ES2332828T3 - Metodo y dispositivo de analisis microbiologico rapido. - Google Patents
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Abstract
Dispositivo para el análisis microbiológico rápido de un soporte microporoso (19) que tiene dos caras opuestas (10, 11) adaptadas para retener microorganismos, que incluye: - unos medios (5) para sujetar dicho soporte (19) en una posición predeterminada en la cual una primera cara (10) de dichas caras enfrentadas de dicho soporte (19), está en una primera posición predeterminada y una segunda cara (11) de dichas caras enfrentadas de dicho soporte (19) está en una segunda posición predeterminada; - una estación (2) para rociar sobre dicho soporte (19) un reactivo para revelar la presencia de ATP por luminiscencia, estando dicha estación (2) enfrente de dicha primera posición; y - una estación (4) para medir dicha luminiscencia, enfrente de dicha segunda posición; caracterizado porque dicha estación de rociado y dicha estación de medición están una enfrente de la otra; por lo que dicho dispositivo es adecuado para analizar soportes cuando dicha luminiscencia es emitida por lo menos en el lado enfrentado al lado en el que se pulveriza dicho reactivo.
Description
Método y dispositivo de análisis microbiológico
rápido.
La presente invención se refiere a un
dispositivo y a un método de análisis microbiológico rápido.
Actualmente, en el marco de las actividades
industriales y médicas, el control de la calidad microbiológica de
líquidos, gases o superficies, tiene que ajustarse a unas normas
estrictas.
Por ello, las autoridades industriales y
sanitarias y de seguridad tienen que poder disponer de herramientas
para detectar una contaminación microbiológica lo más rápido
posible, para poder aplicar con tiempo un remedio con un coste
reducido.
En la práctica, la vigilancia microbiológica se
realiza sobre un medio gelificado, sobre el cual los microorganismos
que se han recogido sobre una membrana microporosa, se cultivan
hasta que son visibles a simple vista.
El tiempo de incubación varía de un
microorganismo a otro, pero generalmente es de al menos 24 horas y a
veces más largo para microorganismos de crecimiento más lento (por
ejemplo, las microbacterias) o porque los microorganismos están
sometidos a estrés debido a sus condiciones ambientales.
Un modo de acelerar la detección, es reducir la
duración mínima del cultivo (o incluso eliminarlo totalmente, en el
caso de determinados microorganismos) basando la detección de los
microorganismos en su actividad metabólica.
Un marcador metabólico universal, generalmente
el trifosfato de adenosina (ATP), contenido en microorganismos
vivos, se mide poniéndole en contacto con un reactivo que revela la
presencia de ATP por luminiscencia, de modo que se puede detectar
la presencia de microorganismos sin tener que esperar a que se
formen las colonias sobre un medio gelificado y que sean visibles a
simple vista.
La cantidad de luz emitida es una función de la
masa del ATP y, por lo tanto, del número de microorganismos.
Ya se conoce en la técnica el dispositivo para
la detección microbiológica rápida, Milliflex®, del solicitante que
incluye:
- una estación en la cual un volumen de líquido
se filtra a través de una membrana para capturar sobre la membrana
del filtro cualquier microorganismo contenido en ese líquido;
- una estación para rociar un agente adaptado
para hacer que el ATP de esos microorganismos sea accesible y un
reactivo para revelar la presencia de ATP por luminiscencia,
enfrente de la cual, el técnico coloca la membrana, después de la
etapa de filtración, para que los reactivos se depositen
sucesivamente; y
- una estación de medición de la cantidad de luz
emitida en respuesta al depósito del reactivo, para revelar la
presencia de ATP por luminiscencia, enfrente de la cual, el técnico
coloca la membrana después de la etapa de rociado, recogiendo la
luz emitida por la membrana con una cámara CCD, tratando y después
analizado para detectar la presencia de microorganismos sobre la
membrana.
El documento de patente de EE.UU. 3.940.250
sobre el que se basa el preámbulo de la reivindicación 1, describe
otro dispositivo detector microbiológico rápido que comprende una
estación de rociado y una estación de medición, para películas
enrolladas en ambos lados.
El objetivo de la invención es proporcionar un
dispositivo del mismo tipo que sea compacto y rápido, y que ofrezca
una alta eficacia.
Para ello, se propone un dispositivo para el
análisis microbiológico rápido, de un soporte microporoso, que
tiene dos caras enfrentadas, adaptadas para retener microorganismos,
que incluye:
- unos medios para sujetar dicho soporte en una
posición predeterminada en la cual una primera cara de dichas caras
enfrentadas de dicho soporte, está en una primera posición
predeterminada y una segunda cara de dichas caras enfrentadas de
dicho soporte está en una segunda posición predeterminada;
- una estación de rociado sobre dicho soporte,
de un reactivo para revelar la presencia de ATP por luminiscencia,
estando dicha estación enfrente de dicha primera posición; y
- una estación de medición de dicha
luminiscencia, enfrente de dicha segunda posición;
caracterizado porque dicha estación de rociado y
dicha estación de medición están una frente a otra;
por lo que dicho dispositivo es adecuado para
analizar soportes cuando dicha luminiscencia se emite por lo menos
en el lado enfrentado al lado en el que se pulveriza dicho
reactivo.
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Ya que la luz es emitida por el soporte en el
lado que está enfrente de la estación de medición, la estación de
medición y la estación de rociado están dispuestas cada una en un
lugar óptimo para satisfacer sus funciones respectivas,
simultáneamente.
Así, la estación de medición está situada lo más
cerca posible del soporte, para recoger la mayor cantidad posible
de luz emitida, sin estar impedida por la estación de rociado y sin
impedir la pulverización.
De acuerdo con las características de la
invención, que se prefieren por razones de sencillez y comodidad en
la fabricación y en el uso:
- dicha estación de rociado está alineada con
dicha primera posición;
- dicha estación de medición está alineada con
dicha segunda posición;
- dichos medios de sujeción incluyen una placa
que tiene un orificio en su centro;
- dicha placa incluye una pestaña anular
alrededor de dicho orificio;
- dicha estación de medición incluye un
fotomultiplicador y un miembro de cierre;
- dicho miembro de cierre incluye una placa fina
opaca, móvil entre una posición en la que está lejos de dicho
fotomultiplicador y una posición en la que aísla dicho
fotomultiplicador de la luz;
- dicha estación de rociado incluye una boquilla
de pulverización;
- dicho dispositivo incluye además, una estación
de lisis de los microorganismos;
- dicha estación de lisis incluye una caja de
microondas y un magnetrón;
- dicha caja de microondas tiene forma de
paralelepípedo;
- dicha caja incluye un primer cuerpo de caja,
un segundo cuerpo de caja y una abrazadera a la cual están unidos
dichos primer y segundo cuerpos de la caja;
- dicha caja tiene una ventana en dicha
abrazadera entre dichos primer y segundo cuerpos de la caja;
- dicha ventana se abre sobre dicha estación de
rociado y dicha estación de medición;
- dichos medios de sujeción están adaptados para
mover dicho soporte desde dicha posición predeterminada a una
posición en la que dicho soporte está en el interior de dicha
estación de lisis;
- dichos medios de sujeción están conectados con
una cinta a un motor; y/o
- dicho reactivo se basa en
luciferina-luciferasa.
Un segundo aspecto de la invención consiste en
un método de análisis microbiológico rápido de un soporte
susceptible de contener microorganismos, caracterizado porque
incluye:
- la etapa de obtener un dispositivo del tipo
anterior;
- la etapa de situar dicho soporte en dicha
posición predeterminada;
- la etapa de rociar dicho reactivo sobre dicho
soporte; y
- y simultáneamente a dicha etapa de rociado, la
etapa de medición de la cantidad de luz emitida como respuesta a
dicho reactivo.
La configuración del dispositivo con la estación
de rociado situada enfrente de la estación de medición, indica que
las etapas de rociado y de medición se pueden efectuar
simultáneamente y de forma óptima durante el desarrollo del
método.
Según las características que se prefieren por
razones de sencillez y de comodidad para la fabricación y el uso,
se selecciona como soporte una membrana microporosa.
Las características y las ventajas de la
invención se revelan con la siguiente descripción, que se ofrece a
modo de ejemplo preferido pero no limitativo, haciendo referencia a
los dibujos adjuntos, en los cuales:
- la figura 1 es una vista en perspectiva, de un
dispositivo para análisis microbiológico rápido, que muestra un
carro móvil del dispositivo en una posición en la cual recibe una
unidad de filtro;
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- la figura 2 es una vista en perspectiva a una
escala mayor que en la figura 1, de este dispositivo en una sección
de un plano vertical centrado en la trayectoria del carro;
- las figuras 3 y 4 son vistas similares a la
figura 2, pero que muestran respectivamente la posición que ocupa
el carro móvil cuando se coloca en una primera y en una segunda
posición de tratamiento de una membrana de la unidad de filtro;
- las figuras 5 y 6 son dos vistas en
perspectiva de una sección con diferentes ángulos y a una escala
mayor que la figura 3;
- la figura 7 es un cronograma que muestra, con
una escala de tiempo común (el eje de abscisas) y una escala de
porcentaje común (el eje de ordenadas), cómo varían en función del
tiempo, cuando la membrana que incluye la unidad de filtración se
calienta hasta una temperatura de 90ºC, la tasa de actividad
remanente de un reactivo depositado previamente sobre la membrana y
la tasa de lisis de un primer y segundo tipo de microorganismos
presentes sobre la membrana;
- la figura 8 es un cronograma que muestra con
una escala de tiempo común (el eje de abscisas), cómo varían
respectivamente la cantidad relativa de luz emitida por la membrana
y su entorno inmediato, antes, durante y después del depósito de un
reactivo que revela la presencia de ATP mediante luminiscencia, y la
cantidad de luz que se habría emitido sin el depósito de este
reactivo;
- la figura 9 es un cronograma similar al de la
figura 8, pero que muestra de forma aislada cómo varía, en función
del tiempo, la cantidad de luz emitida solamente por la puesta en
contacto del reactivo que revela la presencia de ATP de los
microorganismos en la membrana;
- la figura 10 es un diagrama de bloques del
dispositivo, que muestra en particular un microordenador del
dispositivo;
- la figura 11 es un diagrama de flujo que
muestra las operaciones efectuadas por el microordenador sobre los
datos suministrados por un fotomultiplicador del dispositivo; y
- la figura 12 es un cronograma que muestra, con
una escala de tiempo común, (el eje de abscisas), como varía la
cantidad de luz emitida por la membrana y su entorno inmediato, para
diferentes cantidades iniciales de ATP indeseado, antes, durante y
después del depósito del reactivo, para revelar la presencia de ATP
por luminiscencia.
El dispositivo de análisis rápido 1 de una
unidad de filtro 15 incluye una estación de rociado 2, una estación
de lisis 3 y una estación de medición de la luz 4.
La estación de rociado 2 y estación de medición
4 están una enfrente de la otra y la estación de lisis 3 está en la
proximidad de las estaciones 2 y 4.
La estación de rociado 2 incluye una boquilla de
pulverización 21 conectada por un conducto 22 a un matraz, no
mostrado.
La boquilla de pulverización 21 tiene una cabeza
cónica 25 y está fijada por medio de una placa 23 a un bastidor del
dispositivo (no mostrado).
El matraz al que se conecta el conducto 22,
contiene un reactivo para revelar la presencia de ATP por la
luminiscencia, a base de agua, un complejo de
luciferina-luciferasa y magnesio. El matraz es
portador de un chip de RFID en el que se almacenan informaciones
relativas al reactivo, tal como el volumen inicial de reactivo
contenido en el matraz, la fecha de caducidad del reactivo o el
número de ciclos que se pueden realizar usando el volumen restante
de reactivo en el matraz.
La estación de lisis 3 incluye una caja 30 de
forma generalmente paralelepípeda y un magnetrón 31 (representado
en la figura 1 con su panel de control electrónico) conectado por un
cable coaxial (no mostrado) a una antena (no visible) en el interior
de la caja 30.
El magnetrón 31 y su panel de control se montan,
de forma similar a la placa 23 de la boquilla 21, sobre el bastidor
del dispositivo (no mostrado).
La caja 30 tiene un cuerpo de la caja superior
28, un cuerpo de la caja inferior 29 y una abrazadera con sección en
U 32.
Cada cuerpo de la caja tiene generalmente forma
paralelepípeda y tiene una cara abierta.
El cuerpo de la caja 28 (respectivamente 29)
tiene alrededor de su cara abierta, una pestaña de contorno
rectangular 41 (respectivamente 42), conectada transversalmente con
el resto del cuerpo de la caja.
La abrazadera en forma de "U" 32, tiene dos
grandes ramas 43 conectadas entre sí por una pequeña rama
transversal 45.
En el estado ensamblado, cada pestaña 41, 42
coopera con las ramas de la abrazadera 32, de modo que las caras
abiertas de los cuerpos de la caja 28 y 29, están dispuestas una
enfrente de la otra.
Los cuerpos de la caja 28, 29 y la abrazadera 32
de la caja 30, tienen dimensiones tales, que el magnetrón 31
produce ondas estacionarias en la cavidad delimitada por la caja
30.
En el estado ensamblado, el espacio en el lado
de la caja opuesto a la rama 45, entre las ramas 43 y entre las
pestañas 41 y 42, está abierto en dirección hacia la estación de
rociado 2 y la estación de medición 4, en virtud de una ventana
39.
En la proximidad de la ventana 39 hay una aleta
68 para bloquear cerrando esta ventana, para aislar la estación de
rociado 2 y la estación de medición 4 de la interferencia
electromagnética generada por el magnetrón 31.
La estación de medición 4 incluye un
fotomultiplicador 50 que atraviesa una tabla 51 y un elemento de
cierre 52 (figura 6).
El fotomultiplicador 50 es un fotomultiplicador
9266B de Electron Tubes®.
El elemento de cierre 52 se muestra con detalle
en la figura 6 e incluye una placa opaca 53, una varilla 56, una
manivela 55 y un motor 54.
La placa 53 es móvil y está alojada en una
cavidad formada en la tabla 51 y está conectada por la varilla 56 a
la manivela 55.
El dispositivo 1 también incluye un carro 5 que
tiene una placa 12 y un reborde 9 (figuras 2 a 4). La placa 12 está
fijada al reborde 9 por dos tornillos 7 (figura 1).
Un orificio cilíndrico en la placa 12 se abre a
cada lado de la placa.
Este orificio está flanqueado por una pestaña
anular 13 rebajada en relación con cada lado de la placa 12.
El rebajo en el lado de la placa 12 que está
enfrente del fotomultiplicador 50, aloja una ventana de
vidrio
17.
17.
La unidad de filtro 15 incluye un cuerpo 18
alrededor de una membrana microporosa 19 que tiene dos caras
enfrentadas 10 y 11.
El reborde 9 en el carro 5 está conectado por
una cinta 64, fijada al reborde por un tornillo 8 y por un conjunto
de poleas 62, 63 y 67 a un motor 65 (figuras 1 y 2), situadas fuera
de la caja 30, en la proximidad de la rama 45 de la abrazadera
32.
La cinta 64 tiene una sección curva para
presentar una resistencia a la flexión que le permita transmitir
una fuerza de empuje, a la vez está adaptada para ser enrollada
alrededor de una polea.
La cinta 64 atraviesa la caja 30 por medio de la
ventana 39 y por un agujero oblongo 46 formado en la rama pequeña
45 de la abrazadera 32 (figuras 2 a 4).
El carro 5 se fija a la cinta para mover el
carro entre una posición de recepción (figuras 1 y 2), una primera
posición de tratamiento (figuras 3, 5 y 6) y una segunda posición de
tratamiento (figura 4).
El dispositivo 1 también incluye en el lado
opuesto al motor 65, una ventana 60 y una tapa 61 adaptada para que
cuando se cierra, la ventana 60 sea estanca a la luz.
En la posición de recepción, con la tapa 61
abierta, la placa 12 sobresale del dispositivo a través de la
ventana 60.
En la primera posición de tratamiento, el carro
5 está entre la boquilla 21 y el fotomultiplicador 50, con el
resultado de que en esta posición, la estación de rociado 2 está
enfrente y alineada con la cara 10 de la membrana 19, mientras que
la estación de medición 4 está enfrente y alineada con la cara 11 de
la membrana a través de la ventana 17.
La cinta 64 atraviesa totalmente la caja 30 en
la posición de recepción y en la primera posición de
tratamiento.
En la segunda posición de tratamiento, el carro
5 está en el interior de la caja 30 de la estación de lisis 3, de
modo que la membrana 19 está situada completamente en el interior de
esta caja y el reborde 9 está entre las pestañas 41 y 42.
Los sensores en las distintas estaciones de
tratamiento vigilan el estado operativo del dispositivo,
particularmente un lector/escritor de RFID al lado del matraz que
contiene el reactivo, una pluralidad de sensores de la posición del
carro y una pluralidad de sensores de la temperatura (para el
fotomultiplicador y el magnetrón, por ejemplo).
La estación de rociado 2, la estación de lisis
3, la estación de medición 4, los motores 54 y 65 y los diversos
los sensores están conectados a un microordenador 82, tal y como se
muestra en el diagrama de bloques de la figura 10.
El microordenador 82 está adaptado
particularmente para ejecutar las instrucciones para el comienzo o
la parada de un ciclo de análisis, para recibir instrucciones de un
técnico a través de una interfaz hombre-máquina 85
y para almacenar los datos que vienen del fotomultiplicador en una
memoria. El microordenador 82 también está adaptado para presentar
visualmente en una pantalla 83 y/o para imprimir a través de una
impresora de etiquetas 84, la información destinada al técnico (por
ejemplo el progreso del ciclo actual, el número de ciclos aún
disponibles en el matraz, el resultado de los análisis precedentes,
y diferentes informes de alarma y de mantenimiento del
dispositivo).
A continuación, se describe el funcionamiento
del dispositivo 1.
Antes de realizar un ciclo de análisis, el
técnico recoge cualquier microorganismo que pueda estar presente en
un líquido o en un gas, o en una superficie sobre la membrana
microporosa 19 de la unidad de filtro 15.
Después de seleccionar la placa apropiada 12
para cooperar con el cuerpo 18 de la unidad de filtro y atornillarla
en el reborde 9, el técnico coloca a continuación la unidad de
filtro 15 sobre el carro móvil 5 (que está ahora en la posición de
recepción representada en las figuras 1 y 2), centrándola en
relación con la pestaña 13, apoyándose entonces el borde inferior
del cuerpo 18 de la unidad 15, sobre esta pestaña.
Usando una interfaz
hombre-máquina, el técnico ordena a continuación el
comienzo de un ciclo de análisis de la membrana.
Particularmente, el técnico elige entre tres
ciclos diferentes, a saber un ciclo sin tratamiento previo, un
ciclo con tratamiento previo "manual" y un ciclo con
tratamiento previo automático.
Las diferentes etapas del ciclo con tratamiento
previo manual se describen a continuación.
Inicialmente, el módulo de control acciona el
motor 65 para que las poleas 62, 63 y 67 sometan al carro móvil 5 a
un movimiento de traslación.
Este mueve el carro desde su posición de
recepción hasta su primera posición de tratamiento (figura 3), entre
el módulo de rociado 2 y el módulo de medición 4. Durante este
movimiento, cuando el carro 5 ha pasado completamente a través de
la ventana 60, la tapa 61 del dispositivo, que es por resorte, se
cierra y las etapas posteriores se realizan en un entorno cerrado y
oscuro.
En la primera posición de tratamiento, la
estación 2 pulveriza un volumen predeterminado de reactivo. La
boquilla de pulverización 21 se diseña para que deposite
microgotitas del reactivo de forma homogénea y regular sobre toda
la membrana 19. Con el rociado de microgotitas se divide
suficientemente el volumen de líquido depositado, para evitar
cualquier riesgo de dilución.
El reactivo se pone a continuación en contacto
con el ATP indeseado, sobre la membrana, que no proviene de los
microorganismos que retiene, sino de la contaminación externa, por
ejemplo durante el transporte o la filtración.
Poniendo en contacto el reactivo con el ATP
indeseado, se produce una reacción química que genera la luz y
consume el ATP indeseado. El ATP indeseado consumido de este modo,
no interferirá con las etapas posteriores del ciclo de
análisis.
El reactivo no interacciona con el ATP de los
microorganismos, porque en esa etapa del ciclo, todavía está
protegido del reactivo por las paredes celulares de los
microorganismos.
Cuando se pulveriza el reactivo, el módulo de
control acciona el motor 65 para que el carro móvil 5 entre en la
caja 30 a través de la ventana 39, para empezar con la segunda
posición de tratamiento, en el interior de la cavidad de microondas
de la estación de lisis 3.
Cuando el carro 5 se introduce en la caja 30, la
aleta 68, que es por resorte, se cierra para aislar la caja 30 del
resto del dispositivo y para minimizar la interferencia
electromagnética causada por la emisión de microondas.
El magnetrón 31 emite a continuación un campo
mono-onda de modo que una onda incidente se propaga
en la cavidad de microondas, formada por la caja 30. En la caja
ondas se establecen estacionarias (como resultado de la reflexión
de la onda incidente sobre las superficies de la caja 30).
Las porciones de las pestañas 41 y 42 situadas
en la proximidad de la ventana 39 y de la abertura 46, también
ayudan para minimizar la pérdida de campo magnético a través de
estas aberturas.
Las moléculas polarizadas (particularmente el
agua contenida en la membrana después de la filtración y/o aportada
por el primer rociado de reactivo), excitadas por el campo de
microondas, calientan la membrana 19 hasta una temperatura de
aproximadamente 90ºC.
A esa temperatura, el reactivo sobre la membrana
se elimina rápidamente, tal y como se muestra en la curva 75 en la
figura 7, lo que representa la proporción de reactivo que todavía
está activo (nivel de actividad remanente) en función del
tiempo.
Después de 6 segundos de exposición a esta
temperatura, el 20% del reactivo se ha eliminado, después de 15
segundos el 90% del reactivo se ha eliminado y después de 17
segundos, se ha eliminado todo el reactivo.
La cinética de la lisis de los microorganismos a
esta temperatura es más lenta. Las curvas 76 y 77 en la figura 7
representan el porcentaje de microorganismos que experimentan la
lisis en función del tiempo y para dos tipos de microorganismos
(Saccharomyces cerevisae en el caso de la curva 76 y
Cryptococcus en el caso de la curva 77). Nótese que en el
momento en el que se elimina todo el reactivo, solamente una pequeña
cantidad de microorganismos ha experimentado la lisis.
Así, las paredes celulares de la mayoría de los
microorganismos no han experimentado la lisis (y, por lo tanto, el
ATP de los microorganismos no se ha vuelto accesible) en el momento
en el que se elimina el reactivo depositado previamente. De este
modo, la porción principal del ATP de los microorganismos no es
consumida por el reactivo.
Además, la eliminación del reactivo se acelera
porque el incremento de la temperatura conduce a una sequedad
parcial de la membrana 19, volviendo al calor más eficaz para
eliminar el reactivo.
El calentamiento por microondas representa una
entrada de únicamente la cantidad necesaria de energía, que es una
función de la cantidad de agua presente en la membrana, sin producir
calor residual que podría interferir con las etapas siguientes del
proceso.
Después de esta etapa de calentamiento, el ATP
de los microorganismos que han experimentado la lisis, está
accesible para ser analizado. El motor 65 es accionado a
continuación para mover el carro 5 fuera de la caja 30 y volver a
la primera posición de tratamiento, después de lo cual, el motor 54
del elemento de cierre 52 de la estación de medición, es accionado
para girar la manivela 55 y mover la placa opaca 53 hasta una
posición alejada del fotomultiplicador 50 (figura 3).
El fotomultiplicador mide después la cantidad de
luz que recibe a través de la ventana 17, emitida por los
materiales situados en el "campo de visión" del
fotomultiplicador (aquí, la membrana 19 y su entorno inmediato).
Las operaciones realizadas con el microordenador
cuando se abre el elemento de cierre, se describen a continuación
haciendo referencia al diagrama de flujo de la figura 11.
En la operación 90, desde un tiempo t_{1}
(aquí, 30 s) hasta un t_{2} (aquí, 300 s), el microordenador
registra los datos medidos, transmitidos por el
fotomultiplicador.
En un tiempo t_{0} posterior a t_{1} y
anterior a t_{2} (figura 8), la estación de rociado 2 efectúa una
segunda deposición regular y homogénea de microgotitas del reactivo
contenido en el matraz, sobre toda la membrana 19, mientras que
continúa el registro de la cantidad de luz.
La luz es emitida desde ambos lados de la
membrana 19 y de la placa 12, gracias al poco espesor de la membrana
y al orificio formado en la placa 12 para este fin.
La cantidad de luz registrada en forma de unidad
de luz relativas (ULR) en función del tiempo, se indica con la
curva 78 en la figura 8, que muestra que la cantidad de luz
disminuye regular y logarítmicamente en el instante t_{0} que se
corresponde con el instante en el que se rocía el reactivo sobre la
membrana.
Esta fase que disminuye se corresponde con la
pérdida de excitación por la emisión fosforescente de fotones
emitidos de forma natural por el material situado en el campo de
visión del fotomultiplicador.
Más allá del instante t_{0}, tiene lugar una
transición brusca en la emisión de luz, debido a que el reactivo
entra en el contacto con el ATP de los microorganismos, que se ha
vuelto accesible por la etapa de lisis.
Después de esta transición brusca, la cantidad
de la luz vuelve a disminuir logarítmicamente.
Usando los datos registrados, el microordenador
realiza la operación 91 y extrapola en función del tiempo la
cantidad de luz que habría sido emitida si el reactivo no se hubiera
depositado sobre la membrana.
En el ejemplo presente, esta operación se basa
en los datos registrados desde t_{1} (50 s) hasta t_{0} (100
s) y a partir de los datos registrados desde t_{3} = t_{0} + x
hasta t_{2} (300 s), en donde x se elige de modo que t_{3} sea
suficientemente lejano de t_{0} para que se considere que a partir
de t_{3}, la adición de reactivo tiene una influencia
despreciable (aquí, t_{3} = 250 s). El microordenador deduce a
partir de los datos registrados los coeficientes de una función
logarítmica que varía globalmente entre t_{1} y t_{0} y entre
t_{3} y t_{2} como la cantidad de luz representada por la curva
78.
En el ejemplo presente, esta función es Q (t) =
-16518.ln (t) + 120334 y está representada por la curva 79 en la
figura 8; aquí el coeficiente de correlación entre los datos
registrados y los datos procedentes de la función extrapolada es
0,09994 en los intervalos de tiempo [t_{1}, t_{0}] y [t_{3},
t_{2}].
Las curvas 78 y 79 difieren significativamente
entre sí, durante un intervalo de tiempo en el que el límite
inferior es el instante t_{0} (100 s) en el que se pulveriza el
reactivo (aquí, el intervalo [100 s, 150 s]).
El microordenador determina entonces, con la
operación 92, a partir de las cantidades de luz registradas y
extrapoladas, representadas respectivamente por las curvas 78 y 79,
un conjunto de valores en función del tiempo representativo de la
cantidad de luz que proviene solamente de la puesta en contacto del
ATP de los microorganismos con el reactivo. Ese conjunto de valores
está representado por la curva 80 en la figura 9.
En el ejemplo presente, el microordenador
calcula la diferencia, para cada instante entre t_{1} a t_{2},
en el que se ha registrado un de valor de cantidad de luz, entre ese
valor y el valor dado por la función de extrapolación Q (t) en el
mismo instante.
Esta sustracción punto a punto, permite filtrar
numéricamente el ruido de fondo luminoso indeseado (también
denominado "disminución del ruido blanco") para obtener el
conjunto de valores correspondiente a la cantidad de luz que
proviene solamente del ATP de los microorganismos.
La filtración del ruido de fondo elimina los
efectos de las condiciones de almacenamiento (cuya influencia es
importante para la emisión de la luz natural), de la naturaleza del
producto depositado o filtrado sobre la membrana (que emite luz por
sí mismo, dependiendo de su composición), y de las condiciones
experimentales del análisis (estanqueidad a la luz, perturbaciones
térmicas, eficacia del fotomultiplicador).
La cantidad de luz filtrada de este modo se
integra a continuación entre los instantes t_{1} y t_{2}
(operación 93) y una prueba (94) compara los resultados de esta
integración con un umbral que se corresponde a la sensibilidad
requerida por el usuario para detectar el microorganismo.
Entre otras cosas, el valor de este umbral se
elige en función del tipo de microorganismo que se va a detectar,
ya que la masa de ATP contenida en los microorganismos puede variar
significativamente de un tipo de microorganismo a otro.
Si el resultado de esta integración es superior
al valor umbral, el ATP que origina esta luz se considera que
proviene de la presencia de microorganismos sobre la membrana.
Inversamente, si el resultado de esta
integración es inferior al valor umbral, se estima entonces que el
ATP no está presente en cantidades suficientes para considerar que
estén presentes microorganismos (o presentes en cantidades
suficientemente elevadas) sobre la membrana.
El microordenador muestra entonces la
información apropiada en la pantalla del dispositivo, al realizar la
operación 95 o la operación 96, en función del resultado de la
prueba 94.
Una vez que se ha realizado el análisis, el
módulo de control mueve el carro 5 desde la primera posición de
tratamiento hasta la posición de recepción, en la cual el técnico
puede retirar la unidad de filtro 15 que se ha analizado y
sustituirla por la siguiente unidad que se va a analizar.
La disposición de la estación de medición 4 y de
la estación de rociado 2, en relación con la membrana 19, en la
primera posición de tratamiento, indica que el fotomultiplicador 50
está lo más cerca posible de la membrana 19 y dispuesto
transversalmente a la misma, sin estar obstaculizado por la estación
de rociado y sin obstaculizar la estación de rociado. Esta
disposición permite recoger el máximo de luz y, por lo tanto,
optimiza la sensibilidad de la detección del fotomultiplicador.
Por otra parte, usando un elemento de cierre que
tiene una placa opaca delgada y un mecanismo remoto de apertura y
cierre, se reduce adicionalmente la distancia entre el
fotomultiplicador 50 y la membrana 19 y se incrementa de este modo
la sensibilidad de la detección.
La configuración del dispositivo, la etapa de
tratamiento previo y el tratamiento de los datos de las señales
luminosas registradas, hacen que el dispositivo de detección sea
altamente sensible.
Un dispositivo del tipo anterior puede detectar
la presencia de sólo aproximadamente diez femtogramos de ATP.
Esta sensibilidad implica que se puede detectar
una amplia variedad de microorganismos y se puede detectar la
presencia de un solo microorganismo sobre la membrana, sin
incubación.
Las etapas de tratamiento previo realizadas en
el caso de un ciclo automático, se describen a continuación.
El ciclo de análisis automático asegura que se
consuma todo el ATP indeseado.
En la figura 12, que representa la cantidad de
luz registrada antes y después de depositar un reactivo en el
instante t_{0}, para diferentes cantidades de ATP indeseado que no
se han consumido (170 fg en el caso de la curva 78A, 66 fg en el
caso de la curva 78B, 52 fg en el caso de la curva 78C y 18 fg en el
caso de la curva 78D), el ATP indeseado que no se ha consumido
puede estar presente en grandes cantidades y causar análisis
erróneos (detección de "falsos positivos": se detecta la
presencia de microorganismos aunque la membrana no contiene
ninguno).
Por lo tanto, es beneficioso proporcionar al
usuario un ciclo que confirme que la etapa de tratamiento previo ha
consumido todo el ATP indeseado.
Antes de efectuar la lisis de los
microorganismos, cuando el carro 5 se sitúa en la primera posición
de tratamiento y simultáneamente al rociado del reactivo, se abre
el elemento de cierre 52 para que el fotomultiplicador 50 mida
continuamente la cantidad de luz emitida por la membrana y su
entorno inmediato, durante la etapa de rociado. El microordenador
compara esta medición con un valor umbral predeterminado y la
pulverización del reactivo continúa mientras que la cantidad de luz
medida por el fotomultiplicador sea superior a ese umbral.
Cuando la cantidad de luz medida cae por debajo
del umbral, la masa no consumida de ATP indeseado, que todavía está
presente sobre la membrana, se estima que se ha vuelto despreciable
y se detiene la pulverización. A continuación, se mueve el carro
hacia la segunda posición de tratamiento, para continuar con el
ciclo del análisis.
En una variante, en vez de integrar todos los
valores correspondientes a la cantidad de luz representada por la
curva 80, el microordenador puede seleccionar el valor máximo de ese
conjunto y compararlo con un valor umbral predeterminado.
En otra variante, el calentamiento de la
membrana se realiza con rayos infrarrojos.
En otra variante, la etapa de termólisis se
sustituye por una etapa de rociado de un reactivo que permite o
bien la lisis química de los microorganismos o bien volver la
membrana permeable a los microorganismos para hacer que el ATP que
contienen sea accesible al reactivo, para revelar el ATP por
luminiscencia que se pulveriza posteriormente.
En otra variante, se emplea el dispositivo para
realizar el recuento de microorganismos sobre la membrana,
sustituyendo el fotomultiplicador por una cámara CCD o bien tratando
y/o analizando la membrana varias veces, una región elemental cada
vez.
Claims (19)
1. Dispositivo para el análisis microbiológico
rápido de un soporte microporoso (19) que tiene dos caras opuestas
(10, 11) adaptadas para retener microorganismos, que incluye:
- unos medios (5) para sujetar dicho soporte
(19) en una posición predeterminada en la cual una primera cara
(10) de dichas caras enfrentadas de dicho soporte (19), está en una
primera posición predeterminada y una segunda cara (11) de dichas
caras enfrentadas de dicho soporte (19) está en una segunda posición
predeterminada;
- una estación (2) para rociar sobre dicho
soporte (19) un reactivo para revelar la presencia de ATP por
luminiscencia, estando dicha estación (2) enfrente de dicha primera
posición; y
- una estación (4) para medir dicha
luminiscencia, enfrente de dicha segunda posición;
caracterizado porque dicha estación de
rociado y dicha estación de medición están una enfrente de la
otra;
por lo que dicho dispositivo es adecuado para
analizar soportes cuando dicha luminiscencia es emitida por lo
menos en el lado enfrentado al lado en el que se pulveriza dicho
reactivo.
2. Dispositivo según la reivindicación 1,
caracterizado porque dicha estación de rociado (2) está
alineada con dicha primera posición.
3. Dispositivo según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, caracterizado porque dicha estación de
medición (4) está alineada con dicha segunda posición.
4. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dichos medios de
sujeción incluyen una placa (12) que tiene un orificio en su
centro.
5. Dispositivo según la reivindicación 4,
caracterizado porque dicha placa (12) incluye una pestaña
anular (13) alrededor de dicho orificio.
6. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicha estación
de medición incluye un fotomultiplicador (50) y un elemento de
cierre (52).
7. Dispositivo según la reivindicación 6,
caracterizado porque dicho elemento de cierre (52) incluye
una placa opaca delgada (53) móvil entre una posición en la cual
está alejada de dicho fotomultiplicador (50) y una posición en la
cual aísla dicho fotomultiplicador (50) de la luz.
8. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque dicha estación
de rociado (2) incluye una boquilla de pulverización (21).
9. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque incluye
adicionalmente una estación de lisis de los microorganismos
(3).
10. Dispositivo según la reivindicación 9,
caracterizado porque dicha estación de lisis incluye una caja
de microondas (30) y un magnetrón (31).
11. Dispositivo según la reivindicación 10,
caracterizado porque dicha caja de microondas (30) tiene
forma de paralelepípedo.
12. Dispositivo según la reivindicación 11,
caracterizado porque dicha caja (30) incluye un primer cuerpo
de la caja (28), un segundo cuerpo de la caja (29) y una abrazadera
(32) a la que se unen dichos primer y segundo cuerpos de la
caja.
13. Dispositivo según la reivindicación 12,
caracterizado porque dicha caja (30) tiene una ventana (39)
entre dichos primer y segundo cuerpos de la caja.
14. Dispositivo según la reivindicación 13,
caracterizado porque dicha ventana (39) se abre sobre dicha
estación de rociado (2) y dicha estación de medición (4).
15. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 14, caracterizado porque dichos medios
de sujeción (5) están adaptados para mover dicho soporte desde
dicha posición predeterminada hasta una posición en la cual dicho
soporte (19) está en el interior de dicha estación de lisis (3).
16. Dispositivo según la reivindicación 15,
caracterizado porque dichos medios de sujeción (5) están
conectados con una cinta (64) a un motor (65).
17. Dispositivo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque dicho reactivo
se basa en luciferina-luciferasa.
18. Método de análisis microbiológico rápido de
un soporte susceptible de contener microorganismos,
caracterizado porque incluye:
- la etapa de proporcionar un dispositivo según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17;
- la etapa de colocar dicho soporte (19) en
dicha posición predeterminada;
- la etapa de rociar dicho reactivo sobre dicho
soporte (19); y
- simultáneamente a dicha etapa de rociado, la
etapa de medición de la cantidad de luz emitida como respuesta a
dicho reactivo.
19. Método según la reivindicación 18,
caracterizado porque como soporte se selecciona una membrana
microporosa (19).
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