ES2331993T3 - Bacillus subtilis para uso contra patogenos animales y humanos. - Google Patents
Bacillus subtilis para uso contra patogenos animales y humanos. Download PDFInfo
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Abstract
Células bacterianas de la cepa de Bacillus subtilis obtenible del tracto gastrointestinal de un pollo caracterizadas por tener el siguiente perfil de azúcares API: en las que un extracto de fermentación obtenible a partir de las células tiene actividad antimicrobiana contra las bacterias patógenas humanas y animales Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli y Streptococcus pneumoniae.
Description
Bacillus subtilis para uso contra
patógenos animales y humanos.
Esta invención se refiere en general a
compuestos antimicrobianos y, más específicamente, a compuestos
antimicrobianos de Bacillus subtilis PB6 para el uso contra
patógenos animales y humanos.
La enteritis necrótica, una enfermedad
enterotoxémica causada por Clostridium perfringens, conduce
al desarrollo de lesiones necróticas en la pared intestinal que dan
como resultado la mortalidad de aves de corral (Paulus y
Ruckebusch, 1996; Tsai y Tung, 1981). También es una enfermedad
multifactorial con epidemiología y patogénesis complejas y
parcialmente desconocidas (Kaldhusdal, 2000). La bacteria, C.
perfringens, se encuentra comúnmente en el tracto
gastrointestinal de aves de corral (Tshirdewahn et al.,
1991), sin embargo, la aparición de enteritis necrótica es
esporádica (Cowen et al., 1987). No obstante, se han
implicado piensos contaminados con C. perfringens en brotes
de enteritis necrótica en pollos (Kaldhusdal, 2000). Los estudios
también han demostrado que los pollos sanos tienen un número
relativamente reducido de C. perfringens en sus tractos
gastrointestinales, aunque un aumento en la concentración de las
bacterias puede dar como resultado una afección de enteritis
necrótica (Craven et al., 1999).
El uso de la bacitracina, lincomicina y otros
antibióticos promotores del crecimiento se usa comúnmente para
tratar a aves de corral que padecen enteritis necrótica (Craven
et al., 1999). Sin embargo, debido al aislamiento de cepas
resistentes a antibióticos de C. perfringens de pollos y
pavos (Devriese et al., 1993; Kondo, 1988; Watkins et
al., 1997), las autoridades sanitarias y los productores de
aves de corral están cada vez más interesados en el desarrollo y la
aplicación de productos probióticos para sustituir antibióticos.
Los probióticos se han definido como un complemento alimenticio
microbiano vivo que afecta beneficiosamente al hospedador mejorando
su equilibrio microbiano intestinal. Algunos investigadores piensan
que esta normalización de la microbiota intestinal conferirá los
siguientes beneficios: (a) protección frente a patógenos por
exclusión competitiva (también denominada resistencia a la
colonización); (b) suministro de ciertos nutrientes y reacciones
enzimáticas/de detoxificación; (c) implicación en la morfogénesis
tisular y la actividad peristáltica; y (d) interacción con los
sistemas inmune y endocrino del hospedador.
Además, a la luz del aumento de la enteritis
necrótica en aves de corral y la prohibición progresiva de diversos
antibióticos para piensos por muchos países (Council of the
European Communities, 1998), existe un cambio hacia promotores del
crecimiento alternativos (AGP) para mejorar el rendimiento animal.
Se han usado microorganismos beneficiosos tales como levaduras o
bacterias ácido lácticas en producción animal durante las últimas
dos décadas. Las bacterias con atributos probióticos tienen la
función primaria de mantener una microflora intestinal sana por
sustitución o desplazamiento de las bacterias patógenas en el
tracto intestinal. Se ha sabido que los probióticos podían mantener
una microflora intestinal "normal" por exclusión competitiva
(Tournot, 1989) y acción antagonista contra bacterias patógenas en
el intestino animal (Fuller, 1989). Generalmente, los
microorganismos probióticos podían proliferar en grandes cantidades
en el interior del intestino, inhibiendo de este modo la
multiplicación de bacterias patógenas. Los microorganismos
probióticos que tienen usos potenciales en seres humanos o animales
incluyen Bacillus spp., Lactobacillus spp.,
Enterococcus spp. y Streptococcus spp. (Lee et
al., 1999). Se ha descrito que diversos microorganismos son
capaces de colonizar diferentes partes del tracto gastrointestinal
(Jin et al., 1997). Generalmente, la porción del duodeno del
tracto gastrointestinal tiene la menor población de microflora
bacteriana en comparación con el ciego, que tiene la mayor
concentración de microorganismos (Mead y Adams, 1975; Salanitro
et al, 1974). Se han aislado microorganismos tales como
Lactobacillus spp., Streptococcus spp. y
Escherichia coli de las porciones de duodeno, yeyuno e íleon
del intestino delgado (Shapiro y Sarles, 1949). La población
microbiana general del ciego comprende anaerobios estrictos tales
como Streptococcus spp., Staphylococcus spp.,
Lactobacillus spp., Fusobacterium spp. y
Bacteroides (Barnes et al., 1972; Mead, 1997).
Se aislaron y exploraron como probióticos
potenciales contra C. perfringens bacterias beneficiosas de
diversos segmentos del tracto intestinal del pollo. Estudios
anteriores demostraron que la capacidad de microorganismos
probióticos para adherirse y colonizar las células epiteliales del
tracto gastrointestinal es en gran medida dependiente del sitio
específico de los aislados de un origen animal específico (Barrow
et al., 1980; Reid, 1999; Fuller, 1973; Wesney y Tannock,
1979). Existen muchos efectos beneficiosos asociados con el uso de
probióticos microbianos en piensos animales. Estos efectos
beneficiosos incluyen la exclusión competitiva de E. coli
patógena (Watkins et al., 1982), Campylobacter jejuni
(Morishita et al., 1997) y Salmonella enteritidis
(Pascual et al., 1999), la potenciación del crecimiento y la
viabilidad de la microflora intestinal beneficiosa (Hosoi et
al., 2000) y la digestión y absorción mejoradas de nutrientes
(Ratcliff, 2000; Scheinbach, 1998; Sissons, 1989; Thomke y Elwinger,
1998) en pollos.
Otros criterios usados para aislar y definir
bacterias probióticas incluyen la estabilidad en bilis y ácido (Hoa
et al., 2000; Huis Init Veld y Shortt, 1996), la producción
de sustancias antimicrobianas (Salminen et al., 1996) y que
cumplan con la seguridad o un estado generalmente reconocido como
seguro (GRAS) (Donohue y Salminen, 1996; SCAN, 2000). Se demostró
que un gran número de bacterias ácido lácticas, en solitario o en
combinación, presentaban grados variables de actividad
antimicrobiana hacia microorganismos patógenos (Harris et
al., 1989; Motlagh et al., 1991). Además, son útiles
cultivos viables o extractos fermentados de bacterias ácido
lácticas en el tratamiento del desplazamiento de la microflora
intestinal endógena, que es característico de muchos trastornos
intestinales (Charteris et al., 1997, Drake et al.,
1996). Dichas bacterias son capaces de sobrevivir a condiciones
ácidas y biliares para colonizar el tracto intestinal, o al menos
temporalmente, adherirse al epitelio. Se ha descrito que mejoran el
ritmo de crecimiento y la utilización del pienso en cerdos, pollos y
terneros (Hale y Newton, 1979; Tortuero, 1973; Schwab et
al., 1980). Además, se ha observado una disminución
significativa en la aparición de diarrea en cerdos y terneros
alimentados con estas bacterias beneficiosas (Lee et al.,
1999). También se piensa que los cultivos bacterianos ácido
lácticos neutralizan el efecto de enterotoxinas de E. coli
en cerdos (Mitchell y Kenworthy, 1976). Otros efectos beneficiosos
de las bacterias ácido lácticas incluyen el desplazamiento de
bacterias perjudiciales incluyendo C. perfringens, reducción
de actividad ureasa bacteriana, síntesis de vitaminas, efectos
estimuladores sobre el sistema inmune y contribución a la digestión
(Hofacre et al., 1998). Estudios anteriores han demostrado
que Lactobacillus rhamnosus (Alander et al., 1999;
Asensio et al., 1976, Silva et al., 1987), L.
plantarum (Andersson, 1986; West y Warner, 1988), Lactococcus
lactis ssp. lactis (Motlagh et al., 1991;
Spelhaug y Harlander, 1989) y Pediococcus pentosaceus
(Fleming et al., 1975, Graham y McKay, 1985) eran
bactericidas frente a Clostridium spp.
Comúnmente se aíslan péptidos microbianos con
una actividad antimicrobiana pronunciada de animales, plantas,
microbios (Sahl, 1985) y en alimentos no estériles (Muriana, 1993).
Son pequeños y catiónicos, con masas moleculares de entre 3000 y
6000 Daltons (Roller, 1991). Se ha demostrado que la modificación
post-traduccional de péptidos precursores introduce
puentes tioéter intramoleculares en péptidos catiónicos tales como
Pep 5, nisina y subtilina (Gross y Morell, 1971; Kordel y Stahl
1986; Kordel et al., 1989). Aunque estos péptidos ofrecen
una ventaja de seguridad potencial importante sobre conservantes
sintetizados químicamente cuando se incorporan en el alimento,
muchos péptidos no son adecuados debido a la naturaleza patógena de
las cepas productoras. Pueden ser útiles péptidos tales como
colicinas (Konisky, 1982), epidermina y Pep 5
(Ersfeld-Dressen et al., 1984; Horner et
al., 1989) en la aplicación tópica en cremas y pomadas
balsámicas, pero es poco probable que se autoricen para uso en
alimentos debido a la naturaleza de las cepas productoras (Roller,
1991).
La presente invención se refiere a células o
extractos fermentados de Bacillus subtilis PB6 que presentan
actividad antimicrobiana frente a C. perfringens. Estudios
en el laboratorio han demostrado que los extractos fermentados de
Bacillus subtilis PB6 contienen un factor o factores
antimicrobianos de naturaleza proteica que son estables a calor
elevado, condiciones ácidas, concentraciones elevadas de sales
biliares y que pueden extraerse en disolventes. Se ha descrito la
producción de bacteriocinas por Bacillus spp. y las
bacteriocinas mejor caracterizadas son subtilina de B.
subtilis (Jansen y Hirschmann, 1944), megacina de B.
megaterium (Von Tersch y Carlton, 1983), lichenina de B.
licheniformis (Pattnaik et al., 2001), tochicina de
B. thuringiensis (Paik et al., 1997) y algunas
bacteriocinas de B. cereus (Naclerio et al., 1993;
Paik et al., 2000). A pesar de la exploración exhaustiva de
estas bacteriocinas frente a un amplio espectro de microorganismos
patógenos, no se han realizado estudios para determinar el efecto
de células o metabolitos de Bacillus spp. sobre C.
perfringens. Los estudios también han confirmado que los
extractos fermentados de Bacillus subtilis PB6 también eran
inhibidores frente a C. difficile, Campylobacter jejuni,
Campylobacter coli y Streptococcus pneunoniae.
El documento WO99/28441A describe una cepa de
Bacillus subtilis AS2 (nº de acceso: FERM
BP-6139) que se describe que tiene efectos
antibacterianos contra bacterias perjudiciales de los géneros
Salmonella, Escherichia, Shigella, Vibrio, Staphylococcus,
Clostridium y Campylobacter pero que no presenta dichos
efectos contra bacterias ácido lácticas de los géneros
Bifidobacterium y Lactobacillus y Bacillus
natto.
El documento EP128505A2 describe Dificidina y
antibacterianos derivados obtenidos por cultivo microbiológico de
Bacillus subtilis, MB3575 y MB4488, depositados bajo las
denominaciones ATCC39374 y 39320. Estos compuestos son eficaces
contra microorganismos aerobios y anaerobios y se describen como
útiles en el tratamiento de infecciones por bacterias Gram
positivas y Gram negativas. Sin embargo, no se conoce que la
Dificidina sea eficaz contra Clostridium spp.
El aislamiento y la caracterización de un
péptido antimicrobiano producido por Bacillus subtilis 168,
denominado sublancina 168, se describe por Paik et al,
Journal of Biological Chemistry, 273 (36), páginas
23134-23142 (1998). Dichos antibióticos peptídicos
que contienen lantionina en realidad son perjudiciales para ciertas
bacterias Gram positivas pero no bacterias Gram negativas, al
contrario que el metabolito de Bacillus subtilis PB6 que es
eficaz contra bacterias tanto Gram negativas como Gram
positivas.
Se describe que una cepa de subtilina descrita
en Anerson, Journal of Bacteriology, 64 (2), páginas
145-149 (1952) es eficaz frente a cultivos de
Clostridium botulinum culturas y un anaerobio putrefactivo,
N.C.A. 3679 (enumerado por la Colección Americana de Cultivos Tipo
como Clostridium sporogenes, ATCC 7955) después de un
tratamiento de 2 min a 1,00ºC. Se describen cepas de Clostridium
botulinum resistentes a subtilina por Campbell et al,
Applied Microbiology, 7, páginas 285-288 (1959).
Se sabe que la bacteria B. subtilis 3 de
Pinchuk et al, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 45
(11), páginas 3156-3161 (2001) tiene actividad
contra especies de las familias Enterobacteriaceae y
Helicobacter.
Se indica que compuestos derivados de
Bacillus subtilis FHC-402 descritos por
Miyamoto et al (Base de datos Biosis, nº de acceso PREV
199885076663, 1987) son más eficaces contra bacterias Gram negativas
que Gram positivas. Sin embargo, los metabolitos proteicos de
Bacillus subtilis PB6 son eficaces tanto para bacterias Gram
negativas como Gram positivas.
\newpage
Gusils et al describen bacterias que
pertenecen a la familia de Lactobacillaceae que son eficaces
contra Salmonella gallinarum y están destinadas al uso para
el control de la salmonelosis. Por el contrario, el Bacillus
subtilis PB6 es eficaz tanto para bacterias Gram negativas como
Gram positivas.
Por último, Jack et al en Microbiological
Reviews, American Society for Microbiology, Washington DC, 59 (2),
páginas 171-200 (1995) resume las funciones
generales y usos de todas las bacteriocinas Gram positivas pero no
se refiere a bacteriocinas específicas contra patógenos
específicos.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención consiste en una nueva cepa
bacteriana aislada del tracto gastrointestinal de aves de corral y
su uso para inhibir Clostridium spp. En concreto, se
descubrió que Bacillus subtilis PB6 posee un factor o
factores anticlostridiales que presentan excelentes efectos
inhibidores sobre Clostridium perfringens, limitando la
producción de enterotoxinas clostridiales que causan enteritis
necrótica en aves de corral. La cepa puede usarse en un método de
tratamiento que incluye, pero sin limitación, la destrucción de
C. perfringens en piensos animales contaminados
suministrados a aves de corral. La invención también se refiere a
proporcionar una cepa termorresistente de Bacillus subtilis
PB6, así como un factor o factores anticlostridiales termoestables
que puedan resistir altas temperaturas durante el proceso de
granulación de piensos animales. Las células de Bacillus
subtilis PB6 y su factor o factores anticlostridiales después de
un tratamiento térmico conservan totalmente su viabilidad y
actividad antimicrobiana. Además, la invención proporciona una cepa
de Bacillus subtilis PB6, así como el factor o factores
anticlostridiales que son estables a diferentes pH del tracto
gastrointestinal de aves de corral. La invención asegura el paso de
Bacillus subtilis PB6 y su factor o factores
anticlostridiales hacia el tracto intestinal inferior de aves de
corral infectadas, por lo que el C. perfringens puede
desplazarse y/o desprenderse e inhibirse, respectivamente.
Esta invención también se refiere a ampliar la
aplicación de Bacillus subtilis PB6 y su factor o factores
anticlostridiales en la destrucción de patógenos humanos
incluyendo, pero sin limitación, la destrucción de Clostridium
difficile, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli y
Streptococcus pneumoniae.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 es una fotografía de una placa de
petri que muestra el ensayo antagonista, en el que la estría
vertical era el organismo indicador, Clostridium perfringens
ATCC 13124 y las estrías horizontales eran Bacillus subtilis
PB6 y Bacillus subtilis ATCC 6633, el primero aislado del
tracto intestinal de pollos sanos.
La Figura 2 es una fotografía de un
RiboPrint^{TM} que muestra perfiles de ácidos nucleicos digeridos
de Bacillus subtilis PB6. Esta técnica de ribotipado usa
enzimas de restricción tales como EcoRI, PstI y
PvuII para digerir ADN extraído de bacterias productoras de
fragmentos de ADN. Después se usa una sonda específica que usa el
operan del gen del ARNr para detectar estos fragmentos de ADN,
confirmando de este modo que la cepa es el Bacillus subtilis
PB6 original.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron tractos intestinales de pollos
sanos en un mercado local que estaba certificado por la
Agri-food & Veterinary Authority of Singapore
(AVA). Los tractos intestinales recién obtenidos se disecaron en 4
secciones, en concreto, duodeno, yeyuno, íleon y ciego. Se recogió
el contenido de cada segmento en tubos de ensayo que contenían
Caldo Tríptico de Soja estéril (Becton, Dickinson & Co, MD) que
contenía extracto de levadura al 0,6% (Oxoid Ltd, Reino Unido)
(TSBYE) (1 l de TBSYE comprende 30 g de polvo de caldo tríptico de
soja y 6 g de extracto de levadura, autoclavado a 121ºC durante 20
min) y se calentaron a 80ºC durante 20 min. Después del tratamiento
térmico, se sembraron en estrías porciones de cada tubo de ensayo
sobre agar que contenía TSBYE (denominado TSAYE) (1 l de TSAYE
comprende 30 g de polvo de caldo tríptico de soja, 6 g de extracto
de levadura y 10 g de agar, autoclavado a 121ºC durante 20 min) y se
incubaron a 37ºC durante 18-22 h. Se seleccionaron
colonias aleatorias de cuatro cuadrantes y se inocularon en 10 ml
de TSBYE estéril y se incubaron a 37ºC durante
18-22 h.
Para seleccionar formadoras de esporas, todos
los cultivos se sometieron a tratamiento térmico a 100ºC durante 30
min para eliminar las células vegetativas. Después, los cultivos se
sembraron en estrías sobre TSAYE y se incubaron a 37ºC durante
18-22 h.
Colonias representativas de placas de agar TSAYE
se tiñeron con Gram y se examinaron microscópicamente para
determinar las morfologías de los microorganismos aislados de los
tractos intestinales de pollos. Además, colonias representativas de
placas de agar TSAYE se tiñeron usando una solución de verde de
malaquita al 5% y se examinaron microscópicamente para determinar
formadoras de esporas.
Se realizaron ensayos bioquímicos para
identificar supuestamente todas las bacterias aisladas de los
tractos intestinales. Se usó un kit de ensayo bioquímico, API 50 CH
(bio Merieux) para identificar diversas bacterias basándose en los
perfiles de fermentación de 49 carbohidratos. Después de establecer
los perfiles de fermentación de todas las bacterias aisladas del
tracto intestinal de pollos, se usó el API 50 CHB/L para identificar
Bacillus subtilis PB6 del resto de las bacterias. Los
perfiles de fermentación de carbohidratos se calcularon usando el
programa informático APILAB Plus frente a una base de datos, donde
el porcentaje de identificación que es igual o superior a 99,9 se
considera una coincidencia excelente. No se proporcionarán
identificaciones si el porcentaje de identificación es menor de
80.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron cepas supuestas de Bacillus
subtilis PB6 en caldo TSBYE y se incubaron a 37ºC. Se usó
Clostridium perfringens ATCC 13124 como el organismo
indicador para explorar frente a microorganismos aislados del
tracto intestinal de pollos. Se inocularon colonias aisladas de
C. perfringens en caldo de tioglicolato a 37ºC en
condiciones anaerobias usando Anaerogen Pak (Oxoid). Se sembró en
estrías un cultivo de una noche de C. perfringens
(perpendicular) sobre la superficie de agar TSAYE usando un hisopo
de algodón estéril. Después, se sembró en estrías un cultivo de una
noche que contenía la supuesta cepa de Bacillus subtilis PB6
por la misma placa de agar cortando en dos partes iguales la línea
de estría de C. perfringens. Todas las placas inoculadas se
incubaron a 37ºC bajo CO_{2} al 5%. Después de 24 h de
incubación, pueden observarse efectos antagonistas de los
organismos de ensayo contra las bacterias indicadoras por aparición
de zonas transparentes alrededor de las uniones de las líneas de
estría, indicando el efecto inhibidor de un organismo contra el
otro.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células o esporas supuestas de
Bacillus subtilis PB6 durante una noche durante 18 h a 37ºC
en un incubador con agitación ajustado a 100 rpm. Se añadió un
volumen de 1 ml de cultivo de una noche a 9 ml de agua de peptona
tamponada (BPW) en un tubo de ensayo y se sometió a tratamiento
térmico a 90 y 100ºC durante 2, 5 y 10 min, respectivamente. De
forma similar, se calentaron extractos fermentados o filtrados de
Bacillus subtilis PB6 a 70, 80, 90, 100 y 121ºC durante 15
min. Para asegurar un calentamiento completo y uniforme, el nivel
de agua en el baño de agua se mantuvo por encima del nivel del
disolvente de calentamiento. Después de calentar los tubos
respectivos durante los tiempos de calentamiento diferentes a 90 ó
100ºC, se colocaron inmediatamente en un baño de agua con hielo
para evitar una destrucción adicional de las células.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó una solución ácida de pH 2 por
adición de 0,2 ml de HCl 10 M en 200 ml de agua desionizada. Se
preparó una suspensión de esporas por dilución 1000X en agua
desionizada estéril (pH 6) y se precalentó a 80ºC durante 20 min.
La suspensión de esporas se inoculó después en la solución ácida
(pH 2) y se incubó a 40ºC durante 90 min. Se determinaron los
recuentos de células viables a intervalos de 0, 30, 60 y 90 min.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió una concentración de bilis al 0,75% en
una solución ácida (pH 2) y se ajustó a un pH final de 6,0 usando
NaOH (12 M). Para simular las condiciones de granulación y las
condiciones de pH de molleja e intestino delgado, se añadió una
suspensión de esporas pretratada térmicamente (80ºC, 20 min) en una
solución de HCI (pH 2) y se incubó a 40ºC durante 90 min. Después
de 90 min de incubación, se transfirió el contenido de la solución
de pH 2 a otro matraz que contenía solución de bilis al 0,75% (pH 6)
y después se incubó a 40ºC durante otros 90 min. Por último,
alícuotas de la solución de bilis al 0,75% (pH 6) se retiraron y se
diluyeron en BPW a los 0, 30, 60 y 90 min y se extendieron en
placas sobre TSAYE para determinar las células viables.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diluyeron tanto células vegetativas como
esporas de Bacillus subtilis PB6 en agua de peptona tamponada
(BPW) y se sembraron en placas sobre Agar Tríptico de Soja
complementado con 6 g por litro de extracto de levadura (TSAYE)
para confirmar el número de células viables. Se trató térmicamente
una suspensión de esporas a 80ºC durante 20 min, se diluyó
asépticamente en agua de peptona tamponada (BPW) antes de extenderse
en placas sobre TSAYE para recuento de células viables. De forma
similar, también se diluyó una suspensión de esporas no calentada y
se extendió en placas sobre TSAYE para recuentos de células
viables. Todas las placas de medio se incubaron a 30ºC durante 18 h.
En términos de estudios de inactivación térmica, se representaron
los recuentos de células viables con respecto a los tiempos de
calentamiento y se obtuvieron los valores D (min) a partir del
gradiente^{-1} de estas gráficas. El valor D se define como el
tiempo en minutos que le lleva a una población bacteriana disminuir
en 1-log a una temperatura específica (ºC).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó un método de difusión en agar en pocillo
modificado (Tagg y McGiven 1971) para examinar la actividad
anticlostridial de filtrados de los extractos fermentados o
filtrados de Bacillus subtilis PB6. Se usó un cultivo de una
noche de C. perfringens ATCC 13124 o C. difficile como
cepa indicadora para los ensayos de actividad anticlostridial
rutinarios. Se atemperó agar de tioglicolato a 45ºC antes de
inocularse con cultivo de una noche de la cepa indicadora. Después
se vertió un volumen de 20 ml de esta mezcla sobre cada placa de
petri estéril y se dejó solidificar a temperatura ambiente durante
1 h. Los pocillos (0,75 cm de diámetro x 1,0 cm de profundidad) en
el agar de recuento en placa se crearon asépticamente mediante un
perforador de orificios. Después, se colocó en cada pocillo un
volumen de 100 \mul de muestra que contenía extractos fermentados
o filtrados de Bacillus subtilis PB6. De forma similar, se
mezclaron cultivos de una noche de Streptococcus pneumoniae,
Campylobacter jejuni, Campylobacter coli y Helicobacter
pylori en medios de agar adecuados y se usaron como organismos
indicadores para ensayar el efecto de células o caldo fermentado de
Bacillus subtilis PB6. Todas las placas de cultivo se
incubaron a 37ºC durante 18 h.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la producción del compuesto antimicrobiano,
se cultivó Bacillus subtilis PB6 aeróbicamente en TSBYE
durante 18 h a 37ºC con agitación a 100 rpm. Se retiraron células
bacterianas del cultivo usando un disco de filtro de 0,22 \mum
(Sartorius). Parte del filtrado se recogió y se almacenó durante
una noche a 4ºC para observar el efecto de la temperatura de
refrigeración sobre el filtrado. Los filtrados recogidos se
sometieron a tratamientos con pronasa, pepsina (concentración final
de 1 mg por ml) durante 1 h a 37ºC y tripsina (concentración final
de 1 mg por ml) durante 12 h a 37ºC y catalasa (concentración final
de 0,5 mg por ml).
\vskip1.000000\baselineskip
Cuatrocientos pollos de engorde sanos de un día
de edad (Wuxi Broiler Breeding Group Co. Ltd.) se dividieron
aleatoriamente en dos tratamientos incluyendo los controles. Cada
tratamiento comprendía cinco repeticiones con 40 aves de sexo mixto
por repetición durante el periodo de iniciación
(0-21 días). El día 21, se seleccionaron doce aves
macho y doce hembras aleatoriamente de cada repetición y se
separaron durante el periodo de ensayo restante, dando como
resultado 10 repeticiones (12 aves por repetición) por tratamiento
para el periodo de acabado (22-42 días).
\vskip1.000000\baselineskip
Las dietas se formularon con un contenido bruto
de proteína del 20 y del 18% para las dietas de iniciación y
acabado, respectivamente. En el tratamiento se incluyeron en la
dieta 3 kg/T de pienso de filtrado de PB6 que contenía el compuesto
antimicrobiano. La energía metabolizable calculada para ambas dietas
era de aproximadamente 2860 kcal/kg. Había disponible luz natural
durante el día y se proporcionó poca iluminación durante las noches
para asegurar una alimentación continua. Se suministró agua ad
libitum.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó el análisis de varianza y la
diferencia estadística entre tratamientos usando SPSS e Intervalos
Múltiples de Duncan.
\vskip1.000000\baselineskip
Se identificó con una ID del 92% que PB6 era un
Bacillus spp. (Bacillus megaterium) usando el ensayo
bioquímico API (Tabla 1). El perfil de fermentación de PB6 se
comparó con una base de datos LAB de API, en la que la identidad de
la cepa se expresaba como el porcentaje de identificación (%ID), que
se basa en el cálculo de cómo de estrechamente se corresponde el
perfil con el taxón respecto a todos los demás taxones en la base de
datos (Tabla 1). El PB6 se confirmó adicionalmente como Bacillus
subtilis usando la técnica de ribotipado (Figura 2).
Las células y extractos fermentados de
Bacillus subtilis PB6 presentan actividades antimicrobianas
contra C. perfringens, C. difficile, Campylobacter jejuni,
Campylobacter coli y Streptococcus pneumoniae (Tabla
2).
La Tabla 3 presenta datos de un Ensayo de
Difusión en Pocillo en el que se cultivaron cultivos de Bacillus
subtilis PB6 en las temperaturas enumeradas durante 24 h antes
de recoger los filtrados y colocarlos en los pocillos del agar
sembrado con Clostridium perfringens ATCC 13124 como el
organismo indicador.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se trataron térmicamente células
vegetativas de Bacillus subtilis PB6 a 90ºC durante
2-10 min, se observaron aproximadamente de 5 a 6
reducciones logarítmicas en los recuentos de células viables (no se
muestran los datos). En comparación con las otras cepas de
Bacillus ensayadas, las células vegetativas de Bacillus
subtilis PB6 demostraron la mayor resistencia térmica con un
valor D de 0,44 min (Tabla 4). Los valores D a 100ºC para células
vegetativas de Bacillus subtilis PB6 eran de 0,41 min (Tabla
4). Los valores D a 90 y 100ºC para esporas de Bacillus
subtilis PB6 eran de 24 min y 1,07 min, respectivamente (Tabla
4).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El factor o factores anticlostridiales dentro de
los extractos fermentados de Bacillus subtilis PB6
permanecen activos después del tratamiento térmico a 70, 80, 90, 100
y 121ºC durante 15 min y almacenamiento de una noche a 4ºC (Tabla
5).
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
El factor o factores anticlostridiales dentro de
los extractos fermentados de Bacillus subtilis PB6
permanecen activos después del tratamiento con tripsina (Tabla 6).
Pocillos que contenían filtrado sin tratar, almacenados a 4 ó 25ºC,
sirviendo estos últimos como control.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto antimicrobiano era estable al
tratamiento con catalasa y un intervalo de proteasas tales como
pronasa y pepsina (Tabla 7). Pocillos que contenían TSBYE (pH 7,0),
TSBYE a pH 6,3, sirviendo el filtrado sin tratar y el peróxido de
hidrógeno como controles.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Cuando se incorporaron esporas precalentadas de
Bacillus subtilis PB6 (80ºC, 20 min) en una solución
acidificada (pH 2) y se incubaron a 40ºC durante 90 min, se observó
una disminución insignificante o no importante de células viables
(Tabla 8).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Después de 90 min de incubación en solución
acidificada (pH 2), el porcentaje de germinación de esporas de
Bacillus era todavía del 98% (Tabla 8). Se descubrió que las
esporas de Bacillus subtilis PB6 sobreviven y germinan (28%)
cuando se tratan a pH 2 y después se añaden a una solución de pH 6
que contiene bilis al 0,75% y se incubaron durante 90 min (Tabla
9).
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se estudió el efecto de añadir 3 kg/T de
filtrado de PB6 que contenía el compuesto antimicrobiano sobre el
índice de conversión del pienso (FCR) de pollos de engorde. Los
resultados (Tabla 10) muestran que el compuesto mejoraba el FCR de
aves tanto en los periodos de iniciación como de acabado en
comparación con el control en el que no se añadió compuesto
antimicrobiano de PB6.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La descripción anterior comprende realizaciones
ilustrativas de las presentes invenciones. Las realizaciones
anteriores y los métodos descritos en este documento pueden variar
basándose en la capacidad, experiencia y preferencia de los
especialistas en la técnica. Enumerar simplemente las etapas del
método en un orden determinado no constituye necesariamente ninguna
limitación del orden de las etapas del método. La descripción
anterior y los dibujos simplemente explican e ilustran la
invención, y la invención no se limita a los mismos excepto en la
medida en que la limiten las reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido
gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden
excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a
este respecto.
- \bullet WO 9928441 A [0008]
- \bullet EP 128505 A2 [0009]
\bulletPaik et al. Journal of
Biological Chemistty, 1998, vol. 273 (36), 23
134-23142 [0010]
\bulletAnerson. Journal of
Bacteriology, 1952, vol. 64 (2), 145-149
[0011]
\bulletCampbell et al. Applied
Microbiology, 1959, vol. 7, 285-288
[0011]
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Agents and Chemotherapy, 2001, vol. 45 (11),
3156-3161 [0012]
\bulletJack et al.
Microbiological Reviews. American Society for Microbiology,
1995, vol. 59, 171-200 [0015]
Claims (11)
1. Células bacterianas de la cepa de Bacillus
subtilis obtenible del tracto gastrointestinal de un pollo
caracterizadas por tener el siguiente perfil de azúcares
API:
en las que un extracto de
fermentación obtenible a partir de las células tiene actividad
antimicrobiana contra las bacterias patógenas humanas y animales
Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Campylobacter
jejuni, Campylobacter coli y Streptococcus
pneumoniae.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Células bacterianas de acuerdo con la
reivindicación 1, en las que las células tienen el perfil de
ribotipado de la Figura 2.
3. Células bacterianas de acuerdo con la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, en las que las células son
estables durante al menos 90 minutos tras la exposición a un pH
2.
4. Células bacterianas de acuerdo con la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, en las que las células son
estables después de la exposición a pH 2 y posterior incubación a
pH 6 con sales biliares al 0,75% durante al menos 90 minutos.
5. Composición que comprende células de acuerdo
con la reivindicación 1 y un medio de fermentación, que se ha
incubado a 37ºC y tiene actividad antimicrobiana contra
Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Campylobacter
jejuni, Campylobacter coli y Streptococcus
pneumoniae.
6. Composición de acuerdo con la reivindicación
5 en la que el medio de fermentación es caldo tríptico de soja
estéril que contiene un 0,6% de extracto de levadura.
7. Composición de acuerdo con la reivindicación
5 o la reivindicación 6, que conserva un 90% de la actividad
antimicrobiana contra Clostridium spp. tras la exposición a
al menos 121ºC durante al menos 15 minutos.
8. Composición de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 7, que conserva una actividad antimicrobiana
contra Clostridium spp de al menos el 60% tras el
tratamiento con tripsina, de al menos el 44% tras la exposición a
pronasa y de al menos el 79% tras la exposición a pepsina.
9. Procedimiento para producir una composición
antibacteriana que comprende
- (i)
- cultivar células bacterianas de acuerdo con la reivindicación 1; y
- (ii)
- filtrar el producto de la etapa (i)
\vskip1.000000\baselineskip
10. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9, en el que el producto de la etapa (ii) se trata
además con pronasa, pepsina, tripsina y catalasa.
11. Uso de células bacterianas de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 como probiótico.
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=32325671
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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