ES2334286T3 - Homoserinlactonas n-aciladas sustituidas. - Google Patents

Homoserinlactonas n-aciladas sustituidas. Download PDF

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David Idris Pritchard
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Abstract

Un compuesto de fórmula I, **(Ver fórmula)** donde R1 es un grupo hidrocarbilo alifático de cadena lineal o cadena ramificada saturado o insaturado que contiene de 5 a 14 átomos de carbono; R2 es H, o un grupo alquilo C1 a C4; R3 es H o F, y cualquiera de sus enantiómeros.

Description

Homoserinlactonas N-aciladas sustituidas.
La invención se refiere a homoserinlactonas N-aciladas sustituidas. Más concretamente, se refiere a ciertas homoserinlactonas N-aciladas sustituidas que muestran actividad inmunosupresora a la vez que muestran actividad biosensora reducida (autoinductora). La invención se refiere adicionalmente, a una composición farmacéutica que contiene semejante homoserinlactona N-acilada sustituida como ingrediente activo.
Los compuestos inmunosupresores inducen una inhibición del sistema de respuesta inmunitaria. Los compuestos que se sabe que muestran actividad inmunosupresora incluyen el metabolito fúngico Ciclosporina A y el antibiótico macrólido (un metabolito de Streptomyces tsukabaensis) denominado FK506. Estos agentes han sido utilizados ambos clínicamente y experimentalmente para suprimir el sistema inmunitario en los transplantes y en el tratamiento de numerosas enfermedades.
Las enfermedades autoinmunitarias son trastornos en los que la discriminación del anfitrión entre los "propio" y lo "no propio" falla y el sistema inmunitario del individuo (tanto los componentes adquiridos como innatos) ataca los tejidos propios. Estas enfermedades varían entre entidades comunes, tales como la artritis reumatoide, la enfermedad autoinmunitaria del tiroides y la diabetes mellitus de tipo 1 a entidades menos comunes, tales como la esclerosis múltiple y enfermedades más raras tales como la miastenia grave. Los avances en la ciencia biomédica básica y, en particular, en la inmunología han indicado que la lesión principal y fundamental responsable de la inducción y persistencia de la mayoría de las enfermedades autoinmunitarias reside en la proliferación de linfocitos T auto-reactivos. De hecho, la mayoría de las enfermedades autoinmunitarias están ligadas a la pérdida de homeostasis de las células T. El sistema inmunitario sano se mantiene en equilibrio, aparentemente por la producción contra-supresora de citoquinas por los subgrupos de linfocitos T1 coadyuvantes (Th1) y T2 coadyuvantes (Th2). En la autoinmunidad, predominan las citoquinas Th1; en la alergia, se producen citoquinas Th2. Una citoquina íntimamente asociada con el desarrollo de respuestas influenciadas por Th1 y, por consiguiente, con las enfermedades autoinmunitarias es el TNF-\alpha.
Tanto la Ciclosporina A como el FK506 han sido utilizados clínicamente en el tratamiento de las enfermedades autoinmunitarias con resultados esperanzadores.
Los fármacos inmunosupresores disponibles en la actualidad tienen la desventaja de un índice terapéutico estrecho, esto es toxicidad versus beneficio clínico. Se sabe que los compuestos son nefrotóxicos, neurotóxicos y potencialmente diabetogénicos y esto ha limitado su uso en los campos mencionados antes. También existen problemas con la administración de estos compuestos, su biodisponibilidad y el control de sus niveles tanto clínicamente como en el laboratorio.
Se conocen homoserinlactonas N-aciladas. En el documento WO 92/18614 se describen compuestos que tienen la fórmula
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donde n es 2 o 3; Y es O, S o NH; X es O, S o NH y R es un alquilo C_{1}-C_{12} o acilo opcionalmente sustituidos. Estos compuestos fueron descritos en ese documento como autoinductores y como agentes para el control de la expresión génica. Un autoinductor de origen natural es un compuesto producido por un microorganismo durante el metabolismo que después actúa incrementando la expresión de los genes del microorganismo. También se mencionan compuestos de la misma serie que los descritos en el documento WO 92/18614 en Journal of Bacteriology, volumen 175, número 12, Junio de 1993, páginas 3856-3862 pero de nuevo no hay ilustración de que puedan tener efecto alguno fuera de los microorganismos.
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G. Papaccio, Diabetes Res. Clin. Pract. vol. 13, Núm. 1, 1991, páginas 95-102 describe el uso de N-acetilhomocistein-tiolactona como potenciador de la superoxido-dismutasa en un intento de aumentar la protección contra la diabetes inducida químicamente.
El uso de N-acetilhomocistein-tiolactona para modificar la molécula de IgE es ilustrado por J. Ljaljevic et al. en Od. Med. Nauka, vol. 24, 1971, páginas 137-143 y Chemical Abstracts, vol. 78, Núm. 7, Febrero de 1973, resumen Núm. 41213a. No obstante, no existe sugerencia en esta publicación a la inmunosupresión.
En el documento US-A-5.591.872 se describe el compuesto N-(3-oxododecanoil)homoserinlactona como molécula autoinductora para Pseudomonas aeruginosa. En "Infection and Immunity", vol. 66, Núm. 1, Enero de 1998, los autores informan de la acción de la N-(3-oxododecanoil)homoserinlactona (OdDHL) en la inhibición de la proliferación estimulada por el mitógeno concanavalina A de las células de bazo murino y la producción de TNF-\alpha por macrófagos peritoneales murinos adherentes estimulados por LPS.
En el documento WO 95/01175, se describió una clase de compuestos relacionados con aquellos compuestos descritos previamente en el documento WO 92/18614 por exhibir actividad antialérgica e inhibir la liberación de histamina.
En el documento WO 01/74801 se describió una nueva subclase de N-acilhomoserinlactonas. Estos compuestos, que pueden estar representados por la fórmula
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en la que R es un grupo acilo de fórmula
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donde uno de R^{1} y R^{2} es H y el otro se selecciona entre OR^{4}, SR^{4} y NHR^{4}, donde R^{4} es H o alquilo C_{1}-C_{6}, o R^{1} y R^{2} junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un grupo ceto, y R^{3} es un grupo hidrocarbilo alifático saturado o insaturado, de cadena lineal o ramificada que contiene de 8 a 11 átomos de carbono y está opcionalmente sustituido con uno o más grupos sustituyentes seleccionados entre halógeno, alcoxi C_{1}-C_{6}, carboxi, alcoxicarbonilo C_{1}-C_{6}, carbamoilo opcionalmente mono- o di-sustituido en el átomo de N con alquilo C_{1}-C_{6} y NR^{5}R^{6} donde cada uno de R^{5} y R^{6} se seleccionan entre H y alquilo C_{1}-C_{6} o R^{5} y R^{6} junto con el átomo de nitrógeno forman un grupo morfolino o piperazino, o cualquiera de sus enantiómeros, son capaces de modular la respuesta inmunitaria en el organismo animal vivo. En particular, tienen un efecto inhibidor de la proliferación de linfocitos en seres humanos y regulan a la baja la secreción de TNF-\alpha por los monocitos/macrófagos y, en consecuencia, la activación de linfocitos Th1 en seres humanos. Todas estas homoserinlactonas N-aciladas descritas en la técnica anterior tienen actividad biosensora que es una desventaja en un compuesto que también posee actividad anti-proliferativa. El propósito de los investigadores en este campo ha sido encontrar compuestos relacionados con OdDHL que tengan propiedades inmunomoduladoras comparables pero que tengan la ventaja de mostrar una actividad biosensora reducida. Se da crédito a los autores de la presente invención de que tales compuestos se han descubierto ahora.
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Por consiguiente, la presente invención proporciona en un primer aspecto un compuesto de fórmula I
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donde R^{1} es un grupo hidrocarbilo alifático de cadena lineal o cadena ramificada, saturado o insaturado que contiene de 5 a 14 átomos de carbono; R^{2} es H, o un grupo alquilo C_{1} a C_{4}; R^{3} es H o F, y cualquiera de sus enantiómeros.
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El grupo R^{1} de la fórmula I anterior es un grupo hidrocarbilo alifático de cadena lineal o ramificada, saturado o insaturado que contiene de 5 a 14 átomos de carbono. Por ejemplo, R^{1} puede ser un grupo alquilo C5 a C14 de cadena lineal o ramificada o un grupo alquenilo o alquinilo C5 a C14 de cadena lineal o ramificada. Preferiblemente, R^{1} es un grupo alquilo de cadena lineal que contiene de 5 a 14 átomos de carbono. Los ejemplos específicos de tales grupos alquilo incluyen los grupos pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo y decilo. De acuerdo con una realización particularmente preferida de la invención, el grupo R^{1} es n-octilo.
El grupo R^{2} de la fórmula I anterior se selecciona del grupo que comprende H y un grupo alquilo C_{1} a C_{4}. Los ejemplos de los grupos alquilo C_{1} a C_{4} que pueden estar representados por R^{2} en la fórmula I anterior incluyen los grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo e isobutilo. Preferiblemente R^{2} en la presente invención es H o metilo.
El grupo R^{3} en la fórmula I anterior se selecciona entre H y flúor. Resultará evidente que cuando R^{3} en la fórmula I es un grupo flúor, estará presente un centro quiral adicional en el átomo de carbono al cual está anclado el grupo flúor. La presente invención hace referencia a las formas enantioméricas individuales de los compuestos así como a las mezclas racémicas.
Los compuestos preferidos de acuerdo con la presente invención tienen la fórmula I anterior en la que el grupo R^{1} es n-octilo, el grupo R^{2} es H o metilo y el grupo R^{3} es H o flúor. Los ejemplos específicos de los compuestos que son preferidos de acuerdo con la invención son N-(4-aza-3-oxododecanoil)-L-homoserinlactona, N-(4-metil-4-aza-3-oxododecanoil)-L-homoserinlactona, y N-(4-aza-2-fluoro-3-oxododecanoil)-L-homoserinlactona.
Los compuestos de la presente invención pueden, en general, ser preparados mediante reacción de un ácido carboxílico sustituido que tiene la fórmula R^{1}R^{2}NC(O)CHR^{3}C(O)OH, donde R^{1}, R^{2} y R^{3} se definen como antes, con N,N'-carbonildiimidazol y haciendo reaccionar después el N-acilimidazol intermedio con L-homoserinlactona, típicamente en forma de hidrocloruro.
Los ácidos carboxílicos descritos antes como materiales de partida en la preparación pueden ser obtenidos, a su vez, mediante reacción de la amina R^{1}R^{2}NH con un éster etílico de ácido malónico opcionalmente sustituido para formar el éster etílico de ácido carboxílico sustituido requerido que después puede ser hidrolizado al ácido carboxílico. Por ejemplo, los autores de la presente invención han descubierto que los ácidos carboxílicos sustituidos de la fórmula anterior, donde R^{3} es H, pueden ser preparados simplemente mediante reacción de la amina R^{1}R^{2}NH con cloruro de etilmalonilo e hidrolizando después el éster etílico resultante al ácido. En el caso en el que el grupo R^{3} es un grupo flúor, los autores de la presente invención han descubierto que se puede obtener el éster etílico de ácido carboxílico sustituido deseado con un buen rendimiento a partir de la reacción en la amina R^{1}R^{2}NH y fluoromalonato de dimetilo.
Los compuestos de la presente invención tienen uso como ingredientes farmacéuticamente activos en el tratamiento de un individuo que padece una enfermedad o trastorno que es sensible a la actividad de un inmunosupresor. Los compuestos de la presente invención inhiben la proliferación de linfocitos y la producción de TNF-\alpha, al mismo tiempo que muestran una actividad autoinductora reducida en comparación con OdDHL. De este modo, se pueden utilizar los compuestos para modular el sistema inmunitario de un individuo, por ejemplo en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias. Los ejemplos específicos de las enfermedades autoinmunitarias que se pueden tratar mediante la administración de una dosis eficaz de un compuesto de la invención incluyen psoriasis, esclerosis múltiple y artritis reumatoide. La dosificación que se va a administrar a un individuo que necesita terapia dependerá, por supuesto, del compuesto activo real utilizado, del modo de administración y del tipo de tratamiento deseado así como de la masa corporal del individuo. El compuesto activo que se va administrar como tal o en forma de una composición medicinal apropiada contiene, por ejemplo, un portador, excipiente o diluyente farmacéutico apropiado. También se pueden utilizar otras sustancias en tales composiciones medicinales, tales como antioxidantes y estabilizadores, cuyo uso es bien conocido por los expertos en la técnica.
Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis de N-(4-aza-3-oxododecanoil)-L-homoserinlactona (4-aza-OdDHL)
Etapa 1
4-Aza-3-oxododecanoato de etilo
A una solución enfriada con hielo de n-octilamina (101,54 mmoles, 13,12 g) en diclorometano seco (75 ml) se le añadió gota a gota cloruro de etilmalonilo (50,77 mmoles, 6,5 ml) a lo largo de un período de 15 minutos y se agitó adicionalmente durante una hora. La solución se lavó sucesivamente con bicarbonato de sodio saturado (3x20 ml), HCl 2M (3x20 ml) y solución saturada de cloruro de sodio (1x20 ml). El secado sobre MgSO_{4} y la evaporación rotatoria del disolvente orgánico dieron 4-aza-3-oxododecanoato de etilo en forma de un sólido de color blanco (8,5 g, 69%).
TLC R_{f} 0,43, Acetato de etilo:hexano (1:1)
RMN H^{1} (250 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,93 (3H, t, J 6,0 Hz, (CH_{3}(CH_{2})_{7}), 1,07-1,77 (13H, m, CH_{3}(CH_{2})_{5} y OCH_{2}CH_{3}), 1,48 (2H, m, CH_{3}(CH_{2})_{5})CH_{2}), 3,23 (2H, t, J 7,5 Hz, CH_{3}(CH_{2})_{6}CH_{2}), 3,30 (2H, s, COCH_{2}COO), 4,23 (2H, c, J 7,5 Hz, OCH_{2}CH_{3}), 7,71 (1H, s ancho, NH).
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Etapa 2
Ácido 4-aza-3-oxododecanoico
A una solución agitada de 4-aza-3-oxododecanoato de etilo (7,5 mmoles, 1,81 g) en etanol (50 ml) se le añadió una solución de NaOH (8,75 mmoles, 350 mg) en agua (50 ml) y se continuó agitando a la temperatura ambiente durante 16 horas. Esta mezcla se sometió a evaporación rotatoria para separar el etanol. El residuo se redisolvió en agua y se lavó con acetato de etilo. Después se aciduló con HCl 2M (pH 1). El ácido 4-aza-3-oxododecanoico producto se extrajo con diclorometano (4x15 ml). Después de secar sobre MgSO_{4} y de someter a evaporación rotatoria el diclorometano, se obtuvo ácido 4-aza-3-oxododecanoico en forma de un sólido de color blanco (1,35 g, 84,3%).
RMN H^{1} (250 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,9 (3H, t, J 6,15 Hz, CH_{3}(CH_{2})_{7}), 1,3 (10H, m, CH_{3}(CH_{2})_{5}), 1,54 (2H, m, CH_{3}(CH_{2})_{5})CH_{2}-), 3,3 (2H, t, J 6,4 Hz, CH_{3}(CH_{2})_{6}CH_{2}), 3,37 (2H, s, COCH_{2}CO), 7,19 (1H, s, NH), 10,64 (1H, s, COOH).
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Etapa 3
N-(4-aza-3-oxododecanoil)-L-homoserinlactona (4-aza-OdDHL)
A una solución agitada de ácido 4-aza-3-oxododecanoico (5,74 mmoles, 1,23 g) en diclorometano seco (40 ml) se le añadieron sucesivamente N,N'-carbonildiimidazol (5,02 mmoles, 943 mg), trietilamina (5,74 mmoles, 0,8 ml) e hidrocloruro de L-homoserinlactona (5,74 mmoles, 790 mg). La mezcla se agitó a la temperatura ambiente durante la noche y el disolvente se sometió después a evaporación rotatoria. El residuo se redisolvió en acetato de etilo (40 ml) y la solución se lavó con bicarbonato de sodio saturado (2x25 ml), HCl 2M (3x25 ml) y salmuera (1x25 ml). Después de secar sobre MgSO_{4} y eliminar el disolvente a vacío, se purificó el producto aislado 4-aza-OdDHL mediante TLC utilizando un sistema disolvente de Hexano - Acetato de etilo (1:4) (676 mg, 39,5%).
TLC R_{f} 0,23, Acetato de etilo-hexano (4:1).
IR (KBr) 3293 (NH), 1771 (C=O anillo), 1685 (C=O3-amida), 1645 (C=O1-amida) cm^{-1}.
RMN H^{1} (250 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,9 (3H, t, J 6,5 Hz, CH_{3}(CH_{2})_{7}), 1,27 (10H, m, CH_{3}(CH_{2})_{5}), 1,5 (2H, ancho, CH_{3}(CH_{2})_{5})CH_{2}), 2,34 (1H, dd, J 9,9 y 1,5 Hz, anillo,. 4\alpha-H), 2,66 (1H, ddd, J 2,0, 3,8 y 6,8 Hz, anillo, 4\beta-H), 3,22 (2H, t, J 6,6 Hz, CH_{3}(CH_{2})_{6}CH_{2}), 3,28 (2H, s, COCH_{2}CO), 4,23 (1H, ddd, J 3,0, 4,4 y 6,3 Hz, anillo, 3H), 4,49 (1H, dd, J 7,65 y 1,3 Hz, anillo, 5\alpha-H), 4,6 (1H, ddd, J 2,3, 4,9 y 8,7 Hz, anillo, 5\beta-H), 7,14 (1H, t ancho, 4-NH), 8,2 (1H, d, J 6,8 Hz, NH-HSL).
ES-MS m/z 299,13 (M+H, C_{15}H_{26}N_{2}O_{4} requiere m/z 298), 321,11 (M+Na).
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Ejemplo 2 Síntesis de N-(4-aza-4-metil-3-oxododecanoil)-L-homoserinlactona(4-aza-4-Me-OdDHL)
Etapa 1
4-Aza-4-metil-3-oxododecanoato de etilo
Se repitió el procedimiento descrito antes en el Ejemplo 1, etapa 1, excepto que se utilizó N-metil-n-octilamina en lugar de n-octilamina. Se obtuvo el producto del título en forma de un semisólido que se recristalizó en éter dietílico (97%).
TLC R_{f} 0,5, Acetato de etilo-hexano (1:1).
RMN H^{1} (250 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,87 (3H, t, J 6,7 Hz, CH_{3}(CH_{2})_{7}), 1,26-1,32 (13H, m, CH_{3}(CH_{2})_{5} y OCH_{2}CH_{3}), 1,5 (2H, s (ancho), CH_{3}(CH_{2})_{5})CH_{2}), 2,94, 2,98 (3H, 2 x s, NCH_{3}), 3,24 (1H, dd, J 1,9 y 7,6 Hz, CH_{3}(CH_{2})_{6}CH(H)), 3,39 (1H, ddd, J 1,9, 5,6 y 7,6 Hz, CH_{3}(CH_{2})_{6}CH(H)), 3,44 (2H, s, COCH_{2}COO), 4,2 (2H, dos c, (solapamiento), OCH_{2}CH_{3}).
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Etapa 2
Ácido 2-aza-4-metil-3-oxododecanoico
Se saponificó 4-aza-4-metil-oxododecanoato de etilo (4,85 mmoles, 1,246 g) con una solución de NaOH (5,7 mmoles, 226 mg) de acuerdo con el procedimiento descrito antes para el 4-aza-3-oxododecanoato de etilo en el Ejemplo 1, Etapa 2. Se obtuvo el ácido 4-aza-4-metil-3-oxododecanoico producto en forma de un sólido de color blanco (1,03 g, 93%).
RMN H^{1} (250 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,89 (3H, t, J 6,0 Hz, CH_{3}(CH_{2})_{7}), 1,3 (10H, m, CH_{3}(CH_{2})_{5}), 1,58 (2H, s ancho, CH_{3}(CH_{2})_{5}CH_{2}), 3,03 (3H, s, NCH_{3}), 3,24 (2H, J 7,6 Hz CH_{3}(CH_{2})_{6}CH_{2}), 3,42 (2H, s, COCH_{2}COO), 10,15 (1H, s, COOH).
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Etapa 3
N-(4-Aza-4-metil-3-oxododecanoil)-L-homoserinlactona (4-aza-4-Me-OdDHL)
Se acopló ácido 4-aza-4-metil-3-oxododecanoico (3,9 mmoles, 896 mg) a hidrocloruro de L-homoserinlactona (4,0 mmoles, 550 mg) de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, Etapa 3. El producto del título, 4-aza-4-metil-OdDHL se purificó mediante PLC en Hexano - Acetato de etilo (1:4), (237 mg, 19,5%).
TLC R_{f} 0,19, Acetato de etilo-hexano (4:1).
IR (KBr) 3299 (NH), 1776 (C=O anillo), 1683 (C=O 3-amida), 1654 (C=O 1-amida) cm^{-1}.
RMN H^{1} (250 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,88 (3H, t, J 5,6 Hz, CH_{3}(CH_{2})_{7}), 1,27 (10H, m, CH_{3}(CH_{2})_{5}), 1,53 (2H, s ancho, CH_{3}(CH_{2})_{5})CH_{2}), 2,29 (1H, dd, J 10,1 y 1,47 Hz, anillo, 4\alpha-H), 2,66 (1H, dd, J 2,0 y 5,6 Hz, anillo, 4\beta-H), 3,0 (3H, 2xs, NCH_{3}), 3,3 (2H, t, J 7,72 Hz, CH_{3}(CH_{2})_{6}CH_{2}), 3,38 (2H, s, COCH_{2}CO), 4,28 (1H, dddd, J 1,49, 3,19, 4,05 y 6,1 Hz, anillo, 3H), 4,48 (1H, t, J 9,1 Hz, anillo, 5\alpha-H), 4,6 (1H, dddd, J 1,5, 2,6, 4,5 y 7,2 Hz, anillo, 5\beta-H), 8,84 (1H, d, J 7,4 Hz, NH-HSL).
ES-MS m/z 313,14 (M+H, C_{16}H_{28}N_{2}O_{4} requiere m/z 312), 335,12 (M+Na).
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Ejemplo 3 4-Aza-2-fluoro-3-oxododecanoil-L-homoserinlactona (4-aza-2-F-OdDHL)
Etapa 1
4-Aza-2-fluoro-3-oxododecanoato de metilo
A una solución agitada de fluoromalonato de dimetilo (1 mmol, 150,11 mg) en metanol anhidro (10 ml) se le añadió una solución de n-octilamina (1 mmol, 166 \mul) en metanol (5 ml) gota a gota a lo largo de un período de una hora a la temperatura ambiente. Después se agitó adicionalmente a la temperatura ambiente durante dos horas. La solución se sometió a evaporación rotatoria y el residuo se redisolvió en acetato de etilo. La solución de acetato de etilo se lavó sucesivamente con HCl 2 M (2x10 ml) y solución saturada de cloruro de sodio (1x15 ml). El secado sobre MgSO_{4} y la evaporación rotatoria del disolvente orgánico dieron un sólido de color blanco que era una mezcla de bisamida y 4-aza-2-fluoro-3-oxododecanoato de etilo. El producto deseado se purificó en forma de un sólido de color blanco mediante PLC en éter de petróleo 40-60-éter dietílico (3:2), (117 mg, 47%).
TLC R_{f} 0,23, éter de petróleo-éter dietílico (3:2).
RMN H^{1} (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,88 (3H, t, J 6,4 Hz, CH_{3}(CH_{2})_{7}), 1,29 (10H, m, CH_{3}(CH_{2})_{5}), 1,54 (2H, s ancho, CH_{3}(CH_{2})_{5})CH_{2}), 3,32 (2H, m, J 6,6 Hz, CH_{3}(CH_{2})_{6}CH_{2}), 3,9 (3H, s, OCH_{3}), 5,28 (1H, d, J 49,2, C(H)F), 6,42 (1H, s, NH).
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Etapa 2
Ácido 4-aza-2-fluoro-3-oxododecanoico
A una solución agitada de 4-aza-2-fluoro-3-oxododecanoato de metilo (0,28 mmoles, 70 mg) en metanol (15 ml) se le añadió una solución de NaOH (0,28 mmoles, 11,2 mg) en metanol (15 ml) y se agitó adicionalmente a la temperatura ambiente durante dos horas. Esta mezcla se sometió a evaporación rotatoria para eliminar el metanol. El residuo se redisolvió en agua (25 ml) y la solución acuosa se lavó con acetato de etilo. Después se aciduló con HCl 2M (pH 1). El ácido 4-aza-2-fluoro-3-oxododecanoico producto se extrajo en acetato de etilo (3x15 ml). Después de secar sobre MgSO_{4} y someter a evaporación rotatoria el acetato de etilo, se obtuvo el ácido 4-aza-2-fluoro-3-oxododecanoico en forma de un sólido de color blanco (64 mg, 99%).
RMN H^{1} (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,9 (3H, t, J 6,6 Hz, CH_{3}(CH_{2})_{7}), 1,31 (10H, m, CH_{3}(CH_{2})_{5}), 1,60 (2H, m, CH_{3}(CH_{2})_{5}CH_{2}), 3,4 (2H, J 6,8 Hz CH_{3}(CH_{2})_{6}CH_{2}), 5,3 (1H, d, J 47,2 Hz, C(H)F), 6,7 (1H, s, NH), 7,3 (1H, s ancho, COOH).
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Etapa 3
4-Aza-2-fluoro-3-oxododecanoil)-L-homoserinlactona (4-aza-2-F-OdDHL)
A una solución agitada de ácido 4-aza-2-fluoro-3-oxododecanoico (0,28 mmoles, 64 mg) en diclorometano seco (20 ml) se le añadieron sucesivamente 1,1'-carbonildiimidazol (0,3 mmoles, 49 mg), trietilamina (0,3 mmoles, 42 \mul) e hidrocloruro de L-homoserinlactona (0,3 mmoles, 42 mg). Esta mezcla se agitó a la temperatura ambiente durante la noche y el disolvente se sometió después a evaporación rotatoria. El residuo se redisolvió en acetato de etilo (30 ml). La solución de acetato de etilo se lavó con bicarbonato de sodio saturado (2x20 ml), KHSO_{4} 1 M (2x20 ml) y salmuera (1x20 ml). Se secó sobre MgSO_{4} y el disolvente se sometió a evaporación rotatoria. El 4-aza-4-metil-OdDHL producto se purificó mediante PLC en acetato de etilo (8,2 mg, 10,4%).
TLC R_{f} 0,32, Acetato de etilo.
IR (KBr) 3298 (NH), 1772 (C=O anillo), 1683 (C=O 3-amida), 1653 (C=O 1-amida) cm^{-1}.
RMN H^{1} (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 0,89 (3H, t, J 6,9 Hz, CH_{3}(CH_{2})_{7}), 1,3 (10H, m, CH_{3}(CH_{2})_{5}), 1,56 (2H, m, CH_{3}(CH_{2})_{5}CH_{2}), 2,27 (1H, dd, J 8,97 y 2,3 Hz, anillo, 4\alpha-H), 2,80 (1H, ddd, J 1,4, 2,54 y 5,34 Hz, anillo, 4\beta-H), 3,33 (2H, m, CH_{3}(CH_{2})_{6}CH_{2}), 4,28 (1H, dd, J 1,4 y 4,5 Hz, anillo, 3H), 4,53 (1H, m, anillo, 5\alpha-H), 4,64 (1H, ddd, J 2,64, 2,94 y 4,14 Hz, anillo, 5\beta-H), 5,3 (1H, dd, J 10,2 y 38,0 Hz, CF(H)), 6,63 (1H, s, 4-NH), 7,5 (1H, dd, J 13,3, 6,4 Hz, NH-HSL).
ES-MS m/z 317,12 (M+H, C_{15}H_{25}FN_{2}O_{4} requiere m/z 316), 339,09 (M+Na).
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Actividad Inmunomoduladora de los Compuestos de Homoserinlactona Materiales y Métodos 1. Proliferación estimulada por mitógeno ConA de esplenocitos murinos
Se utilizó el análisis de proliferación celular con concanavalina A (ConA) para evaluar el efecto de los compuestos de homoserinlactona (HSL) de ensayo sobre la activación y la proliferación de células T. Se evaluó la proliferación mediante la incorporación de timidina-[H^{3}] al ADN. Se obtuvieron ratones BALB/c hembra de ocho semanas de edad de Harlan (Bicester, Oxon, Reino Unido) y se les administraron alimento y agua ad libitum. Se prepararon suspensiones de esplenocitos separando los bazos y colocándolos en medio RPMI 1640. Los bazos se impelieron a través de mallas de alambre con tamaño de poro de 70 \mum utilizando el émbolo de una jeringa de 5 ml para producir una suspensión de células individuales. Las células se sedimentaron mediante centrifugación, y los eritrocitos se lisaron con Tris 0,017 M, tampón cloruro de amonio 0,144 M, pH 7,2. Los leucocitos se lavaron dos veces con medio RPMI 1640 con suero de ternera fetal (FCS) al 2% (vol/vol) y se resuspendieron en medio de cultivo celular completo (CTCM) que consistía en medio RPMI 1640 con FCS al 5%, L-glutamina 2 mM, y 2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M. Se sometieron a ensayo los compuestos HSL a diluciones al doble en sentido descendente que oscilaban de 1 mM a 0,1 \muM en un volumen final de 200 \mul de CTCM, que contenía ConA (Sigma, Poole, Reino Unido) a 1 \mug/ml y 100.000 células de bazo. Tras la incubación durante 48 horas a 37ºC en aire con CO_{2} al 5%, se añadió timidina-[H^{3}] de 0,25 \muCi (Amersham) en un volumen de 10 \mul preparado en medio RPMI 1640 y las células se incubaron durante 24 horas más. Las células se recogieron sobre litros de fibra de vidrio con un cosechador Filtermate Packard. Tras la adición de 25 \mul de Microscint-O (Packard) a cada pocillo, los filtros se sometieron a recuento con el contador de centelleo TopCount Packard.
La proliferación de esplenocitos murinos inducida por mitógeno (Concanavalina A) estuvo indicada por la incorporación de timidina tritiada al ADN de las células de bazo de ratón como demuestran las cuentas por minuto utilizando el contador de centelleo. El efecto inhibidor de un compuesto HSL que estaba siendo sometido a ensayo sobre la proliferación celular estuvo indicada por una reducción de las cuentas por minuto.
La Figura 1 muestra los gráficos de cuentas por minuto (CPM) frente a las concentraciones (micromolar) del compuesto de la técnica anterior OdDHL y el compuesto N-(4-aza-3-oxododecanoil)-L-homoserinlactona (4-aza-OdDHL). Como se puede observar a partir de esta Figura, la 4-aza-OdDHL, como la OdDHL, inhibe la proliferación de esplenocitos. La Figura 2 muestra gráficos similares a los de la Figura 1, excepto que, aquí, se realiza una comparación del gráfico obtenido para OdDHL con el obtenido para el compuesto N-(4-metil-4-aza-3-oxododecanoil)-L-homoserinlactona (4-metil-4-aza-OdDHL). Como se muestra en la Figura 2, el compuesto 4-metil-4-aza-OdDHL inhibe la proliferación de esplenocitos. Las Figuras 1 y 2 también muestran los gráficos de la actividad autoinductora de los compuestos de HSL frente a la concentración de HSL (micromolar).
Se determinó el valor de CI50, esto es, la dosis de compuesto (micromolar) requerida para inhibir el 50% de una población en proliferación de esplenocitos murinos, para 4-aza-OdDHL, 4-metil-4-aza-OdDHL y para el compuesto N-(2-fluoro-4-aza-3-oxododecanoil)-L-homoserinlactona (2-fluoro-4-aza-OdDHL).
También se determinó para cada uno de estos compuestos la actividad autoinductora como medida de la capacidad del compuesto para inducir la producción de luz en un sistema bioinformador bacteriano diseñado específicamente. Se midió la actividad autoinductora (AI) mediante la capacidad del compuesto de ensayo N-acil-homoserinlactona (AHL) para inducir bioluminiscencia en E. coli que contiene un plásmido informador de bioluminiscencia basado en lux. Para la detección de una AHL de cadena larga, tal como OdDHL, se utilizó E. coli JM109 que albergaba el plásmido informador pSB1075. Este informador contiene el gen lasR de P. aeruginosa y el promotor lasl fusionado a luxCDABE de P. luminiscens y responde preferentemente a las AHL con cadenas aciladas de 10-14 carbonos de longitud.
Los bioanálisis se realizaron en placas de microtitulación de 96 pocillos. En resumen, se colocaron 10 \mul del compuesto que se estaba sometiendo a ensayo en una placa con pocillos de microtitulación y se diluyeron seriadamente utilizando caldo LB para producir un intervalo de concentración de 100 \muM a 100 fM. Se realizaron diluciones similares con OdDHL sintética y se utilizaron como control positivo. Se añadieron a cada pocillo 100 \mul de una cepa biosensora durante la noche y se midió la emisión de luz después de 4 horas de incubación a 37ºC. Se evaluó la producción de luz como cuentas por segundo en un aparato TopCount Perkin Elmer calibrado para medir la bioluminiscencia. Los valores se expresan como el porcentaje de bioluminiscencia medido después de la exposición del bioinformador a OdDHL durante cuatro horas a 37ºC. El análisis de regresión logarítmica del intervalo de diluciones de OdDHL sintética devolvió típicamente un coeficiente de los valores de determinación por encima de 0,96.
Se obtuvieron los valores de CI_{50} (\muM) y de actividad A.I. (10 \muM) para los compuestos de ensayo y para OdDHL se muestran en la siguiente Tabla.
5
* CI50 = dosis de compuesto requerida para inhibir el 50% de una población en proliferación de esplenocitos murinos. Medida utilizando la incorporación de timidina-[H^{3}] como marcador de la proliferación y determinada mediante análisis de regresión no lineal. Todos los coeficientes de los valores de determinación fueron de más de 0,98.
** La actividad autoinductora es una medida de la capacidad del compuesto para inducir la producción de luz en un sistema bioinformador bacteriano diseñado específicamente. Los valores se expresan como un porcentaje de la bioluminiscencia medida después de la exposición de la bacteria a OdDHL durante 4 horas a 37ºC.

Claims (9)

1. Un compuesto de fórmula I,
6
donde R^{1} es un grupo hidrocarbilo alifático de cadena lineal o cadena ramificada saturado o insaturado que contiene de 5 a 14 átomos de carbono; R^{2} es H, o un grupo alquilo C_{1} a C_{4}; R^{3} es H o F, y cualquiera de sus enantiómeros.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, donde R^{1} es un grupo alquilo de cadena lineal que contiene de 5 a 14 átomos de carbono.
3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 2, donde R^{1} es un grupo n-octilo.
4. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el grupo R^{2} se selecciona entre H o un grupo metilo.
5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que es N-(4-aza-3-oxododecanoil)-L-homoserinlactona.
6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que es N-(4-metil-4-aza-3-oxododecanoil)-L-homoserinlactona.
7. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que es N-(4-aza-2-fluoro-3-oxododecanoil)-L-homoserinlactona.
8. Una composición farmacéutica que comprende, como componente activo, un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y uno o más portadores, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
9. Un método de elaboración de un compuesto de fórmula I,
7
donde R^{1} es un grupo hidrocarbilo alifático de cadena lineal o cadena ramificada saturado o insaturado que contiene de 5 a 14 átomos de carbono; R^{2} es H, o un grupo alquilo C_{1} a C_{4}; R^{3} es H o F, y cualquiera de sus enantiómeros, cuyo método comprende hacer reaccionar un ácido carboxílico sustituido que tiene la fórmula R^{1}R^{2}NC(O)CHR^{3}C(O)OH, donde R^{1}, R^{2} y R^{3} se definen como antes, con N,N'-carbonildiimidazol y después hacer reaccionar el N-acilimidazol intermedio con L-homoserinlactona.
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