ES2334083B1 - Metodo para la identificacion de polipeptidos antibacterianos y antivirales obtenidos de mytilus edulis. - Google Patents
Metodo para la identificacion de polipeptidos antibacterianos y antivirales obtenidos de mytilus edulis. Download PDFInfo
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Abstract
Método para la identificación de polipéptidos
antibacterianos y antivirales obtenidos de Mytilus
edulis.
La invención proporciona un método para la
identificación de polinucleótidos que codifican las formas
precursoras de polipéptidos de las familias de las miticinas y de
las mitilinas. La invención proporciona igualmente las miticinas y
mitilinas identificadas con dicho método, así como su uso como
agentes antibacterianos y antivirales.
Description
Método para la identificación de polipéptidos
antibacterianos y antivirales obtenidos de Mytilus
edulis.
La invención se relaciona con un método para la
identificación de polinucleótidos que codifican las formas
precursoras de polipéptidos de las familias de las miticinas y de
las mitilinas, así como a las miticinas y mitilinas identificadas
con dicho método y a su uso como agentes antibacterianos y
antivirales.
El cultivo de moluscos bivalvos supone una de
las mayores producciones de la acuicultura en la Unión Europea
llegando a constituir más del 70% de la producción mundial.
Concretamente, el cultivo del mejillón (Mytilus
galloprovincialis y Mytilus edulis, fundamentalmente)
supera las 500.000 toneladas de producción cada año (593.000
toneladas en 2003 según datos de la FAO). A pesar de la elevada
producción de estos moluscos, y de la existencia de enfermedades
que afectan gravemente a su producción, con las importantes
pérdidas económicas que ello conlleva, poco se conoce de cómo
responden estos organismos a la enfermedad. Los bivalvos, al igual
que el resto de los invertebrados, carecen de un sistema inmune
adaptativo específico y sólo poseen un sistema inmune innato que
actúa independientemente de la naturaleza del estímulo, lo que
imposibilita el uso de vacunas al carecer de memoria inmunológica.
Con estas limitaciones, el control de las enfermedades se basaba
fundamentalmente en el diagnóstico del agente patógeno y en el buen
manejo de los stocks.
Recientemente se han descrito en mejillón una
serie de pequeños péptidos con actividad antimicrobiana, capaces de
reducir el crecimiento de varios microorganismos analizados. La
patente estadounidense US6911524 y Mitta,G. et al. (Eur. J.
Biochem., 265:71-78) describen dos péptidos
aislados de la hemolinfa de Mytilus galloprovincialis,
denominados miticina A y B, que muestran actividad bactericida,
fungicida y antiparasitaria frente a ciertos patógenos. Charlet, M.
et al. (J Biol. Chem., 1996,
271:21808-21813) han descrito dos polipéptidos
aislados de la hemolinfa de Mytilus edulis denominados
mitilinas A y B que muestran actividad bactericida. Mitta, G. et
al (J. Biol. Chem., 2000, 275:12954-12962) han
descrito tres nuevas isoformas de las mitilinas denominadas
mitilinas C, D y G1 que también muestran actividad bactericida y
fungicida.
Sin embargo, la puesta en práctica de dichos
péptidos como agentes para el control de patógenos requiere de
disponer de cantidades suficientes de ellos. Esto sólo es posible
mediante la expresión de los péptidos de forma recombinante en
células heterólogas, ya que la purificación usando métodos
convencionales a partir de los extractos de hemolinfa sólo produce
cantidades muy limitadas de los mismos. Con el fin de poner a punto
sistemas para la expresión recombinante de estos péptidos, es
necesario disponer de la correspondiente secuencia de ADNc. La forma
habitual para obtener la secuencia de ADNc para este tipo de
péptidos consiste en realizar un screening de una biblioteca de
ADNc obtenida de hemolinfa mediante PCR usando cebadores
degenerados obtenidos a partir de la secuencia de aminoácidos
obtenida de la proteína purificada para así amplificar el ADNc. Sin
embargo, dado que estos péptidos se sintetizan en forma de
precursores para después convertirse en péptidos maduros mediante
su procesamiento post-traduccional, la amplificación
del ADNc usando cebadores obtenidos a partir de la secuencia del
péptido maduro permite obtener únicamente un ADNc parcial que
codifica la secuencia del péptido maduro pero que no se corresponde
a la secuencia nucleotídica completa que codifica para el precursor
de la proteína. En estos casos, es necesaria una segunda ronda de
screening usando el ADNc parcial obtenido en el primer screening
como sonda para identificar mediante hibridación en una segunda
ronda de screening el ADNc completo de las miticinas y mitilinas
(véase Mitta,G. et al., 1999, Eur. J. Biochem.,
265:71-78).
Así, existe una necesidad en el arte de métodos
más sencillos que permitan la obtención de ADNcs que codifiquen las
secuencias completas de los precursores de las mitilinas y
miticinas con el fin de simplificar el proceso global de obtención
por via recombinante.
Los estudios realizados hasta la fecha con estas
formas ya patentadas revelan la existencia de actividad frente a
bacterias Gram positivas fundamentalmente, sin apreciarse
especificidad de patógeno. Por tanto, es necesario trabajar en el
desarrollo de nuevos compuestos alternativos y eficaces, que
reduzcan al mínimo posible los problemas antes expuestos, y que
puedan ser incluidos dentro de estrategias integradas para el
control de las enfermedades durante el cultivo de estos
moluscos.
En un primer aspecto, la invención se relaciona
con un método para la identificación de un ADNc que codifica el
precursor de una miticina o una mitilina que comprende
- (i)
- poner en contacto un mejillón un agente inmunogénico,
- (ii)
- preparar librerías de ADNc de mejillones tratados con el agente inmunogénico
\global\parskip0.950000\baselineskip
- (iii)
- efectuar una sustracción de la librería obtenida de los mejillones tratados con una preparación de ácidos nucleicos de mejillones controles y
- (iv)
- aislar los ADNcs específicos de mejillones tratados con el agente inmunogénico.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un ADNc identificado mediante un método de la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una construcción génica que comprende un ácido nucleico de la
invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un vector de expresión que comprende un ácido nucleico o una
construcción génica de la invención que está operativamente
acoplado con una secuencia que regula la expresión de dicho
polinucleótido o de dicha construcción génica.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una célula hospedadora que contiene una construcción génica o un
vector de acuerdo a la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un polipéptido codificado por un ADNc de la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método para la obtención de un polipéptido de la invención que
comprende transformar una célula con un vector de la invención y
recuperar el polipéptido del interior celular o del medio de
cultivo.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método para la obtención de un polipéptido de la invención que
comprende inyectar intramuscularmente en un mejillón un agente
inmunogénico y recuperar posteriormente de la hemolinfa uno o varios
de los polipéptidos.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un anticuerpo que reconoce específicamente el polipéptido de la
invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una composición farmacéutica que comprende al menos un polipéptido
de la invención y un carrier farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un polipéptido de la invención o con una composición farmacéutica
de la invención para su uso en medicina.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el uso de un polipéptido de la invención o de una composición de la
invención para la preparación de un medicamento destinado a tratar
una enfermedad infecciosa.
Los autores de la presente invención han
conseguido desarrollar un método para la identificación de
mitilinas y miticinas que permite obtener en un solo paso la
secuencia completa del ADNc que codifica los precursores de dichos
péptidos, facilitando así la posterior obtención de dichos péptidos
de forma recombinante. Así, en un primer aspecto, la invención se
relaciona con un método para la identificación de miticinas y
mitilinas (de aquí en adelante "el método de la invención") que
comprende las etapas de
- (i)
- inyectar intramuscularmente en un mejillón un agente inmunogénico,
- (ii)
- preparar librerías de ADNc de mejillones tratados con el agente inmunogénico
- (iii)
- efectuar una sustracción de la librería de cADN obtenida de los mejillones tratados con una población de ácidos nucleicos obtenida a partir de mejillones controles y
- (iv)
- aislar los ADNc específicos de mejillones tratados con el agente inmunogénico.
Por "miticina" se entiende, en el contexto
de la presente invención, una proteína que comprende una de las
secuencias definidas en SEQ ID NO:1 a 16 o una variante
funcionalmente equivalente de las mismas.
Por "mitilina" se entiende, en el contexto
de la presente invención, una proteína que comprende una de las
secuencias definidas en SEQ ID NO:17 a 19 o una variante
funcionalmente equivalente de las mismas.
Por "variante funcionalmente equivalente"
se entiende, en el contexto de la presente invención, toda proteína
que se puede obtener a partir de las mitilinas o miticinas
anteriormente indicadas mediante la sustitución, deleción o
inserción de uno o mas aminoácidos y que mantiene sustancialmente
la función de la proteína original. Las determinación de la función
de las miticinas/mitilinas se puede llevar a cabo usando métodos
convencionales ampliamente conocidos para el experto en la materia,
tales como los ensayos de actividad antimicrobiana, antifúngica y
antiparasitaria descritos en US6911524 para las miticinas o los
ensayos de actividad antimicrobiana descritos en Charlet, M. et
al. (J. Biol. Chem., 1996, 271:21808-21813) para
las mitilinas.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Por "precursor de una mitilina o miticina"
se entiende toda proteína cuya secuencia comprende la secuencia de
la mitilina o miticina y una o más regiones adicionales que
mantienen la proteína en su forma inactiva y que se eliminan
mediante procesamiento proteolítico de forma
post-traduccional para generar la forma madura y
activa de las miticinas/mitilinas.
En el primer paso del método de la invención, se
procede a la administración en un mejillón de un agente
innmunogénuico. Preferiblemente, el agente inmunogénico se
selecciona del grupo de un cóctel de bacterias muertas, poli I:C y
una mezcla de ambos.
En el segundo paso del método de la invención,
se prepara una librería de ADNc a partir de los mejillones que se
han tratado con el agente inmunogénico. Preferiblemente, la
librería de ADNc se prepara a partir de los hemocitos. El proceso de
obtención de una librería de ADNc de una célula, órgano u organismo
de interés comienza por la preparación de ARNm de la célula en la
que se expresen las miticinas/mitilinas, como por ejemplo, los
hemocitos o la hemolinfa. El mRNA se puede aislar usando métodos
convencionales tales como mediante la extracción usando
fenol/clorofomo, fenol/SDS o guanidina, en cuyo caso es posible la
purificación previa del ARN mediante en centrifugación en gradiente
de cloruso de cesio, gradiente os descritos en Sambrook, J. et
al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) (vease capítulo
7)) y Ausubel,F (Current Protocols in Molecular Biology) (Units
4.1-4.4). Una vez que se ha aislado el ARN total
del tejido de mejillón, es preferible obtener la fracción
poliA^{+}, que contiene los ARNm. Típicamente, el aislamiento de
los ARN poliA+ se efectúa mediante purificación por afinidad usando
matrices conjugadas con oligo(dT), que permite retener los
ARN mediante su hibridación con las colas de poladenina de los
ARNm. La purificación de ARN poliA+ en matrices de oligodT se puede
llevar a cabo en columna o en suspensión. En el primer caso, la
matriz de oligo(DT) se empaqueta en una columna
cromatográfica sobre la cual se añade el ARN celular total, de forma
que el ARNm queda retenido mientras que el resto de ARN no poliA+
eluye de la columna. EL ARNm se eluye posteriormente lavando la
columna con una solución que permite romper la interacción entre el
ARN poliA+ y las matrices de oligodT, como por ejemplo una mezcla
de EDTA 2 mM y SDS al 0.1%. En caso de que la purificación del ARN
poliA+ se lleve a cabo en suspensión, el procedimiento es
esencialmente idéntico al método en columna con la diferencia de la
separación del ARN no poliA+ que no se ha unido a la matriz de
oligo(dT) del ARNm poliA+ se consigue mediante centrifugación
de las partículas de oligo(dT) lo que resulta en la
sedimentación de las partículas que contienen el ARNm poliA+ unido
mientras que el ARN no poliA+ permanece en el sobrenadante. La
elución del ARNm poliA+ se lleva a cabo mediante lavado de las
partículas con una solución del tipo EDTA 2 mM y SDS al 0.1%. El
ARNm es posteriormente precipitado en presencia de 2.5 volúmenes de
etanol para eliminar el SDS procedente de la solución de
elución.
elución.
Una vez que se dispone de una preparación
purificada de ARNm, este se pone en contacto con un cebador que
puede ser un oligonucleótido que incorpora una región de
poli(dT) en su extremo 3' o una mezcla de cebadores de
secuencia aleatoria en presencia de una transcriptasa inversa
carente de actividad RNase H (por ejemplo, las transcriptasas
reversas del virus de la leucemia murina de Moloney, del virus de la
mieloblastosis aviar, del virus de la inmunodeficiencia humana, del
virus de la inmunodeficiencia en simios, del virus respiratorio
sincitial, del virus espumoso humano, del virus de la leucemia
bovina, del virus linfotrófico T humano tipo I, o la transcriptasa
reversa R2 de Bómbix mori). Si se usa un cebador que contiene una
región de poli(dT), el ADNc comienza a formarse por el
extremo 3' del ARNm que corresponde a la cola de poliadeninas. Por
el contrario, si se usa una mezcla de cebadores de secuencia
aleatoria, se obtendrán moléculas de ADNc correspondientes a todas
las regiones del ARNm, por lo que esta es la técnica de elección en
caso de que se deseen obtener poblaciones de ADNc enriquecidas en
los extremos 5' de los ARNm correspondientes.
La transcriptasa reversa extiende el cebador o
los cebadores usando como molde la secuencia del ARNm creando una
molécula de ADN de cadena sencilla cuya secuencia viene dictada por
la secuencia del ARNm que se ha usado como molde y al cual
permanece unida formando un híbrido ARNm/ADNc. La siguiente etapa
consiste en la eliminación de la cadena de ARNm del híbrido con la
simultánea síntesis de la segunda cadena de ADNc. Para ello, el
híbrido ARNm/ADNc se pone en contacto con una RNasa H, con la ADN
polimerasa de E. coli y con la ADN ligasa de E. coli.
De esta forma, la RNasa H introduce cortes en la cadena de ARNm que
son reparados por la ADN polimerasa de E. coli a la vez que,
gracias a su actividad exonucleasa 3'-5', elimina
los restos de ARNm y los reemplaza por una cadena nueva de ADNc, que
son ligados a los fragmentos contiguos por medio de la actividad de
la ADN ligasa, formándose así el ADN de doble cadena o ADNc. El
ADNc resultante es tratado para eliminar nucleótidos sobrantes en
los extremos 5' y 3'. Alternativamente, si la síntesis de la primera
cadena de ADNc se lleva a cabo usando una transcriptasa reversa que
posee actividad RNasa H, el producto resultante no es un híbrido
ADNc/ARNm sino una cadena sencilla de ADNc.
Una vez que se ha obtenido una población de ADNc
que representa los ARNm que aparecen en células de organismos que
se han estimulado con un agente inmunogénico, es necesario
incorporar dicha población en un vector de clonación para así poder
amplificar la población de ADNc. El experto en la materia apreciará
que existen múltiples alternativas para dicho propósito.
Preferiblemente, la población de ADNc una nucleasa y el fragmento
Klenow de la ADN polimerasa de E. coli para así eliminar
nucleótidos no apareados en los extremos 5' y 3' de la secuencia y
obtener moléculas de extremos romos. Posteriormente, las moléculas
de ADNc de extremos romos son tratadas con una ADN metilasa (por
ejemplo la metilasa EcoRI) en presencia de un donante de grupos
metilo (normalmente S-adenosil metionina). A
continuación, las moléculas de ADNc de extremos romos y metiladas
se pueden ligar a adaptadores o enlazadores (linkers) que contienen
sitios diana para la enzima de restricción cuya metilasa se utilizó
en la etapa anterior (por ejemplo la endonuclease de restricción
EcoRI). Una vez que las moléculas de ADNc se han ligado a los
adaptadores, se digieren con la enzima de restricción
correspondiente y se ponen en contacto con un vector de clonación
linearizado mediante digestión con la misma enzima en presencia de
una ADN ligasa (por ejemplo, la ADN ligasa del fago T4, la ADN
ligasa de Taq o la ADN ligasa de E. coli) para dar lugar a
la recircularización de los vectores conteniendo los insertos de
ADNc en su interior. La población de moléculas de ADNc ligadas a los
adaptadores puede ser fraccionadas mediante cromatografía de
exclusión en gel con el fin de seleccionar aquellos insertos de
mayor peso molecular.
En el tercer paso del método de la invención,
una vez que se dispone de una genoteca de ADNc correspondiente a la
población de ARNm presente en una célula en una condición
determinada, se efectúa una "sustracción" de la genoteca
obtenida de células estimuladas (población (+)) con una población
de ácidos nucleicos obtenidos de las mismas células en ausencia de
dicho estímulo (población (-)) de forma que se eliminen de la
genoteca aquellas secuencias cuya expresión ocurre indistintamente
en presencia y en ausencia de dicha condición. Para ello la
población de ácidos nucleicos usada para efectuar la sustracción
puede ser una preparación de ARNm aislada de mejillones controles
o, alternativamente, una preparación de ADNc obtenida a partir de
dicho mARN.
En el caso de que se disponga de una población
de ADNc de cada una de las poblaciones celulares, se pueden usar
métodos ampliamente conocidos para el experto en la materia tales
como los métodos descritos en Ausubel, F.M, Current Protocols in
Molecular Biology, Unidad 25B.1). En caso de que se disponga de una
preparación de ADNc de la muestra en la que se encuentran los genes
de expresión diferencial y una preparación de ARNm de la muestra en
la que no se expresan dichos genes, también es posible llevar a
cabo una substracción mediante métodos conocidos para el experto en
la materia como por ejemplo (i) hibridación del ARNm al ADNc
desnaturalizado y separación de los híbridos ADNc/ARNm en base a su
capacidad de unión a columnas de hidroxiapatito a 68ºC, (ii)
hibridación de ARNm a una genoteca de ADNc expresada en fagemidos
de cadena sencilla y (iii) hibridación de ARNm a ADNc y separación
de los híbridos mediante unión a
oligo(dT)-latex.
Otros métodos adecuados para el aislamiento de
genes expresados de forma diferencial incluyen el muestreo
aleatorio entre dos o mas poblaciones celulares en el que los
clones se seleccionan al azar de una biblioteca de ADBc),
hibridación diferencial (en el que sondas obtenidas de los ARNms de
los dos poblaciones celulares que se comparan y se usan para
realizar un screening de una biblioteca de ADNc y para aislar
aquellos clones que hibridan a una sonda pero no a otra y
presentación diferencial (differential display) en el que cebadores
parcialmente aleatorios se usan para amplificar un subconjunto de
ARNms que se expresan en una célula determinada, los fragmentos
obtenidos se separan en un gen de acrilamida y las bandas obtenidas
de distintas muestras se comparan.
En una forma preferida de realización, la
sustracción se lleva a cabo mediante la técnica de hibridación
mediante supresión de substracción (suppression substractive
hybridization o SSH). En este método se parte de ADNc de cadena
doble de ambas poblaciones, los ADNc se digieren con endonucleasas
de restricción que tienen un diana de corte de 4 pares de bases. A
continuación, los fragmentos resultantes se ligan a dos conjuntos
diferentes de adaptadores (a1/a2 y b1/b2). Los ADNcs se amplifican
con cebadores adecuados (a1 o b1) para dar lugar a las poblaciones
de ADN A0 y B0. A continuación, se llevan a cabo dos conjuntos de
sustracciones (A0-B0 y B0-A0), lo
que permite obtener los genes expresados diferencialmente en la
población A y los genes expresados diferencialmente en la población
B. En cada caso, los ADNcs (+) y (-) se marcan con una pequeña
cantidad de [^{32}P] dCTP y el ADNc de la población (-) se marca
con biotina durante la síntesis, bien mediante la incorporación de
biotina-11-dUTP durante la reacción
de PCR, bien mediante biotinilación del producto de PCR o bien
mediante el uso de cebadores biotinilados. Los ADNcs (+) y (-) se
mezclan en una relación 1:20, se desnaturalizan y se realinean. Los
híbridos (-)/(-) y (+)/(-) se eliminan mediante tratamiento con
estreptavidina y extracción con fenol. El resultado es un
enriquecimiento en secuencias que aparecen con mayor frecuencia en
la población (+). Opcionalmente, se pueden llevar a cabo rondas
adicionales de sustración. Una vez que las reacciones de
sustracción se han completado, los ADNcs se donan en los vectores
apropiados. Preferiblemente, la substracción se lleva a cabo usando
kits comerciales tales como el kit PCR-Select cDNA
subtraction kit (Clontech).
Usando el método de la invención, es posible la
identificación de los ADNcs correspondientes a los ARNms que se
inducen en hemocitos de mejillón cuando este es tratado con una
composición inmunogénica. Así, en otro aspecto, la invención se
refiere a un ADNc que se ha aislado usando el método de la
invención. Preferiblemente, los ADNc aislados usando el método de
la invención codifican para las formas precursores de mitilinas y
miticinas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una construcción génica que comprende, además del ácido nucleico de
la invención, elementos que regulan la expresión de dicho gen.
Dichos elementos reguladores incluyen promotores y potenciadores.
Los promotores se encuentran típicamente posicionados en posición
5' con respecto al sitio de iniciación de la transcripción o
traducción. Los potenciadores son capaces de influenciar la
expresión de genes cuando se encuentran en posición 5'o 3 'con
respecto al ADNc o cuando se encuentran formando parte de un
intrón. Secuencias reguladoras incluyen, además de promotores,
secuencias que facilitan la traducción, señales de procesamiento
para los intrones, codones de terminación, secuencias señales,
sitios internos de unión al ribosoma (IRES) y señales de
poliadenilación.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de la
invención o con una construcción génica de la invención que está
operativamente acoplado con una secuencia que regula la expresión de
dicho polinucleótido o de dicha construcción génica. El experto en
la materia advertirá que el tipo de vector adecuado para la
expresión de los ácidos nucleicos y construcciones génicas de la
invención dependerá del organismo en el que se desee expresar el
ADNc de la invención.
Así, para la expresión en organismos
procariotas, la invención contempla el uso de vectores del tipo de
pUC18, pUC19, Bluescript y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9,
CoIE1, pCR1, RP4, fagos y vectores "shuttle" tales como pSA3
and pAT28. Para la expresión en levaduras, vectores del tipo de
plásmidos de 2 micras, plásmidos de integración, vectores YEP,
plásmidos centroméricos y similares. Para la expresión en
baculovirus, la invención contempla el uso de vectores de la serie
pAC y de la serie pVL. Para la expresión en plantas, la invención
contempla el uso de vectores del tipo en los que la expresión de
los polinucleótidos de la invención puede estar dirigida por
promotores virales del tipo de los promotores 35S y 19S del CaMV,
que pueden ser usados opcionalmente en combinación con la secuencia
omega de TMV. Alternativamente, se puede usar el promotor del gen
que codifica para la subunidad pequeña de RUBISCO, el promotor del
gen de la nopalina sintetasa o promotores regulados por estrés
térmico y similares.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una célula o un organismo hospedador que contiene una construcción
génica de la invención o un vector tal que definido en la
invención. Cualquier tipo de organismo hoispedadro conocido para el
experto en la materia puede ser usado en la presente invención,
tales como una cepa bacteriana (Escherichia coli,
Bacillus subtilis y similares), una cepa de levadura
(Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris,
Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha y
similares), una planta transgénica (dicotiledoneas o
monocotildoneas), una célula de insecto, por ejemplo, baculovirus,
una célula de mamífero (células COS, CHO, C127, HeLa y similares) y
un transgénico no humano (por ejemplo, un ratón, una vaca, una
cabra, un conejo, un cerdo, etc.).
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método para la obtención de un polipéptido según la invención
que comprende transformar una célula con un vector según la
invención y recuperar el polipéptido del interior celular o del
medio de cultivo. Las proteínas de la invención se pueden expresar
usando una variedad de sistemas de expresión. Normalmente, los
péptidos pueden ser recuperados del medio de cultivo puesto que las
miticinas y mitilinas contienen una secuencia señal que dirige la
expresión de las proteínas al medio extracelular. En la presente
invención, se pueden usar células hospedadoras procariotas, más
concretamente, bacterias tales como E. coli y B.
subtilis transformadas con un plásmido, cósmido o bacteriófago
que contiene el gen del precursor de la miticina y/o mitilina,
levaduras tales como Saccharomyces y Pichia, transformadas con
vectores de expresión en levaduras, células de insecto infectadas
con vectores virales capaces de infectar dichas células
(baculovirus), células de plantas infectas con vectores virales
específicos de plantas (virus del mosaico de la coliflor, virus del
mosaico del tabaco) o transformadas con vectores plasmídicos (por
ejemplo, el plásmido Ti) o células de mamíferos (por ejemplo
células COS, CHO, BHK, 293, 3T3, HeLa, C127, Hep G2 y
similares).
El experto en la materia advertirá que la
invención incluye la expresión de los ADNcs tal y como se han
aislado usando el método de la invención pero que también es posible
la modificación de dichos ADNcs de forma que la secuencia de la
mitilcina y/o mitilina sea ligada a una secuencia heteróloga que
sea traducida en el sistema de expresión anteriormente indicado.
Dicha secuencia heteróloga puede tener utilidad tanto para la
purificación de la proteína como para su identificación si existen
anticuerpos específicos para ella. Dichas secuencias heterólogas
incluyen aquellas que codifican para la
glutation-S-transferasa (GST), la
proteína de unión a maltosa (MBP), tioredoxina (Trx), péptido de
unión a calmodulina (CBP), hexahistidina, FLAG,
c-myc y hemaglutinina. GST, MBP, Trx, CBP y
6-His permiten la purificación de la proteína
asociada a ellas usando glutation, maltosa, óxido de fenilarsina,
calmodulina o metales inmovilizados, respectivamente. FLAG,
c-myc y hemaglutinina permiten la purificación
mediante inmunoafinidad usando anticuerpos monoclonales y
policlonales específicos que reconocen los distintos epítopos.
Puesto que las miticinas y mitilinas se
sintetizan en forma de precursor que contiene, además de la forma
madura, un primer péptido en la región N-terminal y
un segundo péptido en la región C-terminal que
deben ser eliminados durante su maduración intracelular, el experto
en la materia advertirá que la secuencia heteróloga para su
localización/purificación debe estar situada en la secuencia de la
mitilina/miticina adyacentemente a la forma madura del polipéptido,
bien asociado a través de su extremo N-terminal
como asociado a través de su extremo C-terminal.
Alternativamente, las secuencias que codifican para las mitilinas
y/o miticinas y las secuencias que codifican para las proteínas o
péptidos heterólogos pueden estar separadas por una secuencia
heteróloga adicional que codifica para un sitio de reconocimiento
para una proteasa, de forma que la secuencia heteróloga pueda ser
eliminada tras la purificación de la proteína de fusión.
Usando el método objeto de la invención, los
autores han puesto de manifiesto que, de forma sorprendente, el
repertorio de péptidos con actividad antibacteriana presentes en
hemolinfa de mejillón es muy superior a lo que se conocía hasta la
fecha, puesto que los autores han identificado la existencia de 16
nuevas formas de miticinas y 3 nuevas formas de mitilinas, todas
ellas distintas a las descritas previamente. Así, en otro aspecto,
la invención se relaciona con un polipéptido seleccionado del grupo
de:
- (i)
- un polipéptido que comprende una de las secuencias definidas en SEQ ID NO:1 a 19.
- (ii)
- una variante del polipéptido según (i) que muestra una identidad en la secuencia aminoacídica de al menos 90% con los polipéptidos definidos en las secuencias de 1 a 16, y
- (iii)
- una variante del polipéptido según (ii) que muestra una identidad en la secuencia aminoacídica de al menos 66% con los polipéptidos definidos en las secuencias 17 a 19.
Según se entiende en el contexto de la presente
invención, una variante de un polipéptido según se define en las
secuencias de SEQ ID NO:1 a 19 es todo aquel péptido que se puede
obtener a partir de la secuencias 1 a 16 mediante sustitución,
inserción o deleción de uno o más amino ácidos. En el caso de las
variantes por substitución, la substituciones son preferentemente
substituciones conservativas, esto es, los aminoácidos se
sustituyen por otros con características similares en cuanto a la
propiedades de su cadena lateral. Así, substituciones conservativas
incluyen substituciones dentro de los grupos de amino ácidos según
la tabla 1.
Adicionalmente, uno ó más de los amino ácidos de
las variantes de la invención pueden estar sustituidos por amino
ácidos no convencionales naturales o sintéticos como por ejemplo,
beta-amino ácidos, ácido
2-aminoadípico, alpha-asparagina,
ácido 2-aminobutanoico, ácido
2-aminiocáprico, alpha-glutamina,
alpha-metilalanina, ácido
2-aminopimélico, ácido
gamma-amino-beta-hidroxibenzenopentanoico,
ácido 2-aminosubérico,
2-carboxiazetidina, beta-alanina,
ácido beta-aspártico, ácido 3,6 diaminohexanoico,
ácido butanoico, ácido 4-amino
4-amino-3-hidroxi
butanoico, ácido
gamma-amino-beta-hidroxiciclohexanepentanoico,
N5-aminocarbonilornitina,
3-sulfoalanina, ácido 2,4 diaminobutanoico, ácido
diaminopimélico, ácido 2,3 diaminopropanoico, ácido 2,7
diaminosubérico, S-etiltiocisteina, ácido
gamma-glutámico, ácido
gamma-carboxiglutámico, ácid pirogultámico,
homarginina, homocisteina, homohistinba, homoserina, ácido
2-hidroxiisovalérico, ácid
2-hidroxipentanoico,
5-hidroxilisina, 4-hidroxipriolina,
2-carboxioctahidroindol,
3-carboxiisoquinolina, isovalina, ácido
2-hidroxipropanoico, ácido mercaptoacético, ácid
mercaptobutanoico,
4-metil-3-hidroxiprolina,
ácido mercaptopropanoico, norlceucina, nortirosina, norvalina,
ornitina, penicilamina, 2-fenilglicina,
2-carboxipiperidina, sarcosina,
1-amino-1 -carboxiciclopentano,
statin, 3-tienilalanina,
epsilon-N-trimetilisina,
3-tiazolialanina, ácido
alpha-amino-2,4-dioxopirimidinapropanoico.
Adicionalmente, la invención contempla variantes
de los péptidos de la invención en los que uno o mas aminoácidos
han sufrido modificaciones en su cadena lateral. Ejemplos de
modificaciones de cadena lateral contempladas en la presente
invención incluyen modificaciones de grupos amino tales como
alquilación, amidinación, acilación, carbomoilación,
trinitrobencilación, piridoxilación, modificaciones del grupo
guanidino de los restos de arginina consistentes en la formación de
condensados heterocíclicos; modificaciones de los grupos carboxilo
mediante amidación, modificaciones de tirosinas mediante
metoxilación, modificación del animllo imidazólico de la histidina
mediante alquilación o N-carboxietilación,
modificaciones de la prolina mediante hidrixliación en posición 4.
Alternativamente, la invención contempla variantes de los péptidos
de la invención mediante glicosilación, es decir, la adición de
grupos de glicano bien en la cadena lateral serine y/o treonina
(O-glicosliación) o en la cadena lateral asparagina
y/o glutamina (N-glicosilación). Los glicanos que
pueden incorporarse a los polipéptidos de la invención incluyen un
número variable de unidades glucidicas (mono-, di-, tri,
tetrasacáridos y sucesivos). Los monosacáridos que forman en
glicano incluyen D-alosa, D-altrosa,
D-glucosa, D-manosa,
D-gulosa, D-idosa,
D-galactosa, D-talosa,
D-galactosamina, D-glucosamina,
D-N-acetylgucosamina,
D-N-acetylgalatosamina,
D-fucosa o D-arabinosa.
Alternativamente, la invención contempla
variantes de los polipéptidos de la invención en los que se
incluyen los estereoisómeros D de al menos uno de los aminoácidos
que constituyen la cadena peptídico para dar así lugar a los
isómeros retro-inverersos.
En otra forma de realización, la invención
contempla peptidomiméticos de los polipéptidos de la invención, es
decir, variantes en las que uno o más de los enlaces peptídicos ha
sido reemplazado por un tipo alternativo de enlace covalente. Dichos
peptidomiméticos se caracterizan por mostrar una mayor estabilidad
al ser más resistentes a proteasas. Modificaciones del esqueleto
peptídico incluyen la sustitución o la inserción en los elementos
del enlace peptídico (-NH-, -CH-, -CO-) de grupos tales como -O-,
-S-, -CH2 en lugar de -NH-, -N-, -C-alquil p -BH- en
lugar de -CHR y -CS-, -CH2-, -SOn-, -P=O(OH)- o
-B(OH)- en lugar de -CO-. Adicionalmente, es posible
aumentar la estabilidad de los péptidos de la invención usando
grupos que bloquen el extremo N-terminal tales como
t-butiloxicarbonil, acetil, succinil,
metoxisuccinil, suberil, adipil, dansil, benciloxicarbonil,
fluorenilmetoxicarbonil, metoxiadipil, metoxiadipil, metoxisuberil
y 2,3-dinitrofenil. Alternativa p simultáneamente,
es posible modificar el extremo C-terminal de los
péptidos mediante amidación.
La determinación del grado de identidad entre
las variantes y los polipéptidos definidos en las secuencias 1 a 19
se lleva a cabo usando métodos y algoritmos informáticos
ampliamente conocidos para el experto en la materia.
Preferentemente, la identidad entre dos secuencias de amino ácidos
se determina usando el algoritmo BLASTP (BLASTManual, Altschul, S.,
et al, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et
al., J. Mol. Biol. 21 5: 403-410 (1990).
Preferiblemente, los polipéptidos objeto de la invención muestran
una identidad de secuencia con los polipéptidos definidos en las
secuencias de SEQ ID NO:1 a 19 de al menos 50%, al menos 60%, al
menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%,
al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos
97%, al menos 98% o al menos 99%.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método para la obtención de un polipéptido de la invención que
comprende transformar una célula con un vector según de la
invención y recuperar el polipéptido del interior celular o del
medio de cultivo. Células y métodos adecuados para la expresión de
los polipéptidos de la invención son aquellas que se han definido
anteriormente.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método para la obtención de un polipéptido de la invención que
comprende inyectar intramuscularmente en un mejillón un agente
inmunogénico y recuperar posteriormente de la hemolinfa uno o varios
de los polipéptidos. En una forma preferida de realización, el
agente inmunogénico que se usa está seleccionado del grupo de un
cóctel de bacterias muertas, poli I:C y una mezcla de ambos.
En otro aspecto la invención se relaciona con un
anticuerpo que reconoce específicamente al menos un polipéptido de
la invención. Anticuerpos contemplados en el contexto de la
presente invención incluyen antisueros policlonales, moléculas de
IgG purificadas, sobrenadantes o líquido ascítico que contiene
anticuerpos monoclonales, fragmentos Fv, Fab, Fab' y
F(ab')_{2}, ScFvdiabodies, triabodies, tetrabodies
anticuerpos humanizados.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
composiciones farmaceúticas que comprenden al menos uno de los
polipéptidos de la invención o su forma madura acompañado de un
excipiente farmacéuticamente aceptable. Para uso en medicina, los
compuestos y combinaciones de compuestos de la invención pueden ser
formulados conjuntamente con un excipiente que es aceptable desde
el punto de vista farmacéutico. Excipientes preferidos para su uso
en la presente invención incluyen azúcares, almidones, celulosas,
gomas y proteínas. En una realización particular, la composición
farmacéutica de la invención se formulará en una forma farmacéutica
de administración sólida (p.ej., comprimidos, cápsulas, grageas,
gránulos, supositorios, etc.) o líquida (p.ej., soluciones,
suspensiones, emulsiones, etc.). En otra realización particular, las
composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser
administradas por cualquier ruta, incluyendo, sin ser limitante,
oral, intravenosa, intramuscular, intrarterial, intramedular,
intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutana,
intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual o rectal.
Una revisión de las distintas formas de administración de
principios activos, de los excipientes a utilizar y de sus
procedimientos de fabricación puede encontrarse en el Tratado de
Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A. de Ediciones,
1993.
En otra realización particular, cuando el
principio activo comprende un polinucleótido de la invención, la
composición farmacéutica de la invención puede formularse en forma
de una composición destinada para su empleo en terapia génica; a
modo ilustrativo, no limitativo, en este caso, la composición
farmacéutica de la invención puede contener un vector, viral o no
viral, que comprende un polinucleótido de la invención o una
construcción génica de la invención. A modo ilustrativo, no
limitativo, dichos vectores pueden ser vectores virales, por
ejemplo, basados en retrovirus, adenovirus, etc., o no virales
tales como los complejos ADN-liposoma,
ADN-polímero,
ADN-polímero-liposoma, etc. [véase
"Nonviral Vectors for Gene Therapy", editado por Huang, Hung y
Wagner, Academic Press (1999)]. Dichos vectores, que contienen un
polinucleótido o una construcción génica de la invención pueden ser
administrados directamente al cuerpo humano o animal por métodos
convencionales.
Alternativamente, dichos vectores pueden ser
utilizados para transformar, transfectar o infectar células, por
ejemplo, células de mamíferos, incluido el hombre, ex vivo, y,
posteriormente implantarlas en el cuerpo humano o animal para
obtener el efecto terapéutico deseado. Para su administración al
cuerpo humano o animal dichas células se formularán en un medio
adecuado que no afecte adversamente a la viabilidad de dichas
células.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el uso de un polipéptido de la invención o de un polinucleótido de
la invención para la preparación de un medicamento destinado a
tratar una enfermedad infecciosa. Aunque los polipéptidos de la
invención se han demostrado útiles para el tratamiento de
infecciones bacterianas mediadas por E. coli y de
infecciones víricas mediadas por el virus que cause la necrosis
pancreática infecciosa, la presente invención contempla el uso de
los polipéptidos y polinucleótidos de la invención para el
tratamiento de todo tipo de enfermedades infecciosas de origen
bacteriano, vírico, fúngico o parasitario. Así, la invención
contempla el uso de los polipéptidos y polinucleótidos para el
tratamiento de enfermedades causadas por bacterias tales como
menigitus, carbunco, apenditis, disenteria, bacteremia, peste,
lepra, borreliosis, botulismo, bronquitis, brucelosis, peste
bubónica, cerebritos, cervicitis, cólera, conjuntivitis, cistitis,
dermatitis, diarrea, encefalitis, endocarditis, fiebre entérica,
enteritis, enterocolitis, epididimitos, erisipela, tuberculosis,
forúnculos, gangrena, gastritis, gastroenteritis, otitis,
glomerulonefritis, impetigo, laringitis, tetano, mastitis,
meningitis, meningoencefalitis, listeriosis, nocardiosis,
oftalmitis, osteomielitis, otitis media, pancreatitis, parotiditis,
neumonía, listeremia, prostatis, sepsis puerperal, abscesos
cutaneos, pielonefritis, fiebre reumática, rinitis,
romboencefalitis, salmonelosis, escarlatina, sepsis, shigelosis,
sífilis, peritonitis, sinusitis, traqueobronquitis, fiebres de
Malta, tifus, fiebres tifoideas, ulcera y uretritis.
En otra forma de realización, la invención
contempla el uso de los polipéptidos y polinucleótidos para el
tratamiento de enfermedades causadas por hongos tales como
aspergilosis, blastomicosis, candidiasis, cromoblastomicosis,
criptococsis, dermatomicosis, dermatofitosis, histoplasmosis,
mucormicosis, micetoma, queratitis micótica, oculomicosis,
otomicosis, paracoccidiomicosis, rinosporidiosis, esporotricosis,
tiña, dermatitis seborreica, eccema numular, liquen simple,
pitiriasis rosada de Gubert y zigomicosis.
En otra forma de realización, la invención
contempla el uso de los polipéptidos y polinucleótidos para el
tratamiento de enfermedades causadas por protozoos tales como
tripanosomiasis africana, tripanosomiais americana, amebiasis,
disenteria amebiana, enfermedad de Chagas, coccidiosis,
criptoporidiosis, leishmaniasis cutanea, leishmaniais visceral,
ciclosporiasis, entamebiasis, giardiasis, isosporiasis, malaria,
microsporidosis, neumocistosis, sarcosporidiosis, enfermedad del
sueño, toxoplasmosis, tricomoniasis, tripanosomiasis.
En otra forma de realización, la invención
contempla el uso de los polipéptidos y polinucleótidos para el
tratamiento de enfermedades de origen viral tales como SIDA,
enfermedad respiratoria aguda, fiebre hemorrágica de Ebola, fiebre
hemorrágica de Lassa, fiebre hemorrágica de Marburgo, fiebre
hemorrágica argentina, fiebre hemorrágica boliviana,
encefalomielitis, gripe, gripe aviaria, fiebre aftosa, herpes
genital, herpes cutaneo, herpes zoster, herpangina, varicela,
hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E,
enfermedad de Hodgkin, linfoma de Burkitt, sarcoma de Kaposi,
viruela, síndrome respiratorio severo y agudo (SARS), paperas.
Dengue, fiebre amarilla, encefalomielitis, sarampión, resfriado
común, conjuntivitis, gastroenteritis, cáncer cervical, linfoma,
orquitis, rubéola, encefalitis de San Luis, mononucleosis,
menigoencefalitis, laringitis, Molluscum contagiosum, peste porcina,
infeccione spor hantavirus, coriomeningitis linfocítica, verruga,
polimielitis, rabia, enfermedad de
Gerstmann-Straussler-Scheinker,
enfermedad de Boma, difteria, encefalitis causada por Arbovirus,
fiebre de Mayaro, eritema infeccioso, encefalitis LaCrosse,
polimielitis, encefalitis del lóbulo temporal, leucoendefalitis
multifocal progresiva, enfermedad respiratoria febril aguda,
enfermedad de Bornholm y parotitis.
La invención se ilustra a continuación mediante
los siguientes ejemplos que han de ser considerados como meramente
ilustrativos y no limitativos del alcance de la invención.
Para el estudio se partió de un stock de
mejillones de las Rías Bajas gallegas, a los que se estimuló
mediante inyección intramuscular con un cóctel de bacterias muertas
o polyI:C. A las 24 horas se les extrajo la hemolinfa, se separaron
por centrifugación suero y células (hemocitos), y se extrajo RNA del
pellet de hemocitos siguiendo los protocolos habituales para esta
técnica. Con un pool de hemolinfa de 50 mejillones por cada
tratamiento, se llevaron a cabo dos sustracciones de librerías
génicas, entre animales tratados con bacteria o poly I:C y los
animales control (a los que se les había inyectado agua de mar).
Para ello, se sintetizó el cDNA de cada pool de hemocitos (muestras
de infección con bacteria, muestras de infección con poly I:C y
muestras control, sin infección) mediante el kit de síntesis de cDNA
de Clontech SMART PCR cDNA Síntesis kit, que permite la
amplificación completa de eDNA a partir de transcriptos de mRNA.
Posteriormente se realizó una sustracción de librerías génicas
mediante la técnica SSH llevada a cabo con el kit
PCR-Select eDNA Subtraction kit (Clontech).
Mediante esta técnica se identificaron genes expresados o sobre
expresados en tejidos infectados, en comparación con los controles
no infectados. Las secuencias obtenidas expresadas diferencialmente
se amplificaron mediante PCR , se ligaron en vectores de ligación
con el kit TOPO TA cloning (Invitrogen) y se trasformaron en
bacterias E. coli competentes. Las colonias seleccionadas a
partir de la transformación se amplificaron por PCR y se
secuenciaron en secuneciador automático DNA sequencer ABI 3730. Las
secuencias obtenidas se analizaron y compararon con genes
conocidos, con ayuda del BLAST. Una vez caracterizadas las
secuencias, se realizaron estudios de expresión mediante PCR en
tiempo real " Real Time SYBER Green PCR Assay".
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Se ha determinado la actividad antimicrobiana de
una combinación de miticinas y miticinas contra el virus de la
necrosis pancreática infecciosa (IPNV, birnavirus) y la bacteria
Escherichia Coli mediante las técnicas usuales de diluciones
seriadas resultando en una disminución significativa del título
viral y del crecimiento bacteriano.
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<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS
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<120> MÉTODO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE
POLIPÉPTIDOS ANTIBACTERIANOS Y ANTIVIRALES OBTENIDOS DE MYTILUS
EDULIS
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<130> P2764ES00
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<160> 19
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.4
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<210> 1
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<213> Mitylus edulis
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<213> Mytilus edulis
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<212> PRT
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Claims (17)
1. Método para la identificación de un ADNc que
codifica el precursor de una miticina o una mitilina que
comprende
- (i)
- poner en contacto un mejillón un agente inmunogénico,
- (ii)
- preparar librerías de ADNc de mejillones tratados con el agente inmunogénico
- (iii)
- efectuar una sustracción de la librería obtenida de los mejillones tratados con una preparación de ácidos nucleicos de mejillones controles y
- (iv)
- aislar los ADNcs específicos de mejillones tratados con el agente inmunogénico.
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2. Método según la reivindicación 1, en el que
el agente inmunogénico está seleccionado del grupo de un cóctel de
bacterias muertas, poli I:C y una mezcla de ambos.
3. Un ADNc identificado mediante un método según
las reivindicaciones 1 ó 2.
4. Una construcción génica que comprende un
ácido nucleico tal que definido en la reivindicación 3.
5. Un vector de expresión que comprende un ácido
nucleico según la reivindicación 3 o una construcción génica según
la reivindicación 4 que está operativamente acoplado con una
secuencia que regula la expresión de dicho polinucleótido o de
dicha construcción génica.
6. Una célula hospedadora que contiene una
construcción génica tal que definida en la reivindicación 4 o un
vector tal que definido en la reivindicación 5.
7. Un polipéptido codificado por un ADNc según
la reivindicación 3.
8. Un polipéptido según la reivindicación 7
seleccionado del grupo de
- (i)
- un polipéptido que comprende una de las secuencias definidas en SEQ ID NO:1 a 19,
- (ii)
- una variante del polipéptido según (i) que muestra una identidad en la secuencia aminoacídica de al menos 90% con los polipéptidos definidos en las secuencias de 1 a 16, y
- (iii)
- una variante del polipéptido según (ii) que muestra una identidad en la secuencia aminoacídica de al menos 66% con los polipéptidos definidos en las secuencias 17 a 19.
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9. Método para la obtención de un polipéptido
según la reivindicación 7 u 8 que comprende transformar una célula
con un vector según la reivindicación 5 y recuperar el polipéptido
del interior celular o del medio de cultivo.
10. Método para la obtención de un polipéptido
según la reivindicación 7 u 8 que comprende inyectar
intramuscularmente en un mejillón un agente inmunogénico y
recuperar posteriormente de la hemolinfa uno o varios de los
polipéptidos.
11. Método según la reivindicación 10 en el que
el agente inmunogénico está seleccionado del grupo de un cóctel de
bacterias muertas, poli I:C y una mezcla de ambos.
12. Un anticuerpo que reconoce específicamente
el polipéptido según las reivindicaciones 7 u 8.
13. Una composición farmacéutica que comprende
al menos un polipéptido según la reivindicaciones 7 u 8 y un
carrier farmacéuticamente aceptable.
14. Un polipéptido según la reivindicación 7 u 8
o una composición según la reivindicación 13 para su uso en
medicina.
15. Uso de un polipéptido según la
reivindicación 7 u 8 o de una composición según la reivindicación
13 para la preparación de un medicamento destinado a tratar una
enfermedad infecciosa.
16. Uso según la reivindicación 15, en el que la
enfermedad infecciosa es una infección por E. coli.
17. Uso según la reivindicación 15, en el que la
enfermedad infecciosa es una necrosis pancreática infecciosa.
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| ES200703165A ES2334083B1 (es) | 2007-11-28 | 2007-11-28 | Metodo para la identificacion de polipeptidos antibacterianos y antivirales obtenidos de mytilus edulis. |
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|---|---|
| ES2334083A1 ES2334083A1 (es) | 2010-03-04 |
| ES2334083B1 true ES2334083B1 (es) | 2011-04-19 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200703165A Expired - Fee Related ES2334083B1 (es) | 2007-11-28 | 2007-11-28 | Metodo para la identificacion de polipeptidos antibacterianos y antivirales obtenidos de mytilus edulis. |
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|---|---|---|---|---|
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| FR2796072A1 (fr) * | 1999-07-08 | 2001-01-12 | Centre Nat Rech Scient | Peptides anti-microbiens de mollusques |
-
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- 2007-11-28 ES ES200703165A patent/ES2334083B1/es not_active Expired - Fee Related
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Non-Patent Citations (3)
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| DATABASE UNIPROT [Online] 01 noviembre 1999 (01.11.1999) "{}Mytilin B and MGD2, two antimicrobial peptides of marine mussels: gene structure and expression analysis."{} Mytilin B antimicrobial peptide. Retrieved from EBI. Accesion N$^{o}$: Q9Y0B1 * |
| DATABASE UNIPROT [Online] 11 septiembre 2007 (11.09.2009) "{}Sequence variability of Myticins identified in haemocytes from mussels stimulated with Vibrio and poly I:C suggests ancient host-pathogen interactions."{} Myticin C; Precursor. Retrieved from EBI. Accesion N$^{o}$: A7DWW0; A7DWX8; A7DWX1; A7DWX7; A7DWS4;A7DWX3; A7DWX5; A7DWU9; A7DWW2; A7DWX0; A7DWX6; A7DWY0; A7DWW9;A7DWX4; A7DWX2. * |
| DATABASE UNIPROT [Online] 23 octubre 2007 (23.10.2007) "{}Gene of the antimicrobial peptide myticin B from the Mediterranean mussel, Mytilus galloprovincialis."{} Myticin B; Precursor. Retrieved from EBI. Accesion N$^{o}$: A7XP66. * |
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