ES2333835B2 - Compuestos hibridos tripirrol-octaarginina. - Google Patents

Compuestos hibridos tripirrol-octaarginina. Download PDF

Info

Publication number
ES2333835B2
ES2333835B2 ES200802520A ES200802520A ES2333835B2 ES 2333835 B2 ES2333835 B2 ES 2333835B2 ES 200802520 A ES200802520 A ES 200802520A ES 200802520 A ES200802520 A ES 200802520A ES 2333835 B2 ES2333835 B2 ES 2333835B2
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
baselineskip
compound according
tripyrrole
group
spacer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES200802520A
Other languages
English (en)
Other versions
ES2333835A1 (es
Inventor
Olalla Vazquez Vazquez
Eugenio Vazquez Sentris
Juan Bautista Blanco Canosa
Jose Martinez Costas
Jose Luis Mascareñas Cid
Luis Castedo Exposito
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universidade de Santiago de Compostela
Original Assignee
Universidade de Santiago de Compostela
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universidade de Santiago de Compostela filed Critical Universidade de Santiago de Compostela
Priority to ES200802520A priority Critical patent/ES2333835B2/es
Priority to PCT/ES2009/070356 priority patent/WO2010023346A1/es
Priority to EP09809368A priority patent/EP2336108A4/en
Priority to US13/119,954 priority patent/US20110237499A1/en
Publication of ES2333835A1 publication Critical patent/ES2333835A1/es
Application granted granted Critical
Publication of ES2333835B2 publication Critical patent/ES2333835B2/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4025—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. cromakalim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Compuestos híbridos tripirrol-octaarginina.
Híbridos formados por un grupo tripirrol unido a un péptido de poliarginina que permiten la internalización celular eficiente y promueve una mayor afinidad por el ADN. Su método de obtención y sus usos.

Description

Compuestos híbridos tripirrol-octaarginina.
La presente invención se refiere a un compuesto formado por un grupo tripirrol unido a un péptido de poliarginina. Además, se refiere a su método de obtención y sus usos, puesto que dicho compuesto permite la internalización celular eficiente y promueve una mayor afinidad por el ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Estado de la técnica anterior
Una de las estrategias moleculares de mayor interés para el desarrollo de agentes antibióticos o antitumorales se basa en la interacción de determinadas moléculas con zonas específicas del ADN (L. Strekowski, Mutation Res. 2007, 623, 3-13).
Algunas de estas moléculas se encuentran en fase de ensayo clínico, y otras, como las antraciclinas o la bleomicina, ya se vienen utilizando en clínica desde hace años.
La mayoría de los DNA minor groove-binding ligands (MGBLs) presentan dificultad para atravesar las membranas celulares y alcanzar de forma eficiente el núcleo celular. Así, por ejemplo, poliamidas basadas en el antibiótico Distamicina A, a pesar de que son capaces de interaccionar con secuencias específicas del ADN, experimentan procesos de internalización celular muy lentos, y dependientes de su estructura. (N.G. Nickols, C.S. Jacobs, M.E. Farkas, P.B. Dervan, Nucleic Acids Res. 2007, 35, 363-370; Edelson, T.P. Best, B. Olenyuk, N.G. Nickols, R.M. Doss, S. Foister, A. Heckel, P.B. Dervan, Nucleic Acids Res. 2004, 32, 2802-281)).
En este sentido algunos documentos del estado de la técnica, por ejemplo la solicitud de patente WO2008043366, que se refieren a compuestos para el transporte de agentes biológicos a través de membrana. Algunos de estos compuestos son péptidos cationicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Explicación de la invención
La presente invención pretende solucionar el problema de la dificultad de ciertos agentes que interaccionan con ADN en atravesar las membranas celulares y alcanzar de forma rápida el núcleo celular, así como mejorar la interacción con el ADN sin pérdida de selectividad. Para ello, la presente invención se refiere a la conjugación de un elemento de reconocimiento del surco menor del ADN de tipo tripirrólico con fragmentos de poliarginina con el fin de obtener agentes que interaccionan con ADN "in vivo" de forma rápida y eficiente (Fig. 1).
Con el fin de estudiar relaciones estructura-función se prepararon una serie de híbridos péptido-tripirrol, así como controles sin el tripirrol y sin el péptido de poliarginina, y se incorporó un grupo fluoróforo en las moléculas para poder realizar el seguimiento del proceso de internalización celular mediante análisis con un microscopio de fluorescencia. Los ensayos de internalización se realizaron en células HeLa vivas.
Los resultados, que se aportan en el apartado de ejemplos, demuestran como la conjugación de un tripirrol a octaargininas permiten una internalización celular eficiente y una localización muy rápida en el núcleo celular. La presencia de la región peptídica básica provoca un aumento muy destacable en la afinidad del sistema por secuencias de ADN ricas en adeninas (más de 100 veces con respecto al tripirrol solo). El funcionamiento de estos conjugados se fundamenta en la sinergia entre el elemento de reconocimiento específico (tripirrol) y el fragmento peptídico, que no solo facilita el transporte celular sino que también promueve una mayor afinidad por el ADN.
Por todo ello, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto que comprende un elemento de reconocimiento del surco menor del ADN de tipo tripirrólico unido a un péptido poliarginina, más concretamente la octaarginina ((Arg)_{8}). Esta unión se produce por medio de un grupo espaciador que comprende, al menos, una lisina (Lys) por la que se une el tripirrol. (A partir de ahora los denominaremos compuestos de la invención).
Como elemento de reconocimiento del surco menor del ADN ó ligandos del surco menor del ADN (DNA minor groove-binding ligands ó MGBLs) se conocen una serie de compuestos que exhiben una serie de propiedades antitumorales, antimicrobianas, antivirales y antiprotozoo. Se conoce que las estructuras que contienen un imidazol y un pirrol, del tipo de la poliamida heterocíclica Distamicina pueden unirse al surco menor de la doble hélice, preferentemente en zonas ricas en AT, aumentando la torsión de la doble hélice, induciendo un superenrollamiento positivo e interfiriendo tanto en la replicación como en la transcripción. La unión al ADN se debe en parte a que los hidrógenos amida de las N-metilpirrolcarboxamidas forman puentes de hidrógeno bifurcados con los átomos N_{3} de la adenina y O_{2} de la timidina en el surco menor (Koopka et al., 1985. Proc. Natl. Acad. Sci. 82:1376; Koopka et al., 1985. J. Mol. Biol. 183:553). Los anillos de pirrol llenan completamente el surco, excluyendo el grupo amino de la guanina de los pares de bases G,C, mientras establecen fuerzas de van der Waals con las paredes del surco, mostrando afinidad por las secuencias ricas en A y T (Taylor et al., 1985. Tetrahedron 40:457; Schultz & Dervan. 1984. J. Biomol. Struct. Dyn. 1:1133).
Con el fin de estudiar la internalización y la unión de este complejo con el ADN, se unió a un grupo fluoróforo, por lo que en una realización preferida de la invención, este compuesto puede estar unido a su vez a un grupo fluoróforo, preferiblemente fluoresceína (Flu).
En otra realización preferida de la presente invención, el tripirrol presenta la fórmula general (I):
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
Donde, R_{1} es un sustituyente que puede ser igual o diferente en cada caso y se selecciona independientemente de la lista que comprende H, un grupo alquilo (C_{1}-C_{6}) o un grupo acilo; R_{2} es un grupo alquilo sustituido de fórmula general (IIA):
\vskip1.000000\baselineskip
2 
\vskip1.000000\baselineskip
o de fórmula general (IIB):
\vskip1.000000\baselineskip
3 
\vskip1.000000\baselineskip
Donde R_{1} se define como anteriormente y n toma valores entre 1 y 6, preferiblemente 3, 4 y 5, y R_{4} es un sustituyente que puede ser igual o diferente en cada caso y se selecciona independientemente de la lista que comprende H, o un grupo alquilo (C_{1}-C_{6}), preferentemente un metilo.
R_{3} es un grupo alquilo sustituido de fórmula general (III):
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\vskip1.000000\baselineskip
Donde R_{1} y n se definen como anteriormente.
\newpage
En una realización aún más preferida, R_{1} es igual o diferente en cada caso y se selecciona independientemente de la lista que comprende H, un grupo alquilo (C_{1}-C_{3}), preferiblemente metilo o un grupo acetilo. Más preferiblemente el compuesto tripirrolico es el siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
Donde 100 representa el sitio de unión con la lisina del espaciador.
El término "alquilo" citado como sustituyente de R_{1} se refiere en la presente invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 6 átomos de carbono. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 3 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo o n-propilo.
En cuanto al espaciador de la presente invención, se trata de una estructura compuesta por al menos un aminoácido lisina (Lys), al que se unirá el tripirrol y grupos ácido 6-aminohexanoico (Ahx), donde se unirá el péptido y/o el fluoróforo en caso de que este se incluya.
En una realización preferida, el espaciador es del tipo (Lys-Ahx) o (Ahx-Lys-Ahx), esta última presentaría la siguiente fórmula (IV):
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\newpage
En una realización más preferida, el compuesto es el de fórmula 6A o cualquiera de sus sales o isómeros:
7
En otra realización más preferida, el compuesto es el de fórmula 1A o cualquiera de sus sales o isómeros, similar al compuesto 6A, y que incorpora el grupo fluoróforo en su estructura:
8
La síntesis de estas moléculas se realizó usando metodologías en fase sólida, por lo que otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de obtención de los compuestos descritos, que comprende los siguientes pasos:
a) Síntesis de los péptidos mediante métodos Fmoc en fase sólida (fmoc-péptidos)
\bullet
desprotección temporal del grupo Fmoc
\bullet
acoplamiento de los aminoácidos
\bullet
desprotección selectiva del residuo lisina
\bullet
fraccionamiento y desprotección.
\vskip1.000000\baselineskip
b) Síntesis de los compuestos tripirrol-poliarginina
\bullet
acoplamiento del amino tripirrol al péptido, mientras este está todavía unido a la fase sólida y protegido.
\bullet
Eliminación de los grupos protectores y separación de la resina sólida.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema general síntesis de compuestos sin fluoroforo 
\vskip1.000000\baselineskip
9 
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema general síntesis de compuestos con fluoroforo 
\vskip1.000000\baselineskip
90
Los compuestos DNA minor groove binders (MGBLs) constituyen una importante clase de derivados en la terapia antitumoral, siendo de interés intrínseco por sus propiedades biológicas y médicas. Además, la estrategia de reconocimiento podría ser aplicable para la obtención de nuevos agentes reguladores de procesos genéticos con posibilidades clínicas.
Así, otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de la invención, tal y como se ha descrito anteriormente, o cualquiera de sus combinaciones,en cantidad terapéuticamente efectiva, o una sal, profármaco, solvato o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo junto con un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable, para la administración a un paciente. Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar la acción terapéutica determinada por sus propiedades farmacológicas, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de administración.
Las soluciones para inyección o infusión intravenosa pueden contener como vehículo, por ejemplo, agua estéril o, preferiblemente, pueden estar en forma de soluciones salinas acuosas isotónicas estériles. Las suspensiones o soluciones para inyecciones intramusculares pueden comprender, junto con el compuesto activo, un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo agua estéril, aceite de oliva, oleato de etilo, glicoles, por ejemplo propilenglicol, y, si se desea, una cantidad adecuada de clorhidrato de lidocaína.
En las formas para aplicación tópica, por ejemplo, cremas, lociones o pastas para uso en tratamiento dermatológico, se puede mezclar el componente activo con excipientes oleaginosos o emulsionantes convencionales.
Las formas orales sólidas, por ejemplo tabletas y cápsulas, pueden contener, junto con el compuesto activo, diluyentes, por ejemplo lactosa, dextrosa, sacarosa, celulosa, almidón de maíz y almidón de patata; lubricantes, por ejemplo sílice, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio o de calcio y/o polietilenglicoles; agentes ligantes, por ejemplo almidones, gomas arábigas, gelatina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa y polivinilpirrolidona; agentes desintegrantes, por ejemplo almidón, ácido algínico, alginatos y glicolato de sodio y almidón; mezclas efervescentes; colorantes; edulcorantes; agentes humectantes, por ejemplo lecitina, polisorbatos y laurilsulfatos, y, en general, substancias no tóxicas y farmacológicamente inactivas usadas en la formulación farmacéutica. Dicha preparación farmacéutica puede ser fabricada por técnicas conocidas, por ejemplo por medio de procedimientos de mezcla, granulación, formación de tabletas, revestimiento de azúcar o revestimiento de película.
En otra realización particular, dicha composición terapéutica se prepara en forma de una forma sólida o suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida.
El uso de los compuestos de la invención es compatible con su uso en protocolos en que los compuestos de la invención, o sus mezclas se usan por sí mismos o en combinaciones con otros tratamientos o cualquier procedimiento médico.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de cualquiera de los compuestos descritos o de las composiciones farmacéuticas que los incluyen para la elaboración de un medicamento.
Los compuestos de la invención son útiles como agentes antineoplásicos y antimicrobianos. Concretamente, muestran propiedades citostáticas hacia las células tumorales, de tal forma que pueden ser útiles para inhibir el crecimiento de ciertos tumores en mamíferos, incluídos los humanos, tales como, por ejemplo, carcinomas, como el carcinoma mamario, el carcinoma pulmonar, el carcinoma de vejiga, el carcinoma de colon y los tumores de ovario y endometrio. Otras neoplasias en las que pueden hallar aplicación las composiciones farmacéuticas de la presente invención son, por ejemplo, los sarcomas, como el sarcoma de tejidos blandos y de hueso, y las malignidades hematológicas, tales como por ejemplo, las leucemias. Así pues, una realización preferida de este aspecto de la invención, es el uso de cualquiera de los compuestos descritos o de las composiciones farmacéuticas que los incluyen para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
Forma parte de esta realización preferida un método combinado para tratar el cáncer o mejorar las condiciones de mamíferos, incluidos los humanos, que sufren de cáncer, cuyo método consiste en administrar a menos un compuesto de la invención o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable y un agente antitumoral adicional, lo suficientemente próximos en el tiempo y en cantidades suficientes para producir un efecto terapéuticamente útil.
Los antineoplásicos son sustancias que impiden el desarrollo, crecimiento, y/o proliferación de células tumorales malignas.
El término "agente antitumoral" pretende incluir tanto un fármaco antitumoral único como "cócteles", es decir, una mezcla de dichos fármacos, según la práctica clínica.
Los compuestos de la invención muestran también una notable efectividad en la interferencia con la actividad reproductora de virus patógenos y protegen las células tisulares frente a las infecciones víricas. Por ejemplo, muestran actividad frente a virus ADN tales como, por ejemplo, herpes, por ejemplo virus herpes simplex y herpes zoster, virus de la vaccinia, virus ARN tales como, por ejemplo, Rhinovirus y Adenovirus, y frente a retrovirus tales como, por ejemplo, virus del sarcoma, por ejemplo virus del sarcoma murino, y virus de la leucemia, por ejemplo virus de la leucemia de Friend. Así pues, otra realización preferida de este aspecto de la invención, es el uso de cualquiera de los compuestos descritos o de las composiciones farmacéuticas que los incluyen para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades microbianas. Una realización aún más preferida de la invención es el uso de cualquiera de los compuestos descritos o de las composiciones farmacéuticas que los incluyen para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades microbianas virales.
Por todo lo anteriormente citado y avalado por los resultados obtenidos y expuestos en el apartado de ejemplos, se puede afirmar que se produce una entrada eficiente en el núcleo celular de los compuestos, conjugados o híbridos que poseen la octaarginina y el tripirrol unidos covalentemente. (Se representa ilustrativamente en la Fig.1).
Además, el sistema tripirrólico al permitir una interacción fuerte con el ADN facilita el anclaje de los híbridos en los cromosomas de núcleo. Es decir, la acumulación rápida intranuclear, en particular de los compuestos de fórmula 1A (triprirrol-oligoarginina), se debe a la acción cooperativa de ambos fragmentos, la oligoarginina y la molécula de unión al surco menor del ADN (tripirrol).
Además la interacción es selectiva para sitios de ADN que contengan al menos 4 adeninas o timinas seguidas.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Breve descripción de las figuras
Fig. 1.- Muestra el funcionamiento de los conjugados de tripirroles con poliargininas para inducir la internalización celular y el aumento de afinidad.
Fig. 2.- Muestra la distribución intracelular de los diferentes híbridos en células HeLa. Los tiempos de exposición fueron distintos para cada muestra debido a las variaciones observadas en la emisión total como resultado de las diferentes eficiencias de internalización. Los tiempos de exposición fueron: 1A, 1B, 4A = 1/18 s; 2A = 1/2 s; 5A = 1/6 s;
3A = 1 s.
Fig. 3. PAGE de la interacción del péptido 6 con un oligonucleótido de doble cadena con la secuencia ATTTT. Calles 1-10: [6]= 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25 nM. Ahx = 6-aminohexanoic.
\vskip1.000000\baselineskip
Exposición detallada de modos de realización
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la especificidad y efectividad de los compuestos de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1 Preparación del compuesto tripirrol-péptido y ensayos de internalización
Con el fin de estudiar relaciones estructura-función se prepararon una serie de híbridos péptido-tripirrol 1A-5A, así como controles sin el tripirrol (1B-4B). Se incorporó un grupo fluoróforo en las moléculas para poder realizar el seguimiento del proceso de internalización celular mediante análisis con un microscopio de fluorescencia. La síntesis de las moléculas se realizó usando metodologías en fase sólida.
\newpage
Esquema 1
Estructuras de los compuestos estudiados 
\vskip1.000000\baselineskip
10
Los ensayos de internalización se realizaron en células HeLa vivas, registrando las imágenes de fluorescencia a 30 min, 90 min y 3 h. Tal y como se muestra en la Figura 2 (Fig. 2), la incubación de células con el conjugado tripirrol-octaarginina 1A durante 90 min a 37ºC dio lugar a una señal de fluorescencia homogénea e intensa en el núcleo celular. Posteriormente se observó que dicha señal ya se observaba a los 30 minutos. Esto demuestra que la internalización es muy rápida. Un control de internalización del mismo tripirrol desprovisto de la secuencia de octaarginina demostró que no se observaba nada de fluorescencia intracelular incluso después de 3 h. Parece claro pues que la octaarginina es clave para un transporte eficiente del conjugado.
En el caso del híbrido 2A que contiene como fragmento peptídico una señal de localización nuclear (NLS) en vez de la poliarginina, la señal de fluorescencia que se observa después de la incubación está también localizada en el núcleo celular; sin embargo la intensidad de la señal es menor que en el caso del híbrido 1A, probablemente debido a la menor capacidad de internalización citoplasmática inherente a esta secuencia. La introducción de una secuencia de octaargininas además de la NLS, bien de manera lineal (4A) o bien a través de un enlace disulfuro lábil (5A), mejoró las propiedades de internalización con respecto al híbrido que contiene exclusivamente la NLS (2A); sin embargo las capacidad de transporte fue en ambos casos menor a la del híbrido que contenía exclusivamente la octaarginina 1A. El conjugado 3A, similar a 2A pero con una mutación en la NLS no fue eficientemente internalizado, como queda de manifiesto por la baja fluorescencia observada en el interior de las células. El producto aparece distribuido uniformemente por el citoplasma celular, lo cual concuerda con la pérdida de capacidad de señalización nuclear de la NLS mutada.
Los péptidos control que no poseen el fragmento tripirrólico no son capaces de alcanzar el núcleo de las células. Particularmente relevante es el caso del péptido 1B, que es análogo a 1A, pero sin el tripirrol. Como se observa en la Figura 2 (Fig. 2), la fluorescencia es intensa, pero se localiza exclusivamente en el citoplasma.
Por otro lado, para comprobar la posible implicación del fluorofor, se utilizó el híbrido 6, similar a 1A pero desprovisto del grupo fluoróforo. Este mostró una afinidad por secuencias de ADN ricas en adenina muy alta, en torno a 6 nM a temperatura ambiente (Fig. 3). Además la interacción es selectiva para sitios de ADN que contengan al menos 4 adeninas o timinas seguidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Síntesis y purificación de los péptidos
Los péptidos se sintetizaron manualmente en una escala de 0.1 mmol siguiendo los protocolos estándar de síntesis de péptidos mediante la estrategia Fmoc/tBu. Para la síntesis se utilizó una resina PAL-PEG (0.19 mmol/g). Cada amino ácido se activó durante 2 min en DMF previamente a su adición sobre la resina desprotegida. La reacción de formación del enlace peptídico se dejó transcurrir un mínimo de 45 min hasta que el test TNBS dio negativo. La desprotección del grupo temporal Fmoc se llevó a cabo por tratamiento de la resina con piperidina al 20% en DMF durante 15 min. Los péptidos finales se obtuvieron después de la desprotección/liberación de la resina por tratamiento con el coctel estándar de desprotección con TFA tal y como se especifica a continuación.
Desprotección del grupo temporal Fmoc: Se añade piperidina (5 mL, 20% en DMF) a 0.1 mmol de Fmoc-péptido unido al soporte sólido. Se burbujea nitrógeno a través de la mezcla durante 15 min. Se filtra la resina y se lava con DMF (3 x 5 mL x 3 min). Se comprueba la desprotección haciendo un test TNBS a una pequeña fracción de la resina.
Acoplamiento de los amino ácidos: Se añade DIEA (3 mL, 0.195M en DMF) sobre el amino ácido correspondiente (0.4 mmol) disuelto en 2 mL de una disolución 0.2 M HOBt y 0.2 M HBTU en DMF. La mezcla resultante se agita durante 2 min y a continuación se añade sobre la resina. Se hace pasar nitrógeno sobre la mezcla resultante durante 45 min o hasta que se observa que el acoplamiento se completa, mediante el test TNBS en una pequeña alícuota de la resina. Se filtra la resina y se lava con DMF (3 x 5 mL x 3 min). La síntesis continúa con el siguiente ciclo de desprotección/acoplamiento de forma análoga a la descrita.
Desprotección selectiva de la cadena lateral del residuo Lys(Alloc): Una vez completada la secuencia del péptido, la desprotección selectiva de la lisina se lleva a cabo utilizando el siguiente procedimiento: Se tratan 0.1 mmol del péptido unido a la resina con Pd(PPh_{3})_{4} (1 equiv) y morfolina (190 equiv) en 2% H_{2}O/CH_{2}Cl_{2} (5 mL) durante 5 h. Se filtra la resina y se lava con DMF (3 x 5 mL x 3 min), dietilditiocarbamato (DEDTC, 25 mg en 5 mL de DMF, 2 x 5 mL x 2 min), DMF (3 x 5 mL x 2 min) y CH_{2}Cl_{2} (3 x 5 mL x 2 min).
Desprotección/liberación de la resina: El péptido sintetizado, todavía unido a la resina se seca bajo una corriente de nitrógeno y se trata en frío con el coctel de desprotección (50 \muL CH_{2}Cl_{2}, 25 \muL agua, 25 \muL TIS y TFA hasta 1 mL para 40 mg de resina). Los péptidos que contienen cisteínas se desprotegieron utilizando el coctel alternativo específico: 25 \muL EDT, 25 \muL agua, 10 \muL TIS y TFA hasta 1 mL, por cada 40 mg de resina. La suspensión resultante de añadir la mezcla de desprotección a la resina se agitó durante 2 h a ta. La resina se separó y los filtrados se añadieron sobre éter etílico en un baño de hielo (10 mL de éter por cada mL de coctel). Después de 10 min, se centrifuga la mezcla y el sólido decantado se lava con éter frío y se seca bajo una corriente de argon. El precipitado se disolvió en 2 mL de una mezcla de acetonitrilo/agua 1:1 y se analizó por HPLC en fase reversa utilizando las condiciones descritas anteriormente. El producto mayoritario en todas las síntesis se identificó como el péptido deseado por espectrometría de masas. Las fracciones aisladas en HPLC preparativo se liofilizaron y guardaron a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 3 Síntesis de los híbridos fluorescentes
Una vez finalizada la síntesis se eliminó el grupo protector Fmoc del residuo N-terminal siguiendo el procedimiento estándar. Se lavó la resina y se añadieron una disolución de DIEA (0.5 M, 6 equiv) en DMF e isotiocianato de fluoresceina (FITC, 4 equiv. La mezcla resultante se agito durante 1 h a temperatura ambiente. Se lavó la resina con DMF (2 x 5 mL) y el grupo Alloc se desprotegió siguiendo el procedimiento detallado previamente. La peptidil-resina resultante se sometió al procedimiento estándar de desprotección/liberación y purificación para dar los compuestos 1B-5B. Alternativamente, la peptidil-resina se acopló a la unidad de aminotripirrol para sintetizar los derivados 1A-5A. Para los acoplamientos con los tripirroles se suspendió la resina en DMF (1 mL) y se agitó durante 30 min para expandirla convenientemente. Se filtró la DMF y sobre la resina se añadió DIEA (0.5 M en DMF, 8 equiv), DMAP (2 equiv en DMF) y N,N'-disuccinimidil bicarbonato (15 equiv). La mezcla resultante se agito durante 2 h. La resina se lavó con DMF y se añadieron el aminotripirrol 7 en DMF (4 equiv), DIEA (8 equiv, 0.5 M en DMF) y DMAP (2 equiv). La mezcla de reacción se agitó durante 2 h y a continuación se lavo con DMF (2 x 5 mL x 2 min) y éter etílico (2 x 5 mL x 2 min). La desprotección/liberación siguiendo condiciones estándar dio lugar a los conjugados esperados que se purificaron por HPLC en fase reversa e identificaron por espectrometría de masas tal y como se detalló previamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4 Síntesis del híbrido 5A
Este compuesto se obtuvo por acoplamiento del péptido correspondiente que incluye una cisterna, con el péptido de cisteina-ortaargininas activado previamente por reacción con DTNB (reactivo de Ellman). La reacción de acoplamiento se llevó a cabo en tampón 100 mM Tris-HCl, 1M NaCl, pH 7,5 agitando la mezcla a temperatura ambiente por 45 min. El producto mayoritario se purificó por HPLC siguiendo las condiciones estándar y se identificó por espectrometría de masas como el híbrido heterodimérico conteniendo el puente disulfuro deseado.

Claims (12)

1. Compuesto que comprende un grupo tripirrol unido a una octaarginina ((Arg)_{8}) por medio de un espaciador que comprende, al menos, una lisina (Lys).
2. Compuesto según la reivindicación 1 que además comprende un grupo fluoróforo.
3. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 donde el tripirrol presenta la fórmula (1):
\vskip1.000000\baselineskip
11 
\vskip1.000000\baselineskip
R_{1} es igual o diferente y se selecciona independientemente de la lista que comprende H, un grupo alquilo (C_{1}-C_{6}) o un grupo acilo;
R_{2} es un grupo alquilo sustituido de fórmula general (IIA):
\vskip1.000000\baselineskip
12 
\vskip1.000000\baselineskip
ó de fórmula general (IIB):
\vskip1.000000\baselineskip
13 
\vskip1.000000\baselineskip
R_{3} es un grupo alquilo sustituido de fórmula general (III):
\vskip1.000000\baselineskip
14 
\vskip1.000000\baselineskip
donde n toma valores entre 1 y 6.
4. Compuesto según la reivindicación 3 donde el tripirrol es:
15
donde 100 representa el sitio de unión con la lisina del espaciador.
5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde el espaciador además de la lisina comprende ácido 6-aminohexanoico (Ahx).
6. Compuesto según la reivindicación 5 donde el espaciador presenta la fórmula (Ahx-Lys-Ahx):
16
7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 donde el fluoróforo es fluoresceína.
8. Método de obtención de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende los siguientes pasos:
a.
síntesis del péptido en fase sólida,
b.
acoplamiento al fragmento tripirrólico,
c.
desprotección de cadenas laterales y separación de la resina.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la elaboración de un medicamento.
10. Uso del compuesto según la reivindicación 9 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
11. Uso del compuesto según la reivindicación 9 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades microbianas.
12. Uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para interferir de forma eficiente con procesos celulares a nivel del ADN.
ES200802520A 2008-08-29 2008-08-29 Compuestos hibridos tripirrol-octaarginina. Active ES2333835B2 (es)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES200802520A ES2333835B2 (es) 2008-08-29 2008-08-29 Compuestos hibridos tripirrol-octaarginina.
PCT/ES2009/070356 WO2010023346A1 (es) 2008-08-29 2009-08-27 Compuestos híbridos tripirrol-octaarginina y su uso como medicamento, en el tratamiento del cáncer y de enfermedades microbianas.
EP09809368A EP2336108A4 (en) 2008-08-29 2009-08-27 TRIPYRROL-OCTAARGININE HYBRID COMPOUNDS AND USE THEREOF AS A MEDICAMENT FOR TREATING CANCER AND MICROBIAL DISEASES
US13/119,954 US20110237499A1 (en) 2008-08-29 2009-08-27 Hybrid tripyrrole-octaarginine compounds and their use as medicament in the treatment of cancer and microbial illnesses

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES200802520A ES2333835B2 (es) 2008-08-29 2008-08-29 Compuestos hibridos tripirrol-octaarginina.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2333835A1 ES2333835A1 (es) 2010-03-01
ES2333835B2 true ES2333835B2 (es) 2010-07-05

Family

ID=41668530

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES200802520A Active ES2333835B2 (es) 2008-08-29 2008-08-29 Compuestos hibridos tripirrol-octaarginina.

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20110237499A1 (es)
EP (1) EP2336108A4 (es)
ES (1) ES2333835B2 (es)
WO (1) WO2010023346A1 (es)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201409451D0 (en) 2014-05-28 2014-07-09 Ipabc Ltd Antimicrobial preparations, methods for preparing the same and uses thereof to combat microorganisms
CN105037739B (zh) * 2015-07-28 2017-10-27 四川大学 具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物及其制备方法与应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0708299A2 (pt) * 2006-02-27 2011-05-24 Univ Leland Stanford Junior composições e métodos para o transporte de moléculas com propriedades melhoradas de liberação através de barreiras biológicas
WO2008043366A2 (en) * 2006-10-13 2008-04-17 Københavns Universitet Three-domain compounds for transmembrane delivery

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLANCO, J.B. y col. Sequence-specific DNA recognition by monomeric Bzip basic regions equipped with a tripyrrole unit on the N-terminal side. Towards the development of synthetic mimics of Skn-1. ChemBioChem. 2005, Vol. 6, N$^{o}$ 12, páginas 2173-2176. *
VAZQUEZ, E. y col. A practical approach to orthogonally connected oligopyrrole-peptide conjugates. Tetrahedron Letters. 1999, Vol. 40, páginas 3625-3628. *
VAZQUEZ, E. y col. An Fmoc solid-phase approach to linear polypyrrole-peptide conjugados. Tetrahedron Letters. 1999, Vol. 40, páginas 3621-3624. *

Also Published As

Publication number Publication date
US20110237499A1 (en) 2011-09-29
EP2336108A4 (en) 2012-02-15
ES2333835A1 (es) 2010-03-01
WO2010023346A1 (es) 2010-03-04
EP2336108A1 (en) 2011-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101495482B (zh) 氮杂环丙基-埃坡霉素化合物
US10238753B2 (en) Antisense conjugates for decreasing expression of DMPK
ES2735348T3 (es) Conjugados de fármaco de molécula pequeña
ES2638871T3 (es) Polipéptidos clorotoxina y conjugados y usos de los mismos
US20070275904A1 (en) Conjugates of aziridinyl-epothilone analogs and pharmaceutical compositions comprising same
CN106061981A (zh) 具有二硫化物基团的多核苷酸构建体
US7049061B1 (en) Stereochemical control of the DNA binding affinity, sequence specificity, and orientation-preference of chiral hairpin polyamides in the minor groove
SG189945A1 (en) Peptide-based in vivo sirna delivery system
JP2002515063A (ja) 予め決定されたｄｎａ配列にナノモル以下の濃度で結合するポリアミド
CN102625716A (zh) 环孢菌素缀合物
ES2333835B2 (es) Compuestos hibridos tripirrol-octaarginina.
ES2805536T3 (es) Moléculas de neurotensina activadas y sus usos
WO2023208168A1 (zh) 一种包含亲水性糖结构的配体-药物偶联物
ES3044861T3 (en) Agent targeting double-membrane organelle dna
WO2021261592A1 (ja) リピート結合剤
CN121127266A (zh) 用于抑制中枢神经系统靶基因表达的多肽寡核苷酸缀合物及其应用
HK1124335B (en) Aziridinyl-epothilone compounds

Legal Events

Date Code Title Description
EC2A Search report published

Date of ref document: 20100301

Kind code of ref document: A1

FG2A Definitive protection

Ref document number: 2333835B2

Country of ref document: ES