ES2333585T3 - Nuevos hongos endofitos y procedimientos de uso. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para identificar hongos Muscodor, que comprende poner en contacto una cantidad efectiva de los hongos que se van a someter a detección selectiva con volátiles de Muscodor albus o de Muscodor roseus en condiciones de cultivo, seleccionar los hongos resistentes a los voláticles del Muscodor albus o de Muscodor roseus y analizar las características moleculares de los hongos seleccionados.
Description
Nuevos hongos endófitos y procedimientos de
uso.
En la presente solicitud se refiere a un
procedimiento para identificar hongos nuevos que producen
antibióticos volátiles. Los compuestos volátiles tienen actividad
biológica contra hongos y bacterias patógenos de plantas y seres
humanos, insectos y nematodos.
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En la presente solicitud se hace referencia a
varios artículos y libros citando el autor y la fecha. Las citas
bibliográficas completas para cada publicación pueden encontrarse al
final de la memoria, inmediatamente antes de las
reivindicaciones.
Está reconocido que los hongos producen
antibióticos que son útiles en el tratamiento de enfermedades, en
aplicaciones industriales y como pesticidas, por ejemplo,
penicilina, cefalosporinas, tetraciclina y ciclosporinas, ninguna
de las cuales es volátil. Se conocen muchas especies de hongos que
emiten bajas concentraciones de sustancias gaseosas, especialmente
algunas que tienen olores repugnantes distintivos, y esto ha
provocado análisis químicos de los volátiles fúngicos (Bjurman y
col., 1992). Algunas de estas sustancias volátiles son comunes a
muchos hongos, mientras que otras parecen ser únicas para una
especie (Schnurer y col., 1999; Rapior y col., 2000). Dennis &
Webster (1971) comunicaron que ciertas especies de
Trichoderma producían antibióticos volátiles que inhibían el
crecimiento de hongos de prueba tales como Rhizoctonia
solani, Pythium ultimum y Fusarium oxysporum.
Estos autores no comunicaron efectos letales para ninguno de los
hongos de prueba y no se realizó un análisis químico exhaustivo de
los componentes volátiles de los cultivos fúngicos, aunque se
sugirió que el acetaldehído era uno de los volátiles. Por tanto, a
pesar de cierta atención prestada a lo largo de los años a los
compuestos volátiles de los cultivos fúngicos, no se ha comunicado
ninguna mezcla letal de antimicrobianos volátiles producidos por
hongos.
Es también bien conocido que varios
microorganismos exhiben actividad biológica de modo que son útiles
para el control de enfermedades de plantas. Aunque se han hecho
progresos en el campo de la identificación y desarrollo de
plaguicidas biológicos para controlar varias enfermedades de plantas
de importancia en la agronomía y la horticultura, la mayoría de los
plaguicidas en uso siguen siendo compuestos sintéticos. Muchos de
estos fungicidas químicos son clasificados por la EPA como
carcinógenos y son tóxicos para la fauna y flora silvestres y otras
especies a las que no están dirigidos. Por ejemplo, el bromuro de
metilo es ampliamente usado como fumigante de suelos y para tratar
infecciones microbianas posteriores a la recolección. Debido a su
alta toxicidad para seres humanos y animales y a su efecto nocivo
para la atmósfera, el uso de bromuro de metilo va a ser eliminado
pronto y existe la gran necesidad de encontrar sustitutos más
seguros para este y otros plaguicidas sintéticos.
La presente invención satisface esta necesidad y
también proporciona ventajas relacionadas.
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Se proporciona un procedimiento para identificar
hongos navel unicodor, incluidos los hongos truscodor albus y
Muscodor roseus, en el que los hongos Muscodor producen
una mezcla de antibióticos volátiles con actividad contra hongos,
bacterias, insectos y nematodos. En un aspecto, el Muscodor
es identificado empleando la información suministrada en la
presente memoria descriptiva, que incluye, entre otras, secuencias
genómicas parciales expuestas en las SEC ID Nº: 1 a 4. Dos nuevas
cepas fueron depositadas en el NRRL el 1 de febrero de 2002
conforme a las condiciones establecidas en el Tratado de Budapest
sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de
Microorganismos para el Propósito de Procedimiento de Patentes con
los nº de registro 30457 y 30458.
También se proporcionan composiciones que
contienen los hongos y/o los compuestos volátiles. Las composiciones
son útiles para el tratamiento de suelos y para proteger plantas,
semillas, granos y frutas de hongos y bacterias patógenos. Las
composiciones son también útiles para la protección de alimentos
trás la recolección contra infecciones de hongos y bacterias. Las
composiciones además son útiles para el tratamiento de desechos
humanos o animales y para el tratamiento y/o la prevención de la
infestación por el moho tóxico de edificaciones y materiales para
construcción, tales como madera. También se proporcionan en la
presente invención procedimientos no terapéuticos para el
tratamiento y la protección de suelos, plantas, semillas, granos,
productos de desecho, materiales de construcción y productos
alimenticios tras la recolección contra infecciones bacterianas, por
insectos, nematodos y fúngicas.
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La Tabla 1 muestra los efectos de los compuestos
volátiles de M. albus y de una mezcla artificial de
compuestos de M. albus en un grupo de microbios de prueba.
Después de la exposición a los gases de M. albus, el
microbio de prueba fue evaluado para determinar su viabilidad
después de la eliminación de los gases. La atmósfera artificial
estaba constituida por los compuestos identificados después del
análisis de los gases de M. albus. El crecimiento microbiano
en la atmósfera artificial se midió después de la exposición a la
mezcla artificial de compuestos a 3,2-90 \mul/50
cc con el fin de obtener las CI_{50}. El % de crecimiento con
respecto al control y la viabilidad se midieron después de la
exposición a 60 \mul/50 cc. La viabilidad se determinó a los 3
días después de la eliminación de los compuestos.
La Tabla 2 muestra el número promedio de brotes
de brécol por maceta una semana después del plantado (medias \pm
desviación estándar) utilizando vermiculita. Se plantaron las
macetas inmediatamente sin un periodo de incubación.
La Tabla 3 muestra los resultados de un
experimento para determinar la capacidad de Muscodor albus
para controlar el moho azul de las manzanas.
La Tabla 4 muestra los resultados de los
análisis de CG/EM de los compuestos volátiles producidos por M.
albus. Varios picos menores y el pico de gran avance fueron
omitidos del análisis global debido a que representan únicamente el
1% del área total. Los compuestos encontrados en la placa control de
PDA no se incluyen en esta tabla.
La Tabla 5 muestra los resultados de un ensayo
para determinar la influencia inhibidora de cada clase de compuestos
volátiles. Esto se expresa como el % de crecimiento del microbio de
prueba en comparación con un control que no está en presencia de
los compuestos de prueba. Los compuestos se analizaron durante una
exposición de 2 días a las concentraciones relativas que se
producen en M. albus a la concentración óptima de prueba de
60 \mul/50 cc de volumen de aire o 1,2 \mul/cc.
La Tabla 6 muestra los volátiles de Muscodor
albus usados para el tratamiento de semillas de cebada
infestadas con carbón cubierto. Grupos de semillas no tratadas y no
infestadas se usaron como controles.
A lo largo de esta divulgación se hace
referencia a varias publicaciones, patentes y especificaciones de
patentes publicadas mediante una cita que las identifica.
La puesta práctica de la presente invención
emplea, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales
de biología molecular (incluidas técnicas recombinantes),
microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, las
cuales están dentro del conocimiento de la técnica. Tales técnicas
se explican completamente en la literatura. Estos procedimientos se
describen en las siguientes publicaciones. Véase, por
ejemplo, Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY
MANUAL, 2ª edición (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY
(F. M. Ausubel y col., editores (1987)); la serie METHODS IN
ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); PCR: A PRACTICAL APPROACH (M.
MacPherson y col., IRL Press en Oxford University Press (1991)); y
PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames y G. R.
Taylor, editores (1995)).
Las formas en singular "un", "una",
"la" y "el" incluyen las referencias en plural a menos de
que el contexto claramente lo contrario. Por ejemplo, el término
"una célula" incluye una pluralidad de células, incluyendo
mezclas de las mismas.
El término "que comprende" tiene la
intención de significar que las composiciones y procedimientos
incluyen los elementos enumerados, pero no excluye otros.
"Constituido esencialmente por", cuando se usa para definir
composiciones y procedimientos, significará que excluye otros
elementos de cualquier importancia esencial para la combinación.
Así, una composición constituida esencialmente por los elementos
como se define en la presente memoria descriptiva no excluiría las
trazas de contaminantes del procedimiento de aislamiento y
purificación ni los vehículos agrícolamente aceptables.
"reconstituido por" significará que se excluyen más que
elementos traza de otros ingredientes y etapas sustanciales del
procedimiento para aplicar las composiciones de la presente
invención. Las formas de realización definidas por cada uno de estos
términos de transición están dentro del alcance de la presente
invención.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
"control biológico" se define como el control de un patógeno o
de un insecto mediante el uso de un segundo organismo. Mecanismos
conocidos de control biológico incluyen bacterias entéricas que
controlan la descomposición de las raíces mediante el desplazamiento
por competencia de los hongos que se encuentran en la superficie de
la raíz. Toxinas bacterianas, tales como antibióticos, se han usado
para controlar patógenos. La toxina puede aislarse y aplicarse
directamente a la planta o la especie bacteriana puede
administrarse de forma que produzca la toxina in situ.
El término "hongo" u "hongos" incluye
una amplia variedad de organismos con núcleo que presentan esporas y
que carecen de clorofila. Ejemplos de hongos incluyen levaduras,
mohos, mildius, royas y champiñones.
El término "bacteria" incluye cualquier
organismo procariótico que no tenga un núcleo claro.
"Plaguicida" significa la capacidad de una
sustancia para aumentar la mortalidad o inhibir la tasa de
crecimiento de plagas de plantas.
"Fungicida" significa la capacidad de una
sustancia para aumentar la mortalidad o de inhibir la tasa de
crecimiento de hongos.
"Insecticida" significa la capacidad de una
sustancia para aumentar la mortalidad o inhibir la tasa de
crecimiento de insectos o sus larvas.
"Bactericida" significa la capacidad de una
sustancia para aumentar la mortalidad o de inhibir la tasa de
crecimiento de bacterias.
"Nematicida" significa la capacidad de una
sustancia para aumentar la mortalidad o de inhibir la tasa de
crecimiento de nematodos.
"Antibiótico" incluye cualquier sustancia
que es capaz de matar o inhibir a un microorganismo. Los
antibióticos pueden ser producidos por un microorganismo o mediante
un procedimiento sintético o semisintético. Por consiguiente, el
término incluye a una sustancia que inhibe o mata hongos como, por
ejemplo, cicloheximida o nistatina.
El término "cultivar" se refiere a la
propagación de los organismos sobre o dentro de medios de varios
tipos. "Cultivo de caldo entero" se refiere a un cultivo
líquido que contiene tanto células como medio. "Sobrenadante"
se refiere al caldo líquido que queda cuando las células cultivadas
en el caldo se eliminan mediante centrifugación, filtración,
sedimentación, u otros medios bien conocidos en la técnica.
Una "cantidad efectiva" es una cantidad
suficiente para producir los resultados beneficiosos o deseados. Una
cantidad efectiva puede administrarse en una o más
administraciones. En términos de tratamiento y protección, una
"cantidad efectiva" es la cantidad suficiente para mejorar,
estabilizar, revertir, disminuir o retardar la progresión de los
estados de la infección o enfermedad objetivo.
"Control positivo" significa un compuesto
conocido por tener actividad plaguicida. "Controles positivos"
incluyen, entre otros, plaguicidas químicos comercialmente
disponibles. El término "control negativo" significa un
compuesto del que no se sabe si presenta actividad plaguicida.
Ejemplos de controles negativos son agua o acetato de etilo.
El término "metabolito" o "volátil" se
refiere a cualquier compuesto, sustancia o subproducto de una
fermentación de un microorganismo que tiene la actividad biológica.
Los volátiles, en la mayoría de los casos, se evaporan fácilmente a
temperatura y presión ambientes.
El término "mutante" se refiere a una
variante de la cepa parental, así como a los procedimientos para
obtener un mutante o una variante en la que la actividad biológica
deseada es similar a la expresada por la cepa parental. La "cepa
parental" se define en la presente memoria descriptiva como las
cepas Muscodor originales antes de la mutagénesis. Las
mutantes se producen en la naturaleza sin la intervención humana.
También son obtenibles mediante tratamiento con, o mediante una
diversidad de, procedimientos y composiciones conocidos por los
expertos en la técnica. Por ejemplo, las cepas parentales pueden
ser tratadas con una sustancia química tal como
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina,
etilmetanosulfona, o mediante irradiación usando rayos gamma, rayos
X, o irradiación UV, o por otros medios bien conocidos por los
conocedores de la técnica.
Con una "composición" se pretende
significar una combinación de agente activo y otro compuesto,
vehículo o composición, inerte (por ejemplo, un agente o marcador o
vehículo líquido que puede detectarse) o activo, tal como un
adyuvante. Más adelante se proporcionan ejemplos de vehículos para
fines agrícolas. Los hongos también pueden formularse como una
composición, con un vehículo o, como alternativa, con por lo menos
un plaguicida químico o biológico.
Todas las indicaciones numéricas, por ejemplo,
el pH, la temperatura, el tiempo, la concentración y el peso
molecular, incluyendo los intervalos, son aproximaciones que pueden
variarse (+) o (-) en incrementos de 0,1. Debe entenderse, aunque
no siempre se indica explícitamente, que todas las indicaciones
numéricas están precedidas por el término "aproximadamente".
También debe entenderse, aunque no siempre se indica explícitamente,
que los reactivos descritos en la presente memoria descriptiva son
meramente ejemplos y que sus equivalentes son bien conocidos en la
técnica.
Con el fin de lograr una buena dispersión y
adhesión de las composiciones en la presente invención, puede ser
ventajoso formular el cultivo de caldo entero, el sobrenadante, y/o
los volátiles con componentes que ayuden a la dispersión y a la
adhesión. Formulaciones adecuadas serán bien conocidas por los
expertos en la técnica (polvos humectables, gránulos y similares, o
pueden microencapsularse en un medio adecuado y similares, líquidos
tales como fluidos acuosos y suspensiones acuosas, composiciones
volátiles y concentrados emulsionantes. Otras formulaciones
adecuadas serán conocidas por los expertos en la técnica.
Una "variante" es una cepa que tiene todas
las características de identificación de las cepas de la presente
invención y puede identificarse como aquella que posee un genoma que
hibrida en condiciones de alta rigurosidad con el genoma del
organismo, cuya secuencia parcial ha sido depositada en el depósito
GenBank. "Hibridación" se refiere a una reacción en la que
uno o más polinucleótidos reaccionan para formar un complejo que se
estabiliza por medio puentes de hidrógeno entre las bases de los
residuos de nucleótidos. Los puentes de hidrógeno pueden producirse
por apareamiento de las bases de Watson-Crick,
aglutinamiento de Hoogstein, o de cualquier otra manera específica
de la secuencia. El complejo puede comprender dos hebras que forman
una estructura doble, tres o más hebras que forman un complejo de
múltiples hebras, una sola hebra que autohibrida, o cualquier
combinación de las éstas. Las reacciones de hibridación pueden
llevarse a cabo en condiciones de diferente "rigurosidad". En
general, una reacción de hibridación de baja rigurosidad se lleva a
cabo a aproximadamente 40ºC en una solución 10 X SSC o una solución
de fuerza iónica y temperatura equivalentes. Normalmente, una
hibridación de rigurosidad moderada se lleva a cabo a
aproximadamente 50ºC en 6 X SSC, y, normalmente, una reacción de
hibridación de alta rigurosidad se lleva a cabo a aproximadamente
60ºC en 1 X SSC.
Una variante también puede definirse como una
cepa que tiene una secuencia genómica que tiene una identidad de
secuencia mayor que 85%, más preferentemente mayor que 90%, o más
preferentemente mayor que 95% con el genoma de M. roseus o
de M. albus. El hecho de que un polinucleótido o una región
polinucleotídica (o un polipéptido o una región polipepetídica)
tenga un cierto porcentaje (por ejemplo 80%, 85%, 90% o 95%) de
"identidad de secuencia" con otra secuencia significa que,
cuando se alinean, ese porcentaje de bases (o de aminoácidos) son
iguales al comparar las dos secuencias. Este alineamiento y el
porcentaje de homología o identidad de secuencia pueden
determinarse usando programas de software conocidos en la técnica,
por ejemplo, los descritos en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR
BIOLOGY (F. M. Ausubel y col., editores, 1987) suplemento 30,
sección 7.7.18, Tabla 7.7.1. Preferentemente, para el alineamiento
se usan los parámetros por defecto. Un programa preferido para el
alineamiento es BLAST, usando los parámetros por defecto.
De forma particular, los programas preferidos
son BLASTN y BLASTP, que usan los siguientes parámetros por
defecto: código genético = estándar; filtro = ninguno; hebra =
ambas; corte = 60; esperado = 10; matriz = BLOSUM62; descripciones
= 50 secuencias; clasificado por = ALTA PUNTUACIÓN; bases de datos =
traducciones no-redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ
+ PDB + GenBank CDS + SwissProtein + SPupdate + PIR. Detalles de
estos programas pueden encontrarse en la siguiente dirección de
Internet:
www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.
Los solicitantes han aislado y caracterizado un
hongo nuevo denominado Muscodor. Dos especies del nuevo
Muscodor también se han aislado y caracterizado, es decir,
Muscodor albus y Muscodor roseus. Secuencias
genómicas parciales para Muscodor albus se proporcionan en
las SEC ID Nº 1 y 2, y secuencias genómicas parciales para
Muscodor roseus (designado A3-5) se
proporcionan en las SEC ID Nº 3 y 4. También se obtuvo una
secuencia genómica parcial para M. roseus (A10). Un cultivo
aislado de Muscodor albus se ha depositado en el NRRL bajo
el número de registro 30457. Un cultivo aislado de Muscodor
roseus designado A3-5 se ha depositado en el
NRRL bajo el número de registro 30458. Por consiguiente, esta
invención proporciona un hongo nuevo aislado designado
Muscodor y dos especies del mismo, Muscodor albus y
Muscodor roseus, y mutantes de las mismas.
La presente invención también proporciona
composición(es) gaseosa(s) ("volátiles")
producida(s) por los cultivos de Muscodor aislados.
En un aspecto, la composición volátil tiene los componentes
enumerados en la Tabla 4. Las composiciones gaseosas pueden
combinarse con un agente de dispersión o un vehículo adecuado. En
otro aspecto, las composiciones opcionalmente contienen una
cantidad efectiva de uno o más entre un fungicida, un insecticida,
un nematicida, un antimicrobiano, un bactericida o un conservante
alimenticio.
Además, los solicitantes han identificado los
componentes del subproducto volátil y lo han sintetizado a partir
de materiales disponibles comercialmente. Los componentes del
volátil sintético se enumeran en la Tabla 4. Debe entenderse que,
aunque no siempre se indica explícitamente, la composición sintética
puede usarse en los procedimientos descritos en la presente memoria
descriptiva como una alternativa o como un sustituto del
subproducto gaseoso natural producido por los hongos
Muscodor.
Los gases de Muscodor afectan a un número
de otros microbios relacionados con problemas de salud humana. Son
letales para los principales fúngicos y bacterianos patógenos de
seres humanos, incluyendo a C. albicans (Tabla 2) y A.
fumigatus y especies de Pseudomonas. Mata bacterias que
contaminan alimentos, tales como S. aureus y E. coli
(Tabla 2). Se ha descubierto que es letal para especies de
Stachybotrys (contaminante de casas y edificios públicos) y
también para un número de hongos que destruyen la madera.
De este modo, los hongos y los gases producidos
por los hongos son útiles en un procedimiento no terapéutico para
inhibir el crecimiento, o matar, de un organismo seleccionado del
grupo constituido por un hongo, una bacteria, un microorganismo, un
nematodo y un insecto. Usando procedimientos bien conocidos por los
expertos en la técnica, los hongos o sus subproductos volátiles se
ponen en contacto con el organismo en una cantidad efectiva para
matar o inhibir el crecimiento del organismo. De forma alternativa,
los hongos y/o sus subproductos volátiles pueden usarse para el
tratamiento de desechos humanos o animales, por ejemplo como un
componente de aguas de desecho o en manejo o tratamiento de
sólidos. También son útiles para descontaminar desechos humanos y
animales, por ejemplo, para disminuir o eliminar la contaminación
bacteriana y fúngica. Todavía más, los hongos y/o sus subproductos
volátiles pueden usarse para el tratamiento o la prevención del moho
tóxico en materiales de construcción y en edificaciones, poniendo
en contacto la edificación, los materiales de construcción o los
espacios entre los materiales de edificación con una cantidad
efectiva del subproducto volátil. Únicamente para propósitos de
ilustración, una cantidad efectiva del subproducto volátil puede
usarse sola o en combinación con otros fumigantes en una habitación
o, como alternativa, durante fumigaciones de la edificación
completa.
\newpage
Cuando se usa en aplicaciones agrícolas, la
invención proporciona un procedimiento para el tratamiento o
protección de frutas, semillas, plantas o suelos que rodean a las
plantas de una infestación por un organismo seleccionado del grupo
constituido por un hongo, una bacteria, un microorganismo y un
insecto, poniendo en contacto el microorganismo con una cantidad
efectiva de un cultivo aislado de Muscodor o de su
subproducto volátil.
Adicionalmente, la presente invención
proporciona un procedimiento para la identificación de nuevos hongos
Muscodor, que comprende poner en contacto una cantidad
efectiva de los hongos que van a analizarse con los volátiles de
Muscodor albus o Muscodor roseus en condiciones de
cultivo y la selección de los hongos que son resistentes a los
volátiles de Muscodor albus o Muscodor roseus, de modo
que se identifican los nuevos hongos Muscodor.
Adicionalmente, se proporcionan los hongos aislados Muscodor
escogidos mediante este procedimiento.
Además también se proporciona un procedimiento
para obtener una composición volátil mediante el cultivo de
Muscodor aislados de la presente invención y la recolección
de la composición volátil producida por los Muscodor en
crecimiento.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
ilustrar la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Varias ramas pequeñas de un árbol de
Cinnamomum zeylanicum maduro ubicado a 32 kilómetros al oeste
de La Ceiba, Honduras, fueron retiradas e inmediatamente
transportadas a Montana State University para su procesamiento en
el otoño de 1997. Pequeños fragmentos de la corteza interna, la
albura y de los tejidos del xilema externo de las ramas fueron
extraídos asépticamente y colocados en placas de Petri que contienen
agar agua. Después de una incubación durante varios días, puntas de
hifas de los hongos en desarrollo se extrajeron asépticamente y se
colocaron en agar de dextrosa de patata (PDA).
Adicionalmente, después de 7 días, las colonias
de hongos se transfirieron a hojas (0,5 x 0,5 cm) de clavel
irradiadas con rayos gamma para estimular la producción de esporas.
De varios hongos que se aislaron, el de mayor interés, debido a su
olor a moho, fue un aislamiento designado "620", posteriormente
identificado como Muscodor albus.
El hongo se aisló a partir de varias ramas
pequeñas de un helecho frondoso Grevellia (Grevillea
pteridifolia) 12º 59' 39'' sur y 132º 28' 50'' este obtenidas
del territorio norte de Australia. Fragmentos pequeños de corteza
interna, albura y tejidos externos del xilema de algunas ramas
pequeñas (0,5 cm de diámetro) se extrajeron asépticamente y se
colocaron en placas de Petri que contenían agar agua (Strobel y
col., 1996). Después de incubar durante varios días, puntas de
hifas de los hongos en desarrollo se extrajeron asépticamente y se
colocaron en agar de dextrosa de patata (PDA). Adicionalmente,
después de 7 días, las colonias de hongos se transfirieron a hojas
(0,5 x 0,5 cm) de clavel irradiadas con rayos gamma y a otros
materiales vegetales para estimular la producción de esporas. De
los diversos hongos aislados, el de mayor interés, debido a su olor
a moho, fue un aislamiento designado
"A3-5".
Una cepa adicional de Muscodor se obtuvo
de las ramas pequeñas del Palo de hierro de Australia
(Erythophelum chlorostachys) a 15º 29' 29'' sur y 131º 23'
12'' este. Este endófito se aisló usando los volátiles de M.
albus como herramienta de selección. El material vegetal, del
cual los hongos endófitos iban a aislarse, se colocó en la misma
placa con agar que un cultivo de M. albus de crecimiento
rápido con dos semanas de edad. Como resultado, los únicos
organismos que se desarrollaron a partir del material vegetal fueron
los resistentes a M. albus, que son, posiblemente, otros
productores de antibióticos volátiles o relacionados con M.
albus en el grupo Xylariaceae (Strobel y col., 2001). Los
endófitos aislados con más frecuencia a partir de este árbol fueron
especies de Pestalotiopsis spp. y otras especies de
Xylaria. Internamente se designó
"A-10".
\vskip1.000000\baselineskip
El hongo se cultivó en un número de medios
diferentes, incluidos agar de caldo de soja tripticasa (TSBA), agar
de harina de maíz (CMA), agar de malta (MA), agar de dextrosa de
patata (PDA), Difco, Laboratories, Detroit, Mich. Asimismo, se
inoculó el hongo en placas de Petri que contenían agar agua con
muestras individuales de virutas pequeñas de madera de pino blanco
occidental (Pinus monticola), nogal negro (Juglans
nigra), y arce (Acer saccharum), así como fragmentos de
corteza de C. zeylanicum con el fin de estimular la
producción de esporas.
Con el fin de determinar la mejor manera de
almacenar el aislamiento 620 se probaron varias condiciones. El
hongo se cultivó en discos estériles de papel filtro Whatmann nº 1
que se colocaron en la superficie del PDA en las placas de Petri.
El hongo se inoculó en forma de tapón de agar en el centro del disco
de papel filtro sobre la placa con PDA. La placa se incubó durante
14 días a 22ºC. Después, se retiró el disco de papel y se colocó en
una campana de flujo laminar en condiciones estériles durante 1 día,
o hasta que el papel con su micelio fúngico estaba seco. El disco
de papel se cortó después en muchos fragmentos y se almacenó en
diversas condiciones. Asimismo, los tapones de agar que contenían
el hongo se colocaron en agua destilada estéril y se almacenaron a
4ºC. En otro grupo de condiciones de prueba, fragmentos de micelio
que estaban creciendo en agar se colocaron en glicerol al 15% y se
almacenaron a -70ºC. En cada prueba, la viabilidad del hongo se
determinó colocando los fragmentos de micelio sobre una placa con
PDA y se examinó el crecimiento fúngico después de
3-4 días.
Con el fin de determinar la mejor manera de
almacenar los aislamientos de Muscodor roseus (designados
internamente A3-5 y A-10) se
probaron varias condiciones. El hongo se cultivó en discos
estériles de papel filtro Whatmann nº 1 que se colocaron sobre la
superficie del PDA en las placas de Petri. El hongo se inoculó en
forma de un tapón de agar en el centro del disco de papel filtro
sobre la placa con PDA. La placa se incubó durante 14 días a 22ºC.
Después se retiró el disco de papel y se colocó en una campana de
flujo laminar en condiciones estériles durante 1 día, o hasta que
el papel con su micelio fúngico estaba seco. A continuación, el
disco de papel se cortó en muchos fragmentos y se almacenó a 23ºC,
4ºC, 0ºC y -70ºC. Asimismo, los tapones de agar que contenían el
hongo se colocaron en agua destilada estéril y se almacenaron a 4ºC.
En otro grupo de condiciones de prueba, los fragmentos de micelio
que estaban creciendo en agar se introdujeron en glicerol al 15% y
se almacenaron a -70ºC. En cada prueba, la viabilidad del hongo se
determinó colocando los fragmentos de micelio en una placa con PDA
y se examinó el crecimiento fúngico después de 3-4
días.
\vskip1.000000\baselineskip
Para el asilamiento de ADN, todos los hongos se
cultivaron en caldo de dextrosa de patata (PDA) en 1,5 ml durante
18 a 24 h a 23ºC. El micelio se recolectó mediante centrifugación y
se lavó dos veces con H_{2}O destilada y estéril. El ADN genómico
total se extrajo mediante los procedimientos de Lee y Taylor
(1990).
\vskip1.000000\baselineskip
Fragmentos parciales de pares de bases de
nucleótidos del gen del ADNr 18s de cada hongo se amplificaron
mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en forma de
un fragmento único con el cebador UK4F (5'CYGGTTGATCCTGCCRG) y UREV
(5'GYTACCTTGACGAACTT). La PCR se realizó en un vial de reacción de
50 \mul que contenía 0,1 \mug de ADN genómico, 0,4 \muM de
cada cebador, 0,16 mM de cuatro dNTP y 5 \mu de polimerasa
Taq (Promega) en un tampón de tris-HCl 10 mM
(pH 9,0 a 25ºC), KCI 50 mM, MgCl_{2} 3 mM, 0,1% de Triton
X-100. Se realizó una amplificación con 30 ciclos
(45 s a 94,5ºC, 45 s a 53,5ºC, 90 a 72,5ºC).
\vskip1.000000\baselineskip
Las regiones ITS del hongo de prueba se
amplificaron mediante PCR y los cebadores universales de las ITS
ITS5 (5'GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG) e ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC)
(White y col., 1990). La PCR se realizó en una reacción de 50
\mul que contenía 0,1 \mug de ADN genómico, 0,4 \muM de cada
cebador, 0,16 mM de cuatro dNTP y 5 \mu de polimerasa Taq
(Promega) en un tampón de tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a
25ºC), KCI 50 mM, MgCl_{2} 3 mM, y 0,1% de Triton
X-100. Las condiciones de los ciclos de la PCR
consistieron en desnaturalización a 94ºC durante 1,5 min,
hibridación a 55ºC durante 2,5 min y extensión a 72ºC durante 3 min
durante 40 ciclos, con una extensión final a 72ºC durante 10 min
(Willits, 1999). Los productos de la PCR se purificaron en gel y se
desalaron usando el equipo de purificación de PCR QuickStep (Edge
Biosystems).
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias del ADNr 18s y de las regiones
ITS 1-2 de Muscodor albus fueron enviadas al
GenBank con números de serie AF324337 y AF324336, respectivamente.
Estas secuencias también se sometieron a búsqueda o comparación con
otras secuencias fúngicas utilizando BLAST 2.1. y una búsqueda en el
NCBI en el sitio web www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Se
realizaron secuencias de comparación y alineamiento empleando
Clustal W versión 1.7 (Thomson, J. y Gibson T., 1997) y
posteriormente se alinearon manualmente.
El procedimiento de secuencia de instrucciones
iniciales de parsimonia máxima (Maximum parsimony bootstrap method,
Felsenstein, 1985) con búsqueda heurística (heuristic search) y
búsqueda heurística de consenso parsimonioso máximo se realizaron
usando PAUP* (Swofford, 1999). El análisis de secuencia de
instrucciones iniciales se estableció de la siguiente manera: 100
réplicas, intercambio de ramas por
bisección-reconexión del árbol y adición aleatoria
de secuencias. Todos los caracteres se pesaron de la misma forma.
Los taxones de referencia fueron Taphrinales:
Protomyces inouyei (número de serie en GenBank
D11377), Taphrina wiesneri (D12531), T. deformans
(U00971) y T. pruni-subcordatae
(AB000957).
Las secuencias del ADNr 18s y de las regiones
ITS1 y 2 de la colección de cultivo "A3-5"
fueron enviadas a GenBank con el número de serie AY034664 y
AY034665, respectivamente. Mientras que al ADNr 18S del aislamiento
"A-10" se le asignó AY049023. Además, las
secuencias del ADNr 18S y de las regiones ITS1 y 2 de
"A3-5" también se sometieron a búsqueda o
comparación con otras secuencias fúngicas utilizando BLAST 2.2.1
(Altschul y col., 1997), una búsqueda del NCBI en el sitio web
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Las secuencias de
comparación y alineamiento se realizaron usando CLUSTALW versión
1.7 (Thomson y Gibson, 1997), y posteriormente se alinearon
manualmente.
El análisis filogenético de los 1708 pb de las
secuencias parciales del ADNr 18S se realizó con el análisis de
parsimonia máxima del programa de Análisis de Parsimonia que Utiliza
Filogenia (Phylogeny Using Parsimony Análisis) (PAUP*) versión
4.0b4a (Swofford, 1999). El número de caracteres informativos de
parsimonia fue 190, y 1448 caracteres y son constantes. El
análisis filogenético se realizó en dieciocho taxones, incluidos
los taxones de referencia. Los taxones de referencia fueron
Taphrinales: Taphrina wiesneri (GenBank número de orden
D12531), Taphrina deformans (U00971) y Taphrina
pruni-subcordatae (AB000957). Las quince
especies restantes fueron Muscodor albus (AF324337),
Muscodor roseus (AY034664), Xylaria carpophila
(Z49785), X. curta (U32417), X. hypoxylon (U20378), X
polymorpha (AB014043), Xylaria sp. (AB014042),
Rosellinia necatrix (AB014044), Poronia punctata
(AF064052), Daldinia concentrica (U32402), Hypoxylon
fragiforme (AB014046) e Hypoxylon atroroseus (U32411),
Pestalosphaeria hansenii (AF242846), Discostroma
tricellular (AF346546) y Amphisphaeria sp. (AF346545). El
análisis de remuestreo (bootstrap) se estableció de la siguiente
manera: 100 réplicas, intercambio de ramas por
bisección-reconexión del árbol, adición aleatoria
de secuencias. Todos los caracteres se pesaron de la misma
forma.
\vskip1.000000\baselineskip
Se concibió un procedimiento para analizar los
gases en el espacio aéreo sobre los micelios de M. albus
cultivados en placas de Petri. Se usó una jeringa "de micro
extracción en fase sólida" para atrapar los volátiles fúngicos.
El material de fibra (Supelco) fue 50/30 de divinilbenceno/carbureno
en polidimetilsiloxano en una fibra estable flexible. La jeringa se
introdujo a través de un pequeño agujero perforado en el lateral de
la placa de Petri y se expuso a la fase de vapor durante 45 min.
posteriormente, la jeringa se insertó en un cromatógrafo de gases
(Hewlett Packard 5890 Series II Plus) equipado con un detector de
masas selectivo. Una columna capilar ZB Wax (30 m x 0,25 mm D.I.)
con un espesor de película de 0,50 mm se usó para la separación de
los volátiles. La temperatura de la columna se programó como sigue:
25ºC durante 2 min, seguido por 220ºC a 5ºC/min. El gas portador
fue helio de pureza ultraalta (distribuidor local) y la presión
inicial de cabeza de la columna fue de 50 kPa. La presión del He
se incrementó gradualmente con la rampa de temperatura del horno
para mantener una velocidad de flujo del gas portador constante
durante el curso de la separación. Antes de atrapar los volátiles,
la fibra se acondicionó a 240ºC durante 20 minutos con flujo de gas
helio. Se usó una inyección de 30 segundos para introducir la fibra
de muestra en el cromatógrafo de gases. El cromatógrafo de gases se
colocó en interfase con un espectrómetro de masas magnético de doble
foco VG 70E-HF operando a una resolución de masa de
1500. El espectro de masas se escaneó a una velocidad de 0,50
segundos por décima de masa en un intervalo de masas de
35-360 uma. La adquisición de datos y el
procesamiento de los datos se realizó en la interfase y paquete de
software VG SIOS/OPUS. La identificación inicial de los compuestos
desconocidos
producidos por M. albus se realizó mediante la comparación con la biblioteca usando la base de datos NIST.
producidos por M. albus se realizó mediante la comparación con la biblioteca usando la base de datos NIST.
Se efectuaron análisis comparables en placas de
Petri que contenían únicamente PDA, y los compuestos obtenidos de
ellos, principalmente estireno, fueron eliminados de los análisis
realizados en placas que contenían el hongo. La identificación
final de 20 de 28 compuestos se efectuó sobre una base comparativa
con los patrones auténticos usando los procedimientos de CG/EM
descritos en la presente memoria descriptiva. Sin embargo, los
otros 8 compuestos, que corresponden únicamente al 20%
aproximadamente de los volátiles, sólo se han identificado de
manera previsional sobre la base de la información de la base de
datos NIST y no se incluyeron en ninguna de las pruebas de
bioensayos que emplearon mezclas artificiales de compuestos de M.
albus.
Como una primera aproximación, el análisis
cuantitativo de cada compuesto encontrado en los cultivos fúngicos
se basa en su área relativa de pico obtenida después del análisis
CG/EM. Este número se empleó para preparar atmósferas artificiales
de los gases de M. albus en las proporciones relativas en las
que se producen en cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
La mayoría de los compuestos producidos por
M. albus se obtuvieron de Aldrich Chem Co., sin embargo, el
valenceno se obtuvo de Fluka Chem Co. y el bulneseno sintético se
obtuvo del Dr. Clayton Heathcock de la U. C. Berkeley, Departamento
de Química, y puede sintetizarse siguiendo los procedimientos de
Heathcock y Ratcliffe (1971).
Los otros ésteres que no estaban disponibles
comercialmente se prepararon siguiendo algunos de los procedimientos
de acilación, como se establece en Hoefle, G. y col., (1978).
Ester 2-metil,
3-metilbutílico de ácido propanoico. A una
solución a 0ºC de alcohol isoamílico (1 ml, 9,5 mmol),
4-dimetilaminopiridina (583 mg, 4,8 mmol), y
piridina (0,85 ml, 10,5 mmol) en diclorometano se añadió lentamente
cloruro de isobutirilo (2 ml 19,1 mmol). Un precipitado fue evidente
5 minutos después de que la adición se completó. Después de agitar
durante 12 h en argón, la reacción se vertió en 20 ml de HCl 0,1 N.
Se separaron las capas se separaron y se extrajo la capa acuosa con
20 ml de cloruro de metileno. Las capas orgánicas se combinaron y
se lavaron con 10 ml de cloruro de amonio acuoso saturado y luego
con 10 ml de bicarbonato sódico acuoso saturado. Las capas
orgánicas se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se
concentraron al vacío. Se purificaron mediante destilación con una
columna Vigreaux de 14 mm (pe 60-62 C, 25 mm). El
aceite transparente, incoloro resultante se agitó sobre Amberlyst
15 para eliminar todo el cloruro de isobutirilo restante. RMN
^{1}H (250 MHz, CDCl_{3}) 4,09 (t, 2H, J 6,7), 2,53 (m, 1H),
1,68 (m, 1H), 1,52 (c, 2H, J 6,5), 1,16 (d, 6H, J 7,0), 0,92 (d,
6H, J 6,5).
Ester
2-metil-etílico de de ácido
propanoico. A una solución a 0ºC de alcohol etílico (0,55 ml,
9,5 mmol), 4-dimetilaminopiridina (583 mg, 4,8
mmol), y piridina (0,85ml, 10,5 mmol) en diclorometano lentamente se
añadió cloruro de isobutirilo (2 ml 19,1 mmol). Un precipitado fue
evidente 5 minutos después de que la adición se completó. Después
de agitar durante 12 h en argón, la reacción se vertió en 20 ml de
HCl 0,1 N. Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con
20 ml de cloruro de metileno. Las capas orgánicas se combinaron y
se lavaron con 10 ml de cloruro de amonio acuoso saturado,y luego
con 10 ml de bicarbonato sódico acuoso saturado. Las capas
orgánicas se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se
concentraron al vacío. Se purificaron mediante destilación con una
columna Vigreaux de 14 mm (pe. 102ºC). ^{1}H (300 MHz,
CDCl_{3}) 4,12 (c, 2H, J 7,2), 2,52 (m, 1H), 1,25 (t, 3H, J 6,9),
1,16 (d, 6H, J 7,2).
Acetato de
3-metil-1-butanol.
En una atmósfera de argón, a una solución a 0 ºC de alcohol
isoamílico (5 ml, 45,9 mmol), N,N-dimetilpiridina
(2,8 g, 23 mmol) y piridina anhidra (4,1 ml, 50,5 mol) en
diclorometano (92 ml) gota a gota se añadió cloruro de acetilo (6,5
ml, 91,8 mmol). La mezcla de reacción se vertió en 100 ml de HCI
0,1 N, y se separaron las capas resultantes. La capa orgánica se
lavó con 50 ml cloruro de amonio acuoso saturado y luego se secó
sobre sulfato de magnesio. La capa orgánica se filtró y se
concentró al vacío hasta un aceite transparente. El aceite
resultante se purificó mediante destilación (pe
134-136ºC) para dar acetato de isoamilo. RMN
^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) 4,08 (t, 2H, J 6,9), 2,03 (s, 3H),
1,68 (m, 1H), 1,51 (c, 2H, J 6,9), 0,92 (d, 6H, J 6,6).
\vskip1.000000\baselineskip
Una tira de agar se extrajo del centro de las
placas de PDA, creando dos secciones aproximadamente iguales y
separadas donde los microorganismos pudieron crecer, como describen
Strobel y col., 2001. Un tapón de agar del cultivo de M.
albus se colocó en una sección y se cultivó durante 10 días con
las placas encerradas en una bolsa de plástico. Después de diez
días, la otra sección fue inoculada con varios patógenos fúngicos,
con placas en secciones sin M. albus como control. Se
emplearon tres placas para cada tratamiento. Penicillium
expansum, Monilinia fructicola, Candida albicans y las bacterias
se aplicaron en forma de una suspensión de esporas/células,
mientras que los otros patógenos se aplicaron en forma de un solo
tapón de micelio de 3 ó 6 mm en cada placa. El crecimiento de los
patógenos, medido por el diámetro de la colonia, se evaluó después
de 3 días. El reaislamiento de los patógenos, para evaluar su
viabilidad, se intentó al final de los experimentos levantando el
agar en el área inoculada y transfiriéndolos a placas de PDA
frescas.
La capacidad relativa de los compuestos
volátiles autentificados de M. albus para inhibir y matar los
organismos de prueba también se muestra en la Tabla 1. Se
prepararon soluciones de prueba colocando compuestos en viales en
las proporciones relativas en las que se producen en la fase gaseosa
de los cultivos de M. albus. La mezcla de prueba se colocó
en una microcápsula previamente esterilizada (4x6 mm) colocada en el
centro de una placa de Petri que contiene PDA. Cuando no estaba
siendo utilizada, la mezcla se almacenó a 0ºC. Los organismos de
prueba, cultivados recientemente y seccionados en bloques de 3
mm^{3} de agar (al menos 3 bloques de agar por hongo de prueba),
se colocaron a 2-3 cm de la microcápsula y la placa
se envolvió con dos capas de parafilm. Se realizaron mediciones del
crecimiento de los micelios desde el borde de los bloques de agar,
después de un periodo de tiempo dado. Sin embargo, en el caso de las
bacterias y de Candida albicans se sembraron mediante
raspado en el lado de prueba de la placa con PDA y se verificó si
presentaban nuevo crecimiento visible y la viabilidad mediante una
nueva siembra mediante raspado desde el área original de la placa
de agar que había sido inoculada. También se establecieron controles
adecuados en los que no se colocó solución de prueba en la
microcápsula. Se realizaron pruebas con 3,2-90
\mul de la mezcla artificial por 50 cc de espacio aéreo sobre la
placa con PDA en 3 duplicados con el fin de obtener los datos de la
CI_{50} para cada organismo de prueba. También se evaluaron
clases individuales de compuestos en las cantidades relativas en
las que se producen a la concentración óptima de la mezcla completa,
que corresponde a 60\mul de la mezcla de prueba por 50 cc de
espacio aéreo sobre el cultivo en una placa de Petri estándar. Por
ejemplo, los ésteres representan el 44% de la mezcla de los
volátiles identificados y se evaluaron a 26,4 \mul/50 cc de
espacio aéreo y se usó el mismo procedimiento para cada una de las
otras clases de compuestos que se identificaron. Finalmente, cada
compuesto individual, especialmente entre los ésteres, se evaluó a
la concentración o porcentaje relativo en el que ocurre en 60
\mul. La viabilidad de los microbios de prueba se midió eliminando
asépticamente el pequeño bloque de agar y colocándolo en una placa
de PDA y observando el crecimiento después de 1-3
días.
Ninguno de los patógenos, a excepción de F.
solani y F. oxysporum lycopersici, crecieron en presencia
de M. albus (Tabla 1) y se inhibió su crecimiento. Los dos
patógenos sobrevivieron en presencia de M. albus, cuando se
transfirieron a placas frescas tres días después. Además, los
volátiles de M. albus no mataron al mismo M. albus o
a su pariente cercano Xylaria sp., aunque sí inhibieron el
crecimiento de Xylaria sp. (Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Las clases individuales de compuestos en los
volátiles naturales de M. albus se evaluaron con el fin de
determinar la actividad biológica relativa de cada una. Cada clase
de compuestos, en las proporciones relativas en las que se producen
se evaluó al nivel de los porcentajes en los que se producen en el
total de 60 \mul/50 cc (1,2 \mul/cc) (Tabla 5). Esto se realizó
con un grupo selecto de 7 hongos de prueba. Cada grupo de compuestos
poseía algo de actividad inhibitoria contra los organismos de
prueba (Tabla 5). Sin embargo, sobre una base comparativa, los
ésteres tuvieron más actividad inhibitoria que cualquier otro grupo
de compuestos (Tabla 5).
Cada compuesto en la clase de los ésteres se
evaluó individualmente. Cuando una prueba comparable para cada
éster se realizó según las condiciones indicadas en la Tabla 5, el
acetato de
3-metil-1-butanol
prácticamente reprodujo los resultados de todos los ésteres como se
indica en la Tabla 5. Representó el 62% de todos los ésteres
combinados identificados y, por tanto, se evaluó al nivel de 0,32
\mul/cc. Adicionalmente, el éster
1,metil-3-metilbutílico de ácido
propiónico mostró una bioactividad inhibitoria mínima y poca o
ninguna actividad por parte de los otros ésteres. Aunque los
ésteres, y el 3-metil-acetato de
1-butanol presentaron actividad inhibitoria en los
análogos de bioensayos, bajo ninguna condición en ninguno de los
ensayos se observó la muerte de ningún hongo de prueba después del
periodo estándar de exposición de 3 días (Tabla 5). Esta es una
observación significativa, ya que la muerte de los organismos de
prueba se observó tanto en la atmósfera completamente artificial
como en la atmósfera natural de la placa de Petri con M.
albus. Este resultado sugiere fuertemente que un mecanismo
sinérgico o aditivo es operativo en el caso de los volátiles de
M. albus. Por consiguiente, mientras que cada clase de
compuestos posee más o menos actividad inhibitoria, se re-
quiere una mezcla completa de los ingredientes para matar por completo los hongos y bacterias de prueba (Tabla 1).
quiere una mezcla completa de los ingredientes para matar por completo los hongos y bacterias de prueba (Tabla 1).
Sobre la bse del hecho de que los volátiles de
M. albus pueden inhibir y matar E. coli (Tabla 1) se
realizaron experimentos con M. albus para determinar si sus
gases pueden inhibir y matar la microflora presente en desechos
humanos y animales, tal como E. coli y otros microbios
fecales. Normalmente, estos microbios son la causa de la disentería
y otras enfermedades durante tiempos de crisis mayores, entre las
que se incluyen los desastres naturales y las guerras. Existe la
posibilidad de que M. albus pueda desarrollarse y usarse
para aplicaciones de campo para descontaminar los desechos humanos y
animales. Así, de acuerdo con nuestros experimentos, se preparó una
colonia de dos semanas de edad de M. albus cultivada en una
mitad de una placa de Petri que contiene PDA. A continuación, en la
otra mitad de la placa separada se sembró mediante raspado
(empleando procedimientos microbiológicos estándar) desechos humanos
sólidos. Se montó una placa de control en la que no estaba presente
ninguna colonia de M. albus. Después de dos días de
incubación a 23ºC había un número significativamente mayor de
colonias fúngicas y bacterianas en crecimiento en la placa control
que en la placa con M. albus. En un experimento comparable,
M. albus se incubó únicamente en desechos humanos líquidos
(orina) y se impidió el crecimiento bacteriano total en contraste
con un control (sin M. albus) en el que floreció crecimiento
bacteriano.
\vskip1.000000\baselineskip
Para estos experimentos, el medio de crecimiento
se infestó en primer lugar con R. solani añadiendo un
cultivo en una placa PDA a 1 l de medio de crecimiento
(vermiculita). Esta proporción permite un 100% de mortalidad en los
brotes con baja variabilidad entre macetas. Después, al medio en
crecimiento se añade Muscodor albus en varias formas, que
después se coloca en macetas de plástico de 7,62 centímetros. En las
macetas se siembran aproximadamente 70 semillas de brécol, se
colocan en una bandeja y se surten de agua desde el fondo. Los
brotes se cuentan después de aproximadamente una semana. Los
controles consisten en R. solani solamente, Muscodor
albus solamente y medio de crecimiento sencillo. Dependiendo del
experimento, hay 3 o 4 macetas por tratamiento, dispuestas en un
diseño completamente aleatorio.
Un cultivo líquido de 10 días de edad de PDB se
homogeneizó durante algunos segundos en una batidora y se incorporó
a una velocidad de 50 ó 200 ml por litro de vermiculita. El
tratamiento del cultivo en agar sólido se realizó como se describió
en lo que antecede, con 2 placas de cultivo de 2 semanas de edad por
litro. Las macetas se sembraron inmediatamente después de
llenarse. El efecto de sellar los volátiles en las macetas también
se investigó: para cada tratamiento, una bolsa de plástico se selló
sobre 3 macetas con una banda de goma, mientras que otras 3 macetas
se dejaron sin cubrir. Las bolsas se sacaron después de 3 días. Los
resultados mostraron que el cultivo líquido aplicado a la mayor
velocidad (200 ml/l de vermiculita) fue tan efectivo en la
prevención de la destrucción de las semillas por los hongos, como
los cultivos sólidos de Muscodor en PDA (Tabla 2). El efecto
de la aplicación de Muscodor parece ser inmediato, debido a
que las tasas de brote obtenidas con estos tratamientos fueron
normales, a pesar de que no se realizó un periodo de incubación
antes del plantado. La menor proporción de cultivo líquido causó
cierta reducción en la destrucción de las semillas por los hongos,
pero no fue tan efectiva. El sellado de los volátiles en la maceta
con una bolsa de plástico no mejoró la eficacia (Tabla 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Se efectuaron heridas individuales con un clavo
en el ecuador de manzanas, cv Gala, que se introdujeron en platos
de plástico, con la herida hacia arriba, en cajas de plástico de 3,8
l. Se colocaron nueve manzanas en cada caja y se utilizaron tres
cajas por tratamiento. A las frutas se les inoculó el moho azul,
Penicillium expansum, mediante pipeteado de 20 \mul de
suspensión conidial (10^{4}/ml) en cada herida ya sea 24 horas
antes (pre-inoculación) o inmediatamente antes del
experimento. Para el tratamiento de fumigación con Muscodor,
140 gramos de granos de centeno colonizados se colocaron en los
contenedores que posteriormente se sellaron. El control contenía
únicamente frutas inoculadas en cajas selladas. Se incubaron a
temperatura ambiente (19-22ºC). La enfermedad se
evaluó como el porcentaje de frutas infectadas después de 7,14 y 21
días (Tabla 3). El tratamiento que se pre-inoculó
no mostró infección en la manzanas, mientras que se observó una
tasa de infección muy baja, de solamente 7%, a los 21 días, para
las frutas inoculadas inmediatamente antes de la exposición de la
fruta a Muscodor.
\vskip1.000000\baselineskip
En las placas, empleando el sistema de foso
(Worapong y col., 2001) se inoculó en un lado M. albus y en
el lado opuesto E. coli, o nematodos vivos libres con E.
coli. Se montaron placas idénticas sin el Muscodor.
Después de cinco días, la placa sin el Muscodor había
desarrollado una gran población de nematodos en reproducción, que
cruzaron el foso y estaban empezando a poblar el lado opuesto del
plato de Petri. La E. coli había crecido con la morfología
normal de la colonia en la otra placa compañera. La placa tratada
con Muscodor había desarrollado una colonia sustancial que
estaba enviando micelios a través de la superficie del PDA. Los
nematodos que estaban presentes eran lentos, aunque móviles. Después
de 7 días, el Muscodor alcanzó el borde del PDA y estaba
enviando micelios hacia el foso de la placa con E. coli y a
la placa con los gusanos redondos. Únicamente un pequeño número de
nematodos adultos vivos estaba presente en el agar y su movilidad
era limitada.
\vskip1.000000\baselineskip
En una caja de plástico (de aproximadamente 1613
cm^{2}) se introdujeron tres vasos de precipitado de plástico
pequeños que contenían aproximadamente 150 gramos de semillas de
centeno sometidas a autoclave colonizadas con M. albus. Se
montó otra caja a temperatura ambiente sin los tres vasos de
precipitados con hongo. Las dos cajas contenían una placa de Petri
de PDA con un tapón pequeño de Rhizoctonia solani en el
centro, como indicador para el bioensayo. En cada caja se
introdujeron placas de microtitulación de 96 pocillos que contenían
huevos del gusano de la remolacha que habían sido expuestos a una
dieta artificial. Después de dos días, los huevos en la caja sin
el Muscodor empezaron a eclosionar y el R. solani
desarrolló nuevos micelios. Los huevos del gusano de la remolacha
no eclosionaron en la caja que contenía el cultivo en centeno de
M. albus. Además, se suprimió el crecimiento de R.
solani. Después de 5 días, los gusanos en la caja sin
tratamiento habían alcanzado el segundo y tercer
estadio.
estadio.
Pares de placas de microtitulación se
introdujeron en las cajas con larvas de gusano que habían estado
creciendo durante tres días con una dieta artificial. En la placa
en la caja con Muscodor se interrumpió la alimentación y
permanecieron atrofiados en comparación con los controles sin
tratamiento. Después de 5 días, los gusanos en la placa con
tratamiento estaban muertos.
\vskip1.000000\baselineskip
Pares de placas de microtitulación se
introdujeron en las cajas con huevos de gusano de raíz del maíz que
habían sido expuestos a una dieta artificial. Cuando los huevos
acababan de empezar a eclosionar, las placas se introdujeron en
las cajas de prueba. Aproximadamente la mitad de los huevos
eclosionaron en la caja con Muscodor. Los restantes no
eclosionaron y todos los neonatos estaban muertos a los dos días. La
placa de microtitulación en la caja de control sin tratamiento
desarrolló una infestación normal que progresó con
3-6 larvas de tercer estadio por pocillo, después de
una semana.
\vskip1.000000\baselineskip
En experimentos controlados y reproducidos, 25
semillas de cebada infestadas con Ustilago hordei (carbón
cubierto, Tabla 6) se colocaron en cada una de dos placas de agar
con los gases de M. albus durante cuatro días y
posteriormente se sembraron en macetas de prueba en un invernadero.
Después de 15 semanas se procedió a la recolección de las plantas y
se evaluó la presencia de carbón en las cabezas de semillas. Hubo un
100% de control para esta enfermedad en dos grupos de plantas que
habían sido expuestas a los gases de M. albus y ningún signo
de inhibición o daño a las plantas provocado por el tratamiento con
gases. Un número idéntico de plantas de control (sin tratamiento y
de semillas infestadas con U. hordei) presentaron
respectivamente 50% y 41%, de cabezas de semillas infestadas en
este experimento. Asimismo, como se esperaba, las semillas no
infectadas generaron plantas que no tenían granos con la
enfermedad.
\vskip1.000000\baselineskip
Muscodor albus, gen. et sp. nov., es una
especie endófita de deuteromicetos (mycelial sterilia) que está
relacionada a nivel molecular con el grupo Xylaria de ascomicetos.
El hongo está relacionado con Xylariaceae en virtud de su
homología del 96-98% de su ADNr 18S (2089 pb) con
miembros representativos de este grupo. Adicionalmente, las
secuencias ITS1, 5.8S, e ITS2 (652 pb) de M. albus mostraron
una relación cercana con varias especies de Xylaria,
incluidas X. arbuscula, X. longipes, y X. mali
en el nivel del 89-92%. Tanto el ADNr 18S como el
ADNr de las regiones ITS 1 y 2 5.8S son únicos y, por consiguiente,
Muscodor se considera un género y especie taxonómicamente
diferente. (Worapong y col., 2001).
Los volátiles de M. albus también se
analizaron frente a plantas inoculadas con hongos patógenos. Los
volátiles no presentaron, por ellos mismos, efectos perjudiciales en
las plantas superiores que se analizaron. Sin embargo, fue posible
demostrar un 100% de control del Carbón cubierto de la cebada usando
los volátiles para el tratamiento de las semillas inoculadas con
Ustilago hordei. Por consiguiente, a causa de la potencial
importancia práctica de los hongos productores de antibióticos
volátiles se consideró importante determinar si existen en la
naturaleza otros organismos de este grupo.
Usando técnicas estándar para el aislamiento de
hongos endófitos, así como el uso de los volátiles de M.
albus como una herramienta de selección en los cultivos, se
aislaron por lo menos dos endófitos más productores de antibióticos
volátiles. Estos organismos se obtuvieron de dos especies diferentes
de árboles nativos de Australia. Estos dos cultivos fúngicos
compartían similitudes con M. albus porque no producían
cuerpos fructíferos en el cultivo, no producían esporas,
presentaban un olor a moho y producían inhibición o eran letales
para muchos microorganismos. Sin embargo, del mismo modo, estos
organismos poseían características de cultivo, químicas y de
biología molecular que los diferencian de M. albus.
Se ha demostrado claramente que las
características moleculares de un organismo son únicas para éste y
pueden usarse para ayudar en la clasificación, especialmente cuando
no hay estructuras críticas (producción de esporas) u otras
características. Por lo tanto, el procedimiento de mapeo de
caracteres filogenéticos combinado con datos morfológicos puede ser
útil en la identificación de hongos. Habitualmente, los genes del
ADNr son escogidos para propósitos taxonómicos porque presentan un
alto grado de conservación. (Bruns y col.; Guarro y col., 1999 y
Mitchell y col. 1995). Además de su ADNr 18S, las secuencias ITS 1 y
2 también se conservan. Después de buscar secuencias parciales del
ADNr 18s de M. roseus "A3-5" (2055 pb)
con datos en GenBank con BLASTN 2.2.1, los resultados mostraron un
100% de similitudes con 2089 pb de Muscodor albus (AF324337)
desde el sitio 1-981, 1319-2048, y
un 98% de similitudes con 982 pb de Xylaria polymorpha
(AB014043) e Hypoxylon fragiforme (ABO14046), y un 97% de
similitudes con 982 p bde Rosellinia necatrix (AB014044).
Además, el aislamiento "A-10" posee un 99% de
similitud de secuencia en su ADNr 18s (2051 pb) en comparación con
el aislamiento "A3-5."
Por otra parte, análisis comparativos de las
secuencias ITS 1 y 2 y del ADNr 5,8s de M. roseus
"A3-5" coincidió con las ITS 1 y 2 de
Muscodor albus (AF324337), X. arbuscula CBS 452.63
(AF163029) y CBS 454.63 (AF163028), X. enteroleuca CBS 148,
(AF163033), X. longipes CBS 148.73 (AF163038), X mali
CBS 385.35 (AF163040), X cornu-damae CBS
724.69 (AF163031), en un 99, 91, 91, 91, 90 y 89% de similitudes,
respectivamente. No se encontraron identidades totales ya sea de
secuencias parciales del ADNr 18s o de secuencias ITS 1 y 2 y del
ADNr 5.8S.
Análisis filogenéticos basados en las secuencias
18S mostraron que M. roseus es un grupo hermano de
Muscodor albus (AF324337) con confianza de secuencia de
cebado de 100% a partir de 100 duplicados. Además, el análisis de
parsimonia máxima mostró que tanto M. albus como M.
roseus están más estrechamente relacionados con Xylariaceae,
por ejemplo Xylaria spp., Rosellinia necatrix
(AB014044) y Poronia punctata (AF064052) que con tres
géneros representativos de Amphishaeriaceae: Pestalosphaeria
hansenii (AF242846), Discostroma tricellular (AF346546)
y Amphisphaeria sp. (AF346545) con confianza de secuencia de
cebado del 68% a partir de 100 duplicados (Felsenstein, 1985). Este
resultado también se apoyó con un árbol filogenético de búsqueda
heurística de estricto consenso de 30 cladogramas del ADNr 18S
igualmente más parsimoniosos. Por consiguiente, M. roseus
debe colocarse en la familia Xylariaceae, Xylariales. Además, los
resultados de la comparación tanto del ADNr 18s como de las
regiones ITS 1 y 2 y el ADNr 5.8s de M. roseus
"A3-5" presentan grandes similitudes con M.
albus (Worapong y col. 2001). También, los datos de biología
molecular (ADNr 18s) sugieren que ambos aislamientos
"A3-5" y "A-10" de M.
roseus deben considerarse como estrechamente relacionados y
organismos prácticamente idénticos. Adicionalmente, los datos de
biología moleculare proporcionan cierto apoyo al concepto para la
división de M. albus, previamente descrita, a partir de esta
nueva especie fúngica propuesta: M. roseus.
Mientras que la biología molecular de M.
roseus muestra que este organismo tiene el mejor ajuste en el
grupo Xylariaceae, también demuestra una relación estrecha del ADNr
18s con M. albus. Sin embargo, debido a que hay tal
relación a nivel molecular limitado del ADNr, podría argumentarse
que los dos hongos son idénticos. A pesar de esto, se analizaron
otras características químicas tanto en M. albus como en
M. roseus y se descubrió que eran diferentes. Por lo tanto,
aunque tanto M. albus como M. roseus compartían la
capacidad bioquímica de producir un olor a moho, que se demostró que
tenía potentes propiedades antibióticas, muchos de los volátiles
producidos por estos dos organismos resultaron idénticos, según
mediciones por CG/EM. Con frecuencia se ha observado que los hongos
producían diversas sustancias olorosas, pero las impresionantes
propiedades antibióticas de Muscodor spp. parecen ser únicas
(Bjurman y col., 1992; Rapoir y col., 2000 y Schnurer y col.,
1999). Sin embargo, los volátiles de estos dos hongos también
contenían compuestos diferentes (Strobel y col., 2001). Como un
ejemplo, M. albus producía 2-nonanona,
cariofileno, y éster 2-feniletílico de ácido
acético, aunque estos compuestos no se detectaron en ningún
aislamiento de M. roseus. Por otra parte, los dos
aislamientos de M. roseus produjeron compuestos no detectados
en volátiles de M. albus, tal como éster etílico de ácido
2-butenoico; 1,2,4-trimetilbenceno y
2,3 nonadieno. Este resultado aporta cierto apoyo químico a la
asignación realizada en este informe que sugiere que M. albus
es taxonómicamente diferente de M. roseus.
Otras características más clásicas de M.
roseus (aislamientos "A3-5"
y"A-10") también se analizaron y compararon
con M. albus. Estos aislamientos de M. roseus
produjeron un micelio de crecimiento lento, denso y de color rosa
claro en todos los medios probados. Esto contrasta con M.
albus, que produce un micelio blancuzco en todos los medios
comparables probados. (Worapong y col., 2001). No se formaron
esporas en ningún medio, incluidos aquéllos que contenían el
material de la planta huésped u hojas de clavel. El diámetro de las
hifas vaió (0,8-3,6 \mum) y frecuentemente estaban
entretejidas para producir estructuras más complejas e incluso
espirales de hifas. Generalmente, estas hifas eran más grandes que
las de M. albus. Generalmente, lLos micelios de M.
roseus forman, en el cultivo, estructuras entretejidas más
complejas en comparación con M. albus. De hecho, la
aparición de espirales de hifas de hongos en cultivos no es
habitual, según nuestra experiencia, no obstante estas estructuras
aparecieron con frecuencia en cultivos de M. roseus.
Finalmente, debe apreciarse que, para M.
roseus, la mejor condición de almacenamiento fue después de
secarlo en papel filtro y colocarlo a -70ºC. En estas condiciones
el hongo permanece viable durante más de 1,5 años. Asimismo, este
hongo podría almacenarse a 4ºC en agua estéril, pero con menos
certeza de recuperar un organismo viable después de 6 meses.
También, el almacenamiento en glicerol al 15% a -70ºC conservó de un
modo efectivo la viabilidad del organismo.
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Claims (13)
1. Un procedimiento para identificar hongos
Muscodor, que comprende poner en contacto una cantidad efectiva de
los hongos que se van a someter a detección selectiva con volátiles
de Muscodor albus o de Muscodor roseus en condiciones
de cultivo, seleccionar los hongos resistentes a los voláticles del
Muscodor albus o de Muscodor roseus y analizar las
características moleculares de los hongos seleccionados.
2. Un hongo Muscodor aislado que se puede
obtener mediante el procedimiento definido en la reivindicación
1.
3. El hongo Muscodor aislado de la
reivindicación 2, en el que el hongo se selecciona del grupo
constituido por Muscodor albus, Muscodor roseus y
mutantes de los mismos.
4. Una composición que comprende un hongo
Muscodor aislado de acuerdo con las reivindicaciones 2 o
3.
5. Una composición que comprende todos los
volátiles producidos por un hongo Muscodor aislado, en la que
los volátiles comprenden octano, acetona, acetato de metilo,
acetato de etilo, éter metílico de ácido
2-metil-propanoico, etanol, éster
etílico de ácido 2-metil propanoico, éster de
2-metilpropílico de ácido 2-metil
propanoico, alcohol isobutílico,
1-butanol-3-metil-acetato,
éster 3-metilcutílico de ácido
2-metil-propanoico,
1-butanol-3-metilo,
2-pentil-furano,
4-nonanona, 2-nonanona,
(4aR-trans)-dec-anhidro-4ª-metil-1-metilen-7-(1-metiletiliden)-naftaleno,
1,2,3,4,5,6,7,8-octahidro-1,4-dimetil-7-(1-metiletenil)-[1S-(1.alfa,
4-alfa,
7-alfa)]-azuleno,
4-(1,5-dimetil-1,4-hexadienil)-1-metil-ciclohexeno,
2,3,4,7,8,8a-hexahidro-3,6,8,8-tetrametil-[3R-(3.alfa,
3a-beta., 7.beta.,
8a.alfa.)]-1H-3a,
7-metanoazuleno, ácido
2-metil-propanoico, cariofileno,
1,2,4a,5,6,8a-hexahidro-4,7-dimetil-1-(1-metiletil)-[1R-(1-alfa.,4a.alfa.,8a.alfa)]-naftaleno,
3,7,7-trimetil-11-metilen-espiro[5.5]undec-2-eno,
1,2,3,5,6,7,8,8a-octahidro-1,4-dimetil-7-(1-metiletilenil)-[1S-(1.alfa.,7.alfa.,8a.beta)]-azuleno,
1,2,3,5,6,7,8,8a-octahidro-1,8a-dimetil-7-(1-metilete-
nil)-[1R-(1.alfa.,7.beta.,8a.alfa.)]-naftaleno, éster 2-feniletílico de ácido acético y alcohol feniletílico.
nil)-[1R-(1.alfa.,7.beta.,8a.alfa.)]-naftaleno, éster 2-feniletílico de ácido acético y alcohol feniletílico.
6. La composición de la reivindicación 4, que
además comprende un vehículo.
7. La composición de la reivindicación 6, en la
que el vehículo es un vehículo aceptable para fines agrícolas.
8. La composición de cualquiera de las
reivindicaciones 4-7, que comprende además una
cantidad efectiva para fines agrícolas de una composición
seleccionada del grupo constituido por un funguicida, un
insecticida, un antimicrobiano, un bactericida, un nematicida y un
conservante de alimentos.
9. Un procedimiento no terapéutico para inhibir
el crecimiento de un organismo seleccionado del grupo constituido
por un hongo, una bacteria, un microorganismo, un nematodo y un
insecto, que comprende exponer al organismo a una cantidad efectiva
de la composición de cualquiera de las reivindicaciones
4-7.
10. El procedimiento de la reivindicación 9
tratar o proteger frutas, plantas, semillas, granos o el suelo que
rodea a las plantas de una infestación por un organismo seleccionado
del grupo reconstituido por un hongo, una bacteria, un
microorganismo, un nematodo y un insecto.
11. El procedimiento de la reivindicación 9 para
tratar o proteger metarial de construcción de infestaciones por
mohos tóxicos.
12. El procedimiento de la reivindicación 10,
que comprende exponer las frutas, las plantas, las semillas, los
granos o el suelo que rodea a las plantas a una cantidad eficaz de
una composición agrícola seleccionada del grupo constituido por un
funguicida, un insecticida, un antimicrobiano, un bactericida, un
nematicida y un conservante alimenticio.
13. Un procedimiento para obtener una
composición volátil de un hongo Muscodor aislado de acuerdo
con la reivindicación 2, que comprende cultivar el hongo
Muscodor aislado y recolectar la composición volátil
producida por el hongo en crecimiento.
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