ES2333532T3 - Extraccion de acidos usando particulas de diametro paqueño magneticamente respondedoras. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para unir de forma reversible al menos una molécula de ácido nucleico, que comprende: (i) crear una mezcla en un contenedor, en el que la mezcla comprende una muestra que comprende al menos una molécula de ácido nucleico, al menos una partícula magnéticamente respondedora que tiene un diámetro de aproximadamente 0,1 µm a aproximadamente 0,3 µm, y un resto; y (ii) proporcionar la mezcla con un pH ácido, de modo que se alteran las propiedades de carga superficial de la al menos una partícula respondedora magnéticamente; en el que la alteración en las propiedades de carga superficial de la al menos una partícula respondedora magnéticamente es tal que la al menos una molécula de ácido nucleico pasa a unirse de forma inespecífica a la al menos una partícula magnéticamente respondedora para formar un complejo.
Description
Extracción de ácidos nucleicos usando partículas
de diámetro pequeño magnéticamente respondedoras.
La presente solicitud reivindica el beneficio de
prioridad bajo 35 U.S.C. \NAK 119 frente a la solicitud
provisional de patente de EE.UU. Nº 60/564.587 presentada el 23 de
abril de 2004.
La presente invención se refiere a tecnología de
comunicación de pluralidad está dirigida a composiciones y
procedimientos para extraer sustancias de una muestra. Más
particularmente, la presente invención está dirigida a
composiciones y procedimientos para extraer ácidos nucleicos de
muestras mediante unión reversible con partículas de diámetro
pequeño respondedoras magnéticamente.
En la discusión siguiente se describirán ciertos
artículos y procedimientos para fines básicos e introductorios.
Nada de lo contenido en la presente memoria descriptiva debe
interpretarse como una "admisión" de la técnica anterior. El
solicitante se reserva expresamente el derecho de demostrar, cuando
sea adecuado, que los artículos y procedimientos a los que se hace
referencia en la presente memoria descriptiva no constituyen técnica
anterior bajo las condiciones reglamentarias aplicables.
El aislamiento y/o separación de ácidos
nucleicos es un trabajo necesario en muchos procedimientos
diagnósticos y bioquímicos. Entre las técnicas conocidas para
conseguir este objetivo se incluyen la lisis de materiales
biológicos para liberar los ácidos nucleicos contenidos en los
mismos, seguido por la eliminación o separación de al menos una
porción del ácido nucleico.
El ácido nucleico se puede separar y/o eliminar
mediante una serie de diferentes técnicas. Una de estas técnicas
implica la unión reversible del ácido nucleico a partículas
magnéticas. Las patentes de EE.UU. Nº 5.973.138 y 6.433.160, cuyos
contenidos se incorporan en la presente memoria descriptiva por
referencia en su totalidad, también son ilustrativos de las
técnicas de separación que utilizan partículas respondedoras
magnéticamente.
Aunque dichas técnicas generalmente son
eficaces, todavía queda mucho por mejorar. Por ejemplo, la
aplicación de un campo magnético a las partículas magnéticas
descritas en lo que antecede puede hacer que las partículas se
"agrupen" juntos. Se cree que este agrupamiento se debe a la
atracción magnética residual retenida por las partículas después de
eliminar el campo magnético. Este fenómeno requiere la aplicación de
un procedimiento de "desmagnetización" para eliminar el
agrupamiento de las partículas.
La presente invención proporciona composiciones
y técnicas que son eficaces en prevenir el agrupamiento o
agregación de partículas respondedoras magnéticamente, de modo que
se evita la necesidad de un procedimiento de desmagnetización.
De acuerdo con un primer aspecto, la presente
invención proporciona un procedimiento para unir de forma reversible
al menos una molécula de ácido nucleico, que comprende: crear una
mezcla en un contenedor, en la que la mezcla comprende la muestra,
al menos una partícula respondedora magnéticamente, y un resto; y
proporcionar la mezcla con un pH inferior a aproximadamente 7,0, de
modo que se alteran las propiedades de carga superficial de al
menos una partícula magnéticamente respondedora. La alteración en
las propiedades de carga superficial de al menos una partícula
respondedora magnéticamente hace que al menos una molécula de ácido
nucleico se una de forma inespecífica a al menos una partícula
respondedora magnéticamente para formar un complejo.
Preferentemente, la al menos una partícula respondedora
magnéticamente está sin recubrir, sin tratar, carece de modificación
en la superficie y tiene un diámetro de aproximadamente 0,1 \mum
a aproximadamente 0,3 \mum.
De acuerdo con otro aspecto, la presente
invención proporciona un procedimiento para la unión reversible de
al menos una molécula de ácido nucleico, que comprende: (i) crear
una mezcla en un contenedor, en la que la mezcla comprende una
muestra que comprende al menos una molécula de ácido nucleico, al
menos una partícula respondedora magnéticamente que tiene un
diámetro de aproximadamente 0,1 \mum a aproximadamente 0,3 \mum,
y un resto; (ii) proporcionar la mezcla con un pH ácido, de modo
que se alteran las propiedades de carga superficial de al menos una
partícula magnéticamente respondedora, en la que la alteración en
las propiedades de carga superficial de al menos una partícula
respondedora magnéticamente hace que la al menos una molécula de
ácido nucleico se una de forma inespecífica a la al menos una
partícula respondedora magnéticamente para formar un complejo;
(iii) aplicar un campo magnético al complejo; (iv) eliminar el resto
de la mezcla del contenedor mientras se aplica el campo magnético
al complejo; (v) eluir la al menos una molécula de ácido nucleico de
la al menos una partícula respondedora magnéticamente; y (vi)
reaplicar el campo magnético a la al menos una partícula
respondedora magnéticamente eluida, de modo que se separa la al
menos una partícula respondedora magnéticamente de la al menos una
molécula de ácido nucleico.
Las características anteriores y de otro tipo,
aspectos y ventajas de la presente invención se harán evidentes a
partir de la siguiente descripción, las reivindicaciones adjuntas y
las formas de realización ejemplo que se muestran en las figuras,
que se describen brevemente a continuación. Debe observarse que, a
menos que se especifique lo contrario, elementos similares tienen
los mismos números de referencia.
La Fig. 1 es una ilustración esquemática de una
forma de realización de un procedimiento realizado de acuerdo con
los principios de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Los principios de la presente invención se
describirán con más detalle mediante la siguiente discusión de
ciertas formas de realización ilustrativas y por referencia a la
figura anterior.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
"ácido nucleico" significa ácido desoxirribonucleico (ADN),
ribonucleico (ARN) o cualquier modificación natural o sintética de
los mismos, así como combinaciones de los anteriores.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
"muestra" significa cualquier sustancia que contiene ácido
nucleico, incluidas, entre otras, sangre, plasma, suero, orina,
aspirados de médula ósea, líquido cefalorraquídeo, tejido, células,
heces, saliva, secreciones orales, secreciones nasales, lavado
bronquial, pelo, fluidos cervicales, fluidos vaginales, semen,
esputo y fluidos linfáticos.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
"partícula magnéticamente respondedora" significa una partícula
a la que se puede impartir un momento magnético o, de otro modo,
que se puede mover bajo la acción de un campo magnético. Entre
dichas partículas se incluyen hidróxido férrico, óxido
ferrosoférrico, sulfuro de hierro y cloruro de hierro.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
"unido de forma inespecífica" significa que el mecanismo de
unión no se produce a través de un receptor, agente de captura, o
similares, que se acoplaría de forma selectiva únicamente con un
agente específico.
Las partículas magnéticamente respondedoras de
la presente invención pueden estar sin recubrir, sin tratar y/o
carecer de cualquier tipo de modificación en la superficie. Las
partículas magnéticamente respondedoras de la presente invención se
unen de forma inespecífica al ácido nucleico, es decir se unen al
mismo de forma inespecífica en ciertas condiciones.
El solicitante ha descubierto que cuando están
en un entorno ácido, las partículas magnéticamente respondedoras se
unirán de forma reversible a los ácidos nucleicos. Sin desear quedar
ligado a teoría alguna, el solicitante cree que un entorno ácido
aumenta la naturaleza electropositiva de las partículas, de modo que
se incrementa la unión de las partículas a los ácidos nucleicos
electronegativos.
Como se ha indicado anteriormente, de acuerdo
con otra forma de realización, preferentemente las partículas
magnéticamente respondedoras de la presente invención están sin
recubrir, sin tratar y/o carecen de modificación en la superficie.
Por tanto, las partículas se unen de modo inespecífico a los ácidos
nucleicos. Por tanto, las partículas son útiles en la presente
invención y el hierro puede ser un óxido de hierro de formas tales
como hidróxido férrico y óxido ferrosoférrico, que tienen baja
solubilidad en un entorno acuoso. Otras partículas de hierro, tales
como sulfuro de hierro y cloruro de hierro, pueden también ser
adecuadas para unirse y extraer ácidos nucleicos usando las
condiciones descritas en la presente memoria descriptiva.
La forma de las partículas magnéticamente
respondedoras no es crítica para la presente invención. Las
partículas magnéticamente respondedoras pueden tener varias formas,
incluidas, por ejemplo, esferas, cubos, óvalos, forma de cápsula,
forma de comprimido, formas aleatorias sin descripción, etc., y
pueden tener una forma uniforme o una forma no uniforme. Cualquiera
que sea la forma de la partícula, su diámetro medio en su punto más
ancho es, generalmente, de aproximadamente 0,1 \mum a
aproximadamente 0,3 \mum. De acuerdo con una forma de
realización, las partículas magnéticamente respondedoras tienen un
diámetro de aproximadamente 0,3 \mum.
El entorno ácido en el que las partículas
magnéticamente respondedoras se unen de forma efectiva y reversible
al ácido nucleico se puede proporcionar mediante diversos medios.
Por ejemplo, las partículas magnéticamente respondedoras se pueden
añadir a una solución ácida o una solución ácida puede añadirse a
las partículas. Como alternativa, una solución o entorno en el que
se encuentren las partículas magnéticamente respondedoras se puede
acidificar mediante la adición de un agente acidificante, tal como
ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido acético o ácido cítrico.
Siempre que el entorno en el que se encuentren las partículas
magnéticamente respondedoras tenga un pH inferior a aproximadamente
7,0, las partículas se unirán de forma reversible a los ácidos
nucleicos, así como a partículas u organismos enteros intactos.
El complejo unido de ácido nucleico/partícula se
puede eluir en un tampón adecuado para su posterior manipulación.
Calentar el entorno de las partículas con el ácido nucleico unido
y/o elevar el pH de tal entrono puede conseguir dicha elución.
Entre los agentes que se pueden usar para ayudar a la elución del
ácido nucleico a partir de las partículas magnéticamente
respondedoras se incluyen soluciones básicas o tampones, tales como
hidróxido potásico, hidróxido sódico o cualquier compuesto que
aumente el pH del entorno en una medida suficiente de modo que el
ácido nucleico electronegativo se desplaza de las partículas
magnéticamente respondedoras.
El ácido nucleico se puede extraer después,
concentrar y/o aislar. Posteriormente, el ácido nucleico se puede
someter a otros procedimientos, tales como uno o más de: cultivo,
amplificación en cadena de la polimerasa, reacción en cadena de la
polimerasa con transcripción inversa, amplificación por
desplazamiento de cadena, amplificación por desplazamiento de
cadena con transcriptasa inversa, clonación, secuenciación,
amplificación mediada por transcripción y amplificación de cadena
con ligasa.
A continuación se describirá un procedimiento de
ejemplo realizado de acuerdo con los principios de la presente
invención por referencia a la Fig. 1. En la etapa A, una muestra 10
se localiza en un contenedor 15. La muestra 10 contiene ácido
nucleico 20.
Después, en la etapa B se forma una mezcla 25
que incluye la mezcla 10, el ácido nucleico 20 y las partículas
magnéticamente respondedoras 30. Como se ha indicado en lo que
antecede, las partículas magnéticamente respondedoras 30 pueden
tener un diámetro de aproximadamente 0,1 \mum a aproximadamente
0,3 \mum, y puede ser de aproximadamente 0,3 \mum. Las
partículas 30 pueden estar sin recubrir, sin tratar y carecer de
modificación de superficie. El pH de esta mezcla se lleva a un
nivel adecuado, preferentemente a menos de aproximadamente 7,0, o
inferior. La mezcla se puede formar por cualquier medio adecuado.
Por ejemplo, las partículas magnéticamente respondedoras 30 pueden
añadirse a una solución ácida, o una solución ácida puede añadirse a
las partículas 30. Como alternativa, una solución o entorno en el
que las partículas magnéticamente respondedoras 30 se encuentren se
puede acidificar mediante la adición de un agente acidificante tal
como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido acético o
ácido
cítrico.
cítrico.
Opcionalmente, a la mezcla descrita en lo que
antecede se puede añadir una solución control de extracción. La
solución control de extracción contiene un agente que se puede
detectar u observar, cuya presencia es indicativa de un
procedimiento de extracción con éxito o sin éxito. La solución
control de extracción puede tener cualquier composición adecuada y
contener cualquier agente adecuado. A modo de ejemplo, la solución
control de extracción puede contener un agente en forma de un
oligonucleótido con un fluoróforo unido al mismo. El agente también
se une a las partículas magnéticamente respondedoras. La presencia
del agente se puede detectar después en un posterior ensayo de
amplificación, de modo que indica si una extracción deseada ha
tenido éxito.
Como se ha descrito anteriormente, el cambio en
el pH produce una modificación de las características de la carga
superficial de al menos las partículas magnéticamente respondedoras
30, lo que hace que el ácido nucleico 20 se una a las partículas
magnéticamente respondedoras 30, de modo que se forma un complejo.
Después se aplica un campo magnético. Como se ilustra en la etapa
C, esto se puede conseguir acercando los imanes permanentes
opuestos 40, o electroimanes -no mostrados) a la parte exterior del
contenedor 15. Bajo la influencia del campo magnético, el complejo
ácido nucleico unido 20/partícula magnéticamente respondedora 30 es
desplazado hacia los imanes 40. El sobrenadante, o resto, de la
mezcla 25 puede retirarse después del contenedor 15 (etapa D).
En esta etapa pueden realizarse opcionalmente
una o más etapas de lavado (no mostradas) para eliminar
adicionalmente sustancias indeseables. Se puede utilizar cualquier
lavado adecuado. Por ejemplo, se puede utilizar agua, un detergente
no iónico o un detergente no iónico/solución ácida de baja
concentración.
La etapa E es ilustrativa de la elución del
complejo para liberar el ácido nucleico 20 de las partículas
magnéticas. Esta elución se puede conseguir a través de cualquier
medio adecuado, tal como con un agente químico, energía química, o
una combinación de ambos. Por ejemplo, se puede añadir un agente
tampón 45 para incrementar el pH hasta un nivel adecuado. De
acuerdo con la forma de realización, el pH se eleva a
aproximadamente 8,3-8,4. El tampón puede comprender
KOH.
A continuación, los imanes se acercan al
contenedor 15 en la etapa F, que ahora desplaza sólo las partículas
magnéticamente respondedoras 30 a las paredes laterales del
contenedor 15. Después, el ácido nucleico 20 puede retirarse del
contenedor 15 (etapa G).
Una ventaja del uso de las partículas
respondedoras magnéticamente descritas en lo que antecede de la
presente invención es que el procedimiento de separación/extracción
descrito en lo que antecede se puede realizar sin una etapa de
"desmagnetización", que a menudo se requiere en las técnicas
convencionales para eliminar la atracción magnética residual entre
partículas y que puede producir "agrupamiento".
Tras la etapa G, el ácido nucleico 20 puede
someterse a otros procesos, tales como uno o más de los siguientes:
cultivo, amplificación de la cadena con la polimerasa, amplificación
de la cadena con polimerasa y transcripción inversa, amplificación
por desplazamiento de cadena, amplificación por desplazamiento de
cadena y transcriptasa inversa y amplificación de la cadena con
ligasa.
Las etapas del procedimiento de ejemplo
descritas en lo que antecede se pueden llevar a cabo manualmente,
de forma automática o mediante una combinación de etapas manuales y
automáticas. Las etapas automáticas pueden realizarse con un
dispositivo robótico automático, que opcionalmente incluye pipeteo
automático, mezclado y funcionalidad de posicionamiento del imán.
El dispositivo robótico automático puede controlarse con un
ordenador. Uno de estos dispositivos está disponible comercialmente
en Becton, Dickinson and company, como BD Viper^{TM}.
La presente invención se puede usar en una serie
de diferentes contextos. Por ejemplo, la presente invención puede
utilizarse junto con sistemas y procedimientos del tipo descrito en
la patente de EE.UU. Nº 6.672.458, cuyo contenido se incorpora en
la presente memoria descriptiva por referencia en su totalidad.
Generalmente, estos tipos de sistemas y procedimientos implican la
extracción, amplificación y detección de especies diana presentes
en una muestra biológica. Dicho procedimiento puede implicar
cualquier combinación adecuada de las etapas siguientes.
Un contenedor en forma de un tubo de extracción
está provisto de partículas magnéticamente respondedoras. Un agente
de lisis se dispensar en el tubo de extracción que contiene las
partículas magnéticamente respondedoras mediante un dispositivo
robótico automático.
Después, una muestra se dispensa en el tubo de
extracción, también mediante el dispositivo robótico automático, y
después se mezcla para lisar el (los) organismo(s) de interés
contenidos en la muestra a un pH alto, de modo que se libera el
ácido nucleico. Se puede añadir una solución ácida al tubo de
extracción. La solución ácida actúa para normalizar diferentes
tipos de muestras, de modo que se estimula un pH consistente.
Se puede añadir una solución control de
extracción a los tubos de extracción mediante el dispositivo
robótico automático, y mezclarse. La solución control de extracción
contiene un oligonucleótido y fluoróforo unido al mismo que, junto
con el ácido nucleico, se une a las partículas magnéticamente
respondedoras para formar un complejo. El fluoróforo unido al
oligonucleótido se desplaza a través de la extracción y la cantidad
de fluoróforo se lee en un posterior ensayo de amplificación e
indica una extracción con éxito o sin éxito. Un campo magnético se
aplica a los contenidos del tubo de extracción acercando un par de
imanes opuestos a la parte exterior del tuno, de modo que desplaza
el complejo a la periferia interna del tubo. Después, el dispositivo
robótico automático aspira los contenidos del tubo y deja el
complejo en su interior.
A continuación, el complejo se lava con una
solución de, por ejemplo, detergente no iónico. Un detergente no
iónico adecuado está comercialmente disponible como "Tween®
20". El ácido residual contenido en los espacios intersticiales
entre las partículas magnéticamente respondedoras mantiene un pH
ácido. Como alternativa, se puede añadir al detergente no iónico
una solución ácida suave. Tras el lavado, el campo magnético se
reaplica para desplazar el complejo a la periferia interna del tubo
y se aspira el lavado del tubo.
Después, al tubo de extracción se añade un
tampón de elución y se mezcla, para eluir el ácido nucleico del
complejo. El tampón de elución se añade y mezcla con el dispositivo
robótico automático. A continuación, el ácido nucleico se puede
separar de las partículas magnéticamente respondedoras mediante
manipulación de los imanes del modo descrito en lo que
antecede.
Después de la extracción descrita en lo que
antecede, el ácido nucleico se puede someter a procedimientos
adicionales, tales como técnicas para detectar y/o cuantificar
analitos diana. Por ejemplo, se puede usar cualquier procedimiento
adecuado para amplificación en los procedimientos de la invención.
Dichos procedimientos incluyen, entre otros, reacción en cadena de
la polimerasa ("PCR"), amplificación por desplazamiento de
cadena ("SDA"), amplificación por desplazamiento termófilo de
cadena ("toda"), replicación de secuencia autosostenida
("3SR"), amplificación basada en la secuencia del ácido
nucleico ("NASBA"), sistema de replicasa Q\beta; reacción en
cadena de la ligasa ("LCR") y amplificación mediada por
transcripción ("TMA"). La detección puede realizarse mediante
cualquier mecanismo adecuado. Por ejemplo, el incremento de la
fluorescencia de una sonda indicadora.
Ejemplos no limitantes específicos comprendidos
por los principios de la presente invención se describirán a
continuación para ilustrar adicionalmente los conceptos de la
presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un experimento para comparar el
funcionamiento de varias cantidades de partículas magnéticas de
diámetro pequeño (0,3 \mum) con una cantidad estándar de
partículas de diámetro mayor (1,0 \mum) dentro del contexto de un
ensayo para Chlamydia trachomatis (CT).
Se proporcionan contenedores en forma de tubos
de extracción con partículas magnéticamente respondedoras. Las
partículas magnéticas de diámetro pequeño se identifican como óxido
ferrosoférrico TB 5600, comercialmente disponible en Elementis.
Estas partículas tienen un diámetro medio de aproximadamente 0,3
\mum. Las partículas magnéticas de diámetro mayor se identifican
como óxido ferrosoférrico M-25 RPS, comercialmente
disponible en PEA Ridge. Estas partículas tienen un diámetro medio
de aproximadamente 1,0 \mum. Las partículas se añadieron a los
tubos de acuerdo con el programa siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Las partículas se midieron gravimétricamente y
se dispensaron a mano en los tubos de extracción.
En cada tubo de extracción que contiene las
partículas magnéticamente respondedoras se dispensa una solución de
ácido fosfórico (H_{3}PO_{4}) de una concentración 5M mediante
el dispositivo BD Viper^{TM}.
Las muestras de orina se adultera a 100
partículas/ml. Un dispositivo robótico automático dispensó 950
\mul de las muestras de orina adulterada en los tubos de
extracción. El dispositivo robótico dispensó 50 \mul de
H_{3}PO_{4} 5M en los tubos de extracción. Las muestras de orina
se mezclan con la solución de ácido fosfórico para lisar el (los)
organismo(s) de interés contenidos en la muestra, de modo que
se libera el ácido nucleico. El ácido nucleico electronegativo
liberado de una célula se asocia con las partículas
electropositivas.
Se aplica un campo magnético a los contenidos
del tubo de extracción. Después, el dispositivo robótico automático
aspira los contenidos del tubo, dejando el complejo en el interior y
se retira el campo magnético del contenedor. El dispositivo
robótico automático realiza una doble extracción repitiendo las
etapas descritas en lo que antecede, comenzando con la introducción
de orina adulterada en el tubo de extracción.
Después, el complejo se lava con una solución 1
mM de lavado con glicina-HCl. Tras lavar, el campo
magnético se vuelve a aplicar para desplazar el complejo hacia la
periferia interna del tubo y el lavado se aspira del tubo.
Después se añade al tubo de extracción una
solución tampón de elución y se mezcla, para eluir el ácido nucleico
de las partículas presentes en el complejo. A cada tubo se
añadieron aproximadamente 370 \mul del tampón de elución. La
solución tampón de elución comprende una solución basada en una
mezcla de KOH y bicina. El tampón de elución se añade y mezcla
mediante el dispositivo robótico automático.
La muestra eluida que contiene ácido nucleico se
transfiere a pozos de cebado Chlamydia BDProbeTec^{TM}
comercialmente disponibles a 150 \mul por pocillo. Los pozos de
cebado se mantienen a temperatura ambiente durante 20 minutos. Los
pozos de cebado se transfieren a una placa caliente a 72ºC. Los
pozos de amplificación Chlamydia ProbeTec se transfieren a una
placa caliente a 54ºC al mismo tiempo que los pozos de cebado se
transfieren a la placa caliente a 72ºC. Las placas se incuban a
temperatura durante 10 minutos. Después del periodo de incubación
de 10 minutos, 100 \mul de solución se transfieren desde los pozos
de cebado a los pozos de amplificación. La solución se mezcla tres
veces. Encima de los pozos se aplica una cubierta adhesiva para
prevenir la pérdida por evaporación de la muestra durante la
amplificación. Las placas que contienen los pozos de amplificación
se colocan en un lector BDProbeTec^{TM}.
El procedimiento de amplificación se monitorizó
con un lector BDProbeTec^{TM}, que detectó el incremento
fluorescente asociado con la conversión de la sonda indicadora. El
lector produce valores "MOTA" (medida distinta a la
aceleración) basados en la detección de la conversión de la sonda
indicadora durante el procedimiento de amplificación. Los valores
MOTA medios generados durante el periodo de monitorización para cada
una de las muestras descritas en lo que antecede se indican más
adelante en la Tabla II.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de los valores MOTA indicados en la
Tabla II es evidente que la extracción y amplificación del analito
CT diana usando 5,0 mg de partículas magnéticamente respondedoras de
0,3 \mum (tubo nº 2) tuvo más éxito que la extracción y
amplificación usando 40,0 mg de partículas magnéticas de 1,0 \mum
(tubo nº 6), como se pone de manifiesto mediante el valor MOTA
medio más alto asociado con el tubo nº 2. En el caso del ciclo
usando sólo 2,5 mg de las partículas de 0,3 \mum (tubo nº 1), se
cree que el valor MOTA medio menor es atribuible a una deficiencia
en el área de unión de las partículas y/o un elevado porcentaje de
las partículas de 0,3 \mum que se pegan a la punta de la pipeta
durante la dispensación. En el caso de los ciclos que utilizan más
de 5,0 mg de las partículas de 0,3 \mum (tubos nº 3, 4, 5), los
valores MOTA medios menores se pueden atribuir a un incremento de
la inhibición en el procedimiento de amplificación debido a la mayor
masa del hierro y al mayor espacio intersticial entre partículas,
que tiende a aumentar la cantidad de potenciales inhibidores de la
amplificación y otros componentes cargados negativamente específicos
de la orina presentes durante la amplificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un experimento para determinar las
cantidades óptimas de partículas magnéticas y de agente de lisis
ácido fosfórico para usar en la extracción de un analito diana.
Se proporcionan contenedores en forma de tubos
de extracción con partículas magnéticamente respondedoras. Las
partículas magnéticamente respondedoras son las partículas de óxido
ferrosoférrico de Elementis TB5600 mencionadas en el ejemplo 1.
A cada tubo de extracción que contiene las
partículas magnéticamente respondedoras se dispensa una solución de
ácido fosfórico (H_{3}PO_{4}) de concentración 5M. El ácido
fosfórico se dispensó mediante un dispositivo robótico automático,
a saber el dispositivo extractor automático BD VIPER^{TM}.
Los tubos de extracción se cargaron con
partículas magnéticas y ácido fosfórico siguiendo el siguiente
programa expuesto en la Tabla III.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras de orina que tiene un volumen de
1,0 ml se dispensaron después en los tubos de extracción, también
mediante el dispositivo robótico automático. Las muestras de orina
se adultera hasta un nivel de 100 partículas/ml y se mezclaron con
la solución de ácido fosfórico para lisar el (los) organismos de
interés contenidos en la muestra, de modo que se libera ácido
nucleico.
Se aplica un campo magnético a los contenidos
del tubo de extracción. El dispositivo robótico automático acerca
un par de imanes opuestos al exterior del tubo, de modo que se
desplaza el complejo a la periferia interna del tubo. El
dispositivo robótico automático después aspira los contenidos del
tubo, dejando el complejo en su interior, y el campo magnético se
retira del contenedor.
Después el complejo se lava con una solución 1mM
de glicina-HCl de lavado con el dispositivo robótico
automático. Después del lavado, el campo magnético se vuelve a
aplicar para desplazar el complejo a la periferia interna del tubo
y el lavado se aspira del tubo.
Después, al tubo de extracción se añadió una
solución tampón de elución mediante el BD Viper^{TM} y se mezcla,
para eluir el ácido nucleico del complejo. A cada tubo se añadió una
cantidad de 370 \mul de tampón. La solución tampón de elución
comprende una solución basado en una mezcla de KOH y bicina. La
muestra de ácido nucleico eluida se añade después a los pozos de
cebador sometidos al mismo procedimiento de amplificación por
desplazamiento de cadena descrito en el Ejemplo 1. El analito diana
fue CT.
Para el ensayo descrito en lo que antecede se
recogieron los siguientes datos contenidos en la Tabla IV.
A partir de los datos anteriores es evidente que
los tubos de extracción que contienen 5 mg y 10 mg de las
partículas exhibían mejor funcionamiento. Los tubos nº 2, 5 y 8 (5
mg/80 ml, 10 mg/50 ml y 10 mg/140 ml, respectivamente, exhibieron
el mejor funcionamiento, como queda mostrado por los valores MOTA
medios más elevados.
Aunque esta invención se satisface mediante
formas de realización en muchas formas diferentes, como se describe
con detalle en relación con las formas de realización preferidas de
la invención, se entiende que la presente divulgación debe
considerarse como ejemplo de los principios de la invención y no
pretende limitar la invención a las formas de realización
específicas ilustradas y descritas en la presente memoria
descriptiva. Expertos en la técnica pueden realizar numerosas
variaciones si desviarse del espíritu de la invención.
Claims (10)
1. Un procedimiento para unir de forma
reversible al menos una molécula de ácido nucleico, que
comprende:
- (i)
- crear una mezcla en un contenedor, en el que la mezcla comprende una muestra que comprende al menos una molécula de ácido nucleico, al menos una partícula magnéticamente respondedora que tiene un diámetro de aproximadamente 0,1 \mum a aproximadamente 0,3 \mum, y un resto; y
- (ii)
- proporcionar la mezcla con un pH ácido, de modo que se alteran las propiedades de carga superficial de la al menos una partícula respondedora magnéticamente;
en el que la alteración en las propiedades de
carga superficial de la al menos una partícula respondedora
magnéticamente es tal que la al menos una molécula de ácido nucleico
pasa a unirse de forma inespecífica a la al menos una partícula
magnéticamente respondedora para formar un complejo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la al menos una partícula magnéticamente respondedora está
sin recubrir, sin tratar y carece de modificación de superficie.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la etapa (i) comprende añadir la al menos una partícula
magnéticamente respondedora al contenedor, añadiendo un agente de
lisis al contenedor, añadiendo la muestra al contenedor, y
mezclando.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la al menos una partícula magnéticamente respondedora
comprende una partícula de óxido de hierro.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la al menos una partícula magnéticamente respondedora tiene
un diámetro de aproximadamente 0,3 \mum.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, que
además comprende la etapa de aplicar un campo magnético al
complejo.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, que
además comprende la etapa adicional de eluir la al menos una
molécula de ácido nucleico de la al menos una partícula
magnéticamente respondedora.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, en
el que la etapa de eluir comprende añadir una solución tampón al
contenedor.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, que
además comprende la etapa de volver a aplicar un campo magnético a
la al menos una partícula magnéticamente respondedora eluida, de
modo que se separa la al menos una partícula magnéticamente
respondedora de la al menos una molécula de ácido nucleico.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, que
además comprende al menos uno de PCR, SDA, tSDA, 3SR, NASBA,
Q\beta, LCR y TMA.
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