ES2334742B1 - Procedimiento automatizado para la determinacion simultanea de vitaminas liposolubles. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento automatizado para la determinación
simultánea de vitaminas liposolubles.
La presente invención se refiere a un método
para la determinación simultánea automatizada de las vitaminas,
liposolubles y metabolitos de las vitaminas D3 y D2 en suero,
caracterizado porque se requiere un volumen adecuado de suero, que
se trata en línea mediante un sistema automático de extracción en
fase sólida para eliminar las especies interferentes y concentrar
las vitaminas, una separación de las vitaminas en un cromatógrafo de
líquidos y una medida de cada una de las especies separadas mediante
un espectrofotómetro. Los datos que proporciona este detector se
interpolan en las rectas de calibrado de las vitaminas previamente
obtenidas e introducidas en el programa de cuantificación. Los
análisis se pueden solapar (desarrollo de la etapa de extracción en
fase sólida de una muestra mientras la anterior se cromatografía),
consiguiéndose así una alta frecuencia de muestreo.
Description
Procedimiento automatizado para la determinación
simultánea de vitaminas liposolubles.
La presente invención se encuadra en el campo
técnico de los métodos analíticos para la determinación de
vitaminas liposolubles y metabolitos de las vitaminas D_{3} y
D_{2} en suero.
Más concretamente la presente invención consiste
en un nuevo método automático para la determinación de las
vitaminas liposolubles basado en el acoplamiento de un sistema de
extracción en fase sólida con un cromatógrafo de líquidos.
Existen pocos métodos para la determinación
simultánea de vitaminas liposolubles en fluidos biológicos, la
mayoría de los cuales consisten en una etapa de extracción
líquido-líquido previa a una separación
cromatográfica con detección mediante absorción molecular en la
zona UV, o mediante espectrometría de masas (MS). Todos ellos son
métodos relativamente complejos, largos y caros, especialmente los
dedicados a vitamina D por su inestabilidad frente a la temperatura
y la luz. Por tanto, resulta de gran interés, tanto en el campo
clínico como en metabolómica, el desarrollo de un método que
permita determinar en una única muestra y con un tratamiento simple
y automático el contenido de vitaminas liposolubles.
Existen tres patentes que reflejan el estado de
la técnica anterior a este método y que se comentan brevemente.
La patente española con número ES 2133133B1 se
refiere a un método para la determinación de vitamina D3 y sus
metabolitos y se basa en las siguientes etapas: una extracción
líquido-líquido manual, etapa de limpieza y
preconcentración del extracto de suero humano mediante extracción
sólido-líquido, separación del extracto mediante
HPLC y detección mediante espectrofotometría
UV-visible.
La patente que aquí se presenta tiene las
siguientes características diferenciales:
En primer lugar sólo se determinan
hidroximetabolitos de la vitamina D3, mientras que en el documento
que se analiza se determinan en general vitaminas liposolubles y
metabolitos de la D2 y D3 y en dicha patente se requiere una etapa
de extracción líquido-líquido manual, que no se
realiza en el método que se pretende patentar. El procedimiento
propuesto se puede usar para cualquier tipo de suero, mientras que
en esta patente sólo se hace referencia a suero humano. Además en
dicha patente se utilizan 2 mL de suero humano y en el procedimiento
expuesto se utilizan entre 0.3 y 1 mL de suero de cualquier especie
animal.
La patente KR20030073428 se refiere a un método
para la determinación de vitamina E en suero, que se lleva a cabo
utilizando HPLC y espectrofotometría UV. No existe etapa de
extracción líquido-sólido y, además, sólo determina
vitamina E.
La patente americana US 005532166A se refiere a
un método rápido de determinación de retinol (vitamina A) en suero
mediante electroforesis capilar. Por tanto, la técnica de
separación es diferente a la propuesta en la patente que se solicita
y, además, sólo se lleva a cabo la determinación de una
vitamina.
Quedan, por tanto, de manifiesto aspectos
diferenciales que justifican la solicitud de patente para el método
propuesto de determinación de vitaminas liposolubles y metabolitos
de las vitaminas D2 y D3.
El procedimiento se refiere a un método para la
determinación simultánea de las vitaminas liposolubles D3, D2, A,
alfa- y delta-tocoferol,
25-OH-D_{3} y
25-OH-D_{2} en suero basado en el
acoplamiento de un sistema de extracción en fase sólida y un
cromatógrafo de líquidos con un detector ultravioleta.
La sangre y otros fluidos biológicos se recogen
en un tubo apropiado, y se realiza el proceso normal de extracción
con la muestra.
En un vial de muestra se mezcla un volumen de
suero adecuado con un volumen igual de
acetonitrilo-agua en relación 6:4 que tiene una
concentración 150 milimolar en dodecil sulfato sódico (en adelante
SDS). El vial se coloca en un vórtex agitando hasta conseguir una
buena mezcla y a continuación en la bandeja del automuestreador para
su análisis automático.
Se realiza la inyección automática del contenido
del vial en el sistema de extracción
líquido-sólido, que sigue la secuencia de
operaciones que se describe a continuación. Básicamente, el
análisis comienza con la preparación del cartucho de extracción en
fase sólida mediante activación de la fase sólida que contiene
metanol. acondicionamiento y equilibración con
acetonitrilo-agua en relación 3:7 que tiene una
concentración 15 milimolar en SDS. A continuación, con esta misma
mezcla se arrastra la muestra del bucle de inyección y en estas
condiciones los analitos quedan retenidos en la fase sólida.
Posteriormente, se introduce una mezcla
acetonitrilo-agua en relación 3:7 como disolución
de limpieza. En este momento comienza la etapa cromatográfica
mediante la elución de los analitos retenidos en la fase sólida por
la fase móvil. El cartucho de extracción en fase sólida es un
cartucho empaquetado con el sorbente C8 de fase reversa.
La fase móvil inicial es acetonitrilo:metanol en
relación 8.5:1.5 a un caudal de 1 mL/min. En el minuto 5 comienza
un gradiente lineal hasta el minuto 9 para aumentar el caudal el
50% del caudal inicial. La columna cromatográfica se mantiene a
temperatura ambiente. La etapa de extracción se produce
simultáneamente con la etapa cromatográfica de la muestra anterior,
lo cual reduce considerablemente el tiempo de análisis que hasta
ahora se manejaba para este tipo de determinaciones. La columna
analítica está rellena con el sorbente C18.
Para la detección se utiliza un detector (UV) en
el que se selecciona una longitud de onda para cada clase de
compuestos.
En un vial de 1.8 mililitros se mezclan 0.5 mL
de suero con la misma cantidad de acetonitrilo-agua
en relación 6:4 que tiene una concentración 150 milimolar en SDS. El
vial se coloca en un vórtex durante 1 minuto para conseguir una
buena mezcla y a continuación en la bandeja del automuestreador
para su análisis automático.
Se realiza la inyección automática del contenido
del vial en el sistema de extracción
líquido-sólido. El análisis comienza con la
preparación del cartucho de extracción en fase sólida mediante
activación de la fase sólida que contiene con 3 mL de metanol,
acondicionamiento (3 mL) y equilibración (1 mL) con
acetonitrilo-agua en relación 3:7 que tiene una
concentración 15 milimolar en SDS. A continuación, con esta misma
mezcla se arrastra la muestra del bucle de inyección y bajo estas
condiciones los analitos son retenidos en el cartucho de C8.
Posteriormente, se introducen 2 mL de una mezcla
acetonitrilo-agua en relación 3:7 como disolución de
limpieza. En este momento comienza la etapa cromatográfica mediante
la elución de los analitos retenidos en la fase sólida por la fase
móvil inicial que se produce con el giro de una válvula de seis
vías.
La fase móvil inicial es acetonitrilo:metanol en
relación 8.5:1.5 a un caudal de 1 mL/min. En el minuto 5 comienza
un gradiente lineal hasta el minuto 9 para aumentar el caudal hasta
1.5 mL/min. La columna cromatográfica se mantiene a temperatura
ambiente. Con este gradiente se produce la separación en función de
su polaridad relativa llegando al detector donde se monitorizan
cada uno a su longitud de onda de máxima absorción. También se
puede ver el resultado en forma de cromatograma (absorbancia frente
a tiempo).
Claims (9)
1. Procedimiento automatizado para la
determinación simultánea de vitaminas liposolubles y metabolitos de
las mismas en suero, caracterizado por comprender las
siguientes etapas:
- a)
- introducción de un volumen de suero comprendido entre 0.3 y 1.0 mL en un sistema automático de extracción en fase sólida para la eliminación de las especies interferentes y la concentración de las vitaminas.
- b)
- introducción del concentrado obtenido en la etapa anterior en un cromatógrafo líquido de de alta resolución para conseguir la separación de las vitaminas.
- c)
- introducción de cada una de las especies vitamínicas separadas en la etapa anterior en un espectrofotómetro que permita la determinación de las cantidades de cada vitamina mediante interpolación en rectas de calibrado.
2. Procedimiento automatizado para la
determinación de vitaminas liposolubles en suero, según
reivindicación 1, caracterizado por comprender la mezcla en
un vial de un volumen de suero con un volumen igual de
acetonitrilo-agua 6:4 que contiene dodecil sulfato
sódico 150 milimolar.
3. Procedimiento automatizado para la
determinación de vitaminas liposolubles en suero, según
reivindicación 2, caracterizado por comprender una
preconcentranción y limpieza de la muestra de forma automática
mediante una extracción en fase sólida.
4. Procedimiento automatizado para la
determinación de vitaminas liposolubles en suero, según
reivindicación 3, caracterizado porque dicha extracción se
hace arrastrando la muestra con una mezcla acetonitrilo:agua en
relación 3:7 que contiene 15 milimolar de SDS.
5. Procedimiento automatizado para la
determinación de vitaminas liposolubles en suero, según
reivindicación 3, caracterizado por comprender una etapa de
limpieza con acetonitrilo:agua 3:7.
6. Procedimiento automatizado para la
determinación de vitaminas liposolubles en suero, según
reivindicación 3, caracterizado por comprender el uso de un
cartucho de extracción en fase reversa de fase C8.
7. Procedimiento automatizado para la
determinación de vitaminas liposolubles en suero, según
reivindicación 1, caracterizado por comprender el uso de una
válvula de seis vías para la elución automática del concentrado de
vitaminas hacia la columna cromatográfica.
8. Procedimiento automatizado para la
determinación de vitaminas liposolubles en suero, según
reivindicación 8, caracterizado por comprender el uso de una
columna de cromatográfica de fase reversa C18 para separar las
vitaminas liposolubles y sus metabolitos.
9. Procedimiento automatizado para la
determinación de vitaminas liposolubles suero, según reivindicación
1, caracterizado por comprender el uso de un
espectrofotómetro que permita la determinación de las cantidades de
cada vitamina mediante interpolación en rectas de calibrado.
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