ES2332314T3

ES2332314T3 - Metodo para incrementar la resistencia frente a factores de estres en los vegetales.

Info

Publication number: ES2332314T3
Application number: ES04718952T
Authority: ES
Inventors: Markus Frank; Karl-Heinz Kogel; Ralph Huckelhoven
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2003-03-12
Filing date: 2004-03-10
Publication date: 2010-02-02
Anticipated expiration: 2024-03-10
Also published as: WO2004081217A3; ATE441720T1; WO2004081217A2; RU2005131306A; BRPI0408286A; CA2518417A1; PL1604029T3; DE502004010001D1; AR043583A1; EP1604029A2; RU2375452C2; US20060064775A1; EP1604029B1

Abstract

Método para la generación o incremento de la resistencia frente a al menos un factor de estrés biótico en plantas en el cual están comprendidos los siguientes pasos de trabajo: a) Incremento de la cantidad de proteína de al menos una proteína de inhibidor de Bax -1 (BI1) en al menos un tejido vegetal de la planta con la condición de que la expresión en la epidermis de la hoja permanezca esencialmente sin modificar o que se reduzca, y b) Selección de las plantas en las que en comparación con la planta de partida ya exista una resistencia contra al menos un factor de estrés biótico o se incremente; y en donde el factor de estrés es un patógeno de la planta.

Description

Método para incrementar la resistencia frente a factores de estrés en los vegetales.

La invención se refiere a métodos para generar o incrementar la resistencia frente a, al menos, un factor de estrés biótico o abiótico en los vegetales, preferiblemente frente a plantas patógenas, mediante el incremento de la expresión de, al menos, una proteína inhibidora Bax 1 (BI1) en al menos un tejido vegetal, con la condición de que la expresión en la epidermis de la hoja permanece esencialmente inmodificada.

Un objetivo de los trabajos biotecnológicos en vegetales es la producción de vegetales con propiedades novedosas y ventajosas, por ejemplo para el incremento de la productividad agrícola, para el incremento de la calidad en los productos alimenticios o para la producción de determinados productos químicos o farmacéuticos. Con frecuencia son insuficientes los mecanismos de defensa naturales del vegetal frente a patógenos. Las solas enfermedades por hongos conducen a pérdidas anuales en cosechas de muchos millardos de US\textdollar. La introducción de genes ajenos a partir de fuentes vegetales, animales o microbianas puede incrementar las defensas. Ejemplos son la protección de tabaco frente al daño por comida de insectos mediante expresión de endotoxinas de Bacillus thuringiensis (Vaeck et al. (1987) Nature 328:33-37) o la protección del tabaco frente a la infestación de hongos mediante expresión de una quitinasa de frijol (Broglie et al. (1991) Science 254:1194-1197). Sin embargo, la mayoría de los planteamientos descritos solo ofrecen resistencia a un patógeno individual o a un espectro estrecho de
patógenos.

Existen solo unos pocos planteamientos que confieren resistencia a los vegetales frente a un espectro más amplio de patógenos, en particular frente a hongos patógenos. La resistencia sistémica adquirida ("systemic acquired resistance"; SAR) - un mecanismo de defensa en una variedad de interacciones de vegetal/patógeno - puede conferirse mediante aplicación de sustancias mensajeras endógenas, tales como ácido jasmónico (JA) o ácido salicílico (SA) (Ward et al. (1991) Plant Cell 3:1085-1094; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4(6):645-656). Efectos similares también pueden alcanzarse mediante compuestos sintéticos tales como ácido 2,6-dicloroisonicotínico (DCINA) o éster S-metílico de ácido benzo(1,2,3)tiadiazol-7-tiocarboxílico (BTH; Bion®) (Friedrich et al. (1996) Plant J 10(1):61-70; Lawton et al. (1996) Plant J 10:71-82). La expresión de las proteínas relacionadas con patogénesis ("pathogenesis related" (PR)), que están altamente reguladas en el caso de SAR, también puede provocar parcialmente resistencia patógena.

En cebada, el locus Mlo se describe como un regulador negativo de defensa patógena. La pérdida o la pérdida de función ("loss-of-function") del gene Mlo ocasiona una resistencia aumentada resistencia no específica con respecto a la raza frente a un gran número de aislados de mildiu (Büschges R et al. (1997) Cell 88:695-705; Jorgensen JH (1977) Euphytica 26:55-62; Lyngkjaer MF et al. (1995) Plant Pathol 44:786-790). El gen de Mlo está descrito (Büschges R et al. (1997) Cell 88:695-705; WO 98/04586; Schulze-Lefert P, Vogel J (2000) Trends Plant Sci. 5:343-348). Se aislaron diversos homólogos de Mlo de otras especies de cereales. Se han descrito métodos usando estos genes para lograr una resistencia patógena (WO.98/04586; WO 00/01722; WO 99/47552). La desventaja es que las plantas con deficiencia de Mlo también inician los mecanismos de defensa arriba mencionados en ausencia de un patógeno que se manifiesta en una mortandad espontánea de células de la hoja. (Weiter M et al. (1993) Mol Gen Genet 239:122-128). Por esto las plantas resistentes a mlo sufren un menoscabo de rendimiento de alrededor de 5% (Jörgensen JH (1992) Euphytica 63: 141-152). La muerta espontánea de las células de hoja implica además una hiper-susceptibilidad desventajosa frente a patógenos necrotrofos y hemibiotrofos tales como Magnaporte grisea (M. grisea) o Cochliobolus sativus (Bipolaris sorokiniana) (Jarosch B et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:508-514; Kumar J et al. (2001) Phytopathology 91: 127-133).

Los factores que inducen un efecto comparable de resistencia mlo frente a hongos necrotrofos, no han podido identificarse hasta ahora. La razón para esto puede ser el mecanismo de infección específico de los hongos necrotrofos: en lugar de una penetración facilitada por appressoria, primero liberan micotoxinas y enzimas dentro de las células huésped de la planta, lo cual conduce a la muerte de la célula. Sólo entonces la célula es penetrada (Shirasu K and Schulze-Lefert P (2000) Plant Mol Biol 44:371-385). Estrategias similares de infección se emplean por patógenos bacterianos tales como Erwinina carotovora (Whitehead NA et al. (2002) Antonie van Leeuwenhoek 81: 223-231). Una resistencia a la penetración con la ayuda de la formación de papilas no representa una estrategia eficiente de defensa.

La apoptosis, también denominada muerte celular programada, es un mecanismo esencial para mantener la homeostasis de tejido y, de esta manera, constituye un mecanismo negativamente regulador que contrarresta la división celular. En organismos multicelulares, la apoptosis es una parte natural de la ontogénesis e involucra, entre otros, el desarrollo de los órganos y la remoción de células envejecidas, infectadas o mutadas. La apoptosis permite que tenga lugar una eliminación eficiente de células indeseadas. Una interferencia o inhibición de la apoptosis contribuye a la patogénesis de un rango de enfermedades, entre otras de la carcinogénesis. Los efectores principales de la apoptosis son proteasas de cisteína específicas a aspartato, las llamadas caspasas. Estas pueden activarse por medio de, al menos, dos rutas de señales de apoptosis: primero, la activación de la familia receptora de TNF (Tumor Necrosis Factor); segundo, el papel central desempeñado por las micondrias. La activación de las rutas de señal apoptótica de las mitocondria está regulada por proteínas de la familia Bcl-2. Esta familia de proteínas consiste en proteínas anti-apoptóticas y pro-apoptóticas tales como, por ejemplo, Bax. En el caso de un estímulo apoptótico, tiene lugar un cambio conformacional alostérico de la proteína Bax sufre el cual conduce a un anclaje de la proteína en la membrana externa de la mitocondria y a su oligomerización. El resultado de estos oligómeros es que se liberan moléculas pro-apoptóticas desde la mitocondria hacia el zitosol y estas moléculas ocasionan una cascada de señal apoptóticas y, finalmente, la degradación de sustratos celulares específicos, lo cual tiene la muerte celular como consecuencia. El inhibidor Bax 1 BI1 se aisló por su propiedad de inhibir el efecto proapoptótico de BAX (Xu Q & Reed JC (1998) Mol Cell 1(3): 337-346). BI1 representa una proteína altamente conservada. Se encuentra predominantemente como componente integral de membranas intracelulares. BI1 interactúa con bcl-2 y bcl-x1. La sobreexpresión de BI1 en células de mamíferos suprime el efecto proapoptótico de BAX, etoposido y staurosporina, pero no de antígeno Fas (Roth W and Reed JC (2002) Nat Med 8: 216-218). La inhibición de BI1 por ARN antisense, por el contrario induce apoptosis (Xu Q & Reed JC (1998) Mol Cell 1(3):337-346). Los primeros homólogos vegetales de BI1 han sido aislados de arroz y Arabidopsis (Kawai et al. (1999) FEBS Lett 464:143-147; Sanchez et al (2000) Plant J 21:393-399). Estas proteínas vegetales suprimen la muerte celular inducida por BAX en levadura. La homología de secuencia de aminoácido con BI1 es de cerca del 45%. El homólogo de Arabidopsis AtBI1 es capaz de suprimir, en vegetales recombinantes, el efecto pro-apoptótico de BAX de ratón (Kawai-Yamada et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98(21):12295-12300). El homólogo BI1 de arroz (Oryza sativa) se expresa en todos los tejidos vegetales (Kawai et al. (1999) FEBS Lett 464: 143-147). Además, se encuentran descritos genes BI1 de cebada (Hordeum vulgare; GenBank Acc.-No.: AJ290421), arroz (GenBank Acc.-No.: AB025926), Arabidopsis (GenBank Acc.-No.: AB025927), tabaco (GenBank Acc.-No.: AF390556) y colza (GenBank Acc.-No.: AF390555, Bolduc N et al. (2003) Planta 216:377-386). La expresión de BI1 en cebada en altamente regulada como consecuencia de una infección con mildiu (Hückelhoven R et al. (2001) Plant Mol Biol 47(6):739-748). WO 00/26391 describe la sobreexpresión de los genes antiapoptóticos Ced-9 de C. elegans, sfIAP de Spodoptera frugiperda, bcl-2 del ser humano y bcl-xl de gallina en vegetales para elevar la resistencia frente a hongos necrotrofos o hemibiotrofos. Los homólogos de BI1 vegetales no han sido divulgados. La expresión se realiza bajo el control de promotores constitutivos. Además se describe la expresión de proteína BI1 de Arabidopsis bajo el fuerte promotor constitutivo 35S CaMV en células de arroz y una resistencia, inducida por ésta, contra las sustancias que inducen a muerte celular a partir de Magnaporthe grisea (Matsumura H et al. (2003) Plant J
33:425-434).

De manera sorprendente se ha encontrado en el marco de esta invención que si bien una expresión constitutiva de una proteína BI1 causa una resistencia frente a hongos necrotrofos, esto tiene como consecuencia, sin embargo, una ruptura de la resistencia mediada por mlo frente a mildiu polvoriento obligado-biotrófico (véase experimento comparativo 1). Esto cuestiona la utilidad económica de los métodos descritos en el estado de la técnica.

La tarea consistió en suministrar métodos de defensa patógena vegetal que hicieran posible una defensa efectiva contra patógenos vegetales (preferiblemente patógenos necrotrofos) sin romper ninguna resistencia existente frente a otros patógenos (tales como, por ejemplo, patógenos biotrofos). Esta tarea se resuelve mediante el método de acuerdo con la invención.

Un primer objeto de la invención se refiere a métodos para generar o incrementar la resistencia en vegetales a al menos un factor de estrés biótico o abiótico, el cual comprende los siguientes pasos:

a): incremento de la cantidad de proteína de al menos una proteína de inhibidor BAX 1 (BI1) en al menos un tejido vegetal con la condición de que la expresión en la epidermis de la hoja se mantenga esencialmente inmodificada o se reduzca, y

b): selección de los vegetales en los que, en comparación con los vegetales de partida, exista, o se incremente, una resistencia frente a al menos un factor de estrés biótico o abiótico.

El factor de estrés biótico preferido es un patógeno, preferiblemente un patógeno seleccionado del grupo de patógenos necrotrofos y hemibiotrofos.

Por epidermis, la persona técnica en la materia entiende el tejido epidermal predominante de las partes del vegetal primarias superficiales (encima de la tierra), por ejemplo del tallo, de las hojas, de las flores, frutas y semillas. Las células epidermales secretan hacia afuera una capa repelente al agua, la cutícula. Las raíces están rodeadas por rizodermis que en muchos casos se asemeja a la epidermis pero también muestra diferencias pronunciadas. La epidermis se genera de la capa más externa del meristema apical. Por el contrario, la formación de rizodermis es menos clara. Dependiendo de las especies puede considerarse, en términos de evolución, o bien como parte de la piloriza (caliptra) o bien como parte de la corteza primaria. La epidermis tiene numerosas funciones: protege la planta contra la desecación y regula la velocidad de transpiración. Protege la planta frente a las más diversas influencias químicas y físicas externas, frente a ser devorados por animales y frente al ataque de parásitos. Participa en el intercambio de gas, en la secreción de determinados productos metabólicos y en la absorción de agua. Comprende receptores para la luz y los estímulos mecánicos. De esta manera actúa como transformador de señal entre el medio ambiente y la planta. De acuerdo con sus diversas funciones, la epidermis comprende un número de células diferenciadas de manera diferente. A esto deben añadirse variantes específicas por especies y organizaciones diferentes epidérmicas en las partes individuales de una planta. Esencialmente consiste en tres categorías de células: las "propias" células de epidermis, las células de los estomas y los trichomas (del griego: trichoma, pelo), apéndices de la epidermis de forma, estructura y función diferentes. Las "propias" células de la epidermis, es decir, las menos especializadas constituyen la masa principal de las células del tejido final. Desde una vista superior, éstas son o bien poligonales (de forma plana o de plato) o alongadas. Las paredes entre ellas son frecuentemente onduladas o sinuosas. No se conoce qué induce a esta forma durante el desarrollo; las hipótesis existentes solo ofrecen explicaciones insatisfactorias para esto. Pueden encontrarse células epidérmicas alongadas en órganos o partes de órganos que son ellos mismos alongados como, por ejemplo en los tallos, peciolos, venas de hojas y en las hojas de la mayoría de los monocotiledóneas. La parte superior e inferior de los limbos pueden cubrirse con diferentes estructuras de epidermis y es posible que pueda variar tanto la forma de las células, el grosor de las paredes como también la distribución y el número de las células especializadas (estomas y/o trichomas) por unidad de superficie. También se encuentran grandes variaciones dentro de familias individuales, por ejemplo las Crassulaceas. En la mayoría de los casos, la epidermis consiste en una capa individual aunque se han encontrado epidermis multicapas que almacenan agua en especies de varias familias (Moraceae: aquí, la mayoría de las especies de ficus, Piperaceae: peperonia [Peperonie], Begoniaceae, Malvaceae, entre otras). Sin embargo, las células epidérmicas secretan una cutícula en la parte de afuera que cubre todas las superficies epidérmicas como una película ininterrumpida. Puede ser tersa o estructurada por turgencias, cordeles, arrugas o surcos. Sin embargo, no siempre las arrugas de la cutícula, que pueden observarse al inspeccionar la superficie, son ocasionadas por la formación de cordeles cuticulares. En realidad existen casos cuando las arrugas cuticulares son tan solo la expresión de bultos subyacentes de la pared celular. Los apéndices epidérmicos de diversa forma, estructura y función se denominan trichomas y, en el presente contexto, también se entienden por el término de "epidermis". Aparecen en forma de pelos protectores, pelos de soporte y pelos de glándulas, en la forma de escamas, de diversas papilas y en las raíces como pelos absorbentes. Se forman exclusivamente por células epidérmicas. Con frecuencia, un trichoma se forma sólo por una célula así, aunque ocasionalmente más de una célula participa en dicha formación. Así mismo, bajo el término "epidermis" están comprendidas las papilas. Las papilas son protuberancias de la superficie epidérmica. El ejemplo de libro de texto son las papilas sobre las superficies de flor pensamiento (viola tricolor) así como las superficies de hojas de muchas especies en los bosques lluviosos tropicales. Confieren a la superficie una consistencia aterciopelada. Algunas células de la epidermis pueden formarse como almacenamientos de agua. Un ejemplo típico representan las células vesiculares en las superficies de muchas especies de margaritas y otras plantas suculentas. En el caso de algunas plantas, por ejemplo en flores campanilla (campanula persicifolia) las paredes externas de la epidermis se espesan como lentes.

La masa principal de todos los tejidos forma el tejido fundamental o parénquima. Los tejidos de parénquima incluyen el mesófilo que puede estar diferenciado en el parénquima de empalizada y parénquima de espuma.

Por consiguiente, la persona técnica en la materia entiende por mesófilo un tejido de parénquima. Las células de parénquima están vivas sin excepción, la mayoría isodiamétricas, rara vez alongadas. La médula de las yemas, los tejidos de almacenamiento de los frutos, las semillas, la raíz y otros órganos que se ubican bajo tierra deben considerarse así mismo como parénquimas, como el mesófilo.

El mesófilo se subdivide en las hojas de la mayoría de los helechos y fanerógamos, de manera particularmente marcada en las dicotiledóneas y muchas monocotiledóneas, en parénquimas de empalizada y de esponja. Una hoja "típica" está estructurada de manera dorsiventral. El parénquima dorsiventral se encuentra en tal caso, la mayoría de las veces, en el lado superior de la hoja, inmediatamente debajo de la epidermis. El parénquima esponjoso llena el espacio subyacente. Se intercala por un sistema intercelular voluminoso cuyo espacio gaseoso se encuentra en contacto directo con el mundo exterior por medio de las estomas. El parénquima de empalizada está compuesto de células cilíndricas alongadas. En algunas especies, las células son irregulares, ocasionalmente bifurcadas (en forma de Y: parénquima de empalizada de brazo). Tales variantes se encuentran en helechos, coníferas y unas pocas angioespermas (por ejemplo en algunas especies Ranunculaceae y Caprifoliaceae [ejemplo: saúco]). Junto a las formas de organización más ampliamente difundidas acabadas de describir, se han detectado las siguientes variantes:

: parénquima de empalizada en el lado inferior de la hoja. Particularmente ostensible en las hojas escamosas. Ejemplo: la tuya (Thuja), así como en las hojas de ajo silvestre o de oso (Allium ursinum).

: Parénquima de empalizada en ambos lados de la hoja (lado superior e inferior). Con frecuencia en plantas de lugares secos (xerophytos). Ejemplo: lechuga espinosa (Lactuca serriola);

: parénquima de empalizada cerrada con forma de anillo: en hojas organizadas de manera cilíndrica y en las agujas de las coníferas

La variabilidad de las células de la parénquima esponjosa y la organización de parénquima esponjosa misma son incluso más variadas que aquella de la parénquima de empalizada. La mayoría de las veces se denomina tejido de aireación puesto que comprende un gran número de espacios intercelulares enlazados unos con otros. El mesófilo puede comprender el llamado tejido de asimilación, pero los términos mesófilo y tejido de asimilación son deben usarse como sinónimos. Existen hojas libres de cloroplastos cuya organización difiere sólo en menor grado de hojas verdes comparables. Como consecuencia, comprenden mesófilo, pero no tiene lugar una asimilación; viceversa, la asimilación tiene lugar en, por ejemplo, secciones del vástago. La persona técnica en la materia puede encontrar otras ayudas en la caracterización de epidermis y mesófilo, por ejemplo en v. GUTTENBERG, H.: Lehrbuch der Allgemeinen Botanik (Manual de botánica general). Berlin: Akademie-Verlag (editorial), 1955 (5. edición), HABERLANDT, G.: Physiologische Pflanzenanatomie (Anatomía fisiológica de los vegetales). Leipzig: W. Engelmann 1924 (6. Edición); TROLL, W.: Morphologie der Pflanzen (Morfología de los vegetales). Volumen 1: órganos de los vegetales. Berlin: Gebr. Borntraeger, 1937; TROLL, W.: Praktische Einführung in die Pflanzenmorphologie (Introducción práctica a la morfología de los vegetales). Jena: VEB G. Thieme Verlag (editorial) 1954/1957; TROLL, W., HÖHN, K.: Allgemeine Botanik (Botánica general). Stuttgart: F. Enke Verlag (editorial), 1973 (4. edición.).

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En una modalidad la epidermis se caracteriza bioquímicamente. En una modalidad, la epidermis puede caracterizarse por la actividad de uno o más de los siguientes promotores:

-: WIR5 (=GstA1), acc. X56012, Dudler & Schweizer, no publicado.

-: GLP4, acc. AJ310534; Wei, Y.; Zhang, Z.; Andersen, C.H.; Schmelzer, E.; Gregersen, P.L.; Collinge, D.B.; Smedegaard-Petersen, V.; Thordal-Christensen, H. (1998) An epidermis/papilla-specific oxalate oxidase-like protein in the defence response of barley attacked by the powdery mildew fungus. Plant Molecular Biology 36, 101-112.

-: GLP2a, acc. AJ237942, Schweizer, P., Christoffel, A. and Dudler, R. (1999). Transient expression of members of the germin-like gene family in epidermal cells of wheat confers disease resistance, Plant J 20, 541-552.

-: Prx7, acc. AJ003141, Kristensen BK, Ammitzböll H, Rasmussen SK & Nielsen KA. 2001. Transient expression of a vacuolar peroxidase increases susceptibility of epidermal barley cells to powdery mildew. Molecular Plant Pathology, 2(6), 311-317

-: GerA, acc. AF250933; Wu S, Druka A, Horvath H, Kleinhofs A, Kannangara G & von Wettstein D, 2000. Functional characterization of seed coat-specific members of the barley germin gene family. Plant Phys Biochem 38, 685-698

-: OsR0C1, acc. AP004656

-: RTBV, acc. AAV62708, AAV62707; Klöti, A, Henrich C, Bieri S, He X, Chen G, Burkhardt PK, Wünn J, Lucca, P, Hohn, T, Potrykus I & Fütterer J, 1999, Upstream and downstream sequence elements determine the specificity of the rice tungro bacilliform virus promotor and influence RNA production after transcription initiation. PMB 40, 249-266

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En una modalidad la epidermis se distingue porque todos los promotores mencionados son activos en el tejido o en la célula. En otra modalidad la epidermis se distingue porque sólo una parte de los promotores es activa, por ejemplo 2, 3, 5 ó 7 ó más, aunque al menos uno de los arriba enumerados.

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En una modalidad el mesófilo se caracteriza bioquímicamente. El mesófilo puede distinguirse en una modalidad por la actividad de uno o más de los siguientes promotores:

-: PPCZm1 (=PEPC); Kausch, A.P., Owen, T.P., Zachwieja, S.J., Flynn, A.R. and Sheen, J. (2001) Mesophill-specific, light and metabolic regulation of the C(4) PPCZm1 promotor in transgenic maize. Plant Mol. Biol. 45, 1-15

-: OsrbcS, Kyozuka et al PlaNT Phys: 1993 102: Kyozuka J, NcElroy D, Hayakawa T, Xie Y, Wu R & Shimamoto K. 1993. Light-regulated and cell-specific expression of tomato rbcs-gusA and rice rbcs-gusA fusion genes in transgenic rice. Plant Phys 102, 991-1000

-: OsPPDK, acc. AC099041, no publicado

-: TaGF-2.8, acc. M63223; Schweizer, P., Christoffel, A. and Dudler, R. (1999). Transient expression of members of the germin-like gene family in epidermal cells of wheat confers disease resistance, Plant J 20, 541-552.

-: TaFBPase, acc. X53957; no publicado

-: TaWIS1, acc. AF467542; US 200220115849

-: HvBIS1, acc. AF467539; US 200220115849

-: ZmMIS1, acc. AF467514; US 200220115849

-: HvPR1a, acc. X74939; Bryngelsson et al. Molecular Plant-Microbe Interactions (1994)

-: HvPR1b, acc. X74940; Bryngelsson et al. Molecular Plant-Microbe Interactions (1994)

-: HvB1, 3gluc; acc. AF479647; no publicado

-: HvPrx8, acc. AJ276227; Kristensen et al MPP 2001 (véase arriba)

-: HvPAL, acc. X97313; Wei, Y.; Zhang, Z.; Andersen,C.H.; Schmelzer,E.; Gregersen, P.L.; Collinge, D.B.; Smedegaard-Petersen, V.; Thordal-Christensen,H. (1998) An epidermis/papilla-specific oxalate oxidase-like protein in the defence response of barley attacked by the powdery mildew fungus. Plant Molecular Biology 36, 101-112.

En una modalidad el mesófilo se distingue porque todos los promotores mencionados están activos en el tejido o en la célula. En otra modalidad el mesófilo se distingue porque solo una parte de los promotores es activa, por ejemplo 2, 3, 5 ó 7 o más, aunque por lo menos uno de los arriba enumerados.

En una modalidad en un vegetal usado o producido de acuerdo con la invención o en un vegetal de acuerdo con la invención en la epidermis y en el mesófilo todos los promotores mencionados son activos. En una modalidad solo una parte de los promotores mencionados son activos, por ejemplo 2, 5, 7 o más, aunque al menos uno de los promotores arriba enumerados es respectivamente activo.

En una modalidad preferida el incremento de la cantidad de proteína de la proteína BI1 se realiza de manera específica para la raíz, el tubérculo o el mesófilo, de manera particularmente preferida específica para mesófilo, por ejemplo mediante expresión recombinante de una secuencia de ácido nucleico que codifica para dicha proteína BI1 bajo el control de un promotor específico para raíz, tubérculo o mesófilo, preferiblemente bajo el control de un promotor específico para mesófilo.

En una modalidad, tal como se describe aquí, se incrementa la expresión o función de la proteína según la invención o de su BI1 en el mesófilo de un vegetal. Un incremento de la expresión puede lograrse tal como se describe abajo. Por incremento de la expresión se entiende aquí tanto la activación como el aumento de la expresión de la proteína endógena, incluyendo una expresión de novo como también un incremento o aumento mediante la expresión de una proteína o factor transgénicos.

En una modalidad particularmente preferida, el incremento de la cantidad de proteína de al menos una proteína vegetal BI1 puede combinarse con un fenotipo resistente a mlo o con la inhibición o reducción, en comparación con una planta de control, de la expresión de MLO, RacB y/o NaOx en la planta o en una parte de la misma, por ejemplo en un tejido, aunque de manera particularmente ventajosa en la epidermis o en una parte esencial de las células de la epidermis y/o con el incremento de la expresión de PEN2 y/o PEN1 en la planta, por ejemplo de manera constitutiva, o en una parte de la misma, por ejemplo en un tejido, aunque de manera particularmente ventajosa al menos en la epidermis o en una parte esencial de las células de epidermis, con la condición de que la expresión de una proteína vegetal BI1 en la epidermis de la hoja permanece esencialmente inmodificada o se reduce y de esa manera se logra una resistencia combinada contra patógenos tanto necrotróficos como también biotróficos.

El locus Mlo ha sido descrito en cebada como regulador negativo de defensa patógena. La pérdia, o pérdida de función ("loss-of-function"), del gen Mlo condiciona una resistencia elevada, no específica para raza, frente a una cantidad de aislados de mildiu (Büschges R et al. (1997) Cell 88:695-705; Jorgensen JH (1977) Euphytica 26:55-62; Lyngkjaer MF et al. (1995) Plant Pathol 44:786-790). El gen Mlo está descrito (Büschges R et al. (1997) Cell 88:695-705; WO 98/04586; Schulze-Lefert P, Vogel J (2000) Trends Plant Sci. 5:343-348). Se han aislado diversos homólogos de Mlo-Homologe de otras especies de cereales. Un fenotipo resistente a mlo puede obtenerse tal como se describe en el estado de la técnica. Los métodos en los que se usan estos genes para lograr una resistencia patógena se describen, entre otros, en WO 98/04586; WO 00/01722; WO 99/47552.

Ventajosamente, en una modalidad de la presente invención, puede inhibirse la actividad o la expresión de MLO, RacB y/o NaOx en la planta o en una parte de la misma, por ejemplo en un tejido, aunque de manera particularmente ventajosa al menos en la epidermis o en una parte esencial de las células de la epidermis o reducirse en comparación con una planta de control o una parte de la misma. Reduciendo la actividad de MLO, RacB y/o NaOx en la planta o en una parte de la misma, por ejemplo en un tejido, aunque de manera particularmente ventajosa al menos en la epidermis o en una parte esencial de las células de la epidermis, se eleva preferiblemente la resistencia o la fuerza de resistencia frente a patógenos biotróficos en las plantas producidas de acuerdo con la invención. En combinación con una reducción o supresión de la muerte celular necrótica esto es particularmente ventajoso. La actividad de MLO, RacB y/o NaOX puede reducirse o inhibirse de manera análoga a lo que se ha descrito para MLO en WO 98/04586; WO 00/01722; WO 99/47552 y las otras publicaciones mencionadas más abajo, en particular para describir la actividad e inhibición de MLO. La descripción de las publicaciones mencionadas describe proceso, métodos y modalidades particularmente preferidas para disminuir o inhibir la actividad o la función de MLO, los ejemplos indican concretamente cómo puede llevarse esto a cabo. La reducción de la actividad, opcionalmente de la expresión de RacB se describe detalladamente en la WO 2003020939. La descripción de la publicación mencionada describe procesos y métodos para disminuir o inhibir la actividad de BI-1, los ejemplos indican concretamente cómo puede llevarse a cabo esto. Particularmente se prefiere llevar a cabo la reducción o inhibición de la actividad o función de RacB según las modalidades y los ejemplos particularmente preferidos en la WO 2003020939 y los organismos allí representados como particularmente preferibles, en particular en una planta o en una parte de la misma, por ejemplo un tejido, aunque de manera particularmente ventajosa al menos en la epidermis o en una parte esencial de las células de epidermis. La reducción de la actividad, opcionalmente de la expresión de RacB se describe detalladamente en la WO 2003020939. La persona técnica en la materia encuentra en la WO 2003020939 las secuencias que codifican para proteínas de RacB y también pueden identificar RacB por medio del método puesto a disposición en la WO 2003020939. La reducción de la actividad, opcionalmente de la expresión de NaOX se describe detalladamente en la PCT/EP/03/07589. La descripción del paso mencionado describe procesos y métodos para la reducción o inhibición de la actividad de NaOx, los ejemplo indican concretamente cómo puede llevarse a cabo esto. Particularmente se prefiere realizar la reducción o inhibición de la actividad de NaOx según las modalidades particularmente preferidas en la PCT/EP/03/07589 y en los ejemplos y en los organismos allí representados como particularmente preferidos, en especial en una planta o en una parte de la misma, por ejemplo en un tejido, aunque de manera particularmente ventajosa al menos en la epidermis o en una parte esencial de las células de epidermis. La persona técnica en la materia encuentra en la PCT/EP/03/07589 las secuencias que codifican para proteína NaOx y puede también identificas NaOx con el método puesto a disposición en la PCT/EP/03/07589.

Ventajosamente, en una modalidad de la presente invención puede elevarse la actividad, expresión de PEN1, PEN2 y/o SNAP34 en la planta, por ejemplo de manera constitutiva, o en una parte de la misma, por ejemplo en un tejido, aunque de manera particularmente ventajosa en la epidermis o en una parte esencial de las células de epidermis. El incremento de la actividad, que también comprende una expresión de novo, de PEN1, PEN2 y/o SNAP 34 en la planta, por ejemplo de manera constitutiva, o en una parte de la misma, por ejemplo en un tejido, aunque de manera particularmente ventajosa al menos en la epidermis o una parte esencial de las células de epidermis también elevará preferiblemente la resistencia o la fuerza de resistencia frente a los patógenos biotróficos en las plantas producidas según la invención. En combinación con una reducción o una supresión de la muerte celular necrótica, esto es particularmente ventajoso. El incremento de la actividad, opcionalmente la expresión de PEN2 está descrita detalladamente en la WO03074688. La descripción de la publicación mencionada describe procesos y métodos para la disminución o inhibición de PEN2, los ejemplos indican de manera concreta cómo se puede realizar esto. Particularmente se prefiere realizar la reducción o inhibición de la actividad o función de PEN2 según las modalidades particularmente preferidas y los ejemplos y los organismos representados en WO03074688 como particularmente preferidos, en especial en plantas, por ejemplo de manera constitutiva o en una parte de las mismas, por ejemplo en un tejido, aunque de manera particularmente ventajosa al menos en la epidermis o en una parte esencial de las células de epidermis. La persona técnica en la materia encuentra en la WO03074688 las secuencias que codifican para PEN2 y también puede identificar PEN2 con el método puesto a disposición en la WO03074688. La expresión de PEN1 y SNAP34 puede elevarse de manera análoga a los métodos descritos en la WO03074688. Con base en su conocimiento técnico general y al estado de la técnica conocido para ella, la persona técnica puede aislar y sobreexpresar secuencias de ácido nucleico y secuencias de proteína de PEN1 y SNAP34. Seq ID NO.: 39 describe la secuencia de ácido nucleico que codifica para PEN1 de cebada, la secuencia de proteína está descrita en Seq ID No.: 40. Seq ID NO.: 41 describe la secuencia de ácido nucleico que codifica para PEN1 de Arabidopsis thaliana, la secuencia de proteína se describe en Seq ID No.: 42. PEN1 de Arabidopsis thaliana se divulga bajo los (números de acceso) NM 202559 y NM 112015. El homólogo de cebada se divulga como ROR2 en números de acceso AY246907 y AY246906. Se trata de miembros de la familia bastante grande de las proteínas syntaxina. La persona técnica en la materia puede identificar de esta manera, mediante simple homología, a otras proteínas syntaxina, las cuales se expresan como genes de resistencia potenciales en el proceso de acuerdo con la invención.

Seq ID NO.: 43 describe la secuencia de ácido nucleico que codifica para SNAP34 de cebada, la secuencia de proteína está descrita en Seq ID No.: 44. El homólogo SNAP-34 de cebada también está divulgado bajo AY 247208 (SNAP-34). Se encuentran divulgados homólogos de función desconocida que pueden desempeñar un papel en la resistencia bajo AY 247209 (SNAP-28) y AY 247210 (SNAP-25). Los siguientes genes de arabidopsis muestran una homología superior con la cebada SNAP34 que las cebadas SNAP-28 o SNAP-25 con SNAP-34 y de esta manera pueden co-sobreexpresarse ventajosamente como genes potenciales que inducen resistencia:

: AAM 62553 - Arabidopsis SNAP25a

: NP 200929 - Arabidopsis SNAP33b

: NP 172842 - Arabidopsis SNAP30

: NP 196405 - Arabidopsis SNAP29

Por consiguiente, la invención también se refiere a una planta en la que, en la epidermis, se sobre-expresa al menos adicionalmente un polipéptido que se codifica por una molécula de ácido nucleico que comprende las secuencias de aminoácido mostradas en Seq. ID No.: 39, 41 o 43 o una de las secuencias mostradas en las publicaciones de banco de datos mencionadas o que comprende las secuencias mostradas en Seq. ID No.: 40, 42 o 44 o una de las secuencias mostradas en las publicaciones mencionadas de banco de datos, o que comprende un equivalente funcional de la misma o que tiene una homología de al menos 50%, preferible 70%, más preferible 80%, aún más preferible 90% o más con las secuencias nombradas al nivel de la molécula codificante de ácido nucleico o preferible a nivel de aminoácido, o una planta en la que, de manera constitutiva o en una parte, por ejemplo un tejido, aunque de manera particularmente ventajosa al menos en la epidermis o en una parte esencial de las células de epidermis, se activa el polipéptido caracterizado previamente o se eleva su actividad.

Puede efectuarse una reducción de la expresión o actividad mediante métodos corrientes para la persona técnica en la materia, por ejemplo mutagénesis, por ejemplo EMS, opcionalmente Tilling, iRNA; ribozymas, silencing, knockout, etc. En especial se describen métodos para la reducción en WO 2003020939, cuyos métodos pueden fácilmente ajustarse a las secuencias aquí descritas.

La reducción o disminución de la expresión de una proteína BI-1 o de la actividad BI-1 puede realizarse de un tipo y una forma variados.

"Reducción", "reducir", "disminución" o "disminuir" debe entenderse en el sentido amplio en conexión con una proteína BI-1 o una actividad BI-1 y comprende la prevención o bloqueo parcial o esencialmente completa de la funcionalidad de una proteína BI-1 como resultado de diferentes mecanismos biológicos de la célula. Una disminución en el sentido de la invención también comprende una reducción cuantitativa de una proteína BI-1 hasta una ausencia esencialmente completa de la proteína BI-1 (es decir, la falta de capacidad de detección de actividad de BI-1 o función de BI-1 o falta de capacidad de detección inmunológica de la proteína BI-1). En este contexto, la expresión de una determinada proteína BI-1 o de la actividad BI-1 en una célula o un organismo se reduce en más de 50%, particularmente preferible en más de 80%, muy particularmente preferible en más de 90%.

De acuerdo con la invención están comprendidas diversas estrategias para la reducción de la expresión de una proteína BI-1 o de la actividad BI-1. La persona técnica en la materia reconoce que hay disponibles una serie de diversos métodos para influir la expresión de una proteína BI-1 o la actividad de BI-1 de una manera deseada.

Una disminución de la actividad BI-1 se logra preferiblemente mediante una expresión reducida de una proteína endógena BI-1.

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Una disminución de la cantidad de proteína BI-1, o de la actividad BI-1 puede realizarse usando los siguientes métodos:

a): introducción de una secuencia de aminoácido de ARN BI-1 bicatenaria (BI-1-dsRNA) o de uno o unos casetes de expresión que asegura(n) la expresión de la misma;

b): introducción de una secuencia de ácido nucleico antisense BI-1 o de un casete de expresión que garantice la expresión de la misma. Están comprendidos aquellos métodos en los que la secuencia de ácido nucleico antisense está dirigida contra un gen BI-1 (es decir, secuencias de ADN genómicas) o un transcripto de gen de BI-1 (es decir, secuencias de ARN). También están comprendidas secuencias de ácido nucleico \alpha-anoméricas.

c): Introducción de una secuencia de ácido nucleico antisense BI-1 combinada con una ribozima o un casete de expresión que garantice su expresión.

d): introducción de secuencias de ácido nucleico sense BI-1 para la inducción de una co-supresión o de un casete de expresión que garantice su expresión.

e): introducción de una secuencia de ácido nucleico que codifique para proteína BI-1 dominante-negativa o de un casete de expresión que garantice su expresión.

f): Introducción de factores enlazantes de ADN o de proteína contra genes, ARNs o proteínas de BI-1 o un casete de expresión que asegura su expresión.

g): Introducción de las secuencia de ácido nucleico virales que provocan la degradación de ARN de BI-1 y constructos de expresión o de un casete de expresión que asegura su expresión.

h): Introducción de constructos para la inducción de una recombinación homóloga en genes endógenes de BI-1, por ejemplo para la generación de mutantes knockout.

i): Introducción de mutantes en genes endógenos de BI-1 para la generación de una pérdida de función (por ejemplo, generación de codones stop, translaciones en el marco de lectura, etc.)

y cada uno de los métodos nombrados debe ser realizado de manera específica para la epidermis; es decir, la expresión en el tejido de epidermis permanece sin modificar o se reduce. En tal caso, cada uno de esto métodos individuales puede provocar una reducción de la expresión de BI-1 o de la actividad de BI-1 en el sentido de la invención. También es concebible una aplicación combinada. Otros métodos son conocidos para la persona técnica en la materia y pueden comprender el bloqueo o prevención del procesamiento de la proteína BI-1, del transporte de la proteína BI-1 o de su mRNPr, inhibición de la adhesión a ribosomas, inhibición de empalme de ARN, inducción de una enzima que degrada ARN BI-1 y/o inhibición de la elongación o terminación de la translación.

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La reducción específica para epidermis puede efectuarse, por ejemplo, mediante una aplicación transitoria de los métodos nombrados en las células de epidermis o mediante una transformación específica de esencialmente solo células de epidermis o mediante control de expresión de los constructos descritos bajo un promotor específico de epidermis u otro elemento de control específico para epidermis.

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Los métodos individuales preferidos se describirán brevemente a continuación:

a) Introducción de una molécula de ácido nucleico ARN BI-1 bicatenaria (BI-1-dsRNA)

El método de la regulación de genes por medio de ARN bicatenario ("double-stranded RNA interference"; dsRNAi) ha sido descrito repetidamente en organismos animales y vegetales (por ejemplo, Matzke MA et al. (2000) Plant Mol Biol 43: 401-415; Fire A. et al (1998) Nature 391:806-811; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364). Los procesos y métodos descritos en las citas de arriba se toman expresamente como referencia. Una supresión de genes eficiente también puede mostrarse en el caso de una expresión transitoria o después de una expresión transitoria como resultado de una transformación biolística (Schweizer P et al. (2000) Plant J 2000 24: 895-903). Los métodos dsRNAi se basan en el fenómeno de que una introducción simultánea de una cadena y contra-cadena complementarias de un transcripto génico provoca una supresión altamente eficiente de la expresión del gen correspondiente. El fenotipo originado es muy similar a un correspondiente mutante knock-out (Waterhouse PM et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95: 13959-64). El método de dsRNAi ha demostrado se especialmente eficiente y ventajoso para reducir expresión. Tal como se describe, entre otros, en WO 99/32619, los planteamientos de dsRNAi sobrepasan de manera significativa los planteamientos antisense clásicos. Otro objeto de la invención se refiere por lo tanto a moléculas de ARN bicatenarias (moléculas de dsRNA) que provocan la reducción de una BI-1 al introducir en una planta (o en una célula derivada de la misma, un tejido, órganos, especialmente epidermis de la hoja). La molécula de ARN bicatenaria para la reducción de la expresión de una proteína BI-1 se caracteriza porque

a): una de las dos cadenas de ARN es esencialmente idéntica a al menos una parte de una secuencia de ácido nucleico BI-1, y

b): la otra cadena respectiva de ARN es esencialmente idéntica a al menos una parte de la cadena complementaria de una secuencia de ácido nucleico BI-1.

En otra modalidad preferida, la molécula de ARN bicatenaria para la reducción de la expresión de una proteína BI-1 comprende

a): una cadena de ARN "sense" que comprende al menos una secuencia de ribonucleótido que en esencia es idéntica a al menos una parte del transcripto de ARN "sense" de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína BI-1, y

b): una cadena de ARN "antisense" que es esencialmente - preferiblemente completamente - complementaria a la cadena de ARN sense de a).

Con respecto a la molécula de ARN bicatenaria, la molécula de ARN bicatenaria se refiere a una secuencia de ácido nucleico BI-1, preferible a una secuencia según SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 ó 38 o un equivalente funcional de las mismas.

"Esencialmente idéntico" significa que la secuencia de dsRNA también puede presentar inserciones, deleciones, así como mutaciones individuales puntuales en comparación con la secuencia destino BI-1 y, no obstante, provocar una reducción eficiente de la expresión. Según la definición de arriba, la homología es preferiblemente de al menos 50% ó 75%, preferible de al menos 80%, muy particularmente preferible de al menos 90%, lo más preferible 100% entre la cadena "sense" de un dsARN inhibitorio y un segmento parcial de una secuencia de ácido nucleico BI-1 (o entre la cadena "antisense" de la cadena complementaria de una secuencia de ácido nucleico BI-1). La longitud del segmento parcial es de al menos 10 bases, preferiblemente de al menos 256 bases, particularmente preferible de al menos 50 bases, muy particularmente preferible de al menos 100 bases, lo más preferible de al menos 200 bases o al menos 300 bases. De manera alternativa, un dsARN "esencialmente idéntico" también puede definirse como secuencia de ácido nucleico que es capaz de hibridar con una parte de un transcripto génico BI-1 (por ejemplo en NaCl de 400 mM, PIPES de 40 mM, pH 6,4, EDTA de 1 mM a 50ºC o 70ºC durante 12 a 16 h).

"Esencialmente complementario" significa que la cadena de ARN antisense también puede presentar inserciones, deleciones, así como mutaciones individuales de punto en comparación con el complemento de la cadena de ARN "sense". La homología es preferiblemente de al menos 80%, preferiblemente de al menos de 90%, muy particularmente preferible de al menos 95%, lo más preferible 100% entre la cadena de ARN "antisense" y el complemento de la cadena de ARN "sense".

"Parte del trancripto "sense"de ARN" de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína BI-1 o un equivalente funcional de la misma significan fragmentos de un ARN o mARN transcrito de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína BI-1 o un equivalente funcionales de la misma, preferible de un gen BI-1. En tal caso los fragmentos tienen preferiblemente una longitud de secuencia de al menos 20 bases, preferiblemente de al menos 50 bases, particularmente preferible de al menos 100 bases, muy particularmente preferible de al menos 200 bases, lo más preferible de al menos 500 bases. También está comprendido ARN o mARN totalmente transcrito. También está comprendido el uso de las moléculas de dsARN de acuerdo con la invención en los procesos de la invención para la generación de una resistencia patógena en las plantas. EL dsARN puede componerse de una o más cadenas de ribonucleótidos polimerizados. Además, pueden estar presentes modificaciones tanto de la estructura de azúcar -fosfato como también de los nucleósidos. Por ejemplo, los compuestos fosforo-diestéricos del ARN natural pueden estar modificados en tal sentido que comprendan al menos un heteroátomo de nitrógeno o de azufre.

Las bases pueden modificarse de tal manera que se restrinja la actividad de adenosindeaminasa, por ejemplo. Tales y otras modificaciones se describen más aún en lo sucesivo en el método para estabilizar ARN-antisense. Para lograr el mismo propósito, por supuesto también pueden introducirse a las células o al organismo varias moléculas individuales de dsARN que comprenden respectivamente uno de los fragmentos de secuencia de ribonucleotido arriba definidos.

El dsARN puede prepararse de manera enzemática o por síntesis química, total o parcialmente.

La estructura bicatenaria de dsARN puede formarse a partir de dos cadenas de ARN complementarias, separadas o, preferiblemente, a partir de una cadena individual de ARN auto-complementaria. La estructura bicatenaria puede formarse a partir de una cadena individual auto complementaria o a partir de dos cadenas complementarias. En el caso de una cadena individual autocomplementaria, pueden ligarse una secuencia "sense" y una "antisense" por medio de una secuencia enlazante ("linker") y formar, por ejemplo, una estructura de horquilla para pelo. La secuencia enlazante puede ser un intron que se empalma hacia afuera después de la síntesis del dsARN. La secuencia de ácido nucleico que codifica para un dsRNA puede contener otros elementos como, por ejemplo, señales de terminación de transcripción o señales de poliadenilación. Si las dos cadenas del dsARN deben combinarse en una célula o planta, esto puede suceder de maneras diferentes:

La secuencia de ácido nucleico que codifica para un dsRNA puede contener otros elementos, como por ejemplo señales de terminación de transcripción o señales de poliadenilación.

Si las dos cadenas del dsRNA deben combinarse en una célula o una planta, esto puede suceder de diferentes maneras:

a): Transformación de la célula o planta con un vector que comprende ambos casetes de expresión,

b): Cotransformación de la célula o de la planta con dos vectores donde uno comprende los casetes de expresión con la cadena "sense", el otro comprende los casetes de expresión con la cadena "antisense".

c): Cruce de dos plantas que han sido transformadas respectivamente con un vector donde uno comprende los casetes de expresión con la cadena "sense" y el otro comprende los casetes de expresión con la cadena "antisense".

La formación del dúplex ARN puede iniciarse o bien fuera de la célula o bien dentro de la misma. Como en la WO 99/53050, el dsRNA también puede comprender una estructura de horquilla de pelo enlazándose las cadenas "sense" y "antisense" mediante un "linker" (por ejemplo un intron). Las estructuras de dsARN autocomplementarias se prefieren por cuanto solo requieren la expresión de un constructo y siempre comprenden las cadenas complementarias en una proporción de equimolar.

Los casetes de expresión que codifican para la cadena "antisense" o "sense" de un dsRNA o para la cadena autocomplementaria del dsARN se insertan preferiblemente a un vector y se insertan establemente en el genoma de una planta con el método descrito abajo (usando, por ejemplo, marcadores de selección) bajo el control de un promotor específico para epidermis tal como se ilustra en la presente, con el fin de asegurar una expresión duradera del dsARN en la epidermis. El dsARN puede introducirse usando una cantidad que haga posible al menos una copia por célula. Cantidades superiores (por ejemplo, al menos 5, 10, 100, 500 o 1000 copias por célula) pueden opcionalmente provocar una reducción eficiente.

Como ya se ha descrito, una identidad de secuencia del 100% entre dsARN y un transcripto génico BI-1 o el transcripto génico de un gen funcional equivalente no es obligatoriamente necesario para provocar una reducción eficiente de la expresión de BI-1. Por lo tanto, la ventaja consiste en que el método es tolerante frente a desviaciones de secuencia, como pueden presentarse a causa de mutaciones genéticas, polimorfismos o divergencias evolutivas. Así, es posible que con el dsRNA, que ha sido generado a partir de la secuencia de BI-1 de un organismo, que se suprima la expresión de BI-1 en el otro organismo. La alta homología de secuencia entre las secuencias BI-1 de arroz, maíz y cebada permite concluir que esta proteína se conserva en un alto grado dentro de las plantas de modo que la expresión de un dsARN derivado de una de las secuencias divulgadas de BI-1 tal como se muestra en SEQ ID No: 1, 3 ó 5 parezca tener también un efecto ventajoso en otras especies de plantas. También es posible que debido a la alta homología entre las proteínas BI-1 y sus equivalentes funcionales con un único dsARN que se haya generado a partir de una secuencia BI-1 determinada de un organismo, se suprima la expresión de otras proteínas BI-1 homólogas y/o sus equivalentes funcionales del mismo organismo aunque también la expresión de proteínas BI-1 en otros tipos similares.

Para este propósito el dsARN comprende preferiblemente la región de secuencia de transcriptos génicos BI-1 que corresponden a las regiones conservadas. Dichas regiones conservadas pueden fácilmente derivarse de comparaciones de secuencias. El dsARN puede sintetizarse o bien in vivo, o in vitro. Para esto, puede introducirse una secuencia de ADN que codifica para un dsARN en un casete de expresión bajo control de al menos un elemento genético de control (como, por ejemplo, promotor, enhancer, silencer, donador o aceptador splice (de empalme)); se desea una expresión específica de epidermis del dsARN. De manera correspondiente, abajo se siguen describiendo construcciones ventajosas. No se requiere poliadenilación ni tampoco deben estar presentes elementos para iniciar una translación.

Un dsARN puede sintetizarse química o enzimáticamente. Para este propósito pueden usarse polimerasas celulares de ARN o polimerasas bacteriófagas de ARN (como, por ejemplo, polimerasa de ARN T3, T7 o SP6). Se describen métodos correspondientes para la expresión in vitro de ARN (WO 97/32016; US 5,593,874; US 5,698,425, US 5,712,135, US 5,789,214, US 5,804,693). Un dsARN sintetizado in vitro química o enzimáticamente puede purificarse total o parcialmente antes de la introducción a una célula, tejido u organismo, por ejemplo mediante extracción, precipitación, electroforesis, cromatografía o combinaciones de estos métodos. El dsARN puede introducirse directamente a la célula o también puede aplicarse extracelularmente (por ejemplo, en el espacio intersticial). Aunque preferiblemente se transforma la planta de manera estable con una construcción de expresión que realiza la expresión del dsARN en la epidermis. Debajo se siguen describiendo los métodos correspondientes.

b) Introducción de una molécula de ácido nucleico BI-1 antisense

Los métodos para la supresión de una proteína específica mediante la prevención de la acumulación de su mARN por tecnología "antisense", también en plantas, se describen copiosamente (Sheehy et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85: 8805-8809; US 4,801,340; Mol JN et al. (1990) FEBS Lett 268(2):427-430). La molécula de ácido nucleico antisense hibrida o enlaza con el mARN celular y/o ADN genómico que codifica para la proteína destino BI-1 a suprimirse. De esta manera se suprime la transcripción y/o translación de la proteína destino. La hibridación puede originarse de manera convencional por la formación de un dúplex estable o - en el caso de ADN genómico - por el enlace de la molécula de ácido nucleico anti-sense con el dúplex del ADN genómico mediante interacción específica en el gran surco de la hélice de ADN. La introducción se efectúa de tal manera que se reduce la cantidad o función específicamente en la epidermis, por ejemplo mediante transformación transitoria de la epidermis o transformación estable bajo control de la expresión de una construcción correspondiente con un promotor específico de epidermis. Una secuencia de ácido nucleico antisense adecuada para la reducción de una proteína BI-1 puede derivarse usando la secuencia de ácido nucleico que codifica para esta proteína, por ejemplo la secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 o 38 o que codifica para un equivalente funcional del mismo según las reglas de pares de bases de Watson y Crick. La secuencia de ácido nucleico antisense puede ser complementaria a todo el mARN transcrito de la dicha proteína, limitarse a la región codificante o componerse solo de un oligonucleótido, que es complementario parcialmente a la secuencia codificante o no codificante del mARN. Así, el oligonucleótido puede ser complementario, por ejemplo, a la región que comprende el inicio de traslación para la proteína dicha. Las secuencias de ácido nucleico antisense pueden tener, por ejemplo, una longitud de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos, pero también pueden ser más largas y comprender al menos 100, 200, 500, 1000, 2000 o 5000 nucleótidos. Las secuencias de ácido nucleico antisense pueden expresarse de manera recombinante o sintetizarse química o enzimáticamente usando métodos conocidos por la persona técnica en la materia. En la síntesis química pueden usarse nucleótidos naturales o modificados. Los nucleótidos modificados pueden dar una estabilidad bioquímica elevada a la secuencia de ácido nucleico antisense y conducir a una estabilidad física elevada del dúplex formado a partir de secuencia de ácido nucleico antisense y secuencia destino de ácido nucleico sense. Pueden usarse, por ejemplo, derivados de fosforotioato y nucleótidos acridina-sustituidos tales como 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, \beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, \beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosine, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, 5-metil-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo y 2,6-diaminopurina. En otra modalidad preferida, la expresión de una proteína BI-1 puede inhibirse por secuencias de nucleótidos que son complementarias a la región regulatoria de un gen BI-1 (por ejemplo, a un promotor BI-1 y/o enhancer) y forman estructuras de triple hélice con el ADN de hélice doble de allí, de tal modo que se reduce la transcripción del gen BI-1. Se describen métodos correspondientes (Helene C (1991) Anticancer Drug Res 6(6):569-84; Helene C et al. (1992) Ann NY Acad Sci 660:27-36; Maher LJ (1992) Bioassays 14(12): 807-815). En otra modalidad la molécula de ácido nucleico puede ser un ácido nucleico \alpha-anomérico. Moléculas de ácido nucleico \alpha-anomérico de tal tipo forman híbridos bicatenarios específicos con ARN complementario en los cuales las dos cadenas corren paralelas una hacia a la otra, a diferencia de los ácidos \beta-nucleicos convencionales. (Gautier C et al. (1987) Nucleic Acids Res 15:6625-6641). La molécula antisense de ácido nucleico también puede contener además 2'-O-metilribonucleótidos (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res 15:6131-6148) o análogos quiméricos de ARN-ADN (Inoue et al. (1987) FEBS Lett 215:327-330).

c) Introducción de una molécula antisense de ácido nucleico BI-1 combinada con una ribozima

La estrategia antisense arriba descrita puede acoplarse ventajosamente con un método de ribozima. Las moléculas de ARN catalíticas o ribozimas pueden ajustarse a cualquier ARN destino y partir el esqueleto del fosfodiéster en posiciones específicas, por lo cual el ARN destino se desactiva funcionalmente (Tanner NK (1999) FEMS Microbiol Rev 23(3):257-275). El ribozima no se modifica por sí mismo de esta manera sino que es capaz de partir otras moléculas de ARN destino de manera análoga, por lo cual obtiene las propiedades de una enzima. La incorporación de secuencias de ribozima en ARNs "antisense" les confiere a estos ARNs "antisense" esta propiedad enzimática que parte ARN y aumenta así su eficiencia en la inactivación del ARN destino. La preparación y uso de moléculas correspondiente de ribozima - ARN "antisense" se describe, por ejemplo en Haseloff et al. (1988) Nature 334: 585-591. De este modo los ribozimas (por ejemplo, ribozimas "Hammerhead" (cabeza de martillo); Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334:585-591) pueden usarse para partir el mARN de una enzima a suprimirse - por ejemplo de manera catalítica BI-1 e impedir la traslación. La tecnología de ribozima puede elevar la eficiencia de una estrategia antisense. En EP 0 291 533, EP 0 321 201, EP 0 360 257 se describen métodos para la expresión de ribozomas para la reducción de determinadas proteínas. En células vegetales también se describe una expresión de ribozima (Steinecke P et al. (1992) EMBO J 11(4):1525-1530; de Feyter R et al. (1996) Mol Gen Genet. 250(3):329-338). Secuencias destino y ribozimas adecuadas pueden determinarse, por ejemplo, tal como se describe en "Steinecke P, Ribozyme, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al. eds, Academic Press, Inc. (1995), S. 449-460", mediante cálculos estructurales secundarios de ARN de ribozima y destino, así como su interacción (Bailey CC et al. (1992) Plant Mol Biol. 18(2):353-361; Lloyd AM and Davis RW et al. (1994) Mol Gen Genet. 242(6):653-657). A manera de ejemplo pueden construirse derivados de la tetrahimena L-19 IVS RNA que presentan regiones complementarias al mARN de la proteína BI-1 a suprimirse (véase también US 4,987,071 y US 5,116,742). De manera alterna, tales ribozimas también pueden identificarse por un proceso de selección a partir de una biblioteca de diversos ribozimas (Bartel D y Szostak JW (1993) Science 261:1411-1418). La expresión se realiza, por ejemplo, bajo el control de un promotor específico de epidermis.

d) Introducción de una molécula de ácido nucleico sense BI-1 para la inducción de una co-supresión

La expresión específica de epidermis de una molécula de ácido nucleico BI-1 en orientación sense puede conducir a una co-supresión del gen endógeno homólogo correspondiente en las células de epidermis. La expresión de ARN sense con homología hacia un gen endógeno puede reducir o eliminar la expresión del mismo de manera similar a como se ha descrito para planteamientos antisense (Jorgensen et al. (1996) Plant Mol Biol 31(5):957-973; Goring et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:1770-1774; Smith et al. (1990) Mol Gen Genet 224:447-481; Napoli et al. (1990) Plant Cell 2:279-289; Van der Krol et al. (1990) Plant Cell 2:291-99). En tal caso, la construcción introducida puede representar total o sólo parcialmente al gen a reducir. La posibilidad de traslación no es indispensable. La aplicación de esta tecnología en plantas se describe, por ejemplo, en Napoli et al. (1990) The Plant Cell 2: 279-289 y en US 5,034,323. Se prefiere la co-supresión usando una secuencia que es esencialmente idéntica a al menos una parte de la secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína BI-1 o un equivalente funcional de la misma, a manera de ejemplo de la secuencia de ácido nucleico según SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 o 38 o de la secuencia de ácido nucleico que codifica para un equivalente funcional de la misma.

e) Introducción de moléculas de ácido nucleico que codifican para una proteína BI-1 dominante-negativa

La función o actividad de una proteína BI-1 también puede reducirse de manera efectiva mediante expresión epidermis - específica de una variante dominante negativa de esta proteína BI-1 en células de epidermis. Para la persona técnica en la materia son conocidos los métodos para reducción de la función o de la actividad de una proteína mediante la co-expresión de su forma dominante - negativa (Lagna G y Hemmati-Brivanlou A (1998) Current Topics in Developmental Biology 36:75-98; Perlmutter RM y Alberola-Ila J (1996) Current Opinion in Immunology 8(2):285-90; Sheppard D (1994) American Journal of Respiratory Cell & Molecular Biology. 11(1):1-6; Herskowitz I (1987) Nature 329(6136):219-22). El aminoácido a mutarse preferiblemente en homólogos BI-1 de otros tipos puede determinarse, por ejemplo, mediante comparación apoyada en ordenador ("alignment"). Estas mutaciones para alcanzar una variante BI-1 dominante-negativa se llevan a cabo, preferiblemente, al nivel de la secuencia de ácido nucleico que codifica para proteínas BI-1. Una mutación correspondiente puede realizarse por ejemplo mediante mutagénesis in vitro determinada por PCR usando primer de oligonucleótido a través del cual se introduce la mutación deseada. Para este propósito se usan métodos corrientes para la persona versada en la materia. Por ejemplo, para este propósito puede usarse el "LA PCR in vitro Mutagenesis Kit" (Takara Shuzo, Kyoto). Un método para la preparación de una variante dominante-negativa de una proteína RacB-Proteins de maíz se describe también en WO 00/15815 (ejemplo 4, pág. 69). La expresión de un mutante así puede realizarse entonces, por ejemplo, bajo el control de un promotor específico de epidermis.

f) Introducción de factores enlazantes de ADN o proteína frente a genes BI-1, ARNs BI-1 o proteínas BI-1

También es posible una reducción de una expresión de gen BI-1 en la epidermis con factores específicos que enlazan ADN, por ejemplo con factores del tipo de factores de transcripción de dedo de cinc. Estos factores se alojan en la secuencia genómica del gen endógeno de destino, preferible en las regiones regulatorias y provocan una represión del gen endógeno. El uso de un método así hace posible la reducción de la expresión de un gen endógeno BI-1 sin que su secuencia deba manipularse mediante ingeniería genética. Los métodos correspondientes para la preparación de los factores correspondientes se han descrito (Dreier B et al. (2001) J Biol Chem 276(31):29466-78; Dreier B et al. (2000) J Mol Biol 303(4):489-502; Beerli RR et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97 (4):1495-1500; Beerli RR et al. (2000) J Biol Chem 275(42):32617-32627; Segal DJ and Barbas CF 3rd (2000) Curr Opin Chem Biol 4(1):34-39; Kang JS and Kim JS (2000) J Biol Chem 275(12):8742-8748; Beerli RR et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(25): 14628- 14633; Kim JS et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94 (8):3616 -3620; Klug A (1999) J Mol Biol 293(2):215-218; Tsai SY et al. (1998) Adv Drug Deliv Rev 30(1-3):23-31; Mapp AK et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(8):3930-3935; Sharrocks AD et al. (1997) Int J Biochem Cell Biol 29(12):1371-1387; Zhang L et al. (2000) J Biol Chem 275(43):33850-33860).

La selección de estos factores puede realizarse usando cualquier porción deseada de un gen BI-1. Este segmento se localiza preferiblemente en la región de promotor. Para supresión de gen, sin embargo, también puede estar en la región de los exones o intrones que codifican. Los segmentos correspondientes pueden obtenerse por parte de la persona técnica en la materia por medio de búsqueda en el banco de datos o del banco génico o a partir de un cADN BI-1 cuyo gen no está presente en el banco de genes, mediante inspección sistemática de una biblioteca genómica para hallar clones genómicos correspondientes. Los métodos requeridos para este propósito son corrientes para la persona técnica, por ejemplo estos factores pueden expresarse bajo el control de un promotor epidermis-específico u otros factores que median en la expresión epidermis-específico. Además, es posible introducir a la célula factores que inhiben la célula BI-1 de destino misma. Los factores que enlazan proteína pueden ser, por ejemplo, aptámeros (Famulok M y Mayer G (1999) Curr Top Microbiol Immunol 243:123-36) o anticuerpos o fragmentos de anticuerpos o anticuerpos de cadena única. La obtención de estos factores está descrita y son conocidos por la persona técnica en la materia. Por ejemplo, se empleó un anticuerpo scFv citoplasmático para modular la actividad de la proteína fitocroma A en plantas de tabaco modificadas (Owen M et al. (1992) Biotechnology (N Y) 10(7):790-794; Franken E et al. (1997) Curr Opin Biotechnol 8(4):411-416; Whitelam (1996) Trend Plant Sci 1:286-272).

La expresión del gen también puede suprimirse mediante compuestos sintéticos de bajo peso molecular, diseñados a la medida, como por ejemplo del tipo poliamida (Dervan PB y Bürli RW (1999) Current Opinion in Chemical Biology 3:688-693; Gottesfeld JM et al. (2000) Gene Expr 9(1-2):77-91). Estos oligómeros se componen de unidades estructurales de 3-(dimetilamino)-propilamina, N-metil-3-hidroxipirrol, N-metilimidazol y N-metilpirroles y pueden ajustarse a cada pieza del ADN bicatenario de modo que se enlacen en secuencia específica con el gran surco y bloqueen la expresión de las secuencias génicas de allí. Se describen métodos correspondientes (véanse, entre otros, Bremer RE et al. (2001) Bioorg Med Chem. 9(8):2093-103; Ansari AZ et al. (2001) Chem Biol. 8(6):583-92; Gottesfeld JM et al. (2001) J Mol Biol. 309(3):615-29; Wurtz NR et al. (2001) Org Lett 3(8):1201-3; Wang CC et al. (2001) Bioorg Med Chem 9(3): 653-7; Urbach AR y Dervan PB (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98(8):4343-8; Chiang SY et al. (2000) J Biol Chem. 275(32):24246-54).

Todos los factores mencionados se introducen de manera específica a la epidermis para asegurar una reducción de la actividad BI-1sólo en las células de epidermis, por ejemplo mediante la expresión bajo el control de un promotor específico de epidermis, tal como se nombran arriba, por ejemplo.

g) Introducción de moléculas de ácido nucleico virales que provocan la descomposición de ARN BI-1, y de los constructos de expresión correspondientes

La expresión BI-1 en la epidermis también puede realizarse efectivamente mediante inducción de la descomposición específica de ARN BI-1 en las células de epidermis con ayuda de un sistema viral de expresión (Amplikon) (Angell, SM et al. (1999) Plant J. 20(3): 357-362). Estos sistemas - denominados también como "VIGS" (viral induced gene silencing) - introducen a la planta moléculas de ácido nucleico con homología hacia los transcriptos a suprimirse por medio de vectores virales. La transcripción se interrumpe luego, supuestamente mediada por mecanismos de defensa de la planta contra virus. Se describen técnicas y métodos correspondientes (Ratcliff F et al. (2001) Plant J 25(2): 237-45; Fagard M y Vaucheret H (2000) Plant Mol Biol 43(2-3):285-93; Anandalakshmi R et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(22):13079-84; Ruiz MT (1998) Plant Cell 10(6): 937-46).

h) Introducción de constructos para la inducción de una recombinación homóloga en genes endógenos BI-1, por ejemplo para originar mutantes knock-out

Para la producción de un organismo recombinante homólogo con actividad BI-1 reducida en las células de epidermis se utiliza, por ejemplo, un constructo de ácido nucleico que contiene al menos una parte de un gen BI-1 endógeno, el cual se modifica por una deleción, adición o sustitución de al menos un nucleótido, de tal modo que reduzca la funcionalidad o se anule totalmente. La modificación también puede referirse a elementos regulatorios (por ejemplo, al promotor) del gen, de tal modo que quede sin modificar la secuencia codificante, aunque no tenga lugar una expresión (transcripción y/o traslación) y se reduzca. En la recombinación homóloga convencional, la región modificada se flanquea en sus extremos 5' y 3' con otras secuencias de ácidos nucleicos que deben tener una longitud suficiente para hacer posible la recombinación. La longitud se encuentra normalmente en un rango de algunos cientos de bases hasta varios kilobases (Thomas KR y Capecchi MR (1987) Cell 51:503; Strepp et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(8):43368-4373). Para la recombinación homóloga se transforma el organismo huésped, por ejemplo una planta, con el constructo de recombinación usando los métodos descritos abajo y se seleccionan exitosamente los clones recombinados usando, por ejemplo, una resistencia a antibióticos o a herbicidas.

La recombinación homóloga es un evento relativamente raro en las eucariotas superiores, especialmente en las plantas. Predominan las integraciones casuales con el genoma huésped. Una posibilidad de eliminar las secuencias integradas casualmente y así incrementar el número de clones de célula con una recombinación homóloga correcta es el uso de un sistema de recombinación específico de secuencia tal como se describe en US 6,110,736, por el cual pueden volverse a deletar secuencias integradas de manera no específica, lo cual facilita la selección de eventos que se han integrado exitosamente. Puede usarse un gran número de sistemas de recombinación secuencia-específica; como ejemplos se mencionan el sistema Cre/lox del bacteriofago P1, el sistema FLP/FRT de la levadura, la recombinasa Gin del fago Mu, la recombinasa Pin de E. coli y el sistema R/RS del plásmido pSR1. Se prefieren los sistemas de bacteriófagos P1 Cre/lox y de levadura FLP/FRT. Los sistemas recombinantes FLP/FRT y cre/lox se habían aplicado ya en sistemas vegetales (Odell et al. (1990) Mol Gen Genet 223: 369-378). La recombinación específica de epidermis puede asegurarse, por ejemplo, por el hecho de que la expresión de los sistemas y enzimas que inducen la recombinación se realiza bajo control de un promotor específico de epidermis.

i) Introducción de mutaciones en genes BI-1 endógenos para generar una pérdida de función (por ejemplo, generación de stop-codón, desplazamientos en la trama de lectura, etc.)

Otros métodos adecuados para la reducción de la actividad BI-1 son introducir mutaciones nonsense en genes BI-1 endógenos, por ejemplo mediante la introducción de oligonucleótidos ARN/ADN en las células de epidermis (Zhu et al. (2000) Nat Biotechnol 18(5):555-558) así como la generación de mutantes de knock-out con ayuda de, por ejemplo, mutagénesis TADN (Koncz et al. (1992) Plant Mol Biol 20(5):963-976), mutagénesis de ENU-(N-etil-N-nitrosourea) o recombinación homóloga (Hohn B y Puchta (1999) H Proc Natl Acad Sci USA 96:8321-8323.). También pueden generarse mutaciones puntuales por medio de híbridos de ADN-ARN, los cuales se conocen también como "chimeraplasty" (Cole-Strauss et al. (1999) Nucl Acids Res 27(5):1323-1330; Kmiec (1999) Gene therapy American Scientist 87(3): 240-247).

Los métodos de dsARNi, de la co-supresión mediante ARN sense y de "VIGS" ("virus induced gene silencing") también se denomina como "post-transcriptional gene silencing" (PTGS). Los métodos de PTGS, como también la reducción de la función BI-1 o actividad con variantes BI-1 dominante-negativa, son especialmente ventajosas porque los requerimientos de homología entre el gen endógeno a suprimirse y la secuencia de ácido nucleico sense o de dsARN expresada transgénicamente (o bien entre el gen endógeno y su variante dominante -negativa) son más bajos que, por ejemplo, en un planteamiento antisense. En la descripción del método dsARNI se mencionan criterios de homología correspondientes y en general pueden aplicarse a métodos de PTGS o a planteamientos dominantes-negativos. Así, usando las secuencias de ácido nucleico BI-1, probablemente también es posible suprimir de manera efectiva la expresión de proteínas BI-1 homólogas en otras especies sin que sean necesarios obligatoriamente el aislamiento y elucidación de la estructura de los homólogos BI-1 existentes. Esto aligera considerablemente el trabajo empleado. De manera análoga probablemente también pueden reducirse o suprimirse de manera efectiva la función/actividad de su homólogo en otras especies de vegetales usando variantes dominantes-negativas de una proteína BI-1.

Todas las sustancias y compuestos que provocan, directa o indirectamente, una reducción de la cantidad de proteína, cantidad de ARN, actividad de gen o actividad de proteína de una proteína BI-1, estarían comprendidos por consiguiente bajo la denominación de compuestos "anti-BI-1". El término compuesto "anti-BI-1" incluye explícitamente las secuencias de ácido nucleico, péptidos, proteínas u otros factores empleados en los métodos arriba descritos.

En el marco de la invención, "introducción" comprende todos los métodos que son adecuados para introducir, directa o indirectamente, un compuesto "anti-BI-1" en la epidermis o una parte esencial de las células de epidermis, el compartimiento o tejido de la misma o generarlo allí. Están comprendidos métodos directos e indirectos. La introducción puede conducir a una presencia temporal (transitoria) de un compuesto "anti-BI-1" (por ejemplo, de un dsARN) o también a una duradera (estable).

Según la diferente naturaleza de los planteamientos arriba descritos, el compuesto "anti-BI-1" puede ejercer su función directamente (por ejemplo, mediante inserción en un gen BI-1 endógeno). Pero la función también puede ejercerse indirectamente después de la transcripción en un ARN (por ejemplo, en planteamientos antisense) o después de transcripción y traslación en una proteína (por ejemplo, en factores de enlace). De acuerdo con la invención, también están comprendidos compuestos que actúan "anti-BI-1" tanto directamente como indirectamente.

Introducir comprende, por ejemplo, métodos tales como transfección, transducción o transformación.

El término compuestos "anti-BI-1" también comprende de esta manera, por ejemplo, constructos recombinantes que ocasionan una expresión (es decir, transcripción y opcionalmente traslación), por ejemplo de un dsRNA BI-1 o de una ARN "antisense" BI-1 específico para epidermis.

En dichos constructos de expresión se encuentra una molécula de ácido nucleico cuya expresión (transcripción y opcionalmente traslación) genera un compuesto "anti-BI-1", preferible en conexión funcional con al menos un elemento de control genético (por ejemplo, un promotor), que asegura una expresión en una organismo, preferiblemente en plantas, preferentemente epidermis-específico. Si el constructo de expresión debe introducirse en la planta y el compuesto "anti-BI-1" (por ejemplo, el asARN BI-1) debe generarse allí en plantas, entonces se prefieren los elementos de control genéticos específicos para plantas (por ejemplo, promotores); como resultado de lo dicho previamente, la actividad específica para epidermis del promotor es obligatoria en la mayoría de modalidades para una reducción específica para epidermis de BI-1, tal como se describió arriba. Aunque el compuesto "anti-BI-1" también puede generarse en otros organismos o in vitro e introducirse después en la planta. En estas se prefieren todos los elementos de control genéticos procarióticos o eucarióticos (por ejemplo, promotores) que permiten la expresión en el organismo seleccionado respectivamente para la preparación.

Por conexión funcional se entiende, por ejemplo, la disposición secuencial de un promotor con la secuencia de ácido nucleico a expresar (por ejemplo, de un compuesto "anti-BI-1") y opcionalmente de otros elementos regulatorios, como por ejemplo un terminados de tal modo que cada elemento regulatorio pueda desempeñar su función en la expresión transgénica de la secuencia de ácido nucleico, según la disposición de las secuencias de ácido nucleico en relación con ARN sense o antisense. Para este propósito no es obligatorio un enlace directo en el sentido químico. Las secuencias genéticas de control, como por ejemplo secuencias - enhancer, también pueden desempeñar su función sobre la secuencia destino desde otras posiciones alejadas o incluso desde otras moléculas de ADN (translocalización cis o trans). Se prefieren disposiciones en las que la secuencia a expresarse transgénicamente se posiciona detrás de la secuencia que actúa como promotor de modo que ambas secuencias se enlazan una a otra de manera covalente. En tal caso se prefiere que la distancia entre la secuencia de promotor y la secuencia de ácido nucleico a expresarse de manera transgénica sea menor que 300 pares de bases, particularmente preferible menor que 100 pares de bases, muy particularmente menos que 50 pares de bases.

La preparación de una conexión funcional como también la preparación de un casete de expresión puede realizarse por medio de técnicas corrientes de recombinación y clonación, tal como se describen, por ejemplo, en Maniatis T, Fritsch EF y Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), in Silhavy TJ, Berman ML y Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), in Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience y bei Gelvin et al. (1990) In: Plant Molecular Biology Manual. No obstante, entre ambas secuencias también pueden posicionarse otras secuencias que tienen, por ejemplo, la función de un linker (enlazador) con intersecciones determinadas de enzima de restricción o la de un péptido de señal. La inserción de secuencias también puede conducir a la expresión de proteínas de fusión. El casete de expresión, que se compone de una conexión de promotor y de secuencia de ácido nuclecio a expresar, puede estar presente preferiblemente integrado en un vector e insertarse en un genoma vegetal a través de transformación, por ejemplo. Los elementos de control facilitan preferiblemente una expresión específica para epidermis.

Los métodos arriba mencionados (a) hasta (i) también pueden aplicarse para la reducción de la actividad o función, en especial de la expresión, de las otras proteínas aquí nombradas, en especial para la reducción de MLO, RacB y NaOx.

La proteína BI1 de cebada (hvBI1) se expresa de manera predominante en el mesófilo (Ejemplo 6) y se regula de modo superior a causa de una infección con Blumeria (syn. Erysiphe) graminis f. sp.hordei hochreguliert (ejemplo 2). La sobreexpresión recombinante específica para mesófilo en cebada resistente a mlo conduce, junto a la resistencia contra patógenos particularmente necrotóficos y hemibiotróficos, hacia una planta resistente a la Blumeria (syn. Erysiphe) graminis f. sp.hordei, la cual no muestra manchas necróticas ("manchas-mlo"; efectos laterales negativos de la resistencia a mlo). Utilizando este efecto, los efectos secundarios negativos de la resistencia proporcionada por mlo (pérdida de cosecha de aproximadamente 5%, Jörgensen JH (1992) Euphitica 63: 141-152); Hipersusceptibilidad frente a hongos necrotróficos, Jarosch B et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:508-514; Kumar J et al. (2001) Phitopathology 91:127-133) pueden suprimirse sin afectar adversamente la resistencia misma al mlo.

Más aún, puede demostrarse de manera sorprendente que una sobreexpresión de BI1 da lugar a resistencia frente a factores de estrés como los agentes que provocan necrosis (aislados por ejemplo de hongos patógenos necrotróficos; ejemplo 2).

El método de acuerdo con la invención ofrece, por consiguiente, una estrategia biotecnológica eficiente para la resistencia a la formación de necrosis como resultado de estrés endógeno, abiótico y biótico, por ejemplo manchas de mlo, daños por ozono, organismos dañinos necrotróficos y hemibiotróficos.

Las proteínas BI1 parecen ser reguladores cruciales de la resistencia fúngica no específica para raza en plantas. Esto hace posible una amplia capacidad de aplicación en estrategias biotecnológicas para elevar la resistencia a patógenos en plantas, en especial la resistencia a hongos. Por principio, el método de acuerdo con la invención puede aplicarse a a todas la especies vegetales. Proteínas BI1 han sido identificadas en numerosas plantas, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas (véase arriba).

En el marco de esta invención "aproximadamente" significa en referencia a números o tamaños un rango de números o tamaños alrededor del valor enunciado del número o tamaño. En general, el término aproximadamente significa un rango respectivo de 20% por encima o por debajo del valor enunciado.

En el marco de la invención, el término "planta" significa todos los géneros y especies de vegetales superiores e inferiores del reino vegetal. El término incluye las plantas maduras, semillas, brotes y embriones (plántulas), así como las partes derivadas de los mismos, material de reproducción, órganos de la planta, tejidos, protoplastos, callos y otros cultivos, por ejemplo cultivos celulares, y otros tipos de agrupaciones de células vegetales para dar unidades funcionales o estructurales. El término plantas maduras se refiere a plantas en cualquier etapa deseada de desarrollo más allá de la de los brotes. Los brotes se refieren a una planta joven inmadura en una etapa temprana de desarrollo.

"Planta" comprende todas las plantas anuales y perennes, mono- y di-cotiledóneas e incluye, por ejemplo, aunque no se limita a, los géneros Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hioscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solarium, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Sorghum, Picea y Populus.

El concepto "planta" comprende preferiblemente plantas de cultivo monocotiledóneas, tales como por ejemplo especies de cereales como trigo, cebada, mijo, centeno, tritical, maíz, arroz, sorgo o avena, así como caña de azúcar.

El término comprende, además, plantas de cultivo dicotiledóneas tales como, por ejemplo,

-: Brassicáceas tales como colza, nabina, berro, arabidopsis, especies de coles,

-: Leguminosas como soya, alfalfa, guisantes, arvejas, frijoles o maní

-: Solanáceas como patata, tabaco, tomate, berenjena o pimiento,

-: Asteráceas como girasol, tagetes, lechuga o caléndula,

-: Cucurbitáceas como melón, calabaza o calabacín,

así como linaza (lino), algodón, cáñamo, trébol, espinaca, pimienta roja, zanahoria, remolacha, rábano, remolacha de azúcar, patata dulce, pepino, achicoria, coliflor, brócoli, espárragos, cebolla, ajo, apio, fresas, frambuesas, moras, piña, aguacate y las diversas especies de árboles, arbustos, nogales y vides. Las especies de árboles comprenden preferiblemente ciruelo, cerezo, durazno, nectarina, melocotón, banano, papaya, mango, manzano, pera,
membrillo.

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En el contexto de la invención se prefieren tales vegetales que se emplean como alimento para humanos o animales, se prefieren muy particularmente especies y géneros monocotiledóneos com importancia agrícola tales como trigo, avena, mijo, cebada, centeno, maíz, arroz, alforfón, sorgo, tritical, espelta, semillas de lino o caña de azúcar.

El término "factor de estrés" comprende en el contexto de la invención factores bióticos de estrés (como en particular los patógenos listados abajo).

"Resistencia al estrés" significa la reducción o el alivio de los síntomas de una planta a causa del estrés. Los síntomas pueden ser múltiples pero preferiblemente abarcan aquellos que directa o indirectamente afectan de manera adversa a la calidad de la planta, la cantidad de la cosecha, su idoneidad para el uso como alimento de humano o animales, o también que dificultan la siembra, cultivo, cosechamiento o procesamiento del producto cosechado.

"Resistencia a patógenos" significa la reducción o alivio de los síntomas de enfermedad de una planta a consecuencia de la infestación por al menos un patógeno. Los síntomas puede ser múltiples pero abarcan preferiblemente aquellos que conducen directa o indirectamente a perjudicar la calidad de la planta, la cantidad de la cosecha, la aptitud para usarla como alimento de animales o humanos o que también dificultan la siembra, cultivo, recolección de cosecha o procesamiento de los productos cosechados.

"Conferir", "mantener", "generar" o "elevar" una resistencia a estrés o a patógenos significa que los mecanismos de defensa de una especie o variedad determinada de plantas presentan una resistencia elevada frente a uno o más tipos de estrés o de patógeno mediante la aplicación del método de la invención en comparación con la variedad silvestre de la planta ("planta de partida"), a la cual no se ha aplicado el método de la invención, en condiciones por lo demás iguales (como por ejemplo, condiciones de clima y cultivo, tipo de estrés o de patógeno, etc.). La elevada resistencia se manifiesta preferiblemente en una manifestación reducida de los síntomas de estrés o enfermedad, y los síntomas de enfermedad abarcan, en adición a los efectos adversos mencionados arriba, por ejemplo también la eficiencia de penetración de un patógeno en la planta o células de la planta o la eficiencia de proliferación en o sobre las mismas. En este caso, los síntomas del estrés o de la enfermedad se reducen preferiblemente en al menos 10% o al menos 20%, particularmente preferible en al menos 40% o 60%, muy particularmente preferible en al menos 70% o 80%, lo más preferible en al menos 90% o 95%.

"Selección" significa, en referencia a las plantas en las que, a diferencia o en comparación con la planta de partida, existe o se eleva la resistencia frente al menos un factor de estrés o patógeno, todos los métodos que son adecuados para reconocer una resistencia existente o incremetada al estrés o a los patógenos. Estos pueden ser, por ejemplo, síntomas de infección patógena (por ejemplo, el desarrollo de necrosis en el caso de infección fúngica), pero también abarca los síntomas descritos arriba que se refieren a la calidad de la planta, la cantidad de la cosecha, la aptitud para usar como material de alimento a animales o humanos.

"Patógeno" significa, en el contexto de la invención y a manera de ejemplo, aunque no limitando, virus o viroides, bacterias, hongos, pestes animales tales como, por ejemplo insectos o nematodos. Preferiblemente son hongos, en particular hongos necrotróficos o hemibiotrófico. Sin embargo, puede suponerse que la expresión específica para mesófilo de una proteína a BI1 también produzca una resistencia contra otros patógenos puesto que se genera una resistencia total hacia los factores de estrés.

Por ejemplo, aunque sin limitar, se mencionarían los siguientes patógenos:

1. Patógenos fúngicos o patógenos similares a los fúngicos

Patógenos fúngicos o patógenos similares a los fúngicos (como por ejemplo chromista) provienen preferiblemente del grupo que comprende plasmodioforamycota, oomycota, ascomycota, quitridiomicetos, zigomicetos, basidiomycota y deuteromicetos (fungi imperfecti). Sin embargo, a manera de ejemplo sin estar limitando, se mencionarían los patógenos nombrados en las tablas 1 a 4 y las enfermedades asociadas con éstos. Los siguientes términos ingleses y alemanes pueden usarse alternativamente:

1

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Otras traduccionnes pueden encontrarse, por ejemplo en http://www.bba.de/english/da.tabase/psmengl/pilz.htm.

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TABLA 1 Enfermedades provocadas por hongos biotróficos, fitopatógenos

2

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TABLA 2 Enfermedades provocadas por hongos y oomicetos necrotróficos y/o hemibiotróficos

3

4

5

6

7

8

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TABLA 4 Enfermedades provocadas por hongos y oomicetos con clasificación que no es clara con respecto a comportamiento biotrófico, hemibiotrófico o necrotrófico

9

Particularmente se prefieren

- Plasmodioforomycota como plasmodiofora brassicae (Kohlhernie), Spongospora subterranea, Polymyxa graminis,

- Oomycota como Bremia lactucae (moho mildiú en lechuga), Peronospora (moho mildiú) en boca de dragón o antirrino (P. antirrhini), cebolla (P. destructor), espinaca (P. effusa), soya (P. manchurica), tabaco (mildiú algodonoso; P. tabacina) Alfalfa y trébol (P. trifolium), pseudoperonospora humuli (moho mildiú en lúpulo), plasmopara (moho mildiú en uvas) (P. viticola) y girasoles (P. halstedii), sclerophtohra macrospora (moho mildiú en cereales y gramíneas), pythium (por ejemplo podredumbre de semilleros en remolacha a través de P. debaryanum), phitophthora infestans (mildiú de hierba y tubérculos, podredumbre parda en el tomate, etc.), Albugo spec.

- Ascomycota como Microdochium nivale (moho de la nieve en centeno y trigo), Fusarium graminearum, Fusarium culmorum (Podredumbre de espiga especialmente en trigo), fusarium oxisporum (marchitamiento por fusarium en tomate), Blumeria graminis (mildiú genuino en cebada (f.sp. hordei) y trigo (f.sp. tritici)), Erysiphe pisi (mildiú de guisantes), Nectria galligena (chancro de árbol frutal), unicnula necator (Mildiú genuino de la vid), pseudopeziza tracheiphila (clavo rojo de la vid), Claviceps purpurea (cornezuelo en centeno y gramíneas, por ejemplo), gaeumannomyces graminis (mal del pie negro en trigo, centeno entre otras gramíneas), Magnaporthe grisea, Pyrenofora graminea (rayado de la cebada), pyrenofora teres (enfermedad de manchas de red en cebada), Pyrenofora tritici-repentis (enfermedad de manchas en hoja (resequedad) en trigo), Venturia inaequalis (roña del manzano), Sclerotinia sclerotium (podredumbre del tallo, cáncer de colza), Pseudopeziza medicaginis (moho verde de los agrios en alfalfa, trébol blanco y rojo).

- Basidiomicetos wie Typhula incarnata (podredumbre por typhula en cebada, centeno, trigo), Ustilago maydis (carbón del maíz), Ustilago nuda (carbón del trigo en cebada), Ustilago tritici (carbón del trigo, escanda), Ustilago avenae (Carbón del trigo en avena), Rhizoctonia solani (mal vinoso en patatas), Sphacelotheca spp. (carbón de la mazorca en sorgo), Melampsora lini (orín en lino), Puccinia graminis (orín negro en trigo, cebada, centeno, avena), Puccinia recondita (orín pardo en trigo), Puccinia dispersa (orín pardo en centeno), Puccinia hordei (orín pardo en Cebada), Puccinia coronata (orín de corona en avena), Puccinia striiformis (orín amarillo en trigo, cebada, centeno así como en numerosas gramíneas), Uromyces appendiculatus (orín de frijol), Sclerotium rolfsii (podredumbre de raíz y tallo en numerosas plantas).

- Deuteromicetos (Fungi imperfecti) tales como Septoria (Stagonospora) nodorum (manchas de la pluma del trigo) en trigo (Septoria tritici), Pseudocercosporella herpotrichoides (mal de pie en trigo, cebada, centeno), Rynchosporium secalis (enfermedad de mancha de hoja o septoriosis en centeno y cebada), Alternaria solani (negrón, tizón o alternariosis en patata y tomate), Foma betae (carbón de raíz en remolacha), Cercospora beticola (cercospora-septoriosis en remolacha), Alternaria brassicae (negro de colza en colza, col, entre otras crucíferas), Verticillium dahliae (marchitamiento y podredumbre de tallo de colza), Colletotrichum lindemuthianum (antracnosis (manchas quemadas) en fríjol), Foma lingam - caída de almaciga (pie negro en col; podredumbre en el cuello de la raíz o del tallo en colza), Botrytis cinerea (moho gris en la vid, fresa, tomate, lúpulo, etc.).

Los más preferible son Phitophthora infestans (podredumbre de hierba y tubérculo, podredumbre parda en tomate, etc), Microdochium nivale (antes Fusarium nivale; moho de nieve en centeno y trigo), Fusarium graminearum, Fusarium culmorum, Fusarium avenaceum y Fusarium poae (podredumbre de espiga en trigo), Fusarium oxisporum (marchitamiento por fusarium en tomate), Magnaporthe grisea (rice blast disease o enfermedad de tizón del arroz), Sclerotinia sclerotium (podredumbre de tallo, cáncer de colza), Septoria (Stagonospora) nodorum y Septoria tritici (septoriosis en trigo), Alternaria brassicae (negro de colza en colza, coles, entre otras crucíferas), Foma lingam (caída de almaciga, pie negro en col; podredumbre de cuello de raíz o de tallo en colza).

2. Patógenos bacterianos

A manera de ejemplo aunque no limitante se mencionan los patógenos nombrados en la tabla 5 y las enfermedades a éstas asociadas.

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TABLA 5 Enfermedades bacterianas

10

Muy particularmente preferibles las siguientes bacterias patógenas: Corynebacterium sepedonicum (podredumbre de anillo de bacterias en patata), Erwinia carotovora (pie negro en patata), Erwinia amilovora (fuego bacteriano en pera, manzana, membrillo), Streptomyces scabies (roña de patata), Pseudomonas syringae pv. tabaci (mancha angular en la hoja de tabaco), Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (enfermedad de manchas grasosas en poroto (judía) enano), Pseudomonas syringae pv. tomato ("bacterial speck" (motas bacterianas) en tomate), Xanthomonas campestris pv. malvacearum (septoriosis en algodón) y Xanthomonas campestris pv. oryzae (podredumbre bacteriana en arroz y otras gramíneas).

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3. Patógenos virales

El término "patógenos virales" incluye todos los virus vegetales tales como, por ejemplo, virus mosaico de tabaco o pepino, virus de mancha anular, virus de necrosis, virus mosaico enano de maíz, etc.

Los patógenos y enfermedades asociados a éstos se mencionan en la tabla 6 a manera de ejemplo, pero sin limitar.

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TABLA 6 Enfermedades virales

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13

14

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4. Pestes animales 4.1 Patógenos insectos

Los siguientes pueden mencionarse a manera de ejemplo sin ser limitantes: escarabajos, orugas, áfidos o ácaros. Los insectos preferidos son aquellos de los géneros Coleoptera, Diptera, Himenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thisanoptera. Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Sifonaptera, Trichoptera, etc.. Particularmente se prefieren insectos coleopteros y lepidopteros, como por ejemplo el barrenador de maíz (European Corn Borer), Diabrotica barberi, Diabrotica undecimpunctata, Diabrotica virgifera, Agrotis ipsilon, Crymodes devastator, Feltia ducens, Agrotis gladiaria, Melanotus spp., Aeolus mellillus, Aeolus mancus, Horistonotus uhlerii, Sphenoforus maidis, Sphenoforus zeae, Sphenoforus parvulus, Sphenoforus callosus, Phillogphaga spp., Anuraphis maidiradicis, Delia platura, Colaspis brunnea, Stenolophus lecontei y Clivinia impressifrons.

Otros a mencionarse son: el criocero de los cereales (Oulema melanopus), la mosca frit (Oscinella frit), el gusano de alambre (Agrotis lineatus) y áfidos de hoja (como, por ejemplo, áfido de hoja de avena Rhopalosiphum padi, áfidos grandes de cereales Sitobion avenae).

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(Tabla pasa a página siguiente)

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4.2 Nemátodos

Los patógenos y las enfermedades asociados con éstos se mencionan en la tabla 7 a manera de ejemplo, pero sin limitación

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TABLA 7 Nemátodos parasitarios

15

Muy particularmente se prefieren Globoa rostochiensis y G. pallida (nematodos de las raíces en patata, tomate entre otras solanáceas), Heteroa schachtii (nematodos de raíces de remolacha en remolacha de azúcar y para alimento animal, colza, col, etc.), Heteroa avenae (nematodos de raíces de avena en avena entre otras especies de cereales), Ditilenchus dipsaci (nematodos de tallo o bulbo, nematodos de cabeza de remolacha en centeno, avena, maíz, trébol, tabaco, remolacha), Anguina tritici (nematodos de trigo, enfermedad de berberecho en trigo (escanda, centeno), Meloidogyne hapla (nematodos de la raíz en zanahoria, pepino, lechuga, tomate, patata, remolacha de azúcar, alfalfa).

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Para variedades individuales pueden nombrarse como ejemplos de hongos o virus patógenos:

1. Cebada

Patógenos fúngicos, bacterianos y virales: Puccinia graminis f.sp. hordei, Blumeria (Erysiphe) graminis f.sp. hordei, barley yellow dwarf virus (BYDV) (Virus enano amarillo de cebada.

Insectos/nemátodos patógenos: Ostrinia nubilalis (European corn borer o barrenador europeo de maíz); Agrotis ipsilon; Schizaphis graminum; Blissus leucopterus; Acrosternum hilare; Euschistus servus; Deliaplatura; Mayetiola destructor; Petrobia latens.

2. Haba de soja

Patógenos fúngicos, bacterianos o virales: Phitophthora megasperma fsp.glycinea, Macrofomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxisporum, Diaporthe phaseolorum var. sojae (Fomopsis sojae), Diaporthe phaseolorum var. caulivora, Sclerotium rolfsii, Cercospora kikuchii, Cercospora sojina, Peronospora manshurica, Colletotrichum dematium (Colletotrichum truncatum), Corynespora cassiicola, Septoria glycines, Phillosticta sojicola, Alternaria alternata, Pseudomonas syringae p.v. glycinea, Xanthomonas campestris p.v. phaseoli, Microsphaera diffussa, Fusarium semitectum, Phialofora gregata, virus mosaico de haba de soja, Glomerella glycines, Tobacco Ring spot virus (virus de mancha anular en el tabaco), Tobacco Streak virus (virus de pica en tabaco), Phakopsorapachirhizi, Pythium aphanidermatum, Pythium ultimum, Pythium debaryanum, Tomato spotted wilt virus (virus de marchitamiento de tomate manchado), Heteroa glycines Fusarium solani.

Insectos/nemátodos patógenos: Pseudoplusia includens; Anticarsia gemmatalis; Plathipena scabra; Ostrinia nubilalis; Agrotis ipsilon; Spodoptera exigua; Heliothis virescens; Helicoverpa zea; Epilachna varivestis; Myzus persicae; Empoasca fabae; Acrosternum hilare; Melanoplus femurrubrum; Melanoplus differentialis; Hilemya platura; Sericothrips variabilis; Thrips tabaci; Tetranychus turkestani; Tetranychus urticae;

3. Colza

Patógenos fúngicos, bacterianos o virales: Albugo candida, Alternaria brassicae, Leptosphaeria maculans, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Mycosphaerella brassiccola, Pythium ultimum, Peronospora parasitica, Fusarium roseum, Alternaria alternata.

4. Alfalfa

Patógenos fúngicos, bacterianos o virales: Clavibater michiganese subsp. insidiosum, Pythium ultimum, Pythium irregulare, Pythium splendens, Pythium debaryanum, Pythium aphanidermatum, Phitophthora megasperma, Peronospora trifoliorum, Foma medicaginis var. medicaginis, Cercospora medicaginis, Pseudopeziza medicaginis, Leptotrochila medicaginis, Fusarium, Xanthomonas campestris p.v. alfalfae, Aphanomyces euteiches, Stemphilium herbarum, Stemphilium alfalfae.

5. Trigo

Patógenos fúngicos, bacterianos o virales: Pseudomonas syringae p.v. atrofaciens, Urocystis agropyri, Xanthomonas campestris p.v. translucens, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Ustilago tritici, Ascochita tritici, Cephalosporium gramineum, Collotetrichum graminicola, Erysiphe graminis f.sp. tritici, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia recóndita f.sp. tritici, Puccinia striiformis, Pyrenofora tritici-repentis, Septoria (Stagonospora) nodorum, Septoria tritici, Septoria avenae, Pseudocercosporella herpotrichoides, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia cerealis, Gaeumannomyces graminis var. tritici, Pythium aphanidermatum, Pythium arrhenomanes, Pythium ultimum, Bipolaris sorokiniana, Barley Yellow Dwarf Virus (virus enano Amarillo de cebada), Brome Mosaic Virus (virus mosaico de bromo), Soil Borne Wheat Mosaic Virus (virus mosaico de trigo llevao en suelo), Wheat Streak Mosaic Virus (virus mosaico de pica en trigo), Wheat Spindle Streak Virus (virus de pica en eje de trigo), American Wheat Striate Virus (virus estriado de trigo americano), Claviceps purpurea, Tilletia tritici, Tilletia laevis, Ustilago tritici, Tilletia indica, Rhizoctonia solani, Pythium arrhenomannes, Pythium gramicola, Pythium aphanidermatum, High Plains Virus (virus de llanuras altas), European Wheat Striate Virus (virus estriado de trigo europeo), Puccinia graminis f.sp. tritici (Wheat stem rust u orín de tallo de trigo), Blumeria (Erysiphe) graminis f.sp. tritici (Wheat Powdery Mildew o mildiú polvoroso de trigo).

Insectos/nemátodos patógenos: Pseudaletia unipunctata; Spodoptera,frugiperda; Elasmopalpus lignosellus; Agrotis orthogonia; Elasmopalpus Zignosellus; Oulema melanopus; Hipera punctata; Diabrotica undecimpunctata howardi; Russian wheat aphid (pulgón de trigo ruso); Schizaphis graminum; Macrosiphum avenae; Melanoplus femurrubrum; Melanoplus differentialis; Melanoplus sanguinipes; Mayetiola destructor; Sitodiplosis mosellana; Meromyza americana; Hilemya coarctata; Frankliniella fusca; Cephus cinctus; Aceria tulipae;

6. Girasol

Patógenos fúngicos, bacterianos o virales: Plasmofora halstedii, Sclerotinia sclerotiorum, Aster Yellows, Septoria helianthi, Fomopsis helianthi, Alternaria helianthi, Alternaria zinniae, Botrytis cinerea, Foma macdonaldii, Macrofomina phaseolina, Erysiphe cichoracearum, Rhizopus oryzae, Rhizopus arrhizus, Rhizopus stolonifer, Puccinia helianthi, Verticillium dahliae, Erwinia carotovorum p.v. Carotovora, Cephalosporium acremonium, Phitophthora cryptogea, Albugo tragopogonis.

Insectos/nemátodos patógenos: Suleima helianthana; Homoeosoma electellum; zygogramma exclamationis; Bothirus gibbosus; Neolasioptera murtfeldtiana;

7. Maíz

Patógenos fúngicos, bacterianos o virales: Fusarium moniliforme var. subglutinans, Erwinia stewartii, Fusarium moniliforme, Gibberella zeae (Fusarium graminearum), Stenocarpella maydi (Diplodia maydis), Pythium irregulare, Pythium debaryanum, Pythium graminicola, Pythium splendens, Pythium ultimum, Pythium aphanidermatum, Aspergillus flavus, Bipolaris maydis 0, T (Cochliobolus heterostrophus), Helminthosporium carbonum I, II & III (Cochliobolus carbonum), Exserohilum turcicum I, II & III, Helminthosporium pedicellatum, Phisoma maydis, Phillosticta maydis, Kabatiella maydis, Cercospora sorghi, Ustilago maydis, Puccinia sorghi, Puccinia polysora, Macrofomina phaseolina, Penicillium oxalicum, Nigrospora oryzae, Cladosporium herbarum, Curvularia lunata, Curvularia inaequalis, Curvularia pallescens, Clavibacter michiganese subsp. nebraskense, Trichoma viride, Maize Dwarf Mosaic Virus A & B (virus mosaico enano de maíz), Wheat Streak Mosaic Virus (virus mosaico de pica en trigo), Maize Chlorotic Dwarf Virus (virus enano clorótico de maíz), Claviceps sorghi, Pseudonomas avenae, Erwinia chrysanthemi p.v. Zea, Erwinia corotovora, Cornstunt spiroplasma, Diplodia macrospora, Sclerophthora macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinesis, Peronosclerospora maydis, Peronosclerospora sacchari, Spacelotheca reiliana, Phisopella zeae, Cephalosporium maydis, Caphalosporium acremonium, Maize Chlorotic Mottle Virus (virus jaspeado clorótico de maíz), High Plains Virus (virus de las llanuras altas), Maize Mosaic Virus (virus mosaico de maíz), Maize Rayado Fino Virus, Maize Streak Virus (MSV, Maízstrichel-Virus, virus pica de maíz), Maize Stripe Virus (virus raya de maíz), Maize Rough Dwarf Virus (virus enano rugoso de maíz).

Insectos/nemátodos patógenos: Ostrinia nubilalis; Agrotis ipsilon; Helicoverpa zea; Spodoptera frugiperda; Diatraea grandiosella; Elasmopalpus lignosellus; Diatraea saccharalis; Diabrotica virgifera; Diabrotica longicornis barberi; Diabrotica yecimpunctata howardi; Melanotus spp.; Cyclocephala borealis; Cyclocephala immaculata; Popillia japonica; Chaetocnema pulicaria; Sphenoforus maidis; Rhopalosiphum maidis; Anuraphis maidiradicis; Blissus leucopterus; Melanoplus femurrubrum; Melanoplus sanguinipes; Hilemva platura; Agromyza parvicornis; Anafothrips obscrurus; Solenopsis milesta; Tetranychus urticae.

8. Sorgo

Patógenos fúngicos, bacterianos o virales: Exserohilum turcicum, Colletotrichum graminicola (Glomerella graminicola), Cercospora sorghi, Gloeocercospora sorghi, Ascochita sorghina, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Xanthomonas campestris p.v. holcicola, Pseudomonas andropogonis, Puccinia purpurea, Macrofomina phaseolina, Perconia circinata, Fusarium monilifonne, Alternaria alternate, Bipolaris sorghicola, Helminthosporium sorghicola, Curvularia lunata, Foma insidiosa, Pseudomonas avenae (Pseudomonas alboprecipitans), Ramulispora sorghi, Ramulispora sorghicola, Phillachara sacchari, Sporisorium reilianum (Sphacelotheca reiliana), Sphacelotheca cruenta, Sporisorium sorghi, Sugarcane mosaic H, Maize Dwarf Mosaic Virus A & B, Claviceps sorghi, Rhizoctonia solani, Acremonium strictum, Sclerophthona macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Sclerospora graminicola, Fusarium graminearum, Fusarium oxisporum, Pythium arrhenomanes, Pythium graminicola.

Insectos/nemátodos patógenos: Chilo partellus; Spodoptera frugiperda; Helicoverpa zea; Elasmopalpus lignosellus; Feltia subterranea; Phvllophaga crinita; Eleodes, Conous y Aeolus spp.; Oulema melanopus; Chaetocnema pulicaria; Sphenoforus maidis; Rhopalosiphum maidis; Siphaflava; Blissus leucopterus leucopterus; Contarinia sorghicola; Tetranychus cinnabarinus; Tetranychus urticae.

9. Algodón

Insectos/nemátodos patógenos: Heliothis virescens; Helicoverpa zea; Spodoptera exigua; Pectinofora gossypiella; Anthonomus grandis grandis; Aphis gossypii; Pseudatomoscelis seriatus; Trialeurodes abutilonea; Lygus lineolaris; Melanoplus femurrubrum; Melanoplus differentialis; Thrips tabaci (onion thrips); Franklinkiella fusca; Tetranychus cinnabarinus; Tetranychus urticae.

10. Arroz

Insectos/nemátodos patógenos: Diatraea saccharalis; Spodoptera frugiperda; Helicoverpa zea; Colaspis brunnea; Lissorhoptrus oryzophilus; Sitophilus oryzae; Nefotettix nigropictus; Blissus Ieucopterus leucopterus; Acrosternum hilare.

11. Colza

Insectos/nemátodos patógenos: Brevicoryne brassicae; Phiilotreta cruciferae; Mamestra conjgurata; Plutella xilostella; Delia ssp..

En el contexto de la invención el término "proteína BI1" significa polipéptidos que tienen al menos una secuencia con una homología de al menos 50%, preferible al menos 80%, particularmente preferible al menos 90%, muy particularmente preferible 100% hacia un motivo de consenso BI1 seleccionado del grupo compuesto de

a): H(L/I)KXVY

b): AXGA(Y/F)XH

c): NIGG

d): P(V/P)(Y/F)E(E/Q)(R/Q)KR

e): (E/Q)G(A/S)S(V/I)GPL

f): DP(S/G)(L/I)(I/L)

g): V(G/A)T(A/S)(L/I)AF(A/G)CF(S/T)

h): IL(Y/F)LGG, preferiblemente EILILGG

i): L(L/V)SS(G/W)L(S/T)(I/M)L(L/M)W

j): DTGX(I/V) (I/V)E

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Particularmente se prefiere en este caso el motivo de consenso BI f) IL(Y/F)LGG, muy particularmente preferible (EILILGG).

Este motivo es característico para proteínas vegetales BI1.

Particularmente preferible tienen lugar secuencias con homología hacia al menos 2 ó 3 de estos motivos (a hasta g) en una proteína BI1, muy particularmente preferible al menos 4 ó 5, lo más preferible todos los motivos de a hasta j. Otros motivos de secuencia típicos pueden derivarse por parte de la persona técnica sin dificultad a partir de la comparación de secuencias de proteína BI1, tal como se representa en las figuras 1 ó 6.

Especialmente se prefieren proteínas BI que se codifican a través de un polipéptido que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo compuesto de:

a) las secuencias según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 y 38, y

b) Secuencias que tienen una identidad de al menos 50%, preferible de al menos 70%, particularmente preferible de al menos 90%, muy particularmente preferible de al menos 95% hacia una de las secuencias según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 y 38,

c) Secuencias que comprenden al menos una secuencia parcial de al menos 10, preferible 20, particularmente preferible 50 residuos de aminoácidos relacionados contiguos de una de las secuencias según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 y 38.

De acuerdo con la invención, el término proteína BI comprende especialmente mutaciones naturales o artificiales del polipéptido BI1 según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 38 así como polipéptidos homólogos de otros organismos, preferible vegetales, los cuales tienen esencialmente propiedades iguales. Las mutaciones comprenden sustituciones, adiciones, deleciones, inversión o inserciones de uno o varios residuos de aminoácidos. También están comprendidos usando proteínas BI1 de organismos no vegetales como por ejemplo el ser humano (GenBank Acc.-No.: P55061), ratas (GenBank Acc.-No.: P55062) o drosófilas (GenBank Acc.-No.: Q9VSH3). Entre proteínas BI1 vegetales y no vegetales, los motivos conservados pueden identificarse fácilmente mediante comparaciones de secuencia (compárese Alignment in Bolduc et 1. (2003) Planta 216:377-386; Fig. 1 y 6).

De esta manera, por la presente invención también están comprendidos, por ejemplo, aquellos polipéptidos que se obtienen por modificación de un polipéptido según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 38.

Las secuencias de otros vegetales homólogas a las secuencias BI1 divulgadas en el contexto de esta invención pueden descubrirse, por ejemplo, por

a) búsqueda de banco de datos en bancos de organismos cuya secuencia genómica o de cADN sea total o parcialmente conocida, usando secuencias BI1 siministradas como secuencias de búsqueda o

b) inspección completa de bibliotecas de genes o de cADN usando secuencias BI1 suministradas como sondas. La inspección completa de bibliotecas de cADN o genómicas (usando, por ejemplo, un de las secuencias de ácido nucleico descritas bajo SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 y 37 o partes de las mismas como sondas), es uno de los métodos corrientes para la persona técnica en la materia para identificar homólogos en otras especies. En este caso, las sondas derivadas de las secuencias de ácido nucleico según SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 y 37 tienen una longitud de al menos 20 bp, preferible al menos 50 bp, particularmente preferible al menos 100 bp, muy particularmente preferible al menos 200 bp, lo más preferible al menos 400 bp. Para la inspección total de las bibliotecas también puede emplearse una cadena de ADN complementaria a las secuencias descritas bajo SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 y 37.

Por homología entre dos secuencias de ácido nucleico se entiende la identidad de la secuencia de ácido nucleico por toda la longitud de secuencia respectiva, la cual se calcula mediante comparación con ayuda del algoritmo de programático GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 siguientes) estableciendo los siguientes parámetros:

Gap Weight (peso): 50: Length Weight (longitud peso): 3

Average Match (coincidencia promedio): 10: Average Mismatch (no coincidencia promedio): 0

Por ejemplo, por una secuencia que tiene una homología de al menos 80% en la base de ácido nucleico con la secuencia SEQ ID NO: 1 se entiende una secuencia que en comparación con la secuencia SEQ ID NO: 1 según el algoritmo programático de arriba con el parámetro establecido tiene una homología de al menos 80%.

Por homología entre dos polipéptidos se entiende la identidad de la secuencia de aminoácidos por toda la longitud respectiva de secuencia que se calcula por comparación con ayuda del algoritmo programático GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) estableciendo los siguientes parámetros:

Gap weight (peso): 8: lenght weight (longitud peso):2

Coincidencia promedio: 2,912: No coincidencia promedio: -2,003

Por ejemplo, por una secuencia que tiene una homología de sl menos 80% sobre la base de proteína con la secuencia SEQ ID NO: 2, se entiende una secuencia que en comparación con la secuencia SEQ ID NO: 2 presenta una homología de al menos 80% según el algoritmo programático con el parámetro establecido de arriba.

Las proteínas BI1 abarcan también aquellos polipéptidos que se codifican a través de las secuencias de ácido nucleico que hibridan bajo condiciones estándar con una de las secuencias de ácido nucleico BI1 descritas a través de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 y 37, con la secuencia de ácido nucleico complementaria a la misma o con partes de la previamente mencionada y que tienen las características esenciales iguales como las proteínas descritas bajo SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 y 38.

El término "condiciones de hibridación" debe entenderse ampliamente y exige condiciones de hibridación estrictas como también menos estrictas. Tales condiciones de hibridación se describen entre otros en Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., en Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, páginas 9.31-9.57) o en Current Protocols en Molecular Biology, John Wiley &Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, las condiciones durante el paso de lavado pueden seleccionarse del rango de condiciones limitado de aquellas con baja estrictez (con aproximadamente 2X SSC a 50ºC) y aquellas con estrictez más alta (con aproximadamente 0.2X SSC a 50ºC, preferible a 65ºC) (20X SSC: citrato de sodio de 0,3M, NaCl de 3M, pH 7.0). Además, la temperatura puede aumentar durante el paso de lavado en condiciones poco estrictas a temperatura ambiente, aproximadamente 22ºC, hasta condiciones más estrictas a aproximadamente 65ºC. Ambos parámetros, concentración de sal y temperatura, pueden variar simultáneamente; Uno de los dos parámetros también puede mantenerse constante y solo variar el otro. Durante la hibridación también pueden emplearse agentes denaturalizante como por ejemplo formamida o SDS. En presencia de formamida al 50% se realiza la hibridación preferiblemente a 42ºC.

"Propiedades esenciales" significa en referencia a una proteína BI1 una o más de las siguientes propiedades:

a) el otrogamiento o aumento de la resistencia a patógenos frente a al menos un patógeno durante el aumento de la cantidad de proteína o la función de dicha proteína BI1 en al menos un tejido de la planta; dicho tejido no es la epidermis de la hoja.

b) Ausencia de una muerte celular inducida espontáneamente cuando se incrementa la cantidad de proteína o la función de dicha proteína BI

c) La propiedad de inhibir significativamente apoptosis inducida por BAX en el caso de co-transfección de BAX y dicha proteína BI1, por ejemplo en células HEK293. Se han descrito métodos correspondientes (Bolduc N et al. (2003) Planta 216:377-386).

d) La presencia de cinco hasta siete dominios de transmembrana putativos dentro de dicha proteína BI1.

e) Una localización preferencial en las membranas de la célula, en especial en la membrana del núcleo, membrana ER y/o membrana tilacoide.

En este caso, la manifestación cuantitativa de dichas propiedades de una proteína BI1 pueden desviarse en ambas direcciones en comparación con un valor obtenido para la proteína BI1 según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 o 38.

El término "incremento de la cantidad de proteína BI1" debe entenderse en el contexto de esta invención de manera amplia y puede basarse en diversos mecanismos biológicos celulares.

"Cantidad de proteína" significa la cantidad de una proteína BI1 en el organismo, tejido, célula o compartimiento de célula respectivamente indicado.

"Incremento de la cantidad de proteína" significa el incremento cuantitativo de la cantidad de una proteína BI1 en el organismo, tejido, célula o compartimiento indicado respectivo - por ejemplo mediante uno de los métodos descritos abajo - en comparación con el tipo silvestre del mismo género y tipo al cual este método no se ha aplicado, pero bajo condiciones contextuales de otra manera iguales (como, por ejemplo, condiciones de cultivo, edad de las plantas, etc.). El incremento es en tal caso de al menos 10%, preferible de al menos 30% o de al menos 50%, particularmente preferible de al menos 70% ó 100%, muy particularmente preferible en al menos 200% o 500%, lo más preferible en al menos 1000%. La determinación de la cantidad de proteína puede realizarse mediante diferentes métodos corrientes para la persona técnica en la materia. A manera de ejemplo, aunque sin limitar por esto, se mencionan: el método de micro-biuret (Goa J (1953) Scand J Clin Lab Invest 5:218-222), die Folin-Ciocalteu-Metode (Lowry OH et al. (1951) J Biol Chem 193:265-275) o la medición de la adsorción de CBB G-250 (Bradford MM (1976) Analyt Biochem 72:248-254). También puede realizarse una cuantificación mediante métodos inmunológicos, como por ejemplo Western-Blot. La preparación de anticuerpos BI1 correspondientes así como la realización de Western-Blots BI1 se han descrito (Bolduc et al. (2002) FEBS Lett 532:111-114). Una cuantificación indirecta puede realizarse mediante Northern-Blots; normalmente la cantidad de mARN se correlaciona bien con la cantidad de proteína resultante. Se han descrito métodos correspondientes (entre otros, Bolduc et al. (2003) Planta 216:377-386; Matsumura H et al. (2003) Plant J 33:425-434).

"Función" significa preferiblemente la propiedad de una proteína BI1 de reducir muerte celular inducida espontáneamente y/o la propiedad de inhibir el efecto de Bax que indica apoptosis. Las funciones correspondientes pertenecen a la propiedad esencial de una proteína BI1.

"Incremento" de la función significa en el contexto de esta invención por ejemplo el incremento cuantitativo de la acción inhibitoria sobre la muerte celular apoptótica inducida por Bax, la cual puede cuantificarse mediante métodos corrientes para la persona técnica en la materia (véase arriba) La cantidad elevada es de al menos 10%, preferible de al menos 30% o de al menos 50%, particularmente preferible de al menos 70% o 100%, muy particularmente preferible en al menos 200% ó 500%, lo más preferible en al menos 1000%. Los métodos para el incremento de la función comprenden, además de los métodos descritos arriba para el incremento de la cantidad de proteína (la cual siempre aumenta la función), también la introducción de mutaciones en una proteína BI1, a manera de ejemplo pero sin limitar.

La cantidad de proteína BI1 se eleva por ejemplo, sin limitarse a, mediante uno de los siguientes métodos:

a) expresión o sobre-expresión recombinante de una proteína BI1 mediante la introducción de un casete de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína bajo el control de un promotor específico para tejido, donde dicho promotor no tiene esencialmente actividad en la epidermis de la hoja.

b) Modificación (por ejemplo, intercambio) de las regiones regulatorias (por ejemplo, de la región de promotor) de un gen BI1 endógeno, por ejemplo intercambio de un promotor específico de tejido por medio de recombinación homóloga, donde dicho promotor no tiene esencialmente actividad en la epidermis de la hoja.

c) Inserción de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína BI1 en el genoma vegetal detrás de un promotor específico para tejido por medio de recombinación homóloga, donde dicho promotor no tiene esencialmente actividad en la epidermis de la hoja.

d) Incremento de la expresión de una proteína BI1 endógena mediante la introducción de un factor de transcripción (por ejemplo, de un factor de transcripción artificial de la clase de proteína de dedo de cinc) adecuado para la inducción de la expresión de dicha proteína BI1. Se prefiere la introducción de un casete de expresión recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para dicho factor de transcripción bajo control de un promotor específico de tejido, donde dicho promotor no tiene esencialmente actividad en la epidermis de la hoja.

El término "introducción" comprende en el contexto de la invención todos los métodos adecuados para introducir el compuesto a introducir, directa o indirectamente, en una planta o una célula, compartimiento, tejido, órgano o semilla de la misma, o generarlo allí. Están comprendidos métodos directos e indirectos. La introducción puede conducir a una presencia pasajera (transitoria) de dicho compuesto o también a una duradera (estable) o inducible. La introducción comprende, por ejemplo, métodos como la transfección, transducción o transformación.

En los casetes de expresión empleados en el contexto de la invención, una molécula de ácido nucleico (que codifica por ejemplo para una proteína BI1) está en conexión funcional con al menos un promotor específico para tejido, donde dicho promotor no tiene actividad esencialmente en la epidermis de la hoja y donde el promotor es heterólogo con respecto a la secuencia de ácido nucleico a expresar; es decir, no tiene lugar de manera natural en combinación con la misma. Los casetes de expresión recombinantes de acuerdo con la invención pueden comprender opcionalmente otros elementos de control genéticos.

Por conexión funcional se entiende, por ejemplo, la disposición secuencial del dicho promotor con la secuencia de ácido nucleico a expresar y, opcionalmente, otros elementos regulatorios como por ejemplo un terminador de tal modo que cada uno de los elementos regulatorios puede desempeñar su función en la expresión recombinante de la secuencia de ácido nucleico. Para este propósito no es necesariamente obligatoria una conexión directa en el sentido químico. Las secuencias genéticas de control, como por ejemplo secuencias enhancer, también pueden ejercer su función desde otras posiciones alejadas o inclusive desde otras moléculas de ADN sobre la secuencia de destino. Se prefieren disposiciones en los que la secuencia de ácido nucleico a expresarse recombinante se posiciona detrás de la secuencia que funge como promotor, de modo que ambas secuencias están enlazadas una con otra de manera covalente. En tal caso se prefiere la distancia entre la secuencia de promotor y la secuencia a expresarse recombinante menor que 200 pares de bases, particularmente preferible menor que 100 pares de bases, muy particularmente preferible menor que 50 pares de bases. La preparación de una conexión funcional como también la preparación de un casete de expresión recombinante puede realizarse por medio de técnicas corrientes de recombinación y clonación, tal como se describen, por ejemplo, en Maniatis T, Fritsch EF y Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), en Silhavy TJ, Berman ML y Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY), in Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience y en Gelvin et al. (1990) en: Plant Molecular Biology Manual. Entre ambas secuencias también pueden posicionarse otras secuencias que tienen, por ejemplo, la función de un linker (enlazante) con determinadas intersecciones de enzima de restricción o de una señal de péptido. La inserción de secuencias también puede conducir a la expresión de proteínas de fusión.

Preferiblemente, el casete de expresión que se compone de una conexión del promotor y de la secuencia de ácido nucleico a expresar puede estar presente de manera integrada en un vector e insertarse a un genoma vegetal mediante transformación, por ejemplo.

Por un casete de expresión recombinante también deben entenderse aquellas construcciones en las que el promotor, por ejemplo mediante una recombinación homóloga, se ubica antes del gen BI1 endógeno y de esta manera controla la expresión de la proteína BI1. De manera análoga, la secuencia de ácido nucleico a expresarse (que codifica para una proteína BI1, por ejemplo) también puede ubicarse detrás de un promotor endógeno de tal manera que se manifieste el mismo efecto. Ambos planteamientos conducen a los casetes de expresión recombinantes en el sentido de la invención.

Por un "promotor específico para tejido que no tiene esencialmente actividad en la epidermis de la hoja" se entienden en el contexto de esta invención en general aquellos promotores que son adecuados para asegurar o elevar una expresión recombinante de una secuencia de ácido nucleico al menos en un tejido vegetal, con la condición de que

a) dicho tejido vegetal se seleccione de todos los tejidos vegetales con excepción de la epidermis, y

b) la expresión recombinante bajo el control del dicho promotor en dicho tejido vegetal alcance al menos cinco veces, preferible al menos diez veces, particularmente preferible al menos cien veces la expresión en la epidermis de hoja vegetal.

La persona técnica en la materia conoce numerosos promotores que satisfacen estos requisitos. En especial son adecuados promotores específicos para tejido tales como, por ejemplo, aunque sin limitarse a, promotores con especificidades para las anteras, los ovarios, flores, tallos, raíces, tubérculos o semillas.

a) Como promotores específicos de semillas se prefieren, por ejemplo, lo promotores de faseolina (US 5,504,200; Bustos MM et al. (1989) Plant Cell 1(9):839-53), 2S Albumins (Joseffson LG et al. (1987) J Biol Chem 262: 12196-12201), Legumins (Shirsat A et al. (1989) Mol Gen Genet 215(2):326-331) y Legumin B4 (LeB4; Baumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225:121-128; Baumlein H et al. (1992) Plant J 2(2):233-9; Fiedler U et al. (1995) Biotechnology (NY) 13.(10):1090f), USP (unknown seed protein; Baumlein H et al. (1991) Mol Gen Genet 225(3):459-67), Napins (US 5,608,152; Stalberg K et al. (1996) L Planta 199:515-519), Saccharosebindeproteins (WO 00/26388), Oleosins (WO 98/45461), o el promotor Bce4 de Brassica (WO 91/13980). Otros promotores adecuados específicos para semillas son los de genes que codifican para la "High Molecular Weight Glutenin" (HMWG), Gliadina, enzima de ramificación, ADP glucosa pirofosfatasa (AGPase) o la sintaza de almidón. Además se prefieren promotores que permiten expresión específica de semilla en monocotiledóneas tales como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz etc. De manera ventajosa pueden emplearse el promotor del gen lpt2 o Ipt1 (WO 95/15389, WO 95/23230) o los promotores descritos en WO 99/16890 (promotores del gen hordeina, del gen glutelina, del gen oryzina, del gen prolamina, del gen gliadina, del gen glutelina, del gen zeina, del gen kasirina o del gen secalina). Otros promotores específicos de semilla se describen en WO 89/03887.

b) Promotores específicos de tubérculos, de raíces de almacenamiento o de raíces comprenden, por ejemplo, el promotor del gen de patatina (GenBank Acc.-No.: A08215), el promotor B33 de patatina clase I (GenBank Acc.-No.: X14483) o el promotor de la catepsina D inhibidor de patata. En especial se prefiere el promotor descrito por SEQ ID NO: 29. Los promotores específicos de tubérculos son en el contexto de la invención adecuados en especial para lograr una resistencia contra Phitophthora infestans. Puesto que los hongos obligat-biotróficos solo atacan las hojas, es irrelevante una actividad en el tejido epidérmico del tubérculo.

c) Los promotores específicos de flores comprenden, por ejemplo, el promotor de fitoeno sintasa Promotor (WO 92/16635) o el promotor del gen P-rr (WO 98/22593).

d) Los promotores específicos de anteras comprenden, por ejemplo, el promotor 5126 (US 5,689,049, US
5,689,051), el promotor glob-1 y el promotor \gamma-zein.

e) Promotores específicos de granzas, como por ejemplo el promotor en US 6,291,666. Los promotores específicos de granzas son ventajosos especialmente para facilitar una resistencia contra fusarium.

f) Promotores específicos de mesófilos tales como, por ejemplo, el promotor del gen de germen de trigo 9f-3.8 (banco de genes GenBank Acc.-No.: M63224) o el promotor de cebada GerA (WO 02/057412). Dichos promotores son especialmente ventajosos porque son tanto específicos de mesófilos como inducibles para patógenos. También es adecuado el promotor específico para mesófilo de arabidopsis CAB-2 (GenBank Acc.-No.: X15222), así como el promotor zea mays PPCZm1 (GenBank Acc.-No.: X63869). En especial se prefieren los promotores descritos por SEQ ID NO: 30, 31 o 32. Las secuencias de ácido nucleico presentes en casetes de expresión o vectores recombinantes utilizados en los métodos de acuerdo con la invención pueden enlazarse funcionalmente con otras secuencias genéticas en adición al promotor. El término de las secuencias genéticas de control debe entenderse de manera amplia y significa todas aquellas secuencias que tienen una influencia sobre la producción o la función del casete de expresión recombinante de acuerdo con la invención. Las secuencias de control genéticas también comprenden otros promotores, elementos de promotor o promotores mínimos, todos los cuales pueden modificar las propiedades que regulan la expresión. De esta manera, por ejemplo, la expresión específica de tejido puede depender adicionalmente de ciertos factores de estrés debido a las secuencias de control genéticas. Tales elementos se han descrito, por ejemplo para estrés de agua, ácido abscícico (Lam E & Chua NH (1991) J Biol Chem 266(26):17131-17135) y estrés de calor (Schoffl F et al. (1989) Mol Gen Genet 217(2-3):246-53).

Las secuencias genéticas de control comprenden también las regiones 5'-no trasladadas, intrones o la región 3' no trasladada de genes como por ejemplo el intron actin-1 o el intron Adh1-S 1, 2 y 6 (en general: The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Se ha mostrado que éstas pueden desempeñar una función significativa en la regulación de la expresión génica. Así se ha mostrado que las secuencias no trasladas 5' pueden reforzar la expresión transitoria de genes heterólogos. A manera de ejemplo, para reforzadores de traslación se nombra la secuencia líder 5' del virus mosaico del tabaco (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15:8693-8711) y similares. Además, pueden promover aún más la especificidad de tejido (Rouster J et al. (1998) Plant J
15:435-440).

El casete de expresión recombinante puede comprender ventajosamente una o más de lo que se conocen como "secuencias promotoras" ("enhancer secuencies"), enlazadas funcionalmente al promotor, lo cual hace posible una expresión recombinante aumentada de la secuencia de ácido nucleico. Secuencias ventajosas adicionales, tales como otros elementos regulatorios o terminadores, también pueden insertarse en el extremo 3' de las secuencias de ácido nucleico a expresarse de manera recombinante. Las secuencias de ácido nucleico a expresarse de manera recombinante pueden estar contenidas en una o varias copias en el constructo génico.

Las señales de poliadenilación que son adecuadas como secuencias de control son señales de poliadenilación vegetales, preferible aquellas que esencialmente corresponden a señales de poliadenilación de T-ADN de Agrobacterium tumefaciens, en especial del terminador OCS (octopin-sintasa) y el terminador NOS (nopalin-sintasa).

Como secuencias de control se deben entender además aquellas que hacen posible una recombinación homóloga o inserción en el genoma de un organismo huésped o que permiten la remoción desde el genoma. En el caso de recombinación homóloga, el promotor natural de un gen BI1 puede intercambiarse, por ejemplo, por uno de los promotores específicos de tejido preferidos. Métodos tales como la tecnología cre/lox permiten una remoción específica de tejido, si es apropiado inducible, del casete recombinante de expresión desde el genoma del organismo huésped (Sauer B (1998) Methods. 14(4): 381-92). En este método se pegan secuencias flanqueantes determinadas (secuencias lox) que más tarde permiten la remoción por medio de cre-recombinasa.

Un casete recombinante de expresión y los vectores derivados del mismo comprenden otros elementos funcionales. El término elemento funcional debe entenderse de manera amplia y se refiere a todos aquellos elementos que tienen un efecto en la generación, amplificación o función de los casetes de expresión recombinantes, vectores u organismos recombinantes de acuerdo con la invención. Los siguientes pueden mencionarse a manera de ejemplo, pero sin limitarse:

a) marcadores de selección que confieren resistencia a un inhibidor de metabolismo tal como 2-desoxiglucosa-6-fosfato (WO 98/45456), antibióticos o biocidas, preferible herbicidas, como por ejemplo kanamycina, G 418, bleomycina, higromycina, o fosfinotricina, etc. Particularmente se prefieren marcadores de selección aquellos que confieren una resistencia contra herbicidas. A manera de ejemplo se mencionan: secuencias de ADN que codifican para fosfinotricinacetiltransferasas (PAT) e inactivan inhibidores de glutaminsintasa (gen bar y pat), genes de 5-enolpiruvilshikimat-3-fosfatsintasa (EPSP genes de sintasa), que confieren una resistencia contra Glifosato® (N-(fosfonometil)glicina), el gen gox que codifica para enzimas que degradan Glifosato® (glifosatoxidoreductasa), el gen deh (que codifican para una dehalogenasa, que desactiva Dalapon®), acetolactatosintasas que desactivan sulfonilurea e imidazolinona así como genes bxn que codifican para nitrilasaenzimas que degradan bromoxinil, el gen aasa que confiere una resistencia contra el antibiótica apectinomycina, el gen de estreptomycinfosfotransferasa (SPT), que imparte una resistencia frente a estreptomycina, el gen de neomycinfosfotransferasa (NPTII) que confiere una resistencia contra kanamycina o geneticidina, el gen de higromycinfosfotransferasa (HPT), que facilita una resistencia contra higromycina, el gen de acetolactatsintasa (ALS), que confiere una resistencia contra herbicidas de sulfonilurea (por ejemplo, variantes mutadas de ALS con, por ejemplo, la mutación de S4 y/o Hra).

b) Genes reporteros que codifican fácilmente proteóna cuantificables y, por medio de su color o de actividad enzimática, hacen posible una valoración de la eficacia de transformación, el sitio de expresión o el tiempo de expresión. En este contexto muy especialmente preferidos son proteínas reporteras (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1):29-44) tal como "green fluorescence protein" (GFP) (Sheen et al.(1995) Plant Journal 8(5):777-784; Haseloff et al.(1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(6):2122-2127; Reichel et al.(1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(12):5888-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16:267-271; WO 97/41228; Chui WL et al. (1996) Curr Biol 6:325-330; Leffel SM et al. (1997) Biotechniques. 23(5):912-8), la cloramfenicoltransferasa, una luciferasa (Ow et al. (1986) Science 234:856-859; Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10:324-414), el gen de aequorina (Prasher et al. (1985) Biochem Biophis Res Commun 126(3):1259-1268), la \beta-galactosidasa, gen R-locus (codifican una proteína que regula la producción de pigmentos de antocianina (coloración roja) en tejido vegetal y hace así posible un análisis directo de la actividad promotora cin adición de otras sustancias o sustratos cromogénicos; Dellaporta et al., en: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11:263-282, 1988), muy particularmente se prefiere la \beta-glucuronidasa (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907).

c) orígenes de replicación que aseguran amplificación de los casetes de expresión recombinantes o los vectores de acuerdo con la invención en E. coli, por ejemplo. A manera de ejemplo se mencionan ORI (origen de replicación de ADN), el ori pBR322 o el ori P15A (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

d) Elementos que son requeridos para una transformación de vegetal mediada por agrobacterium, tales como, por ejemplo, la limitación derecha o izquierda del T-ADN o la región vir.

Para la selección de células recombinadas o también transformadas de manera homóloga con éxito, normalmente es indispensable introducir adicionalmente un marcador seleccionable que confiera resistencia frente a un biocida (por ejemplo, un herbicida), un inhibidor de metabolismo tal como 2-sesoxiglucosa-6-fosfato (WO 98/45456) o un antibiótico. El marcador de selección permite la selección de las células transformadas de las no transformadas (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84).

La introducción de un casete de expresión recombinantes de acuerdo con la invención a un organismo o células, tejidos, órganos, partes o semillas del mismo (preferiblemente a plantas o células vegetales, tejidos, órganos, partes o semillas) puede efectuarse de manera ventajosa usando vectores en los que están contenidos los casetes de expresión recombinantes. El casete de expresión recombinante puede introducirse en el vector (por ejemplo, un plásmido) por intersecciones de restricción adecuadas. El plásmido formado se introduce primero a E. coli. Las E. coli correctamente transformadas se seleccionan, cultivan y el plásmido recombinante se obtiene mediante métodos familiares a la persona técnica en la materia. Los análisis de restricción y secuenciación pueden servir para verificar el paso de
clonación.

Los vectores pueden ser, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus o también agrobacterias. En una modalidad ventajosa, la introducción del casete de expresión recombinante se realiza por medio de vectores de plásmido. Se prefieren aquellos vectores que hacen posible una integración estable del casete de expresión recombinante al genoma huésped.

La preparación de un organismo transformado (o de una célula o tejido transformados) requiere la introducción de ADN, ARN o proteína en cuestión a la célula huésped relevante en cuestión.

Para este proceso, el cual se denomina como transformación (o transducción o transfección) se encuentran disponibles cantidades de métodos (Keown et al. (1990) Methods Enzymol 185:527-537; Jenes B et al.(1993) Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, publicado por SD Kung y R Wu, Academic Press, pág. 128-143 sowie in Potrykus (1991) Annu Rev Plant Phisiol Plant Molec Biol 42;205-225).

Así, el ADN o ARN, por ejemplo, pueden introducirse directamente mediante microiyección o por bombardeo con micropartículas recubiertas de ADN. También la célula puede permeabilizarse químicamente usando, por ejemplo, polietilenglicol de modo que el ADN pueda entrar a la célula por difusión. El ADN también puede introducirse por fusión de protoplasto con otras unidades que contienen ADN tales como minicélulas, células, lisosomas o liposomas. Otro método adecuado de introducir ADN es electroporación, donde las células se permeabilizan de manera reversible por un pulso eléctrico. Se han descrito métodos correspondientes (por ejemplo en Bilang et al. (1991) Gene 100:247-250; Scheid et al. (1991) Mol Gen Genet 228:104-112; Guerche et al. (1987) Plant Science 52:111-116; Neuhause et al. (1987) Theor Appl Genet 75:30-36; Klein et al. (1987) Nature 327:70-73; Howell et al. (1980) Science 208:1265; Horsch et al.(1985) Science 227:1229-1231; DeBlock et al. (1989) Plant Phisiol 91:694-701).

En el caso de las plantas, los métodos arriba descritos de transformación y regeneración de plantas a partir de tejidos vegetales o células vegetales se utilizan para la transformación transitoria o estable. Métodos adecuados son especialmente transformación de protoplasto por captación de ADN inducida por polietilenglicol, el método biolístico con el cañón de gen, el así llamado método de "particle bombardement" (bombardeo de partículas), la electroporación, la incubación de embriones secos en solución con contenido de ADN y la microinyección.

Además de estas técnicas "directas" de transformación, también puede realizarse una transformación mediante infección bacteriana por medio de Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. La transformación mediada por Agrobacterium es la más adecuada para dicotiledóneas. Los métodos se describen, por ejemplo en Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229 y sig.).

Si se usan agrobacterias el casete de expresión recombinante debe integrarse a plásmidos específicos, ya sea en un vector intermedio (en inglés: shuttle or intermediate vector) o un vector binario. Si debe usarse un plásmido Ti o Ri para la transformación, al menos el límite derecho, aunque en la mayoría de casos el límite derecho e izquierdo, del T-ADN plásmido Ti o Ri se enlaza con el casete de expresión recombinante a introducirse en la forma de una región flanqueante.

Preferiblemente se usan vectores binarios. Los vectores binarios son capaces de repliación tanto en E. colo como en Agrobacterium. Normalmente comprenden un gen de marcador de selección y un linker (enlazante) o polinker flanqueado por secuencia de limitación derecha e izquierda de T-ADN. Pueden transformarse directamente en Agrobacterium (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163:181-187). El gen de marcador de selección permite una selección de agrobacterias transformadas y es el gen nptII, por ejemplo, que confiere una resistencia contra kanamycina. La Agrobacteria que en este caso funge como organismo huésped ya debe contener un plásmido con la región vir. Esta última se requiere para transferir el T-ADN a la célula vegetal. Una agrobacteria transformada de esta manera puede usarse para transformar células vegetales. El uso de T-ADN para transformar células vegetales se ha estudiad y descrito intensamente (EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter V; An et al. (1985) EMBO J 4:277-287). Se conocen diversos vectores binarios y se encuentran disponibles comercialmente, de manera parcial, como por ejemplo pBI101.2 o pBIN19 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12:8711f; Clontech Laboratories, Inc. USA). Otros promotores adecuados para la expresión en vegetales se han descrito (Rogers et al. (1987) Methods Enzymol 153:253-277; Schardl et al. (1987) Gene 61:1-11; Berger et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:8402-8406).

Por principio, las técnicas directas de transformación son adecuadas para cada organismo y tipo de célula. En el caso de inyección o electroporación de ADN o ARN en células vegetales no se requiere que los plásmidos usados cumplan algún requisito en particular. Pueden usarse plásmidos sencillos como aquellos de la serie pUC. Si deben regenerarse plantas completas de las células transformadas, es necesario que en el plásmido se localice un gen adicional de marcador seleccionable.

Pueden seleccionarse células transformadas establemente, es decir, aquellas que contienen ADN introducido, integrado al ADN de la célula huésped, de células no transformadas cuando un marcador seleccionable es componente del ADN introducido. Como marcador puede fungir, por ejemplo, cada gen que es capaz de conferir una resistencia frente a antibióticos o herbicidas (como kanamycina, G 418, bleomycina, higromycina o fosfinotricina, etc.) (véase arriba). Las células transformadas que expresan un gen de marcador así son capaces de sobrevivir en la presencia de concentraciones de un antibiótico o herbicida correspondiente que puede matar un tipo silvestre no transformado. Ejemplos de marcadores de selección adecuados se mencionan arriba. Una vez que una célula vegetal transformada se ha generado, puede obtenerse una planta completa usando métodos conocidos por la persona técnica en la materia. Por ejemplo, como material de partida se usan cultivos de callo. La formación de vástagos y raíces puede inducirse de manera conocida a partir de estas masas celulares aún sin diferenciar. Las plántulas obtenidas pueden plantarse y cultivarse. La persona técnica conoce métodos de regeneración de partes de plantas y de plantas intactas a partir de células vegetales. Los métodos para hacer esto se describen, por ejemplo, por Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11: 567-570; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep. 14:273-278; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89:525-533. Las plantas obtenidas pueden cultivarse e hibridarse (cruzarse) en la forma acostumbrada. Dos o más generaciones deben cultivarse para asegurar que la integración genómica es estable y hereditaria.

El método de acuerdo con la invención puede combinarse con otros métodos que producen resistencia ante patógenos (por ejemplo, frente a insectos, hongos, bacterias, nematodos y similares), resistencia frente a estrés u otro mejoramiento de las propiedades de la planta. Se mencionan ejemplo, entre otros, por Dunwell JM (2000) J Exp Bot. 51 Spec No:487-96. Se divulgan secuencias de polipéptidos que codifican para proteína BI1 que comprenden al menos una secuencia seleccionada del grupo que se compone de

a) las secuencias según SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 28, 30, 32 o 38,

b) secuencias que tienen una homología de al menos 90%, preferible de al menos 95%, particularmente preferible de al menos 98% con una de las secuencias según SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 28, 30, 32 o 38, y

c) secuencias que abarcan al menos 10, preferible al menos 20, particularmente preferible al menos 30 aminoácidos relacionados de una de las secuencias según SEQ ID NO: 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 28, 30, 32 o 38.

En la invención se usan preferiblemente secuencias de ácido nucleico que codifican para las nuevas secuencias de polipéptido de acuerdo con la invención las cuales codifican para proteína BI1. Se prefieren las secuencias de ácido nucleico según SEQ ID NO: 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 o 37, la secuencia de ácido nucleico complementaria a éstas y las secuencias derivadas de allí como resultado de la degeneración del código genético.

Para este propósito sirven casetes de expresión recombinantes que comprenden una de las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención. En los casetes de expresión recombinante, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína BI1 de cebada está enlazada con al menos un elemento de control genético según la definición de arriba de tal modo que pueda realizarse la expresión (transcripción y opcionalmente translación) en cualquier organismo, preferible en vegetales. Los elementos de control genéticos adecuados para este propósito se han descrito arriba. Los casetes de expresión recombinantes también pueden contener otros elementos funcionales según la definición de arriba. La secuencia insertada de ácido nucleico que codifica para una proteína BI1 de cebada puede insertarse en el casete de expresión en orientación sense o antisense, y así conducir a la expresión de ARN sense o antisense. De acuerdo con la invención también se usan vectores recombinantes que contienen los casetes de expresión recombinantes.

Con respecto a, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico, de un casete de expresión o de un vector que contienen dicha secuencia de ácido nucleico o a un organismo transformado con dicha secuencia de ácido nucleico, casete de expresión o vector, "recombinante" significa todas aquellas construcciones producidas mediante métodos de ingeniería genética en las que, o bien

a) la secuencia de ácido nucleico BI1, o

b) una secuencia de control genética enlazada de manera funcional con la secuencia de ácido nucleico BI1, por ejemplo un promotor, o

c) (a) y (b)

no se ubican en su ambiente natural genético o han sido modificados mediante métodos de ingeniería genética, donde la modificación puede ser, por ejemplo, una sustitución, adición, deleción, inversión o inserción de uno o más residuos de nucleótidos. Un ambiente natural genético significa el locus cromosomático natural en el organismo de origen o la presencia en una biblioteca genómica. En el caso de una biblioteca genómica, se conserva preferiblemente, al menos aún en parte el ambiente natural genético de la secuencia de ácido nucleico. El ambiente flanquea la secuencia de ácido nucleico al menos a un lado y tiene una secuencia de al menos 50 bp, preferible de al menos 500 bp, particularmente preferible de al menos 1000 bp, muy particularmente preferible de al menos 5000 bp, en longitud. Un casete de expresión recombinante que tienen lugar naturalmente, por ejemplo la combinación que tienen lugar de manera natural del promotor BI1 con el gen correspondiente BI1, se vuelve un casete de expresión recombiante cuando éste se modifica mediante métodos no naturales, sintéticos ("artificiales") tales como, por ejemplo, una mutagenización.

Se han descrito métodos correspondientes (US 5,565,350; WO 00/15815; véase arriba también).

En una modalidad la invención se refiere al uso de una molécula de ácido nucleico BI-1 codificante o de una proteína BI-1 para la preparación de una planta resistente ante patógenos, preferiblemente para la preparación de una planta resistente ante hongos o para la preparación de un fungicida que provoca esto o para controlar o tratar plantas que son atacadas por patógenos, o amenazadas por el ataque de patógenos.

Secuencias

1. SEQ ID NO: 1: Secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína BI1 de cebada (Hordeum vulgare).

2. SEQ ID NO: 2: Secuencia de aminoácido que codifica para una proteína BI1 de cebada (Hordeum vulgare).

3. SEQ ID NO: 3: Secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína BI1 de Arabidopsis thaliana.

4. SEQ ID NO: 4: Secuencia de aminoácido que codifica para una proteína BI1 de Arabidopsis thaliana.

5. SEQ ID NO: 5; Secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína BI1 de tabaco.

6. SEQ ID NO: 6: Secuencia de aminoácido que codifica para una proteína BI1 de tabaco.

7. SEQ ID NO: 7: Secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína BI1 de arroz.

8. SEQ ID NO: 8: Secuencia de aminoácido kodierende für una proteína BI1 de arroz.

9. SEQ ID NO: 9: Secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína BI1 de colza.

10. SEQ ID NO: 10: Secuencia de aminoácido que codifica para una proteína BI1 de colza.

11. SEQ ID NO: 11: Secuencia de ácido nucleico que codifica para parte de una proteína BI1de soja.

12. SEQ ID NO: 12: Secuencia de aminoácido que codifica para parte de una proteína BI1 de soja.

13. SEQ ID NO: 13: Secuencia de ácido nucleico que codifica para parte de una proteína BI1 de soja.

14. SEQ ID NO: 14: Secuencia de aminoácido que codifica para parte de una proteína BI1 de soja.

15. SEQ ID NO: 15: Secuencia de ácido nucleico que codifica para parte de una proteína BI1 de trigo.

16. SEQ ID NO: 16: Secuencia de aminoácido que codifica para parte de una proteína BI1 de trigo.

17. SEQ ID NO: 17: Secuencia de ácido nucleico que codifica para parte de una proteína BI1 de maíz.

18. SEQ ID NO: 18: Secuencia de aminoácido que codifica para parte de una proteína BI1 de maíz.

19. SEQ ID NO: 19: Secuencia de ácido nucleico que codifica para parte de una proteína BI1 de trigo.

20. SEQ ID NO: 20: Secuencia de aminoácido que codifica para parte de una proteína BI1 de trigo.

21. SEQ ID NO: 21: Secuencia de ácido nucleico que codifica para parte de una proteína BI1 de maíz.

22. SEQ ID NO: 22: Secuencia de aminoácido que codifica para parte de una proteína BI1 de maíz.

23. SEQ ID NO: 23: Secuencia de ácido nucleico que codifica para parte de una proteína BI1 de maíz.

24. SEQ ID NO: 24: Secuencia de aminoácido que codifica para parte de una proteína BI1 de maíz.

25. SEQ ID No: 25: Secuencia de ácido nucleico que codifica para parte de una proteína BI1 de trigo.

26. SEQ ID NO: 26: Secuencia de aminoácido que codifica para parte de una proteína BI1 de trigo.

27. SEQ ID NO: 27: Secuencia de ácido nucleico que codifica para parte de una proteína BI1 de maíz.

28. SEQ ID NO: 28: Secuencia de aminoácido que codifica para parte de una proteína BI1 de maíz.

29. SEQ ID NO: 29: Secuencia de ácido nucleico que codifica para el promotor patatina de patata.

30. SEQ ID NO: 30: Secuencia de ácido nucleico que codifica para el promotor 9f-3.8 de germen de trigo.

31. SEQ ID NO: 31: Secuencia de ácido nucleico que codifica para el promotor de arabidopsis CAB-2.

32. SEQ ID NO: 32: Secuencia de ácido nucleico que codifica para el promotor PPCZm1 de maíz

33. SEQ ID NO: 33: Secuencia de ácido nucleico que codifica para vector recombinante de expresión pUbiBI-1

34. SEQ ID NO: 34: Secuencia de ácido nucleico que codifica para vector recombinante de expresión
pLo114UbiBI-1

35. SEQ ID NO: 35: Secuencia de ácido nucleico que codifica para vector recombinante de expresión pOXoBI-1

36. SEQ ID NO: 36: Secuencia de ácido nucleico que codifica para vector recombinante de expresión
pLo114OXoBI-1

37. SEQ ID NO: 37: Secuencia de ácido nucleico que codifica para proteína BI-1 de trigo

38. SEQ ID NO: 38: Secuencia de aminoácido que codifica para proteína BI-1 de trigo

39. SEQ ID NO: 39: secuencia de ácido nucleico que codifica para PEN1 (= ROR2) de cebada

40. SEQ ID NO: 40: Secuencia de aminoácido que codifica para PEN1 (= ROR2) de cebada

41. SEQ ID NO: 41: secuencia de ácido nucleico para PEN1 (= ROR2) de arabidopsis thaliana

42. SEQ ID NO: 42: Secuencia de aminoácido que codifica para PEN1 (= ROR2) de arabidopsis thaliana

43. SEQ ID NO: 43: Secuencia de ácido nucleico que codifica para SNAP34 de cebada

44. SEQ ID NO: 44: Secuencia de aminoácido que codifica para SNAP34 de cebada

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Figuras

1. Fig. 1a-d: Comparación de secuencia de proteínas de diversas proteínas BI-1 de plantas. AtBI-1: Arabidopsis; BnBI-1: Brassica napus (colza); GmBI2: Glycine max (soja; Variante 1); GmBI3: Glycine max (soja; Variante 2); HVBI-1: Hordeum vulgare (cebada); NtBI-1: Nicotiana tabacum (tabaco); OsBI-1: Oryza sativa (arroz); TaBI11: Triticum aestivum (trigo, Variante 1); TaBI18: Triticum aestivum (trigo, Variante 2); TaBI5 neu: Triticum aestivum (trigo, Variante 3); ZmBI14: Zea mays (maíz; Variante 1); ZmBI16: Zea mays (maíz; Variante 2); ZmBI33: Zea mays (maíz; Variante 3); ZmBI8: Zea mays (maíz; Variante 4); Consenso: secuencia de consenso derivada de la alineación (alignment).

2. Fig. 2: mapa vector para el vector pUbiBI-1 (Ubi: Promotor ubiquitina; BI-1 Secuencia de ácido nucleico que codifica para proteína BI1 de cebada; ter: terminador de transcripción). También se indica la localización de las intersecciones de diversas enzimas de restricción.

3. Fig. 3: mapa vector para el vector pLO114UbiBI-1 (Ubi: Promotor ubiquitina; secuencia de ácido nucleico BI-1 que codifica para proteína BI1 de cebada; ter: terminador de transcripción). También se indica la localización de las intersecciones de diversas enzimas de restricción.

4. Fig. 4: Mapa vector para el vector pOxoBI-1 (Oxo: Promotor de TaGermin 9f-2.8; Secuencia de ácido nucleico BI-1 que codifica para proteína BI1 cebada; ter: Terminador de transcripción). También se indica la localización de las intersecciones de diversas enzimas de restricción.

5. Fig. 5: Mapa vector para el vector pLO114OxoBI-1 (Oxo: Promotor TaGermin 9f-2.8; Secuencia de ácido nucleico BI-1 que codifica para proteína BI1 de cebada; ter: terminador de transcripción). También se indica la localización de las intersecciones de diversas enzimas de restricción.

6. Fig. 6: Comparación de las secuencias de proteína de proteínas BI-1 de cebada (Hordeum vulgare, GenBank Acc.-No.: CAC37797), arroz (Oryza sativa, GenBank Acc.-No.: Q9MBD8), arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: Q9LD45) y ser humano (Homo sapiens, GenBank Acc.-No.: AAB87479). Los aminoácidos puestos en negro son idénticos en todas las especies. Las barras indican los siete dominios de transmembranas predichos en HvBI-1.

7. Fig. 7: expresión BI-1 en líneas de cebada resistentes y susceptibles (análisis de cADN Gelblot): cADNs se sintetizaron por medio de RT-PCR a partir de ARN total. ARN total se obtuvo a partir de línea de cebada susceptible Pallas, línea de cebada resistente BCPMla12 y línea resistente de cebada BCPmlo5 en el tiempo 0 (es decir, inmediatamente antes de la inoculación), y respectivamente 1, 4 y 7 días después de la inoculación con Bgh y en paralelo con esto a partir de plantas de control sin infectar (\diameter). El RT-PCR para BI-1 se llevó a cabo usando 20 ciclos (véase abajo). La cantidad de ARN empleada (0.5 \mug) se controló adicionalmente en geles por medio de tinturado de rARN con bromuro de etidio. La repetición del experimento arrojó resultados comparables.

8. Fig. 8: BI-1 se expresa en el tejido de mesófilo (análisis de cADN gelblot). RT-PCR se llevó a cabo a partir de ARN aislado de Pallas (P) y BCPM1a12 (P10) (24 h después de inocular con BghA6). Para la extracción del ARN total se separaron bandas epidérmicas abaxiales (E, inokulierte Positionen der Blätter) del mesófilo y de la epidermis adaxial (M). Se usó ubiquitina 1 (Ubi) como marcador para expresión de gen no específico para tejido. RT-PCR se realizó usando 30 ciclos.

9. Fig. 9: Expresión BI-1 se reprime durante inducción de resistencia química.

(A): resistencia inducida químicamente en la línea de cebada Pallas gg. Blumeria graminis (DC) Speer f.sp. hordei (Bgh). Las hojas primarias de cebada se trataron con ácido 2,6-dicloroisonicotínico (DCINA) y mostraron menos pústulas de mildiú que las plantas de control correspondientes no tratadas.

(B): ARN y cADN Blots. ARN (10 \mug) se analizó 0, 1, 2 y 3 días después del tratamiento del suelo (soil drench treatment; dpt) con DCINA o con el control (sustancia portadora) y adicionalmente 1 y 4 días después de la inoculación (dpi, corresponde a 4 ó 7 dpt). RT-PCR (Ubi, BI-1) se realizó usando 20 ciclos. La repetición condujo a resultados comparables (véase ejemplo 2). Como control se empleó BCI-4. BCI-4 es un gen inducido por DCINA (Besser et al. (2000) Mol Plant Pahol. 1 (5): 277-286) y un miembro de la familia de genes inducidos químicamente (Barley Chemically (=BTH) Induced).

10. Fig. 10: sobreexpresión de supersusceptibilidad inducida BI-1.

(A): Eficiencia promedio de penetración de Bgh en 6 experimentos independientes con Bgh sobre línea de cebad Ingrid. PE de Bgh se incrementó de manera significativa (p<0.01, prueba de Students) en las células que fueron transformadas (bombardeadas) con pBI-1 en comparación con células que fueron bombardeadas con el vector vacío de control (pGY1).

(B): La eficiencia de penetración de Bgh sobre células fueron bombardeadas con un constructo antisense BI-1 (pasBI-1), fue reducido de una manera insignificante (p>0.05) en comparación con las células que fueron bombardeadas con el vector vacío de control (pGY1). Las columnas reflejan en cada caso el valor medio de los experimentos individuales. Las barras representan el error estándar.

11. Fig. 11: Sobreexpresión de ruptura inducida BI-1 de la resistencia de penetración mediada por mlo5.

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La eficiencia de penetración de Bgh se valoró en 3 a 4 experimentos independientes usando Bgh en las líneas de cebada Ingrid-mlo5 o bien Pallas-mlo5. La PE causada por Bgh se incrementó de manera significativa (p<0.05) en las células que se habían transformado (bombardeado) con pBI-1 en comparación con las células que habían sido bombardeado con el vector vacío de control (pGY1). Las columnas reflejan en cada caso el valor medio de tres experimentos independientes. Las barras representan el error estándar.

12. Fig. 12: La expresión de BI-1 se induce por filtrados de cultivo tóxicos a partir de Bipolaris sorokiniana. Northern-Blots (10 \mug de ARN total) con ARN de Ingrid (I) y BCIngrid-mlo5 (I22). ARN se aisló 0, 24, 48 y 72 h después de la inyección del filtrado de cultivo tóxico de Bipolaris sorokiniana (T) o agua (W). mARNs BI-1 se detectó en membranas de nylon después de lavado estricto. BI-1: Detección de inhibidor BAX 1 mARN; Ubi: Detección de ubiquitina 1; Asprot: Detección de la aspartatproteasa mARN; hat: horas después de tratamiento ("h after treatment")

13. Fig. 13: sobreexpresión BI-1 rompe resistencia que no es de huésped de cebada (cv. Manchuria) frente a Blumeria graminis f.sp. tritici. Velocidades de penetración fueron analizadas en tres experimentos independientes.

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Ejemplos Métodos generales

La síntesis química de oligonucleótidos puede efectuarse, por ejemplo, de la manera conocida usando el método de fosfoamidita (Voet, Voet, 2. edición, Wiley Press New York, páginas 896-897). Los pasos de clonación realizados para los propósitos de la presente invención tales como, por ejemplo, escisiones de restricción, electroforesis de gel agarosa, purificación de fragmentos de ADN, transferencia de ácidos nucleicos a membranas de nitrocelulosa y nylon, enlazamiento de fragmentos de ADN, transformación de células de E. coli, cultivo de bacterias, multiplicación de fagos y análisis secuencias de ADN recombinante, se realizan tal como se describe en Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6. La secuenciación de moléculas de ADN recombinante se realiza con un secuenciador de ADN de fluorescencia por láser de la empresa MWG-Licor según el método de Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467).

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Ejemplo 1

Plantas, patógenos e inoculación

Las variedades de cebada Ingrid, Pallas y la línea retro-cruzada BCPMla12, BCPmlo5 y BCIngrid-m lo5 (I22) fueron puestas a disposición por Lisa Munk, Department of Plant Pathology, Royal Veterinary and Agricultural University, Kopenhagen, Dinamarca. Su preparación se ha descrito (Kølster P et al. (1986) Crop Sci 26: 903-907).

A menos que se describa otra cosa, la semilla que había sido pre-germinada sobre papel filtro húmedo durante 12 a 36 h en la oscuridad se sembró a lo largo del borde una maceta cuadrangular (8x8 cm) de a 5 granos en tierra Fruhstorfer del tipo P, se cubrió con tierra y se regó regularmente con agua corriente de acueducto. Todas las plantas se cultivaron en cabinas o cámaras de ambiente controlado (climatizadas) por 5 a 8 días a 18ºC, 60% de humedad relativa de aire y un ciclo de luz de 16 horas y de oscuridad de 8 horas con 3000 ó 5000 lux (50 ó 60 \mumols^{-1}m^{-2} densidad de flujo de fotones) 5 a 8 días y se usaron en los experimentos en la etapa de plántulas. En experimentos en los que las aplicaciones se realizaron a las hojas primarias, éstas últimas se habían desarrollado plenamente.

Antes de los experimentos de transfección transitoria, las plantas se cultivaron en cabinetes o cámaras climatizados a una temperatura durante del día de 24ºC, de noche 20ºC, 50 a 60% de humedad relativa del aire y un ciclo de luz de 16 horas de oscuridad de 16 horas con 30000 lux.

Para la inoculación de las plantas de cebada se usó mildiú auténtico de cebada Blumeria graminis (DC) Speer f.sp. hordei Em. Marchal de la raza A6 (Wiberg A (1974) Hereditas 77: 89-148) (BghA6). Este fue suministrado por el Instituto para Biometría, JLU Gießen. El post-cultivo del inóculo se llevó a cabo en cámaras climatizadas en las mismas condiciones que se describieron arriba para las plantas, transfiriendo los conidios de material vegetal infectado a plantas de cebada cv. Golden Promise, de 7 días de edad, cultivadas regularmente, a una densidad de 100 ronidios/mm^{2}.

La inoculación se llevó a cabo sobre hojas primarias de plantas de cebada con las siguientes densidades de conidios: 5 conidios/mm^{2} en el caso de inducción química de resistencia y valoración macroscópica del éxito de inducción, 50 conidios/mm^{2} en el caso de estudios de expresión de gene y 150 conidios/mm^{2} en el caso de verificación de la transformación de gene con segmentos de hoja transformados. La inoculación con BghA6 se efectuó usando embriones de 7 días de edad agitando los conidios de plantas ya infectadas en una columna de inoculación (siempre que no se indique algo diferente).

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Ejemplo 2

Modulación de la expresión BI1 con DCINA

Se aplicó ácido 2,6-diclorisonicotínico (DCINA, Syngenta AG, Basel, Suiza; como fórmula al 25% (w/w)) sobre brotes de cebada de 4 días de edad de la vairedad Pallas por medio de riego del suelo ("soil drench") en una concentración final de 8 mg/l de volumen de suelo. La suspensión usada se aplicó con agua de acueducto.Como control sirvió un riego de suelo con el material portador (polvo que puede mojarse "wettable powder"). Después de tres días las plantas se infectaron con Blumeria graminis (DC) Speer f.sp. hordei Em. Marchal de la raza A6 (5 conidios/mm^{2}). Las plantas con resistencia inducida químicamente (CIR) tucieron cerca de 70% menos de colonias de mildiú sobre las plantas de control correspondientes, que solo se trataron con la sustancia portadora (Fig. 9A).

Northern Blot y RT-PCT Blots se efectuaron para determinar las cantidades de transcripto de BI1; estos revelaron una reducción sorprendente de la expresión de BI1 1 a 3 días después del tratamiento químico (Fig. 9B).

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Ejemplo 3

Extracción de ARN

Se extrajo ARN total de 8 a 10 segmentos de hojas primarias (longitud 5 cm) por medio de "RNA Extraction Buffer" (búfer de extracción de ARN) (AGS, Heidelberg, Alemania). Para este propósito se recogieron los segmentos centrales de las hojas primarias de 5 cm de longitud y se homogenizaron en morteros en nitrógeno líquido. El homogenizado se almacenó a -70ºC hasta que se extrajo el ARN. El ARN total se extrajo del material de la hoja, congelado a profundidad, con la ayuda de un kit de extracción de ARN (AGS, Heidelberg). Para este efecto, 200 mg del material de hoja profundamente congelado se cubrió con 1,7 ml de búfer de extracción de ARN (AGS) en un tubo de microcentrífuga (2 ml) e inmediatamente se mezcló bien. Después de la adición de 200 \muL de cloroformo, la mezcla se volvió a mezclar bien y se sacudió por 45 minutos en un agitador horizontal a 200 rpm a temperatura ambiente. Para separar las fases, a continuación se centrifugaron los tubos por 15 minutos a 20 000 g y 4ºC, la fase superior acuosa se transfirió a un tubo nuevo de microcentrífuga mientras que la fase del fondo fue descartada. La fase acuosa se purificó con 900 \muL de cloroformo homogenizando por 10 segundos y re-centrifugando (véase arriba) y retirando la fase acuosa (3 veces). Luego, se adicionaron 850 \muL de 2-propanol y la mezcla se homogenizó y se puso en hielo por 30 a 60 minutos para precipitar el ARN. Después, la mezcla se centrifugó por 20 minutos (véase arriba), el sobrenadante se decantó con cuidado, se adicionaron mediante pipeta 2 mL de etanol al 70% (-20ºC), se mezclo la mezcla y se re-centrifugó por 10 minutos. Luego, se volvió a decantar el sobrenadante y el pelet se liberó cuidadosamente del fluido residual, usando una pipeta y luego se secó en una corriente de aire limpio antes de colocarse en un sitio de trabajo con aire limpio. Luego se disolvió el ARN en 50 \muL de DEPC - agua en hielo, se mezcló y se centrifugó por 5 minutos (véase arriba). 40 \muL del sobrenadante, en calidad de solución de ARN, se transfirieron a un tubo nuevo de microcentrífuga y se almacenaron a -70ºC.

La concentración del ARN se determinó fotométricamente. Para este propósito se diluyó la solución de ARN 1:99 (v/v) con agua destilada y la extinción se midió a a 260 nm (fotómetro DU 7400, Beckman) (E_{260} nm = 1 a 40 \mug de ARN/mL). Las concentraciones de las soluciones de ARN se ajustaron a continuación a 1 \inftyg/\inftyL con DEPC-agua para hacer coincidir los contenidos calculados de ARN y se verificaron en un gel de agarosa.

Para verificar las concentraciones de ARN en un gel de agarosa horizontal (1% de agarosa en búfer 1 x MOPS con 0,2 \mug/mL de bromuro de etidio) se trató 1 \muL de solución de ARN con 1 \muL de 10 x MOPS, 1 \muL de marcador de color y 7 \muL de DEPC-agua, se separó de acuerdo con su tamaño a una tensión (voltaje) de 120 V en el gel en búfer corriente 1 x MOPS por 1,5 h y se fotografió bajo luz UV. Diferencias eventuales en la concentración de los extractos de ARN se ajustaron con DEPC-agua y se verificó de nuevo el ajuste en el gel.

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Ejemplo 4

Clonación de secuencia de cADN BI1de cebada

El clon de longitud completa de hvBI1 (GenBank Acc.-No.: AJ290421) comprende en el extremo 3' dos stop-codones y un codón de inicio potencial en el extremo 5'. El ORF se extiende 247 aminoácidos y muestra el más alto grado de homología de secuencia con un gen BI1 del arroz, maíz, Brassica napus y Arabidopsis thaliana (respectivamente 86% de identidad a nivel de nucleótidos) y un homólogo humano BI1 (53% de similitud) (Fig. 1 y 6). La secuencia de aminoácido de hvBI1 comprende siete dominios potenciales de transmembrana con una orientación del término C en citosol.

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Se prepararon los siguientes constructos:

a) Amplificación de un fragmento 478 bp del ADN BI1 de cebada BI1 cADN (GenBank Acc.-No.: AJ290421)

BI1-sense: 5'-atggacgccttctactcgacctcg-3'

BI1-antisense: 5'- gccagagcaggatcgacgcc-3'

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b) Amplificación de un fragmento de cADN 513 bp Ubi (GenBank Acc.-No.: M60175)

UBI-sense: 5'-ccaagatgcagatcttcgtga-3'

UBI-antisense: 5'-ttcgcgataggtaaaagagca-3'

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c) Amplificación de un marco de lectura BI1 de longitud completa 871 bp

BI1VL sense: 5'-ggattcaacgcgagcgcaggacaagc-3'

BI1VL antisense: 5'-gtcgacgcggtgacggtatctacatg-3'

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Los fragmentos obtenidos se ligaron al vector pGEM-T por medio de una ligadura T-excedente y sirvieron como plásmidos de partida para la generación de sondas (por ejemplo para Northern-Blot) o bien dsRNA.

Los constructos individuales llevaban la denominación pGEMT-BI1, pGEMT-BI1VL(240) y pGEMT-UBI.

El producto de longitud completa BI1 se re-clonó a partir de pGEMT en la intersección SalI del vector pGY-1 (Schweizer, P., Pokorny, J., Abderhalden, O. & Dudler, R. (1999) Mol. Plant-Microbe Interact. 12, 647-654) usando la intersección SalI en pGEMT y por medio de la intersección que había sido anexado al primer antisense BI1VL. Los vectores con orientación sense (pBI-1) y antisense (pasBI-1) se aislaron y se resecuenciaron. Los vectores contienen la secuencia BI-1 bajo control del promotor CaMV 35S.

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Ejemplo 5

Transcripción reversa - reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR)

Para detectar pequeñas cantidades de transcripto, se efectuó un RT-PCR semicuantitativo usando el "OneStep RT-PCR Kit" (Qiagen, Hilden, Germany). En tal caso, primero se trasladó el ARN (véase arriba el aislamiento) a cADN (transcripción reversa) y el cADN buscado se amplificó en una reacción PCR a continuación usando primers específicos. Para estimar la cantidad inicial de ARN matricial se interrumpió la amplificación durante la fase exponencial (después de 20 ciclos) para reflejar las diferencia en el ARN de destino. Los productos de PCR se separaron por medio de un gel agarosa, denaturalizada, borronearon (blotted) en membranas de nylon y detectaron con sondas específicas marcadas no radioactivamente en condiciones estándar estrictas. La hibridación, los pasos de lavado y la inmunodetección se efectuaron tal como se describe bajo el "Northern Blot". Para las reacciones individuales (tanda de 25 \muL) se combinaron los siguientes componentes usando el kit de RT-PCR de un paso "one Step RT-P CR Kit" (Qiagen, Hilden, Alemania):

: 1000 ng de ARN total de una muestra determinada

: 0,4 mM dNTPs,

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En cada caso 0,6 \muM de cada primer sense y antisense

: 0,10 \mul de inhibidor RNasa

: 1 \muL de mezcla de enzima en buffer 1x RT

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La cADN-sintasa (Transcripción reversa) se efectuó por 30 min a 50ºC. A continuación se inactivó la transcriptasa reversa por 15 min a 95ºC, lo cual simultáneamente causa la activación de polimerasa de ADN y desnaturalización de cADN. A continuación se llevó a cabo una PCR con el siguiente programa: 1 min con 94ºC; 25 ciclos de 1 min a 94ºC; 1 min a 54ºC y 1 min a 72ºC; para terminar 10 min a 72ºC. Luego, almacenamiento a 4ºC hasta seguir el procesamiento. Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa 1xTBE con bromuro de etidio. Para las amplificaciones en las tandas individuales se usaron los pares de primers indicados arriba.

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Ejemplo 6

Análisis de Northem-Blot

Para la preparación del Northern-Blotting se separó ARN en gel de agarosa en condiciones desnaturalizantes. Para este efecto, parte de la solución de ARN (correspondiente a 10 \mug de ARN) fue mezclado con un volumen idéntico del búfer de muestra (con bromuro de etidio), desnaturalizado por 5 minutos a 94ºC, colocado en hielo por 5 minutos, centrifugado brevemente y aplicado al gel. El gel de 1 x MOPS (1,5% de agarosa, ultra pura) contenía 5 por ciento en volumen de solución concentrada de formaldehído (36,5% [v/v]). El ARN se separó por 2 horas a 100 V durante 2 h y a continuación se borroneó (blottet).

El Northern-Blotting se efectuó en corriente capilar como una transferencia de ARN dirigida hacia arriba. Para esto, primero se agitó el gel suavemente por 30 min en búfer de fosfato hidrosódico/dihidro fosfato de 25 mM (pH 6,5) y se cortó al tamaño. Se preparó un papel Whatman se tal manera que se colocó en una placa horixontal y se extendió en 2 lados en una cuba con búfer de fosfato hidrosódico/dihidro fosfato de 25 mM. Sobre este papel se puso el gel y las partes del papel Whatman no cubiertas se cubrieron con una película plástica. Entonces, se cubrió el gel con una membrana de nylon cargada positivamente (Boehringer-Mannheim) libre de burbujas de aire, después de lo cual la membrana se volvió a cubrir con una pila de papel absorbente hasta una altura de 5 cm. Además, se puso un peso de 100 g y una placa de vidrio sobre el papel absorbente. El blotting se efectuó por una noche a temperatura ambiente. La membrana se enjuagó brevemente en agua bi-destilada y se irradió con luz UV en un aparato Crosslinker (Biorad) con una energía de luz de 125 mJ para inmovilizar el ARN. Ña uniformidad de la transferencia de ARN a la membrana se verificó en un banco de luz UV.

Para la detección de mARn de cebada se separaron 10 mg de ARN total de cada muestra en un gel de agarosa y se blotearon sobre una membrana de nylon cargada positivamente mediante transferencia capilar. La detección se efectuó usando el sistema DIG de acuerdo con las especificaciones de manufactura con sondas de ARN antisense marcadas de digoxigenina (tal como se describe en Hückelhoven R et al. (2001) Plant Mol Biol 47:739-748).

Preparación de las sondas: para la hibridación con los mARNs a detectarse se prepararon sondas de ARN marcadas con digoxigenina o fluoresceína. Estas se generaron mediante transcripción in vitro de un producto PCR por medio de una polimerasa de ADN T7 o SP6 con UTPs marcados. Como modelo para la amplificación apoyada en PCR sirvieron los vectores de plásmido arriba descritos pGEMT-BI1, pGEMT-UBI. Según la orientación del inserto, se usaron diferentes polimerasas de ARN para la preparación de la cadena antisense. Se usó polimerasa ARN T7 para pGEMT-BI1, mientras que la polimerasa ARN SP6 se usó para pGEMT-UBI. El inserto del vector individual se amplificó por PCR con primers estándar flanqueantes (M13 fwd y rev). La reacción transcurrió en tal caso con las concentraciones finales siguientes en un volumen total de 50 \muL de búfer PCR (Silverstar):

M13-fwd: 5'-GTAAAACGACGGCCAGTG-3'

M13-Rev: 5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3'

10% Dimetilsulfóxido (v/v)

De a 2 ng/\muL de primer (M13 forward y reversed)

1,5 mM MgCl_{2},

0,2 mM dNTPs,

4 Units Taq-Polimerasa (Silverstar),

2 ng/\muL Plasmid-ADN.

La amplificación transcurrió en un Thermocycler (Perkin-Elmar 2400) con temperatura controlada con el siguiente programa: 94ºC por 3 min; 30 ciclos con 94ºC por 30 segundos, 58ºC por 30 segundos y 72ºC por 1,2 min; 72ºC por 5 min; a continuación enfriamiento a 4ºC hasta seguir con el procesamiento. El éxito de la reacción se verificó en gel de agarosa al 1%. Los productos se purificaron a continuación con un kit producto PCR de alta pureza ("High Pure PCR-Product Purification Kit") (Boehringer-Mannheim). Se obtuvieron alrededor de 40 \muL de producto eluido de la columna que fue verificado nuevamente en el gel y se almacenó a -20ºC.

La polimerización de ARN, la hibridación y la inmunodetección se realizaron en gran medida siguiendo las instrucciones del fabricante del kit con respecto a la detección no radioactiva del ARN (DIG System User's Guide, DIG-Luminescence detection Kit, Boehringer-Mannheim, Kogel et al. (1994) Plant Phisiol 106:1264-1277). 4 \mul de producto PCR fueron tratados con 2 \muL de búfer de transcripción, 2 \mul de mezcla de marcación NTP, 2 \mul de mezcla NTP y 10 \mul de DEPC-agua. A continuación 2 \muL de la solución de polimerasa de ARN T7 fueron adicionados mediante pipeta. La reacción se realizó luego por 2 h a 37ºC y a continuación se llevó a 100 \muL con DEPC-agua. La sonda de ARN se detectó en el gel de bromuro de etidio y se almacenó a -20ºC.

Para preparar la hibridación, primero se agitaron suavemente las membranas por 1 h a 68ºC en 2 x SSC (salt, Sodiumcitrate), búfer de SDS 0,1% (dodecilsulfato de sodio); el búfer se renovó de 2 a 3 veces. Las membranas se aplicaron a continuación a la pared interna de los tubos de hibridación precalentados a 68ºC y se incubaron por 30 min con 10 mL de búfer de hibridación Dig-Easy en la estufa de hibridación precalentada. Mientras tanto se desnaturalizaron 10 \muL de solución de sonda en 80 \muL de búfer de hibridación por 5 minutos a 94ºC, a continuación la mezcla se puso en hielo y se centrifugó brevemente. Para la hibridación se transfirió luego la sonda a 10 mL de búfer de hibridación a una temperatura de 68ºC y se reemplazó el búfer en el tubo de hibridación por el búfer de sonda. La hibridación se efectuó por una noche, así mismo a 68ºC. Antes de la inmunodetección de híbridos de ARN-ADN, los blots se lavaron dos veces en condiciones estrictas por 20 minutos en cada caso en 0.1% (p/v) SDS, 0.1 x SSC a 68ºC. Para la inmunodetección los blots primero se agitaron suavemente dos veces por 5 minutos en 2 x SSC, 0,1% SDS a RT. A continuación se efectuaron 2 pasos de lavados estrictos a 68ºC en 0,1 xSSC, 0,1% SDS de a 15 min. La solución se reemplazó luego por búfer de lavado sin Tween. La mezcla de reacción se agitó por 1 minuto y la solución se intercambió por reactivo bloqueante. Después de agitar otros 30 minutos se adicionaron 10 \muL de solución de anticuerpo antifluoresceina y se continuó agitando por 60 minutos. Siguieron dos pasos de lavados de 15 minutos cada uno en búfer de lavado con Tween. La membrana se equilibró a continuación 2 min en búfer de sustrato y después de haberlo dejado drenar se transfirió a una lámina de acetato. Sobre el "lado de ARN" de la membrana se repartió uniformemente luego una mezcla de 20 \muL de CDP-Star^{TM} y 2 mL de búfer de sustrato. Después, la membrana se cubrió con una segunda lámina de acetato y los bordes se sellaron con calor para suministrar un sello hermético al agua, evitando burbujas de aire. En un cuarto oscuro, la membrana se cubrió luego por 10 minutos con una película de rayos X y luego se desarrolló la película. El tiempo de exposición varió en función de la intensidad de la reacción luminiscente.

Si no se distingue por nada extraordinario, las soluciones estaban contenidas en el alcance de entrega del kit (DIG-Luminescence detection Kit, Boehringer-Mannheim). Todas las otras se prepararon a partir de las siguientes soluciones patrón mediante dilución con agua destilada autoclavada. A menos que se especifique otra cosa, todas las soluciones patrón se hicieron con DEPC (como DEPC-agua) y a continuación se autoclavaron.

- DEPC-Agua: agua destilada es tratada por una noche a 37ºC con dietilpirocarbonato (DEPC, 0,1%, p/v) y a continuación se autoclava

- Búfer 10 x MOPS: 0,2 M MOPS (ácido morfolin-3-propansulfónico), 0,05 M acetato de sodio, 0,01 M EDTA, pH ajustado con 10 M NaOH a pH 7,0

- 20 x SSC (cloruro de sodio - citrato de sodio, Salt-Sodiumcitrate): 3 M NaClo, 0,3 M citrato trisódico x 2 H_{2}O, pH ajustado con 4 M HCl a pH 7,0.

- 1% SDS (dodecilsufato de sodio, Sodiumdodecilsulfate) dodecilsulfato de sodio (p/v), sin DEPC

- búfer de muestra de RNA: 760 \muL de formamida, 260 \muL de formaldehído, 100 \muL de bromuro de etidio (10 mg/mL), 80 \muL de glicerina, 80 \muL de bromfenol azul (saturado), 160 \muL de 10 x MOPS, 100 \muL de agua.

- 10 x búfer de lavado sin Tween: 1,0 M ácido maleico, 1,5 M NaCl; sin DEPC, con NaOH (sólido, cerca de 77 g) y 10 M NaOH pH ajustado a 7,5.

- Búfer de lavado con Tween: a partir de búfer de lavado sin Tween con Tween (0,3%, v/v)

- 10 x reactivo bloqueante: suspender 50 g de polvo bloqueante (Boehringer-Mannheim) en 500 mL de búfer de lavado sin Tween.

- Búfer de sustrato: 100 mM Tris (trishidroximetilamino-metano), 150 mM NaCl con 4 M HCl pH ajustado a 9,5.

- 10 x marcador de color: 50% de glicerina (v/v), 1,0 mM EDTA pH 8,0, 0,25% bromfenolazul (p/v), 0,25% xilencianol (p/v).

Una expresión BI1 se analizó tal como se describe usando RT-PCR y cADN Gelblots y se reveló que BI1 se expresa de manera predominante en el tejido de mesófilo de las hojas mientras que ubiquitina se expresa de manera constitutiva uniformemente en la epidermis y mesófilo (Fig. 8).

Además debe observarse una expresión de BI1 como respuesta al tratamiento de plantas con filtrados de cultivos tóxicos de Bipolaris sorokiniana. Las hojas primarias de cebada muestran manchas necróticas típicas (leaf spot blotch symptoms) después de tratar las plantas con filtrados de cultivo tóxico de Bipolaris sorokiniana (realizado tal como se describe por Kumar et al. 2001). La necrosis de hoja fue discernible 48 horas después del tratamiento. La lesión de tejido observada fue más claramente sobresaliente en la línea Bgh-resistente BCIngrid-mlo5 (I22) que en la línea padre Ingrid (Mlo-genotipo. Kumar et al. 2001). La expresión de BI1se correlaciona con la manifestación de la necrosis de hoja 72 horas después del tratamiento (hat) (Fig. 12).

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Ejemplo 7

El promotor de oxalato oxidasa de trigo (germin 9f-2.8) se emplea para obtener sobreexpresión estable, específica de mesófilo. En cebada, la correspondiente expresión de oxalato-oxidasa es específica de mesófilo, débilmente constitutiva y sensible a patógeno (Gregersen PL et al. (1997) Phisiol Mol Plant Pathol 51: 85-97). Por lo tanto puede utilizarse para la expresión específica de mesófilo de BI1. Como un control, HVBI1 se sobre-expresa bajo el control de promotor de ubiquitina de maíz (Christensen AH et al. (1992) Plant Mol Biol 18:675-689) o del promotor de actina de arroz (Zhang W et al. (1991) Plant Cell 3:1155-1165). Los siguientes constructos se emplean:

a) pUbiBI-1 (SEQ ID NO: 33; para transformación transitoria de cebada y de trigo con bombardeo de partículas. Expresión de BI-1 bajo control del promotor de ubititna del maíz).

b) pLo114UbiBI-1 (SEQ ID NO: 34; obtenida mediante re-clonación del casete de expresión Ubi/BI-1 como fragmento EcoR1 de pUbiBI-1 en pLo114-GUS-Kan; vector binario para la transformación transitoria de cebada con A. tumefaciens)

c) pOXoBI-1 (SEQ ID NO: 35; promotor específico de mesófilo TaGermin 9f-2.8 de BI1 para la transformación de trigo mediante bombardeo de partículas.

d) pLo114OXoBI-1 (SEQ ID NO: 36)

Cebada y trigo de tipo silvestre, así como cebada -mlo se transforman, se propagan y se polinizan. La transformación de cebada y trigo se efectúa como se ha descrito (Repellin A et al. (2001) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 64: 159-183): para este propósito se transforman callos de embriones inmaduros de trigo (o c ebada) por transferencia genética biolítica con microproyectiles. En este caso se co-transforman vectores basados en pUC junto con vectores que llevan los marcadores de selección. A continuación, los embriones se cultivan en un medio de selección y se regeneran. La cebada de transforma con la ayuda de Agrobacterium tumefaciens. En este caso, se emplea un vector binario basado en pcambia1301. Los embriones inmaduros de cebada se co-cultivan con A. tumefaciens, se seleccionan y después se regeneran (Repellin A et al. (2001) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 64: 159-183; Horvath H et al. (2003) Proc Natl. Acad Sci USA 100: 365-369; Horvath H et al. (2002) en Barley Science, eds. Slafer, G. A., Molina-Cano, J. L., Savin, R., Araus, J. L. & Romagosa, J. (Harworth, New York), pp. 143-1.76; Tingay S et al. (1997) Plant J. 11: 1369-1376).

Las plantas de cebada y trigo transgénicas (recombinantes) de la generación T1 ó T2 se ensayan en resistencia frente a patógenos hemibiotróficos y pertotróficos. Para este fin se inoculan las hojas con diversos patógenos. Como patógenos biotróficos se usan mildiú polvoroso de cebada (Blumeria graminis f.sp. hordei) y orín pardo (Puccinia hordei). Como medida de la susceptibilidad a mildiú se evalúa el número de pústulas por unidad de área de la hoja 5-7 días después de la inoculación con 2-5 conidios por mm^{2} de área de hoja (Beßer K et al. (2000) Mol Plant Pathology 1: 277-286). Como patógenos hemibiotróficos se usan Bipolaris sorokiniana n y Magnaporthe grisea. La inoculación se efectúa tal como se ha descrito previamente (Kumar J et al. (2001) Phitopathology 91: 127-133; Jarosch B et al. (1999) Mol Plant Microbe Inter 12: 508-514). Como medida para la susceptibilidad sirve el número y el tamaño de las lesiones de la hoja 2 a 6 días después de la inoculación por aspersión con conidios (Kumar J et al. (2001) Phitopathology 91:127-133; Jarosch B et al. (1999) Mol Plant Microbe Inter 12:508-514; Jarosch B et al. (2003) Mol Plant Microbe Inter 16:107-114.). Como patógeno pertotrófico se usa Fusarium graminearum.

Para la determinación de la resistencia tipo 1 a Fusarium Head Blight (FHB) se aspergieron granzas de trigo en una etapa temprana de florecimiento con una suspensión de macroconidios (cerca de 2 x 105 ml^{-1}) de Fusarium graminearum o Fusarium culmorcum. Las plantas inoculadas se transfieren por 3 días a una cámara de niebla con 25ºC de temperatura del aire y 100% de humedad relativa del aire. Después las plantas se incuban en invernadero bajo luz continua a una temperatura de 20ºC y la severidad de los síntomas FHB en las granzas se evaluó después de 5, 7 y 8 días.

Para cuantificar la resistencia tipo II al Fusarium Head Blight (FHB) se inyectaron respectivamente 10 - 20 \mul de alícuotas de una suspensión de macroconidios (cerca de 2 x 105 ml^{-1}) de Fusarium graminearum o Fusarium culmorum en granzas individuales, ubicadas relativamente centradas, de plantas de trigo. Las plantas inoculadas se transfieren por 3 días a una cámara de niebla con 25ºC de temperatura de aire y 100% de humedad relativa de aire. Después las plantas se incuban en invernadero bajo luz continua a una temperatura de 20ºC y se evalúa la expansión de los síntomas de FHB por las granzas después de 7, 14 y 21 días. La expansión de los síntomas por las granzas (la así llamada Fusarium-spreading) se toma como medida para la resistencia tipo II a FHB.

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Ejemplo de comparación 1

Expresión transitoria de BI1 en la epidermis y evaluación del desarrollo de patógenos fúngicos

Se transformaron segmentos de hoja de cebada cv Ingrid con un pGY-BI1 junto con un vector de expresión GFP. Después se inocularon las hojas con Bgh y el resultado se analizó después de 48 horas por medio de microscopía de luz y fluorescente. La penetración en las células que expresan GFP se evaluó detectando historias en células vivas y mediante la evaluación del desarrollo de los hongos en precisamente aquellas células. Se empleó un método de transformación transitoria que ya ha sido descrito para la introducción biolística de ADN y ARN a las células epidérmicas de hojas de cebada (Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:647-54; Schweizer P et al. (2000) Plant J 2000 24:895-903).

Para preparación de micro portadores, se lavaron dos veces 55 mg de partículas de tungsteno (M 17, diámetro 1,1 \mum; Bio-Rad, Munich) con 1 ml de agua destilada autoclavada y una vez con 1 mL de etanol absoluto, se secó y se absorbió en 1 ml de glicerina al 50% (cerca de 50 mg/ml de solución patrón). La solución se diluyó con glicerina al 50% a 25 mg/ml, antes del consumo se mezcló bien y se suspendió en un baño de ultrasonido.

Para recubrir los microportadores para cada bombardeo se adicionan a gotas 0,3 \mug de plásmido pGFP (GFP bajo control del promotor CaMV 35S; Schweizer P et al. (1999) Mol Plant-Microbe Interact 12:647-654.), 0,7 \mug del vector vacío pGY o pGY-BI1 (1\muL), 12,5 \mul de suspensión de partículas de tungsteno (25 mg/ml; correspondiente a 312 \mug de partículas de tungsteno), 12,5 \mul de solución de Ca(NO_{3})_{2} 1 M (pH 10) mezclando continuamente, se deja quieto por 10 min a RT, se centrifuga brevemente y se retiran 20 \mul del sobrenadante. El residuo se re-suspende con las partículas de tungsteno (baño de ultrasonido) y se emplean en el experimento.

Se usaron segmentos de hojas primarias de cebada de alrededor de 4 cm de longitud. Los tejidos se colocaron en 0,5% Phitagar (GibcoBRL^{TM} Life Technologies^{TM}, Karlsruhe) con 20 \mug/ml de benzimidazol en cajas de Petri (6,5 cm de diámetro) y los bordes se cubrieron directamente antes del bombardeo de partículas con una plantilla provista con una abertura rectangular de 2,2 cm x 2,3 cm. Las cajas se colocaron, una después de la otra, en el fondo de la cámara de vacío (Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:647-54) sobre la cual se había insertado una red de nylon (tamaño de malla 0,2 mm, Millipore, Eschborn) en una placa agujereada (5 cm por encima del suelo, 11 cm por debajo del macroportador, véase abajo), para actuar como difusor con el fin de dispersar los agregados de partículas y disminuir la velocidad del flujo de partículas. Para cada bombardeo, el macro portador (sostenedor de filtro plástico estéril, 13 mm, Gelman Sciences, Swinney, UK), el cual se adjuntó a la cima de la cámara, se cargó con 5,8 \muL de partículas de tungsteno recubiertas de ADN (microportador, véase abajo). LA presión en la cámara se redujo en 0,9 bar usando una bpmba de vacío de diafragma (Vacuubrand, Wertheim) y la superficie del tejido vegetal se bombardeó con las partículas de tungsteno a una presión del gas de helio de 9 bar. La cámara se aireó inmediatamente después. Para etiquetar las células transformadas las hojas se bombardearon con el plásmido (pGFP; vector a base de pUC18, promotor/terminador CaMV 35S - casete con gen de GFP insertado; Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12:647-54; puesto a disposición por el Dr. P. Schweizer, Instituto para genética vegetal IPK, Gatersleben, Alemania). Antes del bombardeo de otro plásmido se limpió profundamente el macroportador cada vez con agua. Después de incubación de cuatro horas después del bombardeo con cajas de Petri ligeramente abiertas, RT y luz del día, las hojas se inocularon con 100 conidios/mm^{2} del hongo mildiú polvoroso de cebada auténtico (raza A6; Blumeria graminis f.sp. hordei mildiú A6) y se incubaron por otras 40 horas en condiciones idénticas. Luego se evaluó la penetración. El resultado (por ejemplo,la eficiencia de penetración), definida como un porcentaje de las células atacadas con un haustorio maduro y una hifa secundaria (hifas secundarias alongantes o "secondary elongating hifae"), se analizó mediante microscopía de fluorescencia y luz. Una inoculación con 150 conidios/mm^{2} da lugar a una frecuencia de ataque de cerca de 50% de las células transformadas. Para cada experimento individual se evaluó un número mínimo de 100 sitios de interacción. Las células transformadas (que expresan GFP) se identificaron bajo excitación con luz azul. Se distinguieron tres categorías diferentes de células transformadas:

1 Células penetradas que comprenden un haustorio fácilmente reconocible. Una célula con más de un haustorio contado como una célula.

2. Células que fueron atacadas por un apresorio fúngico pero que no comprenden haustorio. Una célula que fue atacada repetidamente por Bgh, pero no comprende haustorio, contado como una célula.

3. Células que no fueron atacadas por Bgh.

Células estomatales y células estomatales subsidiarias se excluyeron de la evaluación. Las estructuras de superficie de Bgh se analizaron mediante microscopía de luz o tinturación fluorescente del hongo con 0,3% calcofluor (p/v en agua) por 30 segundos. El desarrollo fúngico puede evaluarse fácilmente mediante tinturación con calcoflúor seguida de microscopía de fluorescencia. Mientras que el hongo desarrolla un tubo de germen primario y un tubo de germen apresorial ("germ-tube") en células transformadas con BI1-dsRNA, falla al desarrollar un haustorio. El desarrollo de haustorios es una precondición para la formación de una hifa secundaria. Las eficiencias de penetración (tasas de penetración) se calculan como el número de células penetradas dividido por el número de las células atacadas, multiplicado por 100.

La eficiencia de penetración sirve para la determinación de la susceptibilidad de la células que se transfectaron con pGY-BI1 en comparación con las células que se transformaron con un control de vector vacío (Fig. 10). Se observó que la sobreexpresión de BI1 eleva la frecuencia de penetración de manera significativa (Fig. 10). En seis experimentos independientes la sobreexpresión en las variedades susceptibles de cebada Ingrid provocó un incremento significativa de la eficiencia promedio de penetración (PE) desde 47% hasta 72% (165% de los controles) en células que habían sobreexpresado BI1 en comparación con células que se habían transformado con el vector vacío (control)
(Fig. 10).

Aún más, las células epidérmicas de la cebada mlo5 resistentes a Bgh se transformaron transitoriamente con el constructo de sobreexpresión BI1 pGY-1 tal como se describe arriba. El genotipo mlo5 en un fondo Pallas o Ingrid muestra una susceptibilidad muy baja contra Bgh. En 7 experimentos independientes se encontró una eficiencia de penetración en plantas de control (transformación con vector vacío y vector GFP) de mínimo o hasta máximo 11%. De manera sorprendente, la sobreexpresión (pGY-BI1) dio lugar a una reconstitución casi total del fenotipo susceptible; es decir, se efectuó una ruptura casi completa de la resistencia a mlo. La eficiencia promedio de penetración de Bgh a los segmentos de hoja de Ingrid-mlo5 y Pallas-mlo5 se subió desde 4% a 23%, o bien de 6% a 33% (Fig. 11). Esto significa un aumento relativo de la penetración a un 520% ó 510% de los controles. Además, la sobreexpresión de BI1 en cebada cv Manchuria incrementó la susceptibilidad contra el patógeno de trigo Blumeria graminis f.sp. tritici en tres experimentos independientes desde 0 a 4% a 19 hasta 27% (Fig. 13).

<110> BASF Plant Science GmbH

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<120> Método para el incremento de la resistencia frente a factores de estrés en plantas

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<130> PF54350-AT

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<140>

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<141>

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<160> 44

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 744

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hordeum vulgare

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(741)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para Proteína BI1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

17

170

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 247

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hordeum vulgare

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1067

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(741)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para Proteína BI1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 247

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1160

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nicotiana tabacum

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(747)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para Proteína BI1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

22

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 249

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Nicotiana tabacum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1056

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(747)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para Proteína BI1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

25

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 249

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 973

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Brassica napus

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(741)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para Proteína BI1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

28

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 247

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Brassica napus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 747

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Glycine max

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(744)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para Proteína BI1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Glycine max

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1510

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Glycine max

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(777)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para BI-1 protein

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 259

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Glycine max

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 651

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Triticum aestivum

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(651)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para BI-1 protein

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 217

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Triticum aestivum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 412

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(410)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para Proteína BI1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 345

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Triticum aestivum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(342)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Triticum aestivum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 403

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(402)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para Proteína BI1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 410

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(410)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para Proteína BI1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 463

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Triticum aestivum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(462)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para Proteína BI1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Triticum aestivum

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 388

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(386)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para Proteína BI1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

51

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1737

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Solanum tuberosum

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1737)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> promotor de patatina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1317

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Triticum aestivum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1317)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> germin 9f-3.8 promotor de gen

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 959

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(959)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> CAB-2 promotor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

55

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 445

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> promotor

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(445)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> PPCZm1 promotor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5455

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: vector de expresión recombinante pUbiB1-1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

57

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12633

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: vector de expresión recombinante pLol14UbiBI-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

59

60

61

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5598

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: vector de expresión recombinante pOXoBI-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

63

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12776

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificical

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: vector de expresión recombinante pLo114oXoB1-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

65

66

67

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 744

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Triticum aestivum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(741)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para TaBI-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

68

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 247

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Triticum aestivum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211>

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hordeum vulgare

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (173)..(1126)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para Hordeum vulgare subsp. vulgare syntaxin (Ror2)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

71

72

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 318

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hordeum vulgare

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

73

74

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 948

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(945)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para Arabidopsis thaliana syntaxin 121 (SYP121)/syntaxin-related protein (SYR1) (At3g11820)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

75

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 315

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

77

78

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1275

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hordeum vulgare

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (80)..(1006)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> codificación para Hordeum vulgare subsp. vulgare SNAP-34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

79

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 309

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Hordeum vulgare

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

81

82

Claims

1. Método para la generación o incremento de la resistencia frente a al menos un factor de estrés biótico en plantas en el cual están comprendidos los siguientes pasos de trabajo:

a) Incremento de la cantidad de proteína de al menos una proteína de inhibidor de Bax -1 (BI1) en al menos un tejido vegetal de la planta con la condición de que la expresión en la epidermis de la hoja permanezca esencialmente sin modificar o que se reduzca, y

b) Selección de las plantas en las que en comparación con la planta de partida ya exista una resistencia contra al menos un factor de estrés biótico o se incremente; y

en donde el factor de estrés es un patógeno de la planta.

2. Método según la reivindicación 1 donde el factor de estrés es un patógeno necrotrófico o hemibiotrófico.

3. Método según una de las reivindicaciones 1 a 2, donde la proteína BI-1 comprende al menos una secuencia que presenta una homología de al menos 50% con al menos un motivo de consenso BI1 seleccionado del grupo que se compone de

a) H (L/I) KXVY,

b) AXGA (Y/F) XH,

c) NIGG,

d) P (V/P) (Y/F) E (E/Q) (R/Q) KR,

e) (E/Q) G (A/S) S (V/I) GPL,

f) DP(S/G)(L/I)(I/L),

g) V (G/A) T (A/S) (L/I) AF (A/G) CF (S/T),

h) IL (Y/F) LGG,

i) L (L/V) SS (G/W) L (S/T) (I/M) L (L/M) W, y

j) DTGX(I/V) (I/V)E.

4. Método según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la proteína BI1 se codifica por un polipéptido que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que se compone de:

a) las secuencias según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 o 38, y

b) secuencias que presentan una identidad de al menos 50% con una de las secuencias según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 o 38,

c) secuencias que comprenden al menos una secuencia parcial de al menos 10 residuos de aminoácidos relacionados de una de las secuencias según SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 o 38.

5. Método según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el incremento de la cantidad de proteína de al menos una proteína BI1s mediante expresión recombinante de la dicha proteína BI1 se realiza bajo control de un promotor específico para raíz, tubérculo o mesófilo.

6. Método según una de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende

(a) transformación estable de una célula de la planta con un casete recombinante de expresión que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína BI en conexión funcional con un promotor específico de tejido, donde el promotor no presenta esencialmente actividad en la epidermis de la hoja y donde el promotor es heterólogo con respecto a la dicha secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína BI,

(b) Regeneración de la planta a partir de la célula de la planta, y

(c) Expresión de dicha secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína BI en una cantidad y durante un tiempo que sean suficientes para generar o elevar una resistencia a patógenos en dicha planta.

7. Método según una de las reivindicaciones 1 a 6, donde la planta se selecciona de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas.

8. Método según una de las reivindicaciones 1 a 7, donde la planta se selecciona del grupo de las plantas monocotiledóneas que se compone de trigo, avena, mijo, cebada, centeno, maíz, arroz, alforfón, trigo, triticale, escanda, lino o caña de azúcar.

9. Método según una de las reivindicaciones 1 a 8, donde la expresión del inhibidor de Bax -1 (BI-1) se eleva en el mesófilo.

10. Método según una de las reivindicaciones 1 a 9, donde la planta presenta un fenotipo resistente a mlo o inhibe la expresión o función de MLO, RacB y/o NaOx al menos en la epidermis o se reduce en comparación con una planta de control y/o se incrementa la expresión o función de PEN2, SNAP34 y/o PEN1 al menos en la epidermis en comparación con una planta de control.