ES2331233T3 - Conjunto de bolsa de crioconservacion para lineas celulares de mamiferos. - Google Patents
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Abstract
Un conjunto de bolsa de crioconservación del banco celular de trabajo del fabricante que comprende: una bolsa de politetrafluoroetileno, comprendiendo la bolsa cuatro compartimentos separados y cerrados herméticamente, comprendiendo dichos compartimentos un compartimento de la suspensión celular, un compartimento del puerto de espiga, un compartimento de la línea de inoculación y un compartimento de marca; una primera longitud de tubería no de PVC que se puede usar para acoplar de manera estéril antes de la crioconservación y conectarse y comunicar con uno de los compartimentos cerrados herméticamente una segunda longitud de tubería no de PVC resistente a una temperatura de -180ºC que se puede usar para acoplar de manera estéril tras la crioconservación y conectarse a y comunicar con uno de los compartimentos cerrados, y un puerto de espiga que tiene medios para exportar células desde uno de los compartimentos.
Description
Conjunto de bolsa de crioconservación para
líneas celulares de mamíferos.
La presente solicitud reivindica la prioridad de
la Solicitud Provisional Número 60/289924, presentada el 9 de Mayo
de 2001, y de la Solicitud Provisional Número 60/305460 presentada
el 13 de Julio de 2001.
La presente invención se refiere a un conjunto
de bolsa de crioconservación flexible y a un procedimiento para la
congelación, almacenamiento, y transferencia de células de
mamíferos. Estas células de mamíferos se usan para inocular un
biorreactor.
Los productos de biotecnología implican
normalmente introducir alguna modificación genética en células de
mamíferos y a continuación hacer crecer estas células en un
biorreactor. Estos biorreactores están especialmente diseñados para
permitir el crecimiento y el mantenimiento de las células de
mamíferos.
Para la producción de un fármaco a partir de una
línea específica de células de mamíferos genéticamente modificadas,
se necesita una fuente celular uniforme cada vez que se inocula un
biorreactor. Esta es la razón para la existencia de un Banco
Celular de Trabajo del Fabricante (MWCB). Un MWCB está constituido
por muchas alícuotas (porciones) de una suspensión celular,
conteniendo cada una el mismo tipo de células y aproximadamente el
mismo número de células. Estas alícuotas se preparan el mismo día y
se congelan en el mismo momento. A continuación, las alícuotas se
mantienen a temperaturas muy frías (crioconservadas). Para cada
ciclo, se descongela una de estas alícuotas de células para
conseguir el mismo punto de partida que en cualquier otro ciclo con
las mismas células.
La inoculación satisfactoria de un biorreactor
con células de mamíferos requiere una densidad celular mínima para
conseguir un crecimiento celular apropiado. Si la densidad celular
está por debajo del nivel mínimo, se necesitan requerimientos de
tiempo extendidos para conseguir niveles de crecimiento celular
comerciales que añaden costes al procedimiento y aumentan la
oportunidad de que entren contaminantes en el entorno celular. Si
la densidad celular es demasiado elevada, pueden agotarse los
nutrientes de los medios, lo que da como resultado un crecimiento
celular reducido, y posiblemente la muerte del cultivo celular.
En la práctica actual, cada alícuota de un MWCB
tiene un volumen de sólo 1-2 ml. Se requiere este
volumen limitado por la necesidad de congelar todas las células de
una manera rápida y uniforme. Usando la tecnología existente, si se
congelan grandes volúmenes, el diámetro de la suspensión influirá
sobre la velocidad de congelación y descongelación de las células,
lo que puede dañar las células e influir adversamente sobre la
inoculación del biorreactor. La concentración celular en cada
alícuota está normalmente en el intervalo de 1-20
millones de células/ml. Los biorreactores de producción contienen
normalmente decenas de litros, cientos de litros, o incluso,
volúmenes mayores. Debido a esta diferencia radical en el volumen,
se usa una "expansión en serie de la siembra" para aumentar el
número de células hasta que sean suficientes para introducir en el
biorreactor de producción. Por todas las razones anteriores, la
expansión en serie de la siembra para una campaña de producción es
una etapa crítica del procedimiento.
En los protocolos de producción típicos, se
descongela una alícuota de células procedente del MWCB y las células
se cultivan en botellas pequeñas (tales como matraces en T). A
medida que las células se multiplican, se transfieren a un número
creciente de botellas pequeñas. Esto aumenta el número total de
células sin que la densidad celular sea demasiado elevada o baja.
Una vez que se han acumulado células suficientes, se transfieren a
botellas grandes (tales como botellas cilíndricas o matraces con
agitación). Cuando se alcanza otro umbral, las células se
transfieren a un biorreactor de inoculación. La siembra en serie
descrita es práctica general para las diversas líneas celulares de
mamíferos y se usa ampliamente en la producción comercial y en la
enseñanza (Lindl y Bauer, 1989, Morgan y Darling, 1993). Se
proporciona también una revisión de una expansión en serie de la
siembra comercial usando matraces en T y matraces para agitación
centrífuga en Whitaker y col. 1998.
Normalmente, en el MWCB se usan viales de tapón
roscado. El uso de viales de tapón roscado requiere desenroscar los
tapones de vial antes del rellenado y volverlos a enroscar después
del rellenado lo que es una operación manual incómoda. Lo que es un
riesgo mayor es que mientras que los viales están abiertos, los
contenidos están sometidos a contaminación. Es extremadamente
importante que no se introduzca contaminación en los viales.
Las expansiones en serie de la siembra tardan
normalmente aproximadamente de cuatro a seis semanas para
completarse en condiciones óptimas. Debido al gran número de etapas
de transferencia, las siembras en serie requieren mucha mano de
obra y son susceptibles a la contaminación. Adicionalmente, el
ambiente en botellas pequeñas y botellas más grandes no está bien
instrumentado o controlado. Cambios en los niveles de pH y oxígeno
pueden conducir a heterogeneidad en las células que se transfieren
al biorreactor de producción. Esto puede conducir a su vez a
variabilidad entre un ciclo de biorreactor y otro, y puede afectar
finalmente a la calidad del fármaco que se está produciendo.
El documento D1
(US-B1-6194136) describe un
procedimiento y equipo para crioconservar muestras biológicas, y
menciona una bolsa de recogida fabricada en PTFE.
El Documento D2
(US-A-6022344) describe una bolsa de
criopreservación diseñada para almacenar en nitrógeno líquido a una
temperatura de -196ºC. La bolsa de criopreservación está equipada
con una tubería no de PVC, que se puede cerrar herméticamente y
resistente al nitrógeno líquido para conexión estéril.
Cada uno de los riesgos anteriormente descritos
para la preparación de una suspensión celular homogénea y
uniformemente viable explica la necesidad de mejoras en esta
tecnología.
La invención es un novedoso conjunto de bolsa de
congelación y almacenamiento celular para expansión en serie de la
siembra de células de mamíferos según se reivindica en la
reivindicación independiente 1. La bolsa está construida
principalmente de tejido de politetrafluoroetileno. La bolsa está
diseñada para mantener células suficientes para que un biorreactor
se pueda inocular directamente. La bolsa está diseñada para
rellenarse hasta una fracción de su capacidad máxima, de tal manera
que la suspensión celular tiene una sección transversal muy
delgada. El diseño de la bolsa incluye un conjunto de transferencia
que se puede soldar de manera estéril a la fuente de células de
mamíferos. Este conjunto de transferencia que se puede soldar de
manera estéril permite que las bolsas se rellenen rápidamente con
riesgo mínimo de contaminación. Una vez que se rellena cada bolsa,
se cierra herméticamente por debajo de la conexión con el conjunto
de transferencia, se corta la bolsa "por encima" del nuevo
cierre hermético (en el mismo lado del cierre hermético que el
conjunto de transferencia). Cuando se va a inocular un biorreactor,
se drenan los contenidos de la bolsa mediante una línea de
inoculación que se suelda de manera estéril. Durante la congelación
y el almacenamiento, la línea de inoculación está protegida del daño
mecánico.
Los dibujos acompañantes incorporados en, y que
forman una parte de, la memoria descriptiva ilustran diversos
aspectos de las presentes invenciones, y junto con la descripción,
sirven para explicar los principios de las invenciones. Los
componentes de los dibujos no están necesariamente a escala. En su
lugar, se ha puesto énfasis en ilustrar con claridad los principios
de las presentes invenciones.
la fig. 1 es un dibujo de una realización
preferida de un conjunto que se puede soldar de forma estéril con
bolsas unidas;
la fig. 2 es un dibujo de una realización
preferida de una bolsa de congelación celular, que muestra los
diferentes compartimentos;
la fig. 3 es un detalle de la bolsa de
congelación celular, que ilustra una realización preferida de la
conexión entre el conjunto de transferencia y la bolsa;
la fig. 4 ilustra la realización preferida de la
bolsa antes del relleno, la bolsa rellena y cerrada herméticamente,
y la bolsa rellena, cerrada herméticamente y cortada;
la fig. 5 es un detalle de la bolsa de
congelación celular, que muestra una realización preferida del
compartimento del puerto de espiga, el compartimento de la línea de
inoculación, la línea de inoculación y su conexión con el
compartimento de suspensión celular;
la fig. 6 es un detalle de la bolsa de
congelación celular, que muestra una realización preferida del
compartimiento de marca en la sección transversal antes y después
de que se llene el compartimento de suspensión.
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Los términos usados en esta memoria son:
Biorreactor - Un recipiente que contiene un
entorno controlado para células en crecimiento. Los biorreactores se
denominan también fermentadores.
Tejido de politetrafluoroetileno o Tejido - Un
material flexible que semeja una película o tela preparado mediante
cualquier medio a partir de politetrafluoroetileno. Los ejemplos
comunes de tejido de Politetrafluoroetileno incluyen película de
Teflon®.
Conjunto de transferencia - Una pieza de una
tubería flexible, en algunos ejemplo con una o más ramas
(denominadas en el presente documento como "patas", y usada
para conectar el interior de la cámara de una bolsa de
almacenamiento con el exterior de la bolsa y/o una fuente de la
suspensión celular, y que permite el relleno o el drenaje de los
contenidos de la bolsa.
Sección transversal delgada - Cuando se usen las
bolsas de congelación celular de la presente invención, se
colocarán por su lado en un casete metálico (denominado también como
caja o recipiente) en una orientación sustancialmente nivelada. El
espesor de la suspensión celular en cualquier punto en el interior
de una bolsa no debería exceder aproximadamente de 10 milímetros.
Si el espesor de la suspensión celular tiene sustancialmente más de
10 milímetros, las células adyacentes a la superficie de la bolsa
experimentarán condiciones de congelación y descongelación
diferentes que las células en el interior de la suspensión, y pueden
reaccionar de manera diferente en el curso de la congelación y la
descongelación y cuando se usan posteriormente en un
biorreactor.
Conjunto de bolsa de congelación celular y
almacenamiento - El conjunto incluye la bolsa de congelación celular
y la tubería asociada, el puerto de espiga, y se interconecta según
se reivindica en la reivindicación independiente 1.
La invención es un conjunto de bolsa de
congelación y almacenamiento celular que soporta un nuevo
procedimiento para la expansión en serie de la siembra de células
de mamíferos. La bolsa está construida principalmente de
politetrafluoroetileno. La bolsa está diseñada para contener células
suficientes para un biorreactor se pueda inocular directamente con
su contenido. La bolsa está diseñada para rellenarse hasta una
fracción de su capacidad máxima de tal manera que cuando se coloca
sobre su lado, la suspensión celular tiene una sección transversal
muy delgada. El diseño de la bolsa incluye un conjunto de
transferencia que se puede soldar de forma estéril a la fuente de
células de mamíferos. Este conjunto de transferencia que se puede
soldar de forma estéril permite rellenar rápidamente las bolsas con
riesgo mínimo de contaminación. Una vez que se rellena cada bolsa,
ésta se cierra herméticamente por debajo de la conexión con el
conjunto de transferencia y la bolsa se corta "por encima" del
nuevo cierre hermético (en el mismo lado del cierre hermético y el
conjunto de transferencia). Cuando un biorreactor se va a inocular,
se drenan los contenidos de la bolsa mediante una línea de
inoculación que se puede soldar de forma estéril. Durante la
congelación y el almacenamiento, la línea de inoculación está
protegida del daño mecánico.
La bolsa de congelación celular de la presente
invención se realiza en un tejido de politetrafluoroetileno en
lugar de EVA (bolsas de la técnica anterior). El tejido de
politetrafluoroetileno es flexible a menos 180ºC y por debajo.
(Menos 180ºC es la temperatura del nitrógeno líquido. Ésta es la
temperatura mínima práctica para el almacenamiento en un MWCB).
Debido a su flexibilidad a baja temperatura, y a la vez la reducida
posibilidad de fractura a baja temperatura, esta característica del
tejido proporciona protección adicional de los contenidos de la
bolsa de congelación celular durante la congelación, el
almacenamiento a largo plazo, y la descongelación.
La bolsa de congelación celular está diseñada
para contener aproximadamente 100 ml de la suspensión celular, 100
veces el volumen normalmente congelado en viales de tapón roscado.
Las densidades celulares son comparables para las nuevas bolsas de
congelación celular y los viales que se usan actualmente. Debido a
esta diferencia de volumen, las bolsas pueden contener
aproximadamente 100 veces más células que los viales. Una bolsa de
congelación celular única contiene células suficientes para permitir
la inoculación directa de un biorreactor.
Los volúmenes de suspensión celular que se van a
congelar son una fracción de la capacidad potencial de la bolsa de
congelación celular. Esto limita el espesor de la suspensión
celular. Debido a que la suspensión celular es delgada, la
transferencia térmica es rápida y las células se pueden congelar
uniformemente a una velocidad óptima. La congelación uniforme ayuda
a asegurar la homogeneidad de las células.
Las bolsas de congelación se van a fabricar con
un conjunto de transferencia integral. Este conjunto de
transferencia integral está compuesto por una longitud tubería de
flexible, que en algunas aplicaciones puede tener una o más ramas.
Estas ramas se denominan algunas veces como pata o patas. Cuando las
bolsas se van a rellenar, el extremo libre del conjunto de
transferencia se soldar de forma estéril a la longitud de la tubería
que está conectada a la fuente de la suspensión celular. Este
procedimiento elimina virtualmente la posibilidad de contaminación
cuando se rellenan las bolsas.
Cada pata del conjunto de transferencia está
conectada a la bolsa de congelación celular. Cada pata tiene una
pinza de apriete o dispositivo similar para controlar el flujo de
células a la bolsa de congelación celular unida. El conjunto de
transferencia y las bolsas conectadas se esterilizan y dosifican
como una unidad. Para cada bolsa, la secuencia de relleno es:
- a)
- se abre la pinza de apriete en la pata del conjunto de transferencia conectado,
- b)
- se bombea la suspensión celular al interior de la bolsa,
- c)
- se cierra la pinza de apriete,
- d)
- se extrae todo el aire de la bolsa por encima de la "línea de cierre hermético" (una línea por debajo de la conexión con el conjunto de transferencia)
- e)
- se cierra herméticamente la bolsa a lo largo de la "línea de cierre hermético", y
- f)
- se corta la bolsa por encima del cierre hermético hecho en e), cortando la conexión entre la bolsa y el conjunto de transferencia.
Si se bombea la suspensión celular a velocidad
constante, se pueden rellenar las bolsas basándose en un intervalo
de tiempo fijo. Una vez se cierra herméticamente la bolsa y se corta
por encima de la línea de cierre hermético, el conjunto de
transferencia ya no está unido a la bolsa. Esto elimina uno de los
puntos de vulnerabilidad durante el almacenamiento.
La presente invención usa una longitud unida de
una tubería que se puede soldar de forma estéril para drenar los
contenidos. Esta longitud de tubería se denomina línea de
inoculación. Un extremo de la línea de inoculación está conectado
con el cuerpo de la bolsa de congelación celular. Este extremo
conectado comunica libremente con el compartimento que contiene la
suspensión celular. Durante el almacenamiento, la línea de
inoculación está protegida del daño mecánico encerrándola
firmemente en su propio compartimento. Cuando se van a usar los
contenidos de la bolsa, el extremo libre de la línea de inoculación
se suelda de forma estéril con una longitud de tubería que está
conectada al biorreactor de inoculación.
La invención se basa en un nuevo conjunto de
bolsa de crioconservación según se reivindica en la reivindicación
1 para la expansión en serie de la siembra de las células de
mamíferos. Usando este nuevo conjunto de bolsa, se aumenta el
número de células en cada alícuota del MWCB. Esto reduce la
extensión a la cual deben multiplicarse las células en la expansión
en serie de la siembra. Es posible aumentar un poco el número de
células por alícuota concentrándolas. Sin embargo, es más sencillo
aumentar el volumen de cada alícuota.
Para el nuevo conjunto de bolsa de
crioconservación según se reivindica en la reivindicación 1 para la
expansión en serie de la siembra de células de mamíferos, se
aumenta el volumen de cada alícuota a 100 ml. Un biorreactor
dedicado a inoculación se inocula directamente transfiriendo de
manera estéril los contenidos de la bolsa de congelación celular al
biorreactor. Esta inoculación tiene lugar sin que intervenga ningún
matraz de cultivo de tejido, botellas cilíndricas, matraces en
agitación, o recipientes comparables. El volumen inicial de cultivo
en el biorreactor dedicado a inoculación es de 2 l, aumentando a 15
l a medida que se multiplican las células (Heidemann y col,
2001).
No es suficiente usar un vial más grande con la
misma geometría que los usados en la práctica corriente. Cuando se
escala esta geometría, la sección transversal más grande da como
resultado tiempos de congelación más largos y un gradiente térmico
significativo entre el exterior del vial y el centro. Esto es una
desviación del requisito de una alícuota homogénea de células para
la inoculación del biorreactor. Se usa un diseño basado en bolsa
para proporcionar una sección transversal que sea de espesor
comparable al los viales de congelación celular usados en la
práctica actual. Más específicamente, se rellena la bolsa hasta una
fracción de su capacidad máxima para proporcionar una sección
transversal muy delgada. La sección transversal delgada da como
resultado un enfriamiento rápido de la alícuota completa, con un
gradiente térmico muy pequeño.
Existen bolsas de congelación celular en el
mercado que se adecúan a los volúmenes descritos anteriormente
(Vijayaraghhavan y col, 1998 y Regidor y col, 1999), sin
embargo, estas bolsas tienen numerosas limitaciones. Las bolsas de
congelación celular actualmente disponibles están construidas
principalmente en acetato de etileno vinilo (EVA). El EVA es
quebradizo a las temperaturas a las que se almacenan normalmente las
suspensiones celulares. Esto da como resultado que las bolsas de
congelación celular sean frágiles desde el momento en el que los
contenidos de la bolsa se reducen a las temperaturas de
almacenamiento hasta el momento en el que los contenidos de la
bolsa comienzan a descongelarse. Este intervalo de vulnerabilidad
incluye el almacenamiento a largo plazo, que se mide normalmente en
décadas. Cualquier agrietamiento de la bolsa de congelación celular
en este intervalo de vulnerabilidad da probablemente como resultado
la contaminación de los contenidos.
Una segunda limitación de las bolsas de
congelación celular actualmente disponibles es el uso extendido de
tuberías de policloruro de vinilo (PVC) para rellenar y drenar las
bolsas. La tubería de PVC es quebradiza a las temperaturas normales
de almacenamiento de la suspensión celular, y se sabe que el
plastificante usado en la fabricación de los materiales de PVC
lixivia el plástico en los medios que lo rodean. Estas limitaciones
hacen del PVC una elección indeseable para estas bolsas de
congelación celular.
Una tercera limitación de las bolsas de
congelación celular actualmente disponibles es que se vacían
mediante un puerto con cierre Luer o cubierto por membrana. De
nuevo, esto es una fuente potencial de contaminación.
Figura
1
La Figura 1 muestra la realización preferida del
conjunto de transferencia que se puede soldar de forma estéril. El
extremo libre del conjunto de transferencia es estéril y se puede
soldar. En la realización preferida, toda la tubería del conjunto
de transferencia es compatible con un soldador para tubería estéril.
En algunas realizaciones, parte o toda la tubería diferente del
extremo libre no es compatible con el soldador para tubería
estéril.
En la realización preferida, hay 10 bolsas
conectadas al conjunto de transferencia. En otras realizaciones,
hay entre 2 y 100 bolsas conectadas al conjunto de
transferencia.
En la presente realización, el extremo libre
tiene la misma longitud de tubería que el resto de las patas que
están conectadas. En otras realizaciones, pueden estar interviniendo
uniones o conectores entre el extremo libre y las
patas.
patas.
En la realización preferida, el extremo libre
del conjunto de transferencia se suelda bien herméticamente para
evitar la contaminación. En otras realizaciones, el extremo libre
del conjunto de transferencia no se suelda bien herméticamente,
sino que en su lugar se:
- 1.
- cierra por medio de una pinza, o
- 2.
- cierra por medio de una válvula, o
- 3.
- un dispositivo de desconexión rápida, o
- 4.
- mantiene en una condición estéril por medio de un envasado secundario.
En la realización preferida, el flujo hacia cada
bolsa de congelación celular está controlado mediante una única
pinza de apriete cautiva. En otras realizaciones, las pinzas de
apriete en las patas del conjunto de transferencia pueden no estar
cautivas sino que, en su lugar, pueden aplicarse a la tubería en el
momento del uso. Adicionalmente, en algunas realizaciones, se
pueden usar en lugar de las pinzas de apriete válvulas de bola,
válvulas de compuerta, válvulas de mariposa, o dispositivos de
control de flujo en línea comparables en las patas del conjunto de
transferencia.
En la realización preferida, la longitud entre
el extremo libre y el comienzo de cada pata es de
10-15 centímetros. En otras realizaciones, esta
longitud puede oscilar entre 1 centímetro y 1000 centímetros.
En la realización preferida, la longitud de cada
pata es de 10-15 centímetros. En otras
realizaciones, esta longitud puede ser la misma o variar de pata a
pata dentro de intervalo de 1 centímetro a 200 centímetros.
Figura
2
La Figura 2 muestra la realización preferida de
los compartimentos en la bolsa de congelación celular. Cuando una
bolsa de congelación celular está rellena con la suspensión celular,
específicamente, es el compartimento de la suspensión celular el
que se rellena. Este compartimento se rellena mediante el conjunto
de transferencia. La suspensión celular permanece en este
compartimento durante la congelación, el almacenamiento y la
descongelación. Tras la descongelación, la suspensión de células se
drena de este compartimento mediante la línea de inoculación.
En la realización preferida, la capacidad del
compartimento de suspensión celular cuando se infrarrellena para
mantener una sección transversal delgada adecuada, es de 100
milímetros. En otras realizaciones, la capacidad del compartimento
de suspensión celular puede oscilar entre 2 milímetros y 5
litros.
En la realización preferida, el compartimento de
la línea de inoculación se muestra como adyacente al compartimento
de suspensión celular y al compartimento de marca. En otras
realizaciones, el compartimento de la línea de inoculación puede
estar:
- 1.
- adyacente al compartimento de la suspensión celular, pero no adyacente al compartimento de marca, y/o
- 2.
- parcialmente dentro del compartimento de la suspensión celular, o
- 3.
- enteramente dentro del compartimento de la suspensión celular.
El compartimento de la línea de inoculación se
describirá adicionalmente en relación con la Figura 5.
Se accede al compartimento de marca mediante una
ranura estrecha. Tras la inserción de la marca, se rellena el
compartimento de la suspensión celular. El aumento del espesor del
compartimento de la suspensión celular tras el relleno obstruye la
abertura en el compartimento de marca. Esto hará improbable que la
marca se resbale.
En algunas realizaciones no existe compartimento
de marca separado, marcándose la bolsa:
- 1.
- directamente mediante transferencia de tinta u otro pigmento (usando una prensa, estampadora, pluma, rotulador, o impresora), o
- 2.
- con una marca adhesiva, o
- 3.
- con una serie de muescas en el borde de la bolsa, o
- 4.
- estampando en relieve el material de la bolsa
- 5.
- con una serie de perforaciones del material de la bolsa, o
- 6.
- con material incluido en la suspensión celular, o
- 7.
- con marcas en la línea de inoculación
Figura
3
La Figura 3 muestra la realización preferida de
la conexión entre el extremo de la bolsa del conjunto de
transferencia y el compartimento de la suspensión celular. En esta
realización, el extremo del conjunto de transferencia penetra en la
costura del compartimento de la suspensión celular. Adicionalmente,
en algunas realizaciones, puede existir un accesorio que penetre en
la costura del compartimento de la suspensión celular y el conjunto
de transferencia se conecta a este accesorio.
El extremo del conjunto de transferencia que
está en el interior del compartimento de la suspensión celular está
abierto.
Figura
4
La Figura 4 ilustra la realización preferida de
la bolsa antes del rellenado (a), la bolsa rellena y cerrada
herméticamente (b), y la bolsa rellena, cerrada herméticamente y
cortada (c). El dibujo de la parte superior (a) muestra la bolsa
antes de que se haya rellenado. Suponiendo que el conjunto de
transferencia se haya conectado ya a la fuente celular, tienen
lugar las siguientes etapas entre los dibujos de la parte superior y
la media:
- a)
- se abre la pinza de apriete en la pata del conjunto de transferencia conectado,
- b)
- se bombea la suspensión celular al interior de la bolsa,
- c)
- se cierra la pinza de apriete
- d)
- se extrae todo el aire de la bolsa por encima de la "línea de cierre hermético", y
- e)
- se cierra herméticamente la bolsa a lo largo de la "línea de cierre hermético".
Entre los dibujos de la parte media
(4(b)) y superior (4(c)), se corta la bolsa por encima
del cierre hermético realizado en la etapa e). Esto retira el
conjunto de transferencia de la porción de la bolsa que se va a
congelar y almacenar. También, la porción que se va a almacenar
contiene poco o ningún aire.
En la realización preferida, se imprime la línea
de cierre hermético en la bolsa de congelación celular directamente
mediante transferencia de tinta u otro pigmento (usando una prensa,
estampadora, pluma, rotulador, o impresora). En otras
realizaciones, la línea de cierre hermético está marcada:
- 1.
- con estampado en relieve del material de la bolsa, o
- 2.
- con una marca adhesiva, o
- 3.
- con material que se pega o se suelda a la bolsa, o
- 4.
- con una o más muescas en el borde de la bolsa, o
- 5.
- con una serie de perforaciones del material de la bolsa en el borde de la bolsa.
Figura
5
La Figura 5 muestra la realización preferida del
compartimento del puerto de espiga, el compartimento de la línea de
inoculación, la línea de inoculación y su conexión al compartimento
de la suspensión celular. En la realización preferida, el
compartimento de la línea de inoculación se dimensiona para encajar
estrechamente la línea de inoculación, proporcionando a ésta
protección contra el daño. Ajustando estrechamente el compartimento
a la línea de inoculación, únicamente se pierde un volumen limitado
de suspensión celular si se produce algún daño en la línea de
inoculación. Adicionalmente, en otras realizaciones, se puede
proteger la línea de inoculación mediante la inclusión de material
de empaquetado en el compartimento de la línea de inoculación, la
inclusión de material rígido en las costuras o la superficie del
compartimento de la línea de inoculación, o la inclusión del
compartimento de la línea de inoculación en el compartimento de la
suspensión celular.
En la realización preferida, la longitud
completa de la inoculación es compatible con un soldador para
tubería estéril. En algunas realizaciones, parte de la tubería
diferente del extremo libre no es compatible con un soldador para
tubería estéril.
En esta realización, la tubería de inoculación
es una longitud única de tubería. En otras realizaciones pueden
intervenir juntas, codos u otros conectores en la tubería de
inoculación.
En la realización preferida, la longitud de la
tubería de inoculación en el interior del compartimento de la
tubería de inoculación es de 10-20 centímetros. En
otras realizaciones, la longitud de la tubería puede oscilar entre 3
centímetros y 3 metros.
El extremo de la línea de inoculación en el
interior del compartimento de la suspensión celular está abierto.
En esta realización, el extremo de la línea de inoculación penetra
la costura entre el compartimento de la suspensión y el
compartimento de la línea de inoculación. Adicionalmente, en algunas
realizaciones, existe un accesorio que penetra la costura entre el
compartimento de la suspensión celular y el compartimento de la
línea de inoculación, y el conjunto de transferencia se conecta a
este accesorio.
En la realización preferida, la línea de
inoculación tiene una flexión de noventa grados dentro del
compartimento de la línea de inoculación. Adicionalmente, en otras
realizaciones, la línea de inoculación puede:
- 1.
- no tener flexión, o
- 2.
- tener un número de flexiones de 90º diferentes de 1, pero entre una y veinte, o
- 3.
- tener de una a veinte flexiones en ángulos mayores o menores de 90º, o
- 4.
- tener de una a veinte flexiones en una combinación de ángulos, o
- 5.
- formar una espiral (señalar que una línea espiral puede ser más difícil de usar en conjunción con un soldador para tubería estéril).
En la realización preferida, el extremo libre de
la línea de inoculación se suelda bien herméticamente para evitar
la contaminación y para reducir la probabilidad de que la suspensión
celular migre a la línea de inoculación antes de que se vacíe la
bolsa. Adicionalmente, en algunas realizaciones, el extremo libre de
la línea de inoculación no se suelda bien herméticamente, sino que
en lugar de esto se cierra por medio de:
- 1.
- una válvula de bola, válvula de compuerta, válvula de mariposa, o dispositivos de control de flujo en línea comparables incorporados por el fabricante, o
- 2.
- una válvula de bola, válvula de compuerta, válvula de mariposa, o dispositivos de control de flujo en línea comparables incorporados, añadidos por el usuario, o
- 3.
- una pinza aplicada por el fabricante, o
- 4.
- una pinza aplicada por el usuario, o
- 5.
- un dispositivo de desconexión rápida con válvula incorporada, o
- 6.
- un dispositivo de desconexión rápida tapado por el fabricante, o
- 7.
- un dispositivo de desconexión rápida tapado por el usuario.
La Figura 5 ilustra también el compartimento del
puerto de espiga. En el caso en el que se dañe la línea de
inoculación, será posible drenar la bolsa por medio del puerto de
espiga. Debido a que el puerto de espiga está en su propio
compartimento, se puede acceder a éste sin pérdida adicional de la
suspensión celular desde la línea de inoculación.
Claims (6)
1. Un conjunto de bolsa de crioconservación del
banco celular de trabajo del fabricante que comprende:
- una bolsa de politetrafluoroetileno, comprendiendo la bolsa cuatro compartimentos separados y cerrados herméticamente, comprendiendo dichos compartimentos un compartimento de la suspensión celular, un compartimento del puerto de espiga, un compartimento de la línea de inoculación y un compartimento de marca;
- una primera longitud de tubería no de PVC que se puede usar para acoplar de manera estéril antes de la crioconservación y conectarse y comunicar con uno de los compartimentos cerrados herméticamente una segunda longitud de tubería no de PVC resistente a una temperatura de -180ºC que se puede usar para acoplar de manera estéril tras la crioconservación y conectarse a y comunicar con uno de los compartimentos cerrados, y
- un puerto de espiga que tiene medios para exportar células desde uno de los compartimentos.
2. El conjunto de bolsa de crioconservación de
la reivindicación 1, en el que el compartimento de la suspensión
celular comprende medios de conexión impermeable que unen dicha
primera longitud de tubería con dicho compartimento de la
suspensión celular, y a través del cual se pueden transferir las
células al interior de dicho compartimento.
3. El conjunto de bolsa de crioconservación de
la reivindicación 1, en el que el compartimento de la línea de
inoculación comprende medios de conexión herméticos resistentes a
una temperatura de -180ºC que unen dicha segunda longitud de
tubería con dicho compartimento de la suspensión celular y a través
de los cuales se pueden transferir las células al exterior de dicho
compartimento.
4. El conjunto de bolsa de crioconservación de
la reivindicación 3, en el cual la segunda longitud de tubería está
contenida en el interior del compartimento de la línea de
inoculación.
5. El conjunto de bolsa de crioconservación de
la reivindicación 1, en el que el puerto de espiga está encerrado
en el interior del compartimento del puerto de espiga.
6. El conjunto de bolsa de crioconservación de
la reivindicación 1, en el que el compartimento de marca comprende
una ranura de acceso configurada para permitir la inserción de una
marca en dicho compartimento de marca.
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