación con otro agente.

<110> ARES TRADING SA

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<120> Proteína que contiene dominio MAM

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<130> P038837WO

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<150> GB 0423126.2

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<151> 2004-10-18

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<160> 41

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<170> SeqWin99, versión 1.02

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<210> 1

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<211> 531

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

15

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<210> 2

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<211> 177

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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16

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<210> 3

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<211> 569

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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17

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<210> 4

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<211> 189

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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18

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<210> 5

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<211> 598

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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19

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<210> 6

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<211> 198

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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20

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<210> 7

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<211> 5997

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

21

22

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<210> 8

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<211> 1999

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

23

24

25

26

27

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<210> 9

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<211> 6051

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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28

29

30

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<210> 10

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<211> 2017

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

31

32

33

34

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<210> 11

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<211> 6326

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 11

35

36

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<210> 12

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<211> 2026

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 12

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37

38

39

40

41

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<210> 13

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<211> 6243

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 13

42

43

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<210> 14

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<211> 2081

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 14

45

46

47

48

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<210> 15

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<211> 6297

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 15

50

51

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<210> 16

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<211> 2099

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 16

52

54

55

56

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<210> 17

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<211> 6326

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 17

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57

58

59

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<210> 18

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<211> 2108

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 18

60

61

62

63

64

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<210> 19

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<211> 588

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 19

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65

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<210> 20

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<211> 196

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 20

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66

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<210> 21

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<211> 626

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 21

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67

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<210> 22

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<211> 208

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 22

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68

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<210> 23

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<211> 6054

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 23

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69

70

71

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<210> 24

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<211> 2018

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 24

72

73

74

75

76

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<210> 25

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<211> 6300

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 25

77

78

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<210> 26

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<211> 2100

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 26

79

80

81

82

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<210> 27

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<211> 6354

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 27

83

84

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<210> 28

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<211> 2118

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 28

85

86

87

88

89

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<210> 29

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<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de unión para proteína de fusión

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador INSP152-CP1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgaatgaaa ctttttgttg cctttgg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador INSP152-CP2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaagcagcc tgaactgaaa ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador INSP152-CP3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attgcctgtg ttttcaattc tac

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador 1NSP152-CP4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatatcatca atagcaatga cttc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador T7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taatacgact cactatagg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador T3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attaaccctc actaaagg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador h-INSP 152-D1-SV1-519F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggagagaaat gtcatcaaaa tcca

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador h-INSP152-D1-SV1-584R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccatttgac cttcaaaaac aac

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador hGAPDH-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccacccatgg caaattcc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador hGAPDH-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgggattt ccattgatga ca

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Intron-hGAPDH-F

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctagtccca gggctttgat t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador Intron-hGAPDH-R

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgtgctccc actcctgatt t

\hfill

21

Claims (35)

1. Un polipéptido que está formado por la secuencia de aminoácido tal y como se indica en la SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 4, y que actúa como un inhibidor de linfocitos.

2. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, donde el polipéptido se selecciona del grupo consistente en la secuencia de aminoácido tal y como se indica en la SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16; y/o SEQ ID NO: 18.

3. El polipéptido de la reivindicación 1 o reivindicación 2, donde dicho polipéptido está formado por una etiqueta de histidina.

4. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho polipéptido está formado por un péptido señalizador.

5. El polipéptido de la reivindicación 4, cuya secuencia es como la indicada en SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 26; y/o SEQ ID NO: 28.

6. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

7. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 6, que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 22.

8. Una molécula purificada de ácido nucleico que codifica un polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones anteriores.

9. Una molécula purificada de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8, que está formado o consiste en la secuencia de ácido nucleico tal y como se indica en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 y/o SEQ ID NO: 27.

10. Una molécula purificada de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 8 o reivindicación 9 que consiste en la secuencia de ácido nucleico tal y como se indica en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 y/o SEQ ID NO: 27.

11. Un vector que consiste en una molécula de ácido nucleico como la indicada en las reivindicaciones 8 a 10.

12. Una célula huésped aislada transformada con un vector de acuerdo con la reivindicación 11.

13. Un ligando que se enlaza específicamente con el dominio MAM que contiene la proteína de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7 y que es un anticuerpo.

14. Un polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, una molécula de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 8 a 10, un vector de acuerdo con la reivindicación 11, una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 12, o un ligando de acuerdo con la reivindicación 13, para uso en la terapia o diagnóstico de una enfermedad.

15. Un método in vitro de diagnóstico de una enfermedad en un paciente, que consiste en evaluar el nivel de expresión de un gen natural que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o evaluar la actividad de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el tejido de dicho paciente y comparar dicho nivel de expresión o actividad con un nivel de control, donde el nivel que es diferente a dicho nivel de control es indicativo de enfermedad.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 15, que consiste en los siguientes pasos: (a) poner en contacto un ligando de acuerdo con la reivindicación 13 con una muestra biológica bajo condiciones adecuadas para la formación de un complejo ligando-polipéptido; y (b) detectar dicho complejo.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 15, que consiste en los siguientes pasos:

a)

poner en contacto una muestra de tejido de un paciente con una sonda de ácido nucleico bajo condiciones rigurosas que permitan la formación de un complejo híbrido entre una molécula de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 8 a 10 y la sonda;

b)

poner en contacto una muestra de control con dicha sonda bajo las mismas condiciones usadas en el paso a); y

c)

detectar la presencia de complejos híbridos en dichas muestras; donde la detección de niveles del complejo híbrido en la muestra del paciente que difieren de los niveles del complejo híbrido en la muestra de control es indicativo de enfermedad.

18. Un método de acuerdo con la reivindicación 15, que consiste en:

a)

poner en contacto una muestra de ácido nucleico procedente de tejido de un paciente con un cebador de ácido nucleico bajo condiciones rigurosas que permitan la formación de un complejo híbrido entre una molécula de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 8 a 10 y el cebador;

b)

poner en contacto una muestra de control con dicho cebador bajo las mismas condiciones usadas en el paso a);

c)

amplificar el ácido nucleico que sirve de muestra; y

d)

detectar el nivel de ácido nucleico amplificado de las muestras del paciente y de las muestras del control; donde la detección de niveles del ácido nucleico amplificado en la muestra del paciente que difieren de manera significativa de los niveles de ácido nucleico amplificado en la muestra de control es indicativo de enfermedad.

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19. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 15 a 18, donde dicha enfermedad incluye enfermedad intestinal inflamatoria, artritis, soriasis, rechazo a transplante de órganos y enfermedad de Crohn.

20. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 15 a 18, donde dichas enfermedad es lupus.

21. Uso de un polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7 como un dominio MAM que contiene la proteína y/o dominio LDL que contiene la proteína.

22. Una composición farmacéutica que consiste en el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, un vector de acuerdo con la reivindicación 11, una célula huésped aislada de acuerdo con la reivindicación 12, o un ligando de acuerdo con la reivindicación 13.

23. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 22, que además incluye uno o más de ciclofosfamida (CTX), CLT4-Ig, rapamicina, ácido micofenólico, metilprednisona, FTY720, un agente bloqueador LFA-1, ICOS-Ig, un agente anti-apoptótico, un antagonista de función celular citolítica T, TACI-Ig o metotrexato.

24. Una composición para vacuna que consiste en un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.

25. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, un vector de acuerdo con la reivindicación 11, una célula huésped aislada de acuerdo con la reivindicación 12, un ligando de acuerdo con la reivindicación 13, o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 22 o reivindicación 23 para uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedad intestinal inflamatoria, artritis, soriasis, rechazo a transplante de órganos y enfermedad de Crohn.

26. Un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, un vector de acuerdo con la reivindicación 11, una célula huésped aislada de acuerdo con la reivindicación 12, un ligando de acuerdo con la reivindicación 13, o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 22 o reivindicación 23 para uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de lupus.

27. Un método de control de tratamiento terapéutico de enfermedad en un paciente, que consiste en controlar durante un periodo de tiempo el nivel de expresión o actividad de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o el nivel de expresión de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 en el tejido de dicho paciente, donde la alteración de dicho nivel de expresión o actividad durante el periodo de tiempo hacia un nivel de control es indicativo de regresión de dicha enfermedad.

28. Un método para la identificación de un compuesto que es efectivo en el tratamiento y/o diagnóstico de enfermedad, que consiste en poner en contacto un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 con uno o más compuestos sospechosos de poseer afinidad de enlace con dicho polipéptido o molécula de ácido nucleico, y seleccionar un compuesto que se enlace específicamente con dicha molécula de ácido nucleico o polipéptido.

29. Un kit útil para diagnosticar la enfermedad que consiste en un primer envase que contiene una sonda de ácido nucleico que se hibridiza bajo condiciones rigurosas con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10; un segundo envase que contiene cebadores útiles para amplificar dicha molécula de ácido nucleico; e instrucciones para utilizar la sonda y los cebadores para facilitar el diagnóstico de la enfermedad.

30. El kit de la reivindicación 29, que además incluye un tercer envase que contiene un agente para digerir ARN no hibridizado.

31. Un kit que contiene una variedad de moléculas de ácido nucleico, en las que al menos una es una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.

32. Un kit que contiene uno o más anticuerpos que se enlazan con un polipéptido tal y como aquí se indica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y un reagente útil para la detección de una reacción de enlace entre dicho anticuerpo y dicho polipéptido.

33. Un animal no humano transgénico o knock-out que ha sido transformado para expresar niveles más altos, más bajo o niveles ausentes de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

34. Un método para analizar un compuesto efectivo para tratar la enfermedad, poniendo en contacto un animal no-humano transgénico de acuerdo con la reivindicación 33 con un compuesto candidato y determinando el efecto del compuesto sobre la enfermedad del animal.

35. Método para seleccionar biológicamente compuestos biológicamente activos que consiste en:

(i)

poner en contacto un compuesto candidato con células huéspedes recombinantes de acuerdo con la reivindicación 12;

(ii)

seleccionar los compuestos que se enlazan con el polipéptido expresado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la superficie de dicha células y/o que modulan la actividad de dicho polipéptido.