ES2334864T3 - Peptido-2 analogo al glucagon y su uso terapeutico. - Google Patents
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Abstract
EL PEPTIDO SIMILAR A GLUCAGON ESION DEL GEN DEL GLUCAGON, Y ANALOGOS DEL PEPTIDO SIMILAR A GLUCAGON 2 HAN SIDO IDENTIFICADOS COMO FACTORES DE CRECIMIENTO DE TEJIDO GASTROINTESTINAL. SE DESCRIBEN SUS EFECTOS SOBRE EL CRECIMIENTO DE LOS ISLOTES PANCREATICOS E INTESTINO DELGADO. SE DESCRIBE SU FORMULACION COMO PRODUCTOS FARMACEUTICOS, Y SU USO TERAPEUTICO EN EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS DEL INTESTINO.
Description
Péptido-2 análogo al glucagón y
su uso terapéutico.
Esta invención se refiere a péptidos
relacionados con glucagón con propiedades que promueven el
crecimiento del tejido gastrointestinal, y a su uso terapéutico
para tratar diversas afecciones médicas que resultan de un menor
crecimiento o de la pérdida de tejido gastrointestinal, en
particular, tejido intestinal y pancreático.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión del gen de glucagón proporciona
diversos productos peptídicos específicos de tejidos que son
procesados a partir del producto de proglucagón del residuo 160. La
organización de estos péptidos dentro del precursor de proglucagón
fue descubierta por la clonación molecular de los cADN de
preproglucagón a partir del páncreas de rape, rata, hámster y
bovino. Estos análisis revelaron que el preproglucagón no sólo
contiene la secuencia de glucagón y glicentina, sino que también
dos péptidos más del tipo glucagón (GLP-1 y
GLP-2) separados de glucagón y entre sí por dos
péptidos espaciadores o intermedios (IP-I e
IP-II). Estos péptidos están bordeados por pares de
aminoácidos básicos, característico de los sitios de división
prohormonales clásicos, lo que sugiere que podrían ser liberados
después del procesamiento post-translacional del
proglucagón (Drucker, Pancreas, 1990, 5 (4):484).
El análisis de los péptidos liberados del
proglucagón en los islotes pancreáticos de Langerhans, por ejemplo,
sugiere que el péptido pancreático primario liberado es el mero 29
glucagón, mientras que la glicentina, oxintomodulina,
IP-II y los péptidos tipo glucagón son más
frecuentes en los intestinos delgado y grueso. Esta demostración de
que los péptidos tipo glucagón se encuentran en el intestino ha
dirigido la investigación hacia el estudio de la estructura precisa
y la(s) supuesta(s) función(ones) de estos
péptidos viscerales recientemente descubiertos. La mayor parte de
los estudios se han focalizado en GLP-1, porque las
diversas líneas de evidencias sugirieron que GLP-1
puede ser un nuevo péptido regulador importante. En efecto, se ha
determinado que GLP-1 es el estímulo peptidérgico
más potente conocido para la liberación de insulina, una acción
mediada dependiente de la glucosa por la interacción con receptores
en células \beta pancreáticas. El GLP-1 y sus
derivados están en desarrollo para su uso en el tratamiento de
diabéticos.
Las funciones fisiológicas de la glicentina y la
oxintomodulina, llamadas "enteroglucagones", están también
bajo investigación, en particular con respecto a la regulación de la
secreción ácida y el crecimiento de células intestinales. La
oxintomodulina es capaz de inhibir la secreción de ácido gástrico
estimulada por pentagastrina de una manera dependiente de la dosis.
Se ha investigado la función de la glicentina en la mediación de los
cambios de la adaptación intestinal y el crecimiento de la mucosa
intestinal, y el efecto intestinotrófico de la glicentina y su uso
terapéutico ha sido descrito por Matsuno et al. en el
documento EP 612.531 publicado el 31 de agosto de 1994.
En contraste con GLP-1 y otros
péptidos relacionados con glucagón, la función fisiológica del
péptido tipo glucagón (GLP-2) aún no se entiende
bien a pesar del aislamiento y la secuenciación de varios homólogos
de GLP-2 en las especies humano, rata, bovino,
porcino, conejillo de indias, hámster y degú. Con la utilización de
antisueros de GLP-2 generados contra versiones
sintéticas de GLP-2, varios grupos han determinado
que GLP-2 está presente principalmente más en
extractos intestinales que en pancreáticos (véase Mojsov et
al., J. Biol. Chem., 1986, 261 (25):11880; Orskov
et al., en Endocrinology, 1986, 119 (4):1467 y
en Diabetologia, 1987, 30:874 y en FEBS
Letters, 1989, 247 (2):193; George et al., FEBS
Letters, 1985, 192 (2):275). Con respecto a su función
biológica, Hoosein et al. publicaron (FEBS Letters,
1984, 178 (1):8 83) que GLP-2 ni compite con
glucagón por unirse al hígado de rata y a tejidos cerebrales, ni
estimula la producción de la adenilato ciclasa en membranas
plasmáticas de hígado, aunque, enigmáticamente, estimula a la
adenilato ciclasa tanto en membranas hipotalámicas como pituitarias
de rata a concentraciones de 30-50 pM. Además, se
ha demostrado que GLP-2 no tiene ningún efecto sobre
la liberación de glicerol cuando se incuba con adipocitos de rata
aislados (Ruíz-Grande et al., (1992)
Peptides 13 (1): 13-16). Una
aclaración del papel fisiológico de GLP-2 sería
ciertamente deseable.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha determinado recientemente que
GLP-2 actúa como un agente trófico para promover el
crecimiento del tejido gastrointestinal. El efecto de
GLP-2 resalta en particular por un mayor crecimiento
del intestino delgado, y por lo tanto se refiere en este documento
a un efecto "intestinotrófico". De forma notable, los efectos
promotores del crecimiento de GLP-2 también se
manifiestan como un crecimiento de los islotes pancreáticos, y
particularmente por el agrandamiento y la proliferación de los
islotes. En consecuencia, un objeto general de la presente
invención es explotar los GLP-2 y análogos de
GLP-2 con fines terapéuticos y relacionados.
Más particularmente, y según un aspecto de la
invención, se proporciona un GLP-2 o un análogo de
GLP-2 en una forma farmacéuticamente aceptable que
es adecuada para la formulación y su administración subsecuente a
pacientes.
En otro de sus aspectos, la invención
proporciona una composición farmacéutica que comprende un
GLP-2 o un análogo de GLP-2 y un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto más, la invención proporciona un
método para promover el crecimiento y la proliferación de tejido
gastrointestinal, incluyendo tejido del intestino delgado y de los
islotes pancreáticos, en un paciente con necesidad de éste,
comprendiendo la etapa de administrar al paciente una cantidad que
promueva el crecimiento del tejido gastrointestinal de un
GLP-2 o un análogo de GLP-2.
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En otro aspecto de la invención, se proporciona
un método útil para identificar nuevos análogos de
GLP-2 intestinotróficos, que comprende las etapas
de:
1) obtener un análogo de GLP-2
intestinotrófico, teniendo el análogo al menos una sustitución de
aminoácido o un aminoácido con un grupo bloqueante;
2) tratar a un mamífero con dicho análogo usando
un régimen capaz de obtener un efecto intestinotrófico cuando se
utiliza para GLP-2 de rata; y
3) determinar el efecto de dicho análogo en el
peso del intestino delgado y/o en la altura de cripta más vellosidad
y/o el tamaño de los islotes pancreáticos con relación a un
mamífero control tratado de ensayo, por el cual dicho péptido
intestinotrófico es identificado como un análogo que produce un
aumento de dicho peso y/o dicha altura y/o dicho tamaño.
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En otro de sus aspectos, la presente invención
proporciona nuevos análogos de GLP-2, en la forma de
análogos intestinotróficos de GLP-2 de vertebrados.
Estos análogos de GLP-2 promueven el crecimiento y
la proliferación de tejido gastrointestinal, incluyendo tejido del
intestino delgado y tejido de los islotes pancreáticos.
En otro aspecto de la invención, se proporciona
un método en el que se realiza un tratamiento en pacientes para
restaurar el tejido gastrointestinal mediante las etapas de (1)
cultivar dicho tejido o las células de éste con una cantidad que
promueve el crecimiento de tejido de un GLP-2, o un
análogo de GLP-2, y luego (2) implantar dicho
tejido o células en el paciente que se trate.
En un aspecto relacionado, la invención
proporciona un método para cultivar tejido gastrointestinal o las
células de éste, que comprende la etapa de cultivar dicho tejido o
células en un medio de cultivo suplementado con una cantidad que
promueve el crecimiento de un GLP-2 o un análogo de
GLP-2.
La figura 1 muestra los resultados de la
respuesta frente a la dosis con un GLP-2. Las
medidas del efecto sobre el peso del intestino delgado
(BW-panel A), altura de cripta más vellosidad en
jejuno proximal (PJ-panel B), jejuno distal
(DJ-Panel C) e ileón distal
(DI-panel D) en animales a los que se les ha
inyectado GLP-2 de rata, son cada una representadas
como una función de la dosis de GLP-2 de rata.
La figura 2 muestra el efecto del vehículo de
formulación sobre la actividad intestinotrófica de un
GLP-2. El peso del intestino delgado (BW), y la
altura de cripta más vellosidad en jejuno proximal (PJ), jejuno
distal (DJ) e ileón distal (DI) fueron medidos cada uno como una
función de la administración de GLP-2 de rata en
gelatina (G) o solución salina (PBS). Una solución de gelatina sin
GLP-2 de rata fue usada como control (C).
La figura 3 muestra el efecto de la ruta de
administración sobre la actividad intestinotrófica de un
GLP-2. El cambio del porcentaje del peso del
intestino delgado fue medido después de que se inyectara
GLP-2 de rata subcutáneamente (SC),
intramuscularmente (IM) o intraperitonealmente (IP). Las barras
marcadas con T indican las muestras de ratas tratadas con
GLP-2; C indica las muestras obtenidas de ratas
control a las que se les ha inyectado solución salina.
La figura 4 muestra el efecto de la frecuencia
de administración sobre la actividad de GLP-2. A los
animales se le inyectó subcutáneamente PBS cada 12 horas, con 2,5
\mug de GLP-2 de rata cada 12 horas (q12h), con 5
\mug de GLP-2 de rata cada día (qd), o con 10
\mug de GLP-2 de rata cada dos días (qod), como se
indica en el eje x. El peso del intestino delgado (BW) y la altura
de cripta más vellosidad en jejuno proximal (PJ), jejuno distal
(DJ) e ileón distal (DI) fueron medidos para cada protocolo de
administración.
La figura 5 muestra el efecto de la duración de
la administración de GLP-2 como una función de la
actividad. A los animales se les inyectó una vez cada día 5 \mug
de GLP-2 de rata en gelatina al 10%, o con gelatina
al 10% sola durante cuatro semanas (panel A), ocho semanas (panel B)
o 12 semanas (panel C), luego se sacrificaron. El efecto del
tratamiento con GLP-2 con relación al control fue
medido para el peso del intestino delgado (BW) y la altura de
cripta más vellosidad en jejuno proximal (PJ), jejuno distal (DJ) e
ileón distal (DI).
La figura 6 proporciona un curso de tiempo del
efecto intestinotrófico de un GLP-2. Se sacrificaron
ratones hembra a los que fueron inyectados dos veces al día 2,5
\mug de GLP-2 de rata en PBS varios días después
de la iniciación del tratamiento, y se evaluó el peso del intestino
delgado con relación a un animal de control al que solo se le había
inyectado PBS.
La figura 7 muestra los efectos de la edad del
receptor y del género sobre la actividad intestinotrófica de
GLP-2. En los paneles de A a H, se compararon
animales tratados con GLP-2 emparejados por sexo
(ratones CD1) de 4 a 16 semanas de edad con respecto a sus propios
controles tanto para el peso del intestino delgado (BW) como para
la altura de cripta más vellosidad en jejuno proximal (PJ), jejuno
distal (DJ) e ileón distal (DI) después del tratamiento con
GLP-2 de rata.
La figura 8 muestra el efecto intestinotrófico
de varios GLP-2 diferentes y análogos de
GLP-2 con relación a un control. Los paneles A, C,
E y G presentan el cambio de peso del intestino delgado (BW); los
paneles B, D y F presentan el cambio de la altura de cripta más
vellosidad en jejuno proximal (PJ). Las abreviaturas de los
análogos son N-acetilo (péptido
GLP-2 de rata bloqueado en el extremo amino con un
grupo acetilo), Arg^{+1} (GLP-2 de rata que
contiene un residuo Arg adicional en el extremo amino), Arg^{+34}
(GLP-2 de rata que contiene un residuo Arg
adicional en el extremo carboxilo), C-amido
(GLP-2 de rata con un grupo amido que bloquea el
extremo carboxilo), Arg^{+1+3} que contiene dos residuos Arg
adicionales en el extremo amino). Además, el efecto de
GLP-2 de degú (degú) fue probado según su efecto
intestinotrófico en ratones.
La figura 9 muestra el efecto intestinotrófico
de GLP-2 de rata sobre la longitud del intestino
delgado. El aumento de la longitud del intestino delgado se mide
con relación a un animal control después del tratamiento con
GLP-2 durante 10 días.
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La invención se refiere a usos terapéuticos y
relacionados de GLP-2 y análogos de GLP, en
particular para promover el crecimiento y la proliferación de
tejido gastrointestinal, más particularmente del tejido del
intestino delgado o islotes pancreáticos. Con respecto al tejido del
intestino delgado, tal crecimiento se mide adecuadamente como un
aumento mediado por GLP-2 en masa y longitud del
intestino delgado, con relación a un control no tratado. Como se
demuestra por los resultados presentados en este documento, el
efecto de GLP-2 sobre el intestino delgado también
se manifiesta como un aumento de la altura del eje de la cripta más
las vellosidades. Tal actividad se denomina en este documento
actividad "intestinotrófica". También es detectable como
respuesta frente a GLP-2 un aumento de la
proliferación de células de la cripta y/o una disminución en la
apoptosis del epitelio del intestino delgado. Estos efectos
celulares se aprecian de forma más significativa con relación al
jejuno, incluyendo el jejuno distal y, en particular, el jejuno
proximal, y también se aprecian en el ileón distal. Se considera
que un compuesto tiene "efecto intestinotrófico" si los
animales de ensayo de al menos una especie vertebrada que responde
a un péptido GLP-2 de referencia muestran
significativamente un aumento del peso del intestino delgado, un
aumento de la altura del eje de la cripta más las vellosidades o un
aumento de la proliferación de células de la cripta o una
disminución de la apoptosis del epitelio del intestino delgado
cuando se trata con el compuesto (o se modifican genéticamente para
expresarlo ellos
mismos).
mismos).
Un modelo adecuado para determinar tal
crecimiento gastrointestinal es descrito por Matsuno et al.,
supra, y se ejemplifica más abajo en el Ejemplo 1. El
análisis morfométrico de los efectos celulares de
GLP-2 y análogos de GLP-2 en la
altura del eje de la cripta más las vellosidades en el intestino
delgado se describe más abajo en el Ejemplo 2.
Con respecto a los islotes pancreáticos, tal
crecimiento se muestra por el agrandamiento mediado por
GLP-2 y/o la proliferación de islotes pancreáticos,
con relación a un control no tratado. Un método para determinar el
efecto intestinotrófico de un compuesto evaluando el efecto del
compuesto de ensayo en el crecimiento de células de islotes
pancreáticos, incluyendo tanto el aumento de tamaño como los números
de células pancreáticas, se ejemplifica más abajo en el Ejemplo
1.
La expresión "péptido
GLP-2" se refiere colectivamente en este
documento al GLP-2 que aparece naturalmente en los
vertebrados, y a análogos de formas que aparecen naturalmente de
GLP-2, cuyos análogos de GLP-2
producen un efecto intestinotrófico y tienen una estructura
diferente, con relación al GLP-2 de un vertebrado
dado, por al menos una adición de aminoácido, sustitución, o por la
incorporación de uno (varios) aminoácido(s) con un grupo
bloquean-
te.
te.
Las diversas formas de GLP-2 de
vertebrado incluyen, por ejemplo, GLP-2 de rata y
sus homólogos incluyendo GLP-2 de buey,
GLP-2 porcino, GLP-2 de degú,
GLP-2 bovino, GLP-2 de conejillo de
indias, GLP-2 de hámster, GLP-2
humano, GLP-2 de trucha arco iris y
GLP-2 de pollo, cuyas secuencias han sido descritas
por muchos autores incluyendo Buhl et al., en J. Biol.
Chem., 1988, 263 (18):8621, Nishi y Steiner, Mol.
Endocrinol., 1990, 4:1192-8, e Irwin y
Wong, Mol. Endocrinol., 1995, 9
(3):267-77. Las secuencias descritas por estos
autores se incorporan en este documento como referencia.
Los análogos de GLP-2 de
vertebrado pueden ser generados usando técnicas estándares de la
química de péptidos y pueden ser evaluados respecto a su actividad
intestinotrófica, todos según las directrices proporcionadas en
este documento. Los análogos particularmente preferidos de la
invención son aquellos basados en la secuencia de
GLP-2 humano que sigue:
en la que uno o varios residuos de
aminoácidos se sustituyen de forma conservadora por otro residuo de
aminoácido, siempre que el análogo conserve todavía la actividad
intestinotrófica, tal como el crecimiento del intestino delgado, el
crecimiento de islotes pancreáticos y/o el aumento de la altura de
cripta/vellosidad, en un
vertebrado.
\vskip1.000000\baselineskip
Las sustituciones conservadoras en cualquier
GLP-2 que aparece naturalmente, preferiblemente la
secuencia de GLP-2 humana, son definidas como
intercambios dentro de cualquiera de los cinco grupos
siguientes:
I. Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)
II. Asn, Asp, Glu, Gln
III. His, Arg, Lys
IV. Met, Leu, Ile, Val (Cys)
V. Phe, Tyr, Trp.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también abarca sustituciones no
conservadoras de aminoácidos en cualquier secuencia de
GLP-2 de vertebrado, a condición de que las
sustituciones no conservadoras aparezcan en posiciones de
aminoácidos conocidas que varían en GLP-2 aislado
de diferentes especies. Las posiciones de residuos no conservadas se
determinan fácilmente alineando todas las secuencias de
GLP-2 de vertebrados conocidas. Por ejemplo, Buhl
et al., J. Biol. Chem., 1988, 263 (18):8621,
compararon con las secuencias de GLP-2 humano,
porcino, de rata, hámster, conejillo de indias y bovino, y
encontraron que las posiciones 13, 16, 19, 27 y 28 eran no
conservadas (los números de posición se refieren a la posición
análoga en la secuencia de GLP-2 humana). Nishi y
Steiner, Mol. Endocrinol., 1990,
4:1192-8, encontraron que una posición
adicional dentro de la secuencia que codificaba
GLP-2, el residuo 20 en la susodicha secuencia
humana, también variaba en degú, una especie de roedor indígena de
Sudamérica. Por lo tanto, según esta regla, las posiciones de
aminoácidos que varían en mamíferos y que, preferiblemente, pueden
ser sustituidas con residuos no conservadores son las posiciones
13, 16, 19, 20, 27 y 28.
O bien, pueden hacerse sustituciones no
conservadoras en cualquier posición en la cual la mutagénesis por
barrido con alanina muestre alguna tolerancia por la mutación porque
la sustitución de un residuo de aminoácido con alanina no destruye
toda la actividad intestinotrófica. La técnica de mutagénesis por
barrido con alanina se describe en Cunningham y Wells,
Science, 1989, 244:1081, y se incorpora en este
documento como referencia en su totalidad. Ya que la mayor parte de
las secuencias de GLP-2 consisten en sólo
aproximadamente 33 aminoácidos (y en alanina de
GLP-2 humana ya aparece en cuatro posiciones), un
experto en la técnica podría probar fácilmente un análogo de
alanina en cada posición restante según su efecto intestinotrófico,
como se muestra en los ejemplos siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Alineando las secuencias conocidas de
GLP-2 de vertebrado, se ha construido una fórmula
general que tiene en cuenta la homología de secuencia significativa
entre estas especies de GLP-2, así como los residuos
que se sabe que varían entre especies. Esta fórmula puede usarse
para guiar la elección de los residuos no conservados preferidos
particulares para la sustitución, adición o modificación por la
adición de grupos bloqueantes de aminoácidos. Por lo tanto, los
análogos particulares de GLP-2 de vertebrado
abarcados por la presente invención, de acuerdo con uno de sus
aspectos, son aquellos GLP-2 de vertebrado y
análogos de GLP-2 que se conforman con respecto a
la fórmula general representada más abajo como SEQ ID NO:1
en la que aa se refiere a cualquier
residuo de aminoácido, y de aa1 a aa6 son aquellas posiciones de
residuos conocidas que varían entre secuencias de
GLP-2 obtenidas entre especies diferentes,
y:
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
X es uno o dos aminoácidos seleccionados del
grupo III, tales como Arg, Lys o Arg-Arg
Y es uno o dos aminoácidos seleccionados del
grupo III, tales como Arg, Lys o Arg-Arg
m es 0 ó 1;
n es 0 ó 1;
R1 es H o un grupo bloqueante del extremo
N-terminal; y
R2 es OH o un grupo bloqueante del extremo
C-terminal.
\vskip1.000000\baselineskip
En varias de las realizaciones de la invención,
de aa1 a aa6 son como se define más abajo:
aa1 se selecciona del grupo IV;
aa2 se selecciona del grupo I o II;
aa3 se selecciona del grupo I;
aa4 se selecciona del grupo III;
aa5 se selecciona del grupo IV;
aa6 se selecciona del grupo II o III.
\vskip1.000000\baselineskip
En realizaciones particularmente preferidas de
la invención, de aa1 a aa6 se eligen entre el grupo de residuos que
se sabe que aparecen en dicha posición en GLP-2
aislados de diferentes especies, como sigue:
aa1 es Ile o Val;
aa2 es Asn o Ser;
aa3 es Ala o Thr;
aa4 es Lys o Arg;
aa5 es Ile o Leu; y
aa6 es Gln o His.
\vskip1.000000\baselineskip
El GLP-2 de humano y de rata se
diferencian entre sí en sólo el residuo de aminoácido en la posición
19. En la secuencia humana, este residuo es alanina; en
GLP-2 de rata, la posición 19 es treonina. Así, el
GLP-2 particular o los análogos de
GLP-2 abarcados por la invención contienen un
residuo variable en la posición 19. En estas realizaciones de la
invención, el péptido GLP-2 se conforma respecto a
la SEQ ID NO:2 mostrada a continuación:
en la que aa3, Y, m, X, n, R1 y R2
son como se definen
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
En realizaciones específicas de la invención, el
péptido GLP-2 se selecciona entre:
1) GLP-2 de rata que tiene la
SEQ ID NO:3 ilustrada más abajo:
\global\parskip1.000000\baselineskip
2) GLP-2 humano, que es el
equivalente de Thr^{19} a Ala^{19} de GLP-2 de
rata ilustrado más abajo:
\vskip1.000000\baselineskip
3) GLP-2 de degú que es el
equivalente [de Ile^{13} a Val^{13}, de Asn^{16} a His^{16},
de Lys^{20} a Arg^{20}] de GLP-2 de rata; y
4) los GLP-2, y análogos de
GLP-2, que incorporan un grupo bloqueante del
extremo N-terminal y/o una extensión del extremo
N-terminal tal como Arg o Arg-Arg;
y/o que incorporan un grupo bloqueante del extremo
C-terminal y/o una extensión del extremo
C-terminal tal como Arg o
Arg-Arg.
\vskip1.000000\baselineskip
Los "grupos bloqueantes" representados por
R1 y R2 son grupos químicos que se usan rutinariamente en la técnica
de la química de los péptidos para conferir estabilidad bioquímica
y resistencia frente a la digestión con exopeptidasa. Los grupos
protectores del extremo N-terminal adecuados
incluyen, por ejemplo, grupos alcanoilo C_{1-5},
tales como acetilo. También son adecuados como grupos protectores
del extremo N-terminal los análogos de aminoácido
que carecen de la función amino. Los grupos protectores del extremo
C-terminal adecuados incluyen grupos que forman
cetonas o amidas en el átomo de carbono del carboxilo del extremo
C-terminal, o grupos que forman ésteres en el átomo
de oxígeno del carboxilo. La cetona y los grupos que forman éster
incluyen grupos alquilo, en particular grupos alquilo
C_{1-5} ramificados o no ramificados, p.ej, grupos
metilo, etilo y propilo, mientras que los grupos que forman amida
incluyen funciones amino tales como funciones de amina primaria o
alquilamino, p.ej., grupos mono-alquil
C_{1-5}-amino y
di-alquil
C_{1-5}-amino tales como
metilamino, etilamino, dimetilamino, dietilamino, metiletilamino y
otros similares. Los análogos de aminoácido son también adecuados
para proteger el extremo C-terminal de los presentes
compuestos, por ejemplo, análogos de aminoácidos descarboxilados
tales como agmatina.
La forma particular de GLP-2
seleccionada para promover el crecimiento del tejido
gastrointestinal puede prepararse mediante diversas técnicas
conocidas para generar productos peptídicos. Las formas de
GLP-2 de vertebrados pueden obtenerse, por
supuesto, mediante extracción a partir de una fuente natural, usando
una combinación apropiada de técnicas de aislamiento de proteínas.
Como es descrito por Buhl et al., supra, el
aislamiento y la purificación de GLP-2 porcino se
consigue a partir de extractos de ácido-etanol de la
mucosa ileal por una combinación de selección por tamaños y
fraccionamiento por HPLC, con la ayuda del anticuerpo generado
contra proglucagón sintético 126-159, para
monitorizar la preparación. Como una alternativa respecto a la
extracción de GLP-2, aquellas formas de
GLP-2 que incorporan sólo
L-aminoácidos, tanto GLP-2 de
vertebrado como sus análogos, pueden producirse en cantidades
comerciales por aplicación de la tecnología del ADN recombinante.
Para este fin, se incorpora el ADN que codifica para el
GLP-2 deseado o análogo de GLP-2 en
un vector de expresión y se transforma en un huésped microbiano,
p.ej, levadura, u otro celular, que se cultiva entonces bajo
condiciones apropiadas para la expresión de GLP-2.
Se han adaptado con este fin diversos sistemas de expresión de
genes, y típicamente conducen la expresión del gen deseado a partir
de controles de expresión usados naturalmente por el huésped
elegido. Como GLP-2 no requiere la glucosilación
post-translación para su actividad, su producción
puede ser conseguida más adecuadamente en huéspedes bacterianos
tales como E. coli. Para dicha producción, el ADN que
codifica para el péptido de GLP-2 seleccionado puede
ser colocado útilmente en controles de expresión de los genes lac,
trp o PL de E. coli. Como una alternativa a la expresión del
ADN que codifica para GLP-2 en sí, el huésped puede
ser adaptado para expresar el péptido GLP-2 como una
proteína de fusión en la cual GLP-2 se une de forma
desprendible a una proteína vehículo que facilita el aislamiento y
la estabilidad del producto de expresión.
En un enfoque universalmente aplicable respecto
a la producción de un GLP-2 seleccionado o análogo
de GLP-2, y uno usado necesariamente para producir
péptidos GLP-2 que incorporan aminoácidos no
codificados genéticamente y formas derivatizadas del extremo N- y
C-terminal, se emplean técnicas bien establecidas de
síntesis de péptidos automatizadas, cuyas descripciones generales
aparecen, por ejemplo, en J. M Stewart y J. D. Young, "Solid
Phase Peptide Synthesis", 2ª edición, 1984, Compañía Química
Pierce, Rockford, Ill; y en M. Bodanszky y A. Bodanszky, "The
Practice of Peptide Synthesis", 1984,
Springer-Verlag, Nueva York; "Manual de Usuario
430A de Applied Biosystems", 1987, ABI Inc, Foster City,
California. En estas técnicas, el péptido GLP-2 se
cultiva a partir de su extremo C-terminal, residuo
conjugado por resina por la adición secuencial de aminoácidos
apropiadamente protegidos, usando los protocolos de Fmoc o tBoc,
como se describe, por ejemplo, por Orskov et al., 1989,
supra.
Para la incorporación de grupos N- y/o
C-bloqueantes, también pueden aplicarse protocolos
convencionales a métodos de síntesis de péptidos en fase sólida.
Para la incorporación de grupos bloqueantes del extremo
C-terminal, por ejemplo, la síntesis del péptido
deseado se realiza típicamente usando, como fase sólida, una resina
de soporte que ha sido modificada por medios químicos de modo que
la división desde la resina cause un péptido GLP-2
con el grupo bloqueante del extremo C-terminal
deseado. Para proporcionar péptidos en los cuales el extremo
C-terminal lleva un grupo bloqueante amino primario,
por ejemplo, la síntesis se realiza usando una resina de
p-metilbenzhidrilamina (MBHA) de modo que, cuando la
síntesis de péptidos se completa, el tratamiento con ácido
fluorhídrico libera el péptido amidado del extremo
C-terminal deseado. Del mismo modo, la incorporación
de un grupo bloqueante N-metilamina en el extremo
C-terminal se consigue usando una resina DVB
derivatizada con N-metilaminoetilo, que bajo el
tratamiento con HF libera el péptido que lleva un extremo
C-terminal N-metilamidado. También
puede conseguirse la protección del extremo
C-terminal por esterificación usando procedimientos
convencionales. Esto implica el uso de la combinación resina/grupo
bloqueante que permite la liberación del péptido protegido de la
cadena lateral de la resina, para permitir la consecuente reacción
con el alcohol deseado, para formar la función éster. Los grupos
protectores de FMOC, en combinación con la resina DVB derivatizada
con el alcohol de metoxialcoxibencilo o enlazante equivalente,
pueden usarse para este fin, siendo efectuada la división desde el
soporte por TFA en diclorometano. La esterificación de la función
carboxilo apropiadamente activada, p.ej, con DCC, puede proceder
entonces por la adición del alcohol deseado, seguido de la
desprotección y el aislamiento del péptido GLP-2
esterificado.
La incorporación de grupos bloqueantes del
extremo N-terminal puede conseguirse mientras el
péptido GLP-2 sintetizado todavía está unido a la
resina, por ejemplo, por tratamiento con un anhídrido adecuado y
nitrilo. Para incorporar un grupo bloqueante de acetilo en el
extremo N-terminal, por ejemplo, el péptido
conectado a la resina puede tratarse con anhídrido acético al 20%
en acetonitrilo. El péptido GLP-2
N-bloqueado puede escindirse entonces desde la
resina, desprotegerse y posteriormente aislarse.
Una vez que se ha sintetizado el péptido
GLP-2 deseado, se ha escindido de la resina y está
totalmente desprotegido, el péptido se purifica entonces para
asegurar la recuperación de un oligopéptido sencillo que tiene la
secuencia de aminoácidos seleccionada. La purificación puede
conseguirse usando cualquiera de los enfoques estándares,
incluyendo la cromatografía líquida de alta resolución de fase
inversa (RP-HPLC) en columnas de sílice alquiladas,
p.ej, C_{4}-, C_{8}- o C_{18}-sílice. Tal
fraccionamiento en columna se lleva a cabo generalmente produciendo
gradientes lineales, p.ej, 10-90%, de % de
disolvente orgánico creciente, p.ej, acetonitrilo, en tampón acuoso,
conteniendo por lo general una pequeña cantidad (p.ej, 0,1%) de
agente de emparejamiento, tal como TFA o TEA. O bien, puede
emplearse HPLC de intercambio iónico para separar especies de
péptidos según sus características de carga. Las fracciones de
columna se recuperan, y aquellas que contienen el péptido de la
pureza deseada/requerida son opcionalmente reunidas. En una
realización de la invención, el péptido GLP-2 se
trata entonces de la manera establecida para cambiar el ácido de
escisión (p.ej, TFA) con un ácido farmacéuticamente aceptable, tal
como acético, clorhídrico, fosfórico, maleico, tartárico, succínico
y otros similares, para generar una sal de adición de ácido
farmacéuticamente aceptable del péptido.
Para la administración a pacientes, se
proporciona el péptido GLP-2 o su sal, en un aspecto
de la invención, en una forma farmacéuticamente aceptable, p.ej,
como una preparación filtrada de modo estéril, p.ej, a través de un
filtro de 0,22 \mu, y sustancialmente sin pirógenos.
Deseablemente, el péptido GLP-2 que se formula
emigra como un pico solo o individualizado en HPLC, muestra una
composición de aminoácidos uniforme y auténtica y su secuencia bajo
análisis, y por otra parte satisface los estándares expuestos por
las diversas entidades nacionales que regulan la calidad de los
productos farmacéuticos.
Para uso terapéutico, se formula el
GLP-2 elegido o análogo de GLP-2 con
un vehículo que es farmacéuticamente aceptable y que es apropiado
para administrar el péptido por la ruta de administración elegida.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados son aquellos
usados convencionalmente con fármacos peptídicos, tales como
diluyentes, excipientes y otros similares. Puede hacerse referencia
al "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17ª edición, Mack
Publishing Company, Easton, Penn., 1985, para una guía sobre
formulaciones farmacéuticas generalmente. En una realización de la
invención, se formulan los compuestos para su administración por
infusión, p.ej, cuando se usan como suplementos alimenticios
líquidos para pacientes en terapia nutricional parenteral total, o
por inyección, p.ej, subcutáneamente, intramuscularmente o
intravenosamente, y son, en consecuencia, utilizados como
soluciones acuosas en forma estéril y sin pirógenos y opcionalmente
están tamponados a un pH fisiológicamente tolerable, p.ej., un pH
ligeramente ácido o fisiológico. Así, los compuestos pueden
administrarse en un vehículo tal como agua destilada o, más
deseablemente, en solución salina, solución salina tamponada con
fosfato o solución salina con dextrosa al 5%. La solubilidad en agua
del GLP-2 o análogo de GLP-2 puede
ser realzada, de ser deseado, incorporando un potenciador de la
solubilidad, tal como el ácido acético.
El vehículo acuoso o vehículo puede ser
suplementado para su uso como inyectable con una cantidad de
gelatina que sirva para guardar el GLP-2 o el
análogo de GLP-2 en el sitio de inyección o cerca de
éste, para su liberación lenta en el sitio deseado de acción. Es de
esperar que las concentraciones de gelatina eficaces para conseguir
el efecto de almacenamiento estén en el intervalo del
10-20%. También pueden ser útiles agentes
gelificantes alternativos, tales como el ácido hialurónico, como
agentes de almacenamiento.
También pueden formularse los
GLP-2 y los análogos de GLP-2 de la
invención como un dispositivo de implantación de liberación lenta
para una administración extendida y sostenida de
GLP-2. Los ejemplos de tales formulaciones de
liberación sostenida incluyen materiales compuestos de polímeros
biocompatibles, tales como poli(ácido láctico), poli(ácido
láctico-co-glicólico),
metilcelulosa, ácido hialurónico, colágeno y otros similares. Se
han examinado la estructura, la selección y el uso de polímeros
degradables en vehículos de administración farmacéutica en varias
publicaciones, incluyendo, A. Domb et al., Polymers for
Advanced Technologies 3:279-292 (1992).
Una guía adicional para la selección y utilización de polímeros en
formulaciones farmacéuticas puede encontrarse en el texto de M.
Chasin y R. Langer (editores), "Biodegradable Polymers as Drug
Delivery Systems", volumen 45 de "Drugs and the Pharmaceutical
Sciences", M Dekker, Nueva York, 1990. También pueden usarse
liposomas para proporcionar una liberación sostenida de un
GLP-2 o análogo de GLP-2. Los
detalles acerca de cómo usar y preparar formulaciones liposómicas
de los fármacos de interés pueden ser encontrados, entre otros
sitios, en la patente de EE.UU. Nº. 4.944.948; patente de EE.UU. Nº.
5.008.050; patente de EE.UU. Nº. 4.921.706; patente de EE.UU. Nº.
4.927.637; patente de EE.UU. Nº. 4.452.747; patente de EE.UU. Nº.
4.016.100; patente de EE.UU. Nº. 4.311.712; patente de EE.UU. Nº.
4.370.349; patente de EE.UU. Nº. 4.372.949; patente de EE.UU. Nº.
4.529.561; patente de EE.UU. Nº. 5.009.956; patente de EE.UU. Nº.
4.725.442; patente de EE.UU. Nº. 4.737.323; patente de EE.UU. Nº.
4.920.016. Las formulaciones de liberación sostenida son de interés
particular cuando es deseable proporcionar una concentración local
alta de un GLP-2 o análogo de GLP-2,
p.ej, cerca del páncreas para promover el crecimiento pancreático,
en la diabetes, etc.
Para el uso en la estimulación del crecimiento
del intestino delgado o de la proliferación y el aumento de células
de islotes pancreáticas en un mamífero incluyendo un ser humano, la
presente invención proporciona en uno de sus aspectos un envase, en
forma de un vial rellenado de modo estéril o ampolla, que contiene
una cantidad del GLP-2 o análogo de
GLP-2 que promueve el crecimiento de tejido, en
dosis unitarias o en cantidades multidosis, en el que el envase
incorpora una etiqueta que instruye sobre el uso de su contenido
para la promoción de tal crecimiento. En una realización de la
invención, el envase contiene el GLP-2 o el análogo
de GLP-2 y el vehículo deseado, como una
formulación preparada para la administración. O bien, y según otra
realización de la invención, el envase proporciona el
GLP-2 o análogo de GLP-2 en una
forma, tal como una forma liofilizada, adecuada para su
reconstitución en un vehículo adecuado, tal como una solución salina
tamponada de fosfato.
En una realización, el envase es un vial
rellenado de un modo estéril o ampolla que contiene una solución
inyectable que comprende una cantidad eficaz, intestinotrófica de
GLP-2 o análogo de GLP-2 disuelto en
un vehículo acuoso.
Como una alternativa a las formulaciones
inyectables, el GLP-2 o el análogo de
GLP-2 pueden formularse para su administración por
otras rutas. Las formas de dosificación oral, tales como pastillas,
cápsulas y otros similares, pueden ser formuladas de acuerdo con la
práctica farmacéutica estándar.
Según la presente invención, el
GLP-2 o análogo de GLP-2 se
administra para tratar a pacientes que se beneficiarían del
crecimiento del tejido gastrointestinal. En un aspecto, los
pacientes candidatos son aquellos que se beneficiarían del
crecimiento del tejido de intestino delgado. Los efectos del péptido
GLP-2 en este tejido, como se evidencia por los
resultados ejemplificados en este documento, son drásticos y
beneficiarían claramente a aquellos pacientes que padecen
enfermedades o afecciones marcadas por anormalidades en la mucosa
del tracto del intestino delgado, incluyendo: úlceras y trastornos
inflamatorios; trastornos de la absorción y de la digestión
congénitos o adquiridos incluyendo síndromes de malabsorción; y
enfermedades y afecciones causadas por la pérdida de la función
mucosa del intestino en particular en pacientes que se someten a una
larga alimentación parenteral o a quienes, a consecuencia de una
cirugía, se han sometido a la resección del intestino y sufren el
síndrome del intestino corto y el síndrome
cul-de-sac. El tratamiento
terapéutico con péptidos GLP-2 se administra para
reducir o eliminar los síntomas de la enfermedad en estos pacientes
asociados con su menor función mucosa del tracto intestinal. Por
ejemplo, GLP-2 o el análogo de GLP-2
se administran a un paciente con una afección inflamatoria del
intestino en una cantidad suficiente para mejorar la incomodidad
intestinal y la diarrea causada por la afección. Además,
GLP-2 o un análogo de GLP-2 puede
ser administrado a pacientes con desórdenes de malabsorción para
realzar la absorción alimenticia y así mejorar el estado alimenticio
de tales pacientes.
En general, los pacientes que se beneficiarían
del aumento de la masa del intestino delgado y la consiguiente
mayor función de la mucosa del intestino delgado son candidatos para
el tratamiento con GLP-2 o análogo de
GLP-2. Las afecciones particulares que pueden ser
tratadas con GLP-2 incluyen las diversas formas de
esprúe incluyendo esprúe celiaco causado por una reacción tóxica a
la \alpha-gliadina del trigo, y marcado por una
enorme pérdida de vellosidades del intestino; esprúe tropical
causado por la infección y marcado por un aplanamiento parcial de
las vellosidades; esprúe hipogammaglobulinémico que se observa
comúnmente en pacientes con inmunodeficiencia variable común o
hipogammaglobulinemia y marcado por una disminución significativa de
la altura de las vellosidades. La eficacia terapéutica del
tratamiento con GLP-2 puede ser monitorizada por
una biopsia entérica para examinar la morfología de las
vellosidades, por evaluación bioquímica de la absorción nutritiva,
por la ganancia de peso del paciente, o por la mejora de los
síntomas asociados con estas afecciones. Otras afecciones que
pueden ser tratadas con GLP-2 o el análogo de
GLP-2, o para las que GLP-2 o el
análogo de GLP-2 pueden ser útiles
profilácticamente, incluyen enteritis por radiación, enteritis
infecciosa o post-infecciosa, enteritis regional
(enfermedad de Crohn), daño del intestinal delgado debido a agentes
quimioterapéuticos tóxicos u otros, y pacientes con síndrome del
intestino corto.
En otro aspecto, los pacientes candidatos para
un tratamiento con GLP-2 o análogo de
GLP-2 son aquellos que se beneficiarían del
crecimiento de islotes pancreáticos, y en particular de la
ampliación o proliferación o regeneración de islotes pancreáticos.
Tales pacientes incluyen aquellos que padecen enfermedades o
afecciones marcadas por la ausencia o la reducción de islotes
pancreáticos o por una menor función de los islotes pancreáticos.
Los pacientes candidatos particulares son aquellos que padecen
diabetes tipo 1 o tipo 2, así como pacientes con formas secundarias
de diabetes debido a infiltración, inflamación o destrucción del
páncreas. Se administra GLP-2 o el análogo de
GLP-2 a estos pacientes en una cantidad suficiente
para restaurar la función pancreática, al menos parcialmente, para
aumentar el nivel de insulina endógena, y mejorar sus síntomas.
La medicación terapéutica y el régimen más
apropiado para el tratamiento del paciente variarán, por supuesto,
con la enfermedad o afección que se trate, y según el peso del
paciente y otros parámetros. De aquí en adelante en este documento,
se presentan resultados que demuestran que una dosis de
GLP-2 o análogo de GLP-2 equivalente
a aproximadamente 2,5 mg/kilogramos (o menos, véase más abajo)
administrada dos veces al día durante 10 días puede generar
aumentos muy significativos de la masa del intestino delgado y de la
altura de cripta/vellosidad, en particular, del jejuno proximal. Se
espera que dosis mucho más pequeñas, p.ej, en el intervalo de
\mug/kg, y de duración o frecuencia de tratamiento más corta o
más larga, también producirán resultados terapéuticamente útiles,
es decir, un aumento estadísticamente significativo, en particular,
de la masa del intestino delgado. Las cantidades de las dosis y los
regímenes de medicación más apropiados para uso en humanos se eligen
según los resultados presentados en este documento, y pueden ser
confirmados en procesos clínicos correctamente diseñados.
Pueden determinarse la dosis eficaz y el
protocolo de tratamiento por medios convencionales, comenzando con
una dosis baja en animales de laboratorio y luego aumentando la
dosis supervisando los efectos, y variando sistemáticamente también
el régimen de dosificación. El médico puede tomar en cuenta
numerosos factores cuando determine la dosis óptima para un sujeto
dado. Principalmente, entre éstos está la cantidad de
GLP-2 que normalmente circula en el plasma, que
está en el orden de 151 pmol/mL en estado de reposo, elevándose a
225 pmol/mL después de una ingestión nutritiva para seres humanos
adultos sanos. Orskow, C. y Helst, J. J., 1987, Scand. J. Clin.
Lav. Invest. 47:165. Otros factores incluyen la talla del
paciente, la edad del paciente, la condición general del paciente,
la enfermedad particular tratada, la severidad de la enfermedad, la
presencia de otros fármacos en el paciente, la actividad in
vivo del péptido GLP-2 y otros similares. Las
dosis de ensayo serían elegidas según la consideración de los
resultados de estudios en animales y la historia clínica. Será
apreciado por cualquier experto ordinario en la técnica que también
puede usarse en el cálculo de la dosis información tal como las
constantes de unión y la Ki derivada de los ensayos de unión
competitivos de GLP-2 in vitro.
Una dosis humana típica de un péptido
GLP-2 sería de aproximadamente 10 \mug/kg de peso
corporal/día a aproximadamente 10 mg/kg/día, preferiblemente de
aproximadamente 50 \mug/kg/día a aproximadamente 5 mg/kg/día, y
más preferiblemente aproximadamente de 100 \mug/kg/día a 1
mg/kg/día.
En otro de sus aspectos, la invención
proporciona un tratamiento de pacientes candidatos como el que se ha
identificado usando células implantadas que han sido acondicionadas
in vitro o in vivo por incubación previa o
tratamiento con GLP-2 o análogo de
GLP-2, o que han sido modificadas genéticamente para
producirlo. El acondicionamiento de células ex vivo puede
conseguirse simplemente cultivando las células o el tejido que se
trasplanta en un medio que haya sido suplementado con una cantidad
que promueva el crecimiento de GLP-2 o análogo de
GLP-2 y que sea, por otra parte, apropiado para
cultivar a aquellas células. Las células pueden, después de un
período de acondicionamiento apropiado, ser implantadas después
directamente en el paciente o pueden ser encapsuladas usando la
tecnología de encapsulación de células establecida, y luego
implantarse.
Otro aspecto más de la invención abarca el
tratamiento de animales in vivo con péptidos
GLP-2 a fin de promover el crecimiento del tejido
del intestino delgado o aumentar el tamaño o el número de las
células de los islotes pancreáticos. Después del agrandamiento
subsecuente del intestino delgado y/o de los islotes pancreáticos,
estos tejidos pueden usarse entonces en un procedimiento de
xenotransplante. Tal tratamiento con el péptido
GLP-2 puede ser ventajoso antes del xenotransplante
del tejido de un animal no humano a un ser humano porque el tamaño
del órgano trasplantado o el tejido a menudo limitan el éxito de
este procedimiento. Por ejemplo, un animal donante porcino puede
tratarse con el péptido GLP-2 a fin de aumentar el
tamaño del intestino delgado antes del xenotransplante del tejido
de intestino delgado porcino en un ser humano que necesite este
órgano.
O bien, pueden hacerse crecer las células que se
implantan in vitro a partir de una célula que ha sido
modificada genéticamente para expresar o sobreexpresar el gen de
glucagón o, más directamente, el ADN que codifica únicamente para
GLP-2. La secuencia de tal ADN puede ser determinada
fácilmente a partir de la secuencia de aminoácidos de
GLP-2 seleccionada, con la limitación de que sólo
las formas de GLP-2 que contienen aminoácidos
genéticamente codificados pueden ser producidas de esta manera.
Pueden emplearse varios vectores virales, adecuados para la
introducción de la información genética en células humanas, e
incorporarán el ADN que codifica GLP-2 en controles
de expresión funcionales en las células huésped. Una vez modificadas
genéticamente, las células modificadas pueden ser implantadas
después usando procedimientos establecidos en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
En un primer experimento diseñado para
investigar el efecto de glicentina sobre el crecimiento del
intestino delgado, fueron tratados como sigue dos grupos de seis
ratones (de 8 semanas, hembras CD1 de Laboratorios Charles River).
Cada ratón recibió inyecciones de 41,5 \mug cada 12 horas durante
10 días. Las inyecciones fueron administradas subcutáneamente en un
volumen final de gelatina del 16%, con 0,5 centímetros cúbicos
inyectados subcutáneamente cada 12 horas. La glicentina (rata) se
disolvió fácilmente en 10 ml de agua. Los ratones control
recibieron 0,5 centímetros cúbicos de solución de gelatina del 16%,
pero ningún péptido, cada 12 horas. Los ratones fueron alimentados
con comida de rata estándar y con libre acceso a la comida y al
agua, hasta 12 horas antes de su sacrificio, en cuyo tiempo la
comida fue retirada, y sólo les fue administrada el agua. El peso
del intestino delgado fue calculado escindiendo el intestino delgado
entero, y quitando el estómago (extremo proximal) y el
apéndice/ciego/intestino grueso (extremo distal). El intestino
delgado restante fue limpiado con una solución salina para quitar
las heces, y fue pesado. Los resultados fueron como sigue:
Con estos resultados que indican que el efecto
intestinotrófico de glicentina era modesto, fue realizado un
segundo experimento usando los mismos protocolos para investigar los
efectos de otros productos derivados del gen de proglucagón,
incluyendo GLP-1 y GLP-2. Para este
fin, se sintetizaron a medida GLP-2 de rata de SEQ
ID NO:3 y GLP-1 humano (7-36 amida)
por la aplicación del enfoque en fase sólida basado en tBoc. El
análisis de GLP-2 de rata reveló una pureza del 95%
por HPLC analítico (muestra de 20 \mul de 1,0 mg/ml; columna C18
de Vydac de 5 \mu; TFA al 0,1%/CH_{3}CN al
20-60% durante 20 minutos a 1,5 ml/min).
Las formulaciones de GLP-2 para
la inyección se prepararon como sigue: Se disolvió gelatina en agua
caliente con una proporción en peso del 16%, y la solución de 50 mL
se sometió a autoclave y se enfrió a temperatura ambiente. Una
solución del péptido se preparó por separado entonces mezclando 5 mg
de GLP-2 con agua en un volumen ligeramente menor
de 10 mL, y luego añadiendo ácido acético 1N en un volumen
(10-20 \muL) suficiente para disolver el péptido
completamente. El pH fue reajustado entonces a aproximadamente 7,0
por la adición de un volumen igual de NaOH 1N
(10-20 \muL), y el volumen de solución fue
ajustado entonces a 10 mL por la adición de agua destilada. Para
preparar la formulación para la inyección, se combinaron la solución
del péptido de 10 mL y la solución de 50 mL de gelatina del 16% con
mezcla, y se introdujeron alícuotas para inyección en una
jeringuilla de insulina de 0,5 mL. El mismo procedimiento fue usado
para formular el GLP-1, a excepción del hecho de
que no fue necesario ningún ajuste ácido/básico dado su mayor
solubilidad relativa en agua.
A los ratones les fueron inyectados 0,5 ml de la
solución de gelatina del 16%, sin o con el péptido (62,5
\mug/dosis). A cuatro grupos de cuatro ratones (de 8 semanas,
hembras CD1 de Laboratorios Charles River) les fue inyectado dos
veces al día durante 10 días. Los resultados son tabulados más
abajo:
Estos resultados demuestran que, a una dosis de
aproximadamente 2,5 mg/kilogramo (640 nmol/kg),
GLP-2 muestra un aumento estadísticamente
significativo (p <0,05) de la masa del intestino delgado con un
tratamiento de dos veces al día durante 10 días, respecto tanto al
grupo de control que no recibe ningún péptido, como al grupo que
recibe otro péptido relacionado con glucagón, GLP-1.
Con relación a los resultados presentados en este documento para
glicentina, también está claro que GLP-2 constituye
un factor de crecimiento principal del tejido intestinal.
Los efectos de la administración del péptido
GLP-2 a estos ratones fueron explorados también, por
el seccionamiento de órganos gastrointestinales de cuatro ratones
tratados con GLP-2 y los cuatro ratones control,
usando secciones fijadas con parafina y técnicas histopatológicas
estándar. Las áreas de islote fueron medidas por análisis
morfométrico. La hematoxilina y las secciones teñidas con eosina
fueron usadas para la cuantificación. El área pancreática total y
el área de islotes total en cada sección fueron medidas. Los datos
mostraron que el área de islotes era, por término medio, el 0,31%
del área pancreática total en el grupo de control. Por otra parte,
los islotes del grupo tratado con GLP-2
constituyeron el 0,76% del área pancreática total, representando un
aumento del área de islotes de más del
doble en el grupo tratado con GLP-2. Además del tamaño de islotes, fue observado un aumento del número de islotes.
doble en el grupo tratado con GLP-2. Además del tamaño de islotes, fue observado un aumento del número de islotes.
\vskip1.000000\baselineskip
También fueron investigados los efectos del
péptido GLP-2 sobre el crecimiento del intestino
delgado, en particular para evaluar la respuesta del tejido como
una función de la dosis, el tiempo, la ruta de administración y la
frecuencia, el tipo de formulación, y el género y la edad del
receptor. Estos efectos fueron medidos en el contexto no sólo del
aumento de la masa del intestino delgado, sino también en el
contexto del aumento de la altura de cripta y vellosidad.
Para estos fines, se preparó
GLP-2 de rata como se describe en el Ejemplo 3. El
GLP-2 de rata se formuló en solución salina
tamponada con fosfato o como una formulación de almacenamiento que
contenía gelatina. Para preparar la solución salina tamponada con
fosfato, el péptido GLP-2 se preparó como sigue: Se
preparó primero una solución madre 10X de PBS, usando 80 g de NaCl
(BDH ACS 783), 2 g de KCl (BDH ACS 645), 11,5 g de Na_{2}HPO_{4}
(Anachemia AC-8460), y 2 g de KH_{2}PO_{4}
(Malinckrodt AR7100), que se llevó a un volumen total de un litro
con agua destilada estéril. La solución de trabajo final fue
obtenida por una dilución 10:1 de la solución madre con agua
destilada estéril y se ajustó a un pH 7,3-7,4 si era
necesario usando varios microlitros de NaOH 10N (hidróxido de
sodio). La solución de trabajo se sometió entonces a autoclave
durante 30 minutos. En la solución de trabajo final de PBS, las
concentraciones fueron NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM,
Na_{2}HPO_{4}.7H_{2}O 4,3 mM y KH_{2}PO_{4} 1,4 mM.
Para generar el péptido GLP-2
formulado con PBS, el péptido pulverizado se añadió a la solución de
trabajo de PBS según se requería a formulaciones que tenían las
concentraciones de péptido deseadas. Por ejemplo, para generar una
solución de PBS del péptido a 130 mg/L, se disolvieron 4,2 mg de
GLP-2 en 40 ml de PBS para proporcionar una
concentración de GLP-2 de 130 \mug/ml. Para
administrar una dosis de 2,5 mg/kilogramos a un ratón,
aproximadamente 0,5 ml de esta solución se inyectarían dos veces al
día.
Para generar la formulación con gelatina, se
preparó primero una solución de gelatina disolviendo 12 gramos de
gelatina (Sigma, G-8150, Nº de lote 54HO7241 Tipo A
de piel porcina [9000-70-8] -300
Bloom) en 100 mL de agua destilada. La solución de gelatina se
sometió entonces a autoclave, se calentó a 37ºC, y el péptido
GLP-2, anteriormente disuelto en una solución salina
tamponada con fosfato como se describe antes, fue añadido para
conseguir concentraciones de péptido específicas y deseadas. Las
formulaciones de GLP-2 con gelatina se prepararon
entonces a la concentración de GLP-2 deseada
mezclando el GLP-2 formulado con PBS con la solución
de gelatina preparada justo como se describe antes. Por ejemplo,
para generar una solución de PBS con gelatina del
GLP-2 a una concentración de 130 mg/L, se diluyeron
10 ml de una solución de PBS preparada con GLP-2 de
4,2 miligramos con 30 ml de la solución de trabajo de gelatina al
20% preparada como se describe antes. La solución se mezcló
pipeteando suavemente para proporcionar una solución final de 130
mg/L de GLP-2 en PBS con gelatina del 15%.
Como en el Ejemplo 1, los receptores eran
ratones CD1 obtenidos del Laboratorio Charles River (Ontario,
Canadá). Se emparejaron por edades los ratones CD1 hembras en el
tiempo de inyección (n=3-4 por grupo), 6 semanas de
edad, a menos que se especifique de otro modo. Se permitió a los
animales aclimatarse durante un mínimo de 24 horas a la instalación
del laboratorio antes de la iniciación de cada experimento. Los
animales se identificaron por punción en los oídos. A los ratones
no les fue restringida la dieta o la actividad durante los
experimentos. El ciclo de luz/oscuridad fue de 12 horas, entre las
18 h 00 y las 6 h 00. En la mayoría de las inyecciones se usaba
gelatina del 12% o PBS como vehículo. Los controles eran animales
emparejados por edad y sexo (n=3-4) a los que se
les inyectó la formulación de gelatina o PBS. Cada péptido se
preparó a una concentración específica, disuelto en 0,5 centímetros
cúbicos de vehículo. Los péptidos fueron inyectados subcutáneamente
y los ratones fueron supervisados diariamente en la instalación del
laboratorio. Los animales se sacrificaron 14 días después de la
inyección, y ayunaron 20-24 horas antes del
sacrificio.
Los ratones se anestesiaron con CO_{2} y se
desangraron por punción cardíaca. La sangre fue recuperada en 75
\mul de TED (Trasysol; EDTA (5000 KIU/ml: 1,2 mg/ml;
Diprotin-A), y la sangre se centrifugó a 14 k x g
durante 5 minutos y el plasma se almacenó a -70 antes del análisis.
El intestino delgado se retiró de la cavidad peritoneal, del píloro
al ciego, se pesó limpio y se midió. Con fines comparativos, se
obtuvieron las secciones de cada animal de la posición anatómica
idéntica. Se obtuvieron los fragmentos 8\pm2 cm, 18\pm2 cm,
32\pm2 cm cada uno con una medida de 1,5-2,0 cm de
longitud desde el píloro para la histomorfometría que representa el
jejuno proximal, jejuno distal e ileón distal. Cada fragmento de
intestino delgado fue abierto longitudinalmente por su borde
antimesentérico en un bloque de tejido y luego se colocó en
formalina del 10% (vol./vol.) durante la noche, luego se transfirió
a ETOH del 70%.
Para el análisis de micrometría y morfométrico,
y en particular para evaluar los efectos de GLP-2
sobre la altura de cripta/vellosidad, se cortaron secciones de 5
\mum de espesor y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Se
realizó la micrometría intestinal usando un microscopio con una
cámara de vídeo (Leitz, Wetzar, Alemania) conectado a un monitor de
ordenador. El microscopio se calibró con un aumento de 4x, 10x, 25x
y el mismo microscopio se usó para todas las evaluaciones. La
altura de cripta más vellosidad se midió examinando al menos 20
vellosidades longitudinalmente orientadas desde la base de la cripta
a la punta de la vellosidad de cada corte para el jejuno proximal y
distal e ileón distal y se expresó en \mum + S.E.M.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de los diversos análisis se
muestran en las figuras 1-7 y 9 que acompañan, y se
resumen más abajo con relación a aquellas Figuras:
Respuesta frente a la dosis: La figura 1
muestra la respuesta frente a GLP-2 de rata medida
como el peso del intestino delgado (BW-panel A) y
como la altura de cripta más vellosidad en jejuno proximal
(PJ-panel B), jejuno distal
(DJ-panel C) e ileón distal
(DI-panel D) como una función de la dosis de
GLP-2 de rata en una formulación de gelatina del
12% (es decir, GLP-2 en PBS) administrada s.c. El
péptido GLP-2 de rata se administró
subcutáneamente. Los resultados se expresan como el cambio en tanto
por ciento del control que recibe gelatina del 12% como vehículo
sólo. Los asteriscos denotan diferencias estadísticamente
significativas comparado con el control (*=p<0,005,
**=p<0,01, ***=p<0,001). Será apreciado a partir de los
resultados presentados en la figura 1 que la inyección del péptido
GLP-2 causa aumentos estadísticamente significativos
del peso del intestino delgado a una dosis de 1,0 a 5,0 \mug. El
efecto deseado en la altura de cripta más vellosidad se realiza a
una dosis tan baja como 0,25 \mug.
Efecto de la formulación: La figura 2
muestra los resultados obtenidos usando la formulación con gelatina
(G) o la formulación con PBS (PBS), cuando se administra s.c. a una
dosis de GLP-2 de 2,5 \mug dos veces al día. El
Panel A muestra las diferencias en efecto vistas en el peso del
intestino delgado en gramos, y el panel B muestra las diferencias
en efecto vistas en la altura de cripta más vellosidad en \mum
vistas para el jejuno proximal (PJ) y distal (DJ) e ileón distal
(DI). Será apreciado que ambos tipos de formulación produjeron un
aumento estadísticamente significativo. Probablemente debido a su
capacidad de liberar el GLP-2 de una manera más
sostenida desde el sitio de inyección, la formulación con gelatina
produjo una respuesta ligeramente mayor que la formulación con
PBS.
Efecto de la ruta de administración: La
figura 3 muestra el aumento del porcentaje en peso del intestino
(BW) cuando se inyecta GLP-2 de rata, a una dosis
de 2,5 \mug dos veces al día, subcutáneamente (SC),
intramuscularmente (IM) o intraperitonealmente (IP) en vehículo de
solución salina tamponada con fosfato. Se apreciará que se derivaba
una respuesta significativa frente al péptido GLP-2
independientemente de la ruta de administración seleccionada, con
relación a un grupo control que recibe s.c. la administración de
vehículo PBS solo. La inyección subcutánea proporcionó la mayor
respuesta.
Efecto de la frecuencia de
administración: La figura 4 muestra los resultados de una
evaluación del peso del intestino delgado y la altura de cripta más
vellosidad como una función de la frecuencia de administración de
GLP-2. El GLP-2 fue administrado
s.c. a la dosis mencionada, tanto cada doce horas (q12 h), como una
vez al día (qd) como una vez cada dos días (qod). Se apreciará a
partir de los resultados mostrados que todas las frecuencias de
administración produjeron un aumento significativo en el cambio en
tanto por ciento del peso del intestino delgado, con relación a un
grupo control que recibe PBS solo. El mayor aumento fue producido,
para el peso del intestino delgado y para la altura de cripta más
vellosidad, por el programa de medicación más frecuente, es decir,
cada 12 horas.
Efecto de la administración a largo
plazo: Se administró s.c. GLP-2 de rata en una
formulación de gelatina del 10% en una dosis individual de 5 \mug
una vez al día continuamente durante 4 semanas (panel A), durante 8
semanas (panel B) o durante 12 semanas (panel C). La figura 5
muestra los efectos mediados por GLP-2 en el peso
del intestino delgado (BW) y en las alturas de cripta más vellosidad
(PJ, DJ y DI) en grupos tratados (T), con relación a un control (C)
que recibía gelatina del 10% solo. Los resultados para el peso del
intestino delgado indican que el aumento del peso del intestino
delgado mediado por GLP-2 es inducido y sostenido
durante el tiempo examinado de administración, como aumenta la
altura de cripta/vellosidad del jejuno proximal. Se observó una
respuesta similar también para el jejuno distal. Todos los animales
se sometieron a una autopsia completa en el momento del sacrificio
y no se encontró ninguna anormalidad histológica en ninguno de los
animales.
Evaluación del curso de tiempo: La figura
6 presenta el cambio del porcentaje en el peso del intestino delgado
medido en ratones CD-1 hembra tratados
subcutáneamente con PBS solo (Control) o con 2,5 \mug de
GLP-2 de rata en PBS administrado dos veces al día
durante un número conocido de días consecutivos. Está claro a partir
de los resultados que se alcanza un resultado significativo después
del 4º día de administración, y que este efecto se mantiene con una
administración continuada. En otros estudios, está claro también que
el aumento del peso del intestino delgado alcanzado con la
administración de GLP-2 había retrocedido
aproximadamente 10 días después del tratamiento. Sin embargo, los
efectos de GLP-2 en la hiperplasia de las
vellosidades no retrocedieron completamente, en particular en los
ratones más viejos (de 24 meses) sugiriendo una velocidad más lenta
del recambio de tejido intestinal en estos receptores más viejos.
Por lo tanto, es apropiado poner a los receptores en un régimen de
medicación de mantenimiento durante la terapia con
GLP-2.
Género del receptor y evaluación de la
edad: La figura 7 muestra los resultados obtenidos con ratones
CD-1 emparejados por sexo tratados con 2,5 \mug
de GLP-2 dos veces al día a partir de 4 a 16 semanas
de edad, comparado con sus propios controles tanto para el peso del
intestino delgado como para la histología. Se apreciará a partir de
los resultados presentados que los efectos de GLP-2
en el intestino delgado se producen independientemente del género
del receptor. En un experimento relacionado, se evaluaron ratones
C57BLK hembra (Charles River, Estados Unidos) de 6 meses a 2 años
tratados con GLP-2 y se encontró que
GLP-2 era eficaz en la promoción del crecimiento
del intestino delgado en ratones de 6 meses a 2 años de edad.
Evaluación de los efectos de
GLP-2 en la longitud del intestino delgado: La
figura 9 muestra el efecto de la administración de
GLP-2 en la longitud del intestino delgado. Se
trataron ratones CD1 con PBS (Control) o GLP-2 de
rata (2,5 \mug dos veces al día) en PBS durante 10 días, después
de lo cual los ratones se sacrificaron y se midió en centímetros la
longitud del intestino delgado del estómago frente a la válvula
ileocecal.
\vskip1.000000\baselineskip
El agrandamiento de las vellosidades observado
en respuesta a GLP-2 puede generarse por un efecto
de GLP-2 sobre la proliferación de células o sobre
la inhibición de la senectud. Para examinar estas dos posibilidades,
se examinaron secciones de parafina del intestino delgado a partir
de tejidos estimulados y control para detectar el antígeno nuclear
de células proliferantes (PCNA), como una medida de la
proliferación, y para detectar células apoptóticas usando el método
TUNEL para el análisis de la apoptosis. Las velocidades de
proliferación en el jejuno proximal de ratones tratados con
GLP-2 aumentaron (124%) respecto a los ratones de
control (46,0 \pm 1,2% en control; 57 \pm 5,5% en tratado). En
ratones control, la proliferación se limitó al compartimento de
cripta del intestino delgado; las vellosidades no contenían células
PCNA-positivas. En el grupo tratado con
GLP-2, se detectaron células proliferantes en las
vellosidades, y en la unión del eje
cripta-vellosidad. Las velocidades apoptóticas en
el jejuno proximal de ratones tratados con GLP-2
disminuyeron respecto a los ratones control. Las células
apoptóticas en ratones control se encontraron principalmente en la
punta o el borde de las vellosidades; ninguna se encontró en el
compartimento de cripta del intestino. En los ratones tratados con
GLP-2, la distribución de células apoptóticas fue
similar, pero sus números fueron menores.
\vskip1.000000\baselineskip
Considerando los resultados observados con
GLP-2 de rata en receptores de ratones, se supuso
que varios homólogos vertebrados y análogos de
GLP-2 de rata también mediarían un efecto
intestinotrófico. Con este fin, se sintetizaron y evaluaron
diversos GLP-2 y análogos de GLP-2,
como se describe más abajo.
Se realizó a mano la síntesis de péptidos en
fase sólida (SPPS) en un recipiente de 300 mililitros (mL) sobre
una escala de 3 milimoles (mmol) usando 6 gramos (g) de resina de
clorometilo (Merrifield) (para los péptidos ácidos libres del
extremo C-terminal) con una sustitución de 0,5
miliequivalentes (meq) por gramo. Los aminoácidos se protegieron en
el extremo amino con el grupo t-butiloxicarbonilo
(tBoc). Las cadenas laterales de los aminoácidos fueron protegidas
con los grupos protectores de cadena lateral bencilo (Bz, para
serina y treonina), benciloximetilo (BOM, para histidina),
2-bromobenciloxicarbonilo (2-BrZ,
para tirosina), 2-clorobenciloxicarbonilo
(2-ClZ, para lisina), ciclohexilo (cHex, para los
ácidos aspártico y glutámico) y tosilo (Ts, para arginina) y resina
de clorometilo (Merrifield). El primer aminoácido fue conectado a la
resina de clorometilo por esterificación del aminoácido protegido
en presencia de fluoruro de potasio (KF). Los péptidos de amida del
extremo C-terminal se sintetizaron en una resina de
4-metilbenzhidrilamina (MBHA) sobre una escala de 3
mmol usando 6 g de resina con una sustitución de 0,5
miliequivalentes/g. El primer aminoácido fue conectado a la resina
de MBHA según el procedimiento descrito para el alargamiento de
péptidos.
La desprotección del grupo amino se realizó
usando ácido trifluoroacético al 50% (TFA) en CH_{2}Cl_{2},
seguido de la neutralización usando dos lavados de trietilamina al
10% (Et_{3}N) en CH_{2}Cl_{2}. El alargamiento del péptido se
realizó usando
N,N-diciclohexilcarbodiimida/1-hidroxibenzotriazol
(DCC/HOBt) en CH_{2}Cl_{2}/dimetilformamida (DMF). El
crecimiento de la cadena peptídica se terminó después de cada etapa
de alargamiento con anhídrido acético al 20% (Ac_{2}O) en
diclorometano (CH_{2}Cl_{2}). La resina-péptido
se lavó después de cada alargamiento, terminación y etapa de
desprotección con isopropanol (iPrOH) y metanol (MeOH). Se repitió
el lavado una vez. Se prepararon péptidos de acetilo del extremo
N-terminal por acetilación del grupo
amino-terminal con Ac_{2}O del 20% en
CH_{2}Cl_{2}. Los productos unidos a la resina se separaron
rutinariamente por un procedimiento bajo-alto usando
fluoruro de hidrógeno (HF) conteniendo dimetilsulfuro (DMS) y
p-cresol como secuestrantes.
Los péptidos a granel fueron purificados por
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) usando una columna
de sílice de fase inversa C18 de Vydac, 15-20 \mum
de tamaño de poro, 2 pulgadas x 12 pulgadas, usando un gradiente de
dilución con TFA del 0,1% en agua modificado con acetonitrilo. La
dilución se monitorizó a 220 nanómetros (nm). Cada fracción
recuperada se analizó según su pureza por HPLC analítico usando una
columna de sílice de fase inversa C18 de Vydac, 5 \mum, 4,6 x 254
milímetros (mm), por gradiente de dilución con TFA del 0,1% en agua
modificado con acetonitrilo, y monotorizado a 215 nm. Las fracciones
que se manifestaron con una pureza mayor del 95% se combinaron y
liofilizaron. Las sales de acetato de los péptidos se prepararon a
partir de las sales de TFA por disolución del polvo liofilizado en
agua, con la adición de acetonitrilo para ayudar a la disolución
cuando era necesario. La disolución se pasó por una resina de
intercambio catiónico Bio-Rex 70 protonada. La
resina se lavó con 5 volúmenes de lecho de agua, y el péptido unido
a la resina se diluyó con ácido acético del 50% en agua. La fase
móvil se diluyó con agua y se liofilizó.
El polvo liofilizado final se analizó según su
pureza por dos métodos analíticos de HPLC de fase inversa usando
una columna de sílice de fase inversa, columna C18 de Vydac, 5
\mum, 4,6 x 254 mm. Los dos sistemas disolventes usados fueron un
gradiente de agua ajustada a pH 2,25 con fosfato de trietilamina,
modificado con acetonitrilo, y un gradiente de TFA del 0,1% en
agua, modificado con acetonitrilo. La fase móvil de la columna se
monitorizó a 215 nm. La identidad de cada producto se confirmó por
el análisis de los aminoácidos y por espectrometría de masas por
electropulverización.
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante este método, se produjeron los
siguientes GLP-2 o análogos de
GLP-2, como acetatos:
a) GLP-2 de rata de SEQ ID NO:
3;
b) GLP-2 de rata de
N-acetilo, cuyo extremo amino de
GLP-2 de rata se bloqueó con un grupo acetilo;
c) GLP-2 de rata [Arg^{+1}],
que es GLP-2 de rata modificado con un residuo Arg
adicional en el extremo amino;
d) GLP-2 de rata
C-amido, que es GLP-2 de rata con un
grupo amido añadido al extremo carboxilo (la disolución de 1 mg fue
conseguida en ácido acético del 1% (110 \mul), neutralizada con
450 \mul de NaOH 5N);
e) GLP-2 de rata
[Arg^{+1,+2}], que es GLP-2 de rata modificado por
dos residuos Arg adicionales presentes en el extremo amino;
f) GLP-2 humano [Arg^{+34}],
que es GLP-2 humano con un residuo Arg añadido
después del residuo 33; y
g) GLP-2 de degú.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos péptidos eran totalmente solubles en agua
a temperatura ambiente a menos que se indique otra cosa.
El efecto intestinotrófico de estos
GLP-2 y análogos de GLP-2 se evaluó
de la manera descrita en el Ejemplo 2. En particular, los péptidos
se formularon en PBS a una dosis de 2,5 \mug por inyección de 0,5
ml, y se administraron subcutáneamente a ratones
CD-1 hembra cada 12 horas durante 10 ó 14 días. El
peso del intestino y la altura de cripta y vellosidad se compararon
frente a ratones tratados de ensayo (PBS solo).
Los resultados de estos experimentos se
presentan en la figura 8. Los péptidos que fueron modificados a
partir de GLP-2 por la adición de grupos químicos
al extremo amino, expresamente
[N-acetil]-GLP-2, o
contenían el (los) aminoácido(s) adicional(es) al
extremo N-terminal,
[Arg^{+1}]-GLP-2, o al extremo
carboxilo, tal como
[Arg^{+34}]-GLP-2, causaron
derivados de GLP-2 que todavía mostraban propiedades
del factor de crecimiento del intestino delgado in vivo,
como se demuestra por su eficacia en la promoción del crecimiento
del intestino delgado y el aumento de la altura de cripta más
vellosidad (comparado con los controles tratados con solución
salina) en un experimento de 14 días en ratones (figura 8, paneles
A-F). Además, pueden prepararse moléculas
relacionadas con GLP-2 con propiedades eficaces del
tipo factor de crecimiento del intestino delgado utilizando la
información sacada de las secuencias de moléculas del tipo
GLP-2 relacionadas a partir de diversas especies.
Por ejemplo, la secuencia de GLP-2 de degú también
muestra actividad del tipo factor de crecimiento del intestino
delgado en un experimento de 10 días en ratones, con un aumento del
peso del intestino delgado casi comparable al conseguido con
GLP-2 de rata (ambos péptidos administrados
subcutáneamente a 2,5 \mug dos veces al día). Estos datos
demuestran que estas modificaciones de la estructura del péptido
GLP-2, como se ilustra en este documento, originan
moléculas que muestran propiedades del tipo GLP-2
natural in vivo. En contraste, cuando se modificaba la
región del extremo carboxilo-terminal de la molécula
por la adición de un grupo amino bloqueante,
[C-amido]-GLP-2, el
péptido resultante no mostraba una actividad biológica significativa
de GLP-2 in vivo (figuras
8C-D).
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Drucker, Daniel J.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PÉPTIDO-2 TIPO GLUCAGÓN Y SU USO TERAPÉUTICO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Pennie y Edmonds
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1155 Avenue of the Americas
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Nueva York
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Nueva York
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 10036-2711
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA INFORMÁTICA LEGIBLE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: ordenador personal compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE CONTACTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (202) 638-5000
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (202) 638-4810
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- PROPIEDAD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 13
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota = "UN AMINOÁCIDO NEUTRO/POLAR/GRANDE/NO AROMÁTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- PROPIEDAD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 16
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota = "UN AMINOÁCIDO NEUTRO/POLAR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- PROPIEDAD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 19
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "UN AMINOÁCIDO NEUTRO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- PROPIEDAD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 20
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota = "UN AMINOÁCIDO NEUTRO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- PROPIEDAD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 27
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota = "UN AMINOÁCIDO NEUTRO/POLAR/GRANDE/NO AROMÁTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- PROPIEDAD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 28
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota = "UN AMINOÁCIDO NEUTRO O BÁSICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- PROPIEDAD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 34
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota = "UN AMINOÁCIDO SELECCIONADO DE ARG, LYS O UNA CADENA ARG-LYS"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm8
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- PROPIEDAD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 19
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota = "UN AMINOÁCIDO NEUTRO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- PROPIEDAD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 34
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota = "UN AMINOÁCIDO SELECCIONADO DE ARC, LYS O LA CADENA ARG-LYS"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm9
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm10
Claims (39)
1. Una composición farmacéutica, que comprende
un péptido GLP-2 seleccionado entre un
GLP-2 de vertebrado intestinotrófico o un
GLP-2 de vertebrado intestinotrófico que se
diferencia del GLP-2 de vertebrado natural porque
incorpora al menos una adición o sustitución de aminoácido o un
aminoácido con un grupo bloqueante de aminoácido del extremo C- o
N-terminal, y un vehículo farmacéuticamente
aceptable,
en el que el péptido GLP-2 tiene
la fórmula:
en la que aa1, aa2, aa3, aa4, aa5,
y aa6 se refiere a cualquier residuo de aminoácido, a excepción de
que aa2 no sea His y aa4 no sea Lys,
y:
X sea uno o dos aminoácidos seleccionados de
His, Arg, y Lys;
Y sea uno o dos aminoácidos seleccionados de
His, Arg, y Lys;
m sea 0 ó 1;
n sea 0 ó 1;
R1 sea H o un grupo bloqueante del extremo
N-terminal; y
R2 sea OH o un grupo bloqueante del extremo
C-terminal.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1, en la que la composición comprende
GLP-2 de vertebrado intestinotrófico que se
diferencia de GLP-2 de vertebrado natural porque
incorpora al menos una sustitución de aminoácido.
3. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 1 ó 2, en la que dicha composición está libre de
pirógenos.
4. Una composición farmacéutica según cualquier
reivindicación 1 precedente, en la que dicha composición se filtra
de modo estéril.
\vskip1.000000\baselineskip
5. La composición farmacéutica según cualquier
reivindicación precedente, en la que:
aa1 se selecciona de Met, Leu, Ile, Val y
Cys;
aa2 se selecciona de Ala, Ser, Thr, Pro, Gly,
Asn, Asp, Glu y Gln;
aa3 se selecciona de Ala, Ser, Thr, Pro y
Gly;
aa4 se selecciona de His y Arg;
aa5 se selecciona de Met, Leu, Ile, Val y Cys;
y
aa6 se selecciona de Asn, Asp, Glu, Gln, His,
Arg y Lys.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 5, en la que el péptido GLP-2 tiene
la secuencia de aminoácidos:
7. Una composición farmacéutica según las
reivindicaciones 1, 3 ó 4, en la que el péptido
GLP-2 es GLP-2 de vertebrado.
8. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 7, en la que el péptido GLP-2 es
GLP-2 de mamífero.
9. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 8, en la que el GLP-2 es
GLP-2 de rata.
10. Una composición farmacéutica según las
reivindicaciones 1, 3 ó 4 en la que GLP-2 es
GLP-2 de humano o GLP-2 de humano
intestinotrófico que incorpora, con relación al
GLP-2 de humano natural, al menos una adición o
sustitución de aminoácido o un grupo bloqueante del extremo
C-terminal o N-terminal.
11. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 10, en la que GLP-2 de humano
intestinotrófico incorpora, con relación a GLP-2 de
humano natural, al menos una sustitución de aminoácido.
12. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 10, en la que el péptido GLP-2 es
GLP-2 de humano.
13. Una composición farmacéutica según cualquier
reivindicación precedente, en la forma de un líquido adecuado para
la administración por inyección o infusión.
14. Una composición farmacéutica según cualquier
reivindicación precedente, formulada para causar la liberación
lenta de dicho péptido GLP-2 después de su
administración.
15. Una composición farmacéutica según cualquier
reivindicación precedente, formulada para administración oral.
16. Una composición farmacéutica según cualquier
reivindicación precedente, en la que GLP-2 está
presente en una cantidad eficaz para promover el crecimiento del
tejido gastrointestinal.
17. Una composición farmacéutica según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que el péptido
GLP-2 está presente en una cantidad eficaz para
promover el crecimiento de islotes pancreáticos.
18. Una sal de adición de ácido
farmacéuticamente aceptable de un péptido GLP-2 como
se define en la reivindicación 1.
19. Una sal de adición de ácido
farmacéuticamente aceptable de un péptido GLP-2
según la reivindicación 18, en la que dicho péptido
GLP-2 es un péptido GLP-2 de
mamífero.
20. Una sal de adición de ácido
farmacéuticamente aceptable de un péptido GLP-2
según la reivindicación 19, en la que dicho péptido
GLP-2 es GLP-2 de humano.
\vskip1.000000\baselineskip
21. Un método útil para identificar nuevos
péptidos intestinotróficos, que comprende las etapas de:
- a)
- obtener un péptido GLP-2 de vertebrado intestinotrófico que tiene al menos una sustitución de aminoácido, o un aminoácido con un grupo bloqueante; y
- b)
- tratar a un mamífero con dicho análogo usando un régimen capaz de generar un efecto intestinotrófico cuando se utiliza para GLP-2 de rata; y
- c)
- determinar el efecto de dicho péptido GLP-2 de vertebrado intestinotrófico sobre el peso del intestino delgado y/o sobre la altura de cripta más vellosidad y/o el tamaño de los islotes pancreáticos con relación a un mamífero control tratado de ensayo, por el cual dicho péptido intestinotrófico se identifica como uno que produce un aumento de dicho peso y/o dicha altura y/o dicho tamaño.
\vskip1.000000\baselineskip
22. El uso de un péptido GLP-2
para fabricar una composición farmacéutica según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16 para promover el crecimiento de tejido
gastrointestinal.
23. El uso de un péptido GLP-2
para fabricar una composición farmacéutica según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16 para promover el crecimiento y/o función
del tejido del intestino delgado.
24. El uso de un péptido GLP-2
para fabricar una composición farmacéutica según cualquiera de
reivindicaciones 1 a 16 para la profilaxis o el tratamiento de una
afección, desorden o enfermedad gastrointestinal.
25. El uso de un péptido GLP-2
para fabricar una composición farmacéutica según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16 para el tratamiento de una enfermedad,
desorden, o afección gastrointestinal seleccionada del grupo que
consiste en úlceras, desórdenes de la digestión, síndromes de
malabsorción, síndrome del intestino corto, síndrome
cui-de-sac, enfermedad inflamatoria
del intestino, esprúe celiaco, esprúe tropical, esprúe
hipogammaglobulinémico, enteritis, enteritis regional (enfermedad
de Crohn), daño del intestino delgado debido a agentes tóxicos u
otros agentes quimioterapéuticos y síndrome del intestino corto.
\newpage
26. El uso de un péptido GLP-2
para fabricar una composición farmacéutica según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16 para el tratamiento del síndrome del
intestino corto.
27. El uso de un péptido GLP-2
para fabricar una composición farmacéutica según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, para la profilaxis de una afección
gastrointestinal seleccionada del grupo que consiste en enteritis
por radiación, enteritis infecciosa o
post-infecciosa, enteritis regional (enfermedad de
Crohn), daño del intestino delgado debido a agentes tóxicos u otros
agentes quimioterapéuticos y síndrome del intestino corto.
28. El uso de un péptido GLP-2
para fabricar una composición farmacéutica según cualquiera de
reivindicaciones 1 a 16 para la profilaxis del daño del intestino
delgado debido a agentes quimioterapéuticos.
29. El uso de un péptido GLP-2
para la preparación de una composición farmacéutica según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 15 y 17 para promover el crecimiento de
islotes pancreáticos.
30. El uso de un péptido GLP-2
para la preparación de una composición farmacéutica según la
reivindicación 17 para tratar la diabetes.
31. El uso de un péptido GLP-2
según cualquiera de las reivindicaciones 22-30, en
el que la composición farmacéutica es para ser administrada a seres
humanos.
32. El uso de un péptido GLP-2
según cualquiera de las reivindicaciones 22-31, en
el que el péptido GLP-2 debe ser administrado en
una dosis de aproximadamente 100 \mug/kg/día a 1 mg/kg/día.
33. Un péptido GLP-2 que tiene
actividad intestinotrófica y que incorpora, con relación a
GLP-2 de vertebrado, al menos una adición o
sustitución de aminoácido o un grupo bloqueante del extremo
C-terminal o N-terminal,
en el que el péptido GLP-2 tiene
la fórmula:
en el que aa1, aa2, aa3, aa4, aa5,
y aa6 se refiere a cualquier residuo de aminoácido, a excepción de
que aa4 no sea Lys,
y:
X sea uno o dos aminoácidos seleccionados de
His, Arg, y Lys;
Y sea uno o dos aminoácidos seleccionados de
His, Arg, y Lys;
m sea 0 ó 1;
n sea 0 ó 1;
R1 sea H o un grupo bloqueante del extremo
N-terminal; y
R2 sea OH o un grupo bloqueante del extremo
C-terminal.
\vskip1.000000\baselineskip
34. El péptido GLP-2 de la
reivindicación 33, que incorpora con relación a
GLP-2 de vertebrado, al menos una sustitución de
aminoácido.
35. Un péptido GLP-2 según la
reivindicación 33 ó 34, en el que GLP-2 de
vertebrado es GLP-2 de mamífero.
36. Un análogo de péptido GLP-2
según la reivindicación 35, en el que GLP-2 de
mamífero es GLP-2 de humano.
37. Un envase que comprende un vial relleno de
un modo estéril o ampolla que contiene una composición farmacéutica
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en una cantidad que
promueve el crecimiento de tejido en dosis unitaria o en cantidades
multidosis, en el que el envase incorpora una etiqueta que instruye
sobre el uso de su contenido para estimular tanto el crecimiento
del intestino delgado como la proliferación y el aumento de células
de islotes pancreáticos.
38. Una composición farmacéutica que comprende
una sal farmacéuticamente aceptable de un GLP-2
según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
39. Un GLP-2 natural en
vertebrados para su uso como un medicamento.
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