ES2332648T3 - Procedimiento de preparacion de derivados de l-fenilalanina mediante microorganismos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para preparar un derivado de L-fenilalanina representado por la fórmula (1) **(Ver fórmula)** en el que R 1 , R 2 , R 3 , R 4 y R 5 representan, cada uno independientemente, hidrógeno, un grupo hidroxi, un grupo alquilo lineal o ramificado con entre 1 y 4 átomos de carbono, un grupo alcoxi cuyo grupo alquilo es un grupo alquilo lineal o ramificado con entre 1 y 4 átomos de carbono, un grupo ciano, un grupo nitro, un halógeno, NR 6 R 7 , en el que R 6 y R 7 representan, cada uno independientemente, hidrógeno o un grupo alquilo lineal o ramificado con entre 1 y 4 átomos de carbono, o R 6 y R 7 pueden formar un anillo con entre 3 y 5 átomos de carbono, pudiendo contener dicho anillo un heteroátomo, o un grupo fenilo que puede tener un sustituyente, siempre y cuando R 1 , R 2 , R 3 , R 4 y R 5 no sean hidrógeno al mismo tiempo, que comprende hacer reaccionar por lo menos un microorganismo perteneciente a cualquiera de los géneros Cladosporium, el género Eurotium, el género Thanatephorus y el género Gonatobotryum, un ingrediente del microorganismo o un material tratado con el microorganismo en presencia de amoníaco y un derivado del ácido cinámico representado por la siguiente fórmula (2): **(Ver fórmula)** en el que los símbolos tienen los mismos significados definidos anteriormente.
Description
Procedimiento de preparación de derivados de
L-fenilalanina mediante microorganismos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina ópticamente activo, el cual se
obtiene utilizando la actividad de un microorganismo. Más en
particular, la presente invención se refiere a un procedimiento de
producción que consiste en añadir amoníaco a un derivado del ácido
cinámico y obtener de este modo un correspondiente derivado de
L-fenilalanina ópticamente activo. El derivado de
L-fenilalanina ópticamente activo obtenido mediante
el procedimiento según la presente invención resulta útil como
material de partida o como intermediario en la síntesis de
productos farmacéuticos, productos agroquímicos y otros productos
de química fina.
Con respecto al procedimiento para obtener un
aminoácido ópticamente activo, se han llevado a cabo muchos
estudios sobre la reacción de síntesis orgánica utilizando un
catalizador asimétrico, o sobre el procedimiento de preparación
fermentativa utilizando la especificidad de los microorganismos.
Uno de los procedimientos de preparación para
obtener una fenilalanina ópticamente activa es un procedimiento que
consiste en permitir que la fenilalanina
amoníaco-liasa, que es una enzima de
microorganismos, actúe sobre un ácido cinámico y, de este modo,
obtener de forma ópticamente selectiva una fenilalanina ópticamente
activa (patente británica 1489468 y
JP-A-53-96388). (El
término "JP-A", tal como se utiliza en la
presente memoria, se refiere a "solicitud de patente japonesa
publicada no examinada".) Este procedimiento utiliza una reacción
enzimática que consiste en añadir un grupo amino a un carbono de un
ácido cinámico mediante la acción de una enzima en un sistema con
una concentración elevada de amoníaco, en el que la
L-fenilalanina se puede producir con una elevada
pureza óptica.
Para obtener un derivado de
L-fenilalanina ópticamente activo con un
sustituyente en el grupo fenilo, se lleva a cabo un procedimiento
que consiste en introducir un sustituyente en el grupo fenilo de
L-fenilalanina utilizando diversas reacciones de
modificación. Sin embargo, este procedimiento, produce
inevitablemente un descenso en el rendimiento o en la pureza debido
a una reacción secundaria en la parte distinta del grupo fenilo, y
un descenso en la pureza óptica debido al progreso de la
racemización bajo condiciones de reacción severas. Además, puesto
que la especificidad posicional del sustituyente introducido en el
grupo fenilo no puede obtenerse fácilmente, este proceso se ve
afectado por un rendimiento reducido y por la dificultad en la
separación/purificación y no resulta práctico.
Para superar esto, se puede llevar a cabo un
proceso que utiliza fenilalanina amoníaco-liasa y
que permite que una enzima actúe en un derivado del ácido cinámico
que presenta un grupo fenilo sustituido que presenta un
sustituyente deseado introducido previamente. La reacción enzimática
se produce en condiciones moderadas y por lo tanto, se puede evitar
que el grupo fenilo y el sustituyente en el grupo fenilo sufran
efectos perjudiciales por una reacción secundaria, como resultado,
se espera que un derivado de L-fenilalanina
ópticamente activa pueda obtenerse con una elevada pureza. Sin
embargo, la fenilalanina amoníaco-liasa presenta
generalmente una especificidad estricta de sustrato y en muchos
casos, muestra una reactividad extremadamente baja o prácticamente
ninguna reactividad con un sustrato que presente un grupo fenilo
sustituido en comparación con la reacción original, que consiste en
obtener L-fenilalanina a partir de un ácido
cinámico. Sólo se han dado a conocer algunos casos, por ejemplo, un
procedimiento que consiste en utilizar un derivado del ácido
cinámico con un grupo fenilo fluorado como material de partida y
obtener una fenilalanina fluorada ópticamente activa mediante la
acción de una enzima (véase
JP-A-63-148992), y
un procedimiento de obtención de un derivado de fenilalanina
utilizando un microorganismo específico del género
Rhodotorula (véase patente US nº 5.981.239).
El documento EP 0 152 235 A2 da a conocer un
procedimiento para preparar L-fenilalanina
utilizando, por ejemplo, un microorganismo perteneciente al género
Eurotium, Pellicularia (Thanatephorus) o
Gonatobotryum.
La patente US nº 4.562.151 da a conocer la
preparación de L-fenilalanina y derivados de la
misma, en la que L-fenilalanina
amoníaco-liasas de Rhodotorula o
Sporobolomyces reaccionan sobre derivados del ácido
cinámico.
El documento EP 0 167 411 A2 da a conocer la
preparación de fenilalanina haciendo reaccionar ácido cinámico con
amoníaco en presencia de una fenilalanina
amoníaco-liasa obtenida a partir de un
microorganismo perteneciente, por ejemplo, a la especie
Cladosporium.
Uno de los objetivos de la presente invención
consiste en dar conocer un procedimiento novedoso para obtener, de
forma sencilla y fácil, derivados de fenilalanina con una elevada
pureza óptica con un sustituyente, partiendo de derivados del ácido
cinámico que presentan un sustituyente en el grupo fenilo,
utilizando microorganismos.
Los presentes inventores han llevado a cabo
intensas investigaciones dirigidas al estudio de microorganismos
novedosos de la tierra y en la reactividad de microorganismos
conocidos que producen fenilalanina amoníaco-liasa,
para encontrar un microorganismo que presente actividad de
amoníaco-liasa con una elevada reactividad frente a
un derivado del ácido cinámico con un sustituyente en el grupo
fenilo. Como resultado, se ha puesto de manifiesto que los
microorganismos pertenecientes al género Cladosporium, el
género Eurotium, el género Thanatephorus o el género
Gonatobotryum tienen capacidad para convertir los derivados
del ácido cinámico con diversos grupos fenilo sustituidos en el
correspondiente derivado de L-fenilalanina. La
presente invención se ha llevado a cabo en base a este
descubrimiento.
Hasta el momento, no se ha conocido que los
microorganismos pertenecientes al género Cladosporium, el
género Eurotium, el género Thanatephorus o el género
Gonatobotryum tienen capacidad para convertir los derivados
del ácido cinámico con diversos grupos fenilo sustituidos en el
correspondiente derivado de L-fenilalanina, y los
presentes inventores han descubierto dicha capacidad por primera
vez.
La presente invención da a conocer un
procedimiento para preparar derivados de
L-fenilalanina:
1. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina representado por la fórmula (1)
(en el que R^{1}, R^{2},
R^{3}, R^{4} y R^{5} representan, cada uno independientemente,
hidrógeno, un grupo hidroxi, un grupo alquilo (un grupo alquilo
lineal o ramificado con entre 1 y 4 átomos de carbono), un grupo
alcoxi (el grupo alquilo que constituye el grupo alcoxi es un grupo
alquilo lineal o ramificado con entre 1 y 4 átomos de carbono), un
grupo ciano, un grupo nitro, un halógeno, NR^{6}R^{7} (en el que
R^{6} y R^{7} representan, cada uno independientemente,
hidrógeno o un grupo alquilo lineal o ramificado con entre 1 y 4
átomos de carbono, o R^{6} y R^{7} pueden formar un anillo con
entre 3 y 5 átomos de carbono, pudiendo contener dicho anillo un
heteroátomo), o un grupo fenilo que puede tener un sustituyente,
siempre y cuando R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5} no
sean hidrógeno al mismo
tiempo),
que comprende hacer reaccionar, por lo menos, un
microorganismo perteneciente a cualquiera de los géneros
Cladosporium, el género Eurotium, el género
Thanatephorus y el género Gonatobotryum, un
ingrediente del microorganismo o un material tratado con el
microorganismo en presencia de amoníaco y un derivado del ácido
cinámico representado por la siguiente fórmula (2):
en el que los símbolos tienen los
mismos significados definidos
anteriormente.
2. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según se describe en 1, en el que
R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5} en la fórmula (1) son,
cada uno independientemente, hidrógeno, un grupo ciano o un grupo
hidroxi, pero no son hidrógeno al mismo tiempo.
3. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según se describe en 1 ó 2,
utilizando el microorganismo perteneciente a cualquiera de los
géneros Cladosporium, el género Eurotium, el género
Thanatephorus y el género Gonatobotryum, el cual se
cultiva previamente en un medio de cultivo que contiene una
fenilalanina o un derivado de fenilalanina.
4. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según se describe en 1, en el que,
por lo menos, una parte de amoníaco se suministra en forma de
carbonato.
5. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según se describe en 1 ó 3, en el que
el pH de la solución de reacción se ajusta de 8,5 a 11 utilizando
ácido carbónico o una sal de amonio del mismo.
6. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según se describe en 1, en el que,
por lo menos, una parte del derivado de
L-fenilalanina obtenido se recupera como una sal de
amonio.
7. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según se describe en 4, 5 ó 16, en el
que, por lo menos, una parte del derivado de
L-fenilalanina obtenido se recupera como
carbonato.
8. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según se describe en 1, que comprende
hacer reaccionar los microorganismos, ingredientes del
microorganismo o material tratado con el microorganismo en la
solución de un derivado del ácido cinámico con un contenido del 5%
en masa o menor.
9. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según se describe en 1 ó 2, en el que
el derivado de L-fenilalanina es
3-ciano-L-fenilalanina.
10. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según se describe en 1 ó 2, en el que
el derivado de L-fenilalanina es
4-ciano-L-fenilalanina.
11. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según se describe en 1 ó 2, en el que
el derivado de L-fenilalanina es
3-hidroxi-L-fenilalanina.
12. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según se describe en 1 ó 2, en el que
el derivado de L-fenilalanina es
4-hidroxi-L-fenilalanina.
13. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según se describe en 1 ó 2, en el que
el derivado de L-fenilalanina es
3,4-dihidroxi-L-fenilalanina.
14. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según se describe en 1 ó 3, en el que
el microorganismo utilizado es cualquiera de entre Cladosporium
colocasiae, Eurotium chevalieri, Thanatephorus
cucumeris y Gonatobotryum apiculatum.
15. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según se describe en 1 ó 3, en el que
el microorganismo utilizado es cualquiera de entre Cladosporium
colocasiae IFO 6698, Eurotium chevalieri IFO 4090,
Thanatephorus cucumeris IFO 6254 y Gonatobotryum
apiculatum IFO 9098.
16. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según se describe en 5, en el que el
ajuste del pH utilizando ácido carbónico o una sal de amonio del
mismo se lleva a cabo burbujeando dióxido de carbono en una
solución de reacción.
A continuación, se describe la presente
invención con detalle.
El género Cladosporium, el género
Eurotium, el género Thanatephorus y el género
Gonatobotryum, aplicados a la presente invención, son un
tipo de hongo de moho ampliamente conocidos en la naturaleza.
Ejemplos de las cepas de microorganismo que exhiben actividad de
fenilalanina amoníaco-liasa de catalización de esta
reacción incluyen las cepas Cladosporium colocasiae IFO 6698,
Eurotium chevalieri IFO 4090, Thanatephorus cucumeris
IFO 6254 y Gonatobotryum apiculatum IFO 9098, depositadas en
el Institute for Fermentation, Osaka. De entre los microorganismos
que se pueden utilizar en la presente invención, el género
Thanatephorus se clasificaba anteriormente como género
Pellicularia, y el Thanatephorus cucumeris y la
Pellicularia filamentosa son el mismo microorganismo.
Para ser más específico, la reacción se puede
llevar a cabo del modo siguiente. Por ejemplo, la cepa Eurotium
chevalieri IFO 4090 se cultiva mediante un procedimiento de
cultivo de microorganismos comúnmente conocido, por ejemplo, en un
medio de cultivo con nutrientes de peptona al 1% a una temperatura
comprendida aproximadamente entre 15 y 35ºC, preferentemente
comprendida aproximadamente entre 18 y 30ºC, durante aproximadamente
entre 24 horas y 7 días. A la solución de cultivo obtenida se añade
un derivado del ácido cinámico con un sustituyente como material de
partida de la reacción, hasta una concentración comprendida
aproximadamente entre 1 ppm y 20%, preferentemente comprendida
aproximadamente entre 10 ppm y 10%, se añade amoníaco hasta una
concentración final comprendida aproximadamente entre 0,5 y 11 M,
preferentemente comprendida aproximadamente entre 1 y 9 M, y el pH
se ajusta aproximadamente entre 8,5 y 11, preferentemente
aproximadamente entre 9 y 10,5. A continuación, se prosigue la
agitación durante un periodo comprendido aproximadamente entre 1 y
200 horas a la temperatura descrita anteriormente. Ejemplos del
ácido que se puede utilizar para ajustar el pH incluyen ácidos
inorgánicos, tales como ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido
fosfórico, ácido bórico y ácido carbónico, ácidos orgánicos tales
como ácido fórmico, ácido acético y ácido propiónico, y sales de los
mismos. En este momento, la utilización de un ácido volátil resulta
ventajosa por el hecho de que el producto se puede recolectar de
forma sencilla y fácil sometiendo la solución de reacción a
extracción de células y destilación, pudiéndose prescindir de la
etapa de desalación. Adecuadamente, dicho ácido es ácido carbónico.
En este caso, ácido carbónico incluye el ácido carbónico que se
produce cuando se disuelve dióxido de carbono en una solución acuosa
mediante burbujeo. También se puede utilizar una sal del ácido
descrito anteriormente con amoníaco como fuente de amoníaco para la
solución de reacción y, por las razones expuestas
anteriormente,
una parte o toda la fuente de amoníaco es adecuadamente carbonato de amonio o hidrogenocarbonato de amonio.
una parte o toda la fuente de amoníaco es adecuadamente carbonato de amonio o hidrogenocarbonato de amonio.
El derivado de ácido cinámico que presenta un
sustituyente no tiene por qué estar necesariamente disuelto en la
cantidad total; sin embargo, se pueden añadir un disolvente o un
tensioactivo a efectos de mejorar la solubilidad o la
dispersibilidad en la solución de reacción. De acuerdo con el
consumo de derivado de ácido cinámico con el progreso de la
reacción, se puede añadir continua o intermitentemente un derivado
del ácido cinámico y, en este caso, la concentración de derivado de
ácido cinámico en la solución de reacción no está limitada al
intervalo descrito anteriormente. Sin embargo, se conoce que el
derivado de ácido cinámico añadido en exceso actúa como inhibidor
en la reacción enzimática y, en consecuencia, en la mayor parte del
periodo de reacción, la concentración del derivado de ácido
cinámico disuelto en la solución de reacción es preferentemente no
mayor de un máximo del 5%.
Ejemplos de la fuente de carbono que se puede
utilizar en el medio de cultivo para cultivar el microorganismo
incluyen sacáridos tales como glucosa, sucrosa, fructosa y melaza
residual, sustancias orgánicas tales como etanol, ácido acético,
ácido cítrico, ácido succínico, ácido láctico, ácido benzoico y
ácido graso, sales de metales alcalinos de estas sustancias
orgánicas, hidrocarburos alifáticos tales como
n-parafina, y sustancias orgánicas naturales tales
como peptona, extracto de carne, extracto de pescado, harina de
soja, salvado, extracto de malta y extracto de patata. Estas
sustancias se pueden utilizar individualmente o en combinación, a
una concentración generalmente comprendida entre 0,01 y 30%,
preferentemente entre 0,1 y 10%.
Ejemplos de la fuente de nitrógeno que se puede
utilizar en el medio de cultivo para cultivar el microorganismo
incluyen compuestos inorgánicos de nitrógeno tales como sulfato de
amonio, fosfato de amonio, nitrato de sodio y nitrato de potasio,
sustancias orgánicas que contienen nitrógeno tales como urea y ácido
úrico, y sustancias orgánicas naturales tales como peptona,
extracto de carne, extracto de pescado, harina de soja, extracto de
malta y extracto de patata. Estas sustancias se pueden utilizar
individualmente o en combinación, a una concentración generalmente
comprendida entre 0,01 y 30%, preferentemente entre 0,1 y 10%.
Si se desea, un fosfato tal como
dihidrogenofosfato de potasio, o una sal metálica tal como sulfato
de magnesio, sulfato ferroso, acetato de calcio, cloruro de
manganeso, sulfato de cobre, sulfato de zinc, sulfato de cobalto y
sulfato de níquel, se pueden añadir a efectos de mejorar el
crecimiento del microorganismo. La concentración añadida varía
dependiendo de las condiciones de cultivo, pero generalmente está
comprendida entre 0,01 y 5% para el fosfato, entre 10 ppm y 1% para
la sal de magnesio y aproximadamente entre 0,1 y 1.000 ppm para
otros compuestos. Además, dependiendo del medio de cultivo
seleccionado, por ejemplo, se pueden añadir un extracto de
levadura, un ácido casamino y un ácido nucleico de levadura como
fuente de suministro de vitaminas, aminoácidos y ácidos nucleicos,
hasta una concentración comprendida entre 1 y 100 ppm, con lo que se
puede mejorar el crecimiento del microorganismo.
A efectos de mejorar la reactividad del
microorganismo con el derivado de ácido cinámico, resulta útil
añadir aproximadamente entre 10 ppm y 1% de fenilalanina como
fuente para derivar fenilalanina amoníaco-liasa
durante el cultivo.
Cualquiera que sea el ingrediente utilizado, el
medio de cultivo se ajusta preferentemente a un pH comprendido
entre 4,5 y 8, más preferentemente entre 5 y 7,5. Las células del
microorganismo previamente cultivadas en el medio de cultivo
descrito anteriormente se recolectan de la solución de cultivo
mediante un procedimiento tal como separación por centrifugación o
filtración de membrana, y se utilizan para la reacción, siendo esto
útil porque las impurezas arrastradas de la solución de cultivo se
pueden reducir y se puede facilitar la recolección de producto en
la etapa final.
El derivado de fenilalanina generado en la
solución de reacción se recolecta mediante un procedimiento
utilizado comúnmente, que se selecciona en función del estado en la
solución de reacción, tal como separación por centrifugación,
filtración de membrana, secado bajo presión reducida, destilación,
extracción con disolvente, precipitación por adición de sal,
intercambio iónico y diversos análisis cromatográficos. La
recolección se alcanza sencillamente tal como sigue. Por ejemplo,
la célula o una sustancia tratada con el microorganismo se extrae de
la solución de reacción por filtración y separación por
centrifugación, el material de partida derivado de ácido cinámico
no reaccionado se elimina mediante extracción con disolvente o
ajustando la solución de reacción a un pH ácido, y extrayendo a
continuación el precipitado. El pH del sobrenadante obtenido se
vuelve a ajustar a un valor cercano al punto isoeléctrico del
derivado de fenilalanina, y el derivado precipitado se recupera del
mismo modo. El producto como tal se puede recuperar de la solución
de reacción con un rendimiento y una pureza elevados. También
resulta útil eliminar previamente el exceso de amoníaco de la
solución de reacción por destilación u otro método similar, o
eliminar el agua por destilación a efectos de aumentar la
concentración y mejorar de este modo la recuperación del producto
en el punto isoeléctrico.
Más sencillamente, el pH de la solución de
reacción se ajusta utilizando un ácido volátil. En el caso en que
el porcentaje de conversión es suficientemente alto, el producto se
puede aislar tal como está tras la extracción de células y, en el
caso en el que el material de partida derivado de ácido cinámico
está presente en una gran cantidad, la solución de reacción se
vuelve ácida y se extrae con un disolvente, o el precipitado
resultante de la condición ácida se elimina por
filtración/separación por centrifugación y, a continuación, se
eliminan el agua, el ácido o la base por destilación, pudiéndose a
aislar el producto como una sal del derivado de fenilalanina. El
ácido volátil o su sal, utilizados en este procedimiento, son
adecuadamente ácido carbónico o una sal de amonio del mismo.
Dependiendo de las propiedades del producto de
reacción, la velocidad de reacción puede disminuir debido a la
acumulación del producto en la solución de reacción. En este caso,
se utiliza adecuadamente un procedimiento que consiste en añadir
agua que contiene amoníaco, solución salina fisiológica o solución
tampón de reacción de acuerdo con la concentración del producto,
diluyendo con ello continuamente la solución de reacción. Además,
la velocidad de reacción se puede recuperar mediante un
procedimiento que consiste en recolectar las células en el punto en
el que disminuye la velocidad de reacción, recuperar el sobrenadante
como solución de producto y devolver de nuevo las células
recolectadas a la solución que contiene el material de partida de
reacción o a la suspensión. Estos procedimientos se pueden repetir
muchas veces mientras se mantenga la actividad de
amoníaco-liasa del microorganismo.
La presente invención también se puede llevar a
cabo de forma similar utilizando un material tratado con el
microorganismo que se puede aplicar en la presente invención, tal
como un extracto acelular o un ingrediente concentrado o extraído
capaz de catalizar la reacción descrita anteriormente en el extracto
acelular. Además, la presente invención se puede alcanzar
inmovilizando un microorganismo que se puede aplicar a la reacción,
una solución de extracto o un ingrediente extraído de la misma, a un
soporte moderadamente soluble, y poniendo en contacto dicho
material inmovilizado con la solución de material de partida.
Ejemplos del soporte para su utilización en dicha inmovilización
incluyen poliacrilamida, alcohol polivinílico,
poli-N-vinilformamida,
polialilamina, polietilenimina, metilcelulosa, glucomanán, alginato
o carragenano, y un producto copolimerizado o reticulado de los
mismos, que es un compuesto para formar un sólido moderadamente
soluble en agua que incluye el microorganismo o un ingrediente
extraído del mismo. Dichos productos se pueden utilizar
individualmente o en combinación. Además, se puede utilizar un
material previamente formado como un sólido, tal como carbón
activo, cerámica porosa, fibra de vidrio, artículo polimérico poroso
moldeado y película de nitrocelulosa, después de fijar sobre el
mismo el microorganismo o una solución extraída o un ingrediente
extraído del mismo. Llevando a cabo continuamente la reacción
utilizando un material inmovilizado de este tipo, se puede evitar
de forma eficaz la inhibición de la reacción enzimática debido a la
acumulación del producto.
El derivado de ácido cinámico que presenta un
sustituyente, utilizado como material de partida en la presente
invención, está representado por la siguiente fórmula (2):
en el que R^{1}, R^{2},
R^{3}, R^{4} y R^{5} representan, cada uno independientemente,
hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alquilo (un grupo alquilo
lineal o ramificado con entre 1 y 4 átomos de carbono), un grupo
alcoxi (el grupo alquilo que constituye el grupo alcoxi es un grupo
alquilo lineal o ramificado con entre 1 y 4 átomos de carbono), un
grupo ciano, un grupo nitro, un halógeno, tal como cloro o flúor,
NR^{6}R^{7} (en el que R^{6} y R^{7} representan, cada uno
independientemente, hidrógeno o un grupo alquilo lineal o
ramificado con entre 1 y 4 átomos de carbono, o R^{6} y R^{7}
pueden formar un anillo con entre 3 y 5 átomos de carbono, pudiendo
contener dicho anillo un heteroátomo), o un grupo fenilo que puede
tener un sustituyente, siempre y cuando R^{1}, R^{2}, R^{3},
R^{4} y R^{5} no sean hidrógeno al mismo tiempo.
Preferentemente, R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5} son,
cada uno independientemente, hidrógeno, un grupo ciano, un grupo
hidroxilo (siempre y cuando no todos sean hidrógeno al mismo
tiempo).
Ejemplos preferidos de dicho producto incluyen
ácido 3-cianocinámico, ácido
4-cianocinámico, ácido
3-hidroxicinámico, ácido
4-hidroxicinámico y ácido
3,4-dihidroxicinámico.
Estos derivados del ácido cinámico que presentan
un sustituyente, utilizados como material de partida en la
reacción, se pueden preparar fácilmente mediante un procedimiento
que utiliza una así llamada reacción de Perkin, en la que se dejan
actuar anhídrido acético y el grupo aldehído de un derivado de
benzaldehído, habiendo introducido en el mismo un sustituyente
correspondiente (véase, Arch. Pharm. (Weinheim), 327(10),
pág. 619-625 (1994)), un procedimiento en el que se
deja actuar ácido malónico en un disolvente de piridina en presencia
de piperidina (véase, Journal of Chemical Society, pág.
357-360 (1939)), o diversos procedimientos mejorados
(véase, Synth. Commun., 29(4), pág. 573-581
(1999)) o similares.
El derivado de L-fenilalanina
que presenta un sustituyente, como producto de la presente
invención, está representado por la siguiente fórmula (1):
en el que R^{1}, R^{2},
R^{3}, R^{4} y R^{5} representan, cada uno independientemente,
hidrógeno, un grupo hidroxi, un grupo alquilo (un grupo alquilo
lineal o ramificado con entre 1 y 4 átomos de carbono), un grupo
alcoxi (el grupo alquilo que constituye el grupo alcoxi es un grupo
alquilo lineal o ramificado con entre 1 y 4 átomos de carbono), un
grupo ciano, un grupo nitro, un halógeno, tal como cloro o flúor,
NR^{6}R^{7} (en el que R^{6} y R^{7} representan, cada uno
independientemente, hidrógeno o un grupo alquilo lineal o
ramificado con entre 1 y 4 átomos de carbono, o R^{6} y R^{7}
pueden formar un anillo con entre 3 y 5 átomos de carbono, pudiendo
contener dicho anillo un heteroátomo), o un grupo fenilo que puede
tener un sustituyente, siempre y cuando R^{1}, R^{2}, R^{3},
R^{4} y R^{5} no sean hidrógeno al mismo tiempo.
Preferentemente, R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5} son,
cada uno independientemente, hidrógeno, un grupo ciano o un grupo
hidroxilo (pero no todos son hidrógeno al mismo
tiempo).
Ejemplos preferidos de dicho producto incluyen
3-ciano-L-fenilalanina,
4-ciano-L-fenilalanina,
3-hidroxi-L-fenilalanina
(metatirosina),
4-hidroxi-L-fenilalanina
(tirosina) y 3,4-dihidroxi-
L-fenilalanina (DOPA).
El derivado de L-fenilalanina
obtenido en la presente invención presenta una pureza óptica elevada
y, en el método de medición mostrado en los ejemplos, exhibe una
pureza óptica del 100% dentro del intervalo de 0,1% como límite de
detección.
En la presente invención, el sustituyente en el
grupo fenilo, tal como un grupo ciano o un grupo hidroxilo, no se
ve afectado por las condiciones moderadas de dicha reacción y se
mantiene hasta la compleción de la misma y, en consecuencia, el
derivado correspondiente de L-fenilalanina deseado
se puede obtener con un rendimiento elevado y con un porcentaje de
conversión cercano al 100%.
En consecuencia, según el procedimiento de la
presente invención, se puede obtener un derivado de
L-fenilalanina con una elevada pureza óptica
mediante una reacción de una etapa utilizando como substrato un
derivado del ácido cinámico que presenta un sustituyente, que se
puede obtener de forma sencilla y fácil por síntesis orgánica. El
derivado de L-fenilalanina obtenido de este modo que
presenta un sustituyente resulta útil como intermediario para
sintetizar un compuesto orgánico en el campo de los productos de
química fina, en el que se exige una elevada pureza óptica, tal
como en las preparaciones farmacéuticas y agroquímicas.
A continuación, la presente invención se
describe haciendo referencia a los ejemplos. El alcance de la
presente invención no está limitado en modo alguno por dichos
ejemplos.
El derivado de L-fenilalanina
obtenido se separó y se determinó por HPLC de fase inversa en las
condiciones de análisis indicadas a continuación.
- Columna:
- Shodex® Rspak NN-614 (fabricada por Showa Denko K. K.)
- Temperatura de la columna:
- 40ºC
- Eluyente:
- acetonitrilo/agua/solución acuosa 50 mM de H_{3}PO_{4}-KH_{2}PO_{4} (pH 3) = 20/70/10
- Velocidad de flujo:
- 1,0 ml/min
- Detección:
- mediante la absorción de UV a 210 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
La pureza óptica del derivado de
L-fenilalanina obtenido se analizó mediante HPLC de
resolución óptica en las condiciones indicadas a continuación.
- Columna:
- Shodex® ORpak CRX-853
- Temperatura de la columna:
- temperatura ambiente (22ºC)
- Eluyente:
- acetonitrilo/agua = 15/85 CuSO_{4} 2,5 mM
- Velocidad de flujo:
- 1,0 ml/min
- Detección:
- mediante la absorción de UV a 256 nm.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inoculó Cladosporium colocasiae IFO
6698 (dividido por el Institute for Fermentation, Osaka) en un
medio de patata dextrosa agar (producido por Difco) y se cultivó en
un baño de temperatura constante a 25ºC durante 72 horas. Las
células de microrganismo formadas se rasparon y se suspendieron en
100 ml de un medio líquido con la siguiente composición en un
matraz con fondo deflector de 500 ml.
- Glucosa
- 10 g
- Peptona
- 5 g
- Extracto de levadura
- 3 g
- Extracto de malta
- 3 g
- L-fenilalanina
- 0,5 g
- Agua destilada
- 1 l
pH = 6,0
\vskip1.000000\baselineskip
El matraz se colocó en un recipiente de cultivo
con agitación rotativa a temperatura constante a 25ºC, y el cultivo
se llevó a cabo a 150 rpm durante 3 días. Las células de
microorganismo obtenidas se recuperaron por centrifugación de
10.000 g y se suspendieron en una solución 2 M de hidrogenocarbonato
de amonio/6 M de amoníaco (preparada disolviendo hidrogenocarbonato
de amonio correspondiente a la concentración final de 2 M en una
pequeña cantidad de agua, añadiendo amoníaco acuoso concentrado
correspondiente a la concentración final de 6 M, y llenando con
agua, pH: 10,3), isovolumétrica con respecto a la solución de
cultivo. A esta suspensión celular se añadió ácido
4-cianocinámico correspondiente al 1%
(peso/volumen), el matraz se colocó en un recipiente de cultivo con
agitación rotativa a temperatura constante a 30ºC, y la reacción se
llevó a cabo a 120 rpm durante 96 horas. A continuación, la
solución de reacción se sometió a HPLC de fase inversa; como
resultado se detecto una acumulación de
4-ciano-L-fenilalanina
de 0,58% mediante la comparación con la muestra. Según el análisis
por cromatografía de gases del derivado, la pureza óptica del mismo
se calculó del 100% (límite de detección: 0,1%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivó Cladosporium colocasiae IFO
6698 del mismo modo que en el ejemplo 1 y las células obtenidas se
suspendieron en una solución 2 M de hidrogenocarbonato de amonio/6 M
de amoníaco (pH = 10,3). A esta suspensión celular se añadió ácido
3-cianocinámico correspondiente
al 1% (p/v), el matraz se colocó en un recipiente de cultivo con
agitación rotativa a temperatura constante a 30ºC, y la reacción se
llevó a cabo a 120 rpm durante 96 horas. A continuación, la
solución de reacción se sometió a HPLC de fase inversa; como
resultado se detecto una acumulación de
3-ciano-L-fenilalanina
de 0,70% mediante la comparación con la muestra. Según el análisis
por cromatografía de gases del derivado, la pureza óptica del mismo
se calculó del 100% (límite de detección: 0,1%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivó Cladosporium colocasiae IFO
6698 del mismo modo que en el ejemplo 1 y las células obtenidas se
suspendieron en una solución 2 M de hidrogenocarbonato de amonio/6 M
de amoníaco (pH = 10,3). A esta suspensión celular se añadió ácido
4-hidroxicinámico correspondiente
al 1% (p/v), el matraz se colocó en un recipiente de cultivo con
agitación rotativa a temperatura constante a 30ºC, y la reacción se
llevó a cabo a 120 rpm durante 96 horas. A continuación, la
solución de reacción se sometió a HPLC de fase inversa; como
resultado se detecto una acumulación de L-tirosina
de 0,33% mediante la comparación con la muestra. Según el análisis
por cromatografía de gases del derivado, la pureza óptica del mismo
se calculó del 100% (límite de detección: 0,1%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivó Cladosporium colocasiae IFO
6698 del mismo modo que en el ejemplo 1 y las células obtenidas se
suspendieron en una solución 2 M de hidrogenocarbonato de amonio/6 M
de amoníaco (pH = 10,3). A esta suspensión celular se añadió ácido
3-hidroxicinámico correspondiente
al 1% (p/v), el matraz se colocó en un recipiente de cultivo con
agitación rotativa a temperatura constante a 30ºC, y la reacción se
llevó a cabo a 120 rpm durante 96 horas. A continuación, la
solución de reacción se sometió a HPLC de fase inversa; como
resultado se detecto una acumulación de metatirosina de 0,80%
mediante la comparación con la muestra. Según el análisis por
cromatografía de gases del derivado, la pureza óptica del mismo se
calculó del 100% (límite de detección: 0,1%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se inoculó Eurotium chevalieri IFO 4090
(dividido por el Institute for Fermentation, Osaka) en un medio de
patata dextrosa agar (producido por Difco) y se cultivó en un baño
de temperatura constante a 25ºC durante 72 horas. Las células de
microrganismo formadas se rasparon y se suspendieron en 100 ml de un
medio líquido con la siguiente composición en un matraz con fondo
deflector de 500 ml.
- Glucosa
- 10 g
- Peptona
- 5 g
- Extracto de levadura
- 3 g
- Extracto de malta
- 3 g
- L-fenilalanina
- 0,5 g
- Agua destilada
- 1 l
pH = 6,0
\vskip1.000000\baselineskip
El matraz se colocó en un recipiente de cultivo
con agitación rotativa a temperatura constante a 25ºC, y el cultivo
se llevó a cabo a 150 rpm durante 5 días. Las células de
microorganismo obtenidas se recuperaron por centrifugación de
10.000 g y se suspendieron en una solución 2 M de hidrogenocarbonato
de amonio/6 M de amoníaco (preparada disolviendo hidrogenocarbonato
de amonio correspondiente a la concentración final de 2 M en una
pequeña cantidad de agua, añadiendo amoníaco acuoso concentrado
correspondiente a la concentración final de 6 M, y llenando con
agua, pH: 10,3), isovolumétrica con respecto a la solución de
cultivo. A esta suspensión celular se añadió ácido
4-cianocinámico correspondiente al 1% (p/v), el
matraz se colocó en un recipiente de cultivo con agitación rotativa
a temperatura constante a 30ºC, y la reacción se llevó a cabo a 120
rpm durante 120 horas. A continuación, la solución de reacción se
sometió a HPLC de fase inversa; como resultado se detecto una
acumulación de
4-ciano-L-fenilalanina
de 0,22% mediante la comparación con la muestra. Según el análisis
por cromatografía de gases (HPLC) del derivado, la pureza óptica del
mismo se calculó del 100% (límite de detección: 0,1%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se inoculó Thanatephorus cucumeris IFO
6254 (dividido por el Institute for Fermentation, Osaka) en un
medio de patata dextrosa agar (producido por Difco) y se cultivó en
un baño de temperatura constante a 25ºC durante 72 horas. Las
células de microrganismo formadas se rasparon y se suspendieron en
100 ml de un caldo de patata y dextrosa comercialmente disponible
(producido por Difco) preparado según el manual del fabricante, y
la suspensión en un matraz con fondo deflector de 500 ml se cultivó
en un recipiente de cultivo con agitación rotativa a temperatura
constante a 25ºC, a 150 rpm durante 5 días. Las células de
microorganismo obtenidas se recuperaron por centrifugación de
10.000 g y se suspendieron en una solución 2 M de hidrogenocarbonato
de amonio/6 M de amoníaco (pH: 10,3). A esta suspensión celular se
añadió ácido 3-cianocinámico
correspondiente al 1% (p/v), el matraz se colocó en un recipiente de
cultivo con agitación rotativa a temperatura constante a 30ºC, y la
reacción se llevó a cabo a 120 rpm durante 120 horas. A
continuación, la solución de reacción se sometió a HPLC de fase
inversa; como resultado se detecto una acumulación de
3-ciano-L-fenilalanina
de 0,39% mediante la comparación con la muestra. Según el análisis
por cromatografía de gases (HPLC) del derivado, la pureza óptica
del mismo se calculó del 100% (límite de detección: 0,1%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivó Gonatobotryum apiculatum IFO
9098 (dividido por el Institute for Fermentation, Osaka) del mismo
modo que en el ejemplo 5 y las células obtenidas se suspendieron en
una solución 2 M de hidrogenocarbonato de amonio/6 M de amoníaco
(pH = 10,3). A esta suspensión celular se añadió ácido
4-hidroxicinámico correspondiente al 1% (p/v), el
matraz se colocó en un recipiente de cultivo con agitación rotativa
a temperatura constante a 30ºC, y la reacción se llevó a cabo a 120
rpm durante 120 horas. A continuación, la solución de reacción se
sometió a HPLC de fase inversa; como resultado se detecto una
acumulación de L-tirosina de 0,32% mediante la
comparación con la muestra. Según el análisis por cromatografía de
gases (HPLC) del derivado, la pureza óptica del mismo se calculó
del 100% (límite de detección: 0,1%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivó Eurotium chevalieri IFO 4090
del mismo modo que en el ejemplo 6 y las células obtenidas se
suspendieron en una solución 2 M de hidrogenocarbonato de amonio/6 M
de amoníaco (pH = 10,3). A esta suspensión celular se añadió ácido
3-hidroxicinámico correspondiente al 1% (p/v), el
matraz se colocó en un recipiente de cultivo con agitación rotativa
a temperatura constante a 30ºC, y la reacción se llevó a cabo a 120
rpm durante 96 horas. A continuación, la solución de reacción se
sometió a HPLC de fase inversa; como resultado se detecto una
acumulación de
3-hidroxi-L-fenilalanina
(metatirosina) de 0,64%. Según el análisis por cromatografía de
gases (HPLC) del derivado, la pureza óptica del mismo se calculó del
100% (límite de detección: 0,1%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se filtraron 50 ml de una solución de reacción
obtenida del mismo modo que en el ejemplo 1 por succión a través de
papel de filtro a efectos de extraer las células de microorganismo.
La solución acuosa obtenida se hizo pasar a través de dióxido de
carbono y, de este modo, se ajustó a un pH de 7, se le añadió
tolueno isovolumétrico, y la solución resultante se agitó y se
extrajo. La capa acuosa obtenida por recolección se eliminó por
destilación bajo presión reducida mediante un evaporador. El
producto sólido obtenido se analizó por ^{1}H-RMN,
análisis de elementos y HPLC. Como resultado, el principal
ingrediente del sólido fue la sal de amonio de
4-ciano-L-fenilalanina,
el contenido de la misma fue del 99,0% por peso seco, y la
recuperación de
4-ciano-L-fenilalanina
de la solución de reacción fue del 93%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se filtraron 50 ml de una solución de reacción
obtenida del mismo modo que en el ejemplo 2 por succión a través de
papel de filtro a efectos de extraer las células de microorganismo.
La solución acuosa obtenida se hizo pasar a través de dióxido de
carbono y, de este modo, se ajustó a un pH de 7, se le añadió
tolueno isovolumétrico, y la solución resultante se agitó y se
extrajo. La capa acuosa obtenida por recolección se eliminó por
destilación bajo presión reducida mediante un evaporador. El
producto sólido obtenido se analizó por ^{1}H-RMN,
análisis de elementos y HPLC. Como resultado, el principal
ingrediente del sólido fue la sal de amonio de
4-ciano-L-fenilalanina,
el contenido de la misma fue del 98,0% por peso seco, y la
recuperación de
4-ciano-L-fenilalanina
de la solución de reacción fue del 91,3%.
\vskip1.000000\baselineskip
Según la presente invención, se pueden obtener
con una buena eficiencia y de forma sencilla y fácil derivados de
L-fenilalanina con diversos sustituyentes en el
correspondiente grupo fenilo, partiendo de derivados del ácido
cinámico que se pueden sintetizar fácilmente.
Claims (16)
1. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina representado por la fórmula (1)
en el que R^{1}, R^{2},
R^{3}, R^{4} y R^{5} representan, cada uno independientemente,
hidrógeno, un grupo hidroxi, un grupo alquilo lineal o ramificado
con entre 1 y 4 átomos de carbono, un grupo alcoxi cuyo grupo
alquilo es un grupo alquilo lineal o ramificado con entre 1 y 4
átomos de carbono, un grupo ciano, un grupo nitro, un halógeno,
NR^{6}R^{7}, en el que R^{6} y R^{7} representan, cada uno
independientemente, hidrógeno o un grupo alquilo lineal o
ramificado con entre 1 y 4 átomos de carbono, o R^{6} y R^{7}
pueden formar un anillo con entre 3 y 5 átomos de carbono, pudiendo
contener dicho anillo un heteroátomo, o un grupo fenilo que puede
tener un sustituyente, siempre y cuando R^{1}, R^{2}, R^{3},
R^{4} y R^{5} no sean hidrógeno al mismo
tiempo,
que comprende hacer reaccionar por lo menos un
microorganismo perteneciente a cualquiera de los géneros
Cladosporium, el género Eurotium, el género
Thanatephorus y el género Gonatobotryum, un
ingrediente del microorganismo o un material tratado con el
microorganismo en presencia de amoníaco y un derivado del ácido
cinámico representado por la siguiente fórmula (2):
en el que los símbolos tienen los
mismos significados definidos
anteriormente.
2. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según la reivindicación 1, en el que
R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5} en la fórmula (1) son,
cada uno independientemente, hidrógeno, un grupo ciano o un grupo
hidroxi, pero no son hidrógeno al mismo tiempo.
3. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según la reivindicación 1 ó 2,
utilizando el microorganismo perteneciente a cualquiera de los
géneros Cladosporium, el género Eurotium, el género
Thanatephorus y el género Gonatobotryum, el cual se
cultiva previamente en un medio de cultivo que contiene una
fenilalanina o un derivado de fenilalanina.
4. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según la reivindicación 1, en el que,
por lo menos, una parte de amoníaco se suministra en forma de
carbonato.
5. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según la reivindicación 1 ó 3, en el
que el pH de la solución de reacción se ajusta de 8,5 a 11
utilizando ácido carbónico o una sal de amonio del mismo.
6. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según la reivindicación 1, en el que,
por lo menos, una parte del derivado de
L-fenilalanina obtenido se recupera como una sal de
amonio.
7. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según la reivindicación 4, 5 ó 16, en
el que, por lo menos, una parte del derivado de
L-fenilalanina obtenido se recupera como un
carbonato.
8. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según la reivindicación 1, que
comprende hacer reaccionar los microorganismos, ingredientes del
microorganismo o material tratado con el microorganismo en la
solución de un derivado del ácido cinámico con un contenido del 5%
en masa o menor.
9. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según la reivindicación 1 ó 2, en el
que el derivado de L-fenilalanina es
3-ciano-L-fenilalanina.
\newpage
10. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según la reivindicación 1 ó 2, en el
que el derivado de L-fenilalanina es
4-ciano-L-fenilalanina.
11. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según la reivindicación 1 ó 2, en el
que el derivado de L-fenilalanina es
3-hidroxi-L-fenilalanina.
12. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según la reivindicación 1 ó 2, en el
que el derivado de L-fenilalanina es
4-hidroxi-L-fenilalanina.
13. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según la reivindicación 1 ó 2, en el
que el derivado de L-fenilalanina es
3,4-dihidroxi-L-fenilalanina.
14. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según la reivindicación 1 ó 3, en el
que el microorganismo utilizado es cualquiera de entre
Cladosporium colocasiae, Eurotium chevalieri,
Thanatephorus cucumeris y Gonatobotryum
apiculatum.
15. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según la reivindicación 1 ó 3, en el
que el microorganismo utilizado es cualquiera de entre
Cladosporium colocasiae IFO 6698, Eurotium chevalieri
IFO 4090, Thanatephorus cucumeris IFO 6254 y
Gonatobotryum apiculatum IFO 9098.
16. Procedimiento para preparar un derivado de
L-fenilalanina según la reivindicación 5, en el que
el ajuste del pH utilizando ácido carbónico o una sal de amonio del
mismo se lleva a cabo burbujeando dióxido de carbono en una
solución de reacción.
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