ES2331694T3 - Procedimiento para la caracterizacion y/o identificacion de mecanismos activos de sustancias de prueba antimicrobicas. - Google Patents
Procedimiento para la caracterizacion y/o identificacion de mecanismos activos de sustancias de prueba antimicrobicas. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para la identificación o caracterización del mecanismo activo de una sustancia antimicróbica, que comprende los siguientes pasos: a) Establecer espectros de referencia a través del tratamiento de determinados cultivos microbianos con sustancias de prueba, cuyo mecanismo activo es conocido, y el registro de, al menos, un espectro de grupo de espectros IR, FTIR, Raman y FT-Raman. b) Selección respectiva de, al menos, un rango de longitud de onda de estructura igual o similar, para diferenciar las clases pertenecientes al mecanismo activo correspondiente, y clasificación de los espectros de referencia en las clases en el banco de datos de referencia, asimismo, los espectros de referencia asignados a una clase presentan una estructura igual o similar en el rango de longitud de onda seleccionado, que se diferencia de manera significativa de la estructura de los espectros de referencia de otras clases en el rango de longitud de onda seleccionado c) tratamiento de un cultivo microbiano con la sustancia por evaluar d) registro de, al menos, un espectro (espectro de prueba) del grupo de espectros IR, FT-IR, Raman y FT- Raman; e) comparación del o de los espectros de prueba de d) con uno o múltiples espectros de referencia en el banco de datos de referencia, f) Asignación de los espectros de prueba a una, dos o múltiples clases de espectros de referencia en el banco de datos de referencia e identificación o caracterización del mecanismo activo.
Description
Procedimiento para la caracterización y/o
identificación de mecanismos activos de sustancias de prueba
antimicróbicas.
La presente invención comprende un procedimiento
para la caracterización y/o identificación de mecanismos activos,
especialmente, sustancias de prueba de acción antimicrobiana,
mediante análisis IR (infrarrojo), FT-IR
(infrarrojo por transformada de Fourier), Raman o
FT-Raman (Raman por transformada de Fourier).
Estudios epidemiológicos han demostrado que las
tasas de resistencia de microorganismos patógenos, por ejemplo, de
gérmenes bacterianos, contra sustancias inhibidoras e inhibidores
usuales en el mercado, por ejemplo, antibióticos, antimicóticos y
otros agentes quimioterapéuticos, se han incrementado en el
transcurso de las dos últimas décadas [Levy S.B. (2001) Antibiotic
resistance: consequences of inaction. (Resistencia a antibióticos:
consecuencias de la inacción. Clin Infect Dis Sep 15; 33 Suppl 3:
páginas 124-9]. Para seguir garantizando también en
el futuro el tratamiento terapéutico de infecciones bacterianas, en
este contexto de tasas de resistencia contra antibióticos
conocidos, en todo el mundo se realizan esfuerzos para identificar y
desarrollar nuevos compuestos cabeza de serie (leads) para la
terapia con antibióticos. Para ello, es de central importancia la
investigación y el desarrollo del mecanismo activo de tales
compuestos cabeza de serie antimicrobianos. Por el término mecanismo
activo (información de diana -target-) se entiende, en este caso,
la identificación de las rutas metabólicas hasta los procedimientos
moleculares individuales que se encuentran en relación causal con el
efecto antimicrobiano de un nuevo compuesto cabeza de serie. Por un
lado, el conocimiento de la estructura microbiana de destino, de la
diana, permite una optimización rápida y eficiente del compuesto
cabeza de serie in vitro, por ejemplo, en un análisis
subcelular de la diana (target-assay); por otro
lado, pueden reconocerse ya tempranamente potenciales efectos
secundarios toxicológicos basados en la inhibición de una diana
homóloga que posiblemente también se encuentre en el huésped, en
una contraprueba correspondiente. En el caso del conocimiento de la
diana molecular o del dominio de la diana, se puede impedir, por
otro lado, el desarrollo de una sustancia antimicróbica de prueba
con mecanismo activo no selectivo (por ejemplo, acción detergente
general destructora de membrana, destrucción del potencial de
membrana a través de ionóforos, intercalación en ácidos nucleicos),
gracias a lo cual se pueden ahorrar, entre otros, costos de
investigación.
Los antibióticos utilizados hoy en día en la
terapia de humanos se caracterizan por el efecto específico sobre
un metabolismo esencial para la supervivencia de la bacteria
(compárese, por ejemplo, con Graefe U. (1992) Biochemie der
Antibiótica (Bioquímica de los antibióticos), páginas
15-39, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg,
Berlin, New York). La mayor cantidad de las clases conocidas de
antibióticos inhibe o desregula la biosíntesis de macromoléculas
bacteriales, por ejemplo, ADN (ejemplos: quinolonas, novobiocina),
ARN (ejemplos: rifampicina, estreptolidigina, lipiarmicina,
holomicina), proteínas (ejemplos: macrólidos/quetólidos,
aminoglucosidos, tetraciclinas, oxazolidinonas) o peptidoglicano
(ejemplos: \beta-lactamas, fosfomicina,
vancomicina, moenomicina). Otros antibióticos actúan sobre la
inhibición de rutas metabólicas del metabolismo intermedio (por
ejemplo, sulfonamidas y trimetoprima como inhibidores del
metabolismo de C_{1}; cerulenina como inhibidor de la biosíntesis
de ácidos grasos).
Frecuentemente, el efecto antibiótico puede ser
atribuido directamente a la inhibición de una enzima definida o una
familia de enzimas; por ejemplo, las
\beta-lactamas inhiben de manera irreversible la
familia de enzimas de las proteínas de enlace de la penicilina
indispensables para la síntesis de las paredes celulares y
finalmente, inician con ello la autólisis de la célula bacterial.
En otros casos, las estructuras macromoleculares mayores, como los
ribosomas -complejos de ribonucleoproteína que catalizan la
traslación de ARNm en una secuencia de proteína- sirven como puntos
de ataque de antibióticos (por ejemplo, macólidos) (Graefe U. (1992)
Biochemie der antibiótica (Bioquímica de los antibióticos), páginas
15-39, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg,
Berlin, New York, Russell A.D., Chopra I. (1996) Understanding
Antimicrobial Action and Resistance (Comprender el efecto y la
resistencia antimicrobianos), segunda edición, páginas
28-83, Ellis Horwood, London).
Según el estado actual de la técnica, para
aclarar el mecanismo activo de sustancias de acción antimicrobiana
se utilizan, especialmente, los siguientes métodos, individualmente
o combinados:
- 1)
- En el experimento de extinción (Rybak M.J. et al. (2000) In vitro activities of daptomycin, vancomycin, linezolid, and quinupristin-dalfopristin against Staphylococci and Enterococci, including vancomycin- intermediate and -resistant strains. (Acciones in vitro de daptomicina, vancomicina, linezolida y quinupristina-dalfopristina contra estafylococos y enterococos, incluyendo cepas intermedias y resistentes a vancomicina) Antimicrob. Agents Chemother (Qumioterapia con agentes antimicrobianos) 44(4):1062-1066) la cantidad de bacterias sobrevivientes se determina dependiendo del tiempo de acción de la sustancia por evaluar en comparación con el cultivo de control, no tratado, por lo demás, en las mismas condiciones de crecimiento. Sin embargo, esto sólo permite una diferenciación gruesa entre sustancias bacteriostáticas (que inhiben el crecimiento) y bactericidas (que destruyen las bacterias).
- 2)
- En la prueba de incorporación de metabolitos (Oliva B. et al. (2001) Antimicrobial properties and mode of action of the pyrrothine holomycin (Propiedades antimicróbias y modo de acción de pirrotina holomicina). Antimicrob. Agents Chemother. (Qumioterapia con agentes antimicrobianos) 45, páginas 532-539) las células bacteriales son incubadas en condiciones adecuadas de cultivo, en presencia del compuesto cabeza de serie a evaluar con precursores marcados radiactivamente para rutas importantes metabólicas (por ejemplo, [14C]-timidina, [14C]-uridina, [14C]-leucina, [14C]-N-acetilglucosamina), se incorporan de manera selectiva con material de alto peso molecular, precipitable con ácidos o solventes orgánicos (ADN, ARN, proteína, peptidoglicano). Tras la separación de la sustancia con marcador radioactivo de alto peso molecular de la de bajo peso molecular a través de filtración o centrifugación, la radioactividad en la fracción de alto peso molecular representa una medida para la potencia de síntesis de la célula en la ruta respectiva del metabolismo. Esta prueba se puede automatizar (Renick P. J. y Morris, T. W. (2000) Simultaneous parallel assays for inhibition of major metabolic pathways in intact cells of Staphylococcus aureus (Análisis simultáneos paralelos para la inhibición de rutas mayores de metabolismo en células intactas de staphylococcus aureus). Poster F-2023 Sesión 211, 40th Interscience Conference on Antibacterial Agents and Chemotherapy, (40ª Conferencia interciencia sobre agentes antibacteriales y quimioterapia) Toronto) pero detecta exclusivamente dianas en el área de la biosíntesis macromolecular. Las dianas en el área de las rutas metabólicas intermedias en general no son registradas. Otra restricción del procedimiento es la dependencia de la disponibilidad de etapas previas selectivas marcadas radioactivamente.
- 3)
- en el caso de los métodos genéticos (Zhang L. et al. (2000) Regulated gene expression in Staphylococcus aureus for identifying conditional lethal phenotypes and antibiotic mode of action. (Expresiones reguladas de genes en staphylococcus aureus para la identificación de fenotipos condicionales letales y modos de acción antibióticos). Gene (Genes) 255(2):297-305) se utiliza, sobre todo, en la construcción de mutantes de sobreexpresión o infraexpresión (cepas de cultivo o bibliotecas de mutantes individuales) que frecuentemente producen una modificación de la sensibilidad respecto del compuesto cabeza de serie a evaluar, en tanto la mutación afecta a un gen de la ruta metabólica. Otro modo de proceder consiste en la selección de mutantes resistentes a la sustancia de prueba. A partir del ADN genómico de estos mutantes se puede obtener una biblioteca de vectores en base a, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, bacteriófagos, entre otros. Mediante técnicas usuales de genética molecular y microbiología es posible identificar la mutación y limitar, con ello, la diana o identificar un gen relacionado con la diana. Estos métodos significan un trabajo muy intenso, no pueden ser automatizados y por ello cuestan mucho tiempo y muchos recursos.
- 4)
- Los experimentos de enlace, para comprobar directamente el enlace del compuesto cabeza de serie a evaluar a su diana, frecuentemente son indicaciones muy directas del mecanismo activo (Spratt B.G. (1977) Properties of penicillin-binding proteins of Escherichia coli K12 (Propiedades de proteínas de enlace de penicilina de escherichia coli K12). Eur. J. Biochem. 72:341-352). A su vez, se aprovecha el hecho de que la interacción entre sustancias de acción antimicrobiana y sus puntos de acción en general son muy fuertes (por ejemplo, enlace covalente en el caso de beta-lactamas) y, con ello, frecuentemente superan las manipulaciones analíticas para el aislamiento y la detección del complejo inhibidor de la diana. Sin embargo, es desventajoso que, en general, deban estar a disposición inhibidores marcados adecuados (por ejemplo, radioactivamente) que frecuentemente no se pueden conseguir o se consiguen con un costo elevado y, especialmente en el caso de interacciones más débiles, no covalentes, el complejo deseado no puede ser aislado. A ello se añade que, para cada caso individual se establece un procedimiento nuevamente adaptado (por ejemplo, dependiendo de la localización subcelular de la diana, de la naturaleza del enlace entre la diana y el inhibidor).
\vskip1.000000\baselineskip
El método descrito para la caracterización de la
diana presenta la desventaja de que, como en el caso del
experimento de extinción, sólo brindan una cantidad reducida de
información, o no pueden ser aplicados en general y de manera
uniforme en los diferentes dominios de la diana y, además, requieren
de mucho tiempo. En ciertos casos particulares, la aclaración del
mecanismo activo puede extenderse durante varios años. Es así que
incluso 14 años tras la primera descripción de la daptomicina (Allen
N. E. et al. (1987) Inhibition of peptidoglycan biosynthesis
in gram-positive bacteria by LY146032 (Inhibición de
biosíntesis de peptidoglicano en bacterias grampositivas por
LY146032). Antimicrob. Agents Chemother. (Quimioterapia con agentes
antimicrobianos) 31, 1093-1099) aún no se ha
esclarecido completamente el mecanismo activo molecular.
La memoria WO 91/05238 comprende un
procedimiento para la caracterización de microorganismos. Como punto
de partida de la categorización, se utilizan características
espectrales del microorganismo. Como otros parámetros que sirven
para la clasificación del microorganismo, se utiliza la sensibilidad
a los antibióticos. El antibiótico se utiliza como agente para
provocar una reacción del microorganismos, a partir de la cual se
analizan las características espectrales del microorganismo y de
ese modo, de clasifica el microorganismo.
D. NAUMANN: "Infrared and NIR Raman
Spectroscopy in Medical Microbiology" (Espectroscopia infrarroja
y NIR Raman en microbiología médica), PROCEEDINGS OF SPIE (Actas de
SPIE), H.H. MANTSCH Y M., JACKSON (EDS.), vol. 3257, - 1998 páginas
245-257, comprende la investigación de células
intactas mediante análisis FT-IR y
FT-Raman. La huella espectral se utiliza para
hallar información acerca del microorganismo analizado. Para
diferenciar los espectros de los microorganismos se utiliza un
análisis estadístico multivariado o una red reuronal.
N. A. NGO THI et. al.
"FT-IR microspectrometry: a new tool for
characterizing microorganisms" (Microsespectroscometría
FT-IR: una nueva herramienta para caracterizar
microorganismos), BIOMEDICAL SPECTROSCOPY: VIBRATIONAL SPECTROSCOPY
AND OTHER NOVEL TECHNIQUES (Espectroscopia médica: espectroscopia
vibracional y otras técnicas novedosas), SAN JOSE, CA, USA,
26-27 JAN. 2000, vol. 3918, páginas
36-44, 2000, SPIE-Int. Soc. Opt.
Eng, USA, también describe el análisis espectral de
microorganismos. Cultivos tratados con oxacilina son comparados con
cultivos no tratados, para analizar más de cerca los cultivos.
ZEROUAL WIDAD ET AL:
"FT-IR spectroscopy study of perturbations induced
by antibiotic on bacteria (Escherichia coli)"
(Espectroscopia FT-IR Estudio de perturbaciones
inducidas por antibióticos en bacterias (escherichia coli).
PATHOLOGIE BIOLOGIE (Biología patológica, vol. 43 Nº 4, 1995,
páginas 300-305, describe la espectroscopia
FT-IR para el análisis de los efectos de los
antibióticos sobre una bacteria expuesta a diferentes antibióticos.
Las modificaciones espectrales del cultivo se utilizan para analizar
más de cerca los mecanismos de reacción de la bacteria. El objeto
del estudio es analizar la capacidad de la espectroscopia
FT-IR, detectar las modificaciones espectrales a
través de los antibióticos y esclarecer estas modificaciones.
Finalmente se menciona que se puede estudiar la respuesta
fisiológica de microorganismos a los antibióticos.
En C. KIRSCHNER ET AL.:
"FT-IR Spectroscopic Investigations of Antibiotic
Sensitive and Resistant Microorgansims", (Investigaciones
espectroscópicas de FT-IR acerca de microorganismos
sensibles y resistentes a antibióticos) POSTER: 8TH EUROPEAN
CONFERENCE ON THE SPECTROSCOPY OF BIOLOGICAL MOLECULES, (Sesión de
Poster: 8a Conferencia europea de espectroscopia de moléculas
biológicas) ENSCHEDE, Países Bajos, se describe el uso de
investigaciones FT-IR y NIR Raman, para detectar
espectros de microorganismos. FT-IR se utiliza para
analizar la sensibilidad de los microorganismos ante los
antibióticos, para clasificar el microorganismo. Se utiliza un solo
antibiótico conocido para distinguir organismos resistentes a
antibióticos de los organismos no resistentes a antibióticos.
En D. NAUMANN: "Biophysikalische
Strukturanalysen" (Análisis estructurales biofísicos), ROBERT
KOCH INSTITUT FORSCHUNGSPROJEKTE (Proyectos de investigación del
Instituto Robert Koch), PROF. DR. D. NAUMANN, 2000, páginas
1-4 se describen investigaciones
FT-IR para microorganismos, para analizar los
microorganismos en lo que respecta a su resistencia a los
antibióticos. Las investigaciones se utilizan para analizar los
mecanismos activos dentro de los microorganismos. Los mecanismos
activos dentro de los microorganismos deben ser útiles a la
optimización de antibióticos; el objeto de las observaciones son los
mecanismos activos.
La memoria WO 94 11526 A describe la
identificación de microorganismos mediante espectroscopia UV. Para
analizar la resistencia ante antibióticos de los microorganismos se
registra la tasa de crecimiento a partir de ribosomas bajo la
influencia de antibióticos. Como antibiótico se utiliza solamente
una única sustancia activa (rifampina) cuyo efecto ya es
conocido.
En MASON DAVID J ET AL: "An inexpensive
infrared growth sensor array for detection of bacterial antibiotic
susceptibility"., (Un conjunto económico de sensores infrarrojos
de crecimiento para la detección de la sensibilidad de las
bacterias ante antibióticos) FEDERATION OF EUROPEAN MICROBIOLOGICAL
SOCIETIES (Federación europea de sociedades de microbiología),
MICROBIOLOGY (Microbiología) vol. III, nº 2-3, 1993,
páginas 251-254, se describe la investigación de un
cultivo bajo influencia de antibióticos conocidos. La resistencia
del cultivo a los antibióticos se determina a partir de las cepas
de cultivo de control, con las cuales se compara el cultivo, a
partir de la permeabilidad de la luz IR de una longitud de onda
individual determinada.
Estos documentos del estado actual de la técnica
muestran, con ello, que los cultivos se pueden diferenciar a partir
del criterio de la resistencia a antibióticos, asimismo, en
principio se utilizan los mismos antibióticos ya conocidos. Además,
se describe cómo se deben ilustrar mejor el efecto sobre los
cultivos mediante tratamiento con antibióticos, también en este
caso se utiliza, en principio, un sólo antibiótico conocido, para
fundar los estudios en la misma base y hacer posible la
comparación. Todos los documentos citados están orientados a la
clasificación/observación de cultivos no analizados completamente,
un antibiótico se utiliza, en este caso, como medio para iniciar
una reacción y para poder deducir características de los cultivos
analizados, a partir de dicha reacción.
Además de los métodos mencionados de
identificación de diana, también se describieron los principios de
la utilización de técnicas físicas de medición, por ejemplo, la
espectroscopia FT-IR para la caracterización del
mecanismo activo de sustancias de acción antibacterial (Naumann D.
et al. (1991) The characterization of microorganisms by
Fouriertransform infrared spectroscopy (FT-IR) (La
caracterización de microorganismos mediante espectroscopia
infrarroja de transformada de Fourier (FT-IR)). En:
Modem techniques for rapid microbiological analysis (Técnicas
modernas para el análisis microbiológico rápido), Nelson W. H.,VCH,
páginas 43-96, Weinheim; EP 0 457 789 B1). El
principio de este procedimiento consiste en una comprobación
espectroscópica de la modificación de la composición molecular,
inducida por la incubación de la célula bacterial con la sustancias
de prueba, en comparación con un cultivo de control no tratado.
Este procedimiento se basa en una evaluación de cintas en forma de
integrales de superficie comparadas entre sí. Sirve para la
interpretación del lugar en que se produjo una modificación
molecular en la célula sin poder derivar a partir de ello un típico
modelo de acción. El procedimiento puede ser reproducido, pero en
la forma descrita no puede ser utilizado de manera general y
uniforme, ni puede ser automatizado. Sobre todo, no se pueden
analizar, por ejemplo, nuevos mecanismos activos para los cuales no
se cuenta, aún, con inhibidores como enlaces de referencia. Además,
el procedimiento requiere de diferentes análisis, según el tipo de
mecanismo
activo.
activo.
La presente invención tiene como objeto
desarrollar un procedimiento para la caracterización y/o
identificación de mecanismos activos de sustancias de prueba
antimicróbicas. El procedimiento acorde a la invención debe ser más
rápido y permitir una caracterización y/o identificación uniforme de
diferentes mecanismos activos y también ser aplicable de manera
efectiva, a través de posibilidades de automatización, en la
investigación y el desarrollo industriales, así como en
laboratorios rutinarios.
Este objeto se alcanza a través del
procedimiento acorde a la invención para la caracterización de una
sustancia antimicróbica que contiene los siguientes pasos:
- a)
- tratamiento de un cultivo microbiano con la sustancia por evaluar;
- b)
- registro de, al menos, un espectro (espectro de prueba) del grupo de espectros IR, FT-IR, Raman y FT-Raman;
- c)
- comparación del o de los espectros de prueba de b) con uno o múltiples espectros, clasificados en una, dos o más clases (espectros de referencia) de cultivos microbianos tratados con sustancias de referencia,
- d)
- asignación de los espectros de prueba a una, dos o múltiples clases de espectros de referencia en el banco de datos de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
En un modo de ejecución preferido de la presente
invención, la comparación se realiza con procedimientos matemáticos
de reconocimiento de patrones.
En otro modo de ejecución preferido de la
presente invención, los espectros de referencia y/o espectros de
prueba son procesados de manera tal que se permite un reconocimiento
automático de las modificaciones y patrones característicos
espectrales.
En otro modo de ejecución preferido de la
presente invención, la clasificación se realiza a través de un
reconocimiento de patrones, que puede clasificar simultáneamente
dos o más clases.
En otro modo de ejecución preferido de la
presente invención, la información característica de una muestra
espectral para una de las clases es almacenada en un modelo de
clasificación o en forma de los pesos en redes neuronales
artificiales.
En un modo de ejecución preferido de la presente
invención, la comparación de los espectros de prueba se realiza con
los espectros de referencia, a través del modelo de
clasificación.
Los grupos funcionales de todos los componentes
bioquímicos de un cultivo microbiano, como péptidos, proteínas,
polisacáridos, fosfolípidos, ácidos nucleicos y metabolitos
intermedios contribuyen a un espectro de este cultivo y arrojan
como resultado una huella específica, bioquímica. Los espectros
presentan una composición muy compleja debido a la gran cantidad de
componentes y reflejan muchos modos diferentes de vibración de la
biomolécula de la pared celular, de la membrana citoplasmática, del
citoplasma así como de las sustancias polímeras extracelulares (por
ejemplo, peptidoglicano, lipopolisacáridos, ácido (lipo) teiconico).
Los espectros son muy específicos, a pesar de su complejidad, para
una composición, característica o un estado de un cultivo
microbiano, que, preferentemente, es un cultivo microbiano puro.
Dado que la composición, el estado y las características de
cultivos microbianos cambian bajo la influencia de un tratamiento
con sustancias antimicróbicas de manera específica, dependiente de
la sustancia, la detección espectroscópica de estas modificaciones
puede ser utilizada para la identificación y/o caracterización del
mecanismo activo. En el caso del mecanismo activo se puede tratar,
por ejemplo, de inhibidores de la biosíntesis de proteínas, del
metabolismo del ARN o del ADN, del metabolismo de la pared celular
o de lípidos, de sustancias membranotropas o intercaladores de ADN.
Los mecanismos activos mencionados deben entenderse como ejemplos, y
de ninguna manera como exhaustivos, y pueden ser completados
fácilmente por cualquier especialista del
área.
área.
Gracias al procedimiento acorde a la invención
se relacionan las ventajas de una técnica de medición
espectroscópica con una evaluación matemática decidida del
contenido de información de los espectros.
El banco de datos de referencia es conformado
tratando determinados cultivos microbianos con sustancias de prueba
cuyo mecanismo activo es conocido, con ajustes exactamente análogos
de todas las condiciones de cultivo, como temperatura, valor de pH,
medio de cultivo y duración temporal. De los cultivos microbianos
así tratados se toman espectros de referencia y estos se asignan en
el banco de datos de referencia a la clase a la cual pertenece el
correspondiente mecanismo activo.
Los espectros de referencia asignados a una
clase presentan una estructura igual o similar en uno o múltiples
rangos de longitud de onda seleccionados, que se diferencia de
manera significativa de la estructura de los espectros de
referencia de otras clases en los rangos de longitud de onda
seleccionados.
La selección de rango de longitud de onda para
la diferenciación de las clases ("feature selection") se puede
llevar a cabo a través de diferentes procedimientos, por ejemplo,
por el análisis de variancias, análisis de covariancias, análisis
factorial, medición de distancia estadística, como la distancia
euclidiana o la distancia de Mahalanobis o una combinación de estos
métodos con un procedimiento de optimización, como los algoritmos
genéticos. Utilizando o combinando los algoritmos genéticos se puede
llevar a cabo una búsqueda automatizada y optimizada de la longitud
de onda. Asimismo, las longitudes de onda se componen de manera más
rápida y eficiente y óptimas para la clasificación en una
clasificación jerárquica (ranking). Lo fundamental es, en este
caso, que se lleva a cabo una identificación automatizada de los
rangos espectrales, que significa una contribución a la
modificación espectral. Con estos rangos identificados puede
conformarse un sistema de clasificación automatizado. El modo
preferido de evaluación es a través de una combinación de algoritmos
genéticos y el análisis de covariancias.
Antes de la selección de longitud de ondas se
puede llevar a cabo un procesamiento previo de los espectros de
referencia para incrementar el contraste espectral o a través de la
formación de derivaciones, deconvolución, filtrado, supresión de
ruidos o reducción de datos a través de la transformación wavelet o
descomposición factorial.
La división (clasificación) en los espectros de
referencia en las clases en el banco de datos de referencia se
lleva a cabo a través de métodos matemáticos de clasificación del
reconocimiento de patrones, como procedimientos estadísticos
multivariados del reconocimiento de patrones, redes neuronales,
métodos de la clasificación basada en casos, o del aprendizaje
artificial, de algoritmos genéticos o de métodos de la programación
evolucionaria. Se utilizan múltiples redes neuronales artificiales
como red feed-forward con tres capas y un método de
descenso de gradiente como algoritmo de aprendizaje. El sistema de
clasificación puede presentar una estructura tipo árbol, asimismo,
las tareas de clasificación se descomponen en tareas parciales y los
sistemas de clasificación individuales se combinan en una unidad
formando un sistema de clasificación jerárquico y, a su vez, durante
la evaluación se recorren automáticamente todas las etapas
jerárquicas. En este caso, en las etapas individuales en el sistema
de clasificación se puede tratar de redes neuronales optimizadas
para tareas especiales.
También es posible una combinación de redes
neuronales y un algoritmo genético, para llevar a cabo la
optimización de la clasificación a través de redes neuronales. La
optimización puede, por ejemplo, llevarse a cabo a través de la
mejora de la arquitectura de red o el algoritmo de aprendizaje.
El banco de datos de referencia también puede
presentar la forma de una red neuronal artificial, en la cual están
almacenadas las informaciones espectrales en forma de pesos
neuronales y pueden ser utilizadas para la evaluación.
En principio, sólo se requiere una única vez la
conformación del banco de datos de referencia para la
caracterización y/o identificación de los mecanismos activos en un
cultivo microbiano. Por otro lado, en todo momento es posible
ampliar la base de datos de referencia. Esto puede ocurrir, por
ejemplo, incluyendo otras sustancias en las clases de mecanismos
activos que ya están contenidas en el banco de datos de referencia.
Independientemente de ello, el banco de datos de referencia también
puede ser ampliado con clases de mecanismos activos que hasta ahora
no estaban incluidas en él. En estos casos, es necesaria una nueva
configuración o añadidura del banco de datos como ya se ha
descrito, asimismo, aquellos juegos de datos espectrales que ya han
sido utilizados para la conformación del banco de datos anterior,
no deben ser elevados nuevamente mientras el microorganismo
utilizado, sus condiciones de cultivo y los parámetros de medición
espectral no se hayan modificado.
La asignación de un espectro de prueba a una,
dos o múltiples clases de los espectros de referencia puede
efectuarse a través de los métodos de clasificación matemáticos,
basados en el reconocimiento de patrones. Sobre todo los métodos
que permiten una clasificación simultánea en múltiples clases, por
ejemplo, en el caso de una clasificación a través de redes
neuronales artificiales, son adecuados para la clasificación
automatizada y eficaz de múltiples clases. También son adecuados,
en principio, el procedimiento basado en la función de densidad de
probabilidad, de la matriz de correlación, métodos de la
clasificación basada en casos o de aprendizaje artificial,
algoritmos genéticos o métodos de programación evolucionaria. El
sistema de clasificación puede estar conformado por múltiples
subunidades, que presentan una estructura tipo árbol, asimismo, las
tareas de clasificación se descomponen en tareas parciales y los
sistemas de clasificación individuales se combinan en una unidad,
formando un sistema de clasificación jerárquico y, a su vez, durante
la evaluación se recorren automáticamente todas las etapas
jerárquicas.
El espectro de prueba de una sustancia con un
mecanismo activo desconocido es realizado con el o los cultivos de
exactamente el mismo tipo (cepa idéntica de microorganismos), que
también se utilizan en el registro de los datos de referencia.
Además, todas las condiciones de cultivo (por ejemplo, temperatura,
valor de pH, medio de cultivo y periodo de tiempo) deben coincidir
exactamente con aquellos utilizados en la confección del banco de
datos de referencia.
La asignación de un espectro de prueba a una,
dos o múltiples clases de espectros de referencia se lleva a cabo a
través de métodos matemáticos de clasificación del reconocimiento de
patrones, como procedimientos estadísticos multivariados del
reconocimiento de patrones, redes neuronales, métodos de la
clasificación basada en casos, o del aprendizaje artificial, de
algoritmos genéticos o de métodos de la programación
evolucionaria.
El tratamiento del cultivo microbiano antes del
registro de los espectros puede llevarse a cabo de la siguiente
manera: Los microorganismos (gérmenes de prueba) son cultivados en
un medio nutritivo adecuado microbiológico, que puede ser líquido o
sólido. Luego, la sustancia de prueba o la sustancia de referencia
es puesta en contacto con las bacterias. Tras concluir el tiempo de
acción adecuado que es, preferentemente, de entre cinco y 500
minutos, las bacterias tratadas son separadas de la sustancia de
prueba o la sustancia de referencia, por ejemplo, por
centrifugación o filtración en el caso de que se realice el
procedimiento en un cultivo líquido, o mediante toma de células de
un medio nutritivo sólido mediante un asa de siembra. Para retirar
los restos del aparato de verificación, las células son lavadas una
vez en un volumen adecuado, pero mejor aún, reiteradas veces.
\newpage
Luego pueden ser registrados los espectros. Los
pasos de trabajo de la filtración o centrifugación también pueden
ser evitados, llevando a cabo la medición de gérmenes de prueba con
sustancia de prueba en comparación con un control no tratado de los
gérmenes de prueba. Luego, se lleva a cabo una sustracción
automatizada de los espectros. El espectro obtenido de este modo
sólo está basado en las modificaciones provocadas por la sustancia
activa.
El procedimiento acorde a la invención también
puede ser realizado con espectros IR, FT-IR, Raman y
FT-Raman.
El registro de espectros IR se lleva a cabo,
habitualmente, en el rango espectral del denominado infrarrojo
medio, entre 500 - 4000 cm^{-1}, pero también puede ser medido en
un rango infrarrojo cercano, entre 4000 y 10.000 cm^{-1} o
completado en este rango.
Para el registro de espectros IR o Raman puede
utilizarse cualquier disposición de medición espectroscópica
conocida, como transmisión/absorción, reflexión total debilitada,
reflexión directa o difusa o técnica de conducción de luz IR. Es
especialmente ventajosa la medición en transmisión/absorción.
Las muestras del cultivo microbiológico son,
preferentemente, sólidas o líquidas. En la medición es ventajosa la
implementación de multicubetas para múltiples muestras o la
implementación de técnicas microespectrométricas. Entre ellas se
cuentan la microscopia FT-IR y Raman,
FT-Raman u otros procedimientos de focalización de
haz. De este modo, se puede alcanzar una minimización de la
cantidad de muestras y llevarse a cabo la implementación de un
procesamiento automatizado de muestras, para incrementar el
rendimiento de las muestras y posibilitar un establecimiento del
high-throughput-screening, o cribado
ultrarrápido. También pueden utilizarse soportes de muestras como
los utilizados para placas microtiter, o cubetas de flujo. También
la implementación de cubetas de flujo, acoplada a un sistema de
tarea de prueba HPLC, posibilitaría un incremento del rendimiento de
las muestras. También es posible la implementación de conductores
de luz infrarroja para una automatización de la medición más
independiente de la posición.
Como material para las cubetas y soportes de
muestras de las variantes de preparación descritas pueden utilizarse
todos los materiales ópticos insolubles en agua utilizados
usualmente en la espectroscopia IR, por ejemplo, Ge, ZnSe,
CaF_{2}, BaF_{2}, asimismo, para un elemento multimuestras
demostró ser adecuado el ZnSe. Pero también las placas de metal o
las rejillas de micrometal son adecuadas como soportes de muestras,
especialmente si están concebidas a escala de las placas de
microtiter, para una gran cantidad de muestras y como material
descartable.
Las cantidades de muestra para los registros de
espectros IR pueden mantenerse muy reducidas y ser de unos pocos
\mul (2-5 \mul). Según las condiciones
predeterminadas con o sin focalización de haz, pueden implementarse
cantidades de sustancia de \mug a ng. Los diámetros del área de
muestra atravesada por el haz varían de entre 1 a 6 mm, en el caso
de una microfocalización, entre 5 y 50 \mum.
En el caso de mediciones Raman, también es
adecuada una medición en un cultivo líquido, que se puede efectuar
directamente en los recipientes del preparado de la muestra, por
ejemplo, en placas de microtiter. De ese modo puede alcanzar una
notable ventaja temporal y un mayor grado de automatización, dado
que, de ese modo, se acortan los tiempos de desarrollo y se
suprimen pasos de preparación de las muestras. Gracias a la
utilización de una conducción confocal de haz puede llevarse a cabo
un posicionamiento optimizado de la señal de Raman, para eliminar
señales parásitas y mejorar la relación señal/ruido. Una disposición
de fuentes de luz utilizadas simultáneamente o una correspondiente
multiplicación de la luz de accionamiento y conducción hacia la
muestra para la medición Raman, así como la utilización de
detectores implementados en paralelo (por ejemplo, CCDs) puede
incrementar adicionalmente el rendimiento de las muestras y la
automatización.
La sustancia de prueba puede ser una sustancia
inhibidora. La concentración de la sustancia inhibidora con la cual
es tratado el cultivo bacterial, se encuentra, preferentemente, en
el rango de 0,1 a 20 veces la concentración mínima para la
sustancia inhibidora (MHK) para la sustancias de prueba. La
concentración mínima de la sustancia inhibidora (MHK) es una
concentración mínima de un antibiótico, con el cual es inhibido el
crecimiento de un germen de prueba durante 18-24 h.
La concentración de la sustancia inhibidora puede ser determinada, a
su vez, acorde a determinados procedimientos microbiológicos
estándar (véase, por ejemplo, The National Committee for Clinical
Laboratory Standards. Methods for dilution antimicrobial
susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved
standardfifth edition (Comité nacional de estándares de laboratorio
clínico. Métodos para pruebas de susceptibilidad de la dilución del
antimicrobiano para bacterias de crecimiento aeróbico, quinta
edición estándar aprobada). NCCLS, documento M7-A5
[ISBN
1-56238-394-9].
NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania
19087-1898 EE.UU., 2000.). Los espectros de prueba
son tomados por un cultivo microbiano que había sido tratado
respectivamente con la sustancia inhibidora, o bien en una
concentración, pero, preferentemente, en múltiples concentraciones
diferentes.
El procedimiento acorde a la invención es
adecuado para el análisis de diferentes cultivos celulares. Un grupo
preferido de cultivos son los cultivos microbianos celulares como
bacterias, hongos, levaduras, arqueobacterias y similares. Pero la
invención también comprende el análisis de cultivos celulares de
origen no microbiano, por ejemplo, células cancerígenas, células
con función inmunológica, células epiteliales, células vegetales y
similares. Con ello, acorde a la invención están cubiertas tanto las
utilizaciones en el área de la caracterización celular funcional
como así también el área de investigaciones toxicológicas.
El procedimiento acorde a la invención se
caracteriza porque es sensible y puede ser estandarizado y
reproducido. Puede ser aplicado en forma general y uniforme en
diferentes mecanismos activos. Es económico y arroja resultados
rápidos.
Otra ventaja del procedimiento acorde a la
invención consiste en la posibilidad de incorporar mutantes del
germen de prueba utilizado, asimismo, la mutación produce la
subexpresión de determinada diana y, de este modo, ajusta la
inhibición de esta diana a través de un inhibidor potencial. Acorde
al estado actual de la técnica, hoy en día tales mutantes pueden
ser obtenidos fácilmente para cualquier diana (Guzman L.M. et
al. (1995) Tight regulation, modulation, and
high-level expression by vectors containing the
arabinose (Regulación estrecha, modulación y expresión de alto
nivel por vectores que contienen la arabinosa) (PBAD promoter. J.
Bacteriol. 177 (14):4121-30). De esta manera también
se puede determinar el mecanismo de las sustancias inhibidoras sin
tales dianas, para los cuales aún se desconocen inhibidores de
referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la obtención de un cultivo de una noche se
inyectan 22 ml de medio mínimo Belitsky (Stuhlke et al.
(1993) Temporal activation of beta-glucanase
synthesis in Bacillus subtilis is mediated by the GTP pool
(La activación temporal de la síntesis de
beta-glucanasa en el bacillus subtilis es
mediada por el pool de GTP). J. Gen. Microbiol. Septiembre de 1993;
139 (Pt 9):2041-5) con una alícuota del germen de
prueba bacillus subtilis 168, de un cultivo permanente
almacenado a -80ºC, y se incuban a 37ºC, 200 rpm. El cultivo, que
tras 16-18 h presentaba un OD_{500} de
1,0-1,6, se diluyó con medio mínimo Belitsky a un
OD_{500} de 0,01 (corresponde a una cantidad de gérmenes de,
aproximadamente, 0,8-2x10^{5} gérmenes por ml) y
se incubó con los preparados por evaluar, presentados en el mismo
medio, a una escala de 1:1 de una placa de microtiter de 96 y una
dilución serial de 1:2. Como MHK se indicó la concentración más
baja de un inhibidor, en la cual tras 18-24 de
incubación a 37ºC y no se observó crecimiento bacterial. En la
tabla 1 se indican los valores de MHK de las sustancias de
referencia utilizadas para confeccionar el banco de datos de
referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Partiendo de un cultivo de una noche, cuya
obtención se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente, se
inocularon 50 ml calentados a 37ºC de medio mínimo Belitsky con,
respectivamente, 1 ml del cultivo de una noche y se incubaron a
37ºC, con 200 revoluciones. En la fase exponencial de crecimiento a
OD_{500} 0,25 - 0,27 se agregaron las sustancias en las
concentraciones de la tabla 1 y se incubaron las soluciones durante
otros 150 minutos. Como control se llevó a cabo, conjuntamente con
cada experimento, un cultivo no tratado para una determinación
simple. Para determinar variancias internas, se evaluó cada
preparado en cada concentración en cinco determinaciones o
análisis. Las concentraciones utilizadas se seleccionaron en el
campo previo a partir de un experimento de crecimiento de modo tal
que, aunque tras 150 minutos de tiempo de acción se hizo visible un
efecto sobre la velocidad de crecimiento, en comparación con un
cultivo de control no tratado, no se habían iniciado aún ningún
proceso lítico, ni en la curva de crecimiento ni tras el análisis
microscópico.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras el tratamiento de la célula bacterial con
la sustancias de referencia o de prueba durante 150 minutos, se
separaron por centrifugación, respectivamente, 20 ml de cultivos en
una centrífuga Heraeus Sepatech Minifuge T, a 5500 x g (5650 rpm)
durante 10 minutos, a 16ºC. Los sedimentos celulares se lavaron dos
veces con, respectivamente, 1 ml de agua, asimismo, las células se
sedimentaron entre los pasos de lavado en una centrífuga Eppendorf
a 13000 rpm, durante 10 minutos. Finalmente, las muestras se
absorbieron en agua y se resuspendieron cuidadosamente, de modo que
tras un secado posterior de 30 minutos de, respectivamente, 35
\mul de células a 40-50 mbar, a temperatura
ambiente, con P_{4}O_{10} formaron películas homogéneas de
bacterias cuya absorción se hallaba en el rango de 0,345 a 1,245
unidades de absorción (AU). Los espectros FT-IR de
los cultivos bacteriales tratados con las sustancias de prueba
fueron registrados mediante un espectómetro IFS 28B
FT-IR (Bruker, Ettlingen) en el modo de absorción,
con un soporte de muestra de ZnSe para 15 posiciones de muestras.
Los espectros se registraron con un detector DTGS y 64 escaneos en
el rango de longitud de onda de 4000 - 500 cm^{-1}. La
transformada de Fourier se llevó a cabo en una función de
apodización de Blackman-Harris de tres términos así
como un factor de llenado de ceros (zero-filling) de
4 para alcanzar una resolución espectral de 6 cm^{-1}. Para
minimizar los artefactos por vapor de agua en el aire del entorno,
al espectómetro se le suministró permanentemente
500-1000 1/h de aire seco, generado mediante un
secador de aire Zander. La proporción de vapor de agua fue medida,
durante el registro de los espectros, en el rango de 1837 a 1847
cm^{-1} y no superó las 0,0003 AU. En estas condiciones, el ruido
no fue mayor que 0,0003 AU en el área de 2000 a 2100 cm^{-1}. Una
prueba para el control de calidad de los espectros
FT-IR medidos se aplicó a los espectros, con valores
umbral para la absorción mínima (0.345 AU) y la absorción máxima
(1.245 AU), lo cual se halla en el área de linealidad del detector.
Antes de cada medición en una muestra se tomó un espectro de fondo
para compensar de esta manera el fondo. Para cada muestra se
realizaron 5 mediciones independientes, para registrar las
variancias entre medición y medición para cada muestra. La
reproductibilidad del registro de espectros a lo largo de un periodo
de tiempo de seis meses está representado en la imagen 2. El
control del espectrofotómetro se llevó a cabo mediante el Optics
User Software OPUS 3.0 (versión 970717.0) de Bruker, Ettlingen,
Alemania. El procedimiento matemático descrito a continuación, para
la evaluación de datos, se aplicó para incrementar el contraste
espectral en los espectros FT-IR, tras la
conformación de la primera derivación, utilizando un algoritmo
Savitzki-Golay (Savitzky A. and Golay M.J. (1964)
Smoothing and differentiation of data by simplified least square
procedures (Suavizar y diferencias datos mediante procedimientos de
mínimos cuadrados simplificados). Anal. Chem. 36:
1627-1638) teniendo en cuenta 9 puntos de alisado y
la realización una normalización vectorial.
Para la configuración del modelo matemático de
clasificación se tomaron como base los espectros de referencia tras
la formación de la primera derivación. Luego se llevó a cabo una
normalización a los fines de obtener una comparabilidad espectral
en lo que atañe a las intensidades, mediante una normalización
vectorial (manual del software OPUS, página 126, Firma Bruker
Ettlingen). Luego se llevó a cabo la clasificación de los datos de
referencia en la cantidad deseada de diferentes mecanismos activos,
en este ejemplo, una cantidad de 7 grupos principales (véase imagen
1). Los espectros de referencia se clasificaron según su
correspondencia con estos 7 grupos principales. El objeto de esta
clasificación es descubrir, mediante el procedimiento matemático,
la longitud de onda adecuada para una clasificación del modelo
espectral de cada grupo (feature selection). Un procedimiento
utilizado para la selección de longitud de ondas calcula la
distancia eculidiana de cada punto de dato espectral y el centroide
(centro de la clase) para cada longitud de onda. Para la
clasificación son especialmente adecuadas las longitudes de onda
cuya distancia euclidiana respecto de las clases (respecto del
centroide) es, en lo posible, reducida, per cuya distancia entre las
diferentes clases es, en lo posible, la máxima. Una búsqueda
automatizada y optimizada de las longitudes de onda, que presenta
estos criterios, se llevó a cabo con un algoritmo genético.
Asimismo, las longitudes de onda se componen de manera más rápida y
eficiente y óptimas para la clasificación en un ranking. De esta
lista con longitudes de onda, ordenadas según su potencial de
clasificación, se seleccionaron posteriormente las longitudes de
onda para el modelo de clasificación con redes neuronales. Un
segundo principio se basa en el cálculo de las variancias
(univariancia y covariancia) de cada punto de dato de los espectros
de referencia dentro del grupo, que se comparan con la variancia
entre los grupos. Posteriormente, se llevó a cabo una clasificación
automática en un ranking de las longitudes de onda, en el cual la
variancia dentro del grupo es lo más reducida posible y entre los
diferentes grupos es lo más grande posible. Las mejores 97
longitudes de onda de este ranking se utilizaron como neuronas de
entrada (input) para una red neuronal. La elección de la longitud de
onda acorde a este procedimiento está representada en la figura 6.
Como modelo de clasificación se utilizó una red feedforward de tres
capas, con 97 neuronas de entrada, 22 neuronas ocultas y 7 neuronas
de salida. Como algoritmo de aprendizaje se utilizó el algoritmo de
backpropagation resilente (RProp). La activación de emisión se fijó
entre 0 y 1.
La figura 7 muestra una concepción del
procesamiento de datos.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la validación externa del procedimiento
descrito, las células bacteriales fueron tratadas con la sustancia
de acción antibacterial X (MHK 2 \mug/ml) en cinco
determinaciones, en las concentraciones de 1, 2 y 4 \mug/ml. En
todos los casos, la realización del procedimiento de clasificación
arrojó como resultado, con un tratamiento con 2 y 4 \mug/ml, una
asignación inequívoca de los espectros en las clases de las muestras
tratadas con cerulenina. En el caso de la cerulenina se trata de un
inhibidor del metabolismo de la biosíntesis de ácidos grasos, lo
cual hace suponer que la sustancia X presenta un mecanismo activo
similar al de la cerulenina. De hecho, la figura 10 muestra que la
sustancia X inhibe selectivamente el nuevo agregado de
[14C]-acetato en fosfolípidos extraíbles en
CHCl_{3}/MeOH. La evaluación de los espectros de las bacterias
tratadas con sólo 1 \mug/ml de la sustancia X, no arrojó como
resultado ninguna asignación, lo que pude deberse a las
modificaciones muy reducidas en la curva de crecimiento y en el
espectro FT-IR, debido a la baja dosificación, en
comparación con los cultivos de control no tratados.
Las figuras muestran:
Figura 1 La estructura del banco de datos de
referencia en base a los mecanismos activos de antibióticos
conocidos
Figura 2 La reproductibilidad de la medición de
los espectros
Figura 3 La diferenciación de las clases de
antibióticos
Figura 4 Los espectros de inhibidores de la
biosíntesis de proteínas
Figura 5 El procedimiento para la selección de
longitud de ondas
Figura 6 La asignación jerárquica del mecanismo
activo
Figura 7 La concepción del procesamiento de
datos
Figura 8 El ejemplo de mecanismos activos de la
sustancia X
Figura 9 La evaluación del espectro de la
sustancia X en un primer rango de longitud de onda
Figura 10 La evaluación del espectro de la
sustancia X en un segundo rango de longitud de onda
Figura 11 El ejemplo de mecanismos activos de la
sustancia Y
Figura 12 La evaluación del espectro de la
sustancia Y
La figura 1 muestra la conformación del sistema
de clasificación utilizado para el ejemplo, en forma de redes
neuronales jerárquicas, junto con la asignación de los antibióticos
de referencia. En un primer paso de clasificación se separan las 7
clases principales de inhibidores (inhibidores de biosíntesis de
proteínas, inhibidores de biosíntesis de ARN, inhibidores de
biosíntesis de ADN, inhibidores de la biosíntesis de pared celular,
inhibidores de la biosíntesis de lípidos, inhibidores de sustancias
membranotropas, intercaladores). En un segundo paso se distinguen
los subgrupos (por ejemplo, inhibidores de la biosíntesis de ADN con
los tres subgrupos 1. sustancias similares a la ciprofloxacina, 2.
sustancias similares a la trimetoprima, 3. sustancias similares a la
azaserina. Esta clasificación en subgrupos en principio puede
continuarse y ampliarse. Las asignaciones establecidas pueden ser
comprobadas inmediatamente por el especialista en el área y pueden
ser establecidas a partir de obras de referencia pertinentes (por
ejemplo, Graefe U. (1992) Biochemie der antibiótica (Bioquímica de
los antibióticos), páginas 15-39, Spektrum
Akademischer Verlag Heidelberg, Berlin, New York).
La figura 2 muestra la superposición de la
primera derivación de 25 espectros seleccionados por azar del
microorganismo bacillus subtilis, cepa 168, sin adición de
una sustancia inhibidora. Los espectros han sido registrados a lo
largo de un periodo de tiempo de 6 meses. Los 25 espectros son
prácticamente idénticos y sólo presentan una variancia
despreciable. Esto demuestra la buena reproductibilidad del registro
de espectros de cultivos microbianos. La reproductibilidad es un
requisito importante para que resulte el procedimiento acorde a la
invención.
La figura 3 muestra la primera derivación de 25
espectros de control, obtenidos en experimentos independientes, de
un cultivo bacterial de bacillus subtilis, cepa 168 sin
tratamiento con una sustancia de prueba y superpuesta,
respectivamente, 5 veces, la primera derivación de los espectros de
cultivos bacteriales de la misma cepa, tratada con los diferentes
antibióticos rifampicina, tetraciclina, ciprofloxacina y oxacilina.
Los diferentes antibióticos están asignados, acorde a la figura 1,
a diferentes mecanismos activos. Correspondientemente con ello,
también se diferencian los espectros de los cultivos bacteriales
tratados con los diferentes antibióticos. El tiempo de acción fue,
respectivamente, de 150 minutos, la concentración fue de cuatro
veces la concentración mínima de la sustancia inhibidora (MHK) y
0,25 veces MHK en el caso de tetraciclina. Los valores de MHK de
los antibióticos son 0,25 \mu g/ml para la rifampicina, 16
\mug/ml para la tetraciclina, 0,25 \mug/ml para la
ciprofloxacina y 0,5 \mug/ml para la oxacilina.
La figura 4 muestra la primera derivación de 25
espectros de control, obtenidos en experimentos independientes, de
un cultivo bacterial sin tratamiento con una sustancia de prueba y
superpuesta, respectivamente, 5 veces, la primera derivación de los
espectros de cultivos bacteriales tratada con los diferentes
antibióticos tetraciclina (4 \mug/ml), cloroanfenicol (4
\mug/ml) y canamicina (4 \mug/ml). La duración del tratamiento
de los cultivos bacteriales es de, respectivamente, 150 minutos. En
el caso de los tres antibióticos se trata de inhibidores de la
biosíntesis de proteínas. Las primeras derivaciones de los espectros
tratados con estos diferentes inhibidores de la biosíntesis de
proteínas presentan una buena coincidencia entre sí y diferencias
significativas respecto de las primeras derivaciones de los
espectros de control.
La figura 5 explica un ejemplo de un
procedimiento para la selección de longitud de ondas. En este caso
se lleva a cabo el cálculo de la distancia euclidiana de cada punto
de dato espectral y se calcula el centroide (centro de la clase)
para cada longitud de onda. Para la clasificación son especialmente
adecuadas las longitudes de onda cuya distancia euclidiana respecto
de las clases (respecto del centroide) es, en lo posible, reducida,
per cuya distancia entre las diferentes clases es, en lo posible, la
máxima. Una búsqueda automatizada y optimizada de las longitudes de
onda, que presenta estos criterios, se lleva a cabo con un algoritmo
genético. Asimismo, las longitudes de onda se componen de manera
más rápida y eficiente y óptimas para la clasificación en un
ranking. De esta lista con longitudes de onda, ordenadas según su
potencial de clasificación, se seleccionan posteriormente las
longitudes de onda para el modelo de clasificación (por ejemplo,
redes neuronales).
La figura 6 muestra la asignación jerárquica del
mecanismo activo La barra negra representa aquellos rangos de
longitud de onda que deben ser utilizados para la clasificación de
los antibióticos según su mecanismos activos. En la parte superior
de la imagen están representadas las áreas espectrales que presentan
una significación especialmente elevada para la separación de los 7
grupos principales (inhibidores de la síntesis de proteína, ARN,
ADN, lípidos y pared celular, así como las sustancias membranotropas
y los intercaladores.
La parte inferior de la imagen, por el
contrario, representa las áreas espectrales utilizadas para la
clasificación de los antibióticos en diferentes subgrupos dentro de
un grupo principal, en el ejemplo, de la separación de
\beta-lactamas y D-cicloserina
dentro del grupo principal de inhibidores de la síntesis de la pared
espectral.
La figura 7 muestra una concepción del
procesamiento de datos.
La figura 8 muestra el mecanismo activo de una
sustancia X. La sustancia X inhibe selectivamente el nuevo agregado
de [14C]-acetato en fosfolípidos extraíbles en
CHCl_{3}/MeOH.
La figura 9 muestra la primera derivación de 25
espectros de control de un cultivo bacterial sin tratamiento con
una sustancia de prueba y superpuesta, respectivamente, 5 veces, la
primera derivación de los espectros de cultivos bacteriales tratada
con cerulelina (1 vez MHK, 16 \mug/ml) y la sustancia X (2 veces
MHK; 2 \mug/ml). Como se desprende de la figura 1, en el caso de
cerulenina se trata de un inhibidor de síntesis de lípidos. La
similitud en el modelo FT-IR indica que en el caso
de la sustancia de prueba X también se trata de una inhibición de
la síntesis de lípidos. La figura 10 muestra los mismos espectros
que la figura 9 en otro rango de longitud de onda. Esta área
espectral es dominada por las transiciones de vibración de la
molécula de ácido graso. En esta área espectral las diferencias
entre los espectros de referencia y los espectros con las
sustancias de prueba inhibidoras de síntesis de lípidos son
especialmente significativas.
La figura 11 muestra el mecanismo activo de una
sustancia Y. La sustancia Y inhibe selectivamente el nuevo agregado
de [3H]-leucina en material precibitable en ácido
perclórico.
La figura 12 muestra la primera derivación de un
espectro de control de un cultivo bacterial sin tratamiento con una
sustancia de prueba y superpuesta, la primera derivación de los
espectros de cultivos bacteriales, tratada con un antibiótico
dipéptido (0,5 veces MHK, 0,5 \mug/L) una oxazolidinona (1vez MHK;
2 \mug/L) y la sustancia Y (16 veces MHK, 3 mg/L). Como se
desprende de la figura 1, en el caso de la oxazolidinona se trata
de un inhibidor de la síntesis de proteína, lo mismo vale para el
antibiótico dipéptido. La similitud en el modelo IR indica que en
el caso de la sustancia de prueba Y desconocida también se trata de
una inhibición de la síntesis de proteína.
Claims (25)
1. Procedimiento para la identificación o
caracterización del mecanismo activo de una sustancia antimicróbica,
que comprende los siguientes pasos:
- a)
- Establecer espectros de referencia a través del tratamiento de determinados cultivos microbianos con sustancias de prueba, cuyo mecanismo activo es conocido, y el registro de, al menos, un espectro de grupo de espectros IR, FTIR, Raman y FT-Raman.
- b)
- Selección respectiva de, al menos, un rango de longitud de onda de estructura igual o similar, para diferenciar las clases pertenecientes al mecanismo activo correspondiente, y clasificación de los espectros de referencia en las clases en el banco de datos de referencia, asimismo, los espectros de referencia asignados a una clase presentan una estructura igual o similar en el rango de longitud de onda seleccionado, que se diferencia de manera significativa de la estructura de los espectros de referencia de otras clases en el rango de longitud de onda seleccionado
- c)
- tratamiento de un cultivo microbiano con la sustancia por evaluar
- d)
- registro de, al menos, un espectro (espectro de prueba) del grupo de espectros IR, FT-IR, Raman y FT-Raman;
- e)
- comparación del o de los espectros de prueba de d) con uno o múltiples espectros de referencia en el banco de datos de referencia,
- f)
- Asignación de los espectros de prueba a una, dos o múltiples clases de espectros de referencia en el banco de datos de referencia e identificación o caracterización del mecanismo activo.
2. Procedimiento acorde a la reivindicación 1,
caracterizado porque la comparación e) se realiza mediante
un procedimiento matemático de reconocimientos de patrones.
3. Procedimiento acorde a la reivindicación 1 o
2, caracterizado porque los espectros obtenidos en el paso
d) son procesados de un modo que permite el reconocimiento
automático de las modificaciones y de los patrones espectrales
característicos.
4. Procedimiento acorde a las reivindicaciones 1
a 3, caracterizado porque la clasificación se realiza a
través de un reconocimiento de patrones, que puede clasificar
simultáneamente dos o más clases.
5. Procedimiento acorde a una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la información
característica de un patrón espectral para una de las clases es
almacenada en un modelo de clasificación o en forma de los pesos en
redes neuronales artificiales.
6. Procedimiento acorde a las reivindicaciones 1
a 5, caracterizado porque la comparación de los espectros de
prueba con los espectros de referencia se lleva a cabo a través del
modelo de clasificación.
7. Procedimiento acorde a una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el cultivo
microbiano es un cultivo puro.
8. Procedimiento acorde a una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque en el caso del
mecanismo activo se trata de inhibidores de la biosíntesis de
proteínas, del metabolismo del ARN o del ADN, del metabolismo de la
pared celular o de lípidos, de sustancias membranotropas o
intercaladores de ADN.
9. Procedimiento acorde a una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque para la
facilitación del banco de datos de referencia se utilizan mutantes
del germen microbiano definidos adicionalmente, preferentemente,
aquellos con una producción reducida o elevada de un gen diana o
aquellos con actividad biológica limitada o incrementada a causa de
mutaciones de producto y/o deleciones, asimismo, la mutación del gen
diana correspondiente ajusta la interacción del producto de gen con
una sustancia hipotética de referencia.
10. Procedimiento acorde a una de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la selección de
rango de longitud de onda para la diferenciación de las clases
(selección de longitud de ondas) se lleva a cabo a través de
procedimientos estadísticos multivariados, como el análisis de
variancias, análisis de covariancias, análisis factorial, por
medición de distancia estadística, como la distancia Euclidiana o la
distancia de Mahalanobis, o por una combinación de estos métodos
con un procedimiento de optimización, como los algoritmos
genéticos.
11. Procedimiento acorde a una de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque antes de la
selección de longitud de ondas se lleva a cabo un procesamiento
previo de los espectros de referencia para incrementar el contraste
espectral, o a través de la formación de derivaciones,
deconvolución, filtrado, supresión de ruidos o reducción de datos a
través de la transformación wavelet o descomposición factorial.
12. Procedimiento acorde a una de las
reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la
clasificación en los espectros de referencia en las clases en el
banco de datos de referencia se lleva a cabo a través de métodos
matemáticos de clasificación del reconocimiento de patrones, un
modelo lineal general, a través de redes neuronales artificiales,
métodos de la clasificación basada en casos, de la optimización por
vectores o de aprendizaje artificial, de algoritmos genéticos o de
métodos de la programación evolucionaria.
13. Procedimiento acorde a una de las
reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la
clasificación en los espectros de referencia en las clases en el
banco de datos de referencia se lleva a cabo a través de métodos
matemáticos de clasificación del reconocimiento de patrones, como
procedimientos estadísticos multivariados del reconocimiento de
patrones, redes neuronales, métodos de la clasificación basada en
casos, o de aprendizaje artificial, de algoritmos genéticos o de
métodos de la programación evolucionaria.
14. Procedimiento acorde a la reivindicación 13,
caracterizado porque se utilizan múltiples redes neuronales
artificiales y modelos de clasificación.
15. Procedimiento acorde a la reivindicación 14,
caracterizado porque se utilizan múltiples redes neuronales
artificiales como red feed-forward con tres capas y
un método de descenso de gradiente como algoritmo de
aprendizaje.
16. Procedimiento acorde a las reivindicaciones
14 o 15, caracterizado porque el sistema de clasificación
presenta una estructura tipo árbol, asimismo, las tareas de
clasificación se descomponen en tareas parciales y los sistemas de
clasificación individuales se combinan en una unidad formando un
sistema de clasificación jerárquico y, a su vez, durante la
evaluación se recorren automáticamente todas las etapas
jerárquicas.
17. Procedimiento acorde a la reivindicación 16,
caracterizado porque en el caso de los sistemas de
clasificación individuales se trata de redes neuronales optimizadas
para tareas especiales.
18. Procedimiento acorde a una de las
reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque la asignación
de un espectro de prueba a una, dos o múltiples clases de espectros
de referencia se lleva a cabo a través de métodos matemáticos de
clasificación del reconocimiento de patrones, como procedimientos
estadísticos multivariados del reconocimiento de patrones, redes
neuronales, métodos de la clasificación basada en casos, o de
aprendizaje artificial, de algoritmos genéticos o de métodos de la
programación evolucionaria.
19. Procedimiento acorde a una de las
reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque el registro de
espectros IR se lleva a cabo en el área espectral de 500 a 4000
cm^{-1} y/o de 4000 a 10.000 cm^{-1}.
20. Procedimiento acorde a una de las
reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque la sustancia de
prueba es una sustancia inhibidora.
21. Procedimiento acorde a una de las
reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque la
concentración de la sustancia inhibidora con la cual es tratado el
cultivo bacterial, se encuentra en el rango de 0,1 a 20 veces la
concentración mínima para la sustancia inhibidora para la sustancias
de prueba.
22. Procedimiento acorde a una de las
reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque se registran
los espectros de prueba de un cultivo microbiano que fueron
tratados, respectivamente, con la misma sustancia inhibidora pero
con una concentración diferente.
23. Procedimiento acorde a una de las
reivindicaciones 1 a 22, caracterizado porque la medición se
lleva a cabo en cubetas, cubetas de flujo y microcubetas, que son
medidas en transmisión, absorción o reflexión y son adecuadas para
las mediciones o mediciones de flujo automatizadas y el
high-throughput-screening, o cribado
ultrarrápido.
24. Procedimiento acorde a una de las
reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque las mediciones
FT-IR, IR, Raman y FT -Raman pueden ser medidas
directamente en líquidos y recipientes de tratamiento y preparación
de las muestras.
25. Procedimiento acorde a una de las
reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque como cultivos
celulares microbianos se implementan células procariotas o
eucariotas, preferentemente, bacterias, hongos, levaduras o
arqueobacterias.
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