ES2334948T3 - Aparato y metodo para monitorizar cultivos. - Google Patents

Abstract

Un dispositivo exclusor de burbujas adaptado para uso con, y unido a, una sonda para la medición continua de la densidad celular de un cultivo en un medio líquido en un fermentador aireado, comprendiendo el dispositivo exclusor de burbujas una entrada y una salida para permitir el flujo de líquido a través del dispositivo, teniendo la entrada un conducto que, en uso, es sustancialmente vertical, comprendiendo el conducto un medio de exclusión de burbujas que crea una trayectoria de flujo en serpentín dentro del conducto, sirviendo el medio de exclusión de burbujas para reducir o evitar el ingreso de burbujas desde el medio líquido fuera del dispositivo.

Description

Aparato y método para monitorizar cultivos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un aparato para, y a un método para, la monitorización continua de la densidad celular de un cultivo celular en un fermentador aireado.

Antecedentes de la invención

El proceso de fermentación aerobia proporciona un mecanismo importante para la formación de ciertos productos, tales como enzimas, antibióticos, agentes de diagnóstico y terapéuticos. Tales productos se producen típicamente mediante la sobreexpresión de una proteína en células de un microorganismo, tal como E. coli o S. cerevisiae.

A escala de laboratorio, tales sustancias de interés se producen típicamente preparando un fermento, el cual se usa entonces para inocular un volumen más grande de medio de cultivo. Típicamente, el medio de cultivo está contenido en un matraz cónico, y se coloca en una incubadora a una temperatura deseada. El crecimiento de células en el medio de cultivo se monitoriza mediante la toma intermitente de muestras de pequeñas cantidades del cultivo y midiendo la densidad óptica del medio de cultivo con el uso de un espectrofotómetro externo. A título de explicación, la medida de la densidad óptica a aproximadamente 600 nm detecta la dispersión de la luz por microorganismos, y la lectura de la OD resultante es proporcional a la densidad celular. Las células crecen y se dividen, y, típicamente, cuando la densidad óptica del cultivo ha alcanzado un valor deseado, se induce la sobreexpresión de una proteína de interés, por ejemplo mediante un cambio en la temperatura o la adición de un inductor, etc.

La fermentación aerobia se lleva a cabo de forma habitual a escala industrial en tanques agitados. Típicamente, se usa una sonda óptica para medir la densidad óptica del medio de cultivo según la ley de Beer Lambert, que se define mediante la siguiente ecuación:

OD = E.L. log_{10} (I_{0}/I)

en la que

E = Coeficiente de extinción;

L = Longitud de la trayectoria de la celda;

I_{0} = Intensidad de la luz incidente;

I = Intensidad de la luz transmitida.

En fermentaciones a escala industrial, normalmente se requiere una agitación vigorosa y aireación a fin de mantener el crecimiento óptimo de los microorganismos o células debido a que necesitan respirar. En tales condiciones, tanto como un quinto del volumen líquido aireado global del medio de cultivo puede comprender burbujas de gas dispersas en el líquido. Un buen mezclamiento del líquido del medio aireado significa que muchas de estas burbujas de gas son suficientemente pequeñas para pasar a través del recorrido de la luz de la sonda óptica usada para medir la densidad celular del cultivo. La presencia de burbujas de gas en el medio de cultivo puede tener un efecto sobre la densidad celular aparente del medio, debido a que las burbujas de gas tienen diferentes propiedades dispersoras de la luz en comparación con el medio de cultivo y las células suspendidas en él. La dispersión de la luz por las burbujas en el medio tiende a provocar una sobreestimación de la densidad óptica aparente del medio. En particular, a bajas densidades celulares (en las que la relación de burbujas de gas a células es la más grande), la naturaleza al azar del tamaño y concentración de las burbujas de gas en el punto de medida en el tanque agitado da como resultado "ruido", que se muestra como dispersión de datos en las medidas de densidad celular. Para algunas aplicaciones, tales como el marcado de fluorescencia, esto es un problema, puesto que en tales casos es necesario detectar cambios muy pequeños en la absorbancia, a valores que están más allá del nivel estándar de precisión. Además, la velocidad de aireación y agitación pueden variar durante la fermentación, de forma que el efecto de las burbujas sobre las medidas realizadas también es variable.

Aunque se pueden usar otros métodos para monitorizar el crecimiento de microorganismos durante la fermentación aerobia (tales como la medida de la velocidad de producción de dióxido de carbono, la velocidad de consumo de oxígeno, o la fluorescencia), el método preferido implica la medición de la densidad celular de un cultivo debido a que es menos sensible a las condiciones del cultivo, tales como temperatura y pH. En la mayoría de los casos, la medida de la densidad óptica del cultivo se lleva a cabo "fuera de línea", usando un espectofotómetro, típicamente en la región de 600 nm. A título de explicación, la medición "fuera de línea" de la densidad óptica de un cultivo implica retirar una muestra del medio y medir la densidad óptica de la muestra usando un espectofotómetro externo. Sin embargo, tal medición "fuera de línea" tiene típicamente las desventajas de que puede incrementar el tiempo, coste y pérdida de volumen del cultivo, y también incrementa el riesgo de contaminación del fermentador. Además, usando métodos convencionales, la densidad celular de un cultivo sólo se puede medir directamente de forma exacta para valores por debajo de 0,8, preferiblemente por debajo de 0,7 unidades de densidad óptica (OD). Esto es debido al hecho de que, por encima de estos valores, la relación entre la densidad celular y la densidad óptica ya no es lineal. A fin de medir valores de OD por encima de 0,7-0,8, las muestras se deben de diluir, y las medidas resultantes se deben de multiplicar por un factor de dilución, de forma que el valor de OD no supere 0,8 unidades, y preferiblemente no supere 0,7 unidades. Sin embargo, tal dilución puede introducir errores en la determinación de la densidad celular, y hace imposible las mediciones en línea de la OD.

A título de explicación, la medición "en línea" de la densidad óptica de un cultivo implica el uso de una sonda in situ sumergida en un medio de cultivo, para monitorizar cambios en la densidad celular de un cultivo durante la fermentación. Sin embargo, tales métodos tienen la complicación añadida de que se deben de eliminar las burbujas de aire del medio de cultivo antes de la medición, a fin de producir una determinación exacta y fiable de la densidad óptica. De este modo, tales métodos requieren típicamente la adición de un dispositivo separado para desgasificar el medio, y consiguientemente no proporcionan un método para una medición continua de la densidad óptica del medio.

El uso de una sonda en línea para monitorizar cambios de concentración en un cultivo es conocido en la técnica.

Shiloach y Bahar (Sexto Congreso Europeo en Biotecnología, Florencia, Italia, 1993) describen el uso de un sensor en línea (Cerex Corporation), esterilizable, que es capaz de seguir cambios en la turbidez del cultivo. La sonda se basa en la emisión de luz de un cultivo, y proporciona una buena correlación con las medidas de la turbidez fuera de línea. La sonda se puede conectar por medio de una interfaz a un sistema de control y adquisición de datos, de forma que pueda proporcionar medidas directas durante el proceso de fermentación. Durante el funcionamiento de la sonda, un émbolo de teflón con un imán embebido se mueve ascendente y descendentemente como resultado de un campo magnético alterno. El movimiento del émbolo permite que el medio de cultivo fluya al interior de una cámara de toma de muestras dispuesta en la sonda, y facilita la eliminación de las burbujas de aire del medio de cultivo. Típicamente, el movimiento del émbolo es cíclico, de forma que está abierto durante un minuto y cerrado durante un minuto, proporcionando un nuevo valor de la densidad óptica cada dos minutos. De este modo, aunque el sensor en línea salva el requisito asociado con los sistemas fuera de línea en los que se retira una muestra de medio de cultivo del fermentador a fin de medir externamente la densidad óptica usando un espectofotómetro, la sonda descrita por Shiloach y Bahar no permite la medición continua de la densidad óptica.

Combs y Bishop (Encuentro Anual de la Sociedad para la Microbiología Industrial, Toronto, Canadá, 1993) describen el uso de una sonda en línea similar (Cerex Corporation) para medir la densidad óptica de un cultivo durante la fermentación. Durante el funcionamiento de la sonda, se abre un solenoide, el medio de cultivo entra en la cámara de toma de muestras, se cierra una válvula para eliminar las burbujas del cultivo a través de un puerto vertical, y se mide la densidad óptica de la muestra. De este modo, el funcionamiento de la sonda requiere la apertura y cierre de una válvula, de forma que la medición en línea de la densidad óptica del medio no es continua.

El documento US-A-4725148 describe un medio de exclusión de burbujas colocado en la entrada de un conducto. El medio de exclusión de burbujas comprende una red metálica, y se puede usar en un fermentador aireado.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la invención proporciona un dispositivo exclusor de burbujas adaptado para uso con, y para unirse a, una sonda para la medición continua de la densidad celular de un cultivo en un medio líquido en un fermentador aireado, comprendiendo el dispositivo exclusor de burbujas una entrada y una salida para permitir el flujo de líquido a través del dispositivo; y un medio de exclusión de burbujas para reducir o prevenir el ingreso de burbujas desde el medio líquido fuera del dispositivo. La entrada tiene un conducto que, en uso, es sustancialmente vertical, y comprende un medio de exclusión de burbujas que crea en el conducto una trayectoria en serpentín.

Convenientemente, el dispositivo comprenderá un manguito que se ajusta alrededor de la sonda, permitiendo la entrada y la salida que el medio líquido se comunique con la sonda y, más especialmente, con una abertura para toma de muestras de la sonda. La entrada y la salida se pueden proporcionar con un canal compartido o común en el dispositivo, o, más preferiblemente, pueden ser componentes discretos en diferentes localizaciones en el dispositivo.

El medio de exclusión de burbujas puede comprender, por ejemplo, una válvula unidireccional u otro mecanismo de restricción del flujo. Preferiblemente, el medio de exclusión de burbujas comprende una pluralidad de deflectores, o placas perforadas, u otro mecanismo para forzar una trayectoria en serpentín. El medio de exclusión de burbujas puede estar localizado convenientemente en la entrada y/o la salida del dispositivo exclusor de burbujas. El medio de exclusión de burbujas puede funcionar para excluir burbujas en base al tamaño, o a la flotabilidad relativa de las burbujas (con relación al líquido del medio de cultivo), o tanto al tamaño como a la flotabilidad. En una realización preferida, el dispositivo comprende un canal con un área de sección transversal que es más pequeña que el diámetro de la mayoría de las burbujas en el medio líquido, las cuales por lo tanto serán excluidas del canal.

El dispositivo exclusor de burbujas comprende un conducto, conducto el cual comprende un medio de exclusión de burbujas. El medio de exclusión de burbujas comprende una característica o características estructurales que crean una trayectoria en serpentín dentro del conducto. Por ejemplo, una trayectoria en serpentín dentro del conducto se puede crear mediante una pluralidad de deflectores que solapan o placas perforadas.

Cada placa perforada puede comprender una única o unas pocas perforaciones relativamente grandes, o puede comprender una pluralidad (digamos cinco o más) de perforaciones relativamente pequeñas. Cuando se proporciona un número grande de perforaciones, cada perforación será bastante pequeña, de forma que la mayoría de las burbujas presentes en el medio líquido sean incapaces de pasar a través de las placas perforadas (obsérvese que, en tal realización, no es necesario que la trayectoria sea en serpentín) - el gran número de perforaciones permite no obstante sólo una modesta resistencia a que el líquido fluya. Cuando se proporcionan sólo una o dos perforaciones en cada placa, necesariamente deben tener un tamaño relativamente grande (por ejemplo un orificio circular de 4-6 mm de diámetro), a fin de no restringir de forma importante el flujo de líquido, y preferiblemente están situadas en lados alternos de placas sucesivas, a fin de crear una trayectoria en serpentín.

El conducto constituye la entrada del dispositivo exclusor de burbujas, pero la dirección del flujo de líquido a través del dispositivo puede variar según las condiciones localizadas en el fermentador, de forma que el conducto puede actuar ocasionalmente como la salida del líquido, o incluso simultáneamente como una salida y una entrada.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un dispositivo exclusor de burbujas según el primer aspecto de la invención, en combinación con una sonda para la medición continua de la densidad celular de un cultivo, comprendiendo la sonda una abertura para toma de muestras expuesta al cultivo dentro del dispositivo exclusor de burbujas, para permitir que la sonda mida una característica del cultivo.

En una realización preferida, la combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda de la presente invención permite la medición en línea de la densidad celular de un cultivo.

Según la presente invención, la expresión "en línea" se refiere a una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda que está en comunicación fluida continua con el medio de cultivo. En una realización, la combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda se proporciona in situ, es decir, en el fermentador. En otra realización, la combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda se proporciona fuera del fermentador, pero está en comunicación fluida continua con el medio de cultivo por medio de, por ejemplo, una tubería, un tubo u otro canal de flujo del fluido.

La expresión "fuera de línea" se refiere a la medición intermitente de la densidad celular de un cultivo. La provisión de un conducto y un medio de entrada elimina el requisito asociado con la técnica anterior, en el que el medio de cultivo se debe de desgasificar antes de medir la densidad celular. De este modo, la presente invención permite ventajosamente la medición continua de la densidad celular de un cultivo durante la fermentación.

Típicamente, la medición de la densidad celular del medio de cultivo se puede hacer tomando una lectura directa de la transmitancia del cultivo, o calculando un valor de la densidad óptica.

Según la presente invención, la combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda se puede usar para medir una característica de un cultivo, tal como la resistencia o conductividad eléctrica. Preferiblemente, la característica del cultivo que se mide es una característica óptica. Más preferiblemente, la característica medida es la densidad óptica de un cultivo, tal como la densidad óptica de un cultivo en el intervalo de 500-700 nm. Lo más preferible, la característica medida es la densidad óptica de un cultivo que es aproximadamente 600 nm, o es el color o la fluorescencia de una proteína expresada por las células que se cultivan en el fermentador. Sin embargo, la medición de la densidad óptica de un cultivo no está restringida al intervalo de 500-700 nm, y la combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda de la presente invención se puede usar para medir la densidad óptica de un cultivo a lo largo de una banda completa de ondas de un espectofotómetro, incluyendo la medición en el intervalo de UV.

Preferiblemente, la sonda que se puede usar en combinación con el dispositivo exclusor de burbujas de la presente invención es una sonda óptica. Más preferiblemente, la sonda de la presente invención usa fibra óptica para medir la densidad óptica del medio de cultivo a una o más longitudes de onda seleccionadas. Típicamente, se coloca un tubo o manguito alrededor de las fibras ópticas de la sonda óptica. Lo más preferible, la sonda óptica comprende dos fibras ópticas paralelas que forman una trayectoria de la luz y transmiten la luz en direcciones opuestas. En una realización, la trayectoria de la luz pasa a través de la abertura para toma de muestras y es reflejada, por ejemplo, por medio de dos prismas dispuestos al final de la sonda óptica, de forma que se invierte la dirección de la trayectoria de la luz.

En una realización, un espectofotómetro se acopla a la sonda óptica, por ejemplo por medio de fibras ópticas. El espectofotómetro mide la densidad óptica del medio de cultivo a una longitud de onda deseada, o un intervalo de longitudes de onda. La sonda que se puede usar en combinación con el dispositivo exclusor de burbujas de la presente invención permite que se realicen mediciones continuas de la densidad óptica por el espectofotómetro. Se prefiere la unión directa del espectofotómetro a la combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda, puesto que esto evita la necesidad de fibras ópticas externas para conectar la sonda al espectofotómetro.

Preferiblemente, se proporciona una abertura para toma de muestras dentro de la trayectoria de la luz de la sonda óptica. Más preferiblemente, el medio de cultivo está continuamente en comunicación fluida con la abertura para toma de muestras, a fin de permitir la medición continua de la densidad óptica del medio de cultivo.

En una realización, la sonda óptica usa una trayectoria de la luz de 2 mm. En una realización preferida, la sonda óptica usa una trayectoria de la luz de 1 mm. Ventajosamente, el uso de una trayectoria de la luz de 1 mm facilita la exclusión de las burbujas de gas de la abertura para toma de muestras. La presencia de burbujas de gas en el medio de cultivo puede tener un efecto sobre la densidad celular aparente del medio de cultivo, debido a que las burbujas de gas dispersan la luz y sustituyen a las células. De este modo, el uso de una trayectoria de la luz de 1 mm mejora la exactitud de la medición de la densidad celular, y permite una medición lineal del crecimiento de un cultivo a mayores densidades celulares. Generalmente, una trayectoria corta de la luz incrementa la sensibilidad de las mediciones hechas a mayores densidades celulares.

De forma conveniente, la combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda de la invención se obtiene uniendo un dispositivo exclusor de burbujas adecuado a una sonda adecuada. La sonda puede ser, por ejemplo, una sonda óptica de otro modo convencional, o sustancialmente convencional, adecuada para medir densidad celular, del tipo conocido en la técnica anterior. Típicamente, la combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda se obtiene deslizando un manguito del dispositivo exclusor de burbujas sobre una sonda. Preferiblemente, se forma un canal entre la salida y la entrada del dispositivo exclusor de burbujas, de forma que el canal esté sustancialmente en línea con la abertura para toma de muestras de la sonda. Más preferiblemente, las dimensiones del dispositivo exclusor de burbujas son tales que, cuando se conecta a la sonda, se forma una trayectoria, que es sustancialmente lineal desde la entrada del dispositivo exclusor de burbujas, y trayectoria la cual fluye a través de la abertura para toma de muestras de la sonda. De forma conveniente, las dimensiones del dispositivo exclusor de burbujas son tales que, cuando la sonda está situada tan lejos como sea posible dentro del manguito, esto provoca la colocación relativa correcta del dispositivo exclusor de burbujas y la sonda. En una realización, medios de acoplamiento forzado, dispuestos dentro de un canal presente en el dispositivo exclusor de burbujas, son admitidos dentro de un rebaje conformado y dimensionado correspondientemente dentro de la sonda cuando el dispositivo exclusor de burbujas y la sonda están alineados en la posición correcta. Típicamente, la inserción de la sonda comprime un muelle dispuesto dentro del canal del dispositivo exclusor de burbujas. Al lograr una posición en la que el conducto, la entrada y la abertura para toma de muestras están alineados de forma que la trayectoria del fluido es sustancialmente lineal, los medios de acoplamiento forzado son forzados a acoplarse con el rebaje conformado y dimensionado correspondientemente en la sonda.

Preferiblemente, todas las partes del dispositivo exclusor de burbujas (y preferiblemente de cualquier sonda asociada) son biocompatibles, y son capaces de soportar las condiciones de esterilización en el lugar. Más preferiblemente, los componentes metálicos del dispositivo exclusor de burbujas comprenden acero inoxidable.

Preferiblemente, un manguito del exclusor de burbujas está unido a la superficie externa del cuerpo de una sonda. El dispositivo exclusor de burbujas se une a la sonda de forma que el conducto in situ es sustancialmente vertical, de forma que cualesquiera burbujas de gas (que son menos densas que el medio de cultivo) tenderán a elevarse por el conducto, lejos de la abertura para toma de muestras. Lo más preferible, el conducto se une en una posición por encima de la abertura para toma de muestras de la sonda.

En una realización preferida, el medio de exclusión de burbujas en el conducto comprende una serie de deflectores que solapan. Más preferiblemente, los deflectores se disponen en ángulo, de forma que se inclinan en una dirección ascendente. La provisión de una serie de deflectores que solapan tiene la ventaja de que el movimiento ascendente de las burbujas de gas desde el medio de cultivo dentro del fermentador y a través del conducto está relativamente no restringido, cuando se compara con el ingreso de burbujas desde el medio al interior del exclusor de burbujas, facilitando así la eliminación de burbujas de gas desde el medio de cultivo dentro del dispositivo, a la vez que se previene el movimiento descendente de las burbujas de gas desde el medio externo. Además, se crea un entorno relativamente calmado dentro del conducto, de forma que cualesquiera burbujas de gas presentes en el medio de cultivo son alentada a moverse en una dirección ascendente, debido a que las burbujas de gas tienen una densidad menor que el medio de cultivo, de forma que subirán hacia la superficie del medio de cultivo. De este modo, la exclusión física, la suficiente calma del flujo del fluido para promover la coalescencia, y el efecto de Bernoulli, promueven todos ellos la exclusión de burbujas de gas desde el interior del dispositivo exclusor de burbujas. El efecto de Bernoulli describe la situación en la que, para flujos horizontales de fluidos, un incremento en la velocidad del flujo del fluido da como resultado una reducción de la presión estática del fluido. De este modo, el movimiento rápido del medio de cultivo externo a lo largo de la parte superior del conducto genera un efecto de succión, promoviendo así la salida de las burbujas de gas y facilitando también el llenado del medio de cultivo en la abertura para toma de muestras.

El diámetro del conducto está determinado parcialmente por distribuciones típicas de tamaños de burbujas encontradas en vasijas para cultivos microbianos. Preferiblemente, la separación mínima entre los deflectores que solapan es mayor o igual a 4 mm. Más preferiblemente, las dimensiones del conducto dan una separación mínima de los deflectores de 4,6 mm. Por lo tanto, el diámetro interno de un conducto cilíndrico debería ser al menos 12 mm, para permitir un espacio mínimo libre de 4 mm para las burbujas a medida que suben a través del conducto.

En el ensayo, el número de deflectores requerido fue el objeto de mucho trabajo. El único límite para el número máximo de deflectores es el tiempo de retraso para la primera lectura. El tiempo de retraso es equivalente al volumen interno de la sonda dividido entre el caudal a través de la sonda. En la práctica, habitualmente no es importante medir la densidad celular dentro del primer minuto más o menos de comenzar una fermentación, de forma que generalmente son aceptables tiempos de retraso de este orden de magnitud.

De forma conveniente, el conducto comprende 4-10 deflectores, preferiblemente 4-8 deflectores, lo más preferible 4-6 deflectores. Los deflectores se disponen preferiblemente para que solapen, para crear una trayectoria del fluido sinuosa o en serpentín dentro del conducto. Preferiblemente, los deflectores tienen forma generalmente elíptica, con una anchura sustancialmente equivalente al diámetro interno de la tubería. En una realización preferida, el conducto es esencialmente cilíndrico con una sección transversal circular, y cada uno de los uno o más deflectores se extienden a lo largo de entre 55 y 75% del diámetro interno del conducto. En una realización preferida, los deflectores se colocan formando un ángulo de 45º con las paredes del conducto.

Según la presente invención, preferiblemente se proporciona un cierre estanco a los fluidos entre el manguito del dispositivo exclusor de burbujas y la superficie externa de una sonda. La provisión de un cierre estanco a los fluidos es importante para regular el flujo de fluidos dentro del dispositivo exclusor de burbujas, y evita la entrada de burbujas de gas desde el medio externo al interior de la sonda por medios no regulados. En una realización preferida, el cierre estanco a los fluidos se proporciona por medio de una junta tórica de silicona o de caucho, una abrazadera, o mediante una soldadura metálica o similar.

La salida del dispositivo exclusor de burbujas se puede proporcionar típicamente como un cierre no estanco al agua, o un dispositivo integral autónomo.

Como se ha señalado previamente, aunque generalmente el flujo del líquido a través del dispositivo exclusor de burbujas se da desde arriba hacia abajo, la dirección del flujo se podría invertir, dependiendo de las condiciones localizadas precisas alrededor del dispositivo en el fermentador. En consecuencia, la "salida" puede funcionar realmente en ocasiones como la entrada.

Preferiblemente, en uso, la salida se proporciona en la cara inferior del dispositivo exclusor de burbujas. Más preferiblemente, la salida está sustancialmente alineada de forma vertical con el conducto. Lo más preferible, la salida está sustancialmente alineada en el plano vertical con el conducto. En una realización, la salida está definida y rodeada por una cubierta con ángulo, que sirve para deflectar las burbujas en el líquido lejos de la salida. Preferiblemente, el ángulo de la cubierta con respecto a la salida es entre 30 y 60º, más preferiblemente entre 40 y 50º, y lo más preferible alrededor de 45º. Como resultado, cualesquiera burbujas ascendentes tenderán a deflectarse lejos de la abertura, en lugar de a través de ella.

La salida comprende una abertura y, para la limpieza y el drenado, es deseable disponer la abertura en el punto más bajo del dispositivo exclusor de burbujas. Cuando la abertura no se dispone en el punto más bajo del dispositivo exclusor de burbujas, el fluido puede quedar atrapado en el dispositivo, lo cual puede dar como resultado contaminación.

Para reducir o evitar la introducción de burbujas en la sonda, es deseable que la abertura de la salida sea pequeña. Sin embargo, cuanto más pequeña sea la abertura, mayor es la resistencia a fluir a través de la combinación del dispositivo exclusor de burbujas y la sonda. Es deseable lograr un caudal razonable de flujo del medio líquido a través de la combinación del dispositivo exclusor/sonda, de forma que la sonda esté en contacto con el medio regularmente cambiante, representativo del cultivo como un todo fuera del dispositivo exclusor de burbujas. Típicamente, la abertura de la salida es circular y tiene un radio entre 0,5 y 1,5 mm, más preferiblemente entre 0,8 y 1,2 mm, y lo más preferible alrededor de 1 mm. Esto proporciona un área de sección transversal de alrededor de 0,80-7,07 mm^{2}, preferiblemente alrededor de 2,01-4,43 mm^{2}, lo más preferible alrededor de 3,14 mm^{2}. Se pueden proporcionar otras aberturas conformadas de área de sección transversal equivalente.

En una realización, la salida comprende un tubo cilíndrico por debajo de la abertura para toma de muestras de la sonda. De forma deseable, la longitud del tubo se mantiene en un mínimo, minimizando así la resistencia a fluir a través del dispositivo exclusor de burbujas. Preferiblemente, el tubo tiene una longitud entre 1 y 2 mm, más preferiblemente entre 1,2 y 1,8 mm, y lo más preferible alrededor de 1,4 mm, y tiene una sección transversal más ancha que la abertura de la salida, para minimizar la resistencia a fluir.

Es deseable que el flujo del líquido a través del dispositivo exclusor de burbujas fuese preferiblemente sólo vía el conducto y la salida situados por encima y por debajo de la abertura para toma de muestras, respectivamente. De este modo, en una realización, se proporciona un cierre a ambos lados de la abertura para toma de muestras entre la sonda y el manguito del exclusor de burbujas, de forma que mediante esta ruta no pueda entrar líquido ni burbujas de gas. Preferiblemente, el cierre estanco a los fluidos se proporciona por medio de una junta tórica de silicona o de caucho, en un lado u otro de la abertura para toma de muestras. Alrededor de la abertura para toma de muestras, entre las juntas tóricas, debe haber suficiente espacio para que el líquido fluya, con pérdidas friccionales mínimas.

En una realización, se proporciona un espacio entre el primer deflector dentro del conducto y el manguito. Esto tiene la ventaja de permitir que las burbujas de gas entren en el conducto para ganar velocidad ascendente antes de encontrarse con los deflectores.

Convencionalmente, se pueden producir fermentadores que comprenden un medio para la inclusión de una sonda óptica. Normalmente este toma la forma de una perforación o abertura dispuesta a través de la pared del fermentador. Sin embargo, las dimensiones de la combinación del exclusor de burbujas/sonda de la presente invención son típicamente demasiado grandes para permitir el paso de la combinación a través de tal perforación o abertura. Por lo tanto, de forma conveniente, el dispositivo exclusor de burbujas se une a la sonda después de la inserción de la sonda en el fermentador. Como alternativa, el manguito del dispositivo exclusor de burbujas se puede unir a la sonda antes de la inserción en el fermentador, y el conducto se puede unir subsiguientemente. En algunas realizaciones, el medio de entrada se une a la sonda después de la inserción de la sonda en el fermentador.

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En algunas realizaciones, la abertura o perforación que permite la inserción de una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda en el fermentador es generalmente horizontal, de forma que un conducto y/o salida unidos a una sonda de manera perpendicular estará sustancialmente vertical y en la orientación óptima para permitir la salida de burbujas de gas desde el exclusor de burbujas. Sin embargo, también se conoce cómo fabricar fermentadores con una abertura o perforación para acomodar una sonda, en los que la abertura o perforación no está horizontal sino que está en ángulo oblicuo con respecto a la pared del fermentador y, típicamente, inclinado hacia abajo. A fin de optimizar la combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda de la presente invención para uso con tal fermentador, el conducto y la salida se deberían de disponer idealmente con un ángulo con respecto al eje de la sonda, de forma que, cuando la combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda está in situ en el fermentador, el conducto y la salida están sustancialmente alineados en un plano vertical. Afortunadamente, hay generalmente un número limitado de ángulos estándar que se emplean en fermentadores, de forma que se puede obtener un intervalo limitado correspondiente de combinaciones de sonda/conducto/salida que debería proporcionar una combinación de sonda/conducto/salida adecuada para uso con cualquier fermentador. Como alternativa, debería ser posible obtener una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda que comprenda un conducto y/o salida que se puedan unir al cuerpo de la sonda en una pluralidad de orientaciones, estando cada una a un ángulo diferente con respecto al eje de la sonda, de forma que el conducto y la salida se pueden colocar en una orientación sustancialmente vertical independientemente de la posición de la sonda.

Típicamente, la combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda de la presente invención se puede usar para monitorizar el crecimiento de células de mamíferos, de levaduras, fúngicas, bacterianas o de insectos.

En aún otro aspecto, la invención proporciona una vasija de fermentador que comprende una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según el segundo aspecto de la invención definido anteriormente. De forma deseable, el fermentador de la presente invención comprende un tanque agitado. Preferiblemente, la velocidad a la que se agita el medio dentro del fermentador se puede ajustar de manera dependiente del tipo de células que se hacen crecer. Típicamente, la velocidad del agitador se ajusta entre 500 y 800 rpm durante el crecimiento de células de levaduras; 100 a 500 rpm durante el crecimiento de células bacterianas; y menores que 100 rpm durante el crecimiento de células de mamíferos. Se requieren mayores velocidades durante el crecimiento de células de levaduras, a fin de mantener la saturación de oxígeno. Por el contrario, se usan velocidades mucho menores durante el crecimiento de células de mamíferos, puesto que estas células son muy sensibles a fuerzas de cizallamiento.

Ventajosamente, la presente invención es precisa a lo largo de un intervalo de 0,1 a 20 unidades de densidad óptica (OD), dependiendo del tamaño de la trayectoria de la luz en la sonda.

Ventajosamente, la presente invención proporciona una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda para la medición continua en línea de la densidad celular de un cultivo. Esto evita el requisito asociado con la técnica anterior en el que se deben de retirar alícuotas de medio durante el crecimiento del cultivo a fin de ensayar las muestras fuera de línea, o en el que la muestra se debe de desgasificar intermitentemente de forma que la medición de la densidad óptica no es continua. Ventajosamente, el conducto y el medio de entrada excluyen continuamente burbujas de gas desde la sonda, que podrían de otro modo interferir con la exactitud de las mediciones de la densidad óptica. De este modo, la combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda de la presente invención proporciona una medición fiable y exacta del crecimiento de un cultivo de células.

De forma conveniente, esa porción de la combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda de la presente invención dentro del fermentador (sometida a agitación y exposición a concentraciones elevadas de microorganismos) no comprende partes móviles ni/o componentes electrónicos. Esto tiene la ventaja de que la combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda de la presente invención es más robusta cuando se compara con otras sondas conocidas en la técnica.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un método para monitorizar la densidad celular de un cultivo durante la fermentación aerobia, usando una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según el segundo aspecto de la invención.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un método para excluir burbujas de una sonda, comprendiendo el método la etapa de unir un dispositivo exclusor de burbujas en relación operable con una sonda en forma de una combinación de dispositivo exclusor de burbujas/sonda, y usar dicha combinación dentro de un medio líquido que contiene burbujas.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un método para obtener un dispositivo exclusor de burbujas según el primer aspecto, o una combinación de dispositivo exclusor de burbujas/sonda según el segundo aspecto, comprendiendo el método de obtención de un dispositivo exclusor de burbujas la etapa de acoplar un conducto adecuado y una salida adecuada a un manguito, y comprendiendo el método de obtención de una combinación de exclusor de burbujas/sonda la etapa de acoplar un conducto adecuado y una salida adecuada en relación operable a una sonda adecuada que mide la densidad celular.

Para evitar dudas, en la presente memoria se establece expresamente que cualquier característica de la invención descrita aquí como "preferible", "conveniente", "deseable", "ventajosa" o similar, se puede usar en la invención de manera aislada o en cualquier combinación con cualquier otra característica o características así descritas, excepto que el contexto dicte otra cosa.

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La presente invención se describirá ahora a título de ejemplo y con referencia a los dibujos que se acompañan, en los que:

Las Figuras 1 y 2 son una representación esquemática de algunos de los componentes de la combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda para la medición continua de un cultivo según la presente invención;

Las Figuras 3a y 3b son ilustraciones de otras realizaciones del medio de exclusión de burbujas que puede estar presente en el dispositivo exclusor de burbujas de la invención;

La Figura 4 es una gráfica que muestra el crecimiento de células de S. cerevisiae durante un experimento de fermentación, monitorizándose continuamente el crecimiento a través de la medición de OD (660 nm) usando una sonda óptica según el primer aspecto de la invención; y

Las Figuras 5 y 6 son gráficas de OD (600 nm) frente al tiempo (horas) para dos cepas de S. cerevisiae durante un experimento de fermentación.

Ejemplo 1

Las Figuras 1 y 2 ilustran esquemáticamente algunos de los componentes de la combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda, según la realización preferida de la invención. En particular, la Figura 1 muestra un conducto (2) de entrada unido a la superficie externa (4) de una sonda óptica (6). La sonda óptica (6) comprende dos trayectorias (8a y 8b) de luz paralelas que transmiten luz en direcciones opuestas, según se señala mediante las flechas (10a y 10b). Se disponen dos prismas (12a y 12b) en un extremo de la sonda óptica (6), y reflejan la luz de forma que se invierte la dirección de la trayectoria (8a) de la luz. Se proporciona un tubo o manguito (14) alrededor de las fibras ópticas (8a y 8b), y la sonda óptica (6) y los primas (12a y 12b) se fijan dentro de una carcasa (16) que se mantiene en el sitio mediante un dispositivo de sujeción (18). El conducto (2) comprende una pluralidad de deflectores (20) que se colocan formando un ángulo de forma que se inclinen en dirección ascendente. El conducto (2) se une a la sonda óptica (6) por medio de un cierre estanco a los fluidos, proporcionado mediante dos juntas tóricas (22) de caucho, y se coloca en una orientación sustancialmente vertical, generalmente perpendicular al eje de la sonda.

La Figura 2 muestra una salida (19) unida a la superficie inferior de la región externa de la sonda óptica (6). Se proporciona un canal (21) dentro de la salida (19) y se extiende desde la superficie externa de la sonda hasta la parte inferior de la salida (19). Se proporciona una abertura (23) en la parte inferior de la salida (19).

En uso, la combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda se coloca dentro de un fermentador, y el medio de cultivo es libre de entrar por la abertura (24 en la Figura 1) para toma de muestras de la sonda vía la entrada del dispositivo exclusor de burbujas. La abertura (24) para toma de muestras está situada de forma que la trayectoria de la luz pasa a través de la muestra del medio de cultivo. La sonda óptica (6) está acoplada a un espectrofotómetro (no mostrado) que mide la densidad óptica del medio de cultivo, proporcionando así una medida de la concentración de células en el medio de cultivo. La densidad óptica del medio de cultivo se mide durante un período de tiempo, permitiendo así la medición continua en línea de la densidad celular de un cultivo.

El conducto (2) de entrada está situado por encima de la abertura (24 en la Figura 1) para toma de muestras, para permitir que cualesquiera burbujas de gas en la vecindad de la trayectoria de la luz de la sonda óptica (6) escapen, debido a su tendencia natural a ascender, siendo menos densas que el medio circundante. La serie de deflectores (20) proporciona una ruta para el movimiento ascendente de las burbujas de gas, a la vez que restringe la introducción indeseable de gas desde el medio de cultivo al interior de la abertura para toma de muestras. La posibilidad estadística de que las burbujas de gas entren en la abertura para toma de muestras disminuye con el incremento correspondiente del número de deflectores presentes en el conducto (2). Además, debido a la longitud solapante de los deflectores, no hay ninguna ruta lineal para que las burbujas de gas entren al sistema. La agitación del medio de cultivo genera un efecto de succión a lo largo de la parte superior del conducto (2), lo que promueve el llenado del medio de cultivo en la abertura (24) para toma de muestras. De este modo, la hidrodinámica del sistema es suficiente para llenar la abertura para toma de muestras en tiempo real (sin retraso significativo).

Por lo tanto, el conducto y la salida del exclusor de burbujas sirven para evitar o reducir la interacción de burbujas con la sonda, permitiendo así la medición exacta de la densidad óptica durante el crecimiento de células dentro de un fermentador aireado.

Ejemplo 3

En las Figuras 3a y 3b se ilustran otras realizaciones del medio de exclusión de burbujas.

En la Figura 3a, se proporciona un conducto (2) de entrada cilíndrico con una pluralidad de placas (30) metálicas perforadas, dispuestas horizontalmente en el conducto. Cada placa (30) es circular, y comprende una única perforación (32) relativamente grande. Las perforaciones (32) también son circulares, y tienen 4-6 mm de diámetro. Las perforaciones (32) están dispuestas en lados alternos de las placas (30) sucesivas, estableciendo de ese modo una trayectoria de flujo en serpentín dentro del conducto.

La disposición ilustrada en la Figura 3b es esencialmente similar, excepto que en esta realización las placas (30) están colocadas formando un ángulo. Las placas (30) tienen así necesariamente forma elíptica. La disposición inclinada de las placas (30) se prefiere con respecto a la disposición horizontal ilustrada en la Figura 3a, puesto que la inclinación alentaría el movimiento ascendente de cualesquiera burbujas de gas flotantes atrapadas contra la cara inferior de las placas (30).

Ejemplo 4

Las características de crecimiento de la cepa WB12 de Saccharomyces cerevisiae, transformada con el plásmido pYES3-Paac2-N6His-aac3 o el plásmido pYES3-Paac2-N9His-aac3, se determinaron en dos experimentos de fermentación separados. En ambos casos, se expresó la misma proteína, es decir, un portador de ADP/ATP mitocondrial, pero que tiene una longitud diferente de marcador de histidina, que comprende seis o nueve restos de histidina, respectivamente. La naturaleza precisa de las cepas no es importante para la invención: el fin del ejemplo es ilustrar resultados típicos, y la gran exactitud, que se pueden obtener usando una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según la invención.

Las células de S. cerevisiae se hicieron crecer en medios que contienen los siguientes ingredientes, y en las condiciones especificadas a continuación.

Medios: 2 g/l de peptona bacteriana, 1 g/l de extracto de levadura, 0,2 g/l de adenina, 3 g/l de glicerol, 20 ml/l de etanol (añadido después de la esterilización), y 2-3 ml de emulsión A antiespumante, todo ello completado hasta 1 litro con agua destilada.

Condiciones de fermentación: 30ºC, pH 5,0, dO_{2} 80%, agitación 100-800 rpm, y caudal de aire 0-15 l/min
(0-0,5 vvm).

La agitación y el caudal de aire se variaron usando un bucle de control para mantener la dO_{2} a aproximadamente 80%. A fin de controlar el pH del medio durante la fermentación, se añadieron según fuese necesario alícuotas de disoluciones de hidróxido sódico 5M y ácido fosfórico al 10%.

El fermentador usado fue un 40l Applikon ADI 1075 (que tiene un volumen de trabajo de 30 l), con un biocontrolador ADI 1030.

El espectrómetro modular de fibra óptica usado fue un Zeiss MCS500, que usa un programa de ordenador Zeiss ASPECT plus v.1.62, conectado a un ordenador vía una tarjeta de interfaz PCI. La sonda usada fue una sonda de inmersión Hellma 661.760-UV (que tiene una trayectoria óptica de la luz de 1 mm a 660 nm), equipada con un conducto de escape de burbujas esencialmente como se ilustra en la Figura 1, para adecuarse a la presente invención.

La Figura 4 muestra las curvas de crecimiento de WB12 de S. cerevisiae transformada con cualquiera de los plásmidos. A partir de los resultados, se puede ver que la adición de tres restos de histidina provoca una diferencia en el valor del tiempo de doblado, \Deltat_{2}, observado para las células. En particular, las células transformadas con pYES3-Paac2-N6His-aac3 tuvieron un valor de \Deltat_{2} de 3,53 horas, mientras que las células transformadas con pYES3-Paac2-N9His-aac3 tuvieron un valor de \Deltat_{2} de 3,98 horas. Esto demuestra la exactitud de la sonda de la presente invención cuando se evalúa el crecimiento de las células en respuesta a la expresión de una proteína. Durante la fermentación, las medidas se tomaron continuamente. Sin embargo, los valores obtenidos se presentan en la gráfica a intervalos de 1 minuto.

Las Figuras 5 y 6 son gráficas de la densidad óptica (a 600 nm) frente al tiempo (en horas), y muestran las curvas de crecimiento de la cepa W303 de S. cerevisiae y de la cepa YHM1 de S. cerevisiae, respectivamente, obtenidas en condiciones similares. Las lecturas se tomaron usando una sonda óptica equipada con (gráfica oscura) o sin (gráfica clara) un dispositivo exclusor de burbujas según la invención. Es fácilmente manifiesto que el uso del dispositivo exclusor de burbujas permite lecturas mucho más exactas y reproducibles de OD, especialmente dentro de las primeras 24 horas más o menos de fermentación.

Claims (15)

1. Un dispositivo exclusor de burbujas adaptado para uso con, y unido a, una sonda para la medición continua de la densidad celular de un cultivo en un medio líquido en un fermentador aireado, comprendiendo el dispositivo exclusor de burbujas una entrada y una salida para permitir el flujo de líquido a través del dispositivo, teniendo la entrada un conducto que, en uso, es sustancialmente vertical, comprendiendo el conducto un medio de exclusión de burbujas que crea una trayectoria de flujo en serpentín dentro del conducto, sirviendo el medio de exclusión de burbujas para reducir o evitar el ingreso de burbujas desde el medio líquido fuera del dispositivo.

2. Un dispositivo exclusor de burbujas según la reivindicación 1, en combinación con una sonda para la medición continua de la densidad celular de un cultivo, comprendiendo la sonda una abertura para toma de muestras expuesta al cultivo dentro del manguito del dispositivo exclusor de burbujas, para permitir que la sonda mida una característica del cultivo.

3. Una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según la reivindicación 2, en la que la sonda mide la densidad óptica de un medio de cultivo.

4. Una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según la reivindicación 2 ó 3, que comprende además un espectrofotómetro.

5. Una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según la reivindicación 4, en la que el espectro-fotómetro es un componente integrado de la sonda.

6. Una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según la reivindicación 4, en la que el espectro-fotómetro está enlazado ópticamente al resto de la sonda por medio de una o más fibras ópticas.

7. Un dispositivo exclusor de burbujas según la reivindicación 1, o una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según una cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en el que el medio de exclusión de burbujas comprende una pluralidad de deflectores, y/o una pluralidad de placas perforadas, y/o un canal con una sección transversal más pequeña que el diámetro de la mayoría de las burbujas presentes en el medio líquido.

8. Un dispositivo exclusor de burbujas según la reivindicación 1, o una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, en el que el medio de exclusión de burbujas comprende deflectores dispuestos en ángulo con respecto al eje del conducto, de forma que están inclinados en una dirección ascendente.

9. Un dispositivo exclusor de burbujas o una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según la reivindicación 8, en el que al menos algunos de los deflectores están dispuestos para que solapen, para crear una trayectoria de flujo del fluido sinuosa o en serpentín entre los deflectores dentro del conducto.

10. Una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en la que al menos se proporciona un cierre estanco a los fluidos entre el dispositivo exclusor de burbujas y la superficie externa del cuerpo de una sonda.

11. Una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según la reivindicación 10, en la que se proporciona un cierre estanco a los fluidos a cada lado de la abertura para toma de muestras.

12. Un dispositivo exclusor de burbujas según la reivindicación 1, o una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, en el que la salida está sustancialmente alineada de forma vertical con el conducto o la entrada.

13. Un fermentador que comprende un dispositivo exclusor de burbujas según la reivindicación 1 o una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12.

14. Un método para monitorizar la densidad celular de un cultivo durante la fermentación aerobia, comprendiendo el método el uso de una combinación del dispositivo exclusor de burbujas/sonda según una cualquiera de las reivindicaciones 2-13.

15. Un método para excluir burbujas de una sonda en contacto de flujo fluido con un líquido que contiene burbujas, comprendiendo el método la etapa de unir un dispositivo exclusor de burbujas según la reivindicación 1 en relación operable con la sonda.