ES2333385T3 - Proteina del tipo de interleuquina-17. - Google Patents
Proteina del tipo de interleuquina-17. Download PDFInfo
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: (a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos desde Pro en la posición 1 hasta Trp en la posición 271 de la SEQ ID NO: 2; y (b) moléculas de ácido nucleico que consisten en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 desde la posición 67 hasta la posición 879 de la SEQ ID NO: 1; o la cadena complementaria de dicha molécula de ácido nucleico.
Description
Proteína del tipo receptor de
interleuquina-17.
En la presente memoria se describe un nuevo gen
humano que codifica un polipéptido que es un miembro de la familia
de los receptores de la interleuquina (IL)-17. La
presente invención proporciona moléculas aisladas de ácidos
nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos desde Pro en la
posición 1 hasta Trp en la posición 271 de la SEQ ID NO:2 del
polipéptido humano denominado proteína similar al receptor de la
interleuquina-17 en lo sucesivo abreviadamente
IL17RLP. También se proporciona el polipéptido IL17RLP parcial
correspondiente, así como vectores, células hospedantes y métodos
recombinantes para producirlos.
Las citoquinas ejercen típicamente sus efectos
bioquímicos y fisiológicos respectivos por unión a moléculas
receptoras específicas. La unión al receptor estimulará entonces las
vías específicas de transducción de señales (Kishimoto, T., et
al., Cell 76: 253-262 (1994). Las
interacciones específicas de las citoquinas con sus receptores son
frecuentemente las reguladores primarios de una amplia variedad de
procesos celulares que incluyen la activación, la proliferación y
la diferenciación (Arai, K. I, et al., Ann. Rev.
Biochem. 59: 783-836 (1990); Paul, W. y Seder,
R., Cell 76:241-251 (1994)).
La interleuquina (IL)-17 humana
sólo ha sido identificada recientemente. La IL-17 es
un polipéptido de 155 aminoácidos que fue clonado molecularmente a
partir de una genoteca de cDNA de células T CD4+ (Yao, Z., et
al., J. Immunol. 155:5483-5486 (1995)).
El polipéptido IL-17 contiene un péptido señal
N-terminal y contiene aproximadamente 72% de
identidad en el nivel de aminoácidos con un gen saimiri de
herpesvirus (HVS) trófico de células T, denominado HVS13. Altos
niveles de IL-17 son segregados por leucocitos de
sangre periférica (PBL) primarios CD4-positivos por
estimulación (Yao, Z., et al., Immunity
3:811-821 (1995)). El tratamiento de fibroblastos
con IL-17, HVS13, u otro homólogo murino, denominado
CTLAB, activa las vías de transducción de señales y da como
resultado la estimulación de la familia de factores de la
transcripción NF-_{\kappa}B, la secreción de
IL-6, y la co-estimulación de la
proliferación de células T (Yao, Z., et al., Immunity
3:811-821 (1995)).
Se usó una proteína de fusión
FIVS13-Fc para aislar una molécula del receptor de
IL-17 murina que no parece pertenecer a ninguna de
las familias de receptores de citoquinas previamente descritas (Yao,
Z., et al., Immunity 3:811-821
(1995)). Del receptor de IL-17 murina
(mIL-17R) se predice que codifica una proteína
transmembranal de tipo I de 864 aminoácidos con una masa molecular
aparente de 97,8 kDa. Se predice que la mIL-17R
posee un péptido señal N-terminal con un sitio de
escisión entre la alanina-31 y la
serina-32. La molécula también contiene un dominio
extracelular de 291 aminoácidos, un dominio transmembranal de 21
aminoácidos, y una etiqueta (o cola) citoplásmica de 521
aminoácidos. Una molécula IL-17R recombinante
soluble que consiste en 323 aminoácidos del dominio extracelular de
IL-17R fusionada a la porción Fc de IgG1 humana fue
capaz de inhibir significativamente la producción de
IL-6 inducida por IL-17 por células
NIH-3T3 murinas (supra).
Interesantemente, la expresión del gen
IL-17 gen está altamente restringida. Típicamente se
observa primariamente en células de memorias de linfocitos T
activadas (Broxmeyer, H. J. Exp. Med.
183:2411-2415 (1996); Fossiez, F., et al.,
J. Exp. Med. 183: 2593-2603 (1996)).
Inversamente, el receptor de IL-17 parece ser
expresado en un gran número de células y tejidos incluyendo
(Rouvier, E., et al., J. Immunol.
150:5445-5456 (1993); Yao, Z., et al., J.
Immunol. 155:5483-5486 (1995)). Queda por ver,
sin embargo, si IL-17 por si mismo puede desempeñar
un papel autocrino en la expresión de IL-17. La
IL-17 ha estado implicada como agente causante en la
expresión de IL-6, IL-8,
G-CSF, la prostaglandina E (PGE_{2}), y la
molécula de adhesión intracelular (ICAM)-1 (Fossiez,
F., supra; Yao, Z., et al., Immunity
3:811-821 (1995)). Cada una de estas moléculas posee
propiedades valiosas altamente relevantes y potencialmente
terapéuticas. Por ejemplo, la IL-6 está implicada en
la regulación del crecimiento y la expansión de células madre
hematopoyéticas y progenitoras (Ikebuchi, K., et al.,
Proc, Natl. Acad. Sci. USA 84:9035-9039
(1987); Gentile, P. y Broxmeyer, H. E. Ann. N.Y. Acad. Sci.
USA 628:74-83 (1991)). La IL-8
exhibe una actividad mielosupresora para los subconjuntos de células
madres e inmaduras de progenitoras mieloides.
(Broxmeyer, H. E., et al., Ann.
Hematol. 71:235-246 (1995); Daly, T. J., et
al., J. Biol. Chem. 270:23282-23292
(1995)). La G-CSF actúa temprano y tarde para
activar y estimular la hematopoyesis en general (más
específicamente, la hematopoyesis de neutrófilos) mientras que la
PGE_{2} aumenta la eritropoyesis, suprime la linfopoyesis y la
mielopoyesis en general, y suprime fuertemente la monocitopoyesis
(Broxmeyer, H. E. Amer. J. Ped. Hematol. Oncol.
14:22-30 (1992); Broxmeyer, H. E. y Williams, D. E.
CRC Grit. Rev. Oncol. Hematol. 8:173-226
(1988)).
El receptor de IL-17 parece
estar estructuralmente no relacionado con ninguna familia de
receptores de citoquinas previamente conocida. A pesar de la
existencia de 12 residuos de cisteína en el dominio extracelular,
sus posiciones relativas no son características de moléculas
receptoras clasificadas como miembros de la superfamilia de las
inmunoglobulinas (Williams, A. y Barclay, A. Annu. Rev.
Immunol. 6:381-405 (1988)), la familia de TNFR
(Smith, C., et al., Science
248:1019-1023 (1990)), la familia de receptores de
hematopoyetina (Cosman, D. Cytokine 5:95-106
(1993)), o ninguno de los receptores de
tirosina-quinasa previamente descritos (Hanks, S.,
et al., Science 241:42-52 (1988)).
Por tanto, existe la necesidad de polipéptidos
que funcionen como moléculas receptoras para las citoquinas y, por
tanto funcionen en la transferencia de una señal extracelular
finalmente al núcleo de la célula, puesto que las perturbaciones de
dicha regulación pueden estar implicadas en trastornos que se
refieren a la activación celular, la hemostasis, la angiogénesis,
la metástasis de tumores, la migración celular y la ovulación, así
como la neurogénesis. Por tanto, existe la necesidad de la
identificación y caracterización de dichos polipéptidos humanos que
pueden desempeñar un papel en la detección, prevención, mejora o
corrección de dichos trastornos.
La presente invención proporciona moléculas
aisladas de ácidos nucleicos que codifican la porción del
polipéptido IL17RLP desde la posición 1 hasta la posición 271 de la
secuencia completa de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2 o que
consiste en la secuencia de nucleótidos desde la posición 67 hasta
la posición 879 de la SEQ ID NQ:1. La secuencia de nucleótidos se
determina secuenciando el clon de IL17RLP depositado como DNA
plasmídico como ATCC número de depósito 209198 el 8 de agosto de
1997. Dicha secuencia de nucleótidos que se muestra en las Figuras
1A, 1B y 1C (SEQ ID NO:1), contiene un marco de lectura abierto que
codifica un polipéptido completo de 426 residuos de aminoácidos,
incluyendo un codón de iniciación que codifica una metionina
N-terminal en las posiciones de nucleótidos
10-12, y un peso molecular predicho de
aproximadamente 47,1 kDa.
El polipéptido codificado tiene una secuencia
delantera predicha de 19 aminoácidos subrayada en las Figuras 1A,
1B y 1C; y la secuencia de aminoácidos de la proteína IL17RLP
madura predicha también se muestra en las Figuras 1A, 1B y 1C como
residuos de aminoácidos 20-426, y como residuos
1-407 en la SEQ ID NO:2.
Por tanto, un aspecto de la invención
proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un
polipéptido que consiste en el dominio extracelular predicho del
polipéptido IL17RLP, es decir, que consiste en la secuencia de
aminoácidos en las posiciones 1 a 271 en la SEQ ID NO:2 y una
secuencia de nucleótidos complementaria a dicha molécula de ácido
nucleico.
La presente invención también se refiere a
vectores recombinantes, que incluyen las moléculas de ácidos
nucleicos de la presente invención, y a células hospedantes que
contienen los vectores recombinantes, así como a métodos de
preparar dichos vectores y células hospedantes y para usarlos en
la producción del polipéptido IL17RLP parcial por técnicas
recombinantes.
De acuerdo con un aspecto adicional de la
presente invención, se proporciona un proceso para producir dicho
polipéptido por técnicas recombinantes que comprenden cultivar
células hospedantes recombinantes procarióticas y/o eucarióticas,
que contienen la secuencia de ácido nucleico de la invención, en
condiciones que promueven la expresión de dicha proteína y la
subsiguiente recuperación de dicha proteína.
La invención proporciona además un polipéptido
IL17RLP parcial aislado codificado por la molécula de ácido
nucleico de la invención u obtenible por el proceso antes
mencionado. Este polipéptido consiste en la secuencia de
aminoácidos del dominio extracelular predicho del polipéptido
IL17RLP que tiene la secuencia de aminoácidos completa mostrada en
la SEQ ID NO:2 (es decir, las posiciones 1 a 271 de la SEQ ID
NO:2).
En otra realización, la invención proporciona un
anticuerpo aislado que se une específicamente al polipéptido
IL17RLP parcial que consiste en la secuencia de aminoácidos desde
Pro en la posición 1 hasta Trp en la posición 271 de la SEQ ID
NO:2. En la presente memoria se describen métodos para aislar
anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido IL17RLP
que tiene una secuencia de aminoácidos como la descrita en la
presente memoria. Dichos anticuerpos son útiles como agentes de
diagnóstico o terapéuticos como se describe más adelante.
La invención también proporciona composiciones
farmacéuticas que comprenden el polipéptido IL17RLP parcial que se
puede emplear, por ejemplo, para tratar trastornos relacionados con
la activación celular, la hemostasis, la angiogénesis, la
metástasis de tumores, la migración celular y la ovulación, así como
la neurogénesis. Dichas composiciones se pueden usar en métodos de
tratar individuos que necesitan polipéptidos IL17RLP.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden
un polinucleótido IL17RLP o el polipéptido IL17RLP parcial de la
invención se pueden usar para la administración a células in
vitro, a células ex vivo y a células in vivo, o a
un organismo multicelular.
La composición puede comprender un
polinucleótido IL17RLP para la expresión del polipéptido IL17RLP
parcial de la invención en un organismo hospedante para el
tratamiento de una enfermedad. A este respecto se prefiere
particularmente la expresión en un paciente humano para el
tratamiento de una disfunción asociada con actividad aberrante
endógena de un polipéptido IL17RLP.
Los compuestos de la presente invención se
pueden usar en un método de escrutinio para identificar compuestos
capaces de potenciar o inhibir una actividad biológica del
polipéptido IL17RLP, que implica poner en contacto un ligando que
es inhibido por el polipéptido IL17RLP con el compuesto candidato en
presencia de un polipéptido IL17RLP, analizar la actividad de unión
al receptor del ligando en presencia del compuesto candidato y del
polipéptido IL17RLP, y comparar la actividad del ligando con un
nivel estándar de actividad, siendo el nivel estándar analizado
cuando el contacto se realiza entre el ligando propiamente dicho en
presencia del polipéptido IL17RLP y ausencia del compuesto
candidato. En este análisis, un aumento en la actividad del ligando
sobre el nivel estándar indica que el compuesto candidato es un
agonista de la actividad de IL17RLP y una disminución en la
actividad del ligando comparada con la del nivel estándar indica que
el compuesto es un antagonista de la de actividad de IL17RLP.
En otro aspecto, un ensayo de escrutinio para
agonistas y antagonistas puede implicar determinar el efecto que un
compuesto candidato tiene sobre la unión de IL17RLP a un ligando. En
particular, el método implicar poner en contacto el ligando con el
polipéptido IL17RLP parcial de la invención y un compuesto candidato
y determinar si la unión del polipéptido IL17RLP al ligando se
aumenta o disminuye debido a la presencia del compuesto candidato.
En este ensayo, un aumento en la unión de IL17RLP sobre la unión
estándar indica que el compuesto candidato es un agonista de la
actividad de unión del IL17RLP y una disminución de la unión de
IL17RLP comparada con la estándar indica que el compuesto es un
antagonista de la actividad de unión del IL17RLP.
Se ha descubierto que IL17RLP se expresa no sólo
en tejido pulmonar adulto, sino también en tejido de la enfermedad
de Crohn, pirámide del riñón, córtex, y tejidos de la médula,
hipocampo, córtex frontal del cerebro de un paciente con epilepsia,
tumor de la glándula suprarrenal, depresión del cuerpo estriado,
osteclastoma, tumor endometrial e hipotálamo de un paciente con
esquizofrenia. Por tanto, los ácidos nucleicos de la invención son
útiles como sondas de hibridación para la identificación diferencial
del (de los) tejido(s) o tipo(s) de células presentes
en una muestra biológica. Similarmente, los polipéptidos y
anticuerpos dirigidos contra estos polipéptidos son útiles para
proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial
del (de los) tejidos(s) o tipo(s) de células. Además,
para cierto número de trastornos de los tejidos o células
anteriores, particularmente del sistema inmune, pueden detectarse en
ciertos tejidos niveles significativamente superiores o inferiores
de expresión del gen IL17RLP (por ejemplo, tejidos cancerosos y
heridos) o fluidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina,
fluido sinovial o fluido espinal) tomado de un individuo que tiene
dicho trastorno, con relación a un nivel "estándar" de
expresión del gen IL17RLP, es decir, el nivel de expresión de
IL17RLP en tejido sano de un individuo que no tiene el trastorno del
sistema inmune. Por tanto, un método de diagnóstico útil durante la
diagnosis de dicho trastorno, puede implicar: (a) analizar el nivel
de expresión del gen IL17RLP en células o fluido corporal de un
individuo; (b) comparar el nivel de expresión del gen IL17RLP con
un nivel de expresión estándar del gen IL17RLP, con lo cual un
aumento o disminución en el nivel de expresión del gen IL17RLP
comparado con el nivel de expresión estándar es indicativo de
trastorno en el sistema inmune.
Las Figuras 1A, 1B y 1C muestran las secuencia
de nucleótidos (SEQ ID NO:1) y la secuencia deducida de aminoácidos
(SEQ ID NO:2) de IL17RLP.
La secuencia delantera predicha de
aproximadamente 19 aminoácidos está subrayada. Adviértase que el
residuo de metionina al comienzo de la secuencia delantera en las
Figuras 1A, 1B y 1C se muestra en el número de posición (positivo)
1, mientras que las posiciones delanteras en la secuencia
correspondiente de la SEQ ID NO:2 se designan con números de
posición negativos. Por tanto, la posiciones de la secuencia
delantera 1 a 19 en las Figuras 1A, 1B y 1C corresponden a la
posiciones -19 a -1 en la SEQ ID NO:2.
En la secuencia de aminoácidos de IL17RLP están
marcados seis sitios de glicosilación potenciales unidos a
asparagina. Los sitios están marcados en la secuencia de aminoácidos
de las Figuras 1A, 1B y 1C con el símbolo # (Nota del Traductor.-
En las figuras dicho símbolo # puede confundirse con *) en letra
negrita encima de la secuencia de nucleótidos en frente de la
abreviatura de una letra en negrita para la asparagina (N) en la
secuencia de aminoácidos de las Figuras 1A,1B y 1C; esto es, los
residuos de asparagina reales que están potencialmente glicosilados
resaltados en letras negritas en las Figuras 1A, 1B y 1C. Las
secuencias de glicosilación unidas a N potenciales se encuentran en
las siguientes localizaciones en la secuencia de aminoácidos de
IL17RLP: N-67 hasta W-70
(N-67, V-68, S-69.
W-70); N-103 hasta
E-106 (N-103, Y-104,
T-105, E-106; N-156
hasta S-159 (N-156,
F-157, T-158,
S-159); N-183 hasta
A-186 (N-183, 1-184,
T-185, A-186); N-197
hasta T-200 (N-197,
F-198, T-199,
T-200); y N-283 hasta
K-286 (N-283, K-284,
S-285, K-286). También están
marcados en las Figuras 1A, 1B y 1C con símbolo en negrita de
lisina (K) dos sitios potenciales de fosforilación por
proteína-quinasa dependiente de cAMP y cGMP en la
secuencia de aminoácidos de IL17RLP y un asterisco * encima del
primer nucleótido que codifica ese residuo de lisina en la
secuencia de nucleótidos de IL17RLP. Las potenciales secuencias de
fosforilación por proteína-quinasa dependiente de
cAMP y cGMP se encuentran en la secuencia de aminoácidos de IL17RLP
en las siguientes localizaciones: K-141 hasta
treonina-231 (K-228,
K-229, Q-230, T-231)
y K-319 hasta S-322
(K-319, K-320,
T-321, S-322). También están
marcados con un símbolo (S o T) de tirosina o serina en negrita en
las Figuras 1A, 1B, y 1C tres sitios potencias de fosforilación
proteína-quinasa C (PKC) en la secuencia de
aminoácidos de IL17RLP y un asterisco (*) encima del primer
nucleótido que codifica ese residuo de serina o tirosina en la
secuencia de nucleótidos de IL17RLP. Las secuencias de fosforilación
potenciales por PKC se encuentran en la secuencia de aminoácidos de
IL17RLP en las siguientes localizaciones: S-77 hasta
R-79 (S-77. 1-78,
R-79); T-89 hasta
K-91 (T-89, G-90,
K-91); y T-384 hasta
K-386 (T-384, Q-385,
K-386). En las Figuras 1A, 1B, y 1C también están
marcados tres sitios potenciales de fosforilación por
caseína-quinasa II (CK2) con un símbolo de serina
en negrita (S) en la secuencia de aminoácidos de IL17RLP y con un
asterisco (*) encima del primer nucleótido que codifica el residuo
de serina apropiado en la secuencia de nucleótidos IL17RLP. Las
secuencias potenciales de fosforilación por CK2 se encuentran en las
siguientes localizaciones locaciones en la secuencia de aminoácidos
de IL17RLP: S-178 hasta D-181
(S-178, L-179.
W-180, D-181); S-402
hasta D-405 (S-402,
V-403, C-404,
D-405); y S-414 hasta
E-417 (S-414, P-415,
S-416, E-417). En la secuencia de
aminoácidos de IL17RLP mostrada en las Figuras 1A, 1B, y 1C A se
encuentra un solo sitio de miristolación potencial. En las Figuras
1A, 1B y 1C el sitio de miristolación potencial esta marcado con un
doble subrayado que afecta a los residuos de aminoácidos que
representa el sitio de miristolación potencia en la secuencia de
aminoácidos de IL17RLP. El sitio potencial de miristolación está
situado en la siguiente posición en la secuencia de aminoácidos de
IL17RLP: G-116 hasta F-121
(G-116. G-117,
K-118, W-119, T-120,
F-121).
Las mutaciones en uno o más de los residuos de
aminoácidos en las características estructurales potenciales antes
citadas del polipéptido IL17RLP se contemplan como mutaciones que
pueden afectar a características biológicas, estructurales, de
unión o de otro tipo de un DNA o polipéptido de IL17RLP.
La Figura 2 muestra las regiones de identidad
entre la secuencia de aminoácidos de la proteína IL17RLP y el
producto de la traducción de mRNA murino para el receptor de
IL-17 receptor (SEQ ID NO:3) determinadas por el
programa informático Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis
Package. versión 8 para Unix, Genetics Computer Group,
University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) que
usa los parámetros por defecto.
La Figura 3 muestra un análisis de la secuencia
de aminoácidos de IL17RLP. Se muestran las regiones alfa, beta, de
giro y de arrollamiento; hidrofilicidad e hidrofobicidad; regiones
anfipáticas; regiones flexibles, índice antigénico y de
probabilidad superficial. En el "Índice antigénico o gráfico de
Jameson-Wolf", los picos positivos indican
localizaciones de regiones altamente antigénicas de la proteína
IL17RLP, es decir, regiones de las que pueden obtenerse péptidos
portadores de epítopos.
En el "Índice antigénico o gráfico de
Jameson-Wolf", los picos positivos indican
localizaciones de regiones altamente antigénicas de la proteína
IL17RLP, es decir, regiones de las que pueden obtenerse péptidos
portadores de epítopos. Ejemplos no limitativos de polipéptidos o
péptidos antigénicos que pueden usarse para generar anticuerpos
específicos de IL17RLP incluyen: un polipéptido que comprende
residuos de aminoácidos de aproximadamente Ser-6 a
aproximadamente Val-3 en la SEQ ID NO:2, un
polipéptido que comprende residuos de aminoácidos desde
aproximadamente Cys-5 hasta aproximadamente
Pro-13 en la SEQ ID NO: 2, un polipéptido que
comprenden residuos de aminoácidos desde aproximadamente
Ile-22 hasta aproximadamente Arg-30
en la SEQ ID NO:2, un polipéptido que comprende residuos de
aminoácidos desde aproximadamente Thr-70 hasta
aproximadamente Tyr-78 en SEQ ID. NO:2, un
polipéptido que comprende residuos de aminoácidos desde
aproximadamente Thr-91 hasta aproximadamente
Lys-99 en la SEQ ID NO:2, un polipéptido que
comprenden residuos de aminoácidos desde aproximadamente
Ala-125 hasta aproximadamente
Ser-133 en la SEQ ID NO:2, un polipéptido que
comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente
Thr-221 hasta aproximadamente
Val-229_{..} En SEQ_{,} ID. NO:2, un polipéptido
_{.}que comprende residuos de aminoácidos desde f aproximadamente
-Gly-239 hasta aproximadamente
Thr-248 en la SEQ ID NO:2, un polipéptido que
comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente
Leu-261 hasta aproximadamente
Gly-269 en la SEQ ID NO:2, un polipéptido que
comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente
Cys-385 hasta aproximadamente
Glu-393 en la SEQ ID NO:2, un polipéptido que
comprenden residuos de aminoácidos desde aproximadamente
Pro-396 hasta aproximadamente
Ser-404 en la SEQ ID NO:2, un polipéptido que
comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente
Gly-390 hasta aproximadamente
Glu-398 en la SEQ ID NO:2 y un polipéptido que
comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente
Cys-404 hasta aproximadamente
Leu-426 en las Figura 1A, 1B y 1C (que es idéntica
a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:2 con excepción de los
esquemas de numeración como se ha indicado antes).
Los datos presentados en la Figura 3 también
están representados en forma tabular en la Tabla I. Los datos
presentados en la Tabla I son idénticos a los originalmente
presentados en la Figura 3. Las columnas están marcadas con los
encabezamientos "Res", "Posición", y los números romanos
I-XIV. Los encabezamientos de las columnas se
refieren a las siguientes características de la secuencia de
aminoácidos presentada en la Figura 3 y la Tabla I: "Res":
residuo de aminoácido de la SEQ ID NO:2 o Figuras 1A, 1B y 1C (que
es la secuencia idéntica mostrada en la SEQ ID NO:2, con la
excepción de que los residuos están numerados 1-426
en las Figuras 1A, 1B, y 1C y -19 hasta 407 en la SEQ ID NO:2);
"Posición": posición del residuo correspondiente dentro de la
SEQ ID NO:2 o las Figuras 1A, 1B, y 1C (que es la secuencia
idéntica mostrada en la SEQ ID NO:2, con la excepción de que los
residuos están numerados 1-426 en las Figuras 1A,
1B, y 1C y -19 hasta 406 en la SEQ ID NO:2); 1: Regiones alfa -
Garnier-Robson; II: Regiones alfa -
Chou-Fasman; III: Regiones beta; Regiones -
Garnier-Robson; IV: Regiones beta -
Chou-Fasman; V: Regiones de giro -
Garnier-Robson; VI: Regiones de giro -
Chou-Fasman; VII: Regiones de arrollamiento
Garnier-Robson; VIII: Representación de
hidrofilicidad - Kyte-Doolittle; IX: Representación
de hidrofilicidad - Hopp-Woods; X: Regiones alfa,
anfipáticas - Eisenberg; XI: Regiones beta, anfipáticas -
Eisenberg; XII: Regiones flexibles - Karplus-Schulz;
XIII: Índice antigénico - Jameson-Wolf; y XIV:
Gráfico de probabilidad superficial - Emini.
La presente invención proporciona moléculas
aisladas de ácido nucleico que codifican el polipéptido IL17RLP
parcial que consiste en los residuos 1 a 271 de la secuencia de
aminoácidos mostrada en la Figura SEQ ID NO:2, que se determinó
secuenciando un cDNA clonado. La secuencia de nucleótidos mostrada
en las Figuras 1A, 1B y 1C (SEQ ID NO:1) se obtuvo secuenciando el
clon HAPOR40, que se depositó el 8 de agosto de, 1997 en The
American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard,
Manassas, Virginia 20110-2209, y al que se dio el
número de acceso ATCC 209198. El clon depositado está contenido en
el plásmido pBluescript SK(-) (Stratagene, La Jolla, CA).
La proteína IL17RLP descrita en la presente
memoria comparte homología de secuencia con el producto de la
traducción del mRNA murino para el receptor de IL-17
(Figura 2; SEQ ID NO:3). Se cree que el receptor de
IL-17 murina es un componente importante de la vía
de transducción de señales de la citoquina IL-17. El
receptor de IL-17 no parece estar estructuralmente
relacionado con ningún miembro de las familias de receptores de
citoquinas previamente descritos. El complejo
IL-17/receptor de IL-17 activa la
actividad de NF-_{\kappa}B.
NF-_{\kappa}B es un factor de transcripción que
se sabe regula un gran número de productos génicos implicados en el
control del crecimiento. Los productos génicos inducidos por
NF-_{\kappa}B incluyen moléculas implicadas en
respuestas inmunes, inflamatorias o de fase aguda, tales como
cadenas ligeras de inmunoglobulinas, complejo principal de
histocompatibilidad (MHC), la cadena \alpha de
IL-2R, y citoquinas tales como
IL-1\beta, IL-6 y TNF\alpha.
NF-_{\kappa}B estimula directamente el aumentador
del HIV en células T y el mismo puede ser activado por proteínas
virales diferentes con potencial oncógeno, tales como la proteína
HBX del virus de la hepatitis B, LMPI de EBV, y la proteína Tax de
HTLV-1. La inducción de
NF-_{\kappa}B por Tax da como resultado la
sobre-regulación de IL-2 y
IL-2R y el crecimiento subsiguiente incontrolado de
células T. La IL-17 y HVS13, un producto génico de
HVS y la correspondiente murina de IL-17, inducen
fuertemente la expresión de IL-6. La
IL-6 es un potente factor de crecimiento factor
para mielomas, plasmacitomas e hibridomas y está implicada en el
crecimiento de células T del linfoma de Lennert.
A menos que se indique lo contrario, todas las
secuencias de nucleótidos determinadas secuenciando una molécula de
DNA en la presente memoria se determinaron usando un secuenciador
automático de DNA (tal como el modelo 373 de Applied Biosystems,
Inc., Foster City, CA), y todas las secuencias de aminoácidos de
polipéptidos codificados por moléculas de DNA determinadas en la
presente memoria fueron predichas por la traducción de una secuencia
de DNA determinada como antes. Por tanto, como es sabido en la
técnica para cualquier secuencia de DNA determinada por este método
automático, cualquier secuencia de nucleótidos determinada en la
presente memoria puede contener algunos errores. Las secuencias de
nucleótidos determinadas de modo automático son típicamente al menos
aproximadamente 90% idénticas, más típicamente al menos
aproximadamente 95% a al menos aproximadamente 99,9% idénticas a la
secuencia real de nucleótidos de la secuencia de la molécula de DNA.
La secuencia real se puede determinar con más precisión por otros
métodos incluyendo métodos manuales de secuenciación de DNA bien
conocidos en la técnica. Como también es conocido en la técnica,
una sola inserción o deleción en una secuencia de nucleótidos
determinada comparada con la secuencia real causará un
desplazamiento de marco en la traducción de la secuencia de
nucleótidos, de tal modo que la secuencia predicha de aminoácidos
codificada por una determinada secuencia de nucleótidos será
completamente diferente de la secuencia de aminoácidos realmente
codificada por la secuencia de la molécula de DNA secuenciada, que
comienza en el punto de dicha inserción o deleción.
Por "secuencia de nucleótidos" de una
molécula de ácido nucleico o polinucleótido se quiere significar,
para una molécula o polinucleótido de DNA, una secuencia de
desoxirribonucleótidos, y para una molécula o polinucleótido de
RNA, la secuencia correspondiente de ribonucleótidos (A, G, C y U),
donde cada desoxirribonucleótido de timidina (T) en secuencia de
desoxirribonucleótidos está reemplazada por el ribonucleótido
uridina (U).
Usando la información proporcionada en la
presente memoria, tal como la secuencia de nucleótidos de las
Figuras 1A, 1B y 1C (SEQ ID NO:1), puede obtenerse una molécula de
ácido nucleico de la presente invención que codifica el polipéptido
IL17RLP parcial de la invención usando métodos estándares de
clonación y escrutinio, tales como los usados para clonar los cDNA
que usan mRNA como material de partida. La molécula de ácido
nucleico descrita en las Figuras 1A, 1B y 1C (SEQ ID NO:1) se
descubrió en una genoteca de cDNA derivada de tejido pulmonar
adulto humano.
También se identificaron clones adicionales del
mismo gen en genotecas de cDNA de los siguientes tejidos: tejido de
la enfermedad de Crohn, pirámide de riñón, córtex, y tejidos de
médula, hipocampo, córtex frontal del cerebro de un paciente con
epilepsia, tumor de la glándula suprarrenal, depresión del cuerpo
estriado, osteclastoma, tumor endometrial e hipotálamo de un
paciente con esquizofrenia.
La secuencia de nucleótidos determinada del cDNA
de IL17RLP de las Figuras 1A,1B y 1C (SEQ ID NO: 1) contienen un
marco de lectura abierto que codifica una proteína de 426 residuos
de aminoácidos, con un codón de iniciación en las posiciones
10-12 de los nucleótidos de la secuencia de
nucleótidos de las Figuras 1A, 1B, y 1C (SEQ ID NO:1), y un peso
molecular deducido de aproximadamente 47,1 kDa. La secuencia de
aminoácidos de la proteína IL17RLP mostrada en la SEQ ID NO:2 es
aproximadamente 28,6% idéntica al mRNA murino para el receptor de
IL-17 (Figura 2; Yao, Z., et al.,
Immunity 3:811-821 (1995); Número de acceso
en GenBank No. U31993).
El marco de lectura abierto del gen de IL17RLP
comparte homología de secuencia con el producto de la traducción
del mRNA murino para el receptor de 1L-17 (Figura 2;
SEQ ID NO:3). Se cree que el receptor de IL-17
murina es importante en la regulación de las cascadas de la
transducción de señales en las células inmunes y la regulación
resultante del crecimiento celular, la diferenciación y el estado de
activación. La homología entre el receptor de IL-17
murina y la IL17RLP indica que IL17RLP también puede estar implicada
en la regulación de las cascadas de la transducción de señales en
las células inmunes y la regulación resultante del crecimiento
celular, la diferenciación y el estado de activación.
Como apreciaría un experto ordinario en la
técnica, debido a las posibilidades de los errores de secuenciación
antes indicadas, el polipéptido IL17RLP completo real codificado por
el cDNA depositado, que comprende aproximadamente 426 aminoácidos,
puede ser algo más largo o más corto. Más generalmente, el marco de
lectura abierto real puede tener en alguna parte el intervalo de
\pm20 aminoácidos, más probablemente el intervalo de \pm10
aminoácidos, del que se predijo a partir del primer codón de
metionina del extremo N mostrado en la Figuras 1A, 1B y 1C (SEQ ID
NO:1). Además se apreciará que, dependiendo de los criterios
analíticos usados para identificar diversos dominios funcionales,
la "dirección" exacta de los dominios extracelular,
intracelular y transmembranal del polipéptido IL17RLP puede diferir
ligeramente de las posiciones predichas anteriormente. Por ejemplo,
la localización exacta del dominio extracelular de IL17RLP en la SEQ
ID NO:2 puede variar ligeramente (por ejemplo, la dirección puede
"estar desplazada" en aproximadamente 1 a aproximadamente 5
residuos) dependiendo de los criterios usados para definir el
dominio. En este caso, los extremos del dominio transmembranal y el
comienzo del dominio extracelular fueron predichos sobre la base de
la identificación de la secuencia hidrófoba de aminoácidos en las
posiciones antes indicadas, como se muestra en la Figura 3. En
cualquier caso, como se analiza como más detalle más adelante, la
descripción proporciona polipéptidos que tienen diversos residuos
delecionados desde el extremo N del polipéptido completo, incluyendo
polipéptidos que carecen de uno o más aminoácidos desde el termino
N del dominio extracelular descrito en la presente memoria, que
constituyen te formas solubles del dominio extracelular de la
proteína IL17RLP.
Se apreciará además que dependiendo de los
criterios usados para identificar la localización exacta del sitio
de escisión de la forma precursora de la molécula de IL17RLP madura
mostrada en la SEQ ID NO:2 puede variar ligeramente, dependiendo de
los criterios usados para definir el sitio de escisión. En este
caso, los extremos del péptido señal y el comienzo de la molécula
madura de IL17RLP fueron predichos usando el algoritmo informático
HGSI SignalP. Un experto en la técnica comprenderá que otro
algoritmo informático ampliamente aceptado y usado para predecir
potenciales sitios de escisión de polipéptidos, PSORT, predecirá la
escisión de un péptido señal N-terminal a partir
del polipéptido IL17RLP en un punto ligeramente diferente del
predicho por el algoritmo HGSI SignalP. En cualquier caso,
se describen adicionalmente más adelante en la presente memoria
polipéptidos que tienen diversos residuos delecionados desde el
extremo N del polipéptido completo, incluyendo los polipéptidos
correspondientes a los polipéptidos IL17RLP maduros predichos
descritos en la presente memoria.
La secuencia de aminoácidos de la proteína
IL17RLP completa incluye una secuencia delantera y una proteína
madura, como se muestra en la SEQ ID NO:2. Por tanto, de acuerdo con
la hipótesis de la señal, una vez que se ha iniciado la exportación
de la cadena de proteína en crecimiento a través del retículo
endoplásmico en bruto, las proteínas secretadas por células de
mamíferos tienen una secuencia delantera señal o secretora que se
escinde del polipéptido completo para producir una forma
"madura" secretada de la proteína. La mayoría de las células
de mamíferos e incluso las células de insectos escinden las
proteínas secretadas con la misma especificidad. Sin embargo, en
algunos casos, la escisión de una proteína secretada no es
enteramente uniforme, lo que da como resultado dos o más especies
maduras de la proteína. Además, hace tiempo que se conoce que la
especificidad de escisión de una proteína secretada está finalmente
determinada por la estructura primaria de la proteína completa, es
decir, es inherente a la secuencia de aminoácidos del polipéptido.
Por tanto, la presente descripción proporciona una secuencia de
nucleótidos que codifica el polipéptido IL17RLP maduro que tiene la
secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA identificado
como ATCC Nº de depósito 209198. Por el "polipéptido IL17RLP
maduro que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por clon de
cDNA en el ATCC Nº de depósito 209198" se quiere significar
la(s) forma(s) madura(s) de la proteína IL17RLP
producida por expresión en una célula de mamíferos (por ejemplo,
células COS, como se describe más adelante) del marco de lectura
abierto completo codificado por la secuencia de DNA humano del clon
contenido en el clon depositado HAPOR40.
Además están disponibles métodos para predecir
si una proteína tiene una secuencia delantera secretora, así como
el punto de escisión para dicha secuencia delantera. Por ejemplo, el
método de McGeoch (Virus Res. 3:271-286
(1985)) usa la información de una corta región cargada
N-terminal y una subsiguiente región no cargada de
la proteína completa (no escindida). El método de von Heinje
(Nucleic Acids Res. 14:4683-4690 (1986)) usa
la información de los residuos que rodean el sitio de escisión,
típicamente residuos -13 a +2 en donde +1 indica el extremo amino
de una proteína madura. La precisión de predecir el(los)
punto(s) de escisión de proteínas secretoras de mamíferos
conocidas por cada uno de estos métodos está en el intervalo de
75-80% (von Heinje, supra). Sin embargo, los
dos métodos no siempre producen el(los) mismo(s)
punto(s) de escisión(es) predicho(s) para una
proteína dada.
En el presente caso se analizó la secuencia
deducida de aminoácidos del polipéptido IL17RLP completo por una
variante del programa informático "PSORT", disponible del Dr.
Kenta Nakai del Institute for Chemical Research, Kyoto University
(Nakai, K. y Kanehisa, M. Genomics 14:897-911
(1992)), que es un sistema experto para predecir la localización
celular de una proteína basada en la secuencia de aminoácidos. Como
parte de esta predicción computacional de localización se
incorporan los métodos de McGeoch y von Heinje. Así, el análisis
computacional anterior predijo un solo sitio de escisión dentro de
la secuencia completa de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2
(véase análisis anterior).
Como apreciaría un experto ordinario en la
técnica de las consideraciones anteriores, debido a las
posibilidades de errores de secuenciación, así como a la
variabilidad de los sitios de escisión en diferentes proteínas
conocidas se espera que el polipéptido IL17RLP maduro codificado por
el cDNA depositado consista en aproximadamente 407 aminoácidos
(presumiblemente los residuos 1 a 407 de la SEQ ID NO: 2, pero puede
consistir en cualquier número de aminoácidos en el intervalo de
aproximadamente 407-412 aminoácidos; y se espera
que la(s) secuencia(s) delante-
ra(s) real(es) de esta proteína tengan 14-19 aminoácidos (presumiblemente residuos -19 hasta -1 de la SEQ ID NO:2), pero pueden constar de cualquier número de aminoácidos en el intervalo de 14-19 aminoácidos.
ra(s) real(es) de esta proteína tengan 14-19 aminoácidos (presumiblemente residuos -19 hasta -1 de la SEQ ID NO:2), pero pueden constar de cualquier número de aminoácidos en el intervalo de 14-19 aminoácidos.
Como se ha indicado, las moléculas de ácido
nucleicos de la presente invención pueden estar en la forma de RNA,
tal como mRNA, o en la forma de DNA, incluyendo por ejemplo, cDNA y
DNA genómico obtenidos por clonación o producidos sintéticamente.
El DNA puede ser bicatenario o monocatenario. El DNA o RNA
monocatenario puede ser la cadena codificadora, también conocida
como la cadena con sentido, o puede ser la cadena no codificadora,
también denominada la cadena anti-sentido.
Por molécula(s) de ácido(s)
nucleico(s) "aislada(s)" se quiere significar una
molécula de ácido nucleico, DNA o RNA, que ha sido separada de su
medio ambiente natural, por ejemplo, las moléculas de DNA
recombinante contenidas en un vector se consideran aisladas para
los fines de la de la presente invención. Otros ejemplos de
moléculas de DNA aisladas incluyen moléculas de DNA recombinante
mantenidas en células hospedantes heterólogas o moléculas DNA en
solución purificadas (parcial o sustancialmente). Las moléculas de
RNA aisladas incluyen transcritos de RNA in vivo o in
vitro de las moléculas de DNA de la presente invención. Las
moléculas de ácidos nucleicos aisladas de acuerdo con la presente
invención incluyen además dichas moléculas producidas
sintéticamente.
Además, las moléculas de ácidos nucleicos
aisladas descritas en la presente memoria incluyen moléculas de DNA
que comprenden una secuencia substancialmente diferente de las antes
descritas, pero que, debido a la degeneración del código genético,
todavía codifican la proteína IL17RLP. Naturalmente, el código
genético y las preferencias de codones específicas de especies son
bien conocidos en la técnica. Por tanto, sería rutinario para un
experto en la técnica generar las variantes degeneradas antes
descritas, por ejemplo, para optimizar la expresión de codones para
un hospedante particular (por ejemplo, cambiar los codones en el
mRNA humano por los preferidos por un hospedante bacteriano, tal
como E. coli).
Las moléculas de ácidos nucleicos que tienen un
secuencia complementaria a la molécula de ácido nucleico que
codifica la proteína IL17RLP parcial de la invención,
particularmente las moléculas de DNA, son útiles como sondas para
cartografiar genes, por hibridación in situ con cromosomas, y
para detectar la expresión del gen IL17RLP en tejido humano, por
ejemplo, por análisis de transferencia Northern.
Además, la descripción proporciona moléculas de
ácido nucleicos que tienen secuencias de nucleótidos relacionadas
con porciones extensas de la SEQ ID NO:1 que han sido determinadas a
partir de los siguientes clones de DNA relacionados: HHPCH63R (SEQ
ID NO:4) y HETCC45RA (SEQ ID NO:5). Dichos polinucleótidos
preferiblemente pueden ser excluidos de la invención.
Más generalmente, por un fragmento de una
molécula de ácido nucleico aislada que tiene la secuencia de
nucleótidos del cDNA depositado o la secuencia de nucleótidos
mostrada en las Figuras 1A,1B y 1C (SEQ ID NO:1) se quiere
significar fragmentos de al menos aproximadamente 15 nucleótidos, y
más preferiblemente al menos aproximadamente 20 nucleótidos, aún
más preferiblemente al menos aproximadamente 30 nucleótidos, e
incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 40
nucleótidos de longitud, los cuales son útiles como sondas para
diagnóstico y cebadores como se describe en la presente memoria.
Naturalmente, los fragmento mayores de 50-300
nucleótidos de longitud también son útiles de acuerdo con la
presente invención, como lo son los fragmentos correspondientes a
la mayoría, sino a la totalidad, de la secuencia de nucleótidos del
cDNA depositado como se muestra en la Figuras 1A, 1B y 1C (SEQ ID
NO:1). Por un fragmento de al menos 20 nucleótidos de longitud, por
ejemplo, se quiere significar fragmentos que incluyen 20 o más
bases contiguas de la secuencia de nucleótidos del cDNA depositado
o la secuencia de nucleótidos que se muestra en las Figuras 1A, 1B y
1C (SEQ ID NO:1). Dichos fragmentos de ácido nucleico incluyen
moléculas de ácidos nucleicos que codifican porciones portadoras de
epítopos del polipéptido IL17RLP que se identifica en la Figura 3 y
se describe con más detalle más adelante.
Los fragmentos de los polinucleótidos descritos
en la presente memoria codifican polipéptido que demuestra una
actividad funcional. Por un polipéptido que demuestra "actividad
funcional" se quiere decir un polipéptido capaz de presentar una
o más actividades funcionales conocidas asociadas con una forma
completa, madura o activa del polipéptido IL17RLP. Dichas
actividades funcionales incluyen, pero sin limitación:, actividad
biológica (por ejemplo, activación de vías de transducción de
señales que dan como resultado la estimulación de la familia de
factores de transcripción NF-xB, la secreción de
IL-6, y la co-estimulación de la
proliferación de células T; la inducción de IL-6,
IL-8, G-CSF, prostaglandina E
(PGE_{2}), y expresión de la molécula de adhesión intracelular
(ICAM)-1; la regulación y expansión de células
madres hematopoyéticas y progenitoras; la actividad mielosupresora
para subconjuntos de células madres e inmaduras de progenitores
mieloides; la activación y estimulación de la hematopoyesis en
general (más específicamente, la hematopoyesis de neutrófilos); el
aumento de la eritropoyesis; la supresión de la linfopoyesis y la
mielopoyesis; y la fuerte supresión de la monocitopoyesis)), la
antigenicidad [capacidad para unirse (o competir con un polipéptido
IL17RLP para la unión) a un anticuerpo
anti-1L17RLP], inmunogenicidad (capacidad para
generar anticuerpos que se unen a un polipéptido IL17RLP), la
capacidad para formar polímeros con otros IL17RLP o polipéptidos
similares a IL17RLP, y la capacidad para unirse a un receptor o
ligando para un polipéptido
IL17RLP.
IL17RLP.
Los fragmentos de ácido nucleico descritos en la
presente memoria pueden codificar uno o más de los siguientes
dominios de IL17RLP: Dominio I (es decir, Val-49
hasta Leu-62 de SEQ ID NO:2 (Val-68
hasta Leu-81 de Figuras 1A, 1B y 1C)); Dominio II
(Cys-154 hasta Thr-166 de SEQ ID
NO:2 (es decir, Cys-173 hasta
Thr-185 de Figuras 1A, 1B y 1C)); Dominio III
(Gln-202 hasta Gln-208 de SEQ ID
NO:2 (es decir, Gln-221 hasta
Gln-227 de Figuras 1A, 1B y 1C)); Dominio IV
(Asp-241 hasta Val-249 de SEQ ID
NO:2 (es decir, Asp-260 hasta
Val-268 de Figuras 1A,1B y 1C)); Dominio V
(Thr-255 hasta Leu-261 de SEQ ID
NO:2 (es decir, Thr-274 hasta
Leu-280 de Figuras 1A, 1B y 1C)); Dominio VI
(Leu-310 hasta Tyr-319 de SEQ ID
NO:2 (es decir, Leu-329 hasta
Tyr-338 de Figuras 1A, 1B y 1C)); Dominio VII
(Cys-340 hasta Leu-346 de SEQ ID
NO:2 (es decir, Cys-359 hasta
Leu-365 de Figuras 1A, 1B y 1C)); y Dominio VIII
(Ile-354 hasta Gly-358 de SEQ ID
NO:2 (es decir, Ile-373 hasta
Gly-377 de Figuras 1A,1B y 1C)).
Los fragmentos de polinucleótido como los
descritos en la presente memoria codifican regiones antigénicas.
Ejemplos no limitativos de polipéptidos o péptidos antigénicos que
pueden usarse para generar anticuerpos específicos de IL17RLP
incluyen: un polipéptido que comprenden residuos de aminoácidos
desde aproximadamente Ser-14 hasta aproximadamente
Val-22, desde aproximadamente
Cys-24 hasta aproximadamente Pro-32,
desde aproximadamente lle-41 hasta aproximadamente
Arg-49, desde aproximadamente
Thr-89 hasta aproximadamente ..., desde
aproximadamente Thr-110 hasta aproximadamente
Lys-118, desde aproximadamente
Ala-144 hasta aproximadamente
Ser-152, desde aproximadamente
Thr-240 hasta aproximadamente
Val-248, desde aproximadamente
Gly-258 hasta aproximadamente
Thr-267, desde aproximadamente
Leu-280 hasta aproximadamente
Gly-288, desde aproximadamente
Cys-404 hasta aproximadamente
Glu-412, desde aproximadamente
Pro-415 hasta aproximadamente
Ser-423, desde aproximadamente
Gly-409 hasta aproximadamente
Glu-417, y desde aproximadamente
Cys-404 hasta aproximadamente
Leu-426 en las Figuras 1A, 1B y 1C (que es la
secuencia idéntica a la mostrada en la SEQ ID NO:2, con la
excepción de los esquemas de numeración antes descritos).
Los polinucleótidos como los descritos en la
presente memoria pueden codificar atributos funcionales de
IL17RLP, incluyendo fragmentos que comprenden hélices alfa y
regiones formadoras de hélices alfa ("regiones alfa"), láminas
beta y regiones formadoras de láminas beta ("regiones beta"),
de giro y regiones formadoras de giro ("regiones de giro"),
arrollamiento y regiones formadoras de arrollamiento ("regiones de
arrollamiento"), regiones hidrofílicas, regiones hidrofóbicas,
regiones alfa anfipáticas, regiones beta anfipáticas, regiones
flexibles, regiones formadoras de superficies y regiones de elevado
índice antigénico de IL17RLP.
Los datos que representan los atributos
estructurales o funcionales de IL17RLP expuestos en la Figura 3 y/o
la Tabla I, como los descritos antes, se generaron usando diversos
módulos y algoritmos del DNA*STAR ajustados los parámetros por
defecto. En una realización preferida, los datos presentados en las
columnas VIII, IX, XIII, y XIV de la Tabla I pueden ser usados para
determinar regiones de IL17RLP que exhiben un alto grado de
potencial de antigenicidad. Las regiones de alta antigenicidad se
determinan a partir de los datos presentados en las columnas VIII,
IX, XIII, y/o IV eligiendo valores que representen regiones del
polipéptido que probablemente han de estar expuestas en la
superficie del polipéptido en un ambiente en el que puede ocurrir el
reconocimiento de antígenos en el proceso de iniciación de una
respuesta inmune.
Ciertas regiones preferidas a este respecto se
exponen en la Figura 3, pero pueden como, como se muestra en la
Tabla I, se representadas o identificadas usando representaciones
tabulares de los datos presentados en la Figura 3. El algoritmo
informático DNA*STAR usado para generar la Figura 3 (ajustado en los
parámetros originales por defecto) se usó para presentar los datos
en la Figura 3 en un formato tabular (véase la Tabla I). El formato
tabular de los datos en la Figura 3 se puede usar para determinar
fácilmente los límites específicos de una región preferida.
Las regiones preferidas antes mencionadas en la
Figura 3 y en la Tabla 1 incluyen, pero sin limitación, regiones de
los tipos antes mencionados identificadas por análisis de la
secuencia de aminoácidos expuesta en la Figuras 1A, 1B y 1C. Como
se expone en la Figura 3 y en la Tabla 1, dichas regiones preferidas
incluyen regiones alfa de Garnier-Robson, regiones
beta, regiones de giro, y regiones de arrollamiento, regiones alfa
de Chou-Fasman, regiones beta, y regiones de
arrollamiento, regiones hidrofílicas y regiones hidrofóbicas de
Kyte-Doolittle, regiones alfa y beta anfipáticas de
Eisenberg, regiones flexibles de Karplus-Schulz,
regiones formadoras de superficie de Emini y regiones de alto
índice antigénico de Jameson-Wolf.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
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Los fragmentos pueden comprender regiones de
IL17RLP que combinan diversas características estructurales, tales
como las diversas características expuestas anteriormente.
En otro aspecto, la descripción proporciona una
molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido
que se hibrida en condiciones estrictas de hibridación a una porción
del polinucleótido en una molécula de ácido nucleico de la
invención descrita anteriormente, por ejemplo, el clon de cDNA
contenido en el ATCC Nº de depósito 209198. Por "condiciones de
hibridación estrictas" se quiere significar incubación durante
una noche a 42ºC en una solución que comprende: formamida al 50%, 5
x SSC (NaCl 750 mM, citrato trisódico 75 mM), fosfato sódico 50 mM
(pH 7,6), solución de Denhardt5x, sulfato de dextrano al 10%, y 20
\mug/ml de DNA de esperma de salmón cizallado y desnaturalizado,
seguido por lavado de los filtros en 0,1 x SSC a aproximadamente
65ºC.
Por un polinucleótido que se hibrida a una
"porción" de un polinucleótido se quiere significar un
polinucleótido (de DNA o de RNA) que se hibrida a al menos
aproximadamente 15 nucleótidos, y más preferiblemente a al menos
aproximadamente 20 nucleótidos, aún más preferiblemente a al menos
aproximadamente 30 nucleótidos, e incluso y más preferiblemente a
al menos aproximadamente 30-70 (por ejemplo, 50)
nucleótidos del polinucleótido de referencia. Estos polinucleótidos
son útiles como sondas de diagnóstico y cebadores como se ha
indicado antes y con más detalle más adelante.
Por una porción de un polinucleótido de "al
menos 20 nucleótidos de longitud" por ejemplo, se quiere
significar 20 o más nucleótidos contiguos de la secuencia de
nucleótidos del polinucleótido de referencia (por ejemplo, el cDNA
depositado o la secuencia de nucleótidos que se muestra en la
Figuras 1A, 1B y 1C (SEQ ID NO:1)). Naturalmente, un polinucleótido
que se hibrida solamente a una secuencia poli A (tal como la
extensión de poli(A) 3' terminal del cDNA de IL17RLP
mostrado en las Figuras 1A, 1B y 1C (SEQ ID NO:1)), o a un tramo
complementario de los residuos T (o U), no estaría incluido en un
polinucleótido usado para hibridarse a una porción de un ácido
nucleico de la invención, puesto que dicho polinucleótido se
hibridaría a cualquier molécula de ácido nucleico que contenga un
tramo de poli (A) o a su complemento (por ejemplo, prácticamente a
cualquier clon de DNA bicatenario).
Los polinucleótidos que se hibridan a los
polinucleótidos de referencia descritos en la presente memoria
pueden codificar polipéptidos que retienen sustancialmente la misma
función o actividad biológica que la forma madura del polipéptido
IL17RLP codificado por la secuencia de polinucleótidos representada
en las Figuras 1A, 1B y 1C (SEQ ID NO:1) o el clon contenido en el
depósito (HAPOR40).
Los polinucleótidos alternativos se hibridan al
polinucleótido de referencia (es decir, una secuencia de
polinucleótido descrita en la presente memoria), pero no retienen
la actividad biológica. Aunque estos polinucleótidos no retienen la
actividad biológica, tiene usos, tales como, por ejemplo, como
sondas para los polinucleótidos de la SEQ ID NO:1, para la
recuperación de polinucleótidos, como sondas de diagnóstico y como
cebadores para PCR.
Como se ha indicado, las moléculas de ácidos
nucleicos que codifican un polipéptido IL17RLP pueden incluir, pero
sin limitación, las que codifican la secuencia de aminoácidos del
polipéptido maduro, por sí mismo; y la secuencia codificadora del
polipéptido maduro y secuencias adicionales, tales como las que
codifican la secuencia delantera o secretora de aproximadamente 19
aminoácidos, tal como una secuencia de pre-, o pro- o
prepro-proteína; la secuencia codificadora del
polipéptido maduro, con o sin las secuencias codificadoras
adicionales antes mencionadas.
Los ácidos nucleicos de la invención que
codifican la secuencia de proteína de la invención pueden contener
secuencias no codificadoras adicionales, que incluyen por ejemplo,
pero sin limitación, intrones y secuencias en 5' y 3' no
codificadoras, tales como las secuencias transcritas y no traducidas
que desempeñan un papel en la transcripción, el procesamiento del
mRNA, que incluyen señales de empalme y poliadenilación, por ejemplo
- unión al ribosoma y estabilidad del mRNA.
Una secuencia que codifica el polipéptido de la
invención puede ser fusionada a una secuencia marcadora, tal como
una secuencia que codifica un péptido que facilita la purificación
del polipéptido fusionado. La secuencia de aminoácidos marcadora
puede ser un péptido de hexa-histidina, tal como una
etiqueta (o cola) proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc.,
9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los
cuales están disponibles en el comercio. Como se ha descrito por
Gentz y colegas (Prot. Natl. Acad. Sci. USA
86:821-824 (1989)), por ejemplo, la
hexa-histidina proporciona la purificación
conveniente de la proteína de fusión. La etiqueta (o cola) de
"HA" es otro péptido útil para la purificación que corresponde
a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina del virus de la
gripe, que ha sido descrita por Wilson y colaboradores (Cell
37:767 (1984)). Como se indica más adelante, otras proteínas de
fusión incluyen la IL17RLP fusionada a Fc en el extremo N ó C.
La presente descripción se refiere además a
variantes de las moléculas de ácidos nucleicos descritas en la
presente memoria que codifican porciones, análogos o derivados de la
proteína IL17RLP. Las variantes pueden ocurrir naturalmente, tales
como una variante alélica natural. Por una "variante alélica"
se quiere significar una de varias formas alternativas de un gen
que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo (Genes
II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)). Las
variantes que se presentan de modo no natural se pueden producir
usando métodos de mutagénesis conocidos en la técnica.
Dichas variantes incluyen las producidas por
sustituciones, deleciones o adiciones de nucleótidos. Las
sustituciones, deleciones o adiciones pueden implicar uno o más
nucleótidos. Las variantes pueden estar alteradas en regiones
codificadoras, regiones no codificadoras o en ambas. Las
alteraciones en las regiones codificadoras pueden producir
sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos conservadoras o
no conservadoras. Entre estas son especialmente preferidas las
sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteran
las propiedades ni las actividades de la proteína IL17RLP o sus
porciones. También son especialmente preferidas a este respecto las
sustituciones conservadoras.
La presente invención se refiere a moléculas de
ácido nucleicos que codifican el dominio extracelular de la
proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID
NO:2 o el dominio extracelular de la secuencia de aminoácidos
IL17RLP codificada por el clon de cDNA depositado.
Por un polinucleótido que tiene una secuencia de
nucleótidos al menos, por ejemplo 95% "idéntica" a una
secuencia de nucleótidos de referencia que codifica un polipéptido
IL17RLP se quiere significar que la secuencia de nucleótidos del
polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto que
la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta cinco
mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de
nucleótidos de referencia que codifica el polipéptido IL17RLP. En
otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una
secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica a una secuencia de
nucleótidos de referencia, hasta 5% de los nucleótidos de la
secuencia de referencia pueden estar delecionados o sustituidos con
otro nucleótido, o un número de nucleótidos de hasta 5% de los
nucleótidos totales en la secuencia de referencia pueden esta
insertados en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la
secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones terminales
5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier
lugar entre dichas posiciones terminales, interdispersadas
individualmente entre nucleótidos en la secuencia de referencia o
en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de
referencia.
Como cuestión práctica, si cualquier molécula de
ácido nucleico particular es al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%
idéntica a, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos mostrada en las
Figuras 1A,1B y 1C o a la secuencia de nucleótidos del clon de cDNA
depositado puede ser determinada convencionalmente usando programas
informáticos conocidos, tales como el programa Bestfit (Wisconsin
Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer
Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI
53711). El programa Bestfit usa el algoritmo de homología local de
Smith y Waterman para encontrar el mejor segmento de homología entre
las dos secuencias (Advances in Applied Mathematics
2:482-489 (1981)). Cuando se usa el programa Bestfit
o cualquier otro programa de alineación de secuencias para
determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95%
idéntica a una secuencia de referencia, los parámetros se ajustan,
naturalmente, de tal modo que el porcentaje de identidad se calcula
sobre la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de
referencia y que se permitan huecos en la homología de hasta 5% del
número total de nucleótidos en la secuencia de referencia. Un método
preferido para determinar la mejor igualación total entre la
secuencia de pregunta (una secuencia de la presente invención) y
una secuencia objeto, también denominada la secuencia de
alineamiento global, puede ser determinado usando el programa de
ordenador FASTDB basado el algoritmo de Brutlag y colegas (Comp.
App. Biosci. 6:237-245 (1990)). En una
alineación de secuencias las secuencias de pregunta y objeto son
ambas secuencias de DNA. Una secuencia de RNA puede ser comparada
convirtiendo las U en T. El resultado de dicho alineamiento de
secuencias globales se expresa por la identidad porcentual. Los
parámetros preferidos usados en una alineación FASTDB de secuencias
de DNA para calcular la identidad porcentual son: Matriz = Unitaria,
k-tuple = 4, Penalización por no coincidencia = 1,
Penalización por unión = 30, Longitud del grupo de aleatorización =
0, Puntuación por corte = 1, Penalización por hueco = 5,
Penalización por tamaño de hueco = 0.05, Tamaño de ventana = 500 o
la longitud de la secuencia de nucleótidos objeto, la que sea más
corta.
Si la secuencia objeto es más corta que la
secuencia de pregunta debido a deleciones en 5' o 3', no debido a
deleciones internas, debe realizarse una corrección manual en los
resultados. Esto es debido a que el programa FASTDB no tiene en
cuenta los truncamientos en 5' y 3' de la secuencia objeto cuando
calcula la identidad porcentual. Para secuencias objetos truncadas
en los extremos 5' ó 3', con respecto a la secuencia de pregunta,
la identidad porcentual es corregida calculando el número de bases
de la secuencia de pregunta que están en 5' y 3' de la secuencia
objeto, que no están igualadas/alineadas, como un porcentaje de las
bases totales de la secuencia de pregunta. Si un nucleótido está
igualado/alineado se determina por los resultados del alineamiento
de secuencias por el programa FASTDB. Este porcentaje se sustrae
luego de la identidad porcentual, calculada por el programa FASTDB
usando los parámetros especificados, para llegar a una puntuación de
identidad porcentual final. Esta puntuación corregida es la que se
usa para los fines de la presente descripción. Solamente las bases
fuera de las bases en 5' y 3' de la secuencia objeto, como es
presentada por el alineamiento FASTDB, que no están
igualadas/alineadas con la secuencia de pregunta, se calculan para
los fines de ajustar manualmente la puntuación de identidad.
Por ejemplo, una secuencia objeto de 90 bases se
alinea con una secuencia de pregunta de 100 bases para determinar
la identidad porcentual. Las deleciones ocurren en el extremo 5' de
la secuencia objeto que es comparada con una secuencia de pregunta
de 100 bases. Esta vez las deleciones son deleciones internas de
modo que no hay bases en los extremos 5' o 3' de la secuencia
objeto que no estén igualadas/alineadas con la secuencia de
pregunta. En este caso la identidad porcentual calculada por FASTDB
no se corrige manualmente. Una vez de nuevo, solamente las bases 5'
y 3' de la secuencia objeto que no están igualadas/alineadas con la
secuencia de pregunta se corrigen manualmente. Para los fines de la
presente invención no hay que hacer otras correcciones manuales.
Las moléculas de ácidos nucleicos al menos 90%,
95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a la secuencia de ácido nucleico
mostrada en las Figuras 1A, 1B, y 1C (SEQ ID NO:1) o a la secuencia
de ácido nucleico del cDNA depositado puede codificar o no puede
codificar un polipéptido que tiene actividad de IL17RLP. Esto es
porque incluso cuando una molécula particular de ácido nucleico no
codifica un polipéptido que tiene actividad de IL17RLP, un experto
en la técnica sabría cómo usar la molécula de ácido nucleico, por
ejemplo, como una sonda de hibridación o un cebador para la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los usos de la molécula
de ácido nucleico descritos en la presente memoria que no codifica
un polipéptido que tiene actividad de IL17RLP incluyen, entre
otros: (1) aislar el gen IL17RLP gen o sus variantes alélicas en una
genoteca de cDNA; (2) hibridación in situ (por ejemplo,
"FISH") a la metafase cromosómica que se extiende para
proporcionar la localización cromosómica precisa del gen IL17RLP,
como es descrito por Verma y colegas (Human Chromosomes: A
Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988)); y
análisis de transferencia Northern para detectar la expresión de
mRNA de IL17RLP en tejidos
específicos.
específicos.
Por "un polipéptido que tiene actividad de
IL17RLP " se quiere significar polipéptidos que exhiben actividad
similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad de la
forma madura o soluble de la proteína IL17RLP descrita en la
presente memoria, como se mide en un ensayo biológico particular.
Por ejemplo, la proteína IL17RLP modula la secreción de
IL-6 por células NIH-3T3. Se ha
descrito un ensayo ELISA in vitro que cuantifica la cantidad
de IL-6 secretada por las células en respuesta al
tratamiento con citoquinas o los dominios extracelulares solubles
de los receptores de citoquinas (Yao, Z., et al.,
Immunity 3:811-821 (1995)). Explicado
brevemente, el ensayo implica cultivar en placa las células diana a
una densidad de aproximadamente 5 x 10^{6} células/mL en un
volumen de 500 \muL en los pocillos de un placa de cultivo de
fondo plano de 24 pocillos (Costar). Los cultivos se tratan luego
con diversas concentraciones de la citoquina o el dominio
extracelular soluble del receptor de la citoquina en cuestión. Las
células se cultivan luego durante 24 horas a 37ºC. En ese momento,
se retiran 50 \muL del líquido sobrenadante y se analizan en
cuanto a la cantidad de IL-6 esencialmente como se
ha descrito por el fabricante (Genzyme, Boston, MA). Los niveles de
IL-6 se calculan luego con referencia a una curva
patrón construida con la citoquina IL-17
recombinante. Dicha actividad es útil para determinar el nivel de
secreción de IL-6 mediada por
IL17RLP.
IL17RLP.
La proteína IL17RLP modula la proliferación y la
diferenciación de las células del sistema inmune en un modo
dependiente de la dosis en el ensayo antes descrito. Por tanto,
"un polipéptido que tiene actividad de la proteína IL17RLP"
incluye polipéptidos que también exhiben cualquiera de las mismas
actividades estimuladoras en los ensayos antes descritos en un modo
dependiente de la dosis. Aunque el grado de actividad dependiente
de la dosis no necesita ser idéntico al de la proteína IL17RLP,
preferiblemente, "un polipéptido que tiene actividad de la
proteína IL17RLP" exhibirá sustancialmente una dependencia de la
dosis similar en una actividad dada cuando se compara con la
proteína IL17RLP (es decir, el polipéptido candidato exhibirá mayor
actividad o no más de aproximadamente 25 veces menos y,
preferiblemente, no más de aproximadamente diez veces menos
actividad con relación a la proteína de referencia IL17RLP).
La proliferación de linfocitos es otro ensayo
in vitro que puede realizarse para determinar la actividad de
IL17RLP y los dominios extracelulares solubles de IL17RLP. Por
ejemplo, Yao y colegas (Immunity 3:811-821
(1995)) han descrito recientemente un ensayo in vitro para
determinar los efectos de diversas citoquinas y receptores de
citoquina solubles en la proliferación de leucocitos murinos.
Explicado brevemente, los órganos linfoides se recogen
asépticamente, se aíslan los linfocitos de los órganos recogidos, y
el material recogido resultante de las células linfoides se pone en
suspensión en un medio de cultivo estándar como se ha descrito por
Fanslow y colaboradores (J. Immunol.
147:535-5540 (1991)). Las suspensiones de células
linfoides se pueden dividir en diferentes subclases incluyendo
células T del bazo, células B de los nódulos linfáticos, células T
CD4^{+} y CD8^{+}, y timocitos adultos maduros. Para las células
T del bazo se incuban suspensiones de células del bazo (200 x
10^{6} células) con el mAb CD11b y el mAB para el MHC de clase II
durante 30 minutos a 4ºC, se cargan en una columna de purificación
de células T (Pierce, Rockford, IL), y las células T se eluyen de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. Usando este método, la
pureza de las poblaciones de células T resultantes debe ser >95%
CD3^{+} y <1% slgM^{+}. Para la purificación de subconjuntos
de nódulos linfáticos, las células B se retiran por adherencia a
placas de cultivos de tejidos previamente revestidas con IgG
anti-ratón de cabra (10 \mug/mL). Las células
restantes se incubaron luego con anti-CD4 o
anti-CD8 durante 30 minutos a 4ºC y luego se lavaron
y colocaron en placas de cultivo de tejidos previamente revestidas
con IgG anti-rata de cabra (20 \mug/mL).Después de
45 minutos, se retiran las células no adherentes y se analizan en
cuanto a su pureza por citometría de flujo. Las células CD4 y las
empobrecidas en Ig de la superficie deben ser >90%
TCR-\alpha,\beta, CD8^{+}, mientras que las
células CD8 y la empobrecidas en Ig de la superficie deben ser
>95% TCR- \alpha,\beta, CD4^{+}. Finalmente, para
enriquecer los timocitos adultos maduros, las células se suspenden
a 10^{8}/mL en anti-HSA al 10% y complemento de
conejo de baja toxicidad al 10% (Cedarlane, Ontario, Canadá), se
incuban durante 45 minutos a 37ºC, y las células viables restantes
se aíslan sobre Ficoll-Hypaque (Pharmacia,
Piscataway, NJ). Este método debe proporcionar entre 90 y 95% de
células CD3^{hl} que son CD4^{+}8^{-} o CD4^{-}8^{+}.
Para analizar la respuesta proliferativa de los
cultivos de células primarias antes descritos, se realizan ensayos
de proliferación in vitro en placas de fondo redondo o de
fondo plano de 96 pocillos usando 0,5-1.5 x
10^{5} células/pocillo. Para la estimulación, las células T se
incuban con concentraciones subóptimas (0,25-0,5
\mug/mL) de Con A (Sigma, St. Louis, MO), PHA
(0,25-0,5%; Difco, Detroit, MI),
anti-CD3 inmovilizada, o anti-TCR
\alpha,\beta. Anti-CD3 y
anti-TCR- \alpha,\beta se inmovilizan durante
>2 horas a 37ºC antes de la adición de células efectoras. Las
incubaciones se hacen en presencia y ausencia de células
CV-1/EBNA fijadas transfectadas con IL17RLP, sus
muteínas, un vector de control, o un antígeno de control tal como
rCD40L (Armitage, et al., Nature 357:80 (1992));
Spriggs, et al., J. Exp. Med. 176:1543 (1992)). La
expresión en superficie de CD40L es monitorizada por citometría de
flujo usando la proteína de fusión humana CD40-Fc.
Los cultivos de células se someten a pulsos durante la noche con
[^{3}H]-timidina (1 \muCi/pocillo) durante al
menos 18 horas de un cultivo de 3 días. Luego se cosechan los
cultivos marcados en un cosechador Inotech de 96 pocillos y se
detectan los recuentos radiactivos usando un contador de
centelleo.
Al igual que otros receptores de citoquinas, la
IL17RLP exhibe actividad sobre los leucocitos incluyendo por
ejemplo monocitos, linfocitos y neutrófilos. Por esta razón la
IL17RLP es activa en dirigir la proliferación y diferenciación de
estos tipos de células. Dicha actividad es útil para la mejora del
sistema inmune o para la supresión, mieloprotección, movilización
de células madres, control la inflamación aguda y crónica y
tratamiento de leucemia. Los ensayos para medir dicha actividad son
bien conocidos por los expertos en la técnica (Peters, et
al., Immun. Today 17:273 (1996); Young, et al.,
J. Exp. Med. 182:1111 (1995); Caux, et al.,
Nature 390: 258 (1992); y Santiago-Schwarz,
et al., Adv. Exp. Med. Biol. 378:7 (1995).
Naturalmente, debido a la degeneración del
código genético, un experto ordinario en la técnica reconocerá
inmediatamente que un gran número de moléculas de ácidos nucleicos
que tengan una secuencia al menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%
idéntica a la secuencia de ácido nucleico del cDNA depositado o la
secuencia de ácido nucleico mostrada en las Figuras 1A, 1B y 1C
(SEQ ID NO:1) codificará un polipéptido "que tiene actividad de
la proteína IL17RLP". De hecho, puesto que las variantes
degeneradas de estas secuencias de nucleótidos codificaran todas el
mismo polipéptido, esto será evidente para el experto incluso sin
realizar el ensayo de comparación antes descrito. Se reconocerá
además en la técnica que, para dichas moléculas de ácido nucleicos
que no son variantes degeneradas, un número razonable también
codificará un polipéptido que tiene actividad de la proteína
IL17RLP. Esto es debido a que el experto es plenamente conocedor de
las sustituciones de aminoácidos que son menos probables o no son
probables para afectar significativamente a la función de la
proteína (por ejemplo, reemplazar un aminoácido alifático con un
segundo aminoácido alifático), como se describe adicionalmente en
lo sucesivo.
La presente invención se refiere también a
vectores que incluyen las moléculas de DNA aisladas de la presente
invención, a células hospedantes que han sido manipuladas por
ingeniería genética con los vectores recombinantes, y a la
producción del polipéptido IL17RLP parcial de la invención por
técnicas recombinantes. El vector puede ser, por ejemplo, un vector
fago, plasmídico, viral o retroviral. Los vectores retrovirales
pueden ser competentes en la replicación o defectuosos en la
replicación. En el último caso, generalmente la propagación viral
ocurrirá solamente en células hospedantes complementarias.
Los polinucleótidos puede ser unidos a un vector
que contiene un marcador seleccionable para la propagación en un
hospedante. Generalmente, se introduce un vector plásmido en un
precipitado, tal como un precipitado de fosfato de calcio, o en un
complejo con un lípido cargado. Si el vector es un virus, puede
estar empaquetado in vitro usando una línea celular de
empaquetamiento apropiada y luego transducido en células
hospedantes.
La inserción de DNA debe estar unida
operativamente a un promotor apropiado, tal como el promotor de PL
del fago lambda, tos promotores lac, trp y phoA de
E. coli y los promotores tac, los promotores temprano
y tardío de SV40 y los promotores de las LTR retrovirales, por
nombrar unos pocos. Otros promotores serán conocidos por los
expertos en la técnica. Las construcciones de expresión contendrán
además sitios para la iniciación y terminación de la transcripción
y, en la región transcrita, un sitio de unión al ribosoma para la
traducción. La porción codificante de los transcritos expresados
por las construcciones incluirán preferiblemente un codón de
iniciación de la traducción al comienzo y un codón de terminación
(UAA, UGA o UAG) adecuadamente posicionado al final del polipéptido
que se ha de traducir.
Como se ha indicado, los vectores de expresión
incluirán preferiblemente al menos un marcador seleccionable.
Dichos marcadores incluyen dihidrofolato-reductasa,
G418 o genes de resistencia a la neomicina para el cultivo en
células eucarióticas y de resistencias a la tetraciclina, kanamicina
o ampicilina para cultivo en E. coli y otras bacterias.
Ejemplos representativos de hospedantes apropiados incluyen, pero
sin limitación, células bacterianas, tales como células de E.
coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium;
células fúngicas, tales como células de levadura; células de
insectos tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera
Sf9; células animales, tales como CHO, COS 293 y células de
melanoma de Bowes; y células de plantas. Los medios de cultivo
apropiados y las condiciones para las células hospedantes antes
descritas son conocidos en la técnica.
Los vectores preferidos para uso en bacterias
incluyen pHE4-5, pQE70, pQE60 y
pQE-9 (QIAGEN, Inc., supra); vectores pBS,
vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNHBA, pNH16a, pNH18A,
pNH46A (Stratagene); y ptrc99a, pKK223-3,
pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Entre los
vectores eucarióticos preferidos están pWLNEO, pSV2CAT, pOG44,
pXTI, y pSG (Stratagene); y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL (Pharmacia).
Otros vectores adecuados serán fácilmente evidentes para los
expertos.
La introducción de la construcción en la célula
hospedante se puede efectuar por transfección mediante fosfato de
calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano,
transfección mediada por un lípido catiónico, electroporación,
transducción, infección o otros métodos. Dichos métodos están
descritos en muchos manuales estándares de laboratorio (por
ejemplo, Davis, et al., Basic Methods In Molecular
Biology (1986)).
El polipéptido puede ser expresado en una forma
modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no
sólo señales de secreción, sino también regiones funcionales
adicionales heterólogas. Por ejemplo, se puede añadir al extremo N
del polipéptido una región de aminoácidos adicional, particularmente
aminoácidos cargados, para mejorar la estabilidad y la persistencia
en la célula hospedante, durante la purificación, o durante la
manipulación y conservación subsiguientes. También pueden añadirse
al polipéptido restos de péptidos para facilitar la purificación.
Dichas regiones pueden ser retiradas antes de la preparación final
del polipéptido. La adición de restos de péptidos a polipéptidos
para engendrar secreción o excreción, para mejorar la estabilidad y
para facilitar la purificación, entre otras, son métodos familiares
y habituales en la técnica. Una proteína de fusión preferida
comprende una región heteróloga de inmunoglobulina que es útil para
estabilizar y purificar proteínas. Por ejemplo,
EP-A-0464533 (correspondiente
canadiense 2045869) describe proteínas de fusión que comprenden
varias porciones de la región constante de moléculas de
inmunoglobulina junto con otra proteína humana o una de sus partes.
En muchos casos, la parte Fc en una proteína de fusión es
exhaustivamente ventajosa para uso en terapia y diagnosis y por
tanto da como resultado, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas
mejoradas (EP-A0232262). Por otro lado, para algunos
usos sería deseable poder suprimir la parte Fc después de que la
proteína de fusión se haya expresado, detectado y purificado en el
modo ventajoso descrito. Este es el caso cuando la porción Fc
demuestra ser un estorbo para uso en terapia y diagnosis, por
ejemplo cuando la proteína de fusión ha de usarse como antígeno
para inmunizaciones. En el descubrimiento de fármacos, por ejemplo,
proteínas humanas, tal como hIL-5, han sido
fusionadas con porciones Fc para ensayos de escrutinio de alto
rendimiento para identificar antagonistas de hIL-5
(Bennett, D., et al., J. Molecular Recognition
8:52-58 (1995); Johanson, K., et al., J.
Biol. Chem. 270:9459-9471 (1995)).
La proteína IL17RLP parcial de la invención se
puede recuperar y purificar de cultivos de células recombinantes
por métodos bien conocidos que incluyen precipitación con sulfato de
amonio o etanol, extracción con ácidos, cromatografía de cambio
aniónico o catiónico, cromatografía sobre fosfocelulosa,
cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad,
cromatografía sobre hidroxilapatito y cromatografía sobre lectinas.
Más preferiblemente se emplea para la purificación cromatografía de
líquidos de alta resolución ("HPLC"). Los polipéptidos
descritos en la presente memoria incluyen: productos purificados de
fuentes naturales, incluyendo fluidos corporales, tejidos y
células, tanto aislados directamente como cultivados; productos de
métodos sintéticos químicos; y productos obtenidos por técnicas
recombinantes a partir de un hospedante procariótico o eucariótico,
incluyendo, por ejemplo, células bacterianas, de levaduras, de
plantas superiores, de insectos y de mamíferos. Dependiendo del
hospedante empleado en un método de producción recombinante, el
polipéptido de la presente invención puede estar glicosilado o
puede estar no glicosilado. Un polipéptido producido
recombinantemente puede incluir un residuo de metionina inicial
modificado, en algunos casos como resultado de procesos mediados
por el hospedante. Así, es bien conocido en la técnica que la
metionina N-terminal codificada por el codón de
iniciación de la traducción generalmente es eliminada con alta
eficacia de cualquier proteína después de la traducción en todas
las células eucarióticas. Aunque la metionina
N-terminal en la mayoría de las proteínas también
es eliminada eficazmente en la mayoría de los procariotas, para
algunas proteínas este proceso de eliminación en procariotas es
ineficaz, dependiendo de la naturaleza del aminoácido al cual está
unida covalentemente la metionina N-terminal.
La invención proporciona además un polipéptido
IL17RLP parcial aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos
desde la posición 1 hasta la posición 271 de la SEQ ID NO:2.
Para mejorar o alterar las características de
los polipéptidos IL17RLP, puede emplearse la ingeniería de
proteínas. La tecnología de DNA recombinante conocida por los
expertos en la técnica puede usarse para crear nuevas proteínas
mutantes o muteínas que incluyen sustituciones, deleciones,
adiciones de aminoácidos únicas o múltiples o proteínas de fusión.
Dichos polipéptidos modificados pueden mostrar, por ejemplo,
actividad mejorada o estabilidad aumentada. Además, pueden ser
purificados con altos rendimientos y mostrar mejor solubilidad que
el correspondiente polipéptido natural, al menos en ciertas
condiciones de purificación y conservación.
Por ejemplo, para muchas proteínas, incluyendo
el dominio extracelular de una proteína asociada a membrana o
la(s) forma(s) madura(s) de una proteína
secretada, se sabe en la técnica que uno o más aminoácidos pueden
ser delecionados del extremo N o el extremo C sin pérdida sustancial
de la función biológica. Por ejemplo, Ron y colegas (J. Biol.
Chem., 268:2984-2988 (1993)) informaron de
proteínas KGF modificadas que tenían actividad de unión a heparina
incluso si estuvieran faltando 3, 8 ó 27 residuos de aminoácidos
N-terminales. En el presente caso, puesto que la
proteína descrita en la presente memoria es un miembro de la familia
de polipéptidos receptores de la interleuquina
(IL)-17, las deleciones de aminoácidos
N-terminales hasta la cisteína en la posición 5 de
la SEQ ID NO: 2 puede retener algo de actividad biológica, tal como
unión a ligando o modulación de actividades de células diana. Los
polipéptidos que tienen más deleciones N-terminales
incluyendo el residuo de cisteína en la posición 5 en la SEQ ID
NO:2 no se esperaría que retuvieran dichas actividades biológicas
porque se sabe que este residuo en el polipéptido receptor de
IL-I 7 murina es probable que requiera la formación
de un puente disulfuro para proporcionar la estabilidad
estructural que se necesita para la unión al ligando y la
iniciación de las vías de transducción de señales
apropiadas.
apropiadas.
Sin embargo, incluso si la deleción de uno o más
aminoácidos del extremo N de una proteína da como resultado de la
modificación la pérdida de una o más funciones biológicas de la
proteína, todavía pueden ser retenidas otras actividades
biológicas. Así, la capacidad de la proteína acortada para inducir
y/o unirse a anticuerpos que reconocen el dominio completo maduro o
extracelular de la proteína generalmente se retendrá cuando son
eliminados del extremo N menos de la mayoría de los residuos del
dominio completo, maduro o extracelular de la proteína. Se puede
determinar por métodos habituales descritos en la presente memoria y
por otra parte conocidos en la técnica si un polipéptido particular
que carece de los residuos N-terminales de una
proteína completa retiene dichas actividades inmunológicas.
Por consiguiente, la presente descripción
proporciona polipéptidos que tienen uno o más residuos delecionados
del extremo amino de la secuencia de aminoácidos de la IL17RLP
mostrada en la SEQ ID NO:2, hasta el residuo de cisteína en la
posición número 5, y los polinucleótidos que codifican dichos
polipéptidos. En particular, dichos polipéptidos comprenden la
secuencia de aminoácidos de residuos n^{1}-407 de
la SEQ ID NO:2, donde n^{1} es un número entero en el intervalo
de -19 a 5, y 5 es la posición del primer residuo desde extremo N
del polipéptido IL17RLP completo (mostrado en la SEQ ID NO:2) que se
cree que es requerida para la actividad de unión a ligandos de la
proteína IL17RLP.
Similarmente se conocen muchos ejemplos de
muteínas por deleción C-terminal biológicamente
funcionales. Por ejemplo, el interferón gamma muestra hasta diez
veces actividades superiores delecionando 8-10
residuos de aminoácidos del extremo carboxi de la proteína (Dobeli,
et al., J. Biotechnology 7:199-216
(1988)). En el presente caso, puesto que la proteína descrita en la
presente memoria es un miembro de la familia de polipéptidos
receptores de la interleuquina (IL)-17, las
deleciones de aminoácidos C-terminales hasta la
cisteína en la posición 340 de la SEQ ID NO:2 puede retener alguna
actividad biológica, tal como unión a ligandos. Los polipéptidos
que tienen más deleciones C-terminales incluyendo el
residuo de cisteína en la posición 340 de la SEQ ID NO:2 no se
esperaría que retuvieran dichas actividades biológicas porque se
sabe que este residuo en el polipéptido receptor de
IL-17 murina se requiere probablemente para formar
un puente disulfuro para proporcionar la estabilidad estructural
que se necesita para la unión del receptor y la transducción de
señales.
Sin embargo, incluso si la deleción de uno o más
aminoácidos del extremo C de una proteína da como resultado de la
modificación la pérdida de una o más funciones biológicas de la
proteína, todavía pueden ser retenidas otras actividades
biológicas. Así, la capacidad de la proteína acortada para inducir
y/o unirse a anticuerpos que reconocen el dominio completo, maduro
o extracelular de la proteína generalmente se retendrá cuando se
eliminen del extremo C menos de la mayoría de los residuos del
dominio completo, maduro o extracelular de la proteína. Se puede
determinar por métodos habituales descritos en la presente memoria y
por otra parte conocidos en la técnica si un polipéptido particular
que carece de los residuos C-terminales de una
proteína completa retiene dichas actividades inmunológicas.
Por consiguiente, la presente descripción
proporciona polipéptidos que tienen uno o más residuos del extremo
carboxi de la secuencia de aminoácidos de la IL17RLP mostrada en la
SEQ ID NO:2, hasta el residuo de cisteína en la posición 340 de la
SEQ ID NO:2, y polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos. En
particular, dichos polipéptidos tienen la secuencia de aminoácidos
de los residuos -19-m^{1} de la secuencia de
aminoácidos en la SEQ ID NO2, en donde m^{1} es cualquier número
entero de 340 a 407, y el residuo 340 es la posición del primer
residuo del extremo C del polipéptido IL17RLP completo (mostrado
en la SEQ ID NO:2) que se cree que se requiere para que la proteína
IL17RLP transfiera su señal extracelular al interior de la
célula.
La descripción también proporciona polipéptidos
que tienen uno o más aminoácidos delecionados de ambos términos
amino y carboxi, que pueden ser descritos generalmente teniendo
residuos n^{1}-M^{1} de la SEQ ID NO:2, donde
n^{1} y m^{1} son números enteros como se han descrito
antes.
Además de las formas de deleción terminal de la
proteína estudiada antes, también se reconocerá por un experto
ordinario en la técnica que algunas secuencias de aminoácidos del
polipéptido IL17RLP pueden ser variadas sin efecto significativo
sobre la estructura o función de la proteína. Si se consideran tales
diferencias en secuencia, debe recordarse que habrá zonas críticas
en la proteína que determinan la actividad.
Por tanto, la descripción incluye variaciones
del polipéptido IL17RLP que muestran actividad sustancial del
polipéptido IL17RLP o que incluyen regiones de la proteína IL17RLP,
tales como las porciones de la proteína estudiadas más adelante.
Dichos mutantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones,
repeticiones y sustituciones tipo seleccionadas de acuerdo con las
reglas generales conocidas en la técnica de modo que tienen poco
efecto sobre la actividad. Por ejemplo, se proporcionan directrices
relativas a cómo hacer fenotípicamente silenciosas sustituciones de
aminoácidos en donde los autores indican que hay dos métodos
principales para estudiar la tolerancia al cambio de una secuencia
de aminoácidos (Bowie, J. U., et al., Science
247:1306-1310 (1990)). El primer método se basa en
el proceso de evolución, en el cual las mutaciones son aceptadas o
rechazadas por selección natural. El segundo método usa ingeniería
genética para introducir cambios de aminoácidos en posiciones
específicas de un gen clonado y selecciones o escrutinios para
identificar secuencias que mantienen la funcionalidad.
Como establecen los autores, estos estudios han
revelado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a
sustituciones de aminoácidos. Los autores indican además qué
cambios de aminoácidos son probablemente permisivos en una cierta
posición de la proteína. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos
más enterrados requieren cadenas laterales no polares, mientras se
conservan generalmente pocos aspectos de las cadenas laterales
superficiales. Otras sustituciones fenotípicamente silenciosas
están descritas por Bowie y colaboradores (supra) y en las
referencias citadas en la presente memoria. Vistas típicamente como
sustituciones conservadoras son los reemplazamientos, uno por otro,
entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu y Ile; el intercambio
de residuos hidroxilo Ser y Thr, de residuos ácidos Asp y Glu; la
sustitución entre los residuos amida Asn y Gln; el cambio de los
residuos básicos Lys y Arg, y el reemplazo entre los residuos
aromáticos Phe, Tyr.
Así, el fragmento, derivado o análogo del
polipéptido de la SEQ ID NO:2, o el codificado por el cDNA
depositado, puede ser (I) uno en el cual uno o más de los residuos
de aminoácidos están sustituidos con un residuo de aminoácidos
conservado o no conservado (preferiblemente un residuo de
aminoácidos conservado) y dicho residuo de aminoácidos sustituido
puede o no puede estar codificado por el código genético o (ii) uno
en el cual uno o más de los residuos de aminoácidos incluye un
grupo sustituyente, o (iii) uno en el cual el polipéptido maduro
esta fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para
aumentar la semi-vida del polipéptido (por ejemplo,
polietilenglicol), o (iv) uno en el cual el dominio extracelular del
polipéptido está fusionado con otro compuesto, tal como un
compuesto para aumentar la semi-vida del polipéptido
(por ejemplo, polietilenglicol), o (v) uno en el cual aminoácidos
adicionales están fusionados a la forma anterior del polipéptido,
tal como un péptido de la región de fusión Fc de IgG o una
secuencia delantera o secretora o una secuencia que se emplea para
la purificación de la forma anterior del polipéptido o una secuencia
de proproteína.
Como se ha indicado los cambios son
preferiblemente de una naturaleza secundaria, tal como sustituciones
conservadoras de aminoácidos que no afectan significativamente al
plegado o a la actividad de la proteína (véase la Tabla II).
Para mejorar o alterar las características de
los polipéptidos IL17RLP, puede emplearse ingeniería de proteínas.
La tecnología del DNA recombinante conocida por los expertos en la
técnica puede usarse para crear nuevas proteínas mutantes o
muteínas que incluyen una sola o múltiples sustituciones, deleciones
o adiciones de aminoácidos o proteínas de fusión. Dichos
polipéptidos modificados pueden mostrar por ejemplo, actividad
aumentada o estabilidad incrementada. Además pueden ser purificados
con mayores rendimientos y mostrar mejor solubilidad que el
polipéptido natural correspondiente, al menos en ciertas
condiciones de purificación y de conservación.
Por tanto, la descripción abarca también
derivados y análogos de IL17RLP que tengan uno o más residuos de
aminoácidos delecionados, añadidos o sustituidos para generar
polipéptidos IL17RLP que son más adecuados para la expresión,
aumento de escala, etc., en las células hospedantes elegidas. Por
ejemplo, los residuos de cisteína pueden estar delecionados o
sustituidos con otro residuo de aminoácido para eliminar los puentes
disulfuro, sitios de fosforilación por PKC, sitios de fosforilación
por CK2, sitios de fosforilación por
proteína-quinasa dependiente de cAMP y cGMP,
miristolación, y/o los sitios de glicosilación unidos a N pueden
ser alterados o eliminados para conseguir un modelo de función o
expresión alterado del polipéptido (por ejemplo, un sitio de
glicosilación unido a N mutado puede alterar la expresión de un
producto homogéneo que se recupera y purifica más fácilmente de los
hospedantes de levadura que son conocidos para los sitios unidos a
N de hiperglicosilato). Para este fin, una variedad de sustituciones
de aminoácidos en una o ambas de la primera o tercera posiciones
de aminoácidos en una cualquiera o más de las cisteínas que forman
puentes de disulfuro, sitios de fosforilación por PKC, sitios de
fosforilación por CK2, sitios de fosforilación por
proteína-quinasa dependiente de cAMP y cGMP,
miristolación, y/o secuencias de reconocimiento de glicosilación en
el polipéptido IL17RLP y/o deleción de un aminoácido en la segunda
posición de una cualquiera o más secuencias de reconocimiento
alterarán la función o expresión o impedirán la glicosilación del
polipéptido IL17RLP en la secuencia del tripéptido modificada
(véase, por ejemplo, Miyajima, A., et al., EMBO J.
5(6):1193-1197 (1986)).
Los aminoácidos de la proteína IL17RLP que son
esenciales para la función pueden ser identificados por métodos
conocidos en la técnica, tal como mutagénesis dirigida al sitio o
mutagénesis de escaneo de alanina (Cunningham y Wells,
Science 244: 1081-1085 (1989)). Este último
método introduce mutaciones de la alanina sola en cada residuo de
la molécula. Las moléculas mutantes resultantes se ensayan en cuanto
a su actividad biológica, tal como unión al receptor o actividad
proliferante in vitro.
Son de especial interés las sustituciones de
aminoácidos cargados con otros aminoácidos cargados o neutros que
pueden producir proteínas con características altamente deseables,
tal como menos agregación. La agregación no solo puede reducir la
actividad, sino también ser problemática cuando se preparan
formulaciones farmacéuticas, debido a que los agregados pueden ser
inmunógenos (Pinckard, et al., Clin. Exp. Immunol.
2:331-340 (1967); Robbins, et al.,
Diabetes 36:838-845 (1987); Cleland, et
al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems
10:307-377 (1993)).
El reemplazo de aminoácidos también puede
cambiar la selectividad de la unión de un ligando a los receptores
de la superficie celular. Por ejemplo, Osta de, et al.,
(Nature 361:266-268 (1993)) describen ciertas
mutaciones que dan como resultado la unión selectiva de
TNF-\alpha a solamente uno de los dos tipos
conocidos de receptores del TNF. Los sitios que son críticos para
la unión ligando-receptor también pueden
determinarse por análisis estructural, tal como cristalización,
resonancia magnética nuclear o marcaje por fotoafinidad (Smith,
et al., J. Mol. Biol. 224:899-904
(1992); de Vos, et al. Science
255:306-312 (1992)).
Puesto que IL17RLP es un homólogo del receptor
de la proteína IL-17 murina, para modular más que
para eliminar completamente las actividades biológicas de IL17RLP
se hacen preferiblemente mutaciones en las secuencias que codificas
aminoácidos en el dominio extracelular conservado de IL17RLP, es
decir, en las posiciones 1-271 de la SEQ ID NO:2,
más preferiblemente en residuos dentro de esta región que no están
conservados en la proteína receptora de IL-17
murina.
Las regiones de aminoácidos de la secuencia de
IL17RLP mostrada en la SEQ ID NO:2 que están altamente conservadas
cuando se comparan con la secuencia del polipéptido IL17RLP murino
mostrada como SEQ ID NO:3 (véase la Figura 2) son regiones
atractivas para mutagénesis dianizada. De hecho, un número de
regiones o dominios conservados ha sido expuesto en las Figuras 1A,
1B y 1C (marcados como Dominios I-VIII). Estos
dominios son como sigue: Dominio I (es decir,
Val-49 hasta Leu-62 de la SEQ ID
NO:2 (Val-68 hasta Leu-81 de las
Figuras 1A, 1B y 1C)); Dominio II (Cys-154 hasta
Thr-166 de la SEQ ID NO:2 (es decir,
Cys-173 hasta Thr-185 de las Figuras
1A, 1B y 1C)); Dominio III (Gln-202 hasta
Gln-208 de la SEQ ID NO:2 (es decir,
Gln-221 hasta Gln-227 de las Figuras
1A, 1B y 1C)); Dominio IV (Asp-241 hasta
Val-249 de la SEQ ID NO:2 (es decir,
Asp-260 hasta Val-268 de las
Figuras 1A, 1B y 1C)); Dominio V (Thr-255 hasta
Leu-261 de la SEQ ID NO:2 (es decir,
Thr-274 hasta Leu-280 de las
Figuras 1A, 1B y 1C)); Dominio VI (Leu-310 hasta
Tyr-319 de la SEQ ID NO:2 (es decir,
Leu-329 hasta Tyr-338 de las
Figuras 1A, 1B y 1C)); Dominio VII (Cys-340 hasta
Leu-346 de la SEQ ID NO:2 (es decir,
Cys-359 hasta Leu-365 de Figuras
1A,1B y 1C)); y Dominio VIII (Ile-354 hasta
Gly-358 de la SEQ ID NO:2 (es decir,
Ile-373 hasta Gly-377 de las Figuras
1A,1B y 1C)).
Siete residuos de cisteína de IL17RLP están
conservados con respecto al secuencia del polipéptido
IL-17R murino mostrada en la SEQ ID NO:3. Los
residuos de cisteína tienden a desempeñar un papel importante en la
conformación estructural, y por tanto, la función de un
polipéptido. Como tales, los siete residuos de cisteína conservados
también son residuos atractivos para mutagénesis dianizada del
polipéptido IL17RLP. Los siete residuos de cisteína altamente
conservados de la IL17RLP mostrados en la SEQ ID NO:2 son como
sigue: Cys-5, Cys-80,
Cys-143, Cys-154,
Cys-238, Cys-242 y
Cys-340 de la SEQ ID NQ:2 (que corresponden
exactamente a Cys-24, Cys-99,
Cys-162, Cys-173,
Cys-257, Cys-261 y
Cys-359 de las Figuras 1A,1B y 1C).
El polipéptido de la presente invención es
proporcionado preferiblemente en una forma aislada, y
preferiblemente está sustancialmente purificado. Una versión
producida recombinantemente del polipéptido IL17RLP descrito en la
presente memoria puede ser purificada sustancialmente por los
métodos de una etapa descritos por Smith y Johnson (Gene
67:31-40 (1988)). Los polipéptidos descritos en la
presente memoria pueden purificarse también a partir de fuentes
naturales o recombinantes usando anticuerpos
anti-IL17RLP de la invención en métodos que son
bien con conocidos en la técnica de purificación de proteínas.
"% de similitud" para dos polipéptidos
significa una puntuación producida comparando la secuencia de
aminoácidos de los dos polipéptidos usando el programa Bestfit
(Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics
Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive,
Madison, WI 53711) y los parámetros por defecto para determinar la
similitud. Bestfit usa el algoritmo de homología local de Smith y
Waterman (Advances in Applied Mathematics
2:482-489, 1981) para encontrar el mejor segmento de
similitud entre las dos secuencias.
Por un polipéptido que tiene una secuencia de
aminoácidos al menos, por ejemplo, 95% "idéntica" a una
secuencia de aminoácidos de referencia de un polipéptido IL17RLP se
quiere significar que la secuencia de aminoácidos del polipéptido
es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia
del polipéptido puede incluir hasta cinco alteraciones de
aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos
del polipéptido IL17RLP. En otra palabras para obtener un
polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 95%
idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta 5% de
los residuos de aminoácidos de la secuencia de referencia pueden
estar delecionados o sustituidos con otro aminoácido, o un número de
aminoácidos de hasta 5% de los residuos totales de aminoácidos en
la secuencia de referencia pueden estar insertados en la secuencia
de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia
puede ocurrir en las posiciones terminales amino o carboxi de la
secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier parte entre
las posiciones terminales, interdispersadas individualmente entre
los residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos
contiguos dentro de la secuencia de referencia.
Como cuestión práctica, si cualquier polipéptido
particular es al menos 90%. 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico, por
ejemplo, a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figuras 1A, 1B
y 1C (SEQ ID NO:2), la secuencia de aminoácidos codificada por el
clon de cDNA depositado HAPOR40, o uno de sus fragmentos, puede ser
determinada convencionalmente usando programas de ordenador
conocidos, tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence
Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group.
University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711).
Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineación de
secuencias para determinar si una secuencia particular es por
ejemplo, 95% idéntica a una de secuencia referencia, los parámetros
se ajustan, naturalmente de modo que dicho porcentaje de identidad
se calcule sobre la longitud completa de la secuencia de
aminoácidos de referencia y que se permitan huecos en la homología
de hasta 5% del número total de residuos de aminoácidos en la
secuencia de referencia.
La identidad entre una secuencia de referencia
(pregunta) (una secuencia de la presente invención) y una secuencia
objeto, también denominada secuencia de alineamiento global, se
determina usando el programa de ordenador FASTDB basado en el
algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci.
6:237-245 (1990)). Los parámetros preferidos usados
en la alineación de aminoácidos FASTDB son: Matriz = PAM 0,
k-tuple=2, Penalización por no coincidencia = 1,
Penalización por unión = 20, Longitud del grupo de aleatorización =
0, Puntuación por corte = 1, Tamaño de ventana = Longitud de la
secuencia, Penalización por hueco = 5, Penalización por tamaño de
hueco = 0,05, Tamaño de ventana = 500 o la longitud de la secuencia
de aminoácidos objeto, la que sea más corta. Si la secuencia objeto
es más corta que la secuencia pregunta debido deleciones N- o
C-terminales, no debidas a deleciones internas, se
hace una corrección manual a los resultados para tener en
consideración el hecho de que el programa FASTDB no da cuenta de
los truncamientos N- y C-terminales de la secuencia
objeto cuando se calcula la identidad porcentual global. Para las
secuencias objetos truncadas en los términos N- y C, con respecto a
la secuencia de pregunta, el porcentaje de identidad se corrige
calculando el número de residuos de la secuencia de pregunta que
son N- y C-terminales de la secuencia objeto que no
están igualados/alineados con un residuo objeto correspondiente,
como un porcentaje de las bases totales de la secuencia de pregunta.
Una determinación de si un residuo está igualado/alineado se
determina por los resultados de la alineación de secuencias por
FASTDB. Este porcentaje se sustrae luego de la identidad porcentual,
calculada por el programa FASTDB anterior usando los parámetros
especificados, para llegar a la puntuación de identidad porcentual
final. Esta puntuación de identidad porcentual final es la que se
usa. Solamente los residuos para los términos N y C de la secuencia
objeto, que no estén igualados/alineados con la secuencia de
pregunta, son considerados para los fines de ajustar manualmente la
puntuación de identidad porcentual. Es decir, solamente las
posiciones de los residuos de la secuencia de pregunta fuera de los
residuos N- y C-terminales más alejados de la
secuencia objeto. Por ejemplo, una secuencia objeto de 90 residuos
de aminoácidos se alinea con una secuencia de pregunta de 100
residuos para determinar la identidad porcentual. La deleción ocurre
en el extremo N de la secuencia objeto y por tanto, el alineamiento
por FASTDB no muestra una igualación/alineamiento de los 10 primeros
residuos en el extremo N. Los 10 residuos no apareados representan
10% de la secuencia (número de residuos en los términos N- y C- no
igualados/número total de residuos en la secuencia de pregunta) de
modo que se sustrae 10% de la puntuación de identidad porcentual
calculada por el programa FASTDB. Si los 90 residuos restantes
estuvieran perfectamente igualados la identidad porcentual final
sería 90%. En otro ejemplo, una secuencia objeto de 90 residuos se
compara con una secuencia de pregunta de 100 residuos. Esta vez las
deleciones son deleciones internas de modo que hay residuos en los
términos N o C de la secuencia objeto que no están
igualados/alineados con la secuencia de pregunta. En este caso la
identidad porcentual calculada por FASTDB no se corrige manualmente.
Una vez más, solamente se corrigen manualmente las posiciones de
los residuos fuera de los extremos N- y C-terminales
de la secuencia objeto, como se presentan en la alineación por
FASTDB, que no están igualados/alineados con la secuencia de
pregunta. No se realizan otras correcciones manuales para los fines
descritos en la presente memoria.
La descripción también se refiere a proteínas de
fusión en las cuales el polipéptido de longitud completa IL17RLP o
uno de sus fragmentos, variantes, derivados o análogos está unido o
fusionado a una proteína no relacionada. Estas proteínas de fusión
se pueden diseñar habitualmente sobre la base de las secuencias de
nucleótidos y polipéptidos de IL17RLP descritas en la presente
memoria. Por ejemplo, como apreciaría un experto en la técnica los
polipéptidos IL17RLP y sus fragmentos (incluyendo los fragmentos
portadores de epítopos) descritos en la presente memoria pueden ser
combinados con partes del dominio constante de inmunoglobulinas
(IgG), dando como resultado polipéptidos quiméricos (de fusión).
Estas proteínas de fusión facilitan la purificación y muestran
in vivo una semi-vida aumentada. Esto se ha
demostrado por ejemplo, por ejemplo, para las proteínas quiméricas
que consisten en los dos primeros dominios del polipéptido CD4
humano y diversos dominios de las regiones constantes de las
cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas de mamíferos
(EP-A-394827; Traunecker, et
al, Nature 331:84-86 (1988)). Las
proteínas de fusión que tienen una estructura dímera unida por
disulfuro debido a la parte de IgG también pueden ser más eficaces
en unirse y neutralizar otras moléculas que el polipéptido IL17RLP
monómero o fragmentos del polipéptido solos (Fountoulakis, et
al., J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)).
Ejemplos de proteínas de fusión de IL17RLP pueden incluir la fusión
de secuencias del polipéptido IL17RLP con cualquier secuencia de
aminoácidos que permita que las proteínas de fusión sean presentadas
en la superficie celular (por ejemplo, el dominio Fc de IgG); o
fusiones a una enzima, proteína fluorescente o proteína luminiscente
lo que proporciona una función marcadora.
Como se describe con detalle más adelante, el
polipéptido de la presente invención puede usarse también para
producir anticuerpos policlonales y monoclonales, que son útiles en
ensayos para detectar la expresión de la proteína IL17RLP como se
describe más adelante o como agonistas y antagonistas capaces de
potenciar o inhibir la función de la proteína IL17RLP. Además,
dichos polipéptidos pueden ser usados en un sistema de dos híbridos
de levadura para "capturar" proteínas que se unen a la proteína
IL17RLP que también son agonistas y antagonistas candidatos. El
sistema de dos híbridos de levadura está descrito por Fields y Song
(Nature 340:245-246 (1989)).
En otro aspecto, la descripción proporciona un
péptido o polipéptido que comprende una porción portadora de
epítopo del polipéptido de la invención. El epítopo de esta porción
de polipéptido es un epítopo immunogénico o antigénico del
polipéptido de la invención. Un "epítopo inmunogénico" se
define como parte de una proteína que produce una respuesta de
anticuerpo cuando el inmunógeno es la proteína completa. Por otra
parte, una región de una molécula de proteína a la que puede unirse
un anticuerpo se define como un "epítopo antigénico". El
número de epítopos inmunogénicos de una proteína generalmente es
menor que el número de epítopos antigénicos (véase, por ejemplo,
Geysen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
81:3998-4002 (1983)).
Como para la selección de péptidos o
polipéptidos que llevan un epítopo antigénico (es decir, que
contienen una región de una molécula de proteína al cual puede
unirse a un anticuerpo), es bien conocido en la técnica que
péptidos sintéticos relativamente cortos que mimetizan parte de una
secuencia de proteína son habitualmente capaces provocar un
antisuero que reacciona con la proteína parcialmente mimetizada
(véase, por ejemplo, Sutcliffe, J. G., et al.,
Science 219:660-666 (1983)). Los péptidos
capaces de producir sueros reactivos con proteínas se representan
frecuentemente en la secuencia primaria de una proteína, pueden ser
caracterizados por un conjunto de reglas químicas sencillas, y no
están confinados a ser regiones inmunodominantes de proteínas
intacta (es decir, epítopos inmunogénicos) ni los terminales amino
o carboxilo. Los péptidos y polipéptidos portadores de epítopos
antigénicos son por tanto útiles para producir anticuerpos,
incluyendo anticuerpos monoclonales, que se unen específicamente a
un polipéptido de la invención (véase, por ejemplo, Wilson, et
al., Cell 37:767-778 (1984)).
Los péptidos y polipéptidos portadores de
epítopos antigénicos contienen preferiblemente una secuencia de al
menos siete, más preferiblemente al menos nueve y más
preferiblemente entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30
aminoácidos contenidos dentro de la secuencia de aminoácidos del
polipéptido de la invención. Ejemplos no limitativos de
polipéptidos o péptidos antigénicos que pueden ser usados para
generar anticuerpos específicos de IL17RLP incluyen: un polipéptido
que comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente
Ser-6 hasta aproximadamente Val-3
en la SEQ ID NO:2, un polipéptido que comprende residuos de
aminoácidos desde aproximadamente Cys-5 a
aproximadamente Pro-13 en la SEQ ID NO:2, un
polipéptido que comprenden residuos de aminoácidos desde
aproximadamente Ile-22 hasta aproximadamente
Arg-30 en la SEQ ID NO:2, un polipéptido que
comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente
Thr-70 hasta aproximadamente Tyr-78
en la SEQ ID NO:2, un polipéptido que comprende residuos de
aminoácidos desde aproximadamente Thr-91 hasta
aproximadamente Lys-99 en la SEQ ID NO:2, un
polipéptido que comprende residuos de aminoácidos desde
aproximadamente Ala-125 hasta aproximadamente
Ser-133 in SEQ ID N0:2, un polipéptido que comprende
residuos de aminoácidos desde aproximadamente
Thr-221 hasta aproximadamente
Val-229 en la SEQ ID NO:2, un polipéptido que
comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente
Gly-239 hasta aproximadamente
Thr-248 en la SEQ ID NO:2, un polipéptido que
comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente
Leu-261 hasta aproximadamente
Gly-269 en la SEQ ID NO:2, un polipéptido que
comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente
Cys-385 hasta aproximadamente
Glu-393 en la SEQ ID NO:2, un polipéptido que
comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente
Pro-396 hasta aproximadamente
Ser-404 en la SEQ ID NO:2, un polipéptido que
comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente
Gly-390 hasta aproximadamente
Glu-398 en la SEQ ID NO:2, y un polipéptido que
comprende residuos de aminoácidos desde aproximadamente
Cys-404 hasta aproximadamente
Leu-426 en las Figuras 1A,1B y 1C (que es idéntico a
la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:2 con la excepción del
esquema de numeración que se ha detallado antes). Se ha determinado
que estos fragmentos de polipéptido llevan epítopos antigénicos de
la proteína IL17RLP por el análisis del índice antigénico de
Jameson-Wolf, como se muestra en la Figura 3,
anterior.
Los péptidos y polipéptidos portadores de
epítopos pueden producirse por cualquier medio convencional (véase,
por ejemplo, Houghten, R. A., et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82:5131-5135 (1985); y la Patente de
EE.UU. Nº 4.631.211 de Houghten, et al. (1986)).
Los péptidos y polipéptidos portadores de
epítopos se usan para inducir anticuerpos de acuerdo con métodos
bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sutcliffe, et
al., supra; Wilson, et al., supra; Chow,
M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82;
910-914; y Bittle, F. J., et al., J. Gen.
Virol. 66:2347-2354 (1985)). Los péptidos
portadores de epítopos inmunogénicos descritos en la presente
memoria, es decir, las partes de una proteína que provocan una
respuesta de anticuerpo cuando la proteína completa es el
inmunógeno, se identifican de acuerdo con métodos conocidos en la
técnica (véase, por ejemplo, Geysen, et al., supra).
Todavía más, la Patente de EE.UU. Nº 5.194.392, concedida a Geysen,
describe un método general de detectar o determinar la secuencia de
monómeros (aminoácidos u otros compuestos) que es una equivalente
topológica del epítopo (es decir, un "mimótopo") que es
complementaria a un parátopo particular (sitio de unión al
antígeno) de un anticuerpo de interés. Más generalmente, la patente
de EE.UU. Patente Nº 4.433.092, concedida a Geysen, describe un
método de detectar o determinar una secuencia de monómeros que es un
equivalente topográfico de un ligando que es complementario al
sitio de unión al ligando de un receptor particular de interés.
Similarmente, la Patente de EE.UU. Nº 5.480.971, concedida a
Houghten y otros, por Peralkylated Oligopeptide Mixtures
describe oligopéptidos peralquilados de alquilo
C1-C7 y conjuntos de colecciones de dichos péptidos,
así como métodos para usar dichos conjuntos y colecciones de
oligopéptidos para determinar la secuencia de un oligopéptido
peralquilado que se une preferiblemente a una molécula receptora de
interés. Por tanto también pueden prepararse habitualmente por
estos métodos, análogos no peptídicos de los péptidos portadores de
epítopos.
Como apreciarán los expertos en la técnica, el
polipéptido IL17RLP parcial de la presente invención y sus
fragmentos que llevan epítopos descritos anteriormente pueden ser
combinados con partes del dominio constante de inmunoglobulinas
(IgG), lo que da como resultado polipéptidos quiméricos. Estas
proteínas de fusión facilitan la purificación y muestran in
vivo una semi-vida aumentada. Esto se ha
mostrado, por ejemplo, para proteínas quiméricas que consisten en
los dos primeros dominios del polipéptido CD4 humano y diversos
dominios de las regiones constantes de las cadenas ligera y pesada
de inmunoglobulinas de mamíferos
(EP-A-394.827; Traunecker, et
al., Nature 331:84-86 (1988)). Las
proteínas de fusión que tienen una estructura dímera unida por
disulfuro debida a la parte de IgG pueden también ser más eficaces
en unirse y neutralizar otras moléculas que la proteína IL17RLP
monómera o el fragmento de proteína solo (Fountoulakis; et
al., J. Biochem. 270:3958-3964
(1995)).
Los anticuerpos específicos de la proteína para
uso en la presente invención pueden producirse contra la proteína
IL17RLP parcial intacta de la invención o uno de sus polipéptidos
antigénicos, que pueden estar presentes junto con una proteína
portadora, tal como una albumina, para un sistema animal (tal como
conejo o ratón) o, si es suficientemente grande (al menos
aproximadamente 25 aminoácidos), sin un portador.
Como se usa en la presente memoria, la expresión
"anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Mab) se
emplea para incluir moléculas intactas, así como fragmentos de
anticuerpos (tal como, fragmentos por ejemplo, Fab y F (ab')2) que
son capaces de unirse específicamente a la proteína IL17RLP. Los
fragmentos Fab y F (ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo
intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación, y pueden
tener una menor unión no específica al tejido que el anticuerpo
intacto (Wahl, et al., J. Nucl. Med.
24:316-325 (1983)). Por tanto, se prefieren estos
fragmentos.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
prepararse por cualquiera de una variedad de métodos. Por ejemplo,
las células que expresan la proteína IL17RLP parcial o uno de sus
fragmentos antigénicos pueden administrarse a un animal para
inducir la producción de sueros que contienen anticuerpos
policlonales. En un método preferido, se prepara y purifica una
preparación de la proteína IL17RLP parcial para dejarla
sustancialmente exenta de contaminantes naturales. Dicha
preparación se introduce luego en un animal para producir antisueros
policlonales de mayor actividad específica.
En el método más preferido, los anticuerpos de
la presente invención son anticuerpos monoclonales (o sus fragmentos
de unión a la proteína IL17RLP). Dichos anticuerpos monoclonales se
pueden preparar por la tecnología del hibridoma (Kohler, et
al., Nature 256:495 (1975); Kohler, et al.,
Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler, et al.,
Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling, et al., in:
Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,
Elsevier, N.Y., (1981) pp. 563-681)). En general,
dichos métodos implican inmunizar un animal (preferiblemente un
ratón) con el antígeno de la proteína IL17RLP o, más
preferiblemente, con una célula que expresa la proteína IL17RLP.
Las células adecuadas pueden ser reconocidas por su capacidad para
unirse al anticuerpo de proteína anti-IL17RLP.
Dichas células pueden ser cultivadas en cualquier medio de cultivo
de tejidos adecuado; sin embargo, es preferible cultivar las
células en medio de Eagle modificado por Earle suplementado con
suero bovino fetal al 10% (inactivado a aproximadamente 56ºC), y
suplementado con aproximadamente 10 \mug/l de aminoácidos no
esenciales, aproximadamente 1.000 U/ml de penicilina, y
aproximadamente 100 \mug/ml de estreptomicina. Se extraen los
esplenocitos de ratones y se fusionan con una línea celular de
mieloma adecuada. De acuerdo con la presente invención se puede
emplear cualquier línea celular de mieloma; sin embargo, es
preferible emplear la línea celular de mieloma precursora (SP2O),
disponible en The American Type Culture Collection, Rockville,
Maryland. Después de la fusión, las células hibridomas resultantes
se mantienen selectivamente en medio HAT, y luego se clonan
dilución por limitante como se describe por Wands y colegas
(Gastroenterology 80:225-232 (1981)). Las
células hibridomas obtenidas a través de dicha selección se analizan
luego para identificar los clones que segregan anticuerpos capaces
de unirse al antígeno proteínico IL17RLP.
Alternativamente, pueden producirse anticuerpos
adicionales capaces de unirse al antígeno proteínico IL17RLP en un
método de dos etapas a través del uso de anticuerpos
anti-idiotípicos. Dicho método hace uso del hecho
de que los anticuerpos son por si mismo antígenos, y que, por tanto,
es posible obtener un anticuerpo que se une a un segundo
anticuerpo. De acuerdo con este método se usan anticuerpos
específicos de la proteína IL17RLP para inmunizar a un animal,
preferiblemente un ratón. Los esplenocitos de dicho animal se usan
luego para producir las células hibridomas, y las células
hibridomas se someten a escrutinio para identificar clones que
producen un anticuerpo cuya capacidad para unirse al anticuerpo
específico de la proteína IL17RLP pueda ser bloqueada por el
antígeno proteínico IL17RLP. Dichos anticuerpos comprenden
anticuerpos anti-idiotípicos para el anticuerpo
específico de la proteína IL17RLP y pueden usarse para inmunizar un
animal para inducir la formación de otros anticuerpos específicos
de la proteína IL17RLP.
Se apreciará que Fab y F(ab')2 y otros
fragmentos de los anticuerpos de la presente invención se pueden
usar de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria.
Dichos fragmentos se producen típicamente por escisión
proteolítica, usando enzimas tales como la papaína (para producir
fragmentos Fab) o la pepsina (para producir fragmentos
F(ab')2). Alternativamente, los fragmentos que se unen a la
proteína IL17RLP se pueden producir a través de la aplicación de la
tecnología del DNA recombinante o a través de química sintética.
Para uso in vivo de
anti-IL17RLP en seres humanos, puede ser preferible
usar anticuerpos monoclonales quiméricos "humanizados". Tales
anticuerpos se pueden producir usando construcciones genéticas
derivadas de células hibridomas que producen los anticuerpos
monoclonales antes descritos. Los métodos para producir anticuerpos
quiméricos son conocidos en la técnica (Morrison, Science
229:1202 (1985); Oi, et al., BioTechniques 4:214
(1986); Cabilly, et al., Patente de EE.UU. Nº 4.816.567;
Taniguchi, et al., EP 171496; Morrison, et al., EP
173494; Neuberger, et al., WO 8601533; Robinson, et
al., WO 8702671; Boulianne, et al., Nature 312:643
(1984); Neuberger, et al., Nature 314:268 (1985).
Los autores del presente invento han descubierto
que IL17RLP se expresa en tejido pulmonar adulto. Para cierto
número de trastornos relacionados con el sistema inmune, niveles
sustancialmente alterados (aumentados o disminuidos) de la
expresión del gen IL17RLP pueden ser detectados en el tejido del
sistema inmune u otras células o fluidos corporales (por ejemplo,
suero, plasma, orina, fluido sinovial o espinal) tomados de un
individuo que tiene dicho trastorno, con respecto a un nivel
"estándar" de expresión del gen IL17RLP, es decir, el nivel de
expresión del gen IL17RLP en los tejidos del sistema inmune o los
fluidos corporales de un individuo que no tiene el trastorno del
sistema inmune. Por tanto, los compuestos de la invención se pueden
usar en un método de diagnostico útil durante la diagnosis de un
trastorno del sistema inmune, que implica medir el nivel de
expresión del gen que codifica la proteína IL17RLP en el tejido del
sistema inmune u otras células o fluido corporal de un individuo y
comparar el nivel de expresión del gen medido con un nivel de
expresión estándar del gen IL17RLP, con lo cual un aumento o
disminución del nivel de expresión del gen comparado con el estándar
es indicativo de una trastorno del sistema
inmune.
inmune.
En particular, se cree que ciertos tejidos de
mamíferos con cáncer del sistema inmune expresan niveles
significativamente aumentados de la proteína IL17RLP y el mRNA que
codifica la proteína IL17RLP cuando se comparan con un nivel
"estándar" correspondiente. Además, se cree que los niveles
aumentados de la proteína IL17RLP se pueden detectar en ciertos
fluidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, y fluido
espinal) de mamíferos con dicho cáncer cuando se comparan con los
sueros de mamíferos de la misma especie que no tienen cáncer.
Por tanto, la descripción proporciona un método
de diagnóstico útil durante la diagnosis de un trastorno del
sistema inmune, incluyendo cánceres de este sistema, que implica
medir el nivel de expresión del gen que codifica la proteína
IL17RLP en tejido de sistema inmune o otras células o fluido
corporal de un individuo y comparar el nivel de expresión del gen
medido con un nivel de expresión del gen IL17RLP estándar, con lo
cual un aumento o disminución en el nivel de expresión del gen
comparado en el estándar es indicativo de un trastorno del sistema
inmune.
Cuando ya ha sido hecha de acuerdo con métodos
convencionales una diagnosis de un trastorno en el sistema inmune
incluyendo diagnosis de un tumor, la presente invención es útil como
indicador de pronóstico, con lo cual los pacientes que exhiben una
expresión del gen IL17RLP experimentarán un peor resultado clínico
con respecto a los pacientes que expresan el gen a un nivel más
próximo al nivel estándar.
Por la expresión "analizar el nivel de
expresión del gen que codifica la proteína IL17RLP" se pretende
medir cualitativamente o cuantitativamente el nivel de la proteína
IL17RLP o el nivel del mRNA que codifica la proteína IL17RLP en una
primera muestra biológica bien directamente (por ejemplo,
determinando o estimando el nivel absoluto de proteína o de mRNA) o
relativamente (por ejemplo, comparando el nivel de la proteína
IL17RLP o el nivel del mRNA en una segunda muestra biológica).
Preferiblemente, se mide o estima el nivel de la proteína IL17RLP o
el nivel del mRNA en la primera muestra biológica y se compara con
un nivel de proteína IL17RLP o un nivel de mRNA estándar, tomándose
el nivel estándar de una segunda muestra biológica obtenida de un
individuo que no tiene el trastorno o determinándose por los
niveles medios de una población de individuos que no tiene un
trastorno del sistema inmune. Como se apreciará en la técnica, una
vez que se conoce un nivel de proteína IL17RLP o un nivel de mRNA
estándar, se puede usar repetidamente como patrón de
comparación.
Por "muestra biológica" se quiere
significar cualquier muestra biológica obtenida de un individuo,
fluido corporal, línea celular, cultivo de tejidos u otra fuente
que contenga la proteína IL17RLP o su mRNA. Como se ha indicado,
las muestras biológicas incluyen fluidos corporales (tales como
sueros, plasma, orina, fluido sinovial y fluido espinal) que
contienen dominios extracelulares libres de proteína IL17RLP, tejido
del sistema inmune, y otras fuentes de tejidos encontrados que
expresan el dominio maduro o extracelular completo de la IL17RLP.
Los métodos para obtener biopsias de tejidos y los fluidos
corporales de mamíferos son bien conocidos en la técnica. Si la
muestra biológica es para incluir mRNA, la fuente preferida es una
biopsia de tejido.
La presente invención es útil para la diagnosis
o tratamiento de diversos trastornos relacionados con el sistema
inmune en mamíferos, preferiblemente humanos. Tales trastornos
incluyen tumores, cánceres, enfermedad de pulmón intersticial (tal
como granulomatosis de células de Langerhans), y cualquier
desregulación de la función de las células inmunes incluyendo, pero
sin limitación, autoinmunidad, artritis, leucemias, linfomas,
inmunosupresión, inmunidad, inmunidad humoral, enfermedad
intestinal inflamatoria, mielosupresión y similares.
El RNA celular total puede ser aislado de una
muestra biológica usando cualquier técnica adecuada, tal como el
método de una sola etapa con tiocianato de
guanidinio-fenol-cloroformo descrito
por Chomczynski y Sacchi (Anal. Biochem. 162:
156-159 (1987)). Los niveles de mRNA que codifica la
proteína IL17RLP se analizan luego usando cualquier método
apropiado. Estos incluyen análisis por transferencia Northern,
cartografía con nucleasa S1, reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), transcripción inversa en combinación con la reacción en
cadena de la polimerasa (RT-PCR), y transcripción
inversa en combinación con la reacción en cadena de la ligasa
(RT-LCR).
El análisis de los niveles de la proteína
IL17RLP en una muestra biológica puede hacerse usando técnicas
basadas en anticuerpos. Por ejemplo, la expresión de la proteína
IL17RLP en tejidos puede ser estudiada por métodos
inmunohistológicos clásicos (Jalkanen, M., et al., J.
Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, M.,
et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096
(1987)). Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar
la expresión del gen de la proteína IL17RLP incluyen inmunoensayos,
tal como el ensayo con inmunosorbente unido a enzima (ELISA) y el
radioinmunoensayo (RIA). Los marcadores adecuados para el ensayo con
anticuerpos son conocidos en la técnica e incluyen marcadores
enzimáticos, tales como glucosa-oxidasa y
radioisótopos, tales como yodo (^{251}I, ^{121}I), carbono
(^{14}C), azufre (^{35}S), tritio (^{3}H), indio (^{112}In),
y tecnecio (^{99m}Tc), y marcadores fluorescentes, tales como
fluoresceína y rodamina y biotina.
Además de analizar los niveles de la proteína
IL17RLP en una a muestra biológica obtenida de un individuo, la
proteína IL 17RLP también puede ser detectada in vivo por
técnicas de formación de imagen. Las etiquetas o marcadores de
anticuerpos para formación de imagen in vivo de la proteína
IL17RLP incluyen los detectables por radiografía de rayos X, MNR o
ESR. Para radiografía por rayos X los marcadores adecuados incluyen
radioisótopos, tales como bario o cesio, que emiten radiación
detectable, pero no son demasiado perjudiciales para el sujeto. Los
marcadores detectables para NMR y ESR incluyen los que tiene un
espín característico detectable, tal como deuterio, que pueden ser
incorporados en el anticuerpo por marcaje de nutrientes para el
hibridoma relevante.
Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo
específico de una proteína IL17RLP que ha sido marcado con un resto
formador de imagen detectable, tal como un radioisótopo (por
ejemplo, ^{131}I, ^{112}In, ^{99m}Tc), una sustancia
radio-opaca, o un material detectable por resonancia
magnética nuclear se introduce (por ejemplo, parenteralmente,
subcutáneamente o intraperitonealmente) en el mamífero a examinar en
cuanto al trastorno del sistema inmune. Se entenderá en la técnica
que el tamaño del sujeto y el sistema de imagen usados determinarán
la cantidad de resto formador de imagen necesaria para producir
imágenes de diagnóstico. En el caso de un resto de radioisótopo,
para un sujeto humano, la cantidad de radioactividad inyectada
variará normalmente desde aproximadamente 5 a 20 milicuries de
^{99m}Tc. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo marcado se
acumulará preferencialmente en la localización de células que
contengan la proteína IL17RLP. La formación de imágenes de tumores
in vivo se describe por Burchiel y colaboradores (en el
capítulo 13 de Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of
Cancer, Burchiel, S. W. y Rhodes, B. A., eds., Masson Publishing
Inc. (1982)).
Como se ha indicado antes, los polinucleótidos y
polipéptidos de IL17RLP son útiles para la diagnosis de estados que
implican expresión anormalmente alta o baja de actividades de
IL17RLP. Dadas las células y los tejidos en donde se expresa
IL17RLP, así como las actividades moduladas por IL17RLP, es
fácilmente evidente que un nivel de expresión sustancialmente
alterado (aumentado o disminuido) de IL17RLP en un individuo
comparada con el nivel estándar o "normal" produce estados
patológicos relacionados con el(los) sistema (s) en los
cuales se expresa y/o es activa IL17RLP.
También se apreciará por los expertos ordinarios
en la técnica que, puesto que la proteína IL17RLP es un miembro de
la familia de los receptores de la interleuquina
(IL)-17, el dominio extracelular de la proteína
puede ser liberado en una forma soluble de las células que expresan
la IL17RLP por escisión proteolítica. Por tanto, cuando el dominio
extracelular soluble de IL17RLP se añade desde una fuente exógena a
células, tejidos o al cuerpo de un individuo, la proteína ejercerá
sus actividades fisiológicas en las células dianas de ese individuo.
Además, las células que expresan esta proteína transmembranal
pueden ser añadidas a células, tejidos o el cuerpo de un individuo
y esta células añadidas se unirán a las células que expresan
IL17RLP, con lo cual las células que expresan IL17RLP pueden causar
acciones (por ejemplo estimulación celular) en las células dianas
portadoras de ligandos.
Por tanto, se apreciará que los estados causados
por una disminución del nivel estándar o normal de la actividad de
IL17RLP en un individuo, particularmente trastornos del sistema
inmune, pueden ser tratados por administración del polipéptido
IL17RLP (en la forma de una dominio extracelular soluble o células
que expresan la proteína completa). Así, un individuo que necesita
un nivel aumentado de actividad de IL17RLP puede ser tratado
administrando a dicho individuo una composición farmacéutica que
comprende una cantidad del polipéptido aislado IL17RLP parcial de
la invención, es decir, el dominio extracelular de la proteína
IL17RLP, eficaz para aumentar el nivel de actividad de IL17RLP en
dicho individuo.
Puesto que IL17RLP es un nuevo homólogo del
receptor de IL-17 recientemente descrito, tendrá una
amplia gama de actividades similares a las de los receptores de
citoquinas. La IL17RLP, o los agonistas de IL17RLP, pueden ser
empleados para potenciar las defensas del hospedante contra las
infecciones crónicas y agudas resistentes, por ejemplo, las
infecciones micobacterianas vía la atracción y activación de
leucocitos microbicidas. La IL17RLP también puede ser empleada en
aumentar la proliferación de células T por la estimulación de la
biosíntesis de IL-2 para el tratamiento de
enfermedades auto-inmunes mediadas por células T y
leucemias linfocíticas. La IL17RLP también puede ser empleada para
regular la hematopoyesis, regulando la activación y diferenciación
de diversas células progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, para
liberar los leucocitos maduros de la médula ósea después de
quimioterapia, es decir, en la movilización de células madre. La
IL17RLP también puede ser empleada para tratar la sepsis. Los
dominios extracelulares solubles de IL17RLP se pueden usar como
antagonistas para la actividad de IL17RLP, y, como tales serán
útiles terapéuticamente, como un mecanismo para regular la
actividad de IL17RLP endógena. Además, la estimulación de IL17RLP
induce fuertemente la expresión de IL-6.
IL-6 es un potente factor de crecimiento para
mielomas, plasmacitomas e hibridomas y está implicado en el
crecimiento de las células T del linfoma de Lennert. Como resultado,
los agonistas de IL17RLP y el dominio extracelular soluble del
L17RLP se pueden usar en el tratamiento de tales cánceres, estados
morbosos análogos, y otros conocidos por los expertos en la
técnica.
Una composición que comprende el polipéptido
IL17RLP parcial de la invención se formulará y dosificará de un
modo consistente con la buena práctica médica, teniendo en cuenta el
estado clínico del paciente individual (especialmente los efectos
secundarios del tratamiento con el polipéptido IL17RLP solo), el
sitio de administración de la composición del polipéptido IL17RLP,
el método de administración, el programa de administración, y otros
factores conocidos por los expertos. La "cantidad eficaz" del
polipéptido IL17RLP para los fines en la presente memoria está por
tanto determinada por tales consideraciones.
Como una proposición general, la cantidad total
farmacéuticamente eficaz del polipéptido IL17RLP administrada
parenteralmente por dosis estará en el intervalo de aproximadamente
1 \mug/kg/día a 10 mg/kg/día de peso corporal del paciente,
aunque, como se ha indicado antes, esta cantidad estará sometida a
la discreción terapéutica. Más preferiblemente, esta dosis es al
menos 0,01 mg/kg/día, y más preferiblemente para seres humanos entre
aproximadamente 0,01 y 1 mg/kg/día. Si se administra continuamente,
el polipéptido IL17RLP se administra típicamente un régimen de
dosis de aproximadamente 1 \mug/kg/hora a aproximadamente 50
\mug/kg/hora, por 1-4 inyecciones al día y o por
infusiones subcutáneas continuas, por ejemplo, usando una minibomba.
También se puede emplear una solución de bolsa intravenosa. La
duración del tratamiento necesaria para observar cambios y el
intervalo que sigue al tratamiento para que se produzcan las
respuestas parece variar dependiendo del efecto deseado.
Las composiciones farmacéuticas que contienen
IL17RLP parcial de la de la invención se pueden administrar por las
vías oral, rectal, parenteral, intracisternal, intravaginal,
intraperitoneal, tópica (en forma de polvos, pomadas, gotas o
parche transdérmico), bucal o en forma de una pulverización nasal.
Por "portador o vehículo farmacéuticamente aceptable" se
quiere significar una carga sólida, semi-sólida o
líquida, diluyente, material encapsulante o auxiliar de formulación
de cualquier tipo no tóxicos. El término "parenteral" como se
usa en presente memoria se refiere a modos de administración que
incluyen inyección e infusión intravenosa, intramuscular,
intraperitoneal, intrasternal, subcutánea e
intra-articular.
El polipéptido IL17RLP también se administra
adecuadamente mediante sistemas de liberación prolongada. Ejemplos
adecuados de composiciones de liberación prolongada incluyen
matrices de polímeros semipermeables en forma de artículos
conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de
liberación prolongada incluyen polilactidas (Patentes de EE.UU. Nº
3.773.919, EP 58481), copolímeros de ácido
L-glutámico y
gamma-etil-L-glutamato
(Sidman, U., et al., Biopolimers
22:547-556 (1983)), poli(metacrilato de
2-hidroxietilo); Langer, R., et al., J.
Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981), y Langer,
R., Chem. Tech. 12:98-105 (1982)),
copolímeros de etileno y acetato de vinilo (Langer, R., et
al., id.) o ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico
(EP 133988). Las composiciones del polipéptido L17RLP de liberación
prolongada también incluyen el polipéptido IL17RLP atrapado en
liposomas. Los liposomas que contienen el polipéptido IL17RLP se
preparan por métodos conocidos en la técnica (DE 3.218.121;
Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
82:3688-3692 (1985); Hwang, et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034 (1980); EP
52322; EP 36676; EP 88046; EP 143949; EP 142641; solicitud de
patente japonesa 83-118008; Patentes de EE.UU. Nº
4.485.045 y 4.544.545; y EP 102324). Ordinariamente, los liposomas
son de tipo unilaminar pequeño (aproximadamente
200-800 Angstroms) en los cuales el contenido de
lípido es mayor que aproximadamente 30 por ciento en moles de
colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para la terapia
óptima con el polipéptido IL17RLP.
Para administración parenteral, el polipéptido
IL17RLP se formula generalmente mezclándolo en el grado deseado de
pureza, en una forma de dosificación unitaria (solución, suspensión
o emulsión), con un vehículo farmacéuticamente aceptable, es decir,
uno que no sea tóxico para los individuos que los reciben a las
dosis y concentraciones empleadas y sea compatible con los otros
ingredientes de la formulación, por ejemplo, la formulación
preferiblemente no incluye agentes oxidantes y otros compuestos que
se sabe que son perjudiciales para los polipéptidos.
Generalmente, las formulaciones se preparan
poniendo en contacto el polipéptido IL17RLP uniforme e íntimamente
con vehículos líquidos o sólidos finamente divididos o ambos. Luego,
si es necesario, el producto se conforma en la formulación deseada.
Preferiblemente el portador o vehículo es un vehículo parenteral,
más preferiblemente una solución que es isotónica con la sangre del
individuo que lo recibe. Ejemplos de tales vehículos incluyen agua,
solución salina, solución de Ringer, y solución de dextrosa. También
son útiles los vehículos no acuosos, tales como aceites fijos y
oleato de etilo, así como liposomas.
El vehículo contiene adecuadamente cantidades
secundarias de aditivos, tales como sustancias que potencian la
isotonicidad y la estabilidad química. Dichos materiales no son
tóxicos para los que los reciben a las dosis y concentraciones
empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato,
succinato, ácido acético, y otros ácidos orgánicos o sus sales;
antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso
molecular (menos de aproximadamente diez residuos), por ejemplo,
poliarginina o tripéptidos; proteínas, tales como seroalbúmina,
gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como
polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, ácido
glutámico, ácido aspártico o arginina; monosacáridos, disacáridos, y
otros carbohidratos incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa,
manosa o dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA;
azúcar-alcoholes tales como manitol o sorbitol;
contraiones tal como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como
polisorbatos, poloxámeros o PEG.
El polipéptido IL17RLP se formula típicamente en
dichos vehículos a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a
100 mg/ml, preferiblemente 1-10 mg/ml, a un pH de
aproximadamente 3 a 8. Se entenderá que el uso de algunos de los
excipientes, vehículos o estabilizantes anteriores dará como
resultado la formación de sales del polipéptido IL17RLP.
El polipéptido IL17RLP para ser usado para la
administración terapéutica debe ser estéril. La esterilidad se
consigue fácilmente por filtración a través de membranas de
filtración estériles (por ejemplo, membranas de 0,2 micrómetros).
Las composiciones terapéuticas del polipéptido IL17RLP generalmente
se colocan en un envase que tenga un orificio de acceso estéril,
por ejemplo, una bolsa para solución intravenosa o un vial que
tiene un tapón perforable por una aguja de inyección
hipodérmica.
El polipéptido IL17RLP ordinariamente se
conservará en envases unidosis o multidosis, por ejemplo, ampollas
o viales herméticamente cerrados, en forma de una solución acuosa
liofilizada o en forma de una formulación liofilizada para
reconstitución. Como un ejemplo de formulación liofilizada, se
llenan viales de 10 ml con 5 ml de solución acuosa al 1% (p/v) del
polipéptido IL17RLP filtrada en condiciones estériles, y se
liofiliza la mezcla resultante. La solución para infusión se
prepara reconstituyendo el polipéptido IL17RLP liofilizado usando
agua bacteriostática para inyección (WFI).
La composición farmacéutica de la invención
puede ser proporcionada en un paquete o kit farmacéutico que
comprende uno o más envases rellenos con uno o más de los
ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención.
Asociado con dicho(s) envase(s) puede haber un
prospecto en la forma prescrita por una agencia gubernamental que
regula la fabricación, uso o venta de los productos farmacéuticos o
biológicos, que describe la aprobación por la agencia de la
fabricación, uso o venta para administración a seres humanos.
Además, el polipéptido de la presente invención se puede emplear
junto con otros compuestos terapéuticos.
La descripción también proporciona a método de
escrutar compuestos para identificar los que potencian o bloquean
la acción de IL17RLP en células, tal como su interacción con
moléculas que se unen a IL17RLP, tales como moléculas ligandos. Un
agonista es un compuesto que aumenta las funciones biológicas
naturales de IL17RLP o que funciona de un modo similar a IL17RLP,
mientras que los antagonistas disminuyen o eliminan dichas
funciones.
En otro aspecto la descripción proporciona un
método para identificar una proteína ligando que se une
específicamente a un polipéptido IL17RLP. Por ejemplo, puede
prepararse un compartimento celular, tal como una membrana o una de
sus preparaciones, a partir de una célula que expresa una molécula
que se une a IL17RLP. La preparación se incuba con IL17RLP marcado
y los complejos de IL17RLP unidos al ligando o otra proteína de
unión se aíslan y caracterizan de acuerdo con métodos habituales
conocidos en la técnica. Alternativamente, el polipéptido IL17RLP
puede ser unido a un soporte sólido de modo que las moléculas de
unión solubilizadas desde las células se unen a la columna y luego
se eluyen y caracterizan de acuerdo con métodos habituales.
En el análisis para agonistas o antagonistas, se
puede preparar un compartimento celular, tal como una membrana o
una de sus preparaciones a partir de una célula que expresa una
molécula que se une a IL17RLP, tal como una molécula de una vía de
señalización o reguladora modulada por IL17RLP. La preparación se
incuba con IL17RLP marcado en ausencia o presencia de una molécula
candidata que puede ser un agonista o antagonista de IL17RLP. La
capacidad de la molécula candidata para unirse a la molécula de
unión se refleja en una unión disminuida del ligando marcado. Las
moléculas que se unen de modo no justificado, es decir, sin inducir
los efectos de IL17RLP en la unión en la molécula de unión a
IL17RLP, lo más probable es que sean antagonistas. Las moléculas
que se unen bien y desencadenan efectos que son los mismos o
estrechamente relacionados con IL17RLP son agonistas.
Los efectos similares a IL17RLP de agonistas y
antagonistas potenciales pueden ser medidos, por ejemplo,
determinando la actividad de un segundo sistema mensajero que sigue
a la interacción de la molécula candidata con una célula o
preparación celular apropiada, y comparando el efecto con el de
IL17RLP o moléculas que desencadenan los mismos efectos que
IL17RLP. Los segundos sistemas mensajeros que puede ser útiles a
este respecto incluyen, pero sin limitación, segundos sistemas
mensajeros de AMP guanilato-ciclasa, canal iónico o
hidrólisis de fosfoinositida.
Otro ejemplo de un análisis para antagonistas de
IL17RLP es un ensayo competitivo que combina un ligando de
IL17RLP y un antagonista potencial con moléculas receptoras de
IL17RLP unidas a membranas o moléculas receptoras recombinantes de
IL17RLP unidas a membranas en condiciones apropiadas para un ensayo
de inhibición competitiva. El ligando de IL17RLP puede estar
marcado, tal como por radioactividad, de tal modo que el número de
moléculas de ligando de IL17RLP unidas a una molécula receptora
puede ser determinado con precisión para determinar la eficacia del
antagonista potencial.
Los antagonistas potenciales incluyen pequeñas
moléculas orgánicas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se
unen a un polipéptido de la invención y por tanto inhiben o
extinguen sus actividad. Los antagonistas potenciales también
pueden ser pequeñas moléculas orgánicas, un péptido, un polipéptido
tal como una proteína o anticuerpo estrechamente relacionado que se
une a los mismos sitios en una molécula de unión, sin inducir
actividades inducidas por IL17RLP, impidiendo con ello acción de
IL17RLP al excluir de la unión al ligando de IL17RLP.
Otros antagonistas potenciales incluyen
moléculas antisentido. La tecnología antisentido se puede usar para
controlar la expresión de genes a través de DNA o RNA antisentido o
a través de formación de una triple hélice. Las técnicas
antisentido están descritas en cierto número de estudios (por
ejemplo, Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991);
"Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gen
Expression" CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). La formación
de una triple hélice se analiza asimismo en cierto número de
estudios (por ejemplo, Lee, et al., Nucleic Acids
Research 6:3073 (1979); Cooney, et al., Science
241:456 (1988); Dervan, et al., Science 251:1360
(1991)). Los métodos están basados en la unión de un polinucleótido
a un DNA o RNA complementario. Por ejemplo, la porción codificadora
en 5' de un polinucleótido que codifica el polipéptido maduro
descrito en la presente memoria se puede usar para diseñar un
oligonucleótido de RNA antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares
de bases de longitud. Se diseña un oligonucleótido de DNA para que
sea complementario a una región del gen implicado en la
transcripción con lo cual se impide la transcripción y la producción
de IL17RLP. El oligonucleótido de RNA antisentido se hibrida con el
mRNA in vivo y bloquea la traducción de la molécula de mRNA
en el polipéptido IL17RLP. Los oligonucleótidos descritos
anteriormente también pueden ser administrados a células, de tal
modo que el RNA o DNA antisentido pueda ser expresado in vivo
para inhibir la producción de la proteína IL17RLP.
Los agonistas y antagonistas pueden ser
empleados en una composición con un vehículo farmacéuticamente
aceptable, por ejemplo, como se ha descrito antes.
Los antagonistas pueden ser empleados por
ejemplo para inhibir la activación de macrófagos y sus precursores,
y de neutrófilos, basófilos, linfocitos B y algunos subconjuntos de
células T, por ejemplo, células T activadas y CD8 citotóxicas y
células asesinas naturales, en cierta enfermedades
auto-inmunes e inflamatorias crónicas. Ejemplos de
enfermedades auto-inmunes incluyen esclerosis
múltiple, y diabetes dependiente de insulina. Los antagonistas
también se pueden emplear en enfermedades infecciosas incluyendo
silicosis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática impidiendo la
activación de los fagocitos mono-nucleares. También
se pueden emplear para tratar el síndrome hipereosinofílico
idiopático impidiendo las producción de eosinófilos. Los
antagonistas también se pueden emplear para tratar la artritis
reumatoide impidiendo la activación de monocitos en el fluido
sinovial en las articulaciones de los pacientes. La activación de
los monocitos desempeña un papel significativo en la patogénesis de
las artropatías, tanto degenerativas como inflamatorias. Los
antagonistas se pueden emplear para interferir con las cascadas
perjudiciales atribuibles principalmente a la IL-1 y
el TNF, lo que impide la biosíntesis de otras citoquinas
inflamatorias. De este modo los antagonistas se pueden emplear para
impedir la inflamación. Los anticuerpos contra IL17RLP se pueden
emplear para unirse a IL17RLP e inhibir su actividad, para tratar
tales estados descritos anteriormente. Cualquiera de los
antagonistas anteriores se puede emplear en una composición con un
portador o vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, como
se ha descrito antes.
Las moléculas de ácidos nucleicos de la presente
invención también son valiosas para la identificación de
cromosomas. La secuencia es específicamente dianizada y puede
hibridarse con una localización particular en un cromosoma humano
individual. Además, hay la necesidad actual de identificar sitios
particulares en los cromosomas. Actualmente están disponibles pocos
reactivos marcadores de cromosomas basados en datos de la secuencia
real (polimorfismos de repetición) para la marcar la localización
cromosómica. La cartografía de los DNA para los cromosomas es una
primera etapa importante en correlacionar dichas secuencias con
genes asociados con enfermedades.
A este respecto, el cDNA descrito en la presente
memoria se puede usar para clonar DNA genómico de un gen de la
proteína IL17RLP. Esto se puede realizar usando una variedad de
técnicas y genotecas bien conocidas, que generalmente están
disponibles comercialmente. El DNA genómico se usa luego para
cartografiado cromosómico in situ usando técnicas bien
conocidas para este fin.
Además, en algunos casos, las secuencias pueden
ser cartografiadas para cromosomas preparando cebadores de PCR
(preferiblemente de 15-25 pb) a partir de cDNA. El
análisis por ordenador de la región 3' no traducida se usa para
seleccionar rápidamente los cebadores que no se extienden más de un
exón en el DNA genómico, complicando por tanto el proceso de
amplificación. Estos cebadores se usan luego para escrutinio por PCR
de híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos
individuales. La hibridación con fluorescencia in situ
("FISH") de un clon de cDNA a una extensión cromosómica en
metafase se puede usar para proporcionar una localización
cromosómica precisa en una etapa. Esta técnica se puede usar con
sondas de los cDNA tan cortas como de 50 o 60 pb (para una revisión
de esta técnica véase Verma, et al., Human Chromosomes: A
Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York
(1988)).
Una vez que se ha cartografiado una secuencia
hasta una localización cromosómica precisa, la posición física de
la secuencia en el cromosoma puede ser correlacionada con los datos
de los mapas genéticos. Dichos datos se encuentran, por ejemplo, en
la World Wide Web (McKusick, V. Mendelian inheritance In Man,
disponible on-line a través de Johns Hopkins
University, Welch Medical Library). La relación entre genes y
enfermedades que han sido cartografiados en la misma región
cromosómica se identifica luego a través de análisis de unión
(herencia conjunta de genes físicamente adyacentes).
A continuación, es necesario determinar las
diferencias en el cDNA o secuencia genómicas entre individuos
afectados y no afectados. Si se observa una mutación en algunos o
todos los individuos afectados, pero no en ninguno de los
individuos normales entonces es probable que la mutación sea el
agente causante de la enfermedad.
Habiendo descrito generalmente la invención, la
misma se entenderá más fácilmente con referencia a los siguientes
ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no han de
entenderse como limitativos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1
(a)
El vector de expresión bacteriana pQE9 (pD10) se
usa para la expresión bacteriana en este ejemplo. (QIAGEN, Inc.,
9259 Eton Avenue, Chatsworth. CA, 91311). pQE9 codifica resistencia
al antibiótico ampicilina ("Ampr") y contiene un origen de
replicación bacteriano ("ori"), un promotor inducible IPTG, un
sitio de unión a ribosoma ("RBS"), seis codones que codifican
residuos de histidina que permiten la purificación por afinidad
usando resina de afinidad de níquel-ácido nitrilotriacético
("Ni-NTA") vendida por QIAGEN, Inc.,
supra, y sitios de escisión adecuados por una sola enzima de
restricción. Estos elementos están dispuestos de tal modo que el
fragmento de DNA insertado que codifica un polipéptido expresa ese
polipéptido con los seis residuos de His (es decir, una "etiqueta
6 X His") unidos covalentemente al extremo amino de dicho
polipéptido.
La secuencia de DNA que codifica la porción
deseada de la proteína IL17RLP que comprende el dominio extracelular
de la secuencia de aminoácidos de IL17RLP se amplifica a partir del
clon de cDNA depositado usando cebadores oligonucleotídicos de PCR
que asocian a las secuencias amino-terminales de la
porción deseada de la proteína IL17RLP y las secuencias de la
construcción 3' depositada a la secuencia que codifica el cDNA. A
las secuencias de cebador en 5' y 3' respectivamente se añaden
nucleótidos adicionales que contienen sitios de restricción para
facilitar la clonación en el vector pQE9. Para clonar el dominio
extracelular de la proteína IL17RLP, el cebador en 5' tiene la
secuencia 5'CGC CCA TGG CCG ACC GTT CAA TGT GGC TCT GAA AC 3'
(SEQ ID NO:6) que contiene el sitio de restricción Nco I
subrayado seguido por 26 nucleótidos de la secuencia codificadora
amino-terminal de la secuencia de IL17RLP madura en
la SEQ ID NO:2. Naturalmente un experto ordinario en la técnica
apreciaría que el punto en la secuencia codificadora de la proteína
en donde comienza el cebador en 5' puede ser variado para
amplificar un segmento de DNA que codifica cualquier porción
deseada de la proteína IL17RLP completa más corta o más larga que
el dominio extracelular de la proteína. El cebador en 3' tiene la
secuencia 5'CGC AAG CTT CCA GCC TCC CGG CTT GC 3'(SEQ ID
NO:7) que contiene el sitio de restricción Hind III subrayado
seguido por 17 nucleótidos complementarios al extremo 3' de la
secuencia codificadora de la secuencia de DNA de IL17RLP de las
Figuras 1A,1B y 1C.
El fragmento de DNA de IL17RLP amplificado y el
vector pQE9 se digieren con Nco I y Hind III y los DNA
digeridos se ligan a continuación. La inserción del DNA de IL17RLP
en el vector pQE9 restringido coloca la región codificadora de la
proteína IL17RLP aguas abajo (hacia el extremo 3') del promotor
inducible por IPTG y en el marco con un AUG iniciador y los seis
codones de histidina.
La mezcla de ligación se transforma en células
de E. coli competentes usando métodos estándares, tales como
los descritos por Sambrook y colegas (Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)). La cepa de E. coli
M15/rep4, que contienen múltiples copias del plásmido pREP4, que
expresa el represor lac y confiere resistencia a la
kanamicina ("Kanr") se usa para llevar a cabo el ejemplo
ilustrativo descrito en la presente memoria. Esta cepa que es solo
una de las muchas que son adecuadas para expresar la proteína
IL17RLP, está disponible en el comercio (QIAGEN, Inc.,
supra). Los transformantes se identifican por su capacidad
para crecer en placas de LB en presencia de ampicilina y
kanamicina. El DNA del plásmido se aísla de las colonias resistentes
y la identidad del DNA clonado se confirma por análisis de
restricción, PCR y secuenciación del DNA.
Los clones que contienen las construcciones
deseadas se hacen crecer una noche ("O/N") en cultivo líquido
en medios LB suplementados tanto con ampicilina (100 \mug/ml) como
kanamicina (25 \mug/ml). El cultivo de O/N se usa para inocular
un cultivo grande, a una dilución de aproximadamente 1:25 a 1:250.
Las células se hacen crecer hasta una densidad óptica a 600 nm
("DO600") de entre 0,4 y 0,6. Luego se añade
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido
("IPTG") hasta una concentración final de 1 mM para inducir la
transcripción a partir del promotor sensible al represor
lac, inactivando el represor lacI. Las células se
incuban subsiguientemente más durante 3 a 4 horas. A continuación
las células se cosechan por centrifugación.
Luego las células se agitan durante
3-4 horas a 4ºC en guanidina.HCl 6M a pH 8. El
residuo de células se retira por centrifugación, y el líquido
sobrenadante que contiene la IL17RLP se aísla en una columna cargada
con resina de afinidad de níquel-ácido
nitrilo-triacético ("Ni-NTA")
(QiAGEN, Inc., supra). Las proteínas con una etiqueta 6 x
His se unen a la resina Ni-NTA con alta afinidad y
pueden ser purificadas por un sencillo método de una sola etapa
(para detalles véase: The QIA expressionist, 1995, QIAGEN,
Inc., supra). Expresado brevemente, el liquido sobrenadante
se carga en la columna en guanidina.HCl 6M, a pH 8, la columna se
lava primeramente con 10 volúmenes de guanidina.HCl 6M, a pH 8,
luego se lava con 10 volúmenes de guanidina.HCl 6M a pH 6, y
finalmente la IL17RLP se eluye con guanidina.HCl, 6M a pH 5.
La proteína purificada se renaturaliza luego
dializándola contra solución salina tamponada con fosfato (PBS) o
acetato de sodio 50 mM, tampón de pH 6 más NaCl 200 mM.
Alternativamente, la proteína se puede replegar satisfactoriamente
mientras se encuentra inmovilizada en la columna de
Ni-NTA. Las condiciones recomendadas son como
sigue: renaturalizar usando un gradiente lineal de urea
6M-1M en NaCl 500 mM, glicerol al 20%, Tris/HCl 20
mM a pH 7,4, que contiene inhibidores de proteasa. La
renaturalización debe realizarse durante un período de 1,5 horas o
más. Después de la renaturalización las proteínas pueden ser eluidas
por la adición de immidazol 250 mM. El imidazol se elimina por una
etapa de diálisis final contra PBS o acetato de sodio 50 mM, tampón
de pH 6 más NaCl 200 mM. La proteína purificada se conserva a 4ºC o
se congela a -80ºC.
Los siguientes métodos alternativos pueden ser
usados para purificar la IL17RLP expresada en E. coli cuando
está presente en la forma de cuerpos de inclusión. A menos que se
especifique lo contrario todas las siguientes etapas se realzan a
4-10ºC.
Tras completarse la fase de producción de la
fermentación de E. coli, el cultivo de células se enfría a
4-10ºC y las células se cosechan por centrifugación
continua a 15.000 rpm (Heraeus Sepatech) sobre la base del
rendimiento de proteína esperado por peso unitario de pasta celular
y la cantidad de proteína purificada requerida, una cantidad
apropiada de pasta celular, en peso, se suspende en una solución
tampón que contiene Tris100 mM EDTA, 50 mM, a pH 7,4. Las células
se dispersan hasta obtener una suspensión homogénea usando un
mezclador de alto cizallamiento.
Las células se lisaron luego haciendo pasar la
solución a través de un microfluidizador (Microfuidics, Corp. o APV
Gaulin, Inc.) dos veces a 27,57 - 41,37 MPa
(4000-6000 psi). El homogeneizado se mezcla luego
con solución de NaCl hasta una concentración final de NaCl 0,5M,
seguido por centrifugación a 7000 x g durante 15 minutos. El
sedimento resultante se lava de nuevo usando NaCl 0,5M, Tris 100 mM,
EDTA 50 mM, a pH 7,4.
Los cuerpos de inclusión lavados resultantes se
solubilizan con hidrocloruro de guanidina (GuHCl) 1,5 M durante
2-4 horas. Después de una centrifugación a 7000 x g
durante 15 minutos, se desecha el sedimento y el líquido
sobrenadante que contiene el polipéptido IL17RLP se incuba a 4ºC
durante una noche para permitir más extracción de GuHCl.
Después de centrifugación a alta velocidad
(30.000 x g) para separar las partículas insolubles, la proteína
solubilizada en GuHCl se repliega mezclando rápidamente el extracto
en GuHCl con 20 volúmenes de tampón que contiene acetato de sodio
50 mM, a pH 4,5, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM por agitación vigorosa. La
solución de proteína diluida y replegada se conserva a 4ºC sin
mezcla durante 12 horas antes de más etapas de purificación.
Para clarificar la solución del polipéptido
IL17RLP replegado, se emplea una unidad de filtración tangencial
previamente preparada equipada con un filtro de membrana de 0,16
\mum con un área superficial apropiada (por ejemplo, Filtron),
equilibrada con acetato de sodio 40 mM, a pH 6,0. La muestra
filtrada se carga en una resina de cambio catiónico (por ejemplo,
Poros HS-50, Perseptive Biosystems). La columna se
lava con acetato de sodio 40 mM, a pH 6,0 y se eluye con NaCl 250
mM, 500 mM, 1000 mM, y 1500 mM en el mismo tampón por etapas. La
absorbancia a 280 mm del efluente se monitoriza continuamente. Las
fracciones se recogen y se analizan adicionalmente por
SDS-PAGE.
Las fracciones que contienen el polipéptido
IL17RLP se agrupan luego y se mezclan con 4 volúmenes de agua. La
muestra diluida se carga luego en un conjunto de columnas en tándem
previamente preparadas cargadas con resina de cambio aniónico
fuerte (Poros HQ-50, Perseptive Biosystems) y
aniónico débil (Poros CM-20, Perseptive
Biosystems). Las columnas se equilibran con acetato de sodio 40 mM,
a pH 6.0. Ambas columnas se lavan con acetato de sodio 40 mM, a pH
6,0, NaCl 200 mM. La columna de CM-20 se eluye luego
usando un gradiente lineal en 10 volúmenes de columna que varía
desde NaCl 0,2 M, acetato de sodio 50 mM, a pH 6.0 hasta NaCl 1,0 M,
acetato de sodio 50 mM, a pH 6,5. Las fracciones se recogen bajo
monitorización constante a A_{260} del efluente. Las fracciones
que contienen el polipéptido IL17RLP (determinado, por ejemplo, en
SDS-PAGE) al 16% se reúnen a continuación.
El polipéptido IL17RLP resultante exhibe más de
95% de pureza después de las anteriores etapas de replegado y
purificación. No se observan bandas importantes de contaminantes en
el gel de SDS-PAGE al 16% teñido con azul de
Commasie cuando se carga con 5 \mug de proteína purificada. La
proteína purificada se analiza también respecto a la contaminación
por endotoxina/LPS, y típicamente el contenido de LPS es menor que
0,1 ng/ml de acuerdo con el ensayo LAL.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
En este ejemplo ilustrativo se usa el vector
lanzadera plasmídico pA2 para insertar el DNA clonado que codifica
la proteína completa, incluyendo su señal secretoria (delantera)
naturalmente asociada, en un baculovirus para expresar la proteína
IL17RLP madura, usando métodos estándares como los descritos por
Summers y colegas (A Manual of Methods for Baculovirus Vectors
and insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural
Experimental Station Bulletin Nº 1555 (1987)). Este vector de
expresión contiene el promotor de polihedrina fuerte del virus de
la polihedrosis nuclear Autographa californica (AcMNPV)
seguido por sitios de restricción convenientes, tal como Bam
HI, Xba I y Asp 718. El sitio de poliadenilación del
virus de simios 40 ("SV40") se usa para una poliadenilación
eficaz. Para una fácil selección de virus recombinantes, el plásmido
contiene el gen de la beta-galactosidasa de E.
coli bajo el control de un promotor débil de Drosophila
promotor en la misma orientación, seguido por la señal de
poliadenilación del gen de polihedrina. Los genes insertados están
flanqueados en ambos lados por secuencias virales para
recombinación homóloga mediada por células con DNA viral de tipo
silvestre para generar un virus viable que exprese el polinucleótido
clonado.
Podrían ser usados muchos otros vectores
baculovirus en lugar del vector anterior, tal como pAc373, pVL941
y pAcIM1, como apreciaría fácilmente un experto en la técnica,
siempre y cuando la construcción proporcione señales apropiadamente
localizadas para la transcripción, traducción, secreción y
similares, incluyendo un péptido señal y un codón AUG en marco
según se requiera. Dichos vectores están descritos, por ejemplo,
por Luckow y colaboradores (Virology
170:21-39 (1989)). La de secuencia cDNA que codifica
el dominio extracelular de la proteína IL17RLP en el clon
depositado, incluyendo el codón de iniciación AUG y la secuencia
delantera naturalmente asociada mostrada en la SEQ ID NO:2, se
amplifica usando cebadores oligonucleotídicos para PCR
correspondientes a las secuencias 5' y 3' del gen. El cebador en
5' tiene la secuencia 5'CGC GGA TCC ATG TCG CTC GTG CTG CTA
AGC CTG G 3' (SEQ ID NO:8) que contiene subrayado el sito de la
enzima de restricción Bam HI, una señal eficaz para la iniciación
de la traducción en células eucarióticas (Kozak, M., J. Mol.
Biol. 196:947-950 (1987)), seguido por 25 de los
nucleótidos de la secuencia de la proteína IL17RLP completa
mostrada en las Figuras 1A, 1B y 1C, empezando con el codón de
iniciación AUG. El cebador en 3' tiene la secuencia 5'CGC GGT
ACC CCA GCC TCC CGG CTT GC 3' (SEQ ID NO:9) que contiene
subrayado el sitio de restricción Asp 718 seguido por 17
nucleótidos complementarios a la secuencia no codificadora en 3' en
las Figuras 1A, 1B y 1C.
El fragmento amplificado se aísla en un gel de
agarosa al 1% usando un kit comercialmente disponible
("Genclean," BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). El fragmento se
digiere luego con Bam HI y Asp 718 y se purifica de
nuevo en un gel de agarosa al 1%. Este fragmento se denomina F1 en
la presente memoria.
El plásmido se digiere con la enzima de
restricción Bam HI y Asp 718 y opcionalmente, puede
ser desfosforilado usando fosfatasa intestinal de vaca empleando
métodos habituales conocidos en la técnica. El DNA se aísla luego
en un gel de agarosa al 1% usando un kit comercialmente disponible
("Genclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). Este DNA vector se
denomina "V1" en la presente memoria.
El fragmento Fl y el plásmido V1 desfosforilado
se ligan con DNA ligasa de T4. HB101de E. coli u otras
células hospedantes de E. coli adecuados tal como
XL-1 Blue (Statagene Cloning Systems, La Jolla, CA)
se transforman con la mezcla de ligación y se extienden sobre
placas de cultivo. Se identifican las bacterias que contiene el
plásmido con el gen IL17RLP humano digeriendo el DNA de colonias
individuales usando Bam HI y Asp 718 y analizando
luego el producto de digestión por electroforesis en gel. La
secuencia del fragmento clonado se confirma por secuenciación del
DNA. Este plásmido se denomina pA2 IL17RLP en la presente
memoria.
Cinco \mug del plásmido pA2 IL17RLP se
co-transfectan con 1,0 \mug de un DNA de
baculovirus linealizado comercialmente disponible
("BaculoGold^{TM} baculovirus DNA", Pharmingen, San Diego,
CA), usando métodos de lipofección descritos por Feigner y colegas
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417
(1987)). Un \mug del DNA del virus BaculoGold^{TM} y 5 \mug
del plásmido pA2 IL17RLP se mezclan en un pocillo estéril de una
placa de microtitulación que contiene 50 \mul de medio de Grace
exento de suero (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD).
Después, 10 \mul de Lipofectina más 90 \mul de medio de Grace se
añaden, mezclan e incuban durante 15 minutos a temperatura
ambiente. Luego la mezcla de transfección se añade gota a gota a
células de insectos Sf9 (ATCC CRL 1711) sembradas en una placa de
cultivo de tejidos de 35 mm con 1 ml de medio de Grace sin suero.
La placa se incuba luego durante 5 horas a 27ºC. La solución de
transfección se retira luego de la placa y se añade 1 ml de medio
de insectos de Grace suplementado con suero de ternera fetal al
10%. El cultivo se continúa luego a 27ºC durante cuatro días.
Después de cuatro días se recoge el líquido
sobrenadante y se realiza un ensayo en placa, como el descrito por
Summers y Smith (supra). Se usa un gel de agarosa con "Blue
Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) para permitir la
fácil identificación y aislamiento de los clones que expresan
gal, que producen placas teñidas de azul. (Una descripción
detallada de un "ensayo en placas " de este tipo puede
encontrarse también en la guía del usuario para cultivo de células
de insectos y baculovirología distribuida por Life Technologies
Inc., Gaithersburg, páginas 9-10). Después de la
incubación apropiada, las placas teñidas de azul se recogen con la
punta de una micropipeta (por ejemplo, Eppendorf). El agar que
contiene los virus recombinantes se resuspende luego en un tubo de
microcentrifuga que contiene 200 \mul de medio de Grace y la
suspensión que contiene baculovirus recombinante se usa para
infectar células Sf9 sembradas en platos de 35 mm. Cuatro días más
tarde se cosechan los líquidos sobrenadantes de estos platos de
cultivo y luego se conservan a 4ºC. El virus recombinante se
denomina V-IL17RLP.
Para verificar la expresión del gen IL17RLP se
hacen crecer células Sf9 en medio de Grace suplementado con FBS al
10% inactivado por calor. Las células se infectan con el baculovirus
recombinante V-IL17RLP a una multiplicidad de
infección ("MOI") de aproximadamente 2. Si se desean proteínas
radiomarcadas, 6 horas más tarde se retira el medio y se reemplaza
con medio SF900 II menos metionina y cisteína (disponible de Life
Technologies Inc., Rockville, MD). Después de 42 horas se añaden 5
\muCi de ^{35}S-metionina y 5 \muCi de
^{35}S-cisteína (disponibles de Amersham). Las
células se incuban más durante 16 horas y luego se cosechan por
centrifugación. Las proteínas del líquido sobrenadante así como las
proteínas intracelulares se analizan por SDS-PAGE
seguido por auto-radiografía (si están
radiomarcadas).
La microsecuenciación de la secuencia de
aminoácidos del extremo amino de la proteína purificada se puede
usar para determinar la secuencia amino terminal del dominio
extracelular de la proteína IL17RLP, y por tanto el punto de
escisión y la longitud del péptido señal secretorio naturalmente
asociado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Un vector de expresión en mamíferos típico
contiene el elemento promotor, que media la iniciación de la
transcripción del mRNA, la secuencia codificadora de la proteína, y
las señales requeridas para la terminación de la transcripción y la
poliadenilación del transcrito. Otros elementos incluyen
potenciadores, secuencias de Kozak y secuencias intercalantes
flanqueadas por sitios donadores y aceptores para el empalme de RNA.
Una transcripción altamente eficaz puede ser conseguida con los
promotores temprano y tardío de SV40, las repeticiones terminales
largas (LTR) de retrovirus, por ejemplo, RSV, HTLVI, HIVI y el
promotor temprano de citomegalovirus (CMV). Sin embargo, también se
pueden usar elementos celulares (por ejemplo, el promotor de actina
humano). Vectores de expresión adecuados para uso en llevar a la
práctica la presente invención incluyen, por ejemplo, vectores,
tales como pSVL y pMSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pRSVcat (ATCC
37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) y pBC12Ml (ATCC 67109). Células
hospedantes de mamíferos que podrían usarse incluyen, HeLa humanas,
293, H9 y células Jurkat, NIH3T3 de ratón y células C127, Cos 1,
Cos 7 y CV1, células QC1-3 de codorniz, células L
de ratón y células de ovario de hámster chino (CHO).
Alternativamente, el gen puede ser expresado en
líneas celulares estables que contienen el gen integrado en un
cromosoma. La co-transfección con un marcador
seleccionable, tal como dhfr, gpt, neomicina, higromicina
permite la identificación y aislamiento de las células
transfectadas.
El gen transfectado también puede ser
amplificado para expresar grandes cantidades de la proteína
codificada. El marcador de DHFR (dihidrofolato reductasa) es útil
para desarrollar líneas celulares que llevan varios cientos o
incluso varios miles de copias de interés. Otro marcador de
selección útil es la enzima glutamina-sintasa (GS;
Murphy, et al., Biochem J. 227:277-279
(1991); Bebbington, et al., BioTechnology
10:169-175 (1992)). Usando estos marcadores, las
células de mamífero se hacen crecer en un medio selectivo y se
seleccionan las células con la resistencia más alta. Estas líneas
celulares contienen el (los)gen(es)
integrado(s) en un cromosoma. Las células de ovario de
hámster chino (CHO) y NSO se usan frecuentemente para la producción
de proteínas.
Los vectores de expresión pC1 y pC4 contienen el
promotor fuerte(LTR) del virus del sarcoma de Rous (Cullen,
et al., Mol. Cell. Biol. 5:438-447
(1985)) más un fragmento del potenciador de CMV (Boshart, et
al., Cell 41:521-530 (1985)). Sitios de
clonación múltiples, por ejemplo, con los sitios de escisión por las
enzimas Bam HI, Xba I y Asp 718, facilitan la
clonación del gen de interés. Los vectores contienen además el
intrón en 3', la señal de poliadenilación y terminación del gen de
la proinsulina de rata.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3(a)
El plásmido de expresión, p1L17RLPHA se prepara
clonando una porción del cDNA que codifica el dominio extracelular
de la proteína IL17RLP en el vector de expresión pcDNAl/Amp o
pcDNAIII (que se puede obtener en Invitrogen, Inc.).
El vector de expresión pcDNAl/amp contiene: (1)
un origen de replicación de E. coli eficaz para la
propagación en E. coli y otras células procarióticas; (2)
un gen de resistencia a la ampicilina para la selección células
procarióticas que contienen plásmidos; (3) un origen de replicación
de SV40 para la propagación en células eucarióticas; (4) un
promotor de CMV, un polienlazador, un intrón de SV40; (5) varios
codones que codifican un fragmento de hemaglutinina (es decir, una
etiqueta "HA" para facilitar la purificación) seguido por un
codón de terminación y una señal de poliadenilación dispuestos de
tal modo que el cDNA puede ser clonado convenientemente bajo el
control de expresión del promotor de CMV y unido operativamente al
intrón de SV40 y la señal de poliadenilación señal por medio de
sitios de restricción en el polienlazador. La etiqueta HA
corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina del
virus de la gripe descrita por Wilson y colegas (Cell 37:767
(1984)). La fusión de la etiqueta HA a la proteína diana permite la
fácil detección y recuperación de la proteína recombinante con un
anticuerpo que reconoce el epítopo HA. El pcDNAIII contiene,
además, el marcador seleccionable de neomicina. Un fragmento de DNA
que codifica el dominio extracelular del polipéptido IL17RLP se
clona en la región del polienlazador del vector de modo que la
expresión de la proteína recombinante es dirigida por el promotor
de CMV. La estrategia de la construcción del plásmido es como sigue.
El cDNA de IL17RLP del clon depositado se amplifica usando
cebadores que contienen sitios de restricción convenientes, tantos
como los descritos antes para la construcción de vectores para la
expresión de IL17RLP en E. coli. Los cebadores adecuados
incluyen los siguientes, que se usan en este ejemplo. El cebador en
5', que contiene el sitio Bam HI subrayado, una secuencia de Kozak,
un codón de iniciación AUG, y los 25 nucleótidos de la región 5'
codificadora del dominio extracelular del polipéptido IL17RLP, tiene
la siguiente secuencia: 5' GCC GGA TCC GCC ACC ATG AAC TCC
TTC TCC ACA AGC GCC TTC GGT CCA GTT GCC TTC TCC CTG GGG CTG CTC CTG
GTG TTG CCT GCT GCC TTC CCT GCC CCA GTA TGT CGC TCG TGC TGC TAA GCC
TGG 3' (SEQ ID NO:10). El cebador en 3', que contiene Asp 718 y 17
subrayados de los nucleótidos complementarios a la secuencia
codificadora 3' inmediatamente antes del codón de parada, tiene la
siguiente secuencia: 5' GGC CGG GTA CCC CAG CCT CCC GGC TTG C
3' (SEQ ID NO:11).
El fragmento de DNA amplificado por PCR y el
vector, pcDNAIIAmp, se digerieron con Bam HI y Asp 718
y luego se ligaron. La mezcla de ligación se transforma en la cepa
E. coli SURE (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA
92037), y el cultivo transformado se cultiva en placas en medios de
ampicilina que luego se incuban para permitir el crecimiento de
colonias resistentes a la ampicilina. El DNA del plásmido se aísla
luego de las colonias resistentes y se examina por análisis de
restricción u otros medios para detectar la presencia del fragmento
que codifica el dominio extracelular del polipéptido IL17RLP
Para la expresión de IL17RLP recombinante, se
transfectan células COS con un vector de expresión, tal como el
descrito antes, usando DEAE-dextrano, como se
describe, por ejemplo, por Sambrook y colegas (Molecular
Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, New York (1989)). Las células se incuban en
condiciones para la expresión de IL17RLP por el vector.
La expresión de la proteína de fusión
IL17RLP-HA se detecta por radiomarcado e
inmunoprecipitación, usando métodos descrito en, por ejemplo Harlow
y colegas (Antibodies: A Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York
(1988)). Para este fin, dos días después de la transfección, las
células se marcan por incubación en medios que contienen
^{35}S-cisteína durante 8 horas. Las células y
los medios se recogen, y las células se lavan y luego se lisan con
tampón RIPA que contiene detergente: NaCl 150 mM,
NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, NP-40 al
1%, DOC al 0,5%, TRIS 50 mM, pH 7.5, como se describe por Wilson y
colegas (supra). Las proteínas se precipitan del lisado de
células y de los medios de cultivo usando un anticuerpo monoclonal
específico de HA. Las proteínas precipitadas se analizan luego por
SDS-PAGE y se auto-radiografían. En
el lisado celular se observa un producto de expresión del tamaño
esperado, que no se ve en los controles negativos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3(b)
El vector pC4 se usa para la expresión del
polipéptido IL17RLP. El plásmido pC4 es un derivado del plásmido
pSV2-dhfr (ATCC Nº de acceso 37146). El plásmido
contiene el gen DHFR de ratón bajo el control del promotor temprano
de SV40. Pueden seleccionarse células de ovario de hámster chino u
otras que carecen de actividad de dihidrofolato que se transfectan
con estos plásmidos haciéndolas crecer en un medio selectivo (MEM
menos alfa, Life Technologies) suplementado con el agente
quimioterapéutico metotrexato. La amplificación de los genes DHFR
en células resistentes a metotrexato (MTX) ha sido bien documentada
(véase, por ejemplo, Alt, F. W., et al., J. Biol.
Chem. 253:1357-1370 (1978); Hamlin, J. L. y Ma,
C. Biochem. et Biophys. Acta, 1097:107-143
(1990); Page, M. J. y Sydenham, M. A. Biotechnology
9:64-68 (1991)). Las células crecidas en
concentraciones crecientes de MTX desarrollan resistencia al
fármaco sobreproduciendo la enzima diana, DHFR, como resultado de
la amplificación del gen DHFR. Si un segundo gen está unido al gen
DHFR, usualmente es co-amplificado y
sobre-expresado. Se sabe en la técnica que esté
método se puede usar para desarrollar líneas celulares que llevan
más de 1.000 copias del (de los) gen(es)
amplificado(s). Subsiguientemente, cuando se retira el
metotrexato, se obtienen las líneas celulares que contienen el gen
amplificado integrado en uno o más cromosoma(s) de la célula
hospedante.
El plásmido pC4 contiene para expresar el gen de
interés el promotor fuerte la repetición terminal larga (LTR) del
virus de sarcoma de Rous (Cullen, et al., Mol. Cell.
Biol. 5:438-447 (1985)) más un fragmento aislado
del potenciador del gen temprano inmediato de citomegalovirus
humano (CMV; Boshart, et al., Cell
41:521-530 (1985)). Aguas abajo del promotor (hacia
el extremo 3') están los siguientes sitios únicos por enzimas de
restricción que permiten la integración de los genes: Bam HI,
Xba I, y Asp 718. Detrás de estos sitios de clonación
el plásmido contiene el intrón en 3' y el sitio de poliadenilación
del gen de la preproinsulina de rata. Para la expresión también
pueden usarse otros promotores de alta eficacia, por ejemplo, el
promotor de actina f3 humano, los promotores temprano y tardío de
SV40 o las repeticiones terminales largas de otros retrovirus, por
ejemplo, HIV y HTLVI. Se pueden usar sistemas de expresión de genes
Tet-Off y Tet-On de Clontech y
sistemas similares para expresar el polipéptido IL17RLP en un modo
regulado en células de mamíferos (Gossen, M., y Bujard, H. Proc.
Natl. Acad Sci. USA 89:5547-5551 (1992)). Para
la poliadenilación del mRNA se pueden usar asimismo otras señales,
por ejemplo, de genes de la hormona del crecimiento o de globina
humanos. Las líneas celulares estables que llevan un gen de interés
integrado en los cromosomas también se pueden seleccionar por
co-transfección con un marcador seleccionable tal
como gpt, G418 o higromicina. Es ventajoso usar más de un
marcador seleccionable al comienzo, por ejemplo, G418 más
metotrexato.
El plásmido pC4 se digiere con las enzimas de
restricción Bam HI y Asp 718 y luego se desfosforila
usando fosfatasa intestinal de ternera por métodos conocidos en la
técnica. El vector se aísla luego en un gel al 1% de agarosa. La
secuencia de DNA que codifica el dominio extracelular del
polipéptido IL17RLP se amplifica usando cebadores
oligonucleotídicos de PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3'
de la porción deseada del gen. El cebador en 5' que contiene el
sitio Bam HI subrayado, una secuencia Kozak, un codón de
iniciación AUG, y 25 nucleótidos de la región codificadora 5'del
dominio extracelular del polipéptido IL17RLP, tiene la siguiente
secuencia: 5' CTA GCC GGA TCC GCC ACC ATG TCG CTC GTG CTG CTA
AGC CTG G 3' (SEQ ID NO:12). El cebador en 3', que contienen los
nucleótidos Asp 718 y 17 subrayados complementarios a la secuencia
codificadora en 3' inmediatamente antes del codón de parada como se
muestra en la Figuras 1A. 1B, y1C (SEQ ID NO:1), tiene la siguiente
secuencia: 5' GGC CGG GTA CCC CAG CCT CCC GGC TTG C 3' (SEQ
ID NO:13).
El fragmento se digiere con las endonucleasas
Bam HI y Asp 718 y luego se purifica de nuevo en un
gel de agarosa al 1%. El fragmento aislado y el vector
desfosforilado se ligan luego con DNA ligasa de T4. Luego se
transforman células de E. coli HB1 o XL-1
Blue y se identifican las bacterias que contienen el fragmento
insertado en el plásmido pC4 usando, por ejemplo, análisis por
enzimas de restricción.
Para la transfección se usan células de ovario
de hámster chino que carecen del gen DHFR activo. 5 \mug del
plásmido de expresión pC4 es co-transfectan con 0,5
\mug del plásmido pSVneo usando lipofectina (Feigner, et at.,
supra). El plásmido pSV2-neo contiene un
marcador seleccionable dominante, el gen neo de Tn5 que codifica
una enzima que confiere resistencia a un grupo de antibióticos
incluyendo G418. Las células se siembran en medio MEM menos alfa
suplementado con 1 mg/ml de G418. Después de 2 días, las células se
tripsinizan y se siembran en placas de clonación de hibridomas
(Greiner, Alemania) en MEM menos alfa suplementado con 10, 25 o 50
ng/ml de metotrexato más 1 mg/ml de G418. Después de aproximadamente
10-14 días los clones individuales se tripsinizan y
luego se siembran en placas petri de 6 pocillos o matraces de 10 ml
usando diferentes concentraciones de metotrexato (50 nM, 100 nM,
200 nM, 400 nM, 800 nM). Los clones que crecen a las concentraciones
más altas de metotrexato se transfieren luego a nuevas placas de 6
pocillos que contienen incluso mayores concentraciones de
metotrexato (1 \muM, 2 \muM, 5 \muM, 10 mM, 20 mM). Se repite
el mismo procedimiento hasta que se obtienen clones que crecen a
una concentración de 100-200 \muM. La expresión
del producto génico deseado se analiza, por ejemplo, por
SDS-PAGE y transferencia Western o por análisis de
HPLC inversa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se realiza un análisis por transferencia
Northern para examinar la expresión del gen IL17RLP en tejidos
humanos, usando los métodos descritos por, entre otros, Sambrook y
colegas (supra). Una sonda de cDNA que contiene la secuencia
completa de nucleótidos de la proteína IL17RLP (SEQ ID NO:1) se
marca con ^{32}Pusando el sistema de marcado de DNA
rediprime^{TM} (Amersham Life Science), de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Después del marcaje, la sonda se
purifica usando una columna CHROMA SPIN-100^{TM}
(Clontech Laboratories, Inc.), de acuerdo con el número de
protocolo del fabricante PT1200-1. La sonda marcada
y purificada se usa luego para examinar diversos tejidos humanos en
cuanto a su contenido en de mRNA de IL17RLP.
Las transferencias Northern de tejidos múltiples
(MTN) que contienen diversos tejidos humanos (H) o tejidos del
sistema inmune humano (IM) se obtienen a Clontech y se examinan con
la sonda marcada usando solución de hibridación ExpressHyb^{TM}
(Clontech) de acuerdo con el número de protocolo del fabricante
PT1190-1. Después de la hibridación y lavado, las
transferencias se montan y exponen a una película -70ºC durante una
noche, y las películas se revelan de acuerdo con métodos
estándares.
<110> Shi, Yanggu
\hskip1cmRuben, Steve M.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteína similar al receptor de
interleuquina 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PF398
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> no cedida
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
16-09-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/059.133
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
17-09-1997
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1816
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(1287)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido de igualación
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (67)..(1287)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)..(66)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 426
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 426
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 409
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (65)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (148)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (160)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (362)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (373)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (388)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (406)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 327
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (39)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (42)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (44) -
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (53)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (106)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (120)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (128)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (163)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (173)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (210)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (223)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (233)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (238)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (241)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (247)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (251)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (261)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (267)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (269)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (274)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (277)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (279)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (285)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (289)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (293)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (295)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (302)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (305)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> aspectos misceláneos
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (312)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n igual a a, t, g o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcccatggc cgaccgttca atgtggctct gaaac
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcccatggc cgaccgttca atgtggctct gaaac
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatcca tgtcgctcgt gctgctaagc ctgg
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggtaccc cagcctcccg gcttgc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccgggtac cccagcctcc cggcttgc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagccggat ccgccaccat gtcgctcgtg ctgctaagcc tgg
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccgggtac cccagcctcc cggcttgc
\hfill28
Claims (13)
1. Una molécula de ácido nucleico seleccionada
del grupo que consiste en:
- (a)
- moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos desde Pro en la posición 1 hasta Trp en la posición 271 de la SEQ ID NO: 2; y
- (b)
- moléculas de ácido nucleico que consisten en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 desde la posición 67 hasta la posición 879 de la SEQ ID NO: 1;
o la cadena complementaria de dicha molécula de
ácido nucleico.
2. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, que es DNA o RNA.
3. Un método para preparar un vector
recombinante, que comprende insertar la molécula de ácido nucleico
de la reivindicación 1 ó 2 en un vector.
4. Un vector recombinante que contienen la
molécula de ácido nucleico de reivindicación 1 ó 2 producida por el
método de la reivindicación 3.
5. Un método de preparar una célula hospedante
recombinante que comprenden introducir el vector recombinante de la
reivindicación 4 en una célula hospedante.
6. Una célula hospedante recombinante, que
comprende el vector de la reivindicación 4 o producido por el método
de la reivindicación 5.
7. Un método recombinante para producir un
polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1 ó 2, que comprende cultivar la célula hospedante
recombinante de la reivindicación 6 en condiciones tales que se
exprese dicho polipéptido y recuperar dicho polipéptido.
8. Un polipéptido codificado por la molécula de
ácido nucleico de la reivindicación 1 ó 2 u obtenible por los
métodos de la reivindicación 7.
9. Un anticuerpo que se une específicamente a un
polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos desde Pro
en la posición 1 hasta Trp en la posición 271 de la SEQ ID NO:
2.
10. El anticuerpo de la reivindicación 9, en
donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un fragmento de
anticuerpo, un anticuerpo anti-idiotípico o un
anticuerpo monoclonal quimérico humanizado.
11. El anticuerpo de la reivindicación 10, en
donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo
monoclonal quimérico humanizado.
12. Una composición farmacéutica que comprende
la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 ó 2, el
polipéptido de la reivindicación 8 o un DNA que codifica y es capaz
de expresar dicho polipéptido in vivo, el anticuerpo de una
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 y opcionalmente un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. Una composición para diagnóstico que
comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 ó 2
o el de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.
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