ES2334138T3 - Proteina nmb1125 y uso de la misma en formulaciones farmaceuticas. - Google Patents

Abstract

Uso de un nuevo antígeno vacunal aplicado de manera preventiva o terapéutica contra enfermedades bacterianas, virales, cancerosas, o de otro origen. El objetivo técnico que se persigue es el desarrollo de formulaciones capaces de elevar el espectro protector de las vacunas ya existentes y extenderlo contra diferentes patógenos. Para lograr este objetivo se aisló e identificó la proteína NMB1125 como componente de las preparaciones de membrana externa de Neisseria meningitidis, capaz de inducir actividad bactericida. Adicionalmente, se clonó y expresó el gen codificante para la proteína NMB1125, la cual se purificó evaluándose luego su inmunogenicidad en biomodelos animales. El secuenciamiento de genes homólogos evidenció, por su elevado grado de conservación, su alto valor como antígeno inductor de una respuesta inmune cruzada cuando es presentado por diferentes vías. Las formulaciones resultantes de esta invención son aplicables en la industria farmacéutica como formulaciones vacunales para uso humano.

Description

Proteína NMB1125 y uso de la misma en formulaciones farmacéuticas.

La presente invención se refiere al campo de la medicina, particularmente al desarrollo de nuevas formulaciones de vacuna de aplicación preventiva o terapéutica, que permite un incremento de la calidad de la respuesta inmunitaria contra los antígenos vacunales de enfermedades de diferentes fuentes.

Neisseria meningitidis, un diplococo gramnegativo cuyo único huésped conocido es el hombre, es el agente causal de la meningitis meningocócica. Normalmente, esta bacteria se encuentra en portadores asintomáticos entre la población normal, siendo este nicho la fuente más frecuente para su aislamiento microbiológico.

En términos internacionales, los niños menores de dos años de edad son la población más susceptible a contraer meningitis meningocócica, no obstante, también puede afectar a adultos jóvenes y a la población normal de adultos.

La enfermedad meningocócica sin tratar tiene una evolución mortal para la mayoría de los individuos afectados y la vacunación podría evitar esta situación al detener los acontecimientos ya en la fase de colonización bacteriana.

Se han desarrollado varias estrategias con el objetivo de obtener una vacuna capaz de satisfacer los requisitos necesarios con el fin de inducir protección contra esta enfermedad en la población general. Para este fin, se han tenido en cuenta los antígenos capsulares, dado que sus especificidades inmunológicas han permitido la clasificación de este microorganismo en serogrupos. Cinco de estos serogrupos se han definido como responsables de la mayoría de los casos clínicos de enfermedad meningocócica en todo el mundo. El serogrupo A es la causa principal de la epidemia en el África subsahariana. Los serogrupos B y C están asociados, en la mayoría de los casos, con los episodios en las naciones desarrolladas. Los serogrupos Y y W135 son frecuentes en la mayoría de los casos recurrentes de la enfermedad y prevalecen en la mayoría de las áreas de EE.UU., con un marcado incremento en los últimos años. A partir de estos datos, es obvia la razón del uso, estudio y evaluación de polisacáridos capsulares como candidatos a vacunas. En EE.UU. se ha autorizado una vacuna tetravalente, basada en polisacáridos capsulares, que confiere protección contra los serogrupos A, C, Y y W-135. Los anticuerpos producidos tras la vacunación son específicos de serogrupo (Rosenstein N. y col. 2001. Meningococcal disease. N. Engl. J. Med, 344, 1378-1388).

El serogrupo B, que es diferente del resto, continúa siendo una causa significativa de enfermedad meningocócica endémica y epidémica, lo que se debe, principalmente, a la ausencia completa de vacunas eficaces conrea ella. Se ha observado que el polisacárido capsular B es poco inmunógeno, más la existencia del riesgo teórico de que una vacuna basada en este compuesto induzca inmunotolerancia y autoinmunidad por su similitud estructura con las cadenas de oligosacáridos que están presentes en las estructuras neurales fetales humanas. (Finne J. y col. 1987. An IgG monoclonal antibody to group B meningococci cross-reacts with developmentally regulated polysialic acid units of glycoproteins in neural and extraneural tisues. J. Immunol, 138: 4402-4407). Por tanto, el desarrollo de vacunas contra los serogrupos B se concentra en el uso de antígenos subcapsulares.

Vacunas de proteínas de la membrana externa y en vesículas

Los intentos iniciales en la década de 1970 para producir vacunas basadas en las proteínas de la membrana externa se basaron en la depleción de LPS de las preparaciones de proteína de membrana externa mediante detergente (Frasch CE and Robbins JD. 1978. Protection against group B meningococcal disease. III. Immunogenicity of serotype 2 vaccines and specificity of protection in a guinea pig model. J Exp Med 147(3):629-44). Las proteínas de la membrana externa, PME, se precipitaron después para producir agregados suspendidos en cloruro sódico. A pesar de los prometedores resultados en estudios con animales, estas vacunas no han inducido anticuerpos bactericidas ni en adultos ni en niños (Zollinger WD, y col. 1978. Safety and immunogenicity of a Neisseria meningitidis type 2 protein vaccine in animals and humans. J. Infect. Dis. 137(6):728-39), el mal funcionamiento de estas vacunas se atribuyó en gran medida a la pérdida de estructura terciaria que acompañó a la precipitación. Por tanto, la siguiente etapa lógica fue producir una vacuna con proteínas mostradas en su conformación nativa en forma de vesículas de la membrana externa. 1979. complex of meningococcal group B polysaccharide and type 2 outer membrane protein immunogenic in man. J. Clin. Invest. 63(5):836-48, Wang LY y Frasch CE. 1984. Development of a Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mouse model. Infect Immun. 46(2):408-14136).

Estas vacunas en vesículas de membrana externa fueron significativamente más inmunógenas que los agregados de PME y se ha demostrado que la inmunogenicidad se reforzaba más mediante la adsorción en el adyuvante de hidróxido de aluminio (Wang LY and Frasch CE. 1984. Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mouse model. Infect Immun. 46(2):408-14136).

Se han realizado numerosos ensayos de eficacia usando vacunas solubles de vesículas de membrana externa de diferentes formulaciones. Las dos vacunas más estudiadas se desarrollaron en la década de 1980 en respuesta a los brotes de la enfermedad en Cuba (Sierra GV y col. 1991. Vaccine against group B Neisseria meningitidis: protection trial and mass vaccination results in Cuba. NIPH Ann Dis. 14(2):195-210) y Norway (Bjune G, y col. 1991. Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway. Lancet. 338(8775):1093-6), respectivamente. La vacuna VME producida por el Finlay Institute en Cuba (comercializada como VAP-MENGOC-BC) se produce a partir de la cepa B:4:P1.19,15 con el polisacárido del serogrupo C y una preparación de PME de alto peso molecular y se absorbe en hidróxido de aluminio (Sierra GV y col. 1991. Vaccine against group B Neisseria meningitidis: protection trial and mass vaccination results in Cuba. NIPH Ann Dis. 14(2):195-210). Esta vacuna contribuyó a la rápida disminución de la epidemia en Cuba (Rodríguez AP, y col. The epidemiological impact of antimeningococcal B vaccination in Cuba. 1999. Mem Inst Oswaldo Cruz. 94(4):433-40).

La vacuna producida por el Norwegian National Institute for Public Health (NIPH) estaba, de igual modo, dirigida inicialmente para usar durante un periodo de enfermedad hiperendémica causada por otro microorganismo del clon ET-5 (B:15:P1,7, 16). También era una vacuna monovalente producida a partir de vesículas purificadas de membrana externa adsorbidas en hidróxido de aluminio (Bjune G, y col. 1991. Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway. Lancet. 338(8775):1093-6).

Parece que las vacunas de vesículas de membrana externa presentan de forma eficaz en una conformación suficientemente natural para permitir la generación de anticuerpos bactericidas funcionales, al menos en adolescentes y adultos. Asimismo, se ha mostrado que las respuestas de anticuerpo generadas incrementan la opsonofagocitosis de los meningococos. La formulación precisa de las vacunas (es decir, el contenido en PME, contenido en LPS y la presencia o ausencia de adyuvante) tiene un impacto significativo sobre la inmunogenicidad (Lehmann AK, y col. 1991. Immunization against serogroup B meningococci. Opsonin response in vaccinees as measured by chemiluminescence. APMIS. 99(8):769-72, Gomez JA, y col. 1998. Effect of adjuvants in the isotypes and bactericidal activity of antibodies against the transferrin-binding proteins of Neisseria meningitidis. Vaccine. 16(17):1633-9, Steeghs L, y col. 1999. Immunogenicity of Outer Membrane Proteins in a Lipopolysaccharide-Deficient Mutant of Neisseria meningitidis: Influence of Adjuvants on the Immune Response. Infect Immun. 67 (10):4988-93).

El perfil antigénico de los aislamientos de la enfermedad también cambia rápidamente y es probable que una vacuna con una cobertura de únicamente un número limitado de cepas seleccionadas sea ineficaz en pocos años a menos que la composición de la vacuna se modifique para reflejar la epidemiología local.

En la actualidad, las vacunas de VME se han usado más ampliamente que cualquier otra vacuna del serogrupo B y son potencialmente útiles en el contexto de los brotes de la enfermedad causados por un único tipo PorA.

Todavía han de definirse totalmente los inmunógenos que generan reactividad cruzada entre cepas. Los estudios de sueros pos-vacunación de de ensayos de vacunas tanto del Finlay Institute como del NIPH han sugerido que los anticuerpos contra PorA (P1, la proteína del serosubtipo de clase 1) y OpcA (otra PME fundamental, antes conocida como Opc) ((Wedege E, y col. 1998. Immune Responses against Major Outer Membrane Antigens of Neisseria meningitidis in Vaccinees and Controls Who Contracted Meningococcal Disease during the Norwegian Serogroup B Protection Trial. Infect Immun. 66(7): 3223-31)), fueron importantes en la mediación de la actividad bactericida en suero (siendo el Porra el más inmunógeno), estos dos antígenos muestran una marcada variabilidad de una cepa a otra.

La prominencia de la proteína PorA y el significativo nivel de variabilidad en esta proteína, que parece sufrir una variación continua tanto entre como durante los brotes (Jelfs J, y col. 2000. Sequence Variation in the porA Gene of a Clone of Neisseria meningitidis during Epidemic Spread. Clin Diagn Lab Immunol. 7(3):390 5) en los epítopos a los que está dirigida la mayoría de la actividad bactericida en la posvacunación (y después de la enfermedad) potenciaba la preocupación de que la protección ofrecida por las vacunas basadas en VME de una única cepa (monovalente) podrían estar restringidas por serosubtipo (es decir, dependen del tipo de PorA).

En un intento de superar este posible problema, en el RIVM de los Países Bajos se desarrolló una vacuna de VME que contenía proteínas PorA de seis aislamientos patógenos prevalentes diferentes (Van Der Ley P y Poolman JT. 1992. Construction of a multivalent meningococcal vaccine strain based on the class 1 outer membrane protein. Infect Immun. 60(8):3156-61, Claassen I, y col. 1996. Production, characterization and control of a Neisseria meningitidis hexavalent class 1 outer membrane protein containing vesicle vaccine. Vaccine. 14(10)1001-8). En este caso, las vesículas para vacuna se extrajeron de dos variantes de la cepa H44/76 bien caracterizada que se había sometido a ingeniería genética para expresar tres proteínas PorA distintas. Búsqueda de un antígeno universal.

Está claro que las proteínas de membrana externa (PME) pueden inducir una respuesta inmunitaria funcional contra la enfermedad del serogrupo B, pero que, hasta ahora, ninguna de las vacunas desarrolladas son protectoras universales debido a la gran heterogenicidad de las regiones expuestas en la superficie de las proteínas de membrana externa. La modesta inmunidad de reactividad cruzada inducida por las vacunas compuestas por vesículas de membrana externa (VME) ha avivado la búsqueda de un antígeno (o grupo de antígenos) de membrana externa que induzca anticuerpos funcionales y que está presente en todas las cepas meningocócicas. Dichos antígenos, si estaban presentes en todas las cepas con independencia del serogrupo, podría formar la base de una vacuna meningocócica verdaderamente universal, que eliminaría el posible problema del cambio capsular en cepas patógenas tras la vacunación con polisacárido.

Una vez que se ha puesto de manifiesto que la variabilidad de la proteína PorA inmunodominante limitaría su uso como vacuna universal, se consideró una serie de las otras proteínas de membrana externa predominantes por su potencial como vacuna y varias de estas están en desarrollo. Las que se han considerado incluyen proteínas de clase 5 (OpcA), Nspa y proteínas reguladas por hierro (TbpA y B, FbpA, FetA). La TbpB forma parte del complejo de unión de la transferrina con TbpA. Recientes trabajos sugieren que la TbpA tiene un papel funcional mayor en la unión del hierro (Pintor M, y col. 1998. Analysis of TbpA and TbpB functionality in defective mutants of Neisseria meningitidis. J Med Microbiol 47(9): 757-60) y es un inmunógeno más eficaz que la TbpB.

Mediante una nueva técnica que usa combinaciones de preparaciones de proteínas de membrana externa de diferentes cepas meningocócicas para inmunizar ratones (Martin D, y col., 1997. Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83) se ha descubierto una proteína de membrana externa menor altamente conservada. Las células B de los ratones se usaron para producir hibridomas que, después, se sometieron a detección selectiva para determinar la reactividad cruzada contra múltiples cepas de meningococos. Se descubrió que un anticuerpo monoclonal con gran reactividad cruzada se unió a una proteína de membrana externa de 22 kDa denominada NspA. Se mostró que la inmunización con la proteína NspA recombinante inducía una respuesta bactericida con reactividad cruzada en ratones contra cepas de los serogrupos A-C. La vacunación también protege a los ratones contra la infección meningocócica mortal (Martin D, y col. 1997. Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173 83). La comparación de secuencias de NspA entre cepas meningocócicas genéticamente divergentes demuestra que la proteína está altamente conservada (homología del 97%) (Cadieux N, y col. 1999. Bactericidal and Cross-Protective Activities of a Monoclonal Antibody Directed against Neisseria meningitidis NspA Outer Membrane Protein. Infect Immun 67 (9): 4955-9).

La presencia de NspA se detectó mediante ELISA en el 99,2% de las cepas analizadas de los serogrupos A-C usando anticuerpos monoclonales anti-NspA (Martin D, y col. 1997. Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). Se ha demostrado que estos anticuerpos monoclonales son bactericidas contra numerosas cepas de meningococos y son capaces de reducir la bacteriemia meningocócica en un modelo de ratón (Cadieux N, y col. 1999. Bactericidal and Cross-Protective Activities of a Monoclonal Antibody Directed against Neisseria meningitidis NspA Outer Membrane Protein. Infect Immun 67 (9): 4955-9). Aunque este dato parece sugerir que la NspA es un prometedor candidato a vacuna que es capaz de proteger a través de los límites del serogrupo, el suero policlonal anti-NspA recombinante de ratones no se une a la superficie de alrededor del 35% de las cepas patógenas meningocócicas de serogrupo B a pesar de la presencia del gen nspA en estos organismos (Moe GR y col. 1999. Differences in Surface Expression of NspA among Neisseria meningitidis Group B Strains. Infect Immun 67 (11): 5664 75). Presentación de antígeno y formulación de la vacuna.

Anteriores trabajos han sugerido que es probable que la forma en la que los antígenos se presentan sea crucial. Los epítopos sobre las proteínas unidas a la membrana a menudo dependen del mantenimiento de la correcta estructura terciaria y esto, a su vez, con frecuencia depende de los dominios hidrófobos unidos a la membrana. Se ha demostrado que las preparaciones de proteínas de membrana externa únicamente provocan inmunidad en seres humanos cuando se presentan en forma de vesícula (Zollinger WD, y col. 1979. complex of meningococcal group B polysaccharide and type 2 outer membrane protein immunogenic in man. J Clin Invest 63 (5): 836-48, Zollinger WD, y col. 1978. Safety and immunogenicity of a Neisseria meningitidis type 2 protein vaccine in animals and humans. J Infect Dis 137 (6): 728-39).

En el campo se ha usado las vacunas de una proteína durante décadas y en general exhiben buena estabilidad. Si se requiere la presentación en forma de vesículas, para permitir que los antígenos permanezcan unidos a la membrana, es posible que sea difícil garantizar la estabilidad y la reproducibilidad. La inmunogenicidad y la reactogenicidad de las vesículas de membrana externa pueden variar con las alteraciones en la cantidad de proteína y LPS eliminados en los procedimientos de purificación. No obstante, en la fabricación de vacunas de VME se ha acumulado una gran cantidad de experiencia en la producción de vacunas, y las vacunas producidas en la actualidad están sujetas a un exhaustivo control de calidad. La construcción de vesículas de liposomas enteramente sintéticas puede permitir la posterior optimización y normalización de dichas vacunas (Christodoulides M, y col 1998. Immunization with recombinant class 1 outer-membrane protein from Neisseria meningitidis: influence of liposomes and adjuvants on antibody avidity, recognition of native protein and the induction of a bactericidal immune response against meningococci. Microbiology 144(Pt 11):3027 37). En otras palabras, las proteínas de membrana externa se han presentado tanto en vesículas como en proteínas puras expresadas y el desarrollo de respuestas de anticuerpos ha sido modesto. Hasta ahora, muchos esfuerzos se han concentrado en la inyección intramuscular de vacunas meningocócicas, lo que conduce a la producción de IgG sistémica. No obstante, en la enfermedad meningocócica en la que la invasión del huésped se produce a través del epitelio nasal, la producción de IgA secretora puede también ser importante.

La secuencia del genoma de N. meningitidis

Las secuencias del genoma de MC58 (un meningococo del serogrupo B) (Tettelin H, y col. 2000. complete Genome Sequence of Neisseria meningitidis Serogroup B Strain MC58. Science 287 (5459): 1809-15172) y de Z2491 (una cepa del serogrupo A) (Parkhill J, y col. 2000. complete DNA sequence of a serogroup A strain of Neisseria meningitidis Z2491. Nature 404 (6777):502-6173) se dilucidaron y publicaron durante 2000. La disponibilidad de las secuencias génicas indicadas debería tener una gran influencia sobre la investigación de vacunas meningocócicas. Mientras la secuenciación del genoma de MC58 estaba en curso, Pizza y col. comenzaron a identificar los marcos de lectura abiertos que se había previsto que codificaban sus proteínas exportadas o expuestas en la superficie unidas a la membrana. Identificaron 570 de estos ORF, los amplificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa y los clonaron en Escherichia coli para permitir la expresión de las proteínas codificadas como proteínas de fusión glutatión S-transferasa o marcadas con His (Pizza M, y col. 2000. Identification of Vaccine Candidates Against Serogroup B Meningococcus by Whole-Genome Sequencing. Science 287 (5459): 1816-20). El 61% (350) de los ORF seleccionados se expresó con éxito, los que no se expresaron fueron, a menudo, los que contenían más de un dominio transmembrana hidrófobo (posiblemente excluida una serie de proteínas unidas a la membrana externa). Las proteínas recombinantes se purificaron y usaron para vacunar ratones. Los sueros inmunitarios se evaluaron después para determinar la unión de superficie a múltiples cepas meningocócicas mediante ensayo de inmunoadsorción ligada a enzimas (ELISA) y mediante citometría de flujo, y para determinar la actividad bactericida contra dos cepas usando el ensayo bactericida en suero. Por último, se seleccionaron siete proteínas para su posterior estudio sobre la base de una respuesta positiva en los tres ensayos. Se ha demostrado que las formulaciones de vacuna del estudio usando una serie de estas proteínas en combinación con adyuvantes inducen significativas títulos bactericidas contra la cepa meningocócica homóloga (MC58) en ratones, pero ninguna de las proteínas indujo litros de SBA tal elevados como una vacuna de vesícula de membrana externa de MC58 (Giuliani MM, y col. 2000. Proceedings 12th IPNC. pág. 22). Por otro lado, existen varias pruebas de que las combinaciones de estas proteínas pueden exhibir mayor inmunogenicidad en ratones que las proteínas sencillas (Santini L. y col. 2000. Proceedings 12th IPNC. pág. 25). Los numerosos marcos de lectura que se excluyeron durante este trabajo, quizá por un fallo de expresión proteica o modificación de sus propiedades inmunológicas, pueden tener también potencial de vacuna y requieren investigación adicional.

Entre las muchas secuencias reveladas mediante la secuenciación genómica masiva y registradas en las bases de datos, existe una proteína periplásmica putativa en el índice de la BASE DE DATOS UniProt con el nº de registro en la base de datos Q9JQZ2, con función desconocida (BASE DE DATOS UniProt "Proteína perimásmica putativa". XP002331525 recuperada del nº de registro EBI UNIPROT: Q9JQZ2. Su secuencia de aminoácidos se dedujo a partir de la secuencia de ADN y es idéntica a la identificada en la presente memoria descriptiva como SEC ID Nº 4.

Los componentes de la vacuna pueden seleccionarse con más eficacia una vez que se ha entendido la contribución de antígenos individuales a la patogenia de N. meningitidis. Los propios antígenos puede ser eficaces candidatos a vacuna o, como alternativa, los mutantes atenuados podrían considerarse como constituyentes de vacunas.

En este sentido, el uso de candidatos a vacunas con un grado elevado de conservación de secuencia entre varias especies de microorganismos patógenos podría proporcionar una solución a las múltiples enfermedades que podrían causar en el caso de que estos candidatos induzcan una respuesta conveniente a través de la acción del sistema inmunitario.

El objetivo técnico que persigue la presente invención es el desarrollo de formulaciones de vacunas capaces de incrementar y/o ampliar la respuesta inmunitaria inducida contra diferentes patógenos o contra una amplia gama de variantes patógenas individuales, siendo estos patógenos de origen canceroso, bacteriano, viral o de cualquier otro tipo.

Descripción de la invención

En el trabajo objeto de la presente invención se notifica, por primera vez, el uso de la proteína NMB 1125 como componente de una formulación de vacuna con carácter terapéutico o preventivo contra la enfermedad meningocócica o cualquier infección causada por un miembro del género Neisseria.

El carácter novedoso de la presente invención consiste en el uso, no comunicado previamente, de la proteína NMB1125 en formulaciones con nuevas propiedades, capaces de inducir una respuesta inmunitaria sistémica y mucosa de protección de amplio espectro, debido al carácter conservado de esta proteína en diferentes aislamientos de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Vector de clonación Pm100 empleado en la clonación y expresión de la proteína NMB1125. pTrip, promotor de triptófano; N-term P64k, fragmento N-terminal; terminador T4, terminador de la transcripción fago T4.

Figura 2. Construcción final de la secuencia de nucleótidos del gen NMB1125 en el vector pM100.

Figura 3. Análisis SDS-PAGE de las fracciones obtenidas a partir de la rotura celular. Calle 1, células totales; calle 2, sedimento celular; calle 3, sobrenadante.

Figura 4. Análisis SDS-PAGE del proceso de purificación de NMB1125 a partir del sobrenadante de la rotura. Calle 1, proteína resultante; calle 2, proteína contaminante de peso molecular menor encontrada en una fracción cromatográfica diferente. Calle 3, muestra antes de la aplicación.

Figura 5. Niveles de anticuerpos (IgG) contra la proteína recombinante NMB1125, obtenidos tras la inmunización de ratones por vía intranasal o intraperitoneal. Los resultados del ELISA se representan y expresan como la inversa de la dilución más alta que duplica el valor de los sueros pre-inmunitarios.

Figura 6. Transferencia de tipo western de la proteínas NMB1125 presentes en las VME de N. meningitidis usando sueros de ratones inmunizados con la proteína recombinante. La NMB1125 inmunoidentificada está resaltada.

Figura 7. Respuesta de anticuerpos IgA contra la proteína recombinante NMB1125, a nivel de la mucosa, en ratones inmunizados por vía intranasal. Los resultados se presentan como la inversa de la dilución más alta que duplica el valor de los sueros pre-inmunitarios. (A) Respuesta de anticuerpos IgA en saliva. (B) Respuesta de anticuerpos IgA en lavados pulmonares.

Figura 8. Resultados de las búsquedas de homología entre las secuencias de la proteína NMB1125 (desconocida) e indicadas en los genomas de diferentes serogrupos de Neisseria meningitidis ("Sbjct") usando BLAST.

Figura 9. Reconocimiento de la proteína NMB1125 en diferentes cepas de N. meningitidis mediante suero producido contra el antígeno recombinante. En la gráfica sólo se muestran los resultados obtenidos cuando se usa la proteína semi-purificada mediante vía intra-peritoneal, no obstante se ha observado un comportamiento similar en el resto de los casos. Los resultados se presentan como la inversa de la dilución más alta que duplica el valor de los sueros pre-inmunitarios.

Figura 10. Comparación entre los sueros producidos mediante inmunización con la proteína obtenida mediante dos procedimientos, administrados por vía intra- peritoneal, en los experimentos de protección pasiva contra la infección meningocócica, en el modelo de rata recién nacida.

Figura 11: Reconocimiento de la proteína NMB1125 y un panel de antígenos no relacionados mediante AcMo generados (AcMo H8/92, 3H2764 y 7D2/15). P1, proteína de clase 1 de la cepa de Neisseria meningitidis B:4:P1.15; P64k, subunidad E3 de la piruvato deshidrogenasa de Neisseria meningitidis; T.T. toxoide del tétanos; HbsAg, antígeno de superficie de la hepatitis B.

Figura 12. Reconocimiento de la proteína NMB1125 mediante suero de ser humano convaleciente obtenido de supervivientes de la enfermedad meningocócica. Como control negativo se emplearon sueros de donante sano. Los resultados se muestran como la absorbancia (492 nm) en un ensayo de tipo ELISA.

Figura 13. Títulos del anti-péptido JY1 de los sueros de animales inmunizados con péptido libre (JY1), proteína recombinante (NMB 1125) o el conjugado JY1-NMB1125.

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Ejemplos

La presente invención se describe en la presente memoria descriptiva a través de los ejemplos que, a pesar de ser informativos sobre la propia invención, no representan, de ningún modo, un límite para el alcance de dicha invención.

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Ejemplo 1

Detección de la proteína NMB1125 en preparaciones de vesícula de membrana externa de Neisseria meningitidis del serogrupo B

Con el objetivo de estudiar proteínas que están presentes en las vesículas de membrana de Neisseria meningitidis del serogrupo B (cepa B:4:P1.19,15) se llevó a cabo una electroforesis bidimensional de acuerdo con un procedimiento descrito en otro documento (Gorg A, y col. 1985. Electrophoresis 6:599-604). Posteriormente se realizó una digestión enzimática con las proteínas extraídas del gel usando tripsina (Promega, Madison, WI, EE.UU.) Los péptidos generados tras la digestión se extrajeron en solución mediante el uso de microcolumnas (ZipTips, Millipore, MA, EE.UU.). Para el análisis de espectrometría de masas, los péptidos se eluyeron de las microcolumnas con acetonitrilo al 60%, ácido fórmico al 1%, seguido por una aplicación inmediata en nanopuntas (Protana, Dinamarca).

Las mediciones se llevaron a cabo en un espectrómetro de masas híbrido con cuadrupole y tiempo de vuelo (QT of-2^{TM}, Manchester, Reino Unido), equipado con una fuente de ionización (nanoESI). Los datos de espectrometría de masas se adquirieron en un intervalo w/z de 400-2000 en 0,98 segundos y usando 0,02 segundos entre barridos. La adquisición de datos y el procesamiento de datos se llevaron a cabo usando el programa MassLynx (versión 3.5, Micromass).

La identificación de proteínas sobre la base de los datos del espectro de masas se llevó a cabo usando el programa ProFound (Zhang W y Chait BT. 2000. ProFound an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information. Anal Chem 72:2482-2489. http://prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound). La búsqueda se suscribió a los genes y secuencias proteicas derivadas contenidos en la base de datos SwissProt(http://www.ebi.ac.uk/swissprot/) y NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), considerando que se pueden encontrar como posibles modificaciones oxidación de metioninas, desamidación y carboxiamidometilación de cisteínas.

La identificación de proteínas basada en los espectros de masas se llevó a cabo con el programa MASCOT (Perkins DN, y col. 1999. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis 20:3551-3567. http://www.matrixscience.com/). Los parámetros de búsqueda incluyeron modificaciones de cisteína así como oxidaciones y desamidaciones.

A partir del análisis de resultados obtenido de la identificación de proteínas presentes en las preparaciones de vesículas de membrana externa, la proteína NM1125 se seleccionó de modo que se evaluó como posible candidato a vacuna, a partir de la cual se identificó un péptido mediante espectrometría de masas.

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Ejemplo 2

Análisis de homología de la proteína NMB1125 con los productos génicos indicados en las bases de datos disponibles

Para el análisis de la homología de la proteína NM1125 con otros productos génicos se llevó a cabo una búsqueda basada en homología en la base de datos de secuencias del NCBI usando el programa BLAST (Altschul SF, y col. 1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215:403-410, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Los resultados obtenidos tras este procedimiento se marcaron como homólogos y además de las proteínas indicadas en los genomas publicados de Neisseria, se reconocieron varios productos génicos marcados como proteínas hipotéticas de diferentes organismos, como especies de Ralstonia, Yersinia y Pseudomonas.

El alto grado de conservación de estas proteínas en estos genomas ha conducido a la generación de un grupo ortólogo con un dominio conservado indicado en la base de datos del NCBI (gnl|CDD|13507, COG4259, proteína no caracterizada conservada en las bacterias [función desconocida)], lo que indica la existencia de un posible vínculo filogenético y ancestros comunes entre ellos.

El análisis del entorno genómico del gen que codifica la NM1125 se llevó a cabo usando la baste de datos MBGD (Uchiyama, I. 2003. MBGD: microbial genome database for comparative analysis. Nucleic Acids Res. 31, 58 62.) y reveló una organización genética conservada con estos genes en los microorganismos mencionados anteriormente que, junto con los datos previos, ha sugerido a los inventores concluir que son efectivamente homólogos en sus respectivos genomas.

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Ejemplo 3

Clonación y expresión del gen NMB1125, que codifica la proteína NMB1125, de N. meningitidis en Escherichia coli

Con el fin de clonar y expresar el gen NM1125 se empleó el vector de clonación pM-100. Este vector permite que la clonación se lleve a cabo usando diferentes enzimas de restricción y la generación de niveles de expresión elevados de proteínas heterólogas en forma de cuerpos de inclusión en E. coli.

El vector pM-100 (Figura 1) tiene los elementos siguientes: Promotor de triptófano, segmento génico que codifica la secuencia estabilizante de 47 aminoácidos del fragmento Nt de P64 kDa de la cepa de N. meningitidis B:4 P1.19,15, del terminador de la transcripción del bacteriófago T4 y la secuencia del gen que confiere resistencia a ampicilina como marcador de selección.

A partir de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína NMB1125 (Ejemplo 1) se diseñaron dos cebadores (7738 y 7739) con el fin de amplificar el segmento de este gen, sin la secuencia que codifica el péptido señal predicho del ADN genómico de la cepa B:4:P1.19,15.

1

Para la predicción del péptido señal se empleó el servidor SignalP World Wide Web (hftp://www.cbs.dtu.dk/
services/SignaIP-2.0). Tras la amplificación por PCR el gen de NMB115 (Randall K, y col. 1988. Science 42394:487-491) empleando los cebadores 7738 y 7739, el producto de la PCR se digirió usando las enzimas de restricción BglII y XhoI y se clonó en el vector de clonación pM-100 previamente digerido. La construcción final se muestra en la figura 2 y la proteína NMB1125 se expresa en forma de una proteína de fusión con el segmento Nt de la proteína P64 kDa. La secuenciación del gen clonado NMB1125 se llevó a cabo usando el secuenciador automático ALFexpress II (Termo Sequenase^{TM} Cy^{TM} 5 Dye Terminador Kit, Amersham Biosciences) y los oligonucleótidos 1573 (SEC ID Nº 8) y 6795 (SEC ID Nº 9) que une la secuencia del estabilizante P64 y el terminador de la transcripción T4, respectivamente. El plásmido generado en la presente memoria descriptiva se designó pM-238 para su uso posterior.

Para la expresión del gen NMB1125, la cepa de E. coli GC366 se transformó mediante el procedimiento químico con el plásmido pM-238 (figura 2). El experimento de expresión se llevó a cabo en medio mínimo (M9) (Miller JH. 1972. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NEW York, USA) suplementado con 1% de glicerol, 1% de hidrolizado de caseína, CaCl_{2} 0,1 mM, MgSO_{4} 1 mM y 50 \mug/ml de ampicilina. Los cultivos bacterianos se incubaron 12 horas a 37ºC y 250 rpm. Los cultivos incubados se centrifugaron y se realizó una rotura ultrasónica del sedimento celular (IKA LABORTECHNIK). Las fracciones de sedimento y de sobrenadante se analizaron mediante SDS-PAGE (Laemmli Reino Unido 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 277:680) y se tiñeron con azul brillante de Coomassie R-250. El porcentaje de expresión se llevó a cabo mediante densitometría en gel (LKB Bromma 2202 Ultrascan laser densitometer; Amersham Pharmacia Biotech, Reino Unido). La proteína NMB1125 se obtuvo de la fracción de sobrenadante, siendo aproximadamente el 60% del contenido en proteína total de esta fracción (figura 3). La proteína que contenía la fracción se dializó contra el tampón A (Tris-hidroximetilaminometano 25 mM) del que se purificó la proteína NMB1125 mediante cromatografía de intercambio iónico usando una columna monoQ5/5 (Amersham Biosciences) con un gradiente de 0 a 100% de NaCl en 2 h [Tampón A como tampón de equilibrio y Tampón B (Tampón A + NaCl 1 M) como tampón de gradiente], tras lo cual se obtuvo proteína con un 80% de pureza, como se muestra en la figura 4.

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Ejemplo 4

Evaluación de la respuesta inmunitaria inducida tras inmunización con proteína NMB1125 por vías intra-peritoneal e intra-nasal

Para evaluar la inmunogenicidad de la proteína NMB1125 se diseñó un experimento de inmunización y se realizó en ratones, en los que la misma proteína se administró mediante dos procedimientos diferentes. El primero consistió en extraer la banda de un gel de poliacrilamida (Castellanos L, y col. 1996. A procedure for protein elution from reverse-stained polyacrylamide gels applicable at the low picomole level: An alternative route to the preparation of low abundance proteins for microanalysis. Electroforesis 17: 1564-1572) y el segundo es al que se ha hecho referencia en el ejemplo 3, y el producto se indicó como proteína semipurificada.

Con estas preparaciones, ratones hembra Balb/C (de 8-10 semanas de edad) fueron inmunizadas, una vez divididas en 4 grupos de 8 ratones cada uno. Tres inmunizaciones se aplicaron por vía intra-nasal o intra-peritoneal, con un intervalo de 15 días entre cada una.

La proteína administrada por vía intra-peritoneal se emulsionó con adyuvante de Freund. En la Tabla 1 se describe la composición de los inmunógenos:

TABLA 1 Grupos de ratones Balb/C empleados para inmunización

2

Los títulos de anticuerpos (IgG) frente a la proteína recombinante y la proteína homóloga presente en la bacteria se determinaron mediante un ELISA en las muestras de suero tomadas tras la tercera inoculación. En la figura 5 se muestran los títulos de anticuerpo frente a la proteína recombinante de animales individuales. Los niveles de anticuerpos se determinaron tras la segunda inoculación, aunque fueron mayores tras la tercera inoculación. Además, se realizó un inmunoidentificación mediante transferencia de tipo western, en la que la respectiva banda proteica se reconoció. Los grupos inmunizados mediante vía intraperitoneal presentaron títulos significativamente mayores que los provocados por vía intranasal. Para el análisis estadístico de los resultados, se usó el análisis no paramétrico de la varianza de Kruskal-Wallis debido a la no homogeneidad de la varianza en los grupos, de acuerdo con la prueba de Bartlett. La prueba de comparación múltiple de Dunn se empleó para comparar los medios de cada tratamiento.

Los sueros obtenidos tras la inmunización con la proteína recombinante reconocieron la proteína natural presente en una preparación de proteína de membrana externa (PME) de la cepa CU385. Estos resultados se representan en la figura 6. Para analizar la respuesta mucosa se evaluaron muestras de saliva y lavados pulmonares. La figura 7 muestra sólo los grupos inmunizados por vía intra-nasal. Se observó un incremento en el título de IgA en el grupo que recibió la proteína semipurificada.

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Ejemplo 5

Caracterización de la secuencia del gen que codifica la proteína NMB1125 en diferentes cepas de N. meningitidis

Para analizar la conservación de la secuencia del gen que codifica la proteína NMB1125 entre diferentes cepas de Neisseria meningitidis se efectuó una búsqueda de similitudes con los genomas de Neisseria meningitidis (serogrupos A, B y C) indicados en la base de datos del NCBI (NC 003116.1, NC 003112.1, NC 003221, SANGER 1357201Contig1) empleando el programa BLAST (Altschul SF, y col. 1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215:403-410. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). La figura 8 muestra los resultados de la comparación de secuencias para las secuencias que produjeron una alineación significativa en cada uno de los genomas analizados. Las secuencias en los grupos A y B tienen una identidad del 100% con la secuencia obtenida para el gen que codifica la proteína NMB1125 (SEC ID Nº 3) y una identidad del 99% en el serogrupo C. Además, la secuencia del gen referido se determinó para 3 aislamientos cubanos (SEC ID Nº 5-7), que pertenecen al serogrupo B (B:4:P1.19,15) y se realizó una alineación de secuencia usando el programa ClustalX (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Los resultados de la alineación muestran que hay una gran conservación en la secuencia de nucleótidos del gen NMB1125 entre las cepas
analizadas.

El uso de la proteína NMB1125 como candidato a vacuna, teniendo en cuenta el elevado grado de similitud existente entre las secuencias previamente mencionadas, permitiría la generación de una respuesta inmunitaria eficaz con una protección de amplio espectro (debido a la reactividad cruzada) frente a la enfermedad meningocócica.

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Ejemplo 6

Caracterización de la respuesta inmunitaria con acción de amplio espectro inducida por la inmunización de ratones Balb/C con la proteína NMB1125

Para evaluar si la inmunización con la proteína NMB1125 inducía una respuesta con mucha reactividad cruzada con otras cepas de Neisseria se realizó un ELISA. Las placas de poliestireno se recubrieron con células enteras de 7 cepas de Neisseria, que pertenecen a diferentes serotipos y serosubtipos. Las placas se incubaron con sueros combinados obtenidos contra la proteína NMB1125 mediante dos vías de inmunización, tal como se describe en el ejem-
plo 4.

La figura 9 muestra los resultados obtenidos con los sueros producidas contra la proteína semipurificada administrada por vía intra-peritoneal. Como se ha observado, los sueros inmunes reconocieron la proteína presente en diferentes cepas, con niveles similares a los encontrados en la cepa CU385. El resto del suero tuvo un comportamiento comparable en este ensayo.

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Ejemplo 7

Protección inducida por los sueros murinos específicos para la proteína NMB1125 contra cepas homólogas y heterólogas en el modelo de rata recién nacida

Para determinar la actividad funcional de los antisueros obtenidos se realizó un ensayo de protección en el modelo de rata recién nacida para infección meningocócica. Veinticuatro ratas (de 5-6 días de edad) se dividieron en grupos de 6 ratas cada uno.

Se determinó su los sueros administrados por vía intra-peritoneal protegieron las ratas de la infección causada por bacterias (cepa CU385), inoculadas mediante la misma vía una hora después. Los sueros de cada grupo se combinaron y diluyeron a 1/10 (en PBS estéril) antes de su inoculación en ratas recién nacidas. Cuatro horas después, se obtuvieron muestras de los animales y se contaron las bacterias viables en su sangre.

Para interpretar los resultados se realizó un análisis de la varianza (Anova), seguido por una prueba de comparación múltiple de Dunnet, en la que se compararon los grupos de prueba con el control negativo. Como se observa en la figura 10, los grupos que recibieron antisueros contra la proteína NMB1125 mostraron diferencias estadísticamente significativas con el control negativo y, de este modo, se consideraron protectores en este modelo.

Un ensayo similar se realizó infectando ratas recién nacidas con las cepas H44/48 y 120/90, aisladas de pacientes cubanos, cuya clasificación serológica es homóloga a la cepa CU385. Además se realizaron experimentos de exposición con la cepa 233 (C:2a: P1.5) del serogrupo C y la cepa H44/76 (B:15:P1.7,16) del serogrupo B. en todos los casos, los antisueros protegieron a las ratas recién nacidas contra la infección meningocócica.

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Ejemplo 8

Generación de anticuerpos monoclonales contra la proteína NMB1125 capaces de mediar en la actividad bactericida contra Neisseria meningitidis

Para generar anticuerpos monoclonales (AcMo) específicos contra la proteína NMB1125 y estudiar la capacidad funcional de mediar en la actividad bactericida contra la cepa homóloga y heteróloga de N. meningitidis se realizó un programa de inmunización con una preparación de la proteína NMB1125 con una pureza superior al 80% (Ejemplo 3). La inmunización se realizó en ratones Balb/C (H-2^{d}, hembras, de 5-6 semanas de edad) y se aplicaron 4 dosis del siguiente modo: Los días 0, 15 y 30 de la rutina de inmunización se administraron 10 \mug del antígeno de NMB1125 por ratón (volumen total 100 \mul) por vía subcutánea, se emulsionaron con adyuvante de Freund; el día 50 se administraron 10 \mug de antígeno por ratón en solución salina tamponada con fosfato (NaCl 140 mM, KCl 270 mM, KH_{2}PO_{4} 1,5 mM, Na_{2}HPO_{4} 6,5 mM x 2H_{2}O, pH 7,2) por vía intra-peritoneal. Las extracciones de sangre se realizaron los días 0 y 45.

Los esplenocitos del animal con el título más elevado, medido mediante ELISA indirecto usando la proteína NMB1125 como antígeno de recubrimiento (Ejemplo 3) se condensaron con células de mieloma de ratón X63 Ag8 653. Los hibridomas resultantes se aislaron y sometieron a detección selectiva de acuerdo con los procedimientos estándar (Gavilondo JV. 1995. Anticuerpos Monoclonales: Teoría y Práctica, Elfos Scientiae, La Habana, Cuba).

La reactividad de los anticuerpos secretados por los hibridomas dirigidos a la proteína NMB1125, así como sus antígenos no relacionados de reactividad cruzada, se analizó mediante un ELISA indirecto empleando 5 \mug/ml de cada antígeno y la misma concentración de cada AcMo que se va a analizar. La figura 11 muestra los resultados obtenidos en este experimento, se obtuvieron los 3 clones positivos juntos (AcMo H8/92, 3H2/64 y 7D2/15) que reconocían específicamente la proteína NMB1128 y no reaccionan ni con la secuencia de aminoácidos correspondiente al n-terminal de P64k ni con el resto de antígenos no relacionados analizados.

Para determinar la capacidad de los AcMo generados contra la proteína NMB1125 para mediar en una respuesta bactericida contra cepas homólogas y heterólogas de Neisseria meningitidis se realizó una prueba bactericida. El título de anticuerpos bactericidas se expresó como la recíproca de la dilución más elevada de los anticuerpos analizados que fue capaz de matar un 50% o más de bacterias, dos de los AcMo generados (3H2/64 and 7D2/15) tenían títulos bactericidas superiores a 1:128 contra la cepa homóloga B:4:P1.19,15 y un AcMo (H8/92) superior a 1:80. Además, tenían títulos superiores a 1:64 contra las cepas heterólogas B:15:P1.7,16 y C:2a:P1.5.

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Ejemplo 9

Caracterización de las regiones diana de la respuesta inmunitaria murina contra la proteína NMB1125

Con el fin de identificar las regiones en la proteína que son reconocidas con más frecuencia por los antisueros murinos contra el antígeno recombinante se realizó un ensayo SPOTScan. Un grupo de péptidos superpuestos que extienden la secuencia de la proteína se sintetizó sobre una membrana de celulosa, que se incubó con sueros combinados diluidos a 1:100 La reacción antígeno-anticuerpo se detectó mediante la incubación con un conjugado inmunoglobulina G anti- murina-fosfatasa alcalina, seguida por la adición de una solución que contenía el sustrato bromo-cloro-indolil-fosfato.

Se observaron varias regiones antigénicas comunes dentro de la proteína, con independencia de la preparación que se empleó para la inmunización. No obstante, en los grupos inmunizados con la proteína adyuvada con el adyuvante de Freund, había un patrón mucho más amplio de reconocimiento.

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Ejemplo 10

Reconocimiento de la proteína NMB1125 por suero humano

En este estudio se empleó una colección de suero humano, procedente de individuos convalecientes, y se realizó un ELISA. Las placas se recubrieron con la proteína NMB1125, obtenida mediante electroforesis preparativa (5 \mug/ml). Después de bloquear las placas con 3% de polvo de leche desnatada en PBS que contiene Tween-20, los sueros se diluyeron (1:50) en la misma solución y se incubaron en las placas. El inmunoensayo continuó como se había comunicado ampliamente. Se emplearon sueros de controles sanos como controles negativos. Además, los sueros combinados de individuos vacunados con una vacuna recombinante contra la hepatitis B se usaron como controles no relacionados (datos no mostrados).

La figura 12 muestra los resultados obtenidos con 5 sueros de convalecientes en este ensayo. Se puede apreciar que los sueros humanos reconocían la proteína, lo que indica que se expresa durante la infección meningocócica y es inmunogénica.

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Ejemplo 11

Proteína NMB1125 como portador de un péptido

Para demostrar la capacidad portadora de la proteína recombinante NMB1125, se conjugó con un péptido sintético de 15 mer, derivado de la región V3 de la proteína gp120 del VIH-1, aislamiento JY1. La conjugación se realizó mediante el procedimiento del glutaraldehído. El péptido JY1 libre, la proteína recombinante NMB11125 y el conjugado JY1-NMB1125 se administraron a ratones adultos en un programa de 3 dosis, en el que los inmunógenos se emulsionaron con el adyuvante de Freund. Dos semanas después de la tercera dosis, se obtuvieron muestras de suero de animales inmunizados y las muestras se analizaron mediante ELISA para determinar los títulos de anticuerpos anti-péptido. Para ello, las placas se recubrieron con péptido libre (20 \mug/ml) y el inmunoensayo continuó como se había descrito previamente. Los resultados del experimento (figura 13) muestran la capacidad portadora de la proteína NMB1125, capaz de potenciar significativamente la respuesta de anticuerpos contra el péptido Jy1, tras su conjugación.

Claims (22)

1. Formulación farmacéutica que comprende la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos tal como se describe en la SEC ID Nº 4; o codificada por una secuencia de ácido nucleico tal como se describe en la SEC ID Nº 3.

2. Formulación farmacéutica de la reivindicación 1, que se caracteriza por ser una vacuna capaz de generar en el organismo receptor una respuesta protectora contra las infecciones causadas por bacterias del género Neisseria.

3. Formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que se caracteriza por ser una vacuna capaz de generar en el organismo receptor una respuesta protectora contra las infecciones causadas por bacterias del género Neisseria meningitidis.

4. Formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que se caracteriza por ser una vacuna capaz de generar en el organismo receptor una respuesta protectora contra las infecciones causadas por bacterias del género Neisseria gonorrhoeae.

5. Formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que se caracteriza por ser una formulación profiláctica o terapéutica.

6. Formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que se caracteriza por ser una formulación combinada que contiene uno o varios antígenos de diferente naturaleza antigénica.

7. Formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que se caracteriza porque contiene antígenos polisacáridos.

8. Formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que se caracteriza porque uno de los componentes de la formulación es un polisacárido capsular de N. meningitidis.

9. Formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5, que se caracteriza porque contiene un conjugado polisacárido-proteína, en el que el resto polisacárido corresponde a un polisacárido bacteriano.

10. Formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que se caracteriza porque contiene uno o varios microorganismos inactivados.

11. Formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que se caracteriza porque contiene antígenos peptídicos.

12. Formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que se caracteriza porque contiene hormonas.

13. Formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que se caracteriza porque contiene factores de crecimiento.

14. Formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, que se caracteriza por ser una formulación para administrar por vía parental.

15. Formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, que se caracteriza por ser una formulación para administrar por vía mucosa.

16. Formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, que se caracteriza por ser una formulación para administrar por vía oral.

17. Formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, que se caracteriza por ser una formulación inmunoestimulante o inmunopotenciadora.

18. Formulación farmacéutica que se caracteriza porque contiene péptidos de la proteína definida en la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos como se describe en la SEC ID Nº 4; o codificada por una secuencia de ácido nucleico como se describe en la SEC ID Nº 3, en la que dichos péptidos son capaces de generar en el organismo receptor una respuesta protectora contra las infecciones causadas por bacterias del género Neisseria.

19. Formulación farmacéutica que comprende un organismo modificado genéticamente, que se caracteriza porque contiene el gen que tiene la secuencia de bases identificada en la lista de secuencias como SEC ID Nº 3 y que codifica la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos identificada en la lista de secuencias como SEC ID Nº 4, o parte de ella, en la que dicha parte es capaz de generar en el organismo receptor una respuesta protectora contra las infecciones causadas por bacterias del género Neisseria, sola o incluida en otra secuencia génica, en la que la formulación comprende el organismo genéticamente modificado vivo, atenuado, o una preparación del mismo.

20. Formulación farmacéutica que se caracteriza porque contiene la proteína NMB1125, identificada en la lista de secuencias como SEC ID Nº 4 o codificada por el gen que tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº 3, como portador de antígenos de diversa naturaleza.

21. Uso de la proteína NMB1125, identificada en la lista de secuencias como SEC ID Nº 4 o codificada por el gen que tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº 3, para la detección, sola o en presencia de otros componentes, de la enfermedad meningocócica en seres humanos.

22. Uso del gen que tiene la secuencia de bases de la SEC ID Nº 3 y que codifica la proteína NMB1125 identificada en la lista de secuencias como SEC ID Nº 4, para detección, sola o en presencia de otros componentes, de la enfermedad meningocócica en seres humanos.