ES2331995T3 - Oncogen, proteina recombinante derivada del mismo y sus usos. - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: (a) una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína oncogénica que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y (b) una molécula de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2; como secuencia codificadora para ser traducida a la proteína oncogénica que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
Description
Oncogén, proteína recombinante derivada del
mismo y sus usos.
La presente invención se refiere a un nuevo
oncogén de seres humanos, que está involucrado en el desarrollo del
cáncer cervical humano, a una proteína recombinante derivada del
oncogén y a sus usos en aplicaciones médicas.
Existen numerosos documentos que informan que la
inestabilidad cromosómica está involucrada en el desarrollo del
cáncer. Además, recientemente se ha demostrado que un defecto en una
molécula que controla un punto de control durante la fase G2/M de
un ciclo celular causa inestabilidad cromosómica. Sin embargo,
debido a que en muchas células de carcinoma, no se observa con
frecuencia un defecto en una molécula que controla un punto de
control en la célula, el mecanismo para inducir inestabilidad
cromosómica, que está sustancialmente involucrado en el comienzo
del cáncer, aún no está esclarecido en muchos aspectos.
Es ampliamente conocido que el desarrollo del
cáncer cervical involucra la infección con un virus de papiloma
humano (HPV) tal como los tipos HPV-16 o
HPV-18. En un tejido de cáncer cervical, se ha
observado infección con HPV con una frecuencia de 90% o más. En un
mecanismo de desarrollo del cáncer cervical inducido por la
infección de HPV, los productos génicos E6 y E7 del virus cumplen un
importante papel. Específicamente, se sabe que E6 acelera un
proceso de digestión de la proteína supresora de tumores p53,
mientras que E7 bloquea la actividad inhibidora de la formación de
cáncer de pRB (retinoblastoma) que es un producto génico Rb,
produciendo estas dos etapas tumorigénesis. Sin embargo, aún no se
ha identificado una proteína oncogénica específica activada por la
infección de HPV. En particular, E6 y E7, productos génicos virales
de HPV, inducen inestabilidad cromosómica y originan cáncer en una
célula, pero el detalle de su mecanismo directamente relacionado con
lo dicho permanece aún sustancialmente desconocido en una variedad
de aspectos. Para abordar el tratamiento del cáncer cervical, en
consecuencia, es muy importante identificar una proteína oncogénica
como blanco para HPV y un oncogén que la codifique. El cáncer
cervical progresa desde un estado precanceroso, es decir displasia
(displasia epitelial del cáncer de células escamosas) hasta el
cáncer invasivo. Dependiendo del caso, la enfermedad puede
permanecer en el estadío de displasia sin avanzar hasta el cáncer.
Por otra parte, existe un número considerable de casos en los que
la displasia puede progresar rápidamente a cáncer avanzado. En vista
de la situación, puede ser importante para un diagnóstico más
preciso del cáncer identificar una molécula directamente
involucrada en el desarrollo del cáncer cervical.
La entrada a la base de datos de EMBL que tiene
No. de acceso AF479418 describe el ARNm de Homo sapiens FOE
que comprende la secuencia codificadora completa.
Dobie (Genetics 157 (2001),
1623-1637) se ocupa de la identificación de los
modificadores de herencia de cromosomas en Drosophila
melanogaster. Este artículo describe que el polipéptido WAPL
puede estar involucrado en la herencia cromosómica fiel, que es una
actividad biológica fundamental en la que los errores contribuyen a
defectos de nacimiento y progresión del cáncer.
La entrada a la base de datos EMBL que tiene No.
de acceso D8745 describe una secuencia codificadora parcial del gen
humano KTAA0261.
Como se describió anteriormente, en el proceso
en el que la infección de HPV de la célula epitelial cervical
induce el desarrollo de un cáncer invasivo por medio de un estado
precanceroso, displasia, se consideraría que su origen directo es
un mecanismo donde está deteriorada la actividad de inhibición de la
expresión de la proteína supresora de tumores p53 o la proteína
supresora de tumores pRB, que ha inhibido la expresión de algún
oncogén, y el daño lleva al oncogén a un estado de expresión de alto
nivel. En consecuencia, se debe identificar en primer término la
secuencia de nucleótidos completa del oncogén y una proteína
oncogénica codificada de este modo, que abre un camino para
desarrollar medios para inhibir las funciones bioquímicas de la
proteína oncogénica y además medios para bloquear un mecanismo de
formación de cáncer avanzado por la proteína oncogénica.
Por otra parte, la identificación de la
secuencia de nucleótidos completa del oncogén y la secuencia de
aminoácidos de la proteína oncogénica allí codificada puede
permitirnos producir una sonda de ácido nucleico para detectar la
expresión de un ARNm transcrito del oncogén o para generar un
anticuerpo específico para la proteína oncogénica con el uso de una
proteína oncogénica recombinante de esta. En otras palabras, puede
permitirnos desarrollar un medio de diagnóstico que utilicen la
sonda de ácido nucleico o anticuerpo específico, que sea útil para
diagnosticar una etapa temprana del curso de desarrollo hacia un
cáncer invasivo a través de un estado precanceroso, la displasia,
que es causado por la infección con HPV en el cuello uterino.
Para resolver los problemas anteriores, un
propósito de la presente invención es identificar la secuencia de
nucleótidos completa de un nuevo oncogén humano y la secuencia de
aminoácidos de una proteína oncogénica codificada en el mismo, que
está directamente involucrada en un mecanismo de formación de
cáncer, por ejemplo cáncer cervical causado por la infección con
HPV en células epiteliales cervicales y también para proporcionar
un polinucleótido de longitud completa que codifique una cadena
peptídica de la proteína oncogénica, que derive del nuevo oncogén,
que se pueda usar para la producción recombinante de la proteína
oncogénica, así como la cadena peptídica de la proteína oncogénica
producida en forma recombinante con ella.
Hemos estudiado intensamente para resolver los
problemas anteriores y finalmente hemos hallado y clonado un gen
que incrementa la expresión en una célula de cáncer cervical cuando
se añade una hormona ambiental a la misma. Hemos concluido que el
gen clonado es uno de los oncogenes, porque
- (1)
- el gen está altamente expresado en una célula de carcinoma;
- (2)
- el cáncer cervical es causado por la infección con HPV, y la expresión de las proteínas E6 y E7 por transducción de los genes E6 y E7 desde el HPV a la célula potencia la expresión de dicho gen;
- (3)
- la proteína p53 inhibe la actividad de la región promotora de dicho gen;
- (4)
- la carencia o mutación de la proteína p53 está efectivamente involucrada en el desarrollo del cáncer cervical;
- (5)
- la expresión de dicho gen puede ser inhibida por una doble hebra de ARN de interferencia de cadena corta (ARNsi) para detener el crecimiento del cáncer, y después de otras investigaciones, hemos logrado la presente invención.
En consecuencia, un polinucleótido del oncogén
de acuerdo con la presente invención es un nuevo polinucleótido del
oncogén derivado de seres humanos que involucra el desarrollo del
cáncer cervical, que tiene una secuencia de nucleótidos que
codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. No.1. En
particular, es el polinucleótido en el que la secuencia de
nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID.
No.1 es una secuencia de nucleótidos de la SEQ. ID. No.2.
La presente descripción también proporciona un
péptido o sus sales producidas en forma recombinante, sobre la base
del polinucleótido del oncogén anterior de acuerdo con la presente
invención. Específicamente, el péptido recombinante de la presente
invención es un péptido recombinante o sus sales, que consiste en la
secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID. No.1. En particular, puede
ser una proteína oncogénica recombinante que comprende la secuencia
de aminoácidos de la SEQ. ID. No.1. La presente invención también
proporciona un vector recombinante que comprende un polinucleótido
que codifica el péptido recombinante, que se puede usar para
preparar dicho péptido recombinante con el mismo. Por ejemplo,
cuando se dirige a la proteína oncogénica recombinante de la
presente invención que consiste en la secuencia de aminoácidos de la
SEQ. ID. No.1, dicho vector recombinante para el mismo es un vector
recombinante que contiene un polinucleótido del oncogén que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de
aminoácidos de la SEQ. ID. No. 1, en particular que contiene un
polinucleótido en el que la secuencia de nucleótidos que codifica la
secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID. No. 1 es una secuencia de
nucleótidos de la SEQ. ID. No.2.
La presente descripción también proporciona una
célula transformada producida por transformación de una célula
huésped que utiliza dicho vector recombinante; por ejemplo, una
célula transformada producida transformando una célula huésped con
el vector recombinante dirigido a dicha proteína oncogénica
recombinante de la presente invención. En consecuencia, un proceso
para producir el péptido recombinante o sus sales de la presente
invención es un proceso para producir un péptido recombinante o sus
sales derivado de un oncogén de la presente invención que comprende
las etapas de:
cultivar la célula transformada anterior para
permitir que la célula transformada produzca el péptido recombinante
de la presente invención; y
recolectar el péptido recombinante producido a
partir del cultivo. En particular, puede ser preferentemente un
proceso para producir una proteína oncogénica recombinante de la
presente invención que comprende las etapas de:
cultivar dicha célula transformada en la que se
ha transformado el gen de ADN de longitud completa para permitir
que la célula transformada produzca la proteína oncogénica
recombinante de la presente invención; y
recolectar la proteína oncogénica recombinante
producida del cultivo.
Con el uso del anterior péptido recombinante de
la presente invención, la presente descripción proporciona un
anticuerpo que es un anticuerpo específico generado utilizando el
péptido recombinante como inmunógeno. Por ejemplo, un anticuerpo de
la presente invención puede ser un anticuerpo que exhibe una
reactividad específica con la secuencia parcial de aminoácidos de
los restos 50 a 66 u 814 a 1037 de la secuencia de aminoácidos de
la SEQ. ID. No.1.
Por otra parte, la presente invención
proporciona un kit de anticuerpos reactivos para una reacción
antígeno-anticuerpo que comprende dicho anticuerpo
específico de la invención, disponible para detectar una proteína
oncogénica que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID.
No. 1 o un fragmento peptídico derivado de la proteína oncogénica.
Alternativamente, la presente invención proporciona un kit para
diagnóstico que se puede utilizar para la detección de una proteína
oncogénica que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID.
No.1 o un fragmento peptídico derivado de la proteína oncogénica
por medio de una reacción antígeno-anticuerpo, que
comprende el anticuerpo específico de la presente invención.
La presente invención también proporciona un
polinucleótido antisentido que consiste en una secuencia de
nucleótidos complementaria con una secuencia de nucleótidos parcial
de la secuencia de nucleótidos de la SEQ. ID. No.2, que es un
fragmento de ADN que consiste en una secuencia de nucleótidos
complementaria con la porción de ácidos nucleicos Nos. 2511 a 2813
de la SEQ ID NO:2. Además, en lo que hace a un kit de hibridación de
sonda de acuerdo con la presente invención, también proporciona un
kit de hibridación de sonda disponible para detectar un ARNm que
comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ. ID. No.2, su
secuencia parcial de nucleótidos o ADNc preparado por el ARNm, que
comprende el anterior polinucleótido antisentido como sonda de ADN.
Alternativamente, la presente invención también proporciona un kit
de diagnóstico disponible para detectar la expresión de ARNm que
comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ. 180 ID. No.2, que
se traduce en una proteína oncogénica que comprende la secuencia de
aminoácidos de la SEQ. ID. No.1, por medio de un método de
hibridación de sonda, que comprende dicho polinucleótido
antisentido como sonda de hibridación.
Por otra parte, la presente invención también
proporciona un par de cebadores para la amplificación por PCR del
ADNc que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ. ID. No.2,
que consiste en cebadores apareados de:
una secuencia de nucleótidos:
5'-TTGGATCCATGACATCCAGATTTGGGAAAACATACAGTAGG-3';
y
una secuencia de nucleótidos:
5'-TTGAATTCCTAGCAATGTTCCAAATATTCAATCACTCTAGA-3',
y también la presente invención proporciona un par de cebadores
para la amplificación por PCR de una cadena parcial en ADNc que
comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ. ID. No.2, que
consiste en cebadores apareados de:
5'-GAATTCATAGGCACAGCGCTGAACTGTGTG-3';
y
5'-TTGAATTCCTAGCAATGTTCCAAATATTCA-3'.
Por lo demás, en cuanto a una invención de una
doble hebra de un ARN de interferencia de cadena corta, la presente
invención proporciona una doble hebra de un ARN de interferencia de
cadena corta capaz de inhibir la expresión del ARNm que comprende
la secuencia de nucleótidos de la SEQ. ID. No.2 en una célula de
cáncer cervical, en la que la doble hebra del ARNsi tiene una
secuencia de nucleótidos: CGGACTACCCTTAGCACAA. Además, también se
puede aplicar a una composición farmacéutica para inhibir la
expresión de ARNm que comprende la secuencia de nucleótidos de la
SEQ. ID. No.2 en una célula de cáncer cervical para detener el
crecimiento de las células del carcinoma, que comprenden dicha
cadena doble de ARN de interferencia de cadena corta de la presente
invención.
La Fig. 1 muestra la comparación de una
secuencia de aminoácidos entre una dWAPL de Drosophila informada y
una hWAPL de la presente invención.
La Fig. 2 muestra un alineamiento de aminoácidos
idénticos o similares a los de dWAPL en una secuencia de
aminoácidos parcial de los aminoácidos 623 a 1185 que se hallan en
el lado del extremo C-terminal para la hWAPL de la
presente invención.
La Fig. 3 muestra muy alta homología entre las
secuencias de aminoácidos de una proteína de WAPL humana y una
proteína de WAPL de ratón.
La Fig. 4 muestra los resultados del análisis de
transferencia Western para extractos de células
Saos-2 (calles 2, 3) y células NIH3T3 (calle 1)
utilizando un anticuerpo
anti-hWAPL-N y un anticuerpo
anti-hWAPL-C.
La Fig. 5 muestra (A): La transferencia Northern
para evaluar un nivel de expresión de una proteína hWAPL en células
de carcinoma (T) de cáncer ovárico, cáncer pulmonar, carcinoma
colorrectal, cáncer del cuerpo uterino y cáncer cervical en
comparación con las células normales (N) que corresponden a las
nombradas; (B): los resultados de la PCR en tiempo real para
confirmar la expresión del gen hWAPL en células de carcinoma (T) de
cáncer cervical, cáncer del cuerpo uterino, cáncer ovárico, cáncer
de mama, cáncer gástrico, cáncer renal, carcinoma colorrectal,
células normales (N) en comparación con las correspondientes a las
citadas; y (C): los resultados de la detección por
RT-PCR de la expresión de ARNm del gen E6/E7
derivado del HPV en células de carcinoma (T).
La Fig. 6 muestra (A): transferencia Western
para confirmar la expresión de la proteína hWAPL, que es inducida
por las proteínas recombinantes E6 y E7 derivadas de HPV 16, y por
lo tanto escisión de la proteína supresora p53 en células HDK1; y
(B): transferencia Western para confirmar la inhibición de la
transcripción de los genes E6 y E7, aumento del nivel de la
\hbox{proteína supresora p53 e inhibición de la expresión de la
proteína hWAPL por E2b derivado de HPV.}
La Fig. 7 muestra (A): inestabilidad cromosómica
e incremento de poliploidía; y (B): aumento de la frecuencia de
formación de micronúcleos inducida por la sobreexpresión de una
proteína fusionada GFP-hWAPL en células HeLa.
La Fig. 8 muestra inestabilidad cromosómica y
aumento de la frecuencia de multinucleación inducida por la
sobreexpresión de una proteína fusionada GFP-hWAPL
en células HeLa.
La Fig. 9 muestra la inducción de formación de
cáncer de los fibroblastos NIH 3T3 por la proteína hWAPL,
específicamente (A): formación de una estructura focal al cultivar
una cepa celular HA-hWAPL 3T3; (B): formación de un
tumor en un ratón lampiño, al que se ha inyectado la cepa celular
HA-hWAPL 3T3; (C): sobreexpresión de la proteína
hWAPL con cola de HA
\hbox{en una región formadora de tumor; y
(D): mitosis heterotípica en una célula cancerosa.}
La Fig. 10 muestra los resultados de la
evaluación del efecto inhibidor del crecimiento celular por ARNsi
de hWAPL en células SiHa derivadas del cáncer cervical
HPV16-positivo, que se presenta con un gráfico del
número de células (x10^{3} unidades) (en ordenadas) en función del
tiempo de transducción del ARNsi (horas en unidades) (en
abscisas).
La presente invención se describirá en detalle
de aquí en adelante.
Hemos buscado una proteína derivada de seres
humanos que es un factor inductor para la inestabilidad cromosómica,
asumiendo que la inestabilidad cromosómica estaría
considerablemente involucrada en un mecanismo de formación de
cáncer en una célula de cáncer cervical. Hemos buscado en particular
una proteína que tiene un elevado potencial para inducir
heteroploidía o formación de isogenes entre los eventos de
inestabilidad cromosómica.
Hemos notado que se ha informado a la proteína
dWAPL como una proteína que controla una estructura de
heterocromatina durante una interquinesis del proceso de meiosis,
entre una variedad de proteínas derivadas de Drosophila
melanogaster (mosca de la fruta), cuyos genes genómicos han sido
los más estudiados entre los animales. Específicamente, hemos
hallado que cuando la proteína exhibe semejante función para
controlar la estructura de heterocromatina que se expresa en un
proceso de mitosis en una célula normal, ocasionalmente se puede
inducir heteroploidía o formación de isogenes. Hemos estudiado en
primer término si una proteína que corresponde a dicha dWAPL es
realmente codificada en un gen genómico humano. Sobre la base de la
secuencia de nucleótidos informada del gen dWAPL (No. de acceso en
GenBank: U40214), hemos buscado fragmentos que muestran semejanza
significativa con fragmentos de ADNc registrados en GenBank como
fragmentos de genes originados en seres humanos y hemos
seleccionado el fragmento KIAA0261 como el que comprende una
secuencia de nucleótidos similar al gen dWAPL.
Para identificar un ADNc de longitud completa
que comprende el fragmento KIAA0261, hemos buscado en la base de
datos EST una secuencia de nucleótidos con marca de expresión
derivada de humanos, que puede ser un fragmento que comprende una
parte de no traducción que es presumiblemente una secuencia de
nucleótidos corriente arriba que se halla en el lado 5' del
fragmento KIAA0261, y hemos seleccionado los clones de EST:
BE410177, BF79516 y BE257022.
Hemos determinado una secuencia de nucleótidos
corriente arriba que se halla en el lado 5' del fragmento
KIAA0261, usando un método 5'-RACE con referencia a los clones de EST. Además, debido a que existe una alta probabilidad de que una proteína con una función similar a la dWAPL se exprese realmente en una célula que tiene un proceso de meiosis, hemos clonado un ADNc de longitud completa que comprende la secuencia de nucleótidos del fragmento KIAAO261 así como la secuencia de nucleótidos corriente arriba determinada anteriormente en el lado 5' del mismo, usando una biblioteca de ADNc disponible en el comercio, es decir, un kit de ADNc testicular (Marathon-Ready''' ADNc Kit; Clontech Inc.) como molde.
KIAA0261, usando un método 5'-RACE con referencia a los clones de EST. Además, debido a que existe una alta probabilidad de que una proteína con una función similar a la dWAPL se exprese realmente en una célula que tiene un proceso de meiosis, hemos clonado un ADNc de longitud completa que comprende la secuencia de nucleótidos del fragmento KIAAO261 así como la secuencia de nucleótidos corriente arriba determinada anteriormente en el lado 5' del mismo, usando una biblioteca de ADNc disponible en el comercio, es decir, un kit de ADNc testicular (Marathon-Ready''' ADNc Kit; Clontech Inc.) como molde.
La secuenciación práctica ha indicado que la
región codificadora del ADNc de longitud completa clonado tiene
3570 pares de bases, de la que se deduce una secuencia de
aminoácidos con 1190 aminoácidos correspondientes a la misma. Esta
se denomina "WAPL humana (hWAPL)" como proteína derivada humana
similar a la proteína dWAPL, y el gen correspondiente se denomina
"gen hWAPL". La secuencia de nucleótidos de longitud completa
que se corresponde con el ORF del gen hWAPL está representada por
la SEQ. ID. No.2, y la secuencia de aminoácidos deducida de la
proteína hWAPL está representada por la. ID. No. 1. La comparación
de la secuencia de aminoácidos codificada por el ORF del gen hWAPL
de la presente invención, es decir, la secuencia de aminoácidos
deducida de la proteína hWAPL, con la secuencia de aminoácidos de
la proteína dWAPL indica, como se muestra en la Fig. 1, que existe
una identidad del 35% y una similitud del 53% para una secuencia
parcial de los aminoácidos 623 a 1185 que se halla en la región del
extremo C-terminal. Los aminoácidos que exhiben tal
identidad y similitud se muestran en la Fig. 2.
Además, hemos clonado un ADNc que codifica una
homóloga de la misma derivada de ratón, una proteína WAPL de ratón,
asumiendo que algunos mamíferos diferentes de los seres humanos
también pueden tener una proteína correspondiente. Después de su
secuenciación, se compararon las secuencias de aminoácidos allí
codificadas. En la práctica, se ha confirmado que la proteína WAPL
humana y la proteína WAPL de ratón muestran muy elevada homología
entre sí. La Fig. 3 muestra el resultado del alineamiento
comparativo. Hemos registrado la secuencia de nucleótidos de
longitud completa para la región codificadora del gen WAPL humano
con el No. de acceso AB065003 en DDBJ/EMBL/GenBank.
Hemos realizado el análisis de transferencia
Western para extractos de células Saos-2 y células
NIH3T3, usando un anticuerpo
anti-hWAPL-N y un anticuerpo
anti-hWAPL-C, que son anticuerpos
específicos para la cadena peptídica de la proteína WAPL humana,
como se explica en el Ejemplo 6. Como se muestra en la Fig. 4, los
resultados han revelado una banda de una proteína reactiva al
anticuerpo con aproximadamente 140 kDa. En consecuencia, se ha
confirmado que la proteína WAPL humana está realmente presente en
alguna medida en la célula derivada de humanos.
Por otra parte, sobre la base de los diversos
métodos de confirmación siguientes:
Ejemplo 2: expresión del gen hWAPL en un tejido
de cáncer humano;
Ejemplo 3: inducción de la expresión del gen
hWAPL por E6 y E7 derivadas del HPV tipo 16;
Ejemplo 4: inhibición de la actividad promotora
del producto génico hWAPL por la proteína supresora p53;
Ejemplo 7: inducción de inestabilidad
cromosómica por la proteína hWAPL;
Ejemplo 8: inducción de formación de cáncer de
fibroblastos NIH 3T3 por la proteína hWAPL, se puede concluir que
el gen hWAPL es un oncogén al menos involucrado en un mecanismo de
desarrollo del cáncer cervical.
El plásmido pGEMhWAPL que comprende el ADNc de
longitud completa del gen hWAPL, que se usa para producir el
transformante que contiene el ADNc de longitud completa del gen
WAPL; la cepa de Escherichia coli DH5 pGEMhWAPL que se
obtuvo en el Ejemplo 1, según se describe más adelante, ha sido
depositado el 7 de enero de 2003 como fecha de depósito original,
en el International Patent Organism Depositary (National Institute
of Bioscience and Human-Technology) del National
Institute of Advanced Industrial Science and Technology en Chuo 6th,
1-1-1, Higashi, Tsukuga, Ibaragi,
305-8566, con el número de depósito de FERM
BP-8269 en el International Depositary Authority en
cumplimiento del Tratado de Budapest.
También hemos confirmado que la expresión de la
proteína hWAPL como producto del gen hWAPL es inhibida empleando
una doble hebra del ARN de interferencia de cadena corta (ARNsi).
Específicamente, una doble hebra del ARN de interferencia de cadena
corta (ARNsi) que exhibe semejante actividad de inhibición de
expresión puede incluir, por ejemplo, un ARNsi que tiene la
secuencia de nucleótidos: CGGACTACCCTTAGCACAA. En tal caso, también
se inhibe el crecimiento ulterior de las células de carcinoma, de
modo que se puede frenar el desarrollo del cáncer.
En cuanto a una proteína que comprende una
secuencia de aminoácidos idéntica o sustancialmente idéntica a la
secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID. No.1 de la presente
invención, sus ejemplos pueden incluir una secuencia de aminoácidos
que tiene una homología de aproximadamente 70% o más, con
preferencia aproximadamente 90% o más, más preferiblemente 90% o
más, con máxima preferencia aproximadamente 95% o más con la
secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID. No 1.
En cuanto a la proteína que comprende una
secuencia de aminoácidos idéntica o sustancialmente idéntica a la
secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID. No 1, puede ser un péptido
tal que tenga una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica
a la secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID. No.1 y posea una
actividad sustancialmente equivalente a la proteína que tiene la
secuencia de aminoácidos de la SEQ ID. No 1.
La actividad sustancialmente equivalente puede
incluir, por ejemplo, la actividad de la proteína que comprende la
secuencia de aminoácidos de la SEQ ID. No.1, tal como una función
para inducir cáncer, actividad enzimática, actividad de
transcripción y actividad de unión con una proteína de unión para la
misma.
El término "sustancialmente equivalente",
como se usa en la presente, significa que estas actividades son de
naturaleza idéntica (por ejemplo, en términos bioquímicos o
farmacológicos).
Ejemplos de la secuencia de aminoácidos que es
idéntica o sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos
de la SEQ ID. No.1 incluyen:
- (i)
- la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID. No.1;
- (ii)
- una secuencia de aminoácidos que tiene supresiones de 1 a 30, preferiblemente 1 a 20, más preferiblemente 1 a 10 aminoácidos, de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID. No.1;
- (iii)
- una secuencia de aminoácidos que tiene adición de 1 a 30, preferiblemente 1 a 20, más preferiblemente 1 a 10 aminoácidos, a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID. No.1;
- (iv)
- una secuencia de aminoácidos que tiene inserción de 1 a 30, preferiblemente 1 a 20, más preferiblemente 1 a 10 aminoácidos, en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID. No.1;
- (v)
- una secuencia de aminoácidos que tiene reemplazos de 1 a 30, preferiblemente 1 a 20, más preferiblemente 1 a 10 aminoácidos, de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID. No.1 con otros aminoácidos; y
- (vi)
- una secuencia de aminoácidos que tiene la modificación combinada de dos o más seleccionados de los anteriores (ii) a iv).
Un ejemplo de una proteína de la presente
invención puede ser una proteína que comprende la secuencia de
aminoácidos de la SEQ ID. No. 1.
Un péptido parcial puede ser cualquiera de los
péptidos parciales de la proteína de la presente invención
descritos anteriormente, y en general es un péptido que consiste en
al menos 5 o más, o al menos 10 o más, aminoácidos, y también puede
tener una actividad equivalente a una proteína de la presente
invención.
En una proteína de la presente invención o su
péptido parcial, el extremo izquierdo es el extremo
N-terminal (extremo amino-terminal)
mientras que el extremo derecho es el extremo
C-terminal (extremo
carboxi-terminal) de acuerdo con la notación
convencional para péptidos.
En la proteína de la presente invención que
consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID. No.1, se
puede seleccionar el extremo C-terminal de carboxi
(-COOH), carboxilato (-COO^{-}), amida (-CONH_{2}) y éster
(-COOR).
Los ejemplos de R para el éster incluyen
alquilos C_{1-6} tales como metilo, etilo,
n-propilo, isopropilo y n-butilo;
cicloalquilos C_{3-8} tales como ciclopentilo y
ciclohexilo; arilos C_{6-12} tales como fenilo y
\alpha-naftilo; fenil-alquilos
C_{1-2} tales como bencilo y fenetilo; aralquilos
C_{7-14} tales como
\alpha-naftil-alquilos
C_{1-2} que incluyen
\alpha-naftilmetilo; y pivaloiloximetilo
comúnmente usado como éster para aplicación oral.
Cuando una proteína de la presente invención
tiene un grupo carboxi (o carboxilato) en una posición diferente
del extremo C-terminal, una proteína en la que el
grupo carboxi está amidado o esterificado, también es una proteína
de la presente invención. El éster de la presente puede ser el éster
C-terminal descrito anteriormente.
Por otra parte, ejemplos de una proteína de la
presente invención incluyen una proteína en la que un grupo amino
de un resto de aminoácido N-terminal (por ejemplo,
resto de metionina) está protegido por un grupo protector tal como
acilo C_{1-6} que incluye alcanoílo
C_{1-6} tal como formilo y acetilo; una proteína
en la que el resto de ácido glutámico N-terminal
formado por la escisión in vivo se convierte a la forma de
ácido piroglutámico; una proteína en la que un sustituyente de una
cadena lateral de un resto de aminoácido de la molécula (por
ejemplo, -OH, -SH, amino, imidazol, indol y guanidino) está
protegido por un grupo protector apropiado (por ejemplo, tal como
acilos C_{1-6} que incluyen normalmente alcanoílo
C_{1-6} tal como formilo y acetilo); y una
proteína conjugada tal como una denominada glicoproteína en la que
está unida una cadena de azúcar.
Una sal de una proteína de la presente invención
puede ser una sal con un ácido (por ejemplo, ácidos inorgánicos y
orgánicos) o base (por ejemplo, una sal de metal alcalino)
fisiológicamente aceptable, en particular preferiblemente una sal
de adición de ácido fisiológicamente aceptable. Ejemplos de tales
sales incluyen sales con ácidos inorgánicos tales como ácido
clorhídrico, ácido fosfórico, ácido bromhídrico y ácido sulfúrico, y
con ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido fórmico, ácido
propiónico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido
tartárico, ácido cítrico, ácido málico, ácido oxálico, ácido
benzoico, ácido metansulfónico y ácido bencensulfónico. De aquí en
adelante, tal sal también está incluida en una proteína de la
presente invención.
Una proteína de la presente invención o su sal
se puede preparar por un proceso conocido para la purificación de
una proteína de células humanas o de mamífero de sangre caliente, o
alternativamente cultivando un transformante producido por la
transformación con un ADN que codifica la proteína que se describe
más adelante.
Cuando se produce a partir de tejidos o células
humanas o de mamífero, el tejido o las células humanas o de
mamífero se homogeneiza y extrae con un ácido. El extracto
posteriormente se purifica por procedimientos cromatográficos
combinados tales como cromatografía en fase reversa y cromatografía
de intercambio iónico para aislar un producto deseado.
Un polinucleótido que codifica una proteína
oncogénica de la presente invención puede ser cualquier
polinucleótido que comprende la anterior secuencia de nucleótidos
que codifica una proteína oncogénica de la presente invención (ADN
o ARN, preferiblemente ADN). El polinucleótido puede ser un ADN o
ARN tal como un ARNm que codifica una proteína oncogénica de la
presente invención, que puede ser monocatenario o bicatenario.
Cuando es bicatenario, puede ser ADN bicatenario, un ARN
bicatenario o un híbrido de ADN:ARN. Cuando es monocatenario, puede
ser una cadena homosentido, es decir, una cadena codificadora, o
una cadena antisentido, es decir, una cadena no codificadora.
Un polinucleótido que codifica una proteína de
la presente invención se puede usar para cuantificar un ARNm de una
proteína de la presente invención, de acuerdo con un método conocido
o su modificación, por ejemplo un método descrito en Experimental
Medicine Extra Edition "Novel PCRs and their applications", 15
(7), 1997.
Un ADN que codifica una proteína de la presente
invención puede ser cualquier ADN que comprende la anterior
secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de la presente
invención, y puede ser un ADN genómico, una biblioteca de ADN
genómico, el anterior ADNc derivado de célula/tejido, la biblioteca
de ADNc derivada de célula/tejido anterior o un ADN sintético.
Un vector usado para una biblioteca puede ser un
bacteriófago, plásmido, cósmido o fagémido. Una preparación de un
ARN total o fracción de ARNm de la célula o tejido se puede usar
para la amplificación por una Reacción en Cadena de
Transcriptasa-Polimerasa Inversa directa (de aquí en
adelante, denominada "RT-PCR").
Una secuencia de nucleótidos disponible para un
ADN sonda de la presente invención puede ser cualquier secuencia
tal como una secuencia de ADN que comprende una secuencia de
nucleótidos que se puede hibridar con la secuencia de nucleótidos
de la SEQ ID. No.2 en condiciones de alta rigurosidad y codifica una
proteína que tiene una actividad sustancialmente equivalente a la
de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ
ID. No. 1.
Una secuencia de nucleótidos que se puede
hibridar con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID. No.2 en
condiciones de alta rigurosidad puede ser una secuencia de
nucleótidos que tiene una homología de aproximadamente 70% o más,
preferiblemente aproximadamente 80% o más, más preferiblemente
aproximadamente 90% o más, más preferiblemente aproximadamente 95%
o más, con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID. No. 2.
La hibridación se puede realizar de acuerdo con
un método conocido o su modificación, por ejemplo un método
descrito en Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold
Spring Harbor Lab. Press, 1989). Cuando se usa una biblioteca
disponible en el comercio, la hibridación se puede realizar de
acuerdo con un manual adjunto. Más preferiblemente, se puede
realizar en condiciones de alta rigurosidad.
Las condiciones de alta rigurosidad pueden
incluir, por ejemplo, una concentración de sodio de aproximadamente
19 a 40 mM, preferiblemente aproximadamente 19 a 20 mM y a
temperatura de aproximadamente 50 a 70ºC, preferiblemente
aproximadamente 60 a 65ºC, con máxima preferencia una concentración
de sodio de aproximadamente 19 mM y una temperatura de
aproximadamente 65ºC.
Más específicamente, un ADN que codifica una
proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID.
No. 1 puede ser un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de
la SEQ ID. No. 2.
Un ADN que codifica un péptido parcial puede ser
cualquier ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que
codifica el anterior péptido parcial, y puede ser un ADN genómico,
una biblioteca de ADN genómica, el anterior ADNc derivado de
célula/tejido, la biblioteca de ADNc derivado de célula/tejido
anterior o un ADN sintético.
Un ADN que codifica un péptido parcial puede ser
un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos parcial de un ADN
que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID. No.2, o un
ADN que comprende una secuencia de nucleótidos parcial de un ADN
que comprende una secuencia de nucleótidos que se puede hibridar con
la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID. No.2 en condiciones de
alta rigurosidad y codifica una proteína que tiene una actividad
sustancialmente equivalente a la de una proteína que comprende la
secuencia de aminoácidos de la SEQ ID. No. 1.
La secuencia de nucleótidos que se puede
hibridar con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID. No. 2 se
define como se describió anteriormente.
Un método de hibridación y las condiciones de
alta rigurosidad puede ser como se describió anteriormente.
Un polinucleótido que comprende una parte de una
secuencia de ADN que codifica una proteína de la presente invención
o su péptido parcial o una parte de una secuencia de nucleótidos
complementaria al ADN puede abarcar un ADN así como un ARN que
codifica una proteína de la presente invención o su péptido
parcial.
De acuerdo con la presente invención, un
polinucleótido antisentido (ácido nucleico) capaz de inhibir la
replicación o expresión de un gen de la proteína de la presente
invención diseñado y sintetizado sobre la base de los datos de la
secuencia de nucleótidos en un ADN que codifica la proteína de la
presente invención clonada o determinada. Tal polinucleótido (ácido
nucleico) se puede hibridar con un ARN de un gen de proteína de la
presente invención para inhibir la síntesis o actividades del ARN, o
regular o controlar la expresión de un gen de proteína de la
presente invención por medio de la interacción con un ARN
relacionado con una proteína de la presente invención. Un
polinucleótido complementario a una secuencia seleccionada en el ARN
relacionado con una proteína de la presente invención y un
polinucleótido que se puede hibridar específicamente con el ARN
relacionado con una proteína de la presente invención son útiles
para regular o controlar la expresión in vivo o in
vitro de un gen de proteína de la presente invención, y para el
tratamiento o diagnóstico de una enfermedad. El término
"correspondiente a", como se usa en la presente, significa
homología o complementación a una secuencia particular de un
nucleótido que incluye un gen, una secuencia de nucleótidos o un
ácido nucleico. El término "correspondiente a" en términos de
relación entre un nucleótido, una secuencia de nucleótidos o un
ácido nucleico y un péptido (proteína) generalmente se refiere a un
aminoácido de una proteína (péptido), un comando derivado de una
secuencia de nucleótidos (ácido nucleico) o su secuencia
complementaria. Los ejemplos de un dominio blanco preferible puede
incluir un bucle de horquilla 5-terminal, una
repetición de 6 pares de bases 5'-terminales, un
dominio de no traducción 5'-terminal, un codón de
iniciación de traducción de proteínas, un dominio codificador de
proteínas, un codón de detención de traducción de ORF, un dominio de
no traducción 3'-terminal, un dominio palindrómico
3'-terminal y un bucle de horquilla
3'-terminal en un gen de proteína de la presente
invención, pero se puede seleccionar cualquier dominio de un gen de
proteína de la presente invención como blanco.
La relación entre un ácido nucleico dado, un
polinucleótido complementario con al menos una parte del dominio
blanco y entre un blanco y un polinucleótido hibridizable se puede
llamar "antisentido". Los ejemplos de un polinucleótido
antisentido incluyen un polinucleótido que comprende
2-desoxi-D-ribosa,
un polinucleótido que comprende D-ribosa, otros
tipos de polinucleótidos como un N-glicósido de la
base purina o pirimidina y otros polímeros que comprenden una
estructura no nucleotídica (por ejemplo, un ácido nucleico de
proteína disponible en el comercio y un polímero de ácido nucleico
específico de secuencia sintética) u otro polímero que tiene un
enlace especial aunque el polímero comprende un nucleótido que tiene
una configuración que puede aceptar el apareamiento de bases o
unión de bases que se observa en un ADN o ARN. Estos pueden ser un
ADN bicatenario, un ADN monocatenario, un ARN bicatenario, un ARN
monocatenario o un híbrido ADN:ARN. También pueden incluir
polinucleótidos no modificados (u oligonucleótidos no modificados),
los que tienen una modificación conocida tal como una cola conocida
en la técnica, una terminación, metilación, reemplazo de al menos un
nucleótido natural con un análogo y una modificación de nucleótido
intramolecular; los que tienen un enlace no cargado (por ejemplo,
metilfosfonato, fosfotriéster, fosforamidato y carbamato); los que
tienen un enlace cargado o un enlace que contiene azufre (por
ejemplo, fosforotioato y fosforoditioato); los que tienen un grupo
de cadena lateral que incluye una proteína (una nucleasa, un
inhibidor de nucleasa, toxina, un anticuerpo, un péptido señal y
poli-L-lisina) o un azúcar (por
ejemplo, un monosacárido); los que comprenden un compuesto
intercurrente (por ejemplo, acridina y psoraleno); los que
comprenden un compuesto quelante (por ejemplo, un metal, un metal
radiactivo, boro y un metal oxidante); los que comprenden un agente
alquilante; y los que comprenden un enlace modificado (por ejemplo,
un ácido nucleico \alpha-anomérico). Los términos
"nucleósido", "nucleótido" y "ácido nucleico", como
se usan en la presente, pueden incluir no sólo los que contienen las
bases purina y pirimidina pero también los que además contienen
otra base heterocíclica modificada. Tal sustancia modificada puede
contener purina y pirimidina metiladas, purina y pirimidina aciladas
u otros heterociclos. Un nucleósido modificado y un nucleótido
modificado pueden estar modificados en un resto de azúcar; por
ejemplo, uno o más hidroxilos se pueden reemplazar por un grupo
halógeno o alifático, o se pueden convertir en otro grupo funcional
tal como éter y amina.
Un polinucleótido (ácido nucleico) antisentido
de la presente invención es un ARN, ADN o ácido nucleico modificado
(ARN, ADN). Los ejemplos de un ácido nucleico modificado incluyen,
pero sin limitación, un derivado azufrado o derivado de tiofosfato
de un ácido nucleico y los resistentes a la descomposición por una
polinucleosidoamida o una oligonucleosidoamida. Un ácido nucleico
antisentido de la presente invención se puede diseñar
preferiblemente, por ejemplo, de modo que el ácido nucleico
antisentido se haga más estable en una célula, que el ácido nucleico
antisentido tenga una mayor permeabilidad en una célula, que tenga
afinidad por una cadena homosentido blanco o si es tóxico, el ácido
nucleico antisentido se torne menos tóxico.
Una variedad de tales modificaciones son bien
conocidas en la técnica y han sido descritas, por ejemplo, en J.
Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol.
8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed, Antisense Research
and Applications, CRC Press, 1993.
Un ácido nucleico antisentido de la presente
invención puede comprender un azúcar convertido y/o modificado,
base y/o enlace, y de este modo se puede suministrar como una forma
especial tal como un liposoma y una microesfera, se puede aplicar
en terapia génica o se puede suministrar como un aducto. Los
ejemplos de tal aducto incluyen un aducto policatiónico tal como
polilisina que actúa como neutralizante para una carga de la
estructura del fosfato y un aducto hidrófobo tal como un lípido que
potencia la interacción con una membrana celular o que aumenta la
captación de un ácido nucleico (por ejemplo, un fosfolípido y
colesterol). Los ejemplos de un lípido preferible para la adición
incluyen colesterol y sus derivados (por ejemplo, cloroformiato de
colesterilo y ácido cólico). Se puede unir a un extremo 3'- o
5'-terminal de un ácido nucleico por medio de una
base, azúcar o enlace nucleosídico intramolecular. Otro grupo
disponible puede ser, por ejemplo, un grupo de terminación ubicado
en forma específica en un extremo 3'- o 5'-terminal
en un ácido nucleico para prevenir la descomposición con una
nucleasa tal como exonucleasa y ARNasa. Los ejemplos de tal grupo de
terminación incluyen, pero sin limitación, los conocidos como grupo
protector de hidroxilos en la técnica, tales como glicoles que
incluyen polietilenglicol y tetraetilenglicol.
La inhibición de la actividad del ácido nucleico
antisentido se puede determinar usando un transformante de la
presente invención, un sistema de expresión génica in vivo o
in vitro de la presente invención, o un sistema de
traducción in vivo o in vitro de una proteína de la
presente invención. El ácido nucleico puede ser aplicado a una
célula mediante alguno de los diversos métodos conocidos.
Un ADN que codifica una proteína de la presente
invención se puede marcar por un método conocido; por ejemplo,
marcación isotópica, marcación fluorescente (por ejemplo, marcación
fluorescente con fluoresceína), biotinilación y marcación
enzimática.
Un ADN que codifica completamente una proteína
de la presente invención se puede clonar por amplificación con una
PCR conocida usando un cebador de ADN sintético que comprende una
secuencia de nucleótidos parcial en una proteína de la presente
invención, o seleccionar un ADN integrado en un vector apropiado por
hibridación con el marcado con un fragmento de ADN o ADN sintético
que codifica una proteína parcial o de longitud completa de la
presente invención. La hibridación se puede realizar, por ejemplo,
por un método descrito en Molecular Cloning 2nd, J. Sambrook et
al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989. Cuando se usa una
biblioteca disponible en el comercio, la hibridación se puede
realizar de acuerdo con un manual adjunto.
\newpage
Una secuencia de ADN se puede transformar usando
un kit conocido tal como Mutan^{TM} super Express Km (Takara
Shuzo Co., Ltd.), Mutan^{TM}-K (Takara Shuzo Co.,
Ltd), por un método conocido tal como ODA-LA PCR,
método dúplex con brecha y método de Kunkel o una variación de los
mismos.
Dependiendo de la aplicación, un ADN que
codifica un péptido clonado se puede usar como tal o, si se desea,
se puede usar después de la digestión con una enzima de restricción
o adición de un ligador. El ADN puede tener ATG como codón de
iniciación de traducción en el extremo 5'-terminal y
TAA, TGA o TAG como codón de detención de traducción en el extremo
3'-terminal. El codón de iniciación de traducción o
el codón de detención de traducción se pueden agregar usando un ADN
adaptador sintético apropiado.
Se puede producir un vector de expresión de una
proteína de la presente invención, por ejemplo, (i) escindiendo un
fragmento de ADN deseado a partir de un ADN que codifica una
proteína de la presente invención y (ii) ligando el fragmento de
ADN corriente debajo de un promotor de un vector de expresión
apropiado.
Los ejemplos de un vector que se pueden utilizar
incluyen plásmidos derivados de E. coli (por ejemplo, pBR322,
pBR325, pUC12 y pUC13); plásmidos derivados de Bacillus
subtilis (por ejemplo, pUB110, pTP5 y pC194); plásmidos
derivados de una levadura (por ejemplo, pSHI9 y pSH15);
bacteriófagos tales como el fago \lambda; virus de mamíferos
tales como retrovirus, virus de vaccinia y baculovirus;
pA1-11; pXT1; pRc/CMV; pRc/RSV; y pDNAI/Neo.
Un promotor usado en la presente invención puede
ser cualquier promotor apropiado para un huésped utilizado en la
expresión de genes. Por ejemplo, cuando se usa una célula de
mamífero como huésped, se puede usar un promotor \alpha de SR, un
promotor de SV40, un promotor de HIV-LTR, un
promotor de CMV o un promotor de HSV-TK.
Entre estos, es preferible usar un promotor de
CMV (citomegalovirus) o un promotor \alpha de SR. Cuando el
huésped es una Escherichia coli, son preferibles un promotor
de trp, un promotor de lac, un promotor de recA, un promotor de
\lambda-PL, un promotor de lpp y un promotor de
T7; cuando el huésped es un Bacillus, son preferibles un promotor
de SPO1, un promotor de SPO2 y un promotor de penP; cuando el
huésped es una levadura, son preferibles un promotor de PHO5, un
promotor de aPGK, un promotor de GAP y un promotor de ADH. Cuando
el huésped es una célula de insecto, son preferibles un promotor de
polihetrina y un promotor de P10.
Si se desea, se puede utilizar otro vector de
expresión, que incluye los que comprenden un potenciador, una señal
de empalme, una señal de adición de poli-A, un
marcador de selección y/o un origen de replicación SV40 (de aquí en
adelante, algunas veces denominado "SV40ori"). Los ejemplos de
marcador de selección incluyen el gen de dihidrofolato reductasa
(de aquí en adelante, algunas veces denominado "dhfr")
[resistente a metotrexato (MTX)], un gen resistente a ampicilina
(de aquí en adelante, algunas veces denominado "Ampr") y un gen
resistente a neomicina (de aquí en adelante, algunas veces
denominado "Neor", resistente a G418). En particular, cuando
se usa el gen de dhfr como marcador de selección usando células de
hámster chino con gen de dhfr suprimido, la integración de un gen
deseado se puede seleccionar usando un medio deficiente en
timidina.
Como marcador de selección, se usa un gen
indicador o gen de resistencia a fármacos (New Biochemical
Experimental Lectures (Shin Seikagaku Jikken Koza) 2, nucleic acid
III, 3.6 Mammalian cell expression vector,
p84-103).
Los ejemplos de combinación de un gen de
resistencia a fármacos y un fármaco que se pueden usar incluyen:
- (1)
- una combinación de un gen de puromicina-N-acetiltransferasa y puromicina;
- (2)
- una combinación de un gen de aminoglicósido fosfotransferasa (APH) y G418;
- (3)
- una combinación de un gen de higromicina-B fosfotransferasa (HPH) e higromicina-B; y
- (4)
- una combinación de xantina-guanina fosforribosiltransferasa (XGPRT) y micofenolato.
Cuando una cepa de célula progenitora es una
cepa deficiente en hipoxantina-guanina
fosforribosiltransferasa (HGPRT) o en timidinaquinasa (TK), se
puede usar una combinación de estos genes y HAT (hipoxantina,
aminopterina y timidina).
Se pueden usar el gen de dihidrofolato reductasa
o de resistencia a ampicilina como gen marcador de selección.
Si es necesario, se añade una secuencia señal
apropiada para un huésped al extremo N-terminal de
una proteína de la presente invención. Cuando el huésped es una
Escherichia coli, se puede usar una secuencia señal PhoA y
una secuencia señal OmpA; cuando el huésped es un Bacillus, se puede
usar una secuencia señal de \alpha-amilasa y se
puede usar una secuencia señal subtilisina; cuando el huésped es una
levadura, se puede usar una secuencia señal MF\alpha y una
secuencia señal SUC2; cuando el huésped es una célula de mamífero,
se puede usar una secuencia señal de insulina, una secuencia señal
de \alpha-interferón y una secuencia señal de
molécula de anticuerpo.
Un vector que comprende un ADN que codifica una
proteína de la presente invención construido de este modo se puede
usar para producir un transformante.
Un huésped puede ser, por ejemplo, una
Escherichia coli, un Bacillus, una levadura, una célula de
insecto, un insecto o una célula de mamífero.
Los ejemplos de Escherichia coli incluyen
Escherichia coli K12DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA), Vol.
60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, Vol. 9, 309
(1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology, Vol.120, 517 (1978)],
HB101 (Journal of Molecular Biology, Vol.41, 459 (1969)] y C600
[Genetics, Vol. 39, 440 (1954)].
Los ejemplos de Bacillus incluyen Bacillus
subtilis MI114 [Gene, Vol. 24, 255 (1983)] y
207-21 [Journal of Biochemistry, Vol. 95, 87
(1984)].
Los ejemplos de levadura incluyen
Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R,
NA87-11A, DKD-5D y
20B-12; Schizosaccharomyces pombe NCYC1913 y
NCYC2O36; y Pichia pastoris KM71.
En términos de células de insecto, cuando el
virus es AcNPV, se puede usar una célula establecida derivada de
larvas de oruga militar (célula de Spodoptera frugiperda;
célula de Sf), una célula de MG1 derivada de intestino medio de
Trichoplusia ni, una célula High Five^{TM} derivada de un
huevo de Trichoplusia ni, una célula derivada de Mamestra
brassicae o una célula derivada de Estigmena acres.
Cuando el virus es BmNPV, se puede usar una célula establecida
derivada de gusano de seda (célula de Bombyx mori N; célula
de BmN). Los ejemplos de célula Sf que se pueden usar incluyen una
célula Sf9 (ATCC CRL1711) y una célula Sf21, que se han descrito en
Vaughn, J. L. et al., In Vivo, 13,
213-217 (1977)).
Los ejemplos de insecto incluyen larvas de
gusano de seda [Maeda et al., Nature, Vol.315, 592
(1985)].
Los ejemplos de célula de mamífero incluyen una
célula COS-7 de simio (COST), Vero, una célula de
hámster chino CHO (de aquí en adelante, denominada "célula
CHO"), una célula de hámster chino CHO con gen dhfr suprimido
(de aquí en adelante, denominada "célula CHO(dhfr-)"),
una célula L murina, una AtT-20 murina, una célula
de mieloma murino, una célula GH3 de rata y una FL humana.
Una Escherichia coli se puede transformar
de acuerdo, por ejemplo, con un método descrito en Proc. Natl. Acad.
Sci. USA), Vol.69, 2110 (1972) o Gene, Vol.17, 107 (1982).
Un Bacillus se puede transformar de acuerdo, por
ejemplo, con un método descrito en Molecular & General
Genetics), Vol.168, 111 (1979).
Una levadura se puede transformar de acuerdo,
por ejemplo, con un método descrito en Methods in Enzymology,
Vol.194, 182-187 (1991) o Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Vol.75, 1929 (1978).
Una célula de insecto o un insecto se pueden
transformar de acuerdo, por ejemplo, con un método descrito en
Bio/Technology, 6, 47-55 (1988).
Una célula de mamífero se puede transformar de
acuerdo, por ejemplo, con un método descrito en Cell Technology
Extra Issue 8, New Cell Technological Experiment Protocols.
263-267 (1995) (Shuju Co. Ltd.) o Virology, Vol.52,
456 (1973).
En consecuencia, se puede obtener un
transformante que se ha transformado con un vector de expresión que
comprende un ADN que codifica una proteína de la presente
invención.
Cuando se cultiva un transformante para el que
un huésped es una Escherichia coli o Bacillus, un medio
apropiado usado para el cultivo es un medio líquido que contiene
una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, materiales
inorgánicos y demás necesarios para el cultivo del transformante.
Los ejemplos de fuente de carbono incluyen glucosa, dextrina,
almidón soluble y sacarosa. Los ejemplos de fuente de nitrógeno
incluyen materiales inorgánicos y orgánicos tales como sales de
amonio, nitratos, licor de maíz fermentado, peptona, caseína,
extracto de carne, torta de soja y extracto de patata. Los ejemplos
de material inorgánico incluyen cloruro de calcio, dihidrógeno
fosfato de sodio y cloruro de magnesio. Se puede añadir extracto de
levadura, vitaminas y/o factores de aceleración del crecimiento. El
medio tiene convenientemente un pH de aproximadamente 5 a 8.
Un ejemplo preferible de medio para cultivar una
Escherichia coli puede ser un medio M9 que contiene glucosa
y ácido casamino [Miller, Journal of Experiments in Molecular
Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor LaboHumanory,
New York, 19721. Si es necesario, se puede añadir un agente
adicional tal como ácido 3\beta-indolilacrílico
para conseguir una eficiente actividad promotora.
Cuando el huésped es una Escherichia
coli, el cultivo se realiza generalmente a aproximadamente 15 a
43ºC durante aproximadamente 3 a 24 horas bajo aireación y/o
agitación, si es necesario.
Cuando el huésped es un Bacillus, el cultivo se
realiza generalmente a aproximadamente 30 a 40ºC durante
aproximadamente 6 a 24 horas bajo aireación y/o agitación, si es
necesario.
\newpage
Cuando se cultiva un transformante cuyo huésped
es una levadura, los ejemplos de medio de cultivo que se pueden
usar incluyen un medio mínimo de Burkholder [Bostian, K. L. et
al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, 4505 (1980)] y un medio
SD que contiene 0,5% de ácido casamino [Bitter, G. A. et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 81, 5330 (1984)]. El pH del medio
se ajusta preferiblemente a aproximadamente 5 a 8. El cultivo se
realiza generalmente a aproximadamente 20 a 35ºC durante
aproximadamente 24 a 72 horas bajo aireación y/o agitación, si es
necesario.
Cuando se cultiva un transformante en el que el
huésped es una célula de insecto o insecto, un medio de cultivo
puede ser un medio para insecto de Grace (Grace, T.C.C., Nature,
195, 788 (1962)) que contiene aditivos tales como 10% de suero
bovino sin complemento, según corresponda. El pH del medio se ajusta
preferiblemente a aproximadamente 6,2 a 6,4. El cultivo se realiza
generalmente a aproximadamente 27ºC durante aproximadamente 3 a 5
días bajo aireación y/o agitación, si es necesario.
Cuando se cultiva un transformante en el que el
huésped es una célula de mamífero, los ejemplos de medio de cultivo
incluyen un medio MEM que contiene aproximadamente 5 a 10% de suero
bovino fetal [Science, Vol.122, 501 (1952)], un medio DMEM
(Virology, Vol.8, 396 (1959)], un medio RPMI 1640 [The Journal of
the American Medical Association, Vol. 199, 519 (1967)] y un medio
199 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, Vol.
73, 1(1950)]. El pH del medio se ajusta preferiblemente a
aproximadamente 6 a 8. El cultivo se realiza generalmente a
aproximadamente 30 a 40ºC durante aproximadamente 15 a 60 horas bajo
aireación y/o agitación, si es necesario.
Como se describió anteriormente, una proteína de
la presente invención se puede producir en una región intracelular,
en la membrana celular o en la región extracelular de una célula
transformante.
Una proteína de la presente invención se puede
aislar y purificar del cultivo anterior, por ejemplo, por el
siguiente método.
Una proteína de la presente invención se puede
extraer de bacterias o células cultivadas, según corresponda, por
un método en que después del cultivo, se recolectan las bacterias o
las células por un procedimiento conocido, se suspenden en un
tampón apropiado, las bacterias o las células se lisan usando
ultrasonido, lisozimas y/o congelamiento y descongelamiento,
posteriormente se centrifugan o filtran para dar un extracto bruto
de una proteína de la presente invención. El tampón puede contener
un modificador de proteínas tal como urea e hidrocloruro de
guanidina y un tensioactivo tal como Triton
X-100^{TM.} Cuando un péptido se secreta en un
medio de cultivo, las bacterias o las células se separan del
sobrenadante por un método conocido después de cultivar y
posteriormente se recolecta el sobrenadante.
Una proteína de la presente invención contenida
en el sobrenadante del cultivo o el extracto obtenido de este modo
se puede purificar por una combinación apropiada de métodos de
separación/purificación conocidos. Los ejemplos de tales métodos de
separación/purificación conocidos son métodos que utilizan la
solubilidad, tales como extracción salina o precipitación en
disolvente; métodos que utilizan principalmente una diferencia de
peso molecular tales como diálisis, ultrafiltración, filtración en
gel y electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS;
métodos que utilizan una diferencia de carga tales como
cromatografía de intercambio iónico; métodos que utilizan la
afinidad específica tales como cromatografía de afinidad; métodos
que utilizan una diferencia de hidrofobicidad tales como
cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa; y métodos
que utilizan una diferencia de punto isoeléctrico tales como
isoelectroenfoque.
Cuando la proteína de la presente invención así
obtenida es una forma libre, se puede convertir en una sal por un
método conocido o una modificación del mismo. A la inversa, cuando
se obtiene como sal, se puede convertir en una forma libre u otra
sal por un método conocido o una modificación del mismo.
Antes o después de la purificación, una proteína
de la presente invención producida por un recombinante puede ser
atacada por una enzima modificadora de proteínas apropiadas
modificadas según corresponda o para remover parcialmente un
péptido. Los ejemplos de enzima modificadora de proteínas incluyen
tripsina, quimiotripsina, arginil-endopeptidasa,
proteína quinasa y glicosidasa.
Un anticuerpo contra la proteína de la presente
invención puede ser policlonal o monoclonal siempre que sea un
anticuerpo que pueda reconocer a un anticuerpo contra una proteína
de la presente invención.
El anticuerpo contra una proteína de la presente
invención se puede producir por un método conocido para preparar un
anticuerpo o antisuero usando una proteína de la presente invención
como antígeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Una proteína de la presente invención se aplica
sola o en combinación con un portador y un diluyente a un sitio en
un animal de sangre caliente en el que se puede producir un
anticuerpo. Para la aplicación, se puede aplicar un adyuvante de
Freund completo o incompleto para aumentar la capacidad para
producir anticuerpos. En general se aplica una vez durante 2 a 6
semanas y aproximadamente 2 a 10 veces en total. Los ejemplos de
animales de sangre caliente incluyen mono, conejo, perro, cobayo,
ratón, rata, oveja, cabra y aves, preferiblemente ratón y rata.
Para preparar una célula productora de
anticuerpos monoclonales, se selecciona un individuo que exhiba un
título de anticuerpos de un animal de sangre caliente inmunizado por
un antígeno tal como ratón y se aísla el bazo o un ganglio
linfático 2 a 5 días después de la inmunización final. Una célula
productora de anticuerpos contenida en la muestra aislada se puede
fusionar a una célula de mieloma del mismo o diferente animal para
preparar un hibridoma productor de anticuerpos monoclonales. Se
puede determinar un título de anticuerpos en un antisuero, por
ejemplo, haciendo reaccionar un péptido marcado que se describe
posteriormente con el antisuero y midiendo posteriormente la
actividad del marcador unido a un anticuerpo. La fusión se puede
realizar por un método conocido tal como el método de
Kaehler-Milstein [Nature, 256, 495 (1975)]. Los
ejemplos de acelerador de fusión incluyen polietilenglicol (PEG) y
virus Sendai, preferiblemente PEG.
Los ejemplos de célula de mieloma incluyen las
de un animal de sangre caliente tales como NS-1,
P3U1, SP2/0 y AP-1, preferiblemente P3U1. Una
relación numérica preferible de células productoras de anticuerpos
(células del bazo) a células de mieloma es aproximadamente 1: 1 a
20:1, se añade PEG (preferiblemente PEG1000 a PEG6000) a una
concentración de aproximadamente 10 a 80%, y la fusión celular se
puede realizar en forma eficiente por incubación a 20 a 40ºC,
preferiblemente 30 a 37ºC durante 1 a 10 min.
Un hibridoma productor de anticuerpos
monoclonales se puede seleccionar por alguno de varios métodos; por
ejemplo, añadiendo un sobrenadante de cultivo de hibridoma a una
fase sólida (por ejemplo, una microplaca) en la que se ha adsorbido
un antígeno peptídico (proteína) en forma directa o en combinación
con un portador, añadiendo posteriormente un anticuerpo
anti-inmunoglobulina (cuando una célula usada para
la fusión celular es una célula murina, se utiliza un anticuerpo
inmunoglobulina anti-ratón) o proteína A marcada con
un agente radiactivo o enzima, y detectando finalmente un
anticuerpo monoclonal unido a la fase sólida, o alternativamente
añadiendo un sobrenadante de cultivo de hibridoma a una fase sólida
en la que se ha adsorbido un anticuerpo o proteína A
anti-inmunoglobulina, añadiendo un péptido marcado
con un agente radiactivo o enzima, y detectando finalmente un
anticuerpo monoclonal unido a la fase sólida.
Un anticuerpo monoclonal se puede seleccionar
por un método conocido o su modificación. En general se puede usar
un medio para una célula de mamífero que contiene HAT (hipoxantina,
aminopterina y timidina). Un medio para la selección y mejoramiento
genético puede ser cualquier medio en el que se puede cultivar un
hibridoma; por ejemplo, un medio RPMI 1640 que contiene 1 a 20%,
preferiblemente 0 a 20% de suero bovino fetal, un medio GIT que
contiene 1 a 10% de suero bovino fetal (Wako Pure Chemicals Co. Ltd)
y un medio libre de suero para cultivar un hibridoma
(SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.). La
temperatura de cultivo es generalmente 20 a 40ºC, preferiblemente
aproximadamente 37ºC. El período de cultivo es generalmente 5 días a
3 semanas, preferiblemente 1 a 2 semanas. El cultivo se puede
realizar generalmente bajo atmósfera de 5% de dióxido de carbono
gaseoso. El título de anticuerpos en un sobrenadante de cultivo de
hibridoma se puede determinar como se describe para la
determinación de un título de anticuerpos en el antisuero
anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Un anticuerpo monoclonal se puede separar y
purificar por un método conocido que incluye métodos de
separación/purificación para una inmunoglobulina tal como salazón,
precipitación con alcohol, precipitación isoeléctrica,
electroforesis, un método de adsorción y desorción con un
intercambiador de iones (por ejemplo, DEAE), ultracentrifugación,
filtración en gel y una purificación específica en la que un
anticuerpo es recolectado exclusivamente por un adsorbente activado
tal como una fase sólida de unión al antígeno, proteína A o proteína
G para disociar el enlace para obtener el anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
Un anticuerpo policlonal de la presente
invención se puede preparar de acuerdo con un método conocido o su
modificación. Por ejemplo, se prepara un inmunógeno (antígeno
peptídico) o su complejo con una proteína portadora, un animal de
sangre caliente se inmuniza con este como se describió para el
proceso de preparación para el anterior anticuerpo monoclonal, se
recolecta un producto que contiene un anticuerpo contra una proteína
de la presente invención del animal inmunizado, y después de la
separación y purificación, se puede preparar el anticuerpo.
En términos de un complejo de un inmunógeno y
una proteína portadora para inmunizar a un animal de sangre
caliente, se puede emplear cualquier tipo de proteínas portadoras y
cualquier relación de mezcla del portador al hapteno siempre que se
pueda producir eficientemente un anticuerpo contra un hapteno
inmunizado por entrecruzamiento con el portador; por ejemplo,
aproximadamente 0,1 a 20 partes en peso, preferiblemente
aproximadamente 1 a 5 partes en peso de albúmina sérica bovina,
tiroglobulina bovina, hemocianina o similares se acoplan a 1 parte
en peso del hapteno.
Se pueden usar diversos agentes de condensación
para acoplar el hapteno con el portador, que incluyen
glutaraldehído, carbodiimida, éster de maleimida activado y éster
activado, reactivos que tienen grupos tiol y/o un ditio-
piridilo.
piridilo.
\newpage
Un producto de condensación se aplica solo o en
combinación de un portador y un diluyente, a un sitio de un animal
de sangre caliente en el que se puede producir un anticuerpo. Para
la aplicación, se puede aplicar un adyuvante de Freund completo o
incompleto para aumentar la capacidad para producir anticuerpos. En
general se aplica una vez durante 2 a 6 semanas y aproximadamente 3
a 10 veces en total.
Un anticuerpo policlonal se puede recolectar de
la sangre o ascitis, preferiblemente de la sangre de un animal de
sangre caliente inmunizado como se describió anteriormente.
Se puede determinar el título de anticuerpo
policlonal en un antisuero como se describió para la determinación
del título de anticuerpo en un antisuero. El anticuerpo policlonal
se puede separar y purificar como se describió para la separación y
purificación de la inmunoglobulina en el curso de la
separación/purificación del anterior anticuerpo monoclonal.
Un ADN antisentido que comprende una secuencia
de nucleótidos complementaria o sustancialmente complementaria con
un ADN que codifica una proteína de la presente invención (de aquí
en adelante, el último ADN se denomina a veces "un ADN de la
presente invención", y el primer ADN antisentido se denomina a
veces "ADN antisentido") puede ser cualquier ADN antisentido
que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria o
sustancialmente complementaria con un ADN de la presente invención
y capaz de inhibir la expresión del ADN.
Una secuencia de nucleótidos sustancialmente
complementaria a un ADN de la presente invención puede ser, por
ejemplo, una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de
aproximadamente 70% o más, preferiblemente aproximadamente 80% o
más, más preferiblemente 90% o más, con máxima preferencia
aproximadamente 95% o más con la secuencia de nucleótidos total o
parcial complementaria a un ADN de la presente invención (es decir,
una cadena complementaria a un ADN de la presente invención). De
particular preferencia es un ADN antisentido que tiene una
homología de aproximadamente 70% o más, preferiblemente
aproximadamente 80% o más, más preferiblemente 90% o más, con
máxima preferencia aproximadamente 95% o más con una cadena
complementaria a una secuencia de nucleótidos de un dominio que
codifica el sitio N-terminal de una proteína de la
presente invención (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos
cercana a un codón de iniciación) en la secuencia de nucleótidos
completa de la cadena complementaria a un ADN de la presente
invención. Tal ADN antisentido se puede preparar usando, por
ejemplo, un sintetizador de ADN conocido.
Se describirán aplicaciones de una proteína
oncogénica de acuerdo con la presente invención (que incluye una
sal), un ADN de la presente invención, un anticuerpo de la presente
invención y un ADN antisentido de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Una proteína oncogénica de la presente
invención, un oligonucleótido de la presente invención o un
anticuerpo de la presente invención se pueden usar para un método
de detección de un compuesto que promueve o inhibe la expresión de
una proteína de la presente invención.
En forma específica, la presente descripción
proporciona
- (i)
- un método para detectar un compuesto que promueve o inhibe la expresión de una proteína oncogénica de la presente invención que comprende determinar y comparar la cantidad de expresión de una proteína oncogénica de la presente invención o la cantidad de un ARNm que codifica una proteína oncogénica de la presente invención cuando se cultiva una célula o tejido que puede expresar una proteína oncogénica de la presente invención en presencia o ausencia de un compuesto de ensayo.
Los ejemplos de una célula o tejido que pueden
expresar una proteína oncogénica de la presente invención incluyen
una célula derivada de seres humanos, de una célula de animal de
sangre caliente (por ejemplo, cobayo, rata, ratón, aves, conejo,
cerdo, oveja, vaca y mono) (por ejemplo, célula neural, célula
endocrina, célula neuroendocrina, célula de glía, célula
pancreática \beta, célula de médula, célula hepática, célula de
bazo, célula del mesangio, célula epidérmica, célula epitelial,
célula endotelial, fibroblasto, fibrocito, miocito, adipocito,
inmunocito (por ejemplo, macrófago, célula T, célula B, célula
citolítica natural, mastocito, neutrófilo, célula basófila,
leucocito acidofílico, monocito, célula dendrítica), megacariocito,
sinoviocito, célula de cartílago, osteocito, osteoblasto,
osteoclasto, célula de glándula mamaria, célula intersticial y sus
células precursoras, células madre y células de carcinoma, así como
todos los tejidos en los que están presentes cualquiera de estas
células, tales como cerebro, sitios cerebrales (por ejemplo, bulbo
olfatorio, núcleo amigdaloide, cisterna basal, hipocampo, tálamo
óptico, hipotálamo, corteza cerebral, médula oblonga, cerebelo),
médula espinal, glándula pituitaria, estómago, páncreas, riñón,
hígado, glándula genital, glándula tiroides, vesícula biliar,
médula ósea, glándula adrenal, piel, músculo, pulmón, tracto
gastrointestinal (por ejemplo, intestino grueso e intestino
delgado), vaso sanguíneo, corazón, timo, bazo, glándula salival,
sangre periférica, glándula prostática, testículo (espermario),
ovario, placenta, útero, hueso, cartílago, articulación y músculo
esquelético. En la presente, se puede usar una célula establecida o
sistema de cultivo
primario.
primario.
Un compuesto de ensayo puede ser, además de los
anteriores compuestos de ensayo, una biblioteca de ADN.
La cantidad de expresión de una célula cancerosa
se puede determinar por un método conocido tal como un método
inmunoquímico que usa, por ejemplo, un anticuerpo, o
alternativamente un ARNm que codifica una proteína oncogénica de la
presente invención se puede determinar por un método conocido
empleando hibridación Northern, RT-PCR o PCR
TaqMan.
Las cantidades de expresión de un ARNm se pueden
comparar por hibridación de acuerdo con un método conocido o su
modificación, por ejemplo un método descrito en Molecular Cloning
2nd, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press,
1989.
Específicamente, la cantidad de ARNm que
codifica una proteína oncogénica de la presente invención se
determina de acuerdo con un método conocido, es decir, poniendo en
contacto un ARN extraído de una célula con un polinucleótido de la
presente invención o su parte o un polinucleótido antisentido de la
presente invención y midiendo posteriormente la cantidad de ARNm
unido a un polinucleótido de la presente invención o su parte o un
polinucleótido antisentido de la presente invención. Un
polinucleótido de la presente invención o su parte o un
polinucleótido antisentido de la presente invención se puede
marcar, por ejemplo, con un radioisótopo o colorante para facilitar
la determinación de la cantidad de ARNm unido a un polinucleótido
de la presente invención o su parte o un polinucleótido antisentido
de la presente invención. Los ejemplos de radioisótopo incluyen
^{32}P y ^{3}H, y los ejemplos de colorante incluyen
fluorocromos tales como fluoresceína, FAM (PE Biosystems Inc.), JOE
(PE Biosystems Inc.), TAMRA (PE Biosystems Inc.), ROX (PE
Biosystems Inc.), Cy5 (Amersham Inc.) y Cy3 (Amersham
Inc.).
Inc.).
La cantidad de ARNm se puede determinar
transformando un ARN extraído de una célula en ADNc usando una
transcriptasa inversa y midiendo posteriormente la cantidad de ADNc
amplificado por PCR usando un polinucleótido de la presente
invención o su parte o un polinucleótido antisentido de la presente
invención como cebador.
En consecuencia, un compuesto de ensayo que
aumenta la cantidad de ARNm que codifica una proteína oncogénica de
la presente invención se puede seleccionar como compuesto que
promueve la expresión de una proteína oncogénica de la presente
invención, mientras que un compuesto de ensayo que reduce la
cantidad de ARNm que codifica una proteína oncogénica de la
presente invención se puede seleccionar como compuesto que inhibe la
expresión de una proteína oncogénica de la presente invención.
La presente invención también proporciona:
- (ii)
- un método para detectar un compuesto que promueve o inhibe la actividad promotora, que comprende determinar y comparar una actividad indicadora cuando se cultiva, en presencia o ausencia de un compuesto de ensayo, un transformante obtenido por transformación con un ADN recombinante en el que un gen indicador se liga corriente abajo de un dominio promotor o potenciador para un gen que codifica una proteína oncogénica de la presente invención.
Los ejemplos de gen indicador que se pueden usar
incluyen el de lacZ(\beta-galactosidasa),
cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasa, factores de
crecimiento, \beta-glucuronidasa, fosfatasa
alcalina, proteína fluorescente verde (CFI)) y
\beta-lactamasa.
Por determinación de la cantidad de un producto
gen indicador (por ejemplo, ARNm y proteína) usando un método
conocido, un compuesto de ensayo que incrementa la cantidad del
producto gen indicador se puede seleccionar como compuesto que
controla (en particular, que promueve) la actividad promotora o
potenciadora de una proteína de la presente invención, es decir,
como compuesto que promueve la expresión de una proteína de la
presente invención. Por el contrario, un compuesto de ensayo que
reduce la cantidad del producto gen indicador se puede seleccionar
como compuesto que controla (en particular, que inhibe) la actividad
promotora o potenciadora de una proteína de la presente invención,
es decir, como compuesto que inhibe la expresión de una proteína de
la presente
invención.
invención.
Un compuesto de ensayo puede ser como se
describió anteriormente.
Un vector que comprende un gen indicador se
puede construir o valorar por una técnica conocida (por ejemplo,
véase Molecular Biotechnology 13, 29-43, 1999).
Debido a que un compuesto que inhibe la
expresión de una proteína oncogénica de la presente invención puede
inhibir las actividades biológicas de una proteína oncogénica de la
presente invención, es útil como droga medicinal segura y de baja
toxicidad para inhibir las actividades biológicas de una proteína
oncogénica de la presente invención. Específicamente, es útil como
droga profiláctica o terapéutica para un cáncer tal como cáncer
pulmonar, cáncer renal, carcinoma hepático, cáncer pulmonar de
células no pequeñas, cáncer ovárico, cáncer prostático, cáncer
gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer
de colon, cáncer rectal y cáncer pancreático, en particular cáncer
cervical.
\newpage
Un compuesto o su sal obtenida usando un método
de detección o kit de detección de la presente invención puede ser,
por ejemplo, un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un
péptido, una proteína, un compuesto no peptídico, un compuesto
sintético, un producto de fermentación, un extracto celular, un
extracto de planta, un extracto de tejido animal y plasma. Una sal
del compuesto puede ser como se describe para una sal de un péptido
derivado de una proteína oncogénica de la presente invención.
Cuando se usa un compuesto obtenido utilizando
un método de detección o kit de detección de acuerdo con la
presente invención como el anterior agente terapéutico o
profiláctico, este se puede usar como es usual. Por ejemplo, tal
como se describe para un medicamento que comprende una proteína de
la presente invención, se puede preparar como comprimido, cápsula,
elixir, microcápsula, solución y suspensión estéril.
La dosis del compuesto o su sal depende de
varios factores tales como su efecto, la enfermedad a tratar, el
receptor y la vía de administración. Por ejemplo, en la
administración oral de un compuesto que inhibe la expresión de una
proteína de la presente invención para tratar un cáncer, su dosis es
aproximadamente 0,1 a 100 mg, preferiblemente aproximadamente 1,0 a
50 mg, más preferiblemente aproximadamente 1,0 a 20 mg por día para
un adulto normal (peso: 60 kg). En la administración parenteral, si
bien la dosis del compuesto depende de varios factores tales como
el receptor y la enfermedad a tratar, su dosis es adecuadamente de
aproximadamente 0,01 a 30 mg, preferiblemente aproximadamente 0,1 a
20 mg, más preferiblemente aproximadamente 0,1 a 10 mg por día por
inyección intravenosa cuando un compuesto que inhibe la expresión de
una proteína de la presente invención se administra a un adulto
normal (peso: 60 kg) para tratar un cáncer. Para otro animal, se
puede administrar una cantidad convertida a un peso de 60 kg.
\vskip1.000000\baselineskip
Un anticuerpo de la presente invención puede
reconocer en forma específica a una proteína oncogénica de la
presente invención, de modo que se puede usar para valorar la
proteína oncogénica de la presente invención en una solución de
ensayo, en particular un ensayo por el método de medición de
inmunidad sándwich.
En consecuencia, la presente invención
proporciona:
- (i)
- un proceso para valorar una proteína oncogénica de la presente invención en una solución de ensayo que comprende las etapas de hacer reaccionar competitivamente un anticuerpo de la presente invención con la solución de ensayo y una proteína marcada de la presente invención y determinar posteriormente la proporción de la proteína marcada de la presente invención unida al anticuerpo; y
- (ii)
- un proceso para valorar una proteína oncogénica de la presente invención en una solución de ensayo que comprende las etapas de hacer reaccionar en forma simultánea o sucesiva la solución de ensayo con un anticuerpo de la presente invención insolubilizado en un portador y otro anticuerpo marcado de la presente invención y determinar posteriormente la actividad del agente marcado en el portador insolubiliza- do.
En el ensayo descrito en (ii), es conveniente
que un anticuerpo sea un anticuerpo que reconoce el extremo
N-terminal de una proteína oncogénica de la presente
invención, mientras que el otro anticuerpo sea un anticuerpo que
reacciona con el extremo C-terminal de una proteína
oncogénica de la presente invención.
Un anticuerpo monoclonal contra una proteína
oncogénica de la presente invención se puede usar para analizar o
detectar una proteína oncogénica de la presente invención usando,
por ejemplo, tinción de tejido. Para estos fines, se puede usar la
propia molécula de anticuerpo o, alternativamente, se puede usar una
fracción F(ab')_{2}, Fab' o Fab de la molécula de
anticuerpo.
No existen restricciones particulares para un
procedimiento para valorar una proteína oncogénica de la presente
invención usando un anticuerpo de la presente invención, y puede ser
cualquier procedimiento por el cual se pueda detectar la cantidad
de un anticuerpo, antígeno o complejo
anticuerpo-antígeno correspondiente a la cantidad
de un antígeno (por ejemplo, la cantidad de un péptido) en una
solución medida por medios químicos o físicos y se puede calcular
un valor buscado mediante una curva estándar graficada usando la
solución estándar que contiene una cantidad conocida del antígeno.
Por ejemplo, se usan adecuadamente nefelometría, un ensayo de
competencia, un ensayo inmunorradiométrico y un ensayo sándwich y,
en términos de sensibilidad y especificidad, se prefiere
particularmente un ensayo sándwich.
Los ejemplos de agente marcador usados en un
ensayo mediante tal material de marcación incluyen un radioisótopo,
una enzima, una sustancia fluorescente y un material luminiscente.
Los ejemplos de radioisótopo incluyen [^{125}I], [^{131}I],
[^{3}H] y [^{14}C]. Entre estos, es preferible una enzima
estable que exhiba una gran actividad específica, que incluye
\beta-galactosidasa,
\beta-glucuronidasa, fosfatasa alcalina,
peroxidasa y malato deshidrogenasa. Los ejemplos de sustancia
fluorescente incluyen fluorescamina e isotiocianato de fluoresceína.
Los ejemplos de material luminiscente incluyen luminol, derivados
de luminol, luciferina y lucigenina. Se puede usar un sistema
biotina-avidina para unir un anticuerpo o antígeno
con un agente marcador.
Un antígeno o anticuerpo se puede insolubilizar
usando adsorción física, o usando un enlace químico comúnmente
usado para insolubilizar o inmovilizar un péptido o enzima. Los
ejemplos de portador incluyen polisacáridos insolubles tales como
agarosa, dextrano y celulosa; resinas sintéticas tales como
poliestireno, poliacrilamida y silicones; y
vidrios.
vidrios.
En un ensayo sándwich, un anticuerpo monoclonal
de la presente invención insolubilizado se hace reaccionar con una
solución de ensayo (primera reacción), y posteriormente se hace
reaccionar con otro anticuerpo monoclonal marcado de la presente
invención (segunda reacción). Posteriormente, se puede determinar la
actividad del agente marcador en el portador insolubilizado para
analizar la cantidad de una proteína de la presente invención en la
solución de ensayo. La primera y la segunda reacción se pueden
realizar en orden inverso, en forma simultánea o sucesiva. Un
agente marcador y un método de insolubilización pueden ser los que
se describieron anteriormente. En un método de medición de
inmunidad usando un ensayo sándwich, no es necesario usar sólo un
anticuerpo para una fase sólida o para la marcación, sino que se
puede usar una mezcla de dos o más anticuerpos, por ejemplo, para
mejorar la sensibilidad de la medición.
En la determinación de una proteína oncogénica
de la presente invención con un ensayo sándwich, los anticuerpos
monoclonales de la presente invención usados en la primera y segunda
reacciones son preferiblemente anticuerpos que tienen un sitio
diferente al que se une la proteína oncogénica de la presente
invención. Específicamente, en términos de anticuerpos usados en la
primera y segunda reacciones, cuando el anticuerpo usado en la
segunda reacción reconoce el extremo C-terminal en
la proteína oncogénica de la presente invención, el anticuerpo
usado en la primera reacción es un anticuerpo que reconoce un sitio
diferente del extremo C-terminal, por ejemplo el
extremo N-
terminal.
terminal.
Un anticuerpo monoclonal de la presente
invención puede usar un sistema de medición diferente de un ensayo
sándwich, tal como un ensayo competitivo, inmunometría y
nefelometría.
En un ensayo competitivo, un antígeno en una
solución de ensayo y un antígeno marcado reaccionan competitivamente
con un anticuerpo, el antígeno marcado sin reaccionar (F) se separa
del antígeno marcado unido (B) (separación B/F) y la cantidad
marcada de B o F se determina para analizar la cantidad de antígeno
en la solución de ensayo. Este ensayo de reacción se puede realizar
por un método en fase líquida donde se usa un anticuerpo soluble
como anticuerpo y polietilenglicol y se usa un anticuerpo secundario
contra el anticuerpo anterior en la separación de B/F o,
alternativamente, por un método en fase sólida donde se usa un
anticuerpo inmovilizado como primer anticuerpo o el primer
anticuerpo es soluble y el segundo anticuerpo es un anticuerpo
inmovilizado.
En inmunometría, un antígeno en una solución de
ensayo y un antígeno inmovilizado reaccionan competitivamente con
una cantidad determinada de un anticuerpo marcado, se separan las
fases sólida y líquida o, alternativamente, un antígeno en una
solución de ensayo se hace reaccionar con una cantidad excesiva de
un anticuerpo marcado, se añade un antígeno inmovilizado para
permitir que el anticuerpo marcado sin reaccionar se una a la fase
sólida y posteriormente las fases sólida y líquida se separan. A
continuación, se determina la cantidad de marcador en cada fase
para analizar la cantidad de antígeno en la solución de ensayo.
La nefelometría determina la cantidad de un
precipitado insoluble resultante de una reacción
antígeno-anticuerpo en un gel o solución. Aun
cuando la cantidad de un antígeno en una solución de ensayo es
pequeña de modo que se forma una pequeña cantidad de precipitado,
se usa adecuadamente nefelometría láser que utiliza
dispersión
láser.
láser.
Para aplicar los métodos de medición
inmunológica individuales a un ensayo de la presente descripción, no
son necesarias condiciones u operaciones especiales. Un sistema de
medición para una proteína de la presente invención se puede
construir a la luz de las condiciones y operaciones comunes en los
métodos individuales con modificaciones conocidas para los expertos
en la técnica. Los detalles de estos procedimientos técnicos
comunes se hallarán en varias revisiones y textos.
Tal bibliografía puede ser, por ejemplo,
"Radioimmunoassay", ed. por Hiroshi Irie, Kodansha, publicado
en 1974; "Radioimmunoassay, 2^{nd}", ed. por Hiroshi Irie,
Kodansha, publicado en 1979; "Enzyme Immunoassay", ed. por
Eiji Ishikawa et al., Igaku-Shoin, publicado
en 1978; "Enzyme Immunoassay, 2^{nd} Edition", ed. por Eiji
Ishikawa et al, Igaku-Shoin, publicado en
1982; "Enzyme Immunoassay, 3^{rd} Edition", ed. por Eiji
Ishikawa et al., Igaku-Shoin, publicado en
1987; "Methods in ENZYMOLOGY", Vol.70 (Immunochemical
Techniques (Part A)); ibid., Vol. 73 (Immunochemical
Techniques (Part B)); ibid., Vol.74 (Immunochemical
Techniques (Part C)); ibid., Vol.84 (Immunochemical
Techniques (Part D: Selected Immunoassays)); ibid., Vol.92
(Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and
General Immunoassay Methods)); e ibid, Vol.121
(Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and
Monoclonal Antibodies)) (estos han sido publicados por Academic
Press).
Cuando se detecta reducción del nivel de una
proteína oncogénica de la presente invención analizando el nivel
usando un anticuerpo de la presente invención, por ejemplo, esto
lleva al diagnóstico de que el individuo padece una enfermedad
asociada con insuficiencia de la proteína oncogénica de la presente
invención o probablemente contraerá la enfermedad en el futuro.
\newpage
Cuando se detecta aumento del nivel de una
proteína oncogénica de la presente invención, por ejemplo, esto
lleva al diagnóstico de que el individuo padece una enfermedad
inducida por la sobreexpresión de la proteína oncogénica de la
presente invención, que incluye cánceres tales como cáncer pulmonar,
cáncer renal, carcinoma hepático, cáncer pulmonar de células no
pequeñas, cáncer ovárico, cáncer prostático, cáncer gástrico, cáncer
de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer
rectal y cáncer pancreático (en particular, cáncer cervical), o
probablemente contraerá la enfermedad en el futuro.
Un anticuerpo de la presente invención se puede
usar para detectar una proteína oncogénica de la presente invención
presente en una muestra tal como un fluido corporal y un tejido.
También se puede usar para preparar una columna de anticuerpo usado
para la purificación de una proteína oncogénica de la presente
invención, detección de una proteína de la presente invención en
cada fracción durante la purificación y análisis del comportamiento
de una proteína de la presente invención en una célula de
ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Un polinucleótido o polinucleótido antisentido
de la presente invención también se pueden usar, por ejemplo, como
sonda de ácido nucleico para detectar una anormalidad (defecto de un
gen) en un ADN o ARNm que codifica una proteína oncogénica de la
presente invención principalmente en seres humanos. Por ejemplo, es
útil como agente para diagnóstico de genes para una lesión,
mutación o reducción de la expresión del ADN o el ARNm o la
sobreexpresión del ARNm.
El anterior diagnóstico de genes usando un
polinucleótido o polinucleótido antisentido de la presente invención
se puede realizar de acuerdo, por ejemplo, con hibridación Northern
conocida o PCR-SSCP (Véase, Genomics, Vol.5,
pp.874-879 (1989); Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86,
pp.2766-2770 (1989)).
Por ejemplo, cuando se detecta reducción de la
expresión de un ARNm por hibridación Northern, esto lleva al
diagnóstico de que el individuo padece una enfermedad asociada con
la insuficiencia de una proteína oncogénica de la presente
invención o que probablemente contraerá la enfermedad en el
futuro.
Cuando se detecta sobreexpresión de un ARNm por
hibridación Northern, por ejemplo, esto lleva al diagnóstico de que
el sujeto probablemente padezca una enfermedad inducida por la
sobreexpresión de la proteína oncogénica de la presente invención,
que incluye cánceres tales como cáncer pulmonar, cáncer renal,
carcinoma hepático, cáncer pulmonar de células no pequeñas, cáncer
ovárico, cáncer prostático, cáncer gástrico, cáncer de vejiga,
cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer rectal y
cáncer pancreático (en particular, cáncer cervical), o que
probablemente contraerá la enfermedad en el futuro.
\vskip1.000000\baselineskip
Un polinucleótido antisentido de la presente
invención que se une en forma complementaria a un polinucleótido de
la presente invención (por ejemplo, ADN) y puede inhibir la
expresión del polinucleótido (por ejemplo, ADN) es menos tóxico y
puede inhibir la actividad in vivo de la proteína de la
presente invención o el polinucleótido de la presente invención
(por ejemplo, ADN). En consecuencia, es útil como agente
profiláctico o terapéutico para una enfermedad inducida por la
sobreexpresión de la proteína de la presente invención, por ejemplo
un cáncer tal como cáncer pulmonar, cáncer renal, carcinoma
hepático, cáncer pulmonar de células no pequeñas, cáncer ovárico,
cáncer prostático, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de
mama, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer rectal y cáncer
pancreático.
Cuando se usa el polinucleótido antisentido como
el anterior agente profiláctico o terapéutico, el polinucleótido
antisentido se puede formular como se describió el anterior
polinucleótido de la presente invención.
La formulación así obtenida es menos tóxica y se
puede administrar por vía oral o parenteral a un ser humano o
mamífero (por ejemplo, rata, conejo, oveja, cerdo, vacuno, gato,
perro y mono).
El polinucleótido antisentido se puede
administrar como tal o en combinación con un portador
fisiológicamente aceptable tal como un adyuvante para promover la
ingesta, usando una pistola génica o un catéter tal como un catéter
de hidrogel.
La dosis del polinucleótido antisentido varía de
acuerdo con muchos factores tales como la enfermedad por tratar, el
receptor y la vía de administración y es, por ejemplo,
aproximadamente 0,1 a 100 mg por día a un adulto (peso: 60 kg)
cuando se administra un antisentido nucleótido de la presente
invención en forma local a un órgano (por ejemplo, hígado, pulmón,
corazón y riñón) para tratar un cáncer.
Por otra parte, el polinucleótido antisentido se
puede usar como sonda nucleotídica de diagnóstico para determinar
la presencia de un ADN del oncogén de la presente invención en un
tejido o célula o su estado de expresión.
La presente descripción también proporciona:
- (i)
- un ARN bicatenario que comprende una parte de un ARN que codifica una proteína de la presente invención o un ARN complementario a la misma;
- (ii)
- un fármaco que comprende el ARN bicatenario; cuando sea apropiado,
- (iii)
- una ribozima que comprende una parte de un ARN que codifica una proteína de la presente invención; y
- (iv)
- un fármaco que comprende la ribozima.
Este ARN bicatenario (ARNi; método de ARN de
interferencia) y la ribozima pueden inhibir la expresión de un
polinucleótido (por ejemplo, ADN) de la presente invención como en
el anterior polinucleótido antisentido y pueden inhibir in
vivo las actividades de una proteína oncogénica o polinucleótido
(por ejemplo, ADN) de la presente invención. En consecuencia, es
útil como agente profiláctico o terapéutico para una enfermedad
inducida por la sobreexpresión de la proteína oncogénica de la
presente invención, por ejemplo un cáncer tal como cáncer pulmonar,
cáncer renal, carcinoma hepático, cáncer pulmonar de células no
pequeñas, cáncer ovárico, cáncer prostático, cáncer gástrico,
cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de colon,
cáncer rectal y cáncer pancreático, en particular cáncer
cervical.
El ARN bicatenario se puede diseñar y producir
sobre la base de la secuencia del polinucleótido de la presente
invención de acuerdo con un método conocido (Véase, por ejemplo,
Nature, Vol. 411, p.494, 2001).
La ribozima se puede diseñar y producir sobre la
base del polinucleótido de la presente invención de acuerdo con un
método conocido (Véase, por ejemplo, TRENDS in Molecular Medicine,
Vol. 7, p.221, 2001). Por ejemplo, se puede producir ligando una
ribozima conocida a una parte de un ARN que codifica una proteína de
la presente invención. Un ejemplo de la parte de un ARN que
codifica una proteína de la presente invención es una parte
(fragmento de ARN) cercana a un sitio de restricción sobre el ARN de
la presente invención que puede ser digerido por una ribozima
conocida.
Cuando se usan el ARN bicatenario o la ribozima
como el anterior agente profiláctico o terapéutico, se pueden
formular y administrar como se describió para el polinucleótido
antisentido.
\vskip1.000000\baselineskip
Un anticuerpo de la presente invención capaz de
neutralizar la actividad de formación de cáncer de un proteína
oncogénica de la presente invención se puede usar como droga
profiláctica o terapéutica para una enfermedad inducida por la
sobreexpresión de la proteína oncogénica de la presente invención,
por ejemplo un cáncer tal como cáncer pulmonar, cáncer renal,
carcinoma hepático, cáncer pulmonar de células no pequeñas, cáncer
ovárico, cáncer prostático, cáncer gástrico, cáncer de vejiga,
cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer rectal y
cáncer pancreático, en particular cáncer cervical.
La anterior droga profiláctica o terapéutica
para la enfermedad que comprende el anticuerpo de la presente
invención se puede administrar por vía oral o parenteral a un ser
humano o mamífero (por ejemplo, rata, conejo, oveja, cerdo, ganado
vacuno, gato, perro y mono) como tal, es decir, en forma de solución
o como forma de dosificación apropiada de una composición
farmacéutica. La dosis puede variar dependiendo de varios factores
tales como el receptor, la enfermedad por tratar, un síntoma y la
vía de administración, y puede ser, por ejemplo, generalmente 0,01
a 20 mg/kg, preferiblemente 0,1 a 10 mg/kg, más preferiblemente 0,1
a 5 mg/kg del anticuerpo de la presente invención para una dosis,
aproximadamente una a cinco veces al día, preferiblemente una a
tres veces al día. Se puede administrar de modo adecuado por
inyección intravenosa. En otro tipo de administración parenteral u
oral, se puede emplear una dosis similar a la que se describió
anteriormente. Si un síntoma es en particular grave, se puede
aumentar adicionalmente la dosis, dependiendo del síntoma.
Un anticuerpo de la presente invención se puede
administrar como tal o como composición farmacéutica apropiada. Una
composición farmacéutica usada para la anterior administración
comprende el anterior anticuerpo o su sal y un portador, diluyente
o excipiente farmacológicamente aceptable. Dicha composición se
proporciona como forma de dosificación apropiada para la
administración oral o parenteral.
Específicamente, los ejemplos de composición
para administración oral incluyen formas de dosificación sólidas y
líquidas que incluyen comprimido, tal como comprimido recubierto con
azúcar y comprimido recubierto con película), píldora, gránulo,
polvo, cápsula tal como cápsula blanda, jarabe, emulsión y
suspensión. Tal composición se prepara mediante un proceso conocido
y comprende un portador, diluyente o excipiente comúnmente usado en
la técnica farmacéutica. Los ejemplos de portador o excipiente para
comprimidos incluyen lactosa, almidón, sacarosa y estearato de
magnesio.
Los ejemplos de composición para administración
parenteral incluyen una inyección y un supositorio. Los ejemplos de
inyección incluyen inyección intravenosa, inyección subcutánea,
inyección intracutánea, inyección intramuscular e inyección por
goteo. Tal inyección se puede preparar por un método conocido; por
ejemplo, por disolución, suspensión o emulsión del anticuerpo
anterior o su sal en un líquido acuso u oleoso estéril comúnmente
usado para inyección. Los ejemplos de líquido acuoso para inyección
incluyen una solución salina e isotónica que contiene glucosa u
otros adyuvantes, que se puede combinar con un agente de
solubilización apropiado que incluye alcoholes tales como etanol;
polioles tales como propilenglicol y polietilenglicol; tensioactivos
no iónicos tales como polisorbato 80 y aducto de
HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 moles) de
aceite de ricino hidrogenado). Los ejemplos de líquido oleoso
incluyen aceite de sésamo y aceite de soja, que se puede combinar
con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo y alcohol
bencílico. Una inyección preparada de este modo se llena
generalmente en una ampolla apropiada. Se prepara un supositorio
usado para la administración rectal mezclando el anticuerpo
anterior o su sal con una base para supositorio común.
La composición farmacéutica oral o parenteral se
prepara convenientemente en una forma de dosificación adecuada para
una dosis de ingrediente activo. Los ejemplos de tales formas de
dosificación incluyen comprimido, píldora, cápsula, inyección
(ampolla) y supositorio. Cada forma de dosificación unitaria
preferiblemente contiene generalmente 5 a 500 mg del anticuerpo
anterior. En particular, una inyección contiene 5 a 100 mg, mientras
que otra forma de dosificación contiene 10 a 250 mg.
Cada una de las anteriores composiciones puede
contener otros ingredientes activos siempre que estos no produzcan
una interacción no deseable cuando se formulan con el
anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona un mamífero no
humano, por ejemplo un animal "knock-in", que
tiene un ADN que codifica una proteína oncogénica derivada de seres
humanos de la presente invención (de aquí en adelante, denominado
"un ADN del oncogén de la presente invención") o su variante de
ADN.
Específicamente, la presente invención
proporciona:
- (1)
- un mamífero no humano que tiene un ADN del oncogén derivado de seres humanos de la presente invención o su variante de ADN (animal "knock-in");
- (2)
- el animal "knock-in" en el que el mamífero no humano es un roedor;
- (3)
- el ratón o rata "knock-in" en el que el roedor es ratón o rata; y
- (4)
- un vector recombinante que comprende el ADN del oncogén derivado de seres humanos de la presente invención o su variante de ADN que se puede expresar en el mamífero no humano.
Un mamífero no humano que tiene un ADN del
oncogén derivado de seres humanos de la presente invención se puede
producir transfiriendo un ADN deseado a un huevo no fertilizado, a
un huevo fertilizado, a un espermatozoide o una célula germinal que
incluye sus células iniciales, preferiblemente en una etapa de
embriogénesis en el desarrollo del mamífero no humano (también
preferiblemente, en una etapa de una sola célula o célula huevo
fertilizada y generalmente hasta la fase de 8 células) por un método
apropiado tal como un método de fosfato de calcio, un método de
pulso eléctrico, lipofección, agregación, microinyección, un método
de pistola de partículas y un DEAE-dextrano. Por el
método de transferencia de ADN, se puede transferir un ADN extraño
deseado de la presente invención a una célula somática, célula de
órgano o tejido vivo para usarlo en cultivo celular o cultivo de
tejido. Por otra parte, la célula se puede fusionar con la anterior
célula germinal por un proceso de fusión celular conocido para
producir un animal con ADN transferido de la presente invención.
Los ejemplos de mamífero no humano incluyen
ganado vacuno, cerdo, oveja, cabra, conejo, perro, gato, cobayo,
hámster, ratón y rata. Entre estos, se prefiere un roedor, en
particular un ratón (por ejemplo, una línea pura tal como una cepa
C57BL/6 y una cepa DBA2 y una línea híbrida tal como una cepa
B6C3F_{1}, una cepa BDF_{1}, una cepa B6D2F_{1}, una cepa
BALB/c y una cepa ICR) o rata (por ejemplo, Wistar y SD) porque su
ontogénesis y ciclos biológicos son relativamente más cortos a la
luz de producir un modelo de animal de enfermedad y se pueden criar
fácil-
mente.
mente.
Un "mamífero" en términos de un vector
recombinante que se puede expresar en un mamífero puede ser, además
del anterior mamífero no humano, un ser humano.
Una variante de ADN para un oncogén derivado de
seres humanos no se refiere a un ADN de un homólogo de un oncogén
de la presente invención inherente a un mamífero no humano, sino a
uno mutado artificialmente.
Una variante de ADN puede ser un ADN de oncogén
derivado de seres humanos de la presente invención cuya secuencia
de nucleótidos original ha variado (por ejemplo, mutación) tal como
un ADN que tiene la adición de una base, supresión o sustitución
con otra base o un ADN anormal.
\newpage
Un ADN anormal se refiere a un ADN que expresa
una proteína que es similar a una proteína oncogénica normal de la
presente invención pero tiene una actividad diferente; por ejemplo,
un ADN que expresa un péptido en el que se inhibe la actividad de
una proteína oncogénica normal de la presente invención.
Para transferir un ADN de oncogén de la presente
invención a un animal no humano blanco, en general es ventajoso
usar el ADN como construcción de ADN unido corriente abajo de un
promotor capaz de expresar el ADN en la célula del animal no
humano. Por ejemplo, cuando se transfiere un ADN derivado de seres
humanos de la presente invención, se puede microinyectar una
construcción de ADN (por ejemplo, un vector) al que se ha unido un
ADN del oncogén derivado de seres humanos de la presente invención
a un huevo fertilizado de un mamífero no humano blanco, por ejemplo
un huevo fertilizado murino, corriente abajo de cualquiera de los
diversos promotores capaces de expresar un ADN derivado de
cualquiera de los diversos mamíferos no humanos que exhiben mayor
homología con el ADN de la presente invención (por ejemplo, conejo,
perro, gato, cobayo, hámster, rata y ratón), para producir un
mamífero no humano con ADN transferido capaz de expresar fuertemente
el ADN del oncogén de la presente
invención.
invención.
Los ejemplos de vector de expresión para una
proteína oncogénica de la presente invención incluyen un plásmido
derivado de E. coli, un plásmido derivado de Bacillus
subtilis, un plásmido derivado de levadura, un bacteriófago tal
como el fago \lambda, un retrovirus tal como el virus de leucemia
Moloney y un virus de mamífero tal como un virus de vaccinia y un
baculovirus, preferiblemente un plásmido derivado de E. coli,
un plásmido derivado de Bacillus subtilis y un plásmido
derivado de levadura.
Los ejemplos de un promotor para regular la
expresión del ADN incluyen:
- (i)
- promotores para un ADN derivado de un virus (por ejemplo, virus de simio, citomegalovirus, virus de leucemia Moloney, virus JC, virus del tumor mamario y poliovirus);
- (ii)
- promotores derivados de diversos mamíferos (por ejemplo, ser humano, conejo, perro, gato, cobayo, hámster, rata y ratón); por ejemplo, un promotor para albúmina, insulina II, uroplaquina II, elastasa, eritropoyetina, endotelina, creatina quinasa muscular, proteína ácida fibrilar glial, glutatión S-transferasa, factor de crecimiento derivado de plaquetas \beta, queratina K1, K10 y K14, colágenos tipo I y II, subunidad \beta1 de proteína quinasa dependiente de AMP cíclico, distrofina, fosfatasa alcalina resistente al tartrato, factor diurético de sodio atrial, receptor endotelial de tirosina quinasa (generalmente, abreviada "Tie2"), sodio y potasio adenosina trifosfatasa (Na, K-ATPasa), cadena liviana de neurofilamento, metalotionina I y IIA, inhibidor tisular de metaloproteinasa-1, antígeno MHC Clase I (H-2L), H-ras, renina, dopamina-\beta-hidroxilasa, peroxidasa tiroidea (TPO), factor de elongación de cadena de péptido 1\alpha (EF-1\alpha), (\beta-actina, cadena pesada de \alpha- y \beta-miosina, cadena liviana de miosina 1 y 2, proteína base de mielina, tiroglobulina, Thy-1, inmunoglobulina, parte de la cadena H variable (VNP), componente P amiloide sérico, mioglobina, troponina C, actina \alpha de músculo liso, preproencefalina A y vasopresina. Entre estos, se prefiere un promotor de citomegalovirus, un promotor del factor de elongación de la cadena de péptido 1\alpha (EF-1\alpha), promotores de \beta-actina humana y de aves capaces de una mayor expresión en un cuerpo completo.
El vector mencionado preferiblemente comprende
una secuencia que termina la transcripción de un ARN mensajero
deseado en un mamífero no humano con ADN transferido (generalmente
llamado "terminador"). Por ejemplo, se pueden usar secuencias
de ADN derivadas de bovinos o de diversos mamíferos, preferiblemente
un terminador del virus de simio SV40.
Por otra parte, si se desea, puede ser posible
ligar una señal de empalme para cada ADN, una región potenciadora o
una parte de un intrón de ADN eucariota en 5' corriente arriba de la
región promotora, entre la región promotora y una región de
traducción, o en 3' corriente abajo de la región de traducción para
una mayor expresión de un ADN del oncogén deseado.
Una región de traducción de una proteína
oncogénica normal de la presente invención se puede obtener usando,
como material de partida, un ADN complementario preparado como un
ADN del genoma total o parcial de, célula de hígado, riñón o
glándula tiroidea derivada de humanos, un ADN derivado de
fibroblasto y diversas bibliotecas de ADN genómicos disponibles en
el comercio, o por un proceso conocido a partir de un ARN derivado
de célula de hígado, célula de riñón, célula de glándula tiroidea o
fibroblasto. Para producir un ADN anormal inducido por mutación,
una región de traducción del péptido normal obtenido de la célula
anterior o el tejido se puede mutar por el método de inducción de
mutación puntual para producir una región de traducción mutante.
La región de traducción se puede producir como
construcción de ADN que se puede expresar en un animal con ADN
transferido, por un procedimiento de manipulación genética de un ADN
común en el que este se liga corriente abajo del promotor o, si se
desea, corriente arriba de un sitio de terminación de
transcripción.
La transferencia de un ADN del oncogén derivado
de humanos de la presente invención a una célula de huevo
fertilizado se realiza de modo que el ADN es portado por todas las
células germinales y somáticas de un mamífero no humano blanco. La
presencia del ADN del oncogén de la presente invención en las
células germinales en un animal producido después de la
transferencia del ADN significa que todas las progenies del animal
producido portarán el ADN del oncogén de la presente invención en
todas sus células germinales y somáticas. La descendencia de este
tipo de animal que hereda el ADN del oncogén de la presente
invención porta el ADN del oncogén de la presente invención en
todas sus células germinales y somáticas.
Un mamífero no humano al que se ha transferido
un ADN del oncogén derivado de humanos de la presente invención se
puede cruzar sucesivamente en circunstancias de reproducción comunes
como un mamífero que porta el ADN del oncogén, después de confirmar
que el mamífero porta en forma estable el ADN del oncogén derivado
de humanos después del apareamiento.
La transferencia de un ADN del oncogén derivado
de humanos de la presente invención en un estadio de célula de
huevo fertilizado se realiza de modo que el ADN es portado en todas
las células germinales y somáticas en un mamífero no humano blanco.
La presencia del ADN del oncogén derivado de humanos de la presente
invención en las células germinales en un mamífero producido
después de la transferencia de ADN significa que todas las crías
del mamífero producido portarán sucesivamente el ADN del oncogén
derivado de humanos de la presente invención en todas sus células
germinales y somáticas. La descendencia de este tipo de animal que
hereda el ADN del oncogén derivado de humanos de la presente
invención porta sucesivamente el ADN del oncogén derivado de
humanos de la presente invención en todas sus células germinales y
somáticas.
Un animal homocigota que tiene ADN transducido
en ambos cromosomas homólogos se puede producir y los animales
macho y hembra se pueden aparear para la reproducción sucesiva de
modo que todas las crías porten sucesivamente el ADN.
En un mamífero no humano que tiene un ADN del
oncogén derivado de humanos de la presente invención, el ADN normal
de la presente invención está altamente expresado y se puede
promover una actividad del ADN normal intrínseco, produciéndose
algunas veces el comienzo de hiperactividad de la proteína de la
presente invención. En consecuencia, se puede usar como animal
modelo para enfermedad. Por ejemplo, un ADN normal transferido al
animal de la presente invención se puede usar para dilucidar un
mecanismo de hiperactividad de la proteína oncogénica de la
presente invención o de una enfermedad asociada con la proteína
oncogénica de la presente invención e investigar una terapia para
estas enfermedades.
Por otra parte, debido a que un mamífero no
humano al que se ha transferido un ADN del oncogén derivado de
humanos de la presente invención muestra un incremento de la
proteína libre de la presente invención, se puede usar para
seleccionar un agente terapéutico contra una enfermedad asociada con
la proteína oncogénica de la presente invención.
Por su parte, un mamífero no humano que tiene un
ADN anormal de la presente invención se puede cruzar sucesivamente
en circunstancias de cruza comunes como animal portador del ADN,
después de confirmar que el animal porta en forma estable el ADN
transducido después del apareamiento. Además, se puede incorporar un
ADN anormal deseado en el plásmido mencionado usado como material
de partida. Se puede producir una construcción de ADN por un
procedimiento de manipulación genética de ADN común. La
transferencia de un ADN anormal de la presente invención en un
estadío de célula de huevo fertilizado se realiza de modo que el ADN
es portado en todas las células germinales y somáticas en un
mamífero blanco. La presencia del ADN anormal de la presente
invención en las células germinales en un animal producido después
de la transferencia de ADN significa que todas las crías del animal
producido portarán el ADN anormal de la presente invención en todas
sus células germinales y somáticas. Las crías de este tipo de
animal que hereda el ADN anormal de la presente invención portan el
ADN anormal de la presente invención en todas sus células
germinales y somáticas. Se pueden producir un animal homocigota que
tiene un ADN transducido en los cromosomas homólogos y los animales
macho y hembra se pueden aparear para la reproducción sucesiva de
modo que todas las crías porten sucesivamente el ADN.
En un mamífero no humano que tiene un ADN
anormal de la presente invención, el ADN anormal está altamente
expresado, y se puede inhibir una actividad del ADN normal
intrínseco, lo que algunas veces produce una refractariedad tipo
desactivación de la proteína de la presente invención. En
consecuencia, se puede usar como animal modelo para la enfermedad.
Por ejemplo, se puede usar un animal con ADN anormal transferido de
la presente invención para dilucidar un mecanismo de la
refractariedad tipo desactivación de la proteína oncogénica de la
presente invención e investigar una terapia para la enfermedad.
Como aplicación específica, un animal que
expresa altamente el ADN anormal de la presente invención se puede
usar como modelo para dilucidar la inhibición de una actividad
normal del péptido (actividad negativa dominante) por el péptido
anormal de la presente invención en la refractariedad tipo
desactivación de la proteína de la presente invención.
Por otra parte, debido a que un mamífero no
humano al que se ha transferido un ADN anormal de la presente
invención muestra un incremento de la proteína oncogénica libre de
la presente invención, se puede usar para identificar un agente
terapéutico para la proteína oncogénica o su refractariedad tipo
desactivación.
Un animal con ADN transferido de la presente
invención se puede usar para investigar un síntoma clínico de una
enfermedad asociada con una proteína oncogénica de la presente
invención tal como refractariedad tipo desactivación de la proteína
de la presente invención. Por otra parte, el animal puede dar una
observación más patológica en cada órgano en un modelo de
enfermedad asociado con la proteína oncogénica de la presente
invención y puede contribuir al desarrollo de una nueva terapia e
investigación y tratamiento de una enfermedad secundaria debida a
la enfermedad anterior.
Cada órgano se puede extraer de un animal con
ADN transferido de la presente invención, se puede cortar y tratar
con una proteasa tal como tripsina para obtener una célula con ADN
transferido libre. La célula posteriormente se puede cultivar y la
célula cultivada se puede someter a un estudio de linaje. Por otra
parte, se puede usar para identificar una célula productora de la
proteína oncogénica de la presente invención e investigar la
asociación con la apoptosis, diferenciación o crecimiento o un
mecanismo de transferencia de señales en ella y anormalidad en
ellas. En consecuencia, puede ser un tema de investigación efectivo
para dilucidar la proteína oncogénica de la presente invención y su
actividad.
Por otra parte, a fin de desarrollar un agente
terapéutico para una enfermedad asociada con una proteína oncogénica
de la presente invención tal como una refractariedad tipo
desactivación de la proteína de la presente invención, un animal
con ADN transferido de la presente invención se puede usar para
proporcionar un método efectivo y veloz de detección para el agente
terapéutico usando los procesos de análisis y ensayo
mencionados.
Una célula madre germinal de mamífero no humano
en la que un ADN génico homólogo de un oncogén de la presente
invención está inactivado, es muy útil para producir un modelo de
mamífero no humano que expresa insuficientemente el ADN del oncogén
de la presente invención. Un mamífero no humano que expresa
insuficientemente un ADN génico homólogo del oncogén de la presente
invención no tiene varias actividades biológicas que puedan ser
inducidas con la proteína oncogénica de la presente invención. En
consecuencia, se puede usar como modelo para una enfermedad causada
por la inactivación de las actividades biológicas de la proteína
oncogénica de la presente invención. De este modo, puede ser útil
para dilucidar la causa de la enfermedad e investigar una terapia
para la
misma.
misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Un mamífero no humano que expresa
insuficientemente un ADN de la presente invención se puede usar para
detectar un compuesto terapéutico o profiláctico para una
enfermedad causada por la supresión o daño en un ADN de la presente
invención.
En consecuencia, la presente invención
proporciona un método para detectar un compuesto terapéutico o
profiláctico o su sal para una enfermedad causada por la supresión
o daño en un ADN de la presente invención, que comprende las etapas
de administrar un compuesto de ensayo a un mamífero no humano que
expresa insuficientemente el ADN de la presente invención y
posteriormente observar y/o determinar cambios en el animal.
Un mamífero no humano que expresa
insuficientemente el ADN de la presente invención usado en el
proceso de detección puede ser como se describió anteriormente.
Los ejemplos de un compuesto de ensayo incluyen
un péptido, una proteína, un compuesto no peptídico, un compuesto
sintético, un producto de fermentación, un extracto celular, un
extracto de planta, un extracto de tejido animal y plasma, que
puede ser un compuesto nuevo o conocido.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente descripción proporciona un método
para detectar un compuesto o su sal que promueve o inhibe una
actividad promotora a un ADN del oncogén de la presente invención,
que comprende las etapas de administrar un compuesto de ensayo a un
mamífero no humano que expresa insuficientemente el ADN de la
presente invención y posteriormente detectar la expresión de un gen
indicador.
En el método de detección, un mamífero no humano
que expresa insuficientemente el ADN de la presente invención puede
ser, entre los mamíferos no humanos que expresan insuficientemente
el ADN de la presente invención, un animal en el que el ADN de la
presente invención está inactivado por la transducción de un gen
indicador y el gen indicador se puede expresar bajo el control de
un promotor para el ADN de la presente invención.
Los ejemplos de compuesto de ensayo incluyen un
péptido, una proteína, un compuesto no peptídico, un compuesto
sintético, un producto de fermentación, un extracto celular, un
extracto de planta, un extracto de tejido animal y plasma, que
puede ser un compuesto nuevo o conocido.
Un gen indicador que se puede usar puede ser
como el descrito anteriormente; resultan convenientes el gen de la
\beta-galactosidasa (lacZ), el gen de la fosfatasa
alcalina soluble y el gen de la luciferasa.
\newpage
En el mamífero no humano que expresa
insuficientemente el ADN de la presente invención en que el ADN del
oncogén de la presente invención se reemplaza con el gen indicador,
el gen indicador existe bajo el control del promotor para el ADN de
la presente invención, de modo que se puede rastrear una sustancia
codificada por el gen indicador para detectar una actividad del
promotor.
Por ejemplo, cuando una parte de un dominio de
ADN que codifica una proteína oncogénica de la presente invención
está sustituida con el gen de \beta-galactosidasa
(lacZ) derivado de E. coli, la
\beta-galactosidasa se expresa en lugar de la
proteína oncogénica de la presente invención en un tejido en que la
proteína oncogénica de la presente invención se expresa en forma
natural. Así, por ejemplo, por tinción con un reactivo que es
sustrato para la \beta-galactosidasa, tal como
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-galactopiranósido
(X-gal), se puede observar convenientemente un
estado de expresión de la proteína oncogénica de la presente
invención en un animal vivo. Específicamente, un ratón deficitario
en una proteína homóloga de una proteína oncogénica de la presente
invención o su sección de tejido se fija, por ejemplo, con
glutaraldehído, se lava con solución salina tamponada con fosfato
(PBS) y se hace reaccionar con una solución de colorante que
contiene X-gal a temperatura ambiente o
aproximadamente 37ºC durante aproximadamente 30 min a 1 hora. La
preparación de tejido así obtenida se lava con solución 1 mM de
EDTA/PBS para inactivar la reacción de la
\beta-galactosidasa y posteriormente se puede
observar un color. Alternativamente, un ARNm que codifica lacZ se
puede detectar de manera usual.
Un compuesto o su sal obtenida usando el método
de detección anterior se selecciona de los anteriores compuestos de
ensayo, que pueden promover o inhibir una actividad promotora para
un ADN del oncogén de la presente
invención.
invención.
El compuesto seleccionado por el anterior método
de detección puede formar una sal, que puede ser una sal con un
ácido (por ejemplo, un ácido inorgánico) o base (por ejemplo, una
base orgánica) fisiológicamente aceptable, preferiblemente una sal
de adición de ácido. Los ejemplos de tal sal incluyen sales con un
ácido inorgánico tal como ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido
bromhídrico y ácido sulfúrico, o con un ácido orgánico tal como
ácido acético, ácido fórmico, ácido propiónico, ácido fumárico,
ácido maleico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido cítrico,
ácido málico, ácido oxálico, ácido benzoico, ácido metansulfónico y
ácido bencensulfónico.
Debido a que un compuesto o su sal que promueve
una actividad promotora para un ADN del oncogén de la presente
invención promueve la actividad del péptido, es útil como, por
ejemplo, droga medicinal tal como un agente profiláctico y agente
terapéutico para una enfermedad asociada con insuficiencia de una
proteína oncogénica de la presente invención.
Por otra parte, un compuesto o su sal que inhibe
una actividad promotora de un ADN que codifica una proteína
oncogénica de la presente invención es útil como droga medicinal
segura y de baja toxicidad que inhibe la actividad inductora del
cáncer de la proteína oncogénica de la presente invención, por
ejemplo un agente profiláctico o terapéutico para un cáncer tal
como cáncer pulmonar, cáncer renal, carcinoma hepático, cáncer
pulmonar de células no pequeñas, cáncer ovárico, cáncer prostático,
cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical,
cáncer de colon, cáncer rectal y cáncer pancreático.
También se puede usar un derivado del compuesto
seleccionado por el análisis anterior.
Un fármaco que comprende el compuesto o su sal
seleccionado por el método de detección se puede preparar en una
forma de dosificación adecuada para la administración a un tejido
canceroso blanco como en un fármaco que comprende un fármaco
anticáncer conocido para un cáncer dado.
Debido a que la formulación así preparada es
segura y de baja toxicidad, se puede administrar a un ser humano
como sujeto principal o a un mamífero en el que se esperaría un
efecto farmacológico similar (por ejemplo rata, ratón, cobayo,
conejo, oveja, cerdo, bovino, caballo, gato, perro y mono).
Una dosis del compuesto o su sal depende de
varios factores tales como la enfermedad por tratar, el receptor y
la vía de administración. Por ejemplo, en la administración oral de
un compuesto que inhibe una actividad promotora para un ADN de la
presente invención para tratar un cáncer, su dosis es
aproximadamente 0,1 a 100 mg, preferiblemente aproximadamente 1,0 a
50 mg, más preferiblemente aproximadamente 1,0 a 20 mg por día a un
paciente adulto normal (peso: 60 kg). En la administración
parenteral, si bien una dosis del compuesto depende de varios
factores tales como el receptor y la enfermedad por tratar, su dosis
es en forma adecuada aproximadamente 0,01 a 30 mg, preferiblemente
aproximadamente 0,1 a 20 mg, más preferiblemente aproximadamente
0,1 a 10 mg por día por inyección intravenosa cuando un compuesto
que inhibe una actividad promotora para un ADN de la presente
invención se administra a un paciente adulto normal (peso: 60 kg)
para tratar un cáncer. Para otro animal, se puede administrar una
cantidad convertida a un peso de 60 kg.
En consecuencia, un mamífero no humano que
expresa insuficientemente un ADN del oncogén de la presente
invención es considerablemente útil para detectar un compuesto o su
sal que promueve o inhibe una actividad promotora para el ADN del
oncogén de la presente invención y, por ende, puede contribuir
significativamente a dilucidar las causas de una variedad de
enfermedades debidas a la expresión insuficiente del ADN del oncogén
de la presente invención y desarrollar agentes profilácticos o
terapéuticos para las enfermedades.
Además, usando un ADN que contiene una región
promotora para una proteína oncogénica de la presente invención, un
gen que codifica una proteína dada se puede ligar a un sitio
corriente abajo, y el producto se puede inyectar en una célula
huevo animal para producir un llamado animal transgénico (un animal
introgresivo), de modo que un mecanismo causa en forma específica
la expresión in vivo del oncogén a la vez que se evita la
formación de cáncer. Por otra parte, un gen indicador apropiado se
puede ligar a la región promotora para establecer una cepa de
célula transformante que expresa el gen, que se puede usar como
sistema de búsqueda in vitro para un compuesto de bajo peso
molecular que promueve o inhibe específicamente la capacidad de
producción in vivo de la proteína oncogénica de la presente
invención por sí misma.
Cuando se usa para la prevención o tratamiento
de un cáncer, un compuesto o su sal que regula la actividad de una
proteína oncogénica de la presente invención se puede combinar con
otro agente anticáncer tal como ifosfamida, UTF, adriamicina,
peplomicina, cisplatino, ciclofosfamida, 5-FU, UFT,
metotrexato, mitomicina C y mitoxantrona.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se describirá más
específicamente con referencia a Ejemplos. Estos ejemplos se
incluyen en realizaciones más preferidas de la presente invención,
pero la presente invención no está limitada a estas
realizaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se realizó PCR usando una biblioteca de ADNc
disponible en el comercio, un kit de ADNc testicular humano
(Marathon-Ready^{TM} ADNc Kit; Clontech Inc.)
como molde y usando dos cebadores:
el cebador 1 (secuencia:
TTGGATCCATGACATCCAGATTTGGGAAAACATACAGTAGG); y el cebador 2
(secuencia: TTGAATTCCTAGCAATGTTCCAAATATTCAATCACTCTAGA). En la
reacción de PCR, se usó un kit de mezcla de polimerasa Advantage 2
(Clontech Inc) y de acuerdo con las instrucciones del kit, la
amplificación se realizó con un ciclo de temperatura:
- (1)
- 94ºC durante 1 min;
- (2)
- 5 ciclos de 94ºC durante 10 seg y 72ºC durante 2 min; y
- (3)
- 25 ciclos de 96ºC durante 10 seg y 70ºC durante 2 min, y posteriormente seguido por la reacción de elongación realizada a 72ºC durante 5 min. Después de la reacción, el producto de amplificación por PCR obtenido de este modo se clonó a un vector plásmido pGEM-T easy (PROMEGA) de acuerdo con las instrucciones para pGEM-T easy (PROMEGA). Este se transdujo a E. coli DH5 \alpha (Invitrogen) y usando un gen de resistencia a ampicilina en el vector plásmido pGEM-T easy, se seleccionaron los clones portadores del plásmido en un medio de agar LB que contenía ampicilina.
El plásmido portado por cada uno de los clones
seleccionado se secuenció para obtener la secuencia del nuevo ADNc
(SEQ. ID: No.2) clonado en el mismo. Una nueva proteína que
comprendía una secuencia de aminoácidos (SEQ. ID. No.1) deducida de
un ORF de la secuencia de nucleótidos del ADNc se designó WAPL
humana (hWAPL). Un transformante portador del ADNc de longitud
completa de la hWAPL, que se clonó en el plásmido, se designó
pGEMhWAPL de Escherichia coli DH5.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se suministraron muestras de tejidos cancerosos
extirpados quirúrgicamente con el consentimiento de los pacientes
sometidos a extirpación quirúrgica de tejido canceroso en el Tokyo
Medical College Hospital. Las muestras de tejidos cancerosos
extirpados quirúrgicamente se examinaron para determinar la
presencia de expresión del gen de hWAPL y la cantidad de expresión
del mismo por transferencia Northern y PCR en tiempo real.
En la transferencia Northern, se identificó un
ARNm expresado del gen de hWAPL a partir de los ARN totales
preparados, usando un ADN que tenía una secuencia de nucleótidos
complementaria a la porción de ácido nucleico Nos. 2511 a 2813 en
la secuencia de longitud completa de la hWAPL de la SEQ ID. No. 2,
como sonda de detección. Por otra parte, en la PCR de tiempo real,
se amplificó un ADNc de la hWAPL, usando un kit de amplificación
SYBR Green I (TaKaRa Co. Ltd.) y como cebadores de PCR, un par de
cebadores:
- 5'-GAATTCATAGGCACAGCGCTGAACTGTGTG-3' y
- 5'-TTGAATTCCTAGCAATGTTCCAAATATTCA-3'.
Por otra parte, se usó
\beta-actina como estándar intrínseco. Los
cebadores de PCR usados para la amplificación de ADNc de
\beta-actina humana fueron un par de cebadores
disponibles en el comercio (Clontech) de:
- 5'-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3' y
- 5'-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG--3'.
La condición de ciclos de temperatura
seleccionada para la PCR en tiempo real fueron las siguientes:
- (a)
- 95ºC durante 30 segundos;
- (b)
- 40 ciclos de 95ºC durante 3 segundos y 68ºC durante 30 segundos; y posteriormente
- (c)
- 87ºC durante 6 segundos.
Para el ciclo térmico de la reacción de PCR, se
usó el Sistema Ciclador Smart (TaKaRa Co. Ltd.). Se detectó la
cantidad de ADNc bicatenario por medio de un marcador fluorescente
en el mismo para determinar la cantidad de producto de
amplificación.
Para las muestras de tejido canceroso
mencionadas anteriormente, se prepararon muestras comparativas de
ARN total a partir de células normales y células de carcinoma de
los tejidos individuales de acuerdo con un procedimiento conocido
(Oikawa et al., Cancer Res., 61, 5707-5709
(2001)). Entre las células de carcinoma examinadas de cáncer
cervical, cáncer del cuerpo uterino, cáncer ovárico, cáncer
gástrico, cáncer renal, cáncer pulmonar, carcinoma colorrectal y
cáncer de mama, aproximadamente el 40% de las muestras de células
carcinomatosas de cáncer cervical demostraron expresión
significativa del gen de hWAPL (Fig. 5).
Las muestras de células carcinomatosas de cáncer
cervical se examinaron para determinar la presencia de infección
con HPV. Específicamente, se detectó una región del ARNm para el gen
E6/E7 derivado de HPV por RT-PCR con sus
correspondientes cebadores de acuerdo con un procedimiento conocido
(Nakagawa et al., J. Med. Viral., 62,
251-258 (2000)), y en todas las muestras de células
de carcinomas invasivos de cáncer cervical, se confirmaron la
infección con HPV y la expresión del gen E6/E7. Excepcionalmente,
algunas muestras de cáncer gástrico también demostraron elevada
expresión del gen de hWAPL.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Un gen E6 de HPV 16 se amplificó y aisló por un
método RCR usando un par de cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
16E6attB1:
- 5'-AAAAAGCAGGCTCCACCATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCC-3', y
\vskip1.000000\baselineskip
16E6attB2:
- 5'- AGAAAGCTGGGTTACAGCTGGGTTTCTCTACGTG-3',
\vskip1.000000\baselineskip
mientras que un gen E7 de HPV 16 se
amplificó y aisló por un método RCR usando un par de
cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
16E7attB1:
- 5'-AAAAAGCAGGCTCCACCATGCATGGAGATACACCTACAT-3' y
\vskip1.000000\baselineskip
16E7attB2:
- 5'-AGAAAGCTGGGTTATGGTTTCTGAGAACAGATGGGG-3'.
\vskip1.000000\baselineskip
Posteriormente, cada uno de estos genes se clonó
en un vector de retrovirus pCLXSN de acuerdo con un procedimiento
de Naviaux et al. (Naviaux et al., J. Virol., 70,
5701-5705 (1996)), para generar los retrovirus
LXSN-16E6 y LXSN-16E7 para producir
los recombinantes E6 y E7, respectivamente. Además, se preparó el
retrovirus LXSN-16E6E7 para producir los
recombinantes E6 y E7 en forma simultánea.
Se ha hallado que un producto del gen E2
derivado de HPV se puede unir a una región promotora de los genes
E6 y E7 para poseer una función para la inhibición de su
transcripción y que un producto del gen E2 derivado del virus de
papiloma bovino (BPV) tiene una función similar para inhibir la
transcripción. El fragmento del gen E2 de BPV1 se obtuvo por PCR
anidada usando pBPV-MII como molde. En la PCR
anidada, el par de cebadores internos usados consistió en:
5'-AAAAAGCAGGCTCCACCATGGAGACAGCATGCGAAC-3'
y
5'-AGAAAGCTGGGTCAGAAGTCCAA
GCTGGCTGTAAAG-3',
GCTGGCTGTAAAG-3',
mientras que el par de cebadores
exteriores consistió
en:
5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'
y
5'-GGGGACAAGTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'.
El fragmento del gen E2 BPV1 obtenido de este
modo se clonó en un vector de retrovirus pCMSVpuro, que se basa en
un vector de virus pCMSCV(Clontech) para propósitos
generales, para preparar un retrovirus MSCV-puro
BPV1E2 para producir el recombinante E2 del BPV. El vector de
retrovirus pCMSVpuro comprende un gen de resistencia a la
puromicina como marcador de selección.
Se infectaron células epidérmicas humanas HDK1
(BioWhittaker) con los retrovirus LXSN-16E6,
LXSN-16E7 y LXSN-16E6E7 para
producir recombinantes E6 o E7 derivados de HPV 16, respectivamente.
Como control negativo, se usó una célula epidérmica humana HDK1
infectada con el vector de retrovirus pCLXSN. Se seleccionó una
línea celular en la que se estableció infección continuada del
vector de retrovirus cultivando las células en un medio que
contenía G418 a razón de 50 \mug/mL durante 3 días. Después de la
infección, la expresión del gen de hWAPL inducida por una proteína
recombinante de E6 o E7 de HPV 16 se determinó por transferencia
Western usando un anticuerpo específico que reconoce una región de
la secuencia parcial de aminoácidos 50 a 66 (secuencia de
aminoácidos: CNFKPDIQEIPKKPKVEE) en la proteína oncogénica hWAPL
(Fig. 6).
Al mismo tiempo, también se determinó la
cantidad de expresión de la proteína supresora p53 por transferencia
Western. Posteriormente, se confirmó nuevamente que el producto E6
promovió un proceso de escisión de la proteína supresora tumoral
p53, lo que dio como resultado la expresión de la proteína
oncogénica hWAPL.
Por otra parte, cuando las líneas celulares de
carcinoma del cáncer cervical CaSki, SiHa y C33A se infectaron con
MSCV-puro BPVlE2, las líneas celulares CaSki y SiHa
productoras de E6 y E7 de HPV 16 demostraron aumento de la proteína
supresora tumoral p53 remanente como resultado de la inhibición de
la transcripción de los genes E6 y E7 por el E2 de BPV. En forma
concomitante, se inhibió la expresión de la proteína oncogénica
hWAPL (Fig. 6). Por otra parte, en la línea celular C33A, en la que
se indujo la formación de cáncer por un mecanismo diferente de esta
formación de cáncer originada por la infección con HPV, la cantidad
de proteína supresora tumoral p53 remanente o la cantidad de
expresión de la proteína oncogénica hWAPL no se vio afectada. Los
resultados indican que aunque el aumento de la cantidad de
expresión de la proteína oncogénica hWAPL está estrechamente
asociado con la formación de cáncer, puede existir un mecanismo
independiente que causa aumento de expresión de la proteína
oncogénica WAPL, que es diferente del mecanismo de aumento de
expresión de la proteína oncogénica hWAPL debido a E6 y E7 de
HPV.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se confirmó que la proteína supresora p53 tiene
una función para la inhibición de la transcripción del gen de hWAPL
a partir de su promotor, de la siguiente manera.
Un promotor del gen de hWAPL se amplificó y
aisló por el método de PCR usando un ADN genómico en células
DLD-1 como molde con el uso de un par de
cebadores:
\vskip1.000000\baselineskip
cebador 1
- (secuencia: GTGCATCCCACCCACAGTGGAAGACATGG) y
\vskip1.000000\baselineskip
cebador 2
- (secuencia: CCGCTTCCGCCGGTGAATGGTCAGTGCTGG).
\vskip1.000000\baselineskip
Se clonó en primer término un fragmento de ADN
del producto de PCR al PGEMT-easy (PROMEGA) y, en
forma sucesiva, el fragmento digerido con una enzima de restricción
EcoRI posteriormente se clonó a pBluescript (Stratagene). Una
región que comprendía una porción promotora del gen de hWAPL, que se
insertó en el plásmido, fue digerida con SalI/Xhol y clonada en el
vector pGL3-Basic (PROMEGA).
Después de la purificación con Qiagen Plasmid
MaxiKit(Qiagen), el vector obtenido se
co-transfectó con un vector de expresión de p53,
pHM6 (Roche) como control y un vector pGR3-tK para
la estandarización del ensayo de luciferasa, usando
LipofectAmine2000 (Invitrogen) en una célula HeLa. Se usó un kit
Dual Luciferase (Promega) en el ensayo de luciferasa para
determinar la cantidad de proteína marcada, luciferasa, que fue un
producto del gen indicador transcrito y traducido bajo el control
del promotor del gen de hWAPL.
Como resultado, se confirmó que cuando se
transdujo el vector de expresión de p53, el incremento de la
cantidad de proteína supresora p53 expresada redujo la cantidad de
proteína luciferasa marcada, que fue transcrita y traducida bajo el
control del promotor del gen de hWAPL, en un 30% en comparación con
el control. En otras palabras, se confirma que la proteína
supresora p53 tiene la función de producir la reducción de la
actividad del promotor del gen de hWAPL.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se transdujeron los sitios de restricción
HindIII y EcoRI, respectivamente, en los extremos de la región de
las bases Nos. 1 a 2195 en el ADNc que tiene la secuencia de
nucleótidos de la SEQ ID. No.2 por mutagénesis específica de sitio
usando PCR. El producto de PCR obtenido de este modo se digirió con
HindIII/EcoRI, y el correspondiente fragmento de ADN se insertó en
un vector de expresión de mamífero marcado con HA, pHM6 (Roche
Diagnostics), para construir un vector de expresión para producir un
recombinante de la proteína de hWAPL marcada con HA,
pHM6-hWAPL. El fragmento también se insertó en un
vector de expresión de mamífero, phrGFP-N1
(Stratagene) para expresar una proteína fusionada con un compañero
de fusión hrGFP para construir un vector de expresión para producir
una proteína recombinante de hWAPL fusionada a GFP,
phrGFP-hWAPL.
El vector de expresión para producir un
recombinante se transfectó en una célula huésped de mamífero usando
LipofectAmine 2000 (Invitrogen). Después de cultivar durante 2 días
después de la transfección, se realiza la selección usando EPICS
ALYRA HiperSort (Bechman Coulter) sobre la base de la presencia de
la expresión de la cola hrGFP. Después del cultivo posterior y la
selección adicional, se obtiene una línea celular transformada
portadora del vector de expresión deseado para producir la proteína
recombinante hWAPL.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Para generar un anticuerpo específico para la
proteína oncogénica hWAPL, se preparó una cadena peptídica
(hWAPL_{50-66}) que tenía una secuencia parcial
de aminoácidos 50 a 66: CNFKPDIQEIPKKPKVEE que se ubica en la región
N-terminal de la proteína oncogénica hWAPL como
péptido inmunogénico por síntesis química. Por otra parte, se
produjo por recombinación un polipéptido fusionado marcado con 6xH
His que comprendía una secuencia parcial de aminoácidos
814-1037 que se halla en la región
C-terminal de la proteína oncogénica hWAPL.
De acuerdo con una técnica convencional, estos
dos péptidos inmunogénicos se usaron para inmunizar separadamente
un conejo para producir anticuerpos policlonales específicos para
estos péptidos antigénicos: un anticuerpo
anti-hWAPL-N y un anticuerpo
anti-hWAPL-C. En la transferencia
Western del Ejemplo 3 y demás, la proteína oncogénica hWAPL se
detectó usando el anticuerpo específico
anti-hWAPL-N para el antígeno
hWAPL_{50-66}.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Una célula HeLa se infecta con el vector de
expresión phrGFP-hWAPL para producir una proteína
recombinante de hWAPL fusionada a hrGFP. El procedimiento descrito
en el Ejemplo 5 se realiza para seleccionar una línea celular
positiva para GFP-hWAPL que produce la proteína
fusionada GFP-hWAPL y una línea celular negativa
para GFP-hWAPL que no produce la proteína fusionada
GFP-hWAPL. Después de subcultivar durante cinco
generaciones después de la selección, se analiza el contenido de un
ADN del gen cromosómico por citometría por barrido láser de acuerdo
con el procedimiento de Buse (J. Biol. Chem., 274,
7253-7263 (1999)).
La línea celular negativa para
GFP-hWAPL demuestra un contenido del gen cromosómico
equivalente a la célula huésped, célula HeLa, en la que la mitad o
más está compuesta por un contenido diploide normal y el contenido
tetraploide es aproximadamente la mitad del diploide. Por otra
parte, en la línea celular positiva para GFP-hWAPL,
existe un contenido diploide normal en menor cantidad, la mayor
parte demuestra poliploidía, un contenido tetraploide ligeramente
mayor que el diploide, y existe también un octoploide en una
proporción del 10,1%. En consecuencia, se puede considerar que la
sobreexpresión de una proteína hWAPL induce inestabilidad
cromosómica (Fig. 7).
En forma correspondiente, la inducción de atipia
nuclear, en particular de multinucleación, también se origina en la
sobreexpresión de la proteína hWAPL. Después de subcultivar tres
generaciones, las proporciones de multinucleación observadas son
sólo del 5% y 4% en la línea celular negativa para
GFP-hWAPL y la célula HeLa infectada con el vector
phrGFP-N1 (control), respectivamente, mientras que
es 15,6% (tres veces o más) en la línea celular positiva para
GFP-hWAPL (Fig. 8).
Por otra parte, en asociación con la anormalidad
cromosómica tal como atipia nuclear debido a división anormal de
centrómeros durante un proceso de separación por mitosis de un gen
cromosómico, se produce la inducción de formación de micronúcleos
por la sobreexpresión de una proteína hWAPL. Una frecuencia de
formación de micronúcleos en la línea celular positiva para
GFP-hWAPL es aproximadamente dos veces mayor que la
de la línea celular negativa para GFP-hWAPL (Fig.
7).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se infecta el fibroblasto NIH 3T3 con el vector
de expresión pHM6-hWAPL para producir una proteína
recombinante de la hWAPL con cola de HA para producir una línea
celular recombinante que sobreexpresa la proteína hWAPL con cola de
HA, una línea celular HA-hWAPL 3T3. Como control
negativo, se produce una línea celular HA-3T3
infectada con un vector pHM6. Cuando se cultiva en una placa, la
línea celular HA-3T3 para control negativo forma
una capa celular única de tipo confluente homogénea como en la
célula huésped, el fibroblasto NIH 3T3, mientras que la línea
celular HA-hWAPL 3T3 forma una estructura focal.
A un ratón lampiño se le inyectó por vía
subcutánea la línea celular HA-hWAPL 3T3 y la línea
celular HA-3T3. El seguimiento posterior indicó que
dentro de los 10 días siguientes se indujo la oncogénesis en todos
los sitios de inyección para la línea celular
HA-hWAPL 3T3 mientras que no se indujo la
oncogénesis en los sitios de inyección para la línea celular
HA-3T3. Por transferencia Western, usando el
anticuerpo anti-HA y el anticuerpo
anti-hWAPL-C, se confirmó que la
proteína hWAPL con cola de HA estaba realmente expresada en la
célula cancerosa. En la célula cancerosa, se observó mitosis
heterotípica; por ejemplo, también se observó la división
tripolar.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Usando un ARNsi dirigido al gen de hWAPL, se
confirmó que la inhibición de la expresión de la proteína hWAPL
puede producir la inhibición del crecimiento de una célula de
carcinoma.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando el kit Silencer de construcción de ARNsi
(Ambion), se produjeron ARNsi que se dirigen a la siguiente
secuencia génica (ARNAsi de hWAPL) y a un control (control
negativo), respectivamente:
- ARNAsi de hWAPL: CGGACTACCCTTAGCACAA
- control negativo: ACTACAACTGGTCGCAACC.
Prácticamente, se prepararon dos oligómeros
sintéticos para cada uno; específicamente, para el ARNAsi de
hWAPL,
- AACGGACTACCCTTAGCACAAcctgtctc y
- AATTGTGCTAAGGGTAGTCCGcctgtctc,
y, para el control
negativo,
- AAACTACAACTGGTCGCAACCcctgtctc y AAGGTTGCGACCAGTTGTAGTcctgtctc.
Posteriormente, en cada oligómero sintético, un
cebador promotor T7 se hibridó en la porción de ctgtctc y se trató
con ADN polimerasa Klenow para preparar completamente un ADN
bicatenario. Posteriormente, este fue transcrito por la ARN
polimerasa T7, los ARN de las cadenas antisentido y homosentido
preparados se hibridaron entre sí, y posteriormente ambos extremos
cohesivos se digirieron con ARNsa para preparar un ARNsi bicatenario
con extremos romos.
A una célula SiHa derivada de cáncer cervical,
en la que hWAPL estaba altamente expresada, se transdujo el ARNAsi
de hWAPL y el control negativo de ARNsi a una concentración de 1 nM
para evaluar la influencia sobre el crecimiento celular.
Los ARNsi se transfectaron a la célula SiHa
derivada de un cáncer cervical positivo para HPV16, en el que se
observó alta expresión de hWAPL. La Fig. 10 muestra los resultados
de graficar el número de células vivas (x10^{3}) en ordenadas en
función del tiempo de transducción del ARNsi (horas) en abscisas. En
la figura, "ARNsi" para la transfección de un ARNsi dirigido a
DIF-2, "cont" para la transfección de un ARNsi
control y "TSA" indican los resultados obtenidos cuando se
añade un inhibidor de histona desacetilasa, tricostatina A, a un
cultivo después de la transfección del ARNsi, respectivamente.
Hasta 20 después de la transfección del ARNAsi
de hWAPL, se puede observar un aumento del número de células
tumorales vivas. Durante el período, la comparación con el control
puede indicar la inhibición del crecimiento tumoral.
Posteriormente, las células a las que se transdujo ARNAsi de hWAPL
muestran reducción en el número de células vivas y después de 100
horas, permanecía viva una pequeña cantidad de células. En
contraste, cuando se inhibe el avance de la desacetilación para las
lisinas acetiladas contenidas en una histona por adición de
tricostatina A, se atenúa el efecto de la inhibición del crecimiento
celular por el ARNAsi de hWAPL.
Estos resultados indican que la muerte celular
por inhibición de una hWAPL es causada por inhibición de una
modificación de histona tal como acetilación, e implica que la
propia hWAPL puede estar involucrada en el control de un código de
histona.
\vskip1.000000\baselineskip
A ratones BALB3T3/lampiños de 6 semanas de edad
se inocularon 2x10^{6} células SiHa. A partir de los 10 días
posteriores a la inoculación, a las células tumorales inoculadas se
inyectaron ARNAsi de hWAPL y un ARNsi como control negativo una vez
cada dos días y cinco veces en total, respectivamente.
La variación del tamaño del tumor inoculado se
evaluó para 6 animales del grupo de inyección de ARNAsi de hWAPL, 6
animales del grupo de inyección de ARNsi como control negativo y 5
animales del grupo no tratado. Los resultados indicaron una
reducción del tamaño tumoral promedio de 33% en el grupo de
inyección de ARNAsi de hWAPL con respecto al grupo no tratado.
Por otra parte, se demostró que la secuencia de
nucleótidos del ADNc para la hWAPL, que nosotros clonamos, estaba
ubicada en las posiciones 10q23.31 a q23.32 del genoma humano. La
secuencia de nucleótidos del mismo se muestra a continuación, junto
con la secuencia de nucleótidos de la región no traducida 5' y la
región promotora del gen de hWAPL dilucidado así como la secuencia
de nucleótidos del ADNc para la WAPL de ratón mencionada. En los
ORF de los ADNc, la región que va desde el codón de iniciación ATG
hasta el codón de detención TAG aparece escrita en mayúscula,
mientras que en la región promotora, la región posterior a un punto
de iniciación de transcripción putativa se escribe con mayúsculas
basándose en la comparación con EST.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En la descripción y los dibujos, cuando se
abrevian los nucleótidos y/o aminoácidos, las abreviaturas están de
acuerdo con la Comisión IUPAC-IUB de Nomenclatura
Bioquímica o las abreviaturas convencionales de la técnica. Se
enumeran ejemplos a continuación. Cuando existen isómeros ópticos en
un aminoácido, se indica el isómero L a menos que se indique
específicamente lo contrario.
- ADN:
- ácido desoxirribonucleico;
- ADNc:
- ácido desoxirribonucleico complementario;
- A:
- adenina;
- T:
- timina;
- G:
- guanina;
\newpage
\global\parskip0.970000\baselineskip
- C:
- citosina;
- I:
- inosina;
- R:
- adenina (A) o guanina (G);
- Y:
- timina (T) o citosina (C);
- M:
- adenina (A) o citosina (C);
- K:
- guanina (G) o timina (T);
- S:
- guanina (G) o citosina (C);
- W:
- adenina (A) o timina (T);
- B:
- guanina (G), guanina (G) o timina (T);
- D:
- adenina (A), guanina (G) o timina (T);
- V:
- adenina (A), guanina (G) o citosina (C);
- N:
- adenina (A), guanina (G), citosina (C) o timina (T) o base desconocida u otra;
- ARN:
- ácido ribonucleico;
- ARNm:
- ácido ribonucleico mensajero;
- dATP:
- trifosfato de desoxiadenosina;
- dTTP:
- trifosfato de desoxitimidina;
- dGTP:
- trifosfato de desoxiguanosina;
- dCTP:
- trifosfato de desoxicitidina;
- ATP:
- trifosfato de adenosina;
- EDTA:
- ácido etilendiaminotetraacético;
- SDS:
- dodecilsulfato sódico;
- BHA:
- benzhidrilamina;
- pMBHA:
- p-metilbenzhidrilamina;
- Tos:
- p-toluensulfonilo;
- Bzl:
- bencilo;
- Bom:
- benciloximetilo;
- Boc:
- t-butiloxicarbonilo;
- DCM:
- diclorometano;
- HOBt:
- 1-hidroxibenzotriazol;
- DCC:
- N,N'-diciclohexilcarbodiimida;
- TFA:
- ácido trifluoroacético;
- DIEA:
- diisopropiletilamina;
- Gly o G:
- glicina;
- Ala o A:
- alanina;
- Val o V:
- valina;
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
- Leu o L:
- leucina;
- Ile o I:
- isoleucina;
- Ser o S:
- serina;
- Thr o T:
- treonina;
- Cys o C:
- cisteína;
- Met o M:
- metionina;
- Glu o E:
- ácido glutámico;
- Asp o D:
- ácido aspártico;
- Lys o K:
- lisina;
- Arg o R:
- arginina;
- His o H:
- histidina;
- Phe o F:
- fenilalanina;
- Tyr o Y:
- tirosina;
- Trp o W:
- triptofano;
- Pro o P:
- prolina;
- Asn o N:
- asparagina;
- Gln o Q:
- glutamina;
- pGlu:
- ácido piroglutámico;
- Tyr(I):
- 3-yodotirosina;
- DMF:
- N,N-dimetilformamida;
- Fmoc:
- N-9-fluorenilmetoxicarbonilo;
- Trt:
- tritilo;
- Pbf:
- 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo;
- Clt:
- 2-clorotritilo
- Bu^{t}:
- t-butilo; y
- Met(O):
- sulfóxido de metionina.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de nucleótidos de longitud completa
de un oncogén de hWAPL de acuerdo con la presente invención permite
producir un recombinante de una proteína oncogénica hWAPL codificada
por el oncogén hWAPL, e investigar un mecanismo de formación de
cáncer inducido por la sobreexpresión de la proteína oncogénica
hWAPL en una cepa celular derivada de alguna de varias células
epiteliales. Por otra parte, en la presente invención, una región
promotora del oncogén de hWAPL identificado puede proporcionar un
nuevo blanco para estudiar la prevención o terapia del cáncer sobre
la base de un mecanismo de inhibición del mecanismo de formación de
cáncer inducido por la sobreexpresión del oncogén de hWAPL, por
inhibición de la transcripción del oncogén. Por otra parte, la
producción de un recombinante de la secuencia de nucleótidos de
longitud completa del oncogén de hWAPL de acuerdo con la presente
invención, la proteína oncogénica hWAPL, permite la preparación de
una sonda de ácido nucleico o cebador de PCR para detectar la
expresión de ARNm por transcripción del oncogén de hWAPL o un
anticuerpo específico para detectar un péptido de la proteína
oncogénica hWAPL traducida. En consecuencia, permite usar varios
kits para diagnóstico que
\hbox{detectan la sobreexpresión del
oncogén de hWAPL directamente involucrado en el comienzo de un
cáncer.}
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> NEC Corporation y Dr. Masahiko
KURODA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevo gen del cáncer y su uso
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211>
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3570
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
Claims (17)
1. Una molécula de ácido nucleico seleccionada
del grupo que consiste en:
- (a)
- una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína oncogénica que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y
- (b)
- una molécula de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2;
como secuencia codificadora para
ser traducida a la proteína oncogénica que consiste en la secuencia
de aminoácidos de SEQ ID NO:
1.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un polinucleótido que está compuesto por la
secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, una región promotora que
consiste en la siguiente secuencia de nucleótidos (a) y la región
5'-UTR que consiste en la siguiente secuencia de
nucleótidos (b), donde la región promotora y la región
5'-UTR están ligadas en forma sucesiva al extremo
5'-terminal de la molécula de ácido nucleico que
consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2;
(a) secuencia de la región promotora del gen de
hWAPL:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(b) la secuencia de la región
5'-UTR del gen de hWAPL:
3. Un vector recombinante que comprende el
polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2.
4. Una proteína recombinante que consiste en la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 codificada por el
polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1.
5. Un anticuerpo generado utilizando el péptido
que consiste en la secuencia de aminoácidos de los restos 50 a 66
de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 como inmunógeno,
donde el anticuerpo es generado por inmunización de un conejo con
dicho péptido, y el anticuerpo es reactivo con la secuencia de
aminoácidos parcial de los restos 50 a 66 de la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
6. Un anticuerpo generado utilizando el
polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de los
restos 814 a 1037 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1
como inmunógeno, donde el anticuerpo es generado por inmunización
de un conejo con dicho polipéptido, y el anticuerpo es reactivo con
la secuencia de aminoácidos parcial de los restos 814 a 1037 de la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
7. Un kit de reactivos para anticuerpos para una
reacción antígeno-anticuerpo que comprende el
anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, disponible para
detectar una proteína oncogénica que consiste en la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o un fragmento peptídico derivado de la
proteína oncogénica.
8. Un kit para diagnóstico utilizable para la
detección de una proteína oncogénica que consiste en la secuencia
de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o un fragmento peptídico derivado de
la proteína oncogénica por medio de una reacción
antígeno-anticuerpo, que comprende el anticuerpo de
la reivindicación 5 o 6.
9. Un polinucleótido antisentido que consiste en
una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de
nucleótidos parcial de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2,
que es un fragmento de ADN que consiste en una secuencia de
nucleótidos complementaria a la porción de ácido nucleico entre los
Nos. 2511 y 2813 de SEQ ID NO: 2.
10. Un kit de hibridación con sonda disponible
para detectar un ARNm que comprende la secuencia de nucleótidos de
SEQ ID NO: 2, su secuencia de nucleótidos parcial o ADNc preparado
por el ARNm, que comprende el polinucleótido antisentido de la
reivindicación 9 como sonda de ADN del mismo.
11. Un kit para diagnóstico disponible para
detectar la expresión del ARNm que comprende la secuencia de
nucleótidos de SEQ ID NO: 2, que es traducido a una proteína
oncogénica que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID
NO: 1, por medio de un método de hibridación con sonda, que
comprende el polinucleótido antisentido de acuerdo con la
reivindicación 9 como sonda de hibridación.
12. Un par de cebadores para la amplificación
por PCR del ADNc que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ
ID NO: 2, que consiste en los cebadores apareados de:
una secuencia de nucleótidos:
- 5'-TTGGATCCATGACATCCAGATTTGGGAAAACATACAGTAGG-3'; y
una secuencia de nucleótidos:
- 5'-TTGAATTCCTAGCAATGTTCCAAATATTCAATCACTCTAGA-3'.
13. Un par de cebadores para amplificar por PCR
una cadena parcial del ADNc que comprende la secuencia de
nucleótidos de SEQ ID NO: 2, que consiste en los cebadores apareados
de:
- 5'-GAATTCATAGGCACAGCGCTGAACTGTGTG-3' y
- 5'-TTGAATTCCTAGCAATGTTCCAAATATTCA-3'.
14. Una doble hebra de ARN de interferencia de
cadena corta capaz de inhibir la expresión del ARNm que comprende
la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 en una célula de cáncer
cervical de ser humano, donde el ARNsi tiene una secuencia de
nucleótidos:
- CGGACTACCCTTAGCACAA.
15. Una composición farmacéutica que comprende
la doble hebra del ARN de interferencia de cadena corta de acuerdo
con la reivindicación 14.
16. Una composición para diagnóstico que
comprende el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, o
el polinucleótido antisentido de acuerdo con la reivindicación
9.
17. Uso de la doble hebra del ARN de
interferencia de cadena corta de acuerdo con la reivindicación 14
para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la
expresión del ARNm que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ
ID NO: 2 en una célula de cáncer cervical de ser humano para detener
el crecimiento de la célula de cáncer cervical.
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