ES2331019T3 - Ensayo de proximidad de centelleo. - Google Patents
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Abstract
Método para determinar una actividad de un enzima polimerasa, que comprende las etapas de: a) incubar una mezcla de reacción que comprende dicho enzima polimerasa, un molde adecuado, y una serie de nucleótidos trifosfato marcados y no marcados radiactivamente adecuados dando lugar a transcritos marcados, o bien sin cebador alguno o con un cebador no modificado; b) poner en contacto dichos transcritos marcados con una estructura de soporte de Ensayo de Proximidad de Centelleo (SPA) a un pH entre 2,0 y 4,5; y c) determinar un nivel de centelleo, de manera que dicho nivel de centelleo se correlaciona con la actividad de dicho enzima polimerasa.
Description
Ensayo de proximidad de centelleo.
La presente invención hace referencia a ensayos
biológicos para enzimas polimerasa, y más particularmente a un
ensayo de proximidad de centelleo para determinar las actividades de
polimerasas ARN y ADN.
El virus de la hepatitis C (VHC) es la principal
causa de la enfermedad hepática crónica a nivel mundial. (Boyer, N.
y otros J. Hepatol. 2000 32:98-112). Los pacientes
infectados con el VHC tienen riesgo de desarrollar cirrosis
hepática y subsiguientemente carcinoma hepatocelular y, por tanto,
el VHC es la principal indicación de transplante
hepático.
hepático.
El VHC ha sido clasificado como miembro de la
familia de virus Flaviviridiae que incluye los géneros flavivirus,
pestivirus y hapaceivirus que incluye los virus de la hepatitis C
(Rice, C. M., Flaviviridae: The viruses and their replication
("Flaviviridae: los virus y su replicación") En: Fields
Virology ("Virología de Fields"), Editores: B. N. Fields, D M.
Knipe y P. M. Howley, Lippincott-Raven Publishers,
Filadelfia Pa., capítulo 30, 931-959, 1996). El VHC
es un virus encapsulado que contiene un genoma ARN monocatenario
positivo de aproximadamente 9,4 kb. El genoma viral consta de una
región no traducida (UTR) 5', un marco de lectura abierto largo que
codifica un precursor poli-proteína de
aproximadamente 3011 aminoácidos, y una UTR 3' corta. La UTR 5' es
la parte más altamente conservada del genoma del VHC y es importante
para la iniciación y control de la traducción de la
poli-proteína. La mitad carboxilo de la proteína no
estructural 5, NSB5, contiene la polimerasa ARN dependiente de
ARN.
En la actualidad existe un número limitado de
tratamientos aprobados disponibles para el tratamiento de la
infección por VHC. Las estrategias terapéuticas nuevas y las ya
existentes para el tratamiento del VHC y la inhibición de la
polimerasa NSB5 del VHC han sido revisadas en: R. G. Gish, Sem.
Liver. Dis., 1999 19:5; Di Besceglie, A. M. y Bacon, B. R.,
Scientific American, Octubre: 1999 80-85; G.
Lake-Bakaar, Current and Future Therapy for Chronic
Hepatitis C Virus Liver Disease ("Tratamiento actual y futuro de
la enfermedad hepática crónica por virus de la hepatitis C"),
Curr. Drug Targ. Infect Dis. 2003
3(3):247-253; P. Hoffmann y otros, Recent
patents on experimental therapy for hepatitis C virus infection
(1999-2002)("Patentes recientes sobre
tratamientos experimentales para la infección por virus de la
hepatitis C (1999-2002)"), Exp. Opin. Ther.
Patents 2003 13(11):1707-1723; M. P. Walker y
otros, Promising Candidates for the treatment of chronic hepatitis
C ("Candidatos prometedores para el tratamiento de la hepatitis C
crónica"), Exp. Opin. investing. Drugs 2003
12(8):1269-1280; S.-L. Tan y otros, Hepatitis
C Therapeutics: Current Status and Emerging Strategies
("Tratamiento de la hepatitis C: Situación actual y tratamientos
emergentes"), Nature Rev. Drug Discov. 2002
1:867-881; J. Z. Wu y Z. Hong, Targeting NS5B
RNA-Dependent RNA Polymerase for
Anti-HCV Chemotherapy ("La polimerasa ARN
dependiente de ARN NS5B como diana terapéutica en la quimioterapia
anti-VHC"), Curr. Drug Targ. - Infect. Dis. 2003
3(3):207-219.
In Vitro, la actividad polimerasa de la
NS5B del VHC es dependiente de un molde de ARN y requiere o bien un
cebador ARN o bien uno ADN. Se han desarrollado diversos ensayos
in Vitro para determinar la actividad de la polimerasa NS5B
del VHC. Habitualmente, la mezcla de reacción estándar consta de
tampones, sales, cationes divalentes, agentes reductores así como
nucleósidos trifosfato y un molde y cebador ARN. Los moldes y
cebadores utilizados más habitualmente son moldes/cebadores
homopoliméricos sintéticos tales como poliadenosina
monofosfato:oligo-uridina monofosfato (poliA:oligo
U; ver, por ejemplo, S.-E. Behrens y otros, EMBO J. 1996
15(1):12-22, V. Lohmann y otros, J. Virol.
1997 71(11):8416-8428).
Sin embargo, NS5B también puede iniciar la
síntesis de ARN in Vitro de forma independiente de cebador
cuando se utilizan moldes de ARN de secuencia heteropolimérica,
incluyendo secuencias del genoma del VHC. Entre estas secuencias se
incluyen sitio interno de entrada al ribosoma en la región 5' no
traducida del genoma del VHC (HCV IRES; Kieft y otros, RNA 2001
7:194-206) y la región 3' no traducida ((HCV
3'-UTR; Pellerin y otros, Biochem. Biophys. Res.
Comm. 2002 295:682-688). En este caso, el extremo 3'
del molde se utiliza como cebador y la elongación progresa desde
una estructura en horquilla mediante un mecanismo de retroceso
rápido que origina una molécula de doble cadena en la cual el molde
y el producto están unidos de forma covalente.
El Ensayo de Proximidad de Centelleo (SPA)
utiliza la longitud de recorrido limitada de algunos emisores de
electrones (Hart y otros, Molecular Immunology 1979
16:265-267; Hart, Patentes U.S. nº 4.271.139 y
4.382.074; y Bertoglio-Matte, Patente U.S. nº
4.568.649). Un SPA ejemplar está compuesto de un analito en
solución, bolas de plástico que centellean cuando se exponen a
electrones, y un par de unión específico (como por ejemplo un
anticuerpo) unido a las bolas y específico para el analito en
solución. Si el analito incorpora un marcador radioactivo que emite
electrones con longitud de recorrido relativamente corta, tales como
el tritio, las bolas de plástico, suspendidas en solución con el
analito radioactivo, solamente centellearán cuando éste se una
específicamente al par de unión y por tanto se sitúe cerca de la
superficie de las bolas.
Los SPAs se han desarrollado y explotado para
diversos objetivos analíticos. Los SPAs se han utilizado para
radioinmunoensayos, ensayos competitivos, ensayos de cinética
enzimática, estudios de interacciones ligando/receptor y
antígeno/anticuerpo, y estudios de procesos celulares (ver, Cook,
Drug Discovery Today 1996 1:287-294; y Cook,
Patente U.S. nº 5.665.562). Todos los SPAs descritos hasta la fecha
se basan en interacciones de unión específicas, tales como
interacciones anticuerpo-antígeno, interacciones
ligando-receptor, reactivos biotinilados, ver Zheng
y otros, Analytical Biochem., 290, p.214-220, que se
unen a bolas recubiertas de estreptavidina, formación de complejos
quelato de las especies de interés, u otras interacciones que se
basan en la complementariedad precisa y específica de los pares de
unión. Mientras que este hecho proporciona a los SPAs una elevada
especificidad para el analito de interés, también requiere etapas
adicionales en la preparación de los reactivos y tiempo y capital
para el desarrollo de un sistema de pares de unión específico para
la reacción de interés. También limita su utilización a aquellos
sistemas en los cuales pueden hallarse o desarrollarse pares de
unión específicos. Por ejemplo, se necesitan anticuerpos
específicos para los ensayos antígeno-anticuerpo,
receptores específicos para los ensayos
ligando-receptor, los ligandos quelato deben
acoplarse a la geometría del ión con el cual forman el complejo
quilato. Si no existen anticuerpos o receptores para la detección de
una sustancia, se requiere la modificación específica del analito
con uno de los miembros de un par de unión como, por ejemplo,
biotina-estreptavidina.
Por tanto, para utilizar el ensayo SPA estándar
para determinar la actividad de cualquier enzima polimerasa,
incluyendo la polimerasa NS5B del VHC, debe modificarse un cebador
sintético, tal como un oligo-U, con una molécula
marcador de afinidad (por ejemplo biotina), permitir su hibridación
con un molde homopolimérico adecuado (en este caso poliA) y hacer
reaccionar con bolas SPA recubiertas con una molécula que puede
unirse a la molécula marcador (por ejemplo, estreptavidina). Sin
embargo, sería útil y efectivo en cuanto coste desarrollar un
sistema en el cual pudiera utilizarse, en un ensayo SPA para
determinar la actividad de un enzima polimerasa, moldes
heteropoliméricos sin cebadores o bien con cebadores no
modificados.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que puede realizarse un ensayo SPA para determinar
la actividad de un enzima polimerasa sin la utilización de
cebadores o utilizando cebadores no modificados, poniendo en
contacto los productos generados por la polimerasa con una
estructura de soporte de SPA (por ejemplo bolas) bajo pH ácido. Al
eliminar la necesidad de utilizar cebadores modificados unidos a una
molécula marcador de afinidad (lo cual, por sí mismo, es
coste-efectivo), el ensayo SPA puede realizarse
utilizando como cebadores o bien con secuencias de nucleótidos que
son nativas para un enzima polimerasa determinado o con otras
secuencias heteropoliméricas, lo cual representa una condición más
precisa para determinar la actividad de la polimerasa.
Por consiguiente, la presente invención da a
conocer un método para determinar una actividad de un enzima
polimerasa mediante: incubar una mezcla de reacción que comprende el
enzima polimerasa, un molde adecuado, y una serie de nucleótidos
trifosfato marcados radiactivamente y no marcados radiactivamente,
produciendo transcritos marcados con o sin un cebador no
modificado; poner en contacto los transcritos marcados con una
suspensión de estructura de soporte de SPA a un pH entre
aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,5; y determinar un nivel de
centelleo que se correlaciona con la actividad del enzima
polimerasa. En otra realización, la mezcla de reacción es incubada
en presencia de compuestos que modulan la actividad del enzima
polimerasa. En una realización preferente, el enzima polimerasa en
la polimerasa NS5B del VHC.
Las ventajas y características anteriores y
otras adicionales de la presente invención, y el modo mediante el
cual éstas se alcanzan, serán más fácilmente aparentes tomando en
consideración la siguiente descripción detallada de la invención
conjuntamente con los ejemplos adjuntos, que ilustran realizaciones
ejemplares.
Figura 1. Efecto de la concentración de
polimerasa NS5B. El experimento se realizó en una placa de 384
pocillos con concentraciones de NS5B entre 0 y 160 nM. El molde
IRES VHC a una concentración de 0,26 \mug/pocillo, CTP, GTP, ATP
1 \muM y 1 \muCi de ^{3}H-UTP estaban
presentes en un tampón que contenía Tris 40 mM (pH 8,0), acetato
magnésico 4 mM y DTT 4 mM. Las reacciones se detuvieron tras una
incubación de 2,5 horas a 30ºC con una solución que contenía
acetato sódico 100 mM (pH 3,0) y bolas de SPA de Proteína
A-PVT 2,3 mg/mL.
Figura 2. Curvas dosis-respuesta
de inhibidores NS5B conocidos: El experimento se realizó en una
placa de 384 pocillos con una concentración de NS5B a 0,23
\mug/20 \muL. El molde IRES VHC a una concentración de 0,26
\mug/20 \muL, CTP, GTP, ATP 1 \muM y 1 \muCi de
^{3}H-UTP estaban presentes en un tampón que
contenía Tris 40 mM (pH 8,0), acetato magnésico 4 mM y DTT 4 mM y
DMSO 10%. Las reacciones se detuvieron tras una incubación de 2,5
horas a 30ºC con una solución que contenía acetato sódico 100 mM (pH
3,0) y bolas de SPA de Proteína A-PVT 2,3 mg/mL.
Los términos "polimerasa" y "enzima
polimerasa" hacen referencia a un enzima que cataliza la
polimerización de nucleótidos (es decir, la actividad polimerasa).
En general, el enzima iniciará la síntesis por el extremo 3' del
cebador hibridado a una secuencia molde de polinucleótido, y
continuará hacia el extremo 5' de la cadena molde. La "polimerasa
ARN" cataliza la polimerización de ribonucleótidos y la
"polimerasa ADN" cataliza la polimerización de
desoxirribonucleótidos. Las "polimerasas ADN" pueden incluir
"polimerasas ADN dependientes de ARN" las cuales utilizan ARN
como molde para producir cadenas de ADN (por ejemplo la
transcriptasa inversa) así como "polimerasas ADN dependientes de
ADN" las cuales utilizan ADN como molde para producir cadenas de
ADN.
El término "polimerasa viral" hace
referencia a un enzima polimerasa contenida dentro del genoma de un
virus la cual cataliza la polimerización de ribonucleótidos o
desoxinucleótidos y permite que el virus se replique.
El término "NS5B" hace referencia a una
parte del genoma del VHC cercana al extremo 3' del mismo que
especifica la región que codifica una proteína, denominada
"proteína NS5B", "polipéptido NS5B", "polimerasa
NS5B" o combinaciones de estos términos los cuales se utilizan
de forma intercambiable en la presente invención. NS5B en su estado
natural, funciona como una polimerasa ARN dependiente de ARN (RdRp).
La región del ácido nucleico que codifica la proteína NS5B también
puede denominarse como "gen NS5B". Por consiguiente, el término
"NS5B" puede hacer referencia o bien a un ácido nucleico que
codifica el polipéptido NS5B, a un gen NS5B o a un polipéptido NS5B,
o a partes de los mismos, dependiendo del contexto en el cual se
utilice el término. NS5B también puede hacer referencia a variantes
alélicas naturales, mutantes y derivados de o bien las secuencias de
ácido nucleico o los polipéptidos NS5B. El ácido nucleico, gen NS5B
o proteína NS5B a los que se hace referencia es una polimerasa
funcional, o una polimerasa no funcional que mantiene su capacidad
de unión al molde adecuado.
"Ensayo de Proximidad de Centelleo (SPA)"
hace referencia a un procedimiento de ensayo homogéneo que produce
energía luminosa cuantificable con un nivel relacionado con la
cantidad de producto marcado radiactivamente en el medio de ensayo.
La energía luminosa es producida por un centellador el cual o bien
se incorpora o forma parte de una estructura de soporte (bolas u
otra superficie sólida que pueda ser utilizada en el proceso de
ensayo). Aunque la estructura de soporte puede estar recubierta con
una molécula de captura, las moléculas de captura no son necesarias
para llevar a cabo la presente invención. En un ensayo directo, se
mezcla una muestra que contiene un producto marcado radiactivamente
en una solución acuosa que contiene la estructura de soporte
centelleante. Se provoca que el producto marcado radiactivamente se
una a la estructura de soporte que contiene el centelleante. El
centelleante es activado provocando la emisión de luz, la cual puede
ser detectada convencionalmente utilizando un contador de
centelleo. La cantidad de luz producida es directamente
proporcional a la cantidad de reactante unido a la superficie de las
estructuras de soporte. Las bolas que se utilizan en el SPA pueden
ser microesferas, de aproximadamente 5 \mum de diámetro, y pueden
estar formadas por polímeros hidrofóbicos tales como, sin que sirva
de limitación, poliacrilamida, acrilamida, agarosa, poliestireno,
polipropileno, policarbonato y poliviniltolueno o a partir de
centelladores inorgánicos tales como el silicato de itrio. El
núcleo de la bola puede recubrirse de una película polihidroxi que
reduce la hidrofobicidad de la bola. En una realización, las bolas
de SPA son de o bien silicato de itrio o de un poliviniltolueno que
contiene un centellador orgánico tal como el difeniloxazol y están
comercializadas por Amersham Biosciences (Piscataway, N.J.).
El isótopo de una molécula "marcada
radiactivamente de forma adecuada" hace referencia a que posee
una emisión beta de energía relativamente baja, por ejemplo
electrones auger de yodo-125 o tritio. Solamente una
parte de la muestra que se une a o se encuentra cercana a la
estructura de soporte que contiene centelleante dará lugar a
acontecimientos de centelleo que puedan ser contados. Las moléculas
marcadas radiactivamente no unidas estarán a una distancia
demasiado grande de la superficie centelleante como para producir
centelleos, disipándose la desintegración beta en el medio líquido
acuoso.
El término "marcador de afinidad", tal como
se utiliza en la presente invención, hace referencia a un ligando
(unido a un cebador) cuya potente afinidad por un "receptor"
puede ser utilizada para extraer de una solución la entidad a la
cual se une el ligando. Como ejemplos de dichos ligandos se incluyen
la biotina y derivados de la misma, un polipéptido histidina, un
grupo azúcar amilosa, o un epitopo definido reconocible por un
anticuerpo especifico. Dichos "marcadores de afinidad" se unen
preferentemente al cebador en solución y son capturados por un grupo
"receptor" unido a un soporte sólido.
El término "cebador", tal como se utiliza
en la presente invención, hace referencia a un oligonucleótido, ya
sea de ARN o ADN, ya sea monocatenario o de doble cadena, ya sea
derivado de un sistema biológico generado por digestión de enzima
de restricción o generado sintéticamente, el cual, cuando se sitúa
en el medio adecuado, es capaz de actuar funcionalmente como un
iniciador de una síntesis de ácidos nucleicos dependiente de un
molde. Cuando se presente con un molde de ácido nucleico adecuado,
precursores trifosfato de ácidos nucleicos adecuados, un enzima
polimerasa, cofactores adecuados y condiciones tales como
temperatura y pH adecuados, el cebador puede ser alargado
(extendido) por su extremo 3' mediante la adición de nucleótidos por
la acción de una polimerasa o actividad similar dando lugar al
producto de la elongación (extensión) del producto. El cebador
puede variar en longitud dependiendo de las condiciones y requisitos
particulares de la aplicación. Por ejemplo, en el método de la
presente invención, el cebador nucleótido u oligonucleótido tiene
típicamente una longitud de entre 1 y 24 o más nucleótidos. El
cebador debe ser de complementariedad suficiente con el molde
deseado para cebar la síntesis del producto de extensión deseado, es
decir, ser capaz de hibridarse con la cadena molde deseada de forma
suficiente para dar lugar a un grupo hidroxilo 3' de cebador en
yuxtaposición adecuada para un enzima similar. No es necesario que
la secuencia del cebador represente un complemento exacto del molde
deseado. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos no
complementarios puede unirse al extremo 5' de un cebador por otro
lado complementario. Alternativamente, pueden intercalarse bases no
complementarias dentro de la secuencia de cebador deseada, siempre
y cuando la secuencia del cebador tenga una complementariedad
suficiente con la secuencia de la cadena molde deseada para
proporcionar funcionalmente un complejo
cebador-molde para la síntesis del producto de
extensión.
El término "cebador no modificado", tal
como se utiliza en la presente invención, hace referencia a un
cebador que no está modificado o unido a una molécula "marcador
de afinidad".
Los términos "síntesis de ARN" y
"transcripción" se utilizan de forma intercambiable y vienen
definidos por las etapas específicas de una polimerasa ARN de:
reconocer y unirse a un lugar de iniciación del molde; cebar
mediante la incorporación de un primer nucleótido complementario; y
añadir consecutivamente nucleótidos complementarios para alongar la
cadena de ARN naciente.
El término "molde" hace referencia aun
oligonucleótido de ADN, o preferentemente ARN, de al menos 50
nucleótidos de longitud, que sirve como uno de los substratos de
una polimerasa. La secuencia del molde es complementaria a la
secuencia producida por la polimerasa durante la transcripción. Un
molde "adecuado" para una polimerasa es uno que sea capaz de
servir de substrato para una polimerasa determinada. El término
"molde homopolimérico" hace referencia a un molde cuya
secuencia completa está formada de un solo nucleótido, tal como
poliadenosina o poliguanidina. El término "molde
heteropolimérico" hace referencia a un molde que no es
"homopolimérico" y cuya secuencia está formada por más de un
nucleótido.
La presente invención da a conocer métodos de
analizar la actividad de un enzima polimerasa mediante la
utilización de un Ensayo de Proximidad de Centelleo (SPA). Los SPAs
funcionan llevando una molécula marcada radiactivamente a la
cercanía del centelleante de una estructura de soporte para
estimular la emisión de luz. En una primera realización de la
presente invención, se da a conocer un método para analizar la
actividad de un enzima polimerasa, que comprende las etapas de: a)
incubar una mezcla de reacción que comprende dicho enzima
polimerasa, un molde adecuado, y una serie de nucleótidos
trifosfato marcados y no marcados radiactivamente dando lugar a
transcritos marcados, con o sin un cebador no modificado; b) poner
en contacto dichos transcritos marcados con un estructura de
soporte de un Ensayo de Proximidad de Centelleo (SPA) a un pH entre
aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,5; y c) medir un nivel de
centelleo en el cual el nivel de centelleo se correlaciona con la
actividad de dicho enzima polimerasa.
En una realización de la primera realización de
la presente invención, el enzima polimerasa es la polimerasa NS5B
del VHC. En este ensayo, NS5B se une a un molde ARN monocatenario
con o sin un cebador e inicia la síntesis de novo de ARNdc (de
doble cadena). El molde puede ser o bien homopolimérico, en cuyo
caso será necesario un cebador complementario (por ejemplo
poliA-oligoU), o heteropolimérico en cuyo caso será
o no será necesario un cebador complementario. Los moldes de ARN
para NS5B que no necesitan cebadores incluyen el sitio interno de
entrada al ribosoma situado en la región 5' no traducida del genoma
del VHC (IRES VHC) y la región 3' no traducida
(3'-UTR VHC). El UTP marcado radiactivamente y los
CTP, GTP y ATP no marcados radiactivamente se incorporan a la
hélice de doble cadena durante la unión
polimerasa-molde. La detección del producto (ARNdc)
se mide añadiendo una cantidad fija de bolas de SPA de
Proteína-A- poliviniltolueno (PVT) (a pH bajo) las
cuales se acoplan al ARNdc y detienen la progresión de la reacción.
La cercanía de una bola a un UTP marcado radiactivamente
incorporado provoca que se emita un fotón y sea capturado por un
detector. La ausencia de señal (fotón) indica la ausencia de
formación de ARNdc a través del bloqueo enzima/compuesto.
En una segunda realización de la presente
invención, se da a conocer un método para determinar una actividad
de un enzima polimerasa que comprende las etapas de: a) incubar una
mezcla de reacción que comprende dicho enzima polimerasa, un molde
adecuado, y una serie de nucleótidos trifosfatos marcados y no
marcados radiactivamente dando lugar a transcritos marcados, en
presencia de uno o más compuestos que modulan la actividad de dicho
enzima polimerasa con o sin un cebador no modificado; b) poner en
contacto dichos transcritos marcados con un estructura de soporte
de un Ensayo de Proximidad de Centelleo (SPA) a un pH entre
aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,5; y c) medir un nivel de
centelleo en el cual el nivel de centelleo se correlaciona con la
actividad de dicho enzima polimerasa. En una realización preferente
de la segunda realización de la presente invención, el enzima
polimerasa es la polimerasa NS5B del VHC.
Los métodos de la presente invención también
pueden ponerse en practica con diferente enzimas polimerasa ARN y
ADN dado que los productos marcados que se generan por la polimerasa
(es decir, ARNdc o ADN) pueden llevarse cerca de una estructura de
soporte de SPA en condiciones de pH ácido de manera que el nivel de
centelleo se correlaciona con la actividad de la polimerasa. La
presente invención es aplicable a polimerasas ARN y ADN de especies
procariotas y eucariotas así como a virus ARN y ADN. Las polimerasas
ADN pueden incluir polimerasas ADN dependientes de ADN o
polimerasas ADN dependientes de ARN tales como la transcriptasa
inversa del Virus de Inmunodeficiencia Humano
(VIH-RT).
Los ejemplos y preparaciones siguientes se
proporcionan para permitir a los expertos en la técnica entender de
forma más clara y poner en práctica la presente invención. No se
deben considerar limitativos del alcance de la presente invención
sino meramente ilustrativos y representativos de la misma.
La polimerasa VHC marcada en histidina
N-terminal, derivada de la cepa VHC BK, genotipo 1b
(NS5B570n-BK) contiene una deleción de 21
aminoácidos C-terminal en comparación con la
polimerasa VHC completa y se purifica a partir de la cepa E. col
M15. El constructo que contiene la secuencia de codificación de los
aminoácidos 2421-2999 de la cepa VHC BK (nº de
acceso GenBank M58335) aguas abajo de un cassette de expresión de
promotor Tag se insertó en constructos plásmidos. Los constructos
plásmidos se transformaron en E. coli, se inocularon las
colonias y cultivaron durante una noche en 10L de medio de cultivo
Terrific (Tartoff y Hobbs) suplementado con 100 \mug/mL de
ampicilina a 37ºC. Se indujo la expresión proteica mediante la
adición de
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido
(IPTG) 1 mM cuando las densidades ópticas alcanzaron un OD_{600}
entre 1,5 y 3,5 y a continuación el cultivo se incubó durante
16-18 horas a 22ºC. NS5B570n-BK se
purificó hasta la homogeneidad utilizando un protocolo de tres
etapas que incluía cromatografía subsiguiente en columna de resinas
Ni-NTA, SP-Sefarosa HP y Superdex
75.
Se añadió la polimerasa NS5B a una placa de 384
pocillos a diversas concentraciones y se co-incubó
con una secuencia molde de nucleótidos IRES VHC (nº de
identificación de secuencia: 1), la cual contiene los residuos
21-371 de la región 5' no traducida del VHC del nº
de acceso GenBank AF356827, a una concentración de 0,26
\mug/pocillo y 1 \muM de CTP, GTP y ATP y 1 \muCi de
^{3}H-UTP (Amersham TRK412, 1 mCi/mL) en un tampón
que contenía Tris 40 mM (pH 8,0), acetato magnésico 4 mM y DTT 4
mM. En algunos casos, también se añadieron los compuestos de
análisis a una concentración de 10 \muM. Tras una incubación de
tres horas a 30ºC, se añadió a cada pocillo una solución que
contenía acetato sódico 100 mM (pH 3,0) y bolas de SPA Proteína
A-PVT 2,3 mg/mL. Las muestras se dejaron reposar
durante 12 horas a temperatura ambiente. La cantidad emitida a
partir del centelleante contenido en las bolas SPA se convirtió a
cuentas por minuto (CPM) en un lector de placas Topcount
(Perkin-Elmer). La Figura 1 muestra los resultados
del ensayo con diferentes concentraciones de la polimerasa NS5B. La
Figura 2 muestra los resultados del ensayo en forma de curvas
dosis-respuesta de diversos inhibidores conocidos
de la polimerasa NS5B.
La transcriptasa inversa recombinante
(polimerasa ADN dirigida por ARN) de la cepa VIH-1
puede expresarse en E. Coli y purificarse tal como se
describe en Mizrahi y otros, Arch. Biochem. Biophys. 1989
273:347-358. La transcriptasa inversa se añade a
una placa de microtitulación y se mezcla con 5 \mug/mL de molde
poli (rA) pre-hibridado con 2,5 \mug/mL de
cebador oligo (dT)_{16}, y 1 \muM de dATP, dCTP, dGTP y 1
\muCi de [metil-1'2'-^{3}H]
dTTP (Amersham TRK-576) en un tampón formado por
Tris 40 mM (pH 8,0), acetato magnésico 4 mM y DTT 4 mM. La reacción
se realizó a 37ºC durante 30 minutos. Tras la incubación, se añadió
a cada pocillo una solución de acetato sódico 100 mM (pH 3,0) y 2,3
mg/mL de bolas SPA de Proteína A-PVT, tratándose las
muestras y detectándose el centelleo tal como se describe en el
Ejemplo 1.
La actividad polimerasa de la polimerasa ADN de
E. Coli I del fragmento (Klenow) grande disponible
comercialmente (por ejemplo Invitrogen nº catalogo
18012-021) puede determinarse utilizando los métodos
descritos en el Ejemplo 2 pero utilizando como molde o bien ADN de
doble cadena con extremos 3'-hidroxilo (por ejemplo
generado mediante digestión con la ADNasa I) y sin cebadores o bien
con ADN monocatenario con cebadores específicos o aleatorios.
<110> F. Hoffmann-La Roche
AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Ensayo de proximidad de centelleo
para determinar la actividad polimerasa
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 23540
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Versión de patente 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 377
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus hepatitis C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (10)
1. Método para determinar una actividad de un
enzima polimerasa, que comprende las etapas de:
a) incubar una mezcla de reacción que comprende
dicho enzima polimerasa, un molde adecuado, y una serie de
nucleótidos trifosfato marcados y no marcados radiactivamente
adecuados dando lugar a transcritos marcados, o bien sin cebador
alguno o con un cebador no modificado;
b) poner en contacto dichos transcritos marcados
con una estructura de soporte de Ensayo de Proximidad de Centelleo
(SPA) a un pH entre 2,0 y 4,5; y
c) determinar un nivel de centelleo, de manera
que dicho nivel de centelleo se correlaciona con la actividad de
dicho enzima polimerasa.
2. Método, según la reivindicación 1, en el que
dicho enzima polimerasa es la polimerasa NS5B VCH.
3. Método, según la reivindicación 1, en el que
dicho molde adecuado es un molde heteropolimérico.
4. Método, según la reivindicación 3, en el que
dicho molde heteropolimérico se selecciona del grupo formado por la
región 5' no traducida del genoma del VHC (IRES VHC) y la
3'-UTR del VHC.
5. Método, según la reivindicación 1, en el que
dicho molde adecuado es un molde homopolimérico.
6. Método para analizar la actividad de un
enzima polimerasa que comprende las etapas de:
a) incubar una mezcla de reacción que comprende
dicho enzima polimerasa, un molde adecuado, y una serie de
nucleótidos trifosfato marcados y no marcados radiactivamente
adecuados dando lugar a transcritos marcados, en presencia de uno o
más compuestos que modulan la actividad de dicho enzima polimerasa,
o bien sin cebador alguno o con un cebador no modificado;
b) poner en contacto dichos transcritos marcados
con una estructura de soporte de Ensayo de Proximidad de Centelleo
(SPA) a un pH entre 2,0 y 4,5; y
c) determinar un nivel de centelleo, de manera
que dicho nivel de centelleo se correlaciona con la actividad de
dicho enzima polimerasa.
7. Método, según la reivindicación 6, en el que
dicho enzima polimerasa es la polimerasa NS5B VCH.
8. Método, según la reivindicación 6, en el que
dicho molde adecuado es un molde heteropolimérico.
9. Método, según la reivindicación 8, en el que
dicho molde heteropolimérico se selecciona del grupo formado por
IRES VHC y la 3'-UTR.
10. Método, según la reivindicación 6, en el que
dicho molde adecuado es un molde homopolimérico.
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