ES2335089T3

ES2335089T3 - Polipeptidos de proteina quinasa relacionados con el estres y metodos de uso en las plantas.

Info

Publication number: ES2335089T3
Application number: ES02791237T
Authority: ES
Inventors: Nocha Van Thielen; Oswaldo Basf Plant Science GmbH DA COSTA E SILVA; Ruoying Chen
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2001-11-09
Filing date: 2002-11-12
Publication date: 2010-03-22
Anticipated expiration: 2022-11-12
Also published as: WO2003040171A3; US20080301835A1; US7176026B2; US7427698B2; EP2138573A1; CA2466412A1; US20080141389A1; EP1451326A4; US20070157345A1; US7598431B2; US20030182692A1; US20100011465A1; WO2003040171A2; DE60234377D1; ATE448294T1; EP2189524A2; EP1451326A2; US7303919B2; EP1451326B1; EP2189524A3

Abstract

Un ácido nucleico aislado, en donde el ácido nucleico incluye un polinucleótido que codifica a un polipéptido que tiene al menos una identidad de secuencia del 70% con un polipéptido como el definido en la SEQ ID NO: 12, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que funciona como un modulador de una respuesta al estrés por parte de una planta y en donde el estrés se selecciona de uno o más entre el grupo que consiste de alta salinidad, sequía, y baja temperatura.

Description

Polipéptidos de proteína quinasa relacionados con el estrés y métodos de uso en las plantas.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención se relaciona generalmente con secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos que están asociados con respuestas al estrés abiótico y con tolerancia al estrés abiótico en plantas.

En particular, esta invención se relaciona con secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos que confieren tolerancia a las plantas a la sequía, el frío y/o a la sal.

Estado del arte

Los estreses ambientales abióticos, tales como el estrés por sequía, el estrés por salinidad, el estrés por calor y el estrés por frío, son los factores limitantes principales para el crecimiento y la productividad de una planta. Las pérdidas de los cultivos y de rendimiento de los mismos de los cultivos más importantes tales como soja, arroz, maíz, algodón, y trigo causadas por estos estreses representan y factor político y económico significativo y contribuyen a la escasez de alimentos en muchos países subdesarrollados.

Las plantas están típicamente expuestas durante su ciclo de vida a condiciones de una cantidad reducida de agua en el medio ambiente. La mayoría de las plantas han desarrollado estrategias para protegerse a sí mismas contra estas condiciones de desecación. Sin embargo, si la severidad y la duración de las condiciones de sequía son muy grandes, los efectos sobre el desarrollo, el crecimiento y la productividad de la mayoría de las plantas de cultivo son profundos. La exposición continua a condiciones de sequía causa mayores alteraciones mayores en el metabolismo de la planta que en últimas conducen a la muerte celular y por consiguiente a pérdidas de productividad.

El desarrollo de plantas tolerantes al estrés es una estrategia que tiene el potencial para resolver o para mediar al menos algunos de estos problemas. Sin embargo, las estrategias tradicionales de reproducción de las plantas para desarrollar nuevas líneas de plantas que exhiban resistencia (tolerancia) a estos tipos de estreses son relativamente son relativamente lentas y requieren líneas resistentes específicas para cruzamiento con la línea deseada. Fuentes limitadas de germoplasma para tolerancia al estrés e incompatibilidad en cruzamientos entre especies de plantas relacionadas en forma distante representan problemas significativos que se encuentran en la reproducción convencional. Adicionalmente, los procesos celulares que conducen a tolerancia a la sequía, al frío y a la sal en modelos de plantas tolerantes a la sequía y/o a la sal son de naturaleza compleja e involucran múltiples mecanismos de adaptación celular y numerosas rutas metabólicas. Esta naturaleza de múltiples componentes de tolerancia al estrés no solamente ha hecho que fracase en gran medida la tolerancia de los cultivos, sino que también ha limitado la habilidad para modificar genéticamente las plantas tolerantes al estrés utilizando métodos biotecnológicos.

Los estreses por sequía y frío, así como los estreses por salinidad, tienen un patrón común importante para el cultivo de las plantas, y es la disponibilidad de agua. Se exponen las plantas durante su ciclo completo de vida a condiciones de bajo contenido de agua en el medio ambiente, y la mayoría de ellas han desarrollado estrategias para protegerse así mismas contra estas condiciones de desecación. Sin embargo, si la severidad y la duración de las condiciones de sequía son muy grandes, los efectos sobre el desarrollo, crecimiento y productividad de las plantas de la mayoría de las plantas de cultivo son muy profundos. Además, la mayoría de las plantas de cultivo son muy susceptibles a concentraciones mayores de sal en el suelo. Ya que un alto contenido de sal en algunos suelos conduce a una menor disponibilidad de agua para la ingesta por parte de la célula, una alta concentración de sal tiene un efecto sobre las plantas similar al efecto de la sequía sobre las plantas. Adicionalmente, bajo temperaturas de congelación, las células de la planta pierden agua como resultado de la formación de hielo que se inicia en el apoplasto y retira agua del simplasto. Los mecanismos de respuesta molecular de las plantas a cada una de estas condiciones de estrés son comunes, y las proteínas quinasas juegan un papel esencial en estos mecanismos moleculares.

Las proteínas quinasas representan una superfamilia, y los miembros de esta superfamilia catalizan la transferencia reversible de un grupo fosfato de ATP a cadenas laterales de amino ácidos de serina, treonina y tirosina sobre polipéptidos objetivo. Las proteínas quinasas son elementos primarios en procesos de señalización en plantas y se ha reportado que juegan papeles cruciales en la percepción y transducción de señales que le permiten a una célula (y a la planta) responder a estímulos del medio ambiente. En particular, las proteínas quinasas receptoras (RPK) representan un grupo de proteínas quinasas que activan un arreglo complejo de rutas de señalización intracelular en respuesta al medio ambiente extracelular (Van der Gear y colaboradores, 1994, Annu. Rev. Cell Biol. 10: 251 - 337). Las RPK son polipéptidos transmembrana que atraviesan en forma individual que contienen una secuencia señal amino terminal, dominios extracelulares únicos para cada receptor, y un dominio citoplasmático de quinasa. El enlazamiento de un ligando induce homo o heterodimerización de las RPK, y la proximidad resultante de los dominios citoplasmáticos resulta en la activación de la quinasa por medio de transfosforilación. Aunque las plantas tienen muchos polipéptidos similares a las RPK, no se ha identificado un ligando para estas quinasas tipo receptor (RLK). La mayoría de las RLK de la planta han sido identificadas como pertenecientes a la familia de las Serina/Treonina (Ser/Thr) quinasas, y la mayoría tienen repeticiones extracelulares ricas en Leucina (Becraft, P. W., 1998, Trends Plant Sci. 3: 384 - 388).

Otro tipo de proteína quinasa es la proteína quinasa dependiente de Ca+ (CDPK).

Este tipo de quinasa tiene un dominio como el de la calmodulina en el terminal COOH que permite responder a señales de Ca+ directamente sin estar presente la calmodulina. Actualmente, las CDPK son las Ser/Thr polipéptido quinasas más prevalentes encontradas en plantas superiores. Aunque sus papeles fisiológicos permanecen sin aclarar, son inducidas por frio, sequía, y ácido abscisico (ABA) (Knight y colaboradores, 1991, Nature 352: 524; Schroeder, J. I. y Thuleau, P., 1991, Plant Cell 3: 555; Bush, D. S., 1995, Annu. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 46: 95; Urao, T. y colaboradores, 1994, Mol. Gen. Genet. 244: 331).

Otro tipo de mecanismo de señalización involucra a miembros de la familia conservada de la Serina/Treonina polipéptido quinasa. Estas quinasas juegan papeles esenciales en la señalización del estrés y de la glucosa eucariota. Las quinasas tipo SNF-1 de la planta participan en el control de enzimas metabólicas clave, incluyendo HMGR, nitrato reductasa, sacarosa sintasa, y sacarosa fosfato sintasa (SPS). Los datos genéticos y bioquímicos indican que la regulación dependiente del azúcar de las SNF1 quinasas involucran a otros componentes sensoriales y de señalización en levaduras, plantas y animales.

Adicionalmente, se ha implicado a los miembros de la familia de la Proteína Quinasa Activada por Mitógeno (MAPK) en las acciones de numerosos estreses ambientales en animales, levaduras y plantas. Se ha demostrado que tanto la actividad de la quinasa tipo MAPK como los niveles de ARNm de los componentes de cascadas de MAPK se incrementan en respuesta al estrés ambiental y a la transducción de la señal de la hormona de la planta. Las MAP quinasas son componentes de cascadas secuenciales de quinasa, que se activan por fosforilación de residuos de treonina y tirosina por medio de quinasas intermedias secuencia arriba de la MAP quinasa (MAPKK). Las MAPKK se activan por sí mismas por fosforilación de residuos de serina y de treonina por medio de quinasas secuencia arriba (MAPKKK). Se han reportado una cantidad de genes para la MAP Quinasa en plantas
superiores.

Otro tipo importante de estrés ambiental es el doblamiento, que se refiere al doblamiento de los brotes o los tallos en respuesta al viento, la lluvia, las plagas o las enfermedades. Se presentan dos tipos de doblamiento en cereales: doblamiento de la raíz y rompimiento del tallo. El tipo más común de doblamiento es el doblamiento de la raíz, que se presenta temprano en la estación. El rompimiento del tallo, por el contrario, se presenta tarde en la estación a medida que el tallo se hace más quebradizo debido a la maduración del cultivo. El rompimiento el tallo tiene consecuencias adversas mayores sobre la producción del cultivo, ya que las plantas no se pueden recuperar así como del doblamiento temprano de la raíz.

El doblamiento en cultivos de cereales está influenciado por rasgos morfológicos (estructurales) de la planta así como por condiciones ambientales. El doblamiento en cultivos es a menudo el resultado de los efectos combinados de una capacidad inadecuada del cultivo para permanecer en pie y de condiciones climáticas adversas, tales como lluvia, viento, y/o granizo. El doblamiento depende también de la variedad cultivada. Por ejemplo, una variedad de cultivo de trigo alto de tallo débil tiene una mayor tendencia al doblamiento que una variedad de cultivo semienana con paja rígida. Además, la tendencia de un cultivo al doblamiento depende de la resistencia, especialmente de los entrenudos inferiores. Esto es debido a que los entrenudos inferiores tienen que resistir una mayor fuerza de movimiento. El peso de los entrenudos superiores de los tallos más las hojas y espigas en relación con el tallo (columna) afectará la resistencia de un cultivo al doblamiento. Entre más pesadas sean las partes superiores del tallo y mayor la distancia dese su centro de gravedad hasta la base del tallo, mayor es el movimiento de las fuerzas que actúan sobre los entrenudos inferiores y las raíces. Apoyando a este argumento, se encontró que la resistencia al rompimiento del entrenudo más inferior y del brote en proporción a la raíz fueron los índices más adecuados de doblamiento. Además, las características morfológicas (estructurales) de la planta tales como su altura, el espesor de la pared, y la lignificación de la pared celular pueden afectar la habilidad de la planta para resistir una fuerza lateral.

Un doblamiento severo es muy costoso debido a su efecto sobre la formación del grano y está asociado con problemas de cosecha y pérdidas. Toma aproximadamente el doble de tiempo cosechar un cultivo doblado que uno que se encuentre erguido. El crecimiento secundario junto con un cultivo aplanado hace difícil la cosecha y puede conducir posteriormente a una pobre calidad del grano. La pérdida de productividad proviene de un pobre llenado de grano, pérdida de espigas y daño causado por los pájaros. La pérdida de productividad es más severa cuando un cultivo se dobla durante los diez días posteriores al surgimiento de la espiga. La pérdida de productividad en esta etapa estará en el rango entre 15% y 40%. El doblamiento que se presenta después de que la planta madura no afectará la productividad pero puede reducir la cantidad de grano cosechable. Por ejemplo, cuando se presenta el doblamiento después de que la planta madura, puede producirse el rompimiento del cuello y la pérdida total de la espiga; esto conduce a menudo a pérdidas severas de la cosecha. En estos casos, los agricultores que combinan directamente su grano probablemente incurrirán en pérdidas mayores que aquellos que lo apilan en ringleras. Por lo tanto, es deseable identificar los genes expresados en plantas resistentes al doblado que tiene la capacidad de conferir resistencia al doblado a la planta hospedera y a otras especies de plantas.

Aunque se han caracterizado algunos genes que están involucrados en respuestas al estrés en plantas, la caracterización y clonación de genes de plantas que confieren tolerancia al estrés permanece muy incompleta y fragmentada. Por ejemplo, ciertos estudios han indicado que el estrés por sequía y sal en algunas plantas puede ser debido a efectos genéticos aditivos, en contraste con otra investigación que indica que genes específicos son transcripcionalmente activados en el tejido vegetativo de plantas bajo condiciones de estrés osmótico. Aunque se asume generalmente que las proteínas inducidas por estrés juegan un papel en la tolerancia, aún falta evidencia directa, y las funciones de muchos genes responsables del estrés son desconocidas.

Por lo tanto, existe la necesidad de identificar genes expresados en plantas tolerantes al estrés que tienen la capacidad de conferir tolerancia al estrés a su planta hospedera y a otras especies de plantas. Las plantas tolerantes al estrés recientemente generadas tendrán muchas ventajas, tales como un mayor rango en el cual se pueden cultivar las plantas de cultivo, por ejemplo, disminuyendo los requerimientos de agua de una especie de planta. Otras ventajas deseables incluyen una mayor resistencia al doblamiento, el doblado de brotes o tallos en respuesta al viento, la lluvia, las plagas o enfermedades.

Resumen de la invención

Esta invención satisface en parte la necesidad de identificar proteínas quinasas nuevas y únicas capaces de conferir tolerancia al estrés a las plantas por sobreexpresión. La presente invención describe un nuevo género de Polipéptidos de Proteína Quinasa Relacionados con el Estrés (PKSRP) y ácidos nucleicos que codifican al PKSRP que son importantes para modular una respuesta de una planta a un estrés ambiental. Más particularmente, la sobreexpresión de estos ácidos nucleicos que codifican al PKSRP en una planta resulta en una mayor tolerancia de la planta a un estrés ambiental.

La presente invención incluye una célula aislada de una planta que contiene al ácido nucleico que codifica al PKSRP, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la célula de la planta resulta en una mayor tolerancia al estrés ambiental comparado con una variedad de tipo silvestre de la célula de la planta. Concretamente, se describe aquí PK-11 de Physcomitrella patens.

La invención establece en algunas modalidades que el PKSRP y el ácido nucleico que lo codifica son aquellos que se encuentran en miembros del genero Physcomitrella. En otra modalidad preferida, el ácido nucleico y el polipéptido son de una planta Physcomitrella patens.

La invención establece que el estrés ambiental puede ser mayor salinidad, sequía, temperatura, o combinaciones de los mismos. En modalidades preferidas, el estrés ambiental puede ser sequía o temperaturas bajas.

La invención proporciona además una semilla producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica al PKSRP, en donde la planta es una reproducción verdadera para mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta. La invención proporciona además una semilla producida por una planta transgénica que expresa un PKSRP, en donde la planta es una reproducción verdadera para mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta.

La invención proporciona además un producto agrícola producido por cualquiera de las plantas transgénicas descritas más adelante, partes de plantas o semillas. La invención proporciona además un PKSRP aislada como se describe más adelante. La invención proporciona además un ácido nucleico aislado que codifica al PKSRP, en donde el ácido nucleico que codifica al PKSRP codifica para un PKSRP como se describe más adelante.

La invención proporciona además un vector aislado de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica al PKSRP como se describe más adelante, en donde la expresión del vector en una célula hospedera resulta en una mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la célula hospedera. La invención proporciona además una célula hospedera que contiene al vector y una planta que contiene la célula hospedera.

La invención proporciona además un método para producir una planta transgénica con un ácido nucleico que codifica al PKSRP, en donde la expresión del ácido nucleico en la planta resulta en una mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta que comprende: (a) la transformación de una célula de una planta con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica al PKSRP, y (b) la generación a partir de la célula de la planta de una planta transgénica con una mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta. En modalidades preferidas, el PKSRP y el ácido nucleico que codifica al PKSRP son como se describe más adelante.

Adicionalmente se describe aquí un método para la identificación de un nuevo PKSRP, que comprende (a) el surgimiento de una respuesta de un anticuerpo específico para un PKSRP, o fragmento del mismo como se describe más adelante; (b) la selección de material putativo de PKSRP con el anticuerpo, en donde el enlazamiento específico del anticuerpo con el material indica la presencia de un PKSRP potencialmente nuevo; y (c) la identificación a partir del material enlazado de nuevo PKSRP en comparación con PKSRP conocido. Alternativamente, la hibridación con sondas de ácido nucleico como se describe más adelante se puede utilizar para identificar nuevos ácidos nucleicos para PKSRP.

La presente invención también proporciona métodos para modificar la tolerancia al estrés de una planta que comprenden, la modificación de la expresión de un ácido nucleico para PKSRP en la planta, en donde el PKSRP es como se describe más adelante. La invención permite que este método pueda ser llevado a cabo de tal manera que se pueda aumentar o disminuir la tolerancia al estrés. Preferiblemente, se incrementa la tolerancia al estrés en una planta incrementando la expresión de un ácido nucleico para PKSRP.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un diagrama del vector de expresión de la planta pBPS-JH001 que contiene al súper promotor que dirige la expresión del ácido nucleico que codifica al PKSRP ("Gen de Interés"). Los componentes son: gen de resistencia a la gentamicina aacCI (Hajdukiewicz y colaboradores, 1994, Plant Molec. Biol. 25: 989 - 94), promotor NOS (Becker y colaboradores, 1992, Plant Molec. Biol. 20: 1195 - 97), terminador g7T (Becker y colaboradores, 1992), y terminador NOSpA (Jefferson y colaboradores, 1987, EMBO J. 6: 3901 - 7).

La Figura 2 muestra un diagrama del vector de expresión de la planta pBPS-SC022 que contiene al súper promotor que dirige la expresión del ácido que codifica al PKSRP ("Gen de Interés"). Los componentes son: gen de resistencia a la kanamicina NPTII (Hajdukiewicz y colaboradores, 1994, Plant Molec. Biol. 25: 989 - 98), promotor AtAct2-1 (An y colaboradores, 1996, Plant J. 10: 107 - 21), y terminador OCS3 (Weigel y colaboradores, 2000, Plant Physiol 122: 1003 - 13).

Descripción detallada de la invención

La presente invención puede ser entendida más fácilmente haciendo referencia a la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la invención y a los Ejemplos incluidos allí. Sin embargo, antes de divulgar y describir los presentes compuestos, composiciones y métodos, se debe entender que esta invención no está limitada a ácidos nucleicos específicos, polipéptidos específicos, tipos específicos de células, células hospederas específicas, condiciones específicas, o métodos específicos, etc., los cuales pueden variar, desde luego, y las numerosas modificaciones y variaciones allí serán evidentes para aquellos capacitados en el arte. Debe entenderse también que la terminología usada aquí tiene como propósito describir modalidades específicas únicamente y no pretende constituirse en una limitante. En particular, la designación de las secuencias de aminoácidos como "Protein Kinase Stress - Related Polypeptides" (PKSRP) ("Polipéptidos de Proteína Quinasa Relacionados con el Estrés"), no limita de ninguna manera la funcionalidad de aquellas secuencias.

La presente invención describe un nuevo género de Polipéptidos de Proteína Quinasa Relacionados con el Estrés (PKSRP) y ácidos nucleico que codifican PKSRP que son importantes para la modulación de la respuesta de una planta a un estrés ambiental. Más particularmente, la sobreexpresión de estos ácidos nucleicos que codifican PKSRP en una planta resulta en una mayor tolerancia de la planta a un estrés ambiental.

La presente invención proporciona una célula de una planta transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica PKSRP, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la célula de la planta resulta en una mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la célula de la planta. La invención proporciona además partes de plantas transgénicas y plantas transgénicas que contienen las células de la planta descritas aquí. En modalidades preferidas, las plantas transgénicas y partes de las plantas han incrementado la tolerancia al estrés ambiental comparadas con una variedad de tipo silvestre de la planta. Las partes de la planta incluyen, pero no se limitan a, tallos, raíces, óvulos, estambres, hojas, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, gametofitos, esporofitos, polen, microesporas, y similares. En una modalidad, la planta transgénica es macho estéril. También se proporciona semilla de una planta producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico que codifica PKSRP, en donde la semilla contiene el ácido nucleico que codifica PKSRP, y en donde la planta s una reproducción verdadera para mayo tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta. La invención proporciona además una semilla producida por una planta transgénica que expresa un PKSRP, en donde la semilla contiene al PKSRP, y en donde la planta es una reproducción verdadera para mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta. La invención también proporciona un producto agrícola producido por cualquiera de las plantas transgénicas descritas más adelante, partes de planta, y semillas de planta. Los productos agrícolas incluyen, pero no se limitan a, extractos de planta, proteínas, aminoácidos, carbohidratos, grasas, aceites, polímeros, vitaminas, y similares.

Como se lo utiliza aquí, el término "variedad" se refiere a un grupo de plantas dentro de una especie que comparte caracteres constantes que los separan de la forma típica y de otras posibles variedades dentro de esa especie. Aunque poseen al menos un rasgo distintivo, una variedad se caracteriza también por alguna variación entre individuos dentro de la variedad, con base principalmente en la segregación Mendeliana de rasgos entre la progenie de generaciones sucesivas. Una variedad es considerada una "reproducción verdadera" para un rasgo particular si es genéticamente homocigota para ese rasgo en una medida tal que, cuando la variedad de una reproducción verdadera es autógama, no se observa una cantidad significativa de segregación independiente del rasgo entre la progenie. En la presente invención, el rasgo surge de la expresión transgénica de una o más secuencias de ADN introducidas dentro de una variedad de planta.

La presente invención describe por primera vez que la PK-11 de PKSRP de Physcomitrella patens es útil para incrementar la tolerancia de una planta al estrés ambiental. Como se lo utiliza aquí, el término polipéptido se refiere a una cadena de al menos cuatro aminoácidos unidos por medio de enlaces peptídicos. La cadena puede ser lineal, ramificada, circular o combinaciones de las mimas. Por lo tanto, la presente invención proporciona la PK-11 aislada de PKSRP, y homólogos de la misma. En una modalidad preferida, el PKSRP es el polipéptido de la Proteína Quinasa-11 (PK-11) de Physcomitrella patens como se define en la SEQ ID NO: 12; y homólogos y ortólogos del mismo. Más adelante se definen homólogos y ortólogos de las secuencias de aminoácidos.

Los PKSRP de la presente invención so producidos preferiblemente por medio de técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, se clona una molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido en un vector de expresión (como se describe más adelante), se introduce el vector de expresión en una célula hospedera (como se describe más adelante) y se expresa el PKSRP en la célula hospedera. Se puede aislar luego el PKSRP de las células por medio de un esquema apropiado de purificación utilizando técnicas estándar de purificación de polipéptidos. Para los propósitos de la invención, el término "polinucleótido recombinante" se refiere a un polinucleótido que ha sido alterado, reordenado o modificado por medio de ingeniería genética. Los ejemplos incluyen cualquier polinucleótido clonado, y polinucleótidos que están enlazados o unidos a secuencias heterólogas. El término "recombinante" no se refiere a alteraciones de polinucleótidos que resultan de eventos de ocurrencia natural, tal como mutaciones espontaneas. En forma alternativa a la expresión recombinante, se puede sintetizar químicamente un PKSRP o péptido utilizando técnicas estándar de síntesis de péptidos. Además, se puede aislar PKSRP nativo a partir de las células (por ejemplo, Physcomitrella patens, Brassica napus, Glycine max, u Oryza sativa), por ejemplo utilizando un anticuerpo anti-PKSRP, que puede ser producido por medio de técnicas estándar utilizando un PKSRP o fragmento del mismo.

La invención proporciona además un ácido nucleico aislado que codifica PKSRP. La presente invención incluye ácidos nucleico que codifican PKSRP que codifican los PKSRP como los descritos aquí. En una modalidad preferida, el ácido nucleico que codifica al PKSRP es el ácido nucleico para la Proteína Quinasa-11 (PK-11) de Physcomitrella patens como la definida en la SEQ ID NO: 11; y homólogos y ortólogos de la misma. Los homólogos y ortólogos de las secuencias de nucleótidos se definen más adelante. En una modalidad preferida, el ácido nucleico, el ácido nucleico y el polipéptido se aíslan de la planta del género Physcomitrella. En otra modalidad preferida, el ácido nucleico y el polipéptido son de una planta de Physcomitrella patens (P. patens).

Como se lo utiliza aquí, el término "estrés ambiental" se refiere a cualquier condición de crecimiento por debajo del óptimo e incluye, pero no se limita a, condiciones por debajo del óptimo asociadas con estreses por salinidad, sequía, temperatura, metal, químico, patógeno y oxidativo, o combinaciones de los mismos. En modalidades preferidas, el estrés ambiental se puede seleccionar entre uno o más del grupo que consiste de salinidad, sequía o temperatura, o combinaciones de los mismos, y en particular, se puede seleccionar entre uno o más del grupo que consiste de salinidad alta, bajo contenido de agua, o temperatura baja. Se debe entender también que como se lo utiliza en la descripción y en las reivindicaciones, "un" o "uno" puede significar uno o más, dependiendo del contexto en el cual se los utilice. Así, por ejemplo, cuando se hace referencia a "una célula" puede significar que se puede utilizar al menos una célula.

Como se lo utiliza aquí también, el término "ácido nucleico" y "polinucleótido" se refiere a ARN o ADN que sea lineal o ramificado, monocatenario o bicatenario, o un híbrido de los mismos. El término también abarca una secuencia no traducida localizada tanto en el extremo 3' como en el extremo 5' de la región de codificación del gen: aproximadamente al menos 1000 nucleótidos de la secuencia, secuencia arriba del extremo 5' de la región de codificación y aproximadamente al menos 200 nucleótidos de la secuencia, secuencia abajo del extremo 3' de la región de codificación del gen. Bases menos comunes, tales como inosina, 5-metilcitosina, 6-metiladenina, hipoxantina y otras, pueden ser utilizadas también para antisentido, ARNds y apareamiento de ribozima. Por ejemplo, se ha mostrado que polinucleótidos que contienen análogos de propino C-5 de uridina y citidina enlazan ARN con alta afinidad y que son potentes inhibidores antisentido de la expresión del gen. Pueden hacerse otras modificaciones, tales como la modificación de la columna vertebral del fosfodiéster, o del 2'-hidroxi en el grupo del azúcar ribosa del ARN. Lo polinucleótidos antisentido y los ribozimas pueden consistir enteramente de ribonucleótidos, o pueden contener ribonucleótidos mezclados y desoxirribonucleótidos. Se pueden producir los polinucleótidos de la invención por cualquier medio, incluyendo preparaciones genómicas, preparaciones de ADNc, síntesis in vitro, RT-PCR, y transcripción in vitro o in vivo.

Una molécula "aislada" de ácido nucleico es una que está sustancialmente separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico (es decir, secuencias que codifican otros polipéptidos). Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado", está libre de algunas de las secuencias que flanquean naturalmente al ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en su replicón de ocurrencia natural. Por ejemplo, un ácido nucleico clonado es considerado aislado. En diferentes modalidades, la molécula aislada de ácido nucleico que codifica para PKSRP puede contener aproximadamente menos de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ó 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente a la molécula de ácido nucleico en ADN genómico de la célula a partir de la cual se deriva el ácido nucleico (por ejemplo, una célula de Physcomitrella patens, de Brassica napus, de Glycine max, o de Oryza sativa). Se considera también aislado un ácido nucleico si ha sido alterado por medio de intervención humana, o colocado en un locus o ubicación que no es un sitio natural, o si es introducido en una célula por medio de agroinfección. Además, una molécula "aislada" de ácido nucleico, tal como una molécula de ADNc, puede estar libre de algo del material celular con el cual está naturalmente asociado o medio de cultivo cuando se lo produce por medio de técnicas recombinantes o de precursores químicos o de otros químicos cuando se lo sintetiza químicamente.

Se excluyen específicamente de la definición de "ácidos nucleicos aislados": cromosomas de ocurrencia natural (tales como extensiones de cromosomas), bibliotecas artificiales de cromosomas, bibliotecas genómicas, y bibliotecas de ADNc que existen ya sea como una preparación in vitro de ácido nucleico o como una preparación de células hospederas transfectadas/transformadas, en donde las células hospederas son o bien una preparación heterogénea in vitro o sembrada en placa como una población heterogénea de colonias individuales. También se excluyen específicamente las bibliotecas anteriores en donde un ácido nucleico especificado hace menos del 5% del número de insertos de ácido nucleico en las moléculas del vector. También se excluyen específicamente el ADN genómico de células enteras o las preparaciones de ARN de células enteras (incluidas las preparaciones de células enteras que son cortadas mecánicamente o digeridas enzimáticamente). Incluso también se excluyen específicamente las preparaciones de células enteras encontradas ya sea como una preparación in vitro o como una mezcla heterogénea separada por electroforesis en donde el ácido nucleico de la invención no ha sido aún separado de los ácidos nucleico heterólogos en el medio de electroforesis (por ejemplo, separación adicional cortando una única banda de una población de una banda heterogénea en un gel de agarosa o en una transferencia sobre nylon).

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11, o una porción de la misma, puede ser aislada utilizando técnicas estándar de biología molecular y la información de la secuencia suministrada allí. Además, una molécula de ácido nucleico que abarca todo o una porción de la secuencia de la SEQ ID NO: 11, puede ser aislada por medio de la reacción en cadena de la polimerasa utilizando iniciadores de oligonucleótido diseñados con base en esta secuencia. Por ejemplo, se puede aislar ARNm de células de plantas (por ejemplo, por medio del procedimiento de extracción de guanidinio-tiocianato de Chirgwin y colaboradores, 1979, Biochemistry 18: 5294 - 5299) y se puede preparar ADNc utilizando transcriptasa inversa (por ejemplo, transcriptasa inversa MLV de Moloney, que puede obtenerse con Gibco/BRL, Bethesda, MD; o transcriptasa inversa en AMV, que puede obtenerse con Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Los iniciadores sintéticos de oligonucleótidos para amplificación por medio de la reacción en cadena de la polimerasa se pueden diseñar con base en la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 11. Se puede amplificar una molécula de ácido nucleico de la invención utilizando ADNc o, alternativamente, ADN genómico, como molde e iniciadores apropiados de oligonucleótido de acuerdo con técnicas estándar de amplificación por PCR. Se puede clonar la molécula de ácido nucleico así amplificada dentro de un vector apropiado y caracterizada por medio del análisis de la secuencia de ADN. Además, se pueden preparar oligonucleótidos correspondientes a una secuencia de nucleótidos que codifica para PKSRP por medio de técnicas estándar de síntesis, por ejemplo, utilizando un sintetizador automatizado de ADN.

En una modalidad preferida, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención incluye la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 11. El ADNc puede incluir una secuencia que codifica a los PKSRP (es decir, la "región de codificación" así como una secuencia 5' no traducida y una secuencia 3' no traducida.

La presente invención también incluye ácidos nucleicos que codifican para PKSRP que codifican a los PKSRP descritos aquí. Se prefiere un ácido nucleico que codifica para PKSRP que codifica a la PK- 11 de PKSRP como se define en la SEQ ID NO: 12.

Además, la molécula de ácido nucleico de la invención puede incluir una porción de la región de codificación de la secuencia en la SEQ ID NO: 11, por ejemplo, un fragmento que puede ser utilizado como una sonda o iniciador o un fragmento que codifica una porción biológicamente activa de una PKSRP. La secuencia de nucleótidos determinada a partir de la clonación del gen que codifica para PKSRP de Physcomitrella patens, permite la generación de sondas y de iniciadores diseñados para uso en la identificación y/o clonación de homólogos de PKSRP en otros tipos de células y organismos, así como homólogos de PKSRP de otras especies relacionadas. La porción de la región de codificación puede codificar también un fragmento biológicamente activo de un PKSRP.

Como se lo utiliza aquí, el término "porción biológicamente activa de" un PKSRP también incluye una porción, por ejemplo, un dominio/motivo, de un PKSRP que participa en la modulación de la tolerancia al estrés en una planta, y más preferiblemente tolerancia a la sequía o tolerancia a la sal. Para los propósitos de la presente invención, la modulación de la tolerancia al estrés se refiere al menos a un aumento o disminución del 10% en la tolerancia al estrés de una planta transgénica que contiene un casete de expresión de PKSRP (o vector de expresión) comparada con la tolerancia al estrés de una planta de control no transgénica. Los métodos para cuantificación de la tolerancia al estrés se suministran al menos en el Ejemplo 7 más adelante. En una modalidad preferida, la porción biológicamente activa de un PKSRP incrementa la tolerancia de una planta a un estrés ambiental.

Las porciones biológicamente activas de un PKSRP incluyen péptidos que contienen secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencia de aminoácidos de un PKSRP, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, o la secuencia de aminoácidos de un polipéptido idéntico a un PKSRP, que incluye menos aminoácidos que un PKSRP de longitud completa o al polipéptido de longitud completa que es idéntico a un PKSRP, y exhibe al menos la actividad de un PKSRP. Típicamente, las porciones biológicamente activas (por ejemplo, los péptidos que son, por ejemplo, de 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 o más aminoácidos de longitud) incluyen un dominio o motivo con al menos una actividad de un PKSRP. Además, se pueden preparar otras porciones biológicamente activas en las cuales se suprimen otras regiones del polipéptido, por medio de técnicas recombinantes y se evalúan una o más de las actividades descritas aquí. Preferiblemente, las porciones biológicamente activas de un PKSRP incluyen uno o más dominios/motivos seleccionados o porciones de los mismos que tienen actividad biológica tal como un dominio de quinasa.

La invención también suministra PKSRP quimérico o polipéptidos de fusión. Como se lo utiliza aquí, un "polipéptido quimérico" PKSRP o "polipéptido de fusión" incluye un PKSRP operativamente enlazado a un no PKSRP. Un PKSRP se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a un PKSRP, mientras que un no PKSRP se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a un polipéptido que no es sustancialmente idéntico al PKSRP, por ejemplo, un polipéptido que es diferente al PKSRP y se deriva del mismo organismo o de un organismo diferente. Como se lo utiliza aquí con respecto al polipéptido de fusión, el término "operativamente enlazado" pretende indicar que el PKSRP y el no PKSRP están fusionados entre sí de tal manera que ambas secuencias cumplen con la función propuesta atribuida a la secuencia utilizada. El no PKSRP se puede fusionar con el terminal N o con el terminal C del PKSRP. Por ejemplo, en una modalidad, el polipéptido de fusión es un polipéptido de fusión GST-PKSRP en el cual las secuencias de PKSRP están fusionadas al terminal C de las secuencias de GST. Tales polipéptidos de fusión pueden facilitar la purificación de los PKSRP recombinantes. En otra modalidad, el polipéptido de fusión es un PKSRP que contiene una secuencia de una señal heteróloga en su terminal N. En ciertas células hospederas (por ejemplo, células hospederas de mamífero), se puede incrementar la expresión y/o la secreción de un PKSRP a través del uso de una secuencia de una señal heteróloga.

Preferiblemente, se produce un PKSRP quimérico o polipéptido de fusión de la invención por medio de técnicas estándar de ADN recombinante. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican para las diferentes secuencias de polipéptidos se ligan juntos en el marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo empleando terminales de ligación de extremo romo o de extremo escalonado, digestión con enzimas de restricción para suministrar terminales apropiados, rellenando los extremos cohesivos según sea conveniente, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar una unión indeseable y ligación enzimática. En otra modalidad, se puede sintetizar el gen de la fusión por medio de técnicas convencionales que incluyen sintetizadores automatizados de ADN. Alternativamente, la amplificación por PCR de fragmentos de genes se puede llevar a cabo utilizando iniciadores ancla que dan lugar a voladizos complementarios entre dos fragmentos consecutivos de genes que pueden posteriormente ser apareados y amplificados nuevamente para generar una secuencia quimérica del gen (Ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel y colaboradores, John Wiley & Sons: 1992). Además, se encuentran comercialmente disponibles muchos vectores de expresión que ya codifican una fracción de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST). Un ácido nucleico que codifica para un PKSRP puede ser clonado en tal vector de expresión de tal manera que la fracción de fusión se enlace en el marco al PKSRP.

Además de los fragmentos y de los polipéptidos de fusión de los PKSRP descritos aquí, la presente invención incluye homólogos y análogos de los PKSRP de ocurrencia natural y ácidos nucleicos que codifican para PKSRP en una planta. Se definen aquí como "homólogos" a dos ácidos nucleico o polipéptidos que tiene secuencias similares, o sustancialmente idénticas de nucleótidos o aminoácidos, respectivamente. Los homólogos incluyen variantes alélicas, ortólogos, parálogos, agonistas y antagonistas de los PKSRP como se define aquí más adelante. El término "homólogo" abarca además moléculas de ácido nucleico que difieren de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 11, (y porciones de la misma) debido a degeneración del código genético y por lo tanto codifican al mismo PKSRP codificado por la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 11.

Como se lo utiliza aquí, un PKSRP de "ocurrencia natural" se refiere a una secuencia de aminoácidos de PKSRP que se presenta en la naturaleza. Preferiblemente, un PKSRP de ocurrencia natural incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11.

Un agonista del PKSRP puede retener sustancialmente la misma, o un subgrupo de las actividades biológicas del PKSRP. Un antagonista del PKSRP puede inhibir una o más de las actividades de la forma de ocurrencia natural del PKSRP. Por ejemplo, el antagonista de PKSRP puede enlazarse competitivamente a un miembro secuencia arriba o secuencia abajo de la cascada metabólica del componente de la membrana celular que incluye al PKSRP, o enlazarse a un PKSRP, que media el transporte de compuestos a través de tales membranas, evitando así que tenga lugar una translocación.

Se pueden aislar moléculas de ácido nucleico correspondientes a variantes alélicas naturales y análogos, ortólogos y parálogos de un ADNc para PKSRP con base en su identidad con los ácidos nucleicos para PKSRP de Physcomitrella patens descritos aquí utilizando los ADNc que codifican para PKSRP o una porción de los mismos, como sonda de hibridación de acuerdo con técnicas estándar de hibridación bajo condiciones de hibridación estrictas. En una modalidad alternativa, se pueden identificar homólogos del PKSRP por medio de bibliotecas de selección por combinación de mutantes, por ejemplo, mutantes de truncamiento, del PKSRP para la actividad agonista o antagonista de PKSRP. En una modalidad, se genera una biblioteca abigarrada de variantes de PKSRP por medio de mutagénesis por combinación a nivel de ácidos nucleicos y es codificada por medio de una biblioteca génica abigarrada. Se puede producir una biblioteca abigarrada de variantes de PKSRP por ejemplo, ligando enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias génicas de tal manera que pueda expresarse un conjunto de generado de secuencias potenciales de PKSRP como polipéptidos individuales, o alternativamente como un conjunto de polipéptidos de fusión mayores (por ejemplo, para desplegar un fago) que contienen allí dentro al conjunto de secuencias de PKSRP. Existen una variedad de métodos que pueden ser utilizados para producir bibliotecas de homólogos potenciales de PKSRP a partir de una secuencia degenerada de oligonucleótidos. La síntesis química de una secuencia génica degenerada se puede llevar a cabo en un sintetizador automatizado de ADN, y se liga luego el gen sintético dentro de un vector apropiado de expresión. El uso de un conjunto degenerado de genes permite el suministro en una mezcla, de todas las secuencias que codifican al conjunto deseado de secuencias potenciales de PKSRP. Los métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados son conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Narang, S.A., 1983, Tetrahedron 39: 3; Itakura y colaboradores, 1984, Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura y colaboradores, 1984, Science 198: 1056; Ike y colaboradores, 1983, Nucleic Acid Res. 11: 477.

Además, se pueden utilizar bibliotecas de fragmentos de las regiones de codificación para PKSRP para generar una población abigarrada de fragmentos de PKSRP para cribado y posterior selección de homólogos de un PKSRP. En una modalidad, se puede generar una biblioteca de fragmentos de secuencia de codificación tratando un fragmento bicatenario de PCR de una secuencia de codificación de un PKSRP con una nucleasa bajo condiciones en las cuales ocurre mella únicamente aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizando al ADN bicatenario, renaturalizando al ADN para formar ADN bicatenario, que puede incluir pares sentido/antisentido de diferentes productos mellados, removiendo porciones monocatenarias de las bicatenarias reformadas por medio de tratamiento con nucleasa S1, y ligando la biblioteca del fragmento resultante en un vector expresión. Por medio de este método, se puede derivar una biblioteca de expresión que codifique fragmentos N-terminales, C-terminales e internos de diferentes tamaños del PKSRP.

Se conocen diferentes técnicas en el arte para selección de productos técnicos de bibliotecas por combinación elaboradas por medio de mutaciones puntuales o truncamiento, y para selección de bibliotecas de ADNc para productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. Tales técnicas se pueden adaptar para selección rápida de las bibliotecas génicas generadas por medio de mutagénesis por combinación de homólogos de PKSRP. Las técnicas más ampliamente utilizadas que son susceptibles a análisis de alto rendimiento, para seleccionar bibliotecas génicas grandes incluyen típicamente clonación de la biblioteca génica en vectores de expresión replicables, transformación apropiada de células con la biblioteca resultante de vectores, y expresión de los genes por combinación bajo condiciones en las cuales la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica la gen cuyo producto fue detectado. La mutagénesis recursiva de conjunto (REM), una nueva técnica que refuerza la frecuencia de los mutantes funcionales en las bibliotecas, puede ser utilizada en combinación con los ensayos de selección para identificar homólogos de PKSRP (Arkin yYourvan, 1992, PNAS 89: 7811 - 7815; Delgrave y colaboradores, 1993, Polypeptide Engineering 6(3): 327 - 331). Además, se pueden explotar ensayos con base en las células para analizar una biblioteca abigarrada de PKSRP, utilizando métodos bien conocidos en el arte. Se describe aquí adicionalmente un método para identificar un nuevo PKSRP, que comprende (a) elevar la respuesta específica del anticuerpo para un PKSRP, o un fragmento del mismo, como se describe aquí; (b) seleccionar material putativo de PKSRP con el anticuerpo, en donde el enlazamiento específico del anticuerpo con el material indica la presencia de un PKSRP potencialmente nuevo; y (c) analizar el material enlazado en comparación con un PKSRP conocido, para determinar su novedad.

Como se estableció anteriormente, la presente invención a los PKSRP y homólogos de los mismos. Para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de dos secuencias de aminoácidos (por ejemplo, una de las secuencias de la SEQ ID NO: 12, y una forma mutante de la misma), se alinean las secuencias para propósitos de una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir vacíos en la secuencia de un polipéptido para alineación óptima con el otro polipéptido o ácido nucleico). Se comparan luego los residuos de aminoácidos en las correspondientes posiciones de los aminoácidos. Cuando una posición en una secuencia (por ejemplo, la secuencia de la SEQ ID NO: 12), está ocupada por el mismo residuo aminoácido que la correspondiente posición en la otra secuencia (por ejemplo, una forma mutante de la secuencia seleccionada del polipéptido de la SEQ ID NO: 12), entonces las moléculas son idénticas en esa posición. Se puede hacer el mismo tipo de comparación entre dos secuencias de ácido nucleico.

El porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad de secuencia = números de posiciones idénticas/números totales de posiciones x 100). Preferiblemente, los homólogos aislados de aminoácidos incluidos en la presente invención son idénticos al menos en un 70%, y más preferiblemente al menos en un 70 - 75%, 75 - 80%, 80 - 85%, 85 - 90% ó 90 - 95% y lo más preferible al menos en un 96%, 97%, 98%, 99% o más con una secuencia entera de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 12. En aún otra modalidad, los homólogos aislados de aminoácidos incluidos en la presente invención son idénticos al menos en un 70%, y más preferiblemente al menos en un 70 - 75%, 75 - 80%, 80 - 85%, 85 - 90% ó 90 - 95% y lo más preferible al menos en un 96%, 97%, 98%, 99%, o más con una secuencia entera de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO: 11.

En otras modalidades, los homólogos de los aminoácidos de PKSRP tienen una identidad de secuencia al menos sobre 15 residuos contiguos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 25 residuos contiguos de aminoácidos, y los más preferible al menos 35 residuos contiguos de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12.

En otra modalidad preferida, un homólogo aislado de ácido nucleico de la invención incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con un polipéptido como el definido en la SEQ ID NO: 12 y que es idéntica al menos en un 70%, más preferiblemente al menos en un 70 - 75%, 75 - 80%, 80 - 85%, 85 - 90% ó 90 - 95%, e incluso más preferiblemente al menos en un 96%, 97%, 98%, 99%, o más con una secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 11. La longitud preferible de comparación de la secuencia para ácidos nucleicos es al menos de 75 nucleótidos, más preferiblemente al menos 100 nucleótidos y lo más preferible la longitud entera de la región de codificación.

Se prefiere adicionalmente que el homólogo aislado del ácido nucleico de la invención codifique un PKSRP, o una porción del mismo, que sea al menos 85% idéntico a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, y que funcionen como un modulador de una respuesta al estrés ambiental en una planta. En una modalidad más preferida, la sobre expresión del homólogo de ácido nucleico en una planta aumenta la tolerancia de la planta a un estrés ambiental. En una modalidad preferida adicional, el homólogo del ácido nucleico codifica un PKSRP que funciona como una proteína quinasa.

Para los propósitos de la invención, el porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de ácido nucleico o de polipéptido se puede determinar utilizando el paquete de software Vector NTI6.0 (PC) (InforMax, 7600 Winsconsin Ave., Bethesda, MD 20814). Se utilizan una penalización por apertura de una brecha de 15 y una penalización por extensión de la brecha de 6,66 para determinar el porcentaje de identidad de dos ácidos nucleico. Se utilizan una penalización por apertura de una brecha de 10 y una penalización por extensión de la brecha de 0,1 para determinar el porcentaje de identidad de dos polipéptidos. Se fijan todos los otros parámetros con los ajustes por defecto. Para los propósitos de una alineación múltiple (algoritmo Clustal W), la penalización por apertura de brecha es de 10, y la penalización por extensión de brecha es de 0,05 con la matriz blosum62. Se entiende que para los propósitos de la determinación de la identidad de secuencia cuando se compara una secuencia de ADN con una secuencia de ARN, un nucleótido de timidina es equivalente a un nucleótido de uracilo.

En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que codifica a un polipéptido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con un polipéptido como el definido en la SEQ ID NO: 12 y que hibrida al polinucleótido de la SEQ ID NO: 11, bajo condiciones estrictas. Más particularmente, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención tiene al menos una longitud de 15 nucleótidos e hibrida bajo condiciones rigurosas a la molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11.

En otras modalidades, el ácido nucleico es al menos de 30, 50, 100, 250 o más nucleótidos de longitud. Preferiblemente, un homólogo aislado de ácido nucleico de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones altamente estrictas a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 11, y funciona como un modulador de la tolerancia al estrés en una planta. En una modalidad preferida adicional, la sobre expresión del homólogo aislado de ácido nucleico en una planta incrementa la tolerancia de la planta a un estrés ambiental. En una modalidad aún más preferida, el homólogo aislado de ácido nucleico codifica un PKSRP que funciona como una proteína quinasa.

Como se lo utiliza aquí con relación a la hibridación para ADN a una transferencia de ADN, el término "condiciones estrictas" se refiere a la hibridación durante la noche a 60ºC en una solución de Denhart 10X, SSC 6X, SDS al 0,5% y 100 \mug/ml de ADN desnaturalizado de esperma de salmón. Se lavan secuencialmente las transferencias a 62ºC durante 30 minutos cada vez en SSC 3X/SDS al 0,1%, seguido por SSC 1X/SDS al 0,1% y finalmente SSC 0,1X/SDS al 0,1%. Como se utiliza aquí también, "condiciones altamente estrictas" se refiere a hibridación durante la noche a 65ºC en solución de Denhart 10X, SSC 6X, SDS al 0,5% y 100 \mug/ml de ADN desnaturalizado de esperma de salmón. Se lavan secuencialmente las transferencias a 65ºC durante 30 minutos cada vez en SSC 3X/SDS al 0,1%, seguido por SSC 1X/SDS al 0,1% y finalmente SSC 0,1X/SDS al 0,1%. Los métodos para hibridaciones de ácido nucleico están descritas en Meinkoth y Wahl, 1984, Anal. Biochem. 138: 267 - 284; Ausubel y colaboradores eds, 1995, Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York; y Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2, Elsevier, New York. Preferiblemente, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención que hibrida bajo condiciones estrictas o altamente estrictas a una secuencia de SEQ ID NO: 11 corresponde a una molécula de ácido nucleico de ocurrencia natural. Como se lo utiliza aquí, una molécula de ácido nucleico de "ocurrencia natural" se refiere a una molécula de ARN o de ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que se presenta en la naturaleza (por ejemplo que codifica a un polipéptido natural). En una modalidad, el ácido nucleico codifica a un PKSRP de Physcomitrella patens de ocurrencia natural.

Utilizando los métodos anteriormente descritos, y otros conocidos por aquellos capacitados en el arte, alguien ordinariamente entrenado en el arte puede aislar homólogos de los PKSRP que contienen secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 11.

Un subconjunto de estos homólogos son las variantes alélicas. Como se lo utiliza aquí, el término "variante alélica" se refiere a una secuencia de nucleótidos que contiene polimorfismos que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de un PKSRP y que existe dentro de una población natural (por ejemplo, una especie o variedad de planta). Tales variaciones alélicas naturales pueden resultar típicamente en una varianza de 1 - 5% en un ácido nucleico para PKSRP. Las variantes alélicas se pueden identificar por secuenciación de la secuencia de ácido nucleico de interés en una cantidad de plantas diferentes, lo cual se puede llevar a cabo fácilmente por medio del uso de sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético para PKSRP en esas plantas. Cualquiera y todas las variaciones de tal ácido nucleico y los polimorfismos resultantes de los aminoácidos o las variaciones en un PKSRP que son el resultado de una variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional de un PKSRP, están destinados a estar dentro del alcance de la invención.

Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican para los PKSRP de especies iguales o diferentes tales como análogos, ortólogos, y parálogos de PKSRP, están destinados a estar dentro del alcance de la presente invención. Como se lo utiliza aquí, el término "análogos" se refiere a dos ácidos nucleicos que tienen la misma función o una función similar, pero que han evolucionado separadamente en organismos no relacionados. Como se lo utiliza aquí, el término "ortólogos" se refiere a dos ácidos nucleico de especies diferentes, pero que han evolucionado a partir de un gen ancestral común por medio de especiación. Normalmente, los ortólogos que codifican polipéptidos tienen funciones iguales o similares. Como se lo utiliza aquí también, el término "parálogos" se refiere a dos ácidos nucleicos que están relacionados por duplicación dentro de un genoma. Los parálogos usualmente tienen funciones diferentes, pero estas funciones pueden estar relacionadas (Tatusov, R. L. y colaboradores, 1997, Science 278 (5338): 631 - 637). Los análogos, ortólogos y parálogos de un PKSRP de ocurrencia natural pueden diferir del PKSRP de ocurrencia natural por medio de modificaciones posteriores a la traducción, por diferencias en la secuencia de aminoácidos, o por ambos. Las modificaciones posteriores a la traducción incluyen derivatización química in vivo e in vitro de polipéptidos, por ejemplo, acetilación, carboxilación, fosforilación, o glicosilación, y tales modificaciones pueden presentarse durante la síntesis o el procesamiento de polipéptidos o después de tratamiento con enzimas aisladas para modificación. En particular, los ortólogos de la invención generalmente exhibirán al menos 80 - 85%, más preferiblemente 85 - 90% ó 90 - 95%, y lo más preferible 95%, 96%, 97%, 98% o incluso 99% de identidad o de identidad de secuencia con todo o parte de una secuencia de aminoácidos de PKSRP de ocurrencia natural y exhibirán una función similar a una PKSRP. Preferiblemente, un ortólogo de PKSRP de la presente invención funciona como un modulador de una respuesta al estrés ambiental en una planta y/o funciona como una proteína quinasa. Más preferiblemente, un ortólogo de PKSRP incrementa la tolerancia al estrés de una planta. En una modalidad, los ortólogos de PKSRP mantienen la habilidad para participar en el metabolismo de compuestos necesarios para la construcción de membranas celulares en una planta, o en el transporte moléculas a través de estas membranas.

Además de las variantes de ocurrencia natural de una secuencia de PKSRP que pueden existir en la población, la persona entrenada se dará cuenta además de que se pueden introducir cambios por medio de mutación dentro de una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11, conduciendo de esta manera a cambios en la secuencia de aminoácidos del PKSRP codificado, sin alterar la actividad funcional del PKSRP. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos "no esenciales" en una secuencia de la SEQ ID NO: 11.

Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede ser alterado a partir de una secuencia de tipo silvestre de uno de los PKSRP sin alterar la actividad de dicho PKSRP, mientras que se requiere de un residuo de aminoácido "esencial" para la actividad de PKSRP. Otros residuos de aminoácidos, sin embargo, (por ejemplo, aquellos que no están conservados o únicamente semiconservados en el dominio que tiene actividad de PKSRP) pueden no ser esenciales para la actividad y por lo tanto probablemente son susceptibles a alteración sin alterar la actividad de PKSRP.

Por lo tanto, otro aspecto de la invención se relaciona con moléculas de ácido nucleico que codifican para los PKSRP que contienen cambios en los residuos de aminoácidos que no son esenciales para la actividad de PKSRP. Tales PKSRP difieren en la secuencia de aminoácidos de una secuencia contenida en la SEQ ID NO: 12, tienen todavía al menos una de las actividades de PKSRP descritas aquí. En una modalidad, la molécula aislada de ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos que codifican a un polipéptido, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos aproximadamente al menos 70% idéntica a una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12. Preferiblemente, el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico es aproximadamente al menos 70 - 75%, 75 - 80%, 80 - 85%, 85 - 90% ó 90 - 95% idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 12 y más preferiblemente aproximadamente al menos un 96%, 97%, 98%, 99% idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 12. Los homólogos preferidos de PKSRP de la presente invención participan en la respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o más particularmente, participan en la transcripción de un polipéptido involucrado en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, y/o funcionan como una proteína quinasa.

Se puede crear una molécula aislada de ácido nucleico que codifica a un PKSRP que tiene una identidad de secuencia con una secuencia del polipéptido de la SEQ ID NO: 12, por medio de la introducción de una o más sustituciones, adiciones o supresiones de nucleótidos dentro de una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11, respectivamente, de tal manera que una o más de las sustituciones, adiciones, o supresiones de aminoácidos son introducidas dentro del polipéptido codificado. Se pueden introducir mutaciones dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 11, por medio de técnicas estándar, tales como la mutagénesis dirigida al sitio y la mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, las sustituciones conservadas de aminoácidos se hacen en uno más de los residuos de aminoácidos no esenciales predichos. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la cual el residuo de aminoácidos es remplazado con un residuo de aminoácidos que tienen una cadena lateral similar.

Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en el arte. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). De este modo, como se predijo se remplaza preferiblemente el residuo de aminoácido no esencial en un PKSRP con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Alternativamente, en otra modalidad, se pueden introducir mutaciones en forma aleatoria a lo largo de toda o de parte de una secuencia que codifica para PKSRP, tal como por medio de mutagénesis de saturación, y se pueden seleccionar los mutantes resultantes por una actividad de PKSRP descrita aquí para identificar mutantes que retienen la actividad de PKSRP. Después de la mutagénesis de la secuencia de la SEQ ID NO: 11, se puede expresar el polipéptido codificado en forma recombinante y se puede determinar la actividad del polipéptido analizando la tolerancia al estrés de una planta que expresa al polipéptido como se describe en el Ejemplo 7.

Adicionalmente, se pueden crear ácidos nucleicos optimizados para PKSRP. Preferiblemente, un ácido nucleico optimizado para PKSRP codifica a un PKSRP que funciona como una proteína quinasa y/o modula la tolerancia de una planta a un estrés ambiental, y más preferiblemente incrementa la tolerancia de la planta a un estrés ambiental por su sobreexpresión en la planta. Como se utiliza aquí, "optimizado" se refiere a un ácido nucleico que está genéticamente modificado por ingeniería genética para incrementar su expresión en una planta o animal dados. Para proporcionar ácidos nucleicos optimizados para PKSRP en una planta, se puede modificar la secuencia de ADN de un gen para 1) incluir codones preferidos por genes de la planta altamente expresados; 2) incluir un contenido de A + T en composición básica de nucleótidos como aquella sustancialmente encontrada en las plantas; 3) formar una secuencia de iniciación de la planta; o 4) eliminar secuencias que provoquen desestabilización, poliadenilación inapropiada, degradación, y terminación de ARN, o que formen horquillas de estructura secundaria o sitios de empalme de ARN. Se puede lograr una mayor expresión de ácidos nucleicos que codifican para PKSRP en plantas utilizando la frecuencia de distribución del uso del codón en plantas en general o en plantas en particular. Los métodos para optimizar la expresión de ácido nucleico en plantas se puede encontrar en EPA 0359472; EPA 0385962; la solicitud PCT No. WO 91/16432; la patente estadounidense No. 5.380.831; la patente estadounidense No. 5.436.391; Perlack y colaboradores, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324 - 3328; y Murray y colaboradores, 1989, Nucleic Acids Res. 17: 477 - 498.

Como se lo utiliza aquí, "frecuencia de uso preferido del codón" se refiere a la preferencia exhibida por una célula hospedera específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Para determinar la frecuencia de uso de un codón particular en un gen, el número de ocurrencias de ese codón en el gen se divide por el número total de ocurrencias de todos los codones especificando el mismo aminoácido en el gen. En forma similar, la frecuencia de uso preferido del codón exhibida por una célula hospedera se puede calcular promediando la frecuencia de uso preferido del codón en un gran número de genes expresados por la célula hospedera. Es preferible que este análisis se limite a genes que sean altamente expresados por la célula hospedera. El porcentaje de desviación de la frecuencia de uso del codón preferido para un gen sintético con respecto a aquel empleado por una célula hospedera se calcula primero determinando el porcentaje de desviación de la frecuencia de uso de un solo codón con respecto a aquel de la célula hospedera seguido por la obtención de la desviación promedio sobre todos los codones. Como se define aquí, este cálculo incluye codones únicos (es decir, ATG y TGG). En términos generales, la desviación promedio total del uso del codón de un gen optimizado con respecto a aquel de una célula hospedera se calcula utilizando la ecuación 1A = n = 1 Z X_{n}- Y_{n}X_{n} veces 100 Z donde X_{n} = frecuencia de uso para el codón n en la célula hospedera;
Y_{n} = frecuencia de uso para el codón n en el gen sintético; n representa un codón individual que especifica un aminoácido; y el número total de codones es Z. La desviación total de la frecuencia de uso del codón, A, para todos los aminoácidos debe ser preferiblemente aproximadamente menor al 25%, y más preferiblemente aproximadamente menor al 10%.

Por lo tanto, se puede utilizar un ácido nucleico para PKSRP de tal manera que su frecuencia de distribución de uso del codón se desvíe, preferiblemente no más del 25% con respecto a aquel de los genes de la planta altamente expresados y, más preferiblemente, aproximadamente no más del 10%. Además, se tiene en cuenta el porcentaje del contenido de G + C de la tercera base degenerada (parece que las monocotiledóneas favorecen G + C en esta posición, mientras que las dicotiledóneas no lo hacen). También se reconoce que el nucleótido XCG (donde X es A, T, C o G) es el codón menos preferido en dicotiledóneas mientras que el codón XTA es evitado tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas. Los ácidos nucleicos optimizados para PKSRP de esta invención preferiblemente también tienen índices de evitar al doblete CG y TA aproximadamente cercanos a aquellos de la planta hospedera escogida (es decir, Physcomitrella patens). Más preferiblemente estos índices se desvían de aquel del hospedador aproximadamente no más de 10 -15%.

Además de las moléculas de ácido nucleico que codifican los PKSRP descritos anteriormente, otro aspecto de la invención se relaciona con moléculas aisladas de ácido nucleico que son antisentido a ellas. Se piensa que los polinucleótidos antisentido inhiben la expresión génica de un polinucleótido objetivo enlazando específicamente al polinucleótido objetivo e interfiriendo con la transcripción, el empalme, el transporte, la traducción y/o la estabilidad del polinucleótido objetivo. Se describen métodos en el estado del arte para dirigir el polinucleótido antisentido al ADN cromosómico, a una transcripción primaria de ARN, o a un ARNm procesado. Preferiblemente, las regiones objetivo incluyen sitios de empalme, codones de iniciación de la traducción, codones de terminación de la traducción, y otras secuencias dentro del marco de lectura abierto.

El término "antisentido", para los propósitos de la invención, se refiere a un ácido nucleico que contiene un polinucleótido que es suficientemente complementario a todo o a una porción de un gen, transcripto primario, o ARNm procesado, con el fin de interferir con la expresión del gen endógeno. Polinucleótidos "complementarios" son aquellos que son capaces de aparear bases de acuerdo con las reglas estándar de complementariedad de Watson - Crick. Específicamente, las purinas se aparearan con pirimidinas para formar una combinación de guanina apareada con citosina (G:C) y la adenina se apareará o bien con timina (A:T) en el caso del ADN, o la adenina se apareará con uracilo (A:U) en el caso del ARN. Se entiende que dos polinucleótidos pueden hibridar entre sí incluso sin no son completamente complementarios entre sí, con tal de que cada uno tenga al menos una región que sea sustancialmente complementaria con la del otro. El término "ácido nucleico antisentido" incluye casetes de expresión de ARN monocatenario así como de ADN bicatenario que pueden ser transcritos para producir un ARN antisentido. Los ácidos nucleico antisentido "activos" son moléculas de ARN antisentido que son capaces de hibridar selectivamente con un transcripto primario o ARNm que codifica a un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID NO: 12.

El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una cadena entera de codificación de PKSRP, o únicamente a una porción de la misma. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido a una "región de codificación" de la cadena de codificación de una secuencia de nucleótidos que codifican para un PKSRP. El término "región de codificación" se refiere a la región de la secuencia de nucleótidos que incluye codones que son traducidos en residuos de aminoácidos.

En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido a una "región no codificadora" de la cadena de codificación de una secuencia de nucleótidos que codifican para un PKSRP. El término "región no codificadora" se refiere a secuencias 5' y 3' que flanquean la región de codificación que no son traducidas en aminoácidos (es decir, también denominadas como regiones 5' y 3' no traducidas). La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a la región entera de codificación del ARNm para PKSRP, pero más preferiblemente es un oligonucleótido que es antisentido únicamente con una porción de la región de codificación o no codificadora del ARNm para PKSRP. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región que rodea al sitio de inicio de la traducción del ARNm para PKSRP. Un oligonucleótido antisentido puede ser, por ejemplo, aproximadamente de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos de longitud. Típicamente, las moléculas antisentido de la presente invención contienen un ARN que tiene 60 - 100% de identidad de secuencia con al menos 14 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO: 11, o un polinucleótido que codifica a la SEQ ID NO: 12. Preferiblemente, la identidad de secuencia será al menos del 70%, más preferiblemente al menos del 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% y lo más preferible 99%.

Se puede construir un ácido nucleico antisentido de la invención utilizando síntesis química y reacciones de ligación enzimática utilizando procedimientos conocidos en el arte. Por ejemplo, se puede sintetizar químicamente un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) utilizando nucleótidos de ocurrencia natural de diferentes nucleótidos modificados diseñados para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleico sentido y antisentido, por ejemplo, pueden utilizarse derivados fosforilados y nucleótidos sustituidos de acridina. Los ejemplos de nucleótidos modificados que pueden ser utilizados para generar al ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-iodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometil uracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, seudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, se puede producir biológicamente el ácido nucleico antisentido utilizando un vector de expresión dentro del cual se ha subclonado un ácido nucleico en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito a partir del ácido nucleico insertado será de una orientación antisentido a un ácido nucleico objetivo de interés, que se describe adicionalmente en la siguiente subsección).

En aún otra modalidad, la molécula de ácido nucleico antisentido de la invención es una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérico. Una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérico forma híbridos bicatenarios específicos con ARN complementario en el cual, contrario a las unidades \beta usuales, las cadenas corren paralelas entre sí (Gaultier y colaboradores, 1987, Nucleic Acids. Res. 15: 6625 - 6641). La molécula de ácido nucleico antisentido también puede incluir un 2'-o-metilribonucleotido (Inoue y colaboradores, 1987, Nucleic Acids Res. 15: 6131 - 6148) o un análogo quimérico de ARN-ADN (Inoue y colaboradores, 1987, FEBS Lett. 215: 327 - 330).

Las moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención son típicamente administrada a una célula o generadas in situ de tal manera que hibriden con o se enlacen a un ARNm celular y/o a un ADN genómico que codifica un PKASRP para inhibir de esta manera la expresión del polipéptido, por ejemplo, inhibiendo la transcripción y/o la traducción. La hibridación puede ser por medio de complementariedad convencional del nucleótido para formar un dúplex estable, o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se enlaza a dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en el surco principal de la hélice doble. Se puede modificar la molécula antisentido de tal manera que se enlace específicamente a un receptor o a un antígeno expresado sobre una superficie celular seleccionada, por ejemplo, por enlazamiento de la molécula de ácido nucleico antisentido con un péptido o un anticuerpo que se enlaza a un receptor de la superficie de la célula o a un antígeno. Se puede enviar también la molécula de ácido nucleico antisentido a células utilizando los vectores descritos aquí. Para lograr concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas antisentido, se prefieren las construcciones de vectores en las cuales se coloca la molécula de ácido nucleico antisentido bajo el control de un promotor fuerte procariota, viral o eucariota (incluida una planta).

Como alternativa a los polinucleótidos antisentido, se pueden utilizar ribozimas, polinucleótidos sentido, o ARN bicatenario (ARNds) para reducir la expresión de un polipéptido PKSRP. Por "ribozima" se entienda una enzima catalítica con base en ARN con actividad de ribonucleasa que es capaz de escindir un ácido nucleico monocatenario, tal como un ARNm con el cual tiene una región complementaria. Se pueden utilizar los ribozimas (por ejemplo, los ribozimas cabeza de martillo descritos en Haselhoff y Gerlach, 1988, Nature 334: 585 - 591) para escindir catalíticamente transcriptos de ARNm para PKSRP para inhibir así la traducción del ARNm para PKSRP. Se puede diseñar una ribozima que tiene especificidad por un ácido nucleico que codifica para PKSRP con base en la secuencia de nucleótidos de un ADNc que codifica para PKSRP, como se divulga aquí (es decir, la SEQ ID NO:11, o con base en la secuencia heteróloga que va a ser aislada de acuerdo con métodos enseñados en esta invención. Por ejemplo, se puede construir un derivado de un ARN de Tetrahymena L - 19 IVS en el cual la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótidos que va a ser escindida en un ARNm que codifica para PKSRP. Ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 4.987.071 y 5.116.742 de Cech y colaboradores. Alternativamente, se puede utilizar el ARNm para PKSRP para seleccionar un ARN catalítico que tiene actividad específica de ribonucleasa a partir de una reserva de moléculas de ARN. Ver, por ejemplo, Bartel. D. y Szostak, J. W., 1993. Science 261:
1411 - 1418. En modalidades preferidas, la ribozima contendrá una porción que tiene al menos 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 ó 20 nucleótidos y más preferiblemente 7 u 8 nucleótidos, que tiene 100% de complementariedad con una porción del ARN objetivo. Los métodos para elaboración de ribozimas son conocidos por aquellos capacitados en el arte. Ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 6.025.167; 5.773.260; y 5.496.698.

El término "ARNds", como se lo utiliza aquí, se refiere a híbridos de ARN que contienen dos cadenas de ARN. Los ARNds pueden ser de estructura lineal o circular. En una modalidad preferida, el ARNds es específico para un polinucleótido que codifica ya sea al polipéptido de la SEQ ID NO: 12, o a un polipéptido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 12.

La hibridación de los ARN puede ser sustancial o completamente complementaria. Por "sustancialmente complementaria", se entiende que cuando los dos ARN de hibridación están óptimamente alineados utilizando el programa BLAST como se describió anteriormente, las porciones de hibridación son al menos 95% complementarias. Preferiblemente, los ARNds serán al menos de 100 pares de bases de longitud. Típicamente, los ARN de hibridación serán de idéntica longitud sin extremos 5' ó 3' sobresalientes y sin vacíos. Sin embargo, los ARNds que tienen extremos 5' ó 3' sobresalientes hasta de 100 nucleótidos pueden ser utilizados en los métodos de la invención.

Los ARNds pueden incluir ribonucleótidos o análogos de ribonucleótidos, tales como los residuos de 2'-O-metil ribosilo o combinaciones de los mismos. Ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 4.130.641 y 4.024.222. Se describe un ácido polirriboinosínico de ARNds:ácido polirribocitidílico en la patente estadounidense No. 4.283.393. Los métodos para elaborar y utilizar ARNds son conocidos en el Arte. Un método comprende la transcripción simultánea de dos cadenas complementarias de ADN, ya sea in vivo o en una mezcla de reacción única in vitro. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense No. 5.795.715. En una modalidad, se puede introducir ARNds en una planta o célula de planta directamente por medio de procedimientos estándar de transformación. Alternativamente, se puede expresar ARNds en una célula de una planta por transcripción de dos ARN complementarios.

Otros métodos para la inhibición de la expresión endógena del gen, tales como la formación de una hélice triple (Moser y colaboradores, 1987, Science 238: 645 - 650 y Cooney y colaboradores, 1988, Science 241: 456 - 459) y cosupresión (Napoli y colaboradores, 1990, The Plant Cell 2: 279 - 289) son conocidos en el arte. Se han utilizado los ADNc de longitud completa o parcialpara la cosupresión de genes endógenos de plantas. Ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 4.801.340, 5.034.323, 5.231.020, y 5.283.184; Van der Kroll y colaboradores, 1990, The Plant Cell 2: 291 - 299; Smith y colaboradores, 1990, Mol. Gen. Genetics 224: 477 - 481 y Napoli y colaboradores, 1990, The Plant Cell 2: 279 - 289.

Para la supresión sentido, se cree que la introducción de un polinucleótido sentido bloquea la transcripción del correspondiente gen objetivo. El polinucleótido sentido tendrá al menos una identidad de secuencia del 65% con el gen de la planta objetivo o ARN. Preferiblemente, el porcentaje de identidad es al menos del 80%, 90%, 95% o más. El polinucleótido sentido introducido no necesita ser de longitud completa con relación al gen objetivo o al transcripto. Preferiblemente, el polinucleótido sentido tendrá al menos una identidad de secuencia del 65% con al menos 100 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO: 11.

Las regiones de identidad pueden incluir intrones y/o exones y regiones no traducidas. El polinucleótido sentido introducido puede estar presente en la célula de la planta en forma transitoria, o puede estar integrado en forma estable dentro de un cromosoma de la planta o replicón extracromosómico.

Alternativamente, se puede inhibir la expresión del gen que codifica para PKSRP por medio de secuencias de nucleótidos objetivo complementarias a la región reguladora de una secuencia de nucleótidos para PKSRP (por ejemplo, un promotor y/o reforzador de PKSRP) para formar estructuras de triple hélice que eviten la transcripción de un gen que codifica para PKSRP en células objetivo. Ver generalmente, Helene, C., 1991, Anticancer Drug Des. 6(6):
569 - 84; Helene, C. y colaboradores, 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27 - 36; y Maher, L. J., 1992, Bioassays 14(12):
807 - 15.

Además de los ácidos nucleicos para PKSRP y de los polipéptidos descritos anteriormente, la presente invención abarca estos ácidos nucleicos y polipéptidos unidos a una fracción. Estas fracciones incluyen, pero no se limitan a, fracciones de detección, fracciones de hibridación, fracciones de purificación, fracciones de suministro, fracciones de reacción; fracciones de enlazamiento, y similares. Un grupo típico de ácidos nucleicos que tienen fracciones unidas son sondas e iniciadores. Las sondas y los iniciadores contienen típicamente un oligonucleótido sustancialmente aislado. El oligonucleótido contiene típicamente una región de secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones estrictas al menos aproximadamente a 12, preferiblemente aproximadamente 25, más preferiblemente aproximadamente 40, 50 ó 75 nucleótidos consecutivos de una cadena sentido de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 11, una secuencia antisentido de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 11, o mutantes de ocurrencia natural de las mismas. Se pueden utilizar iniciadores con base en una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11, en reacciones de PCR para clonar homólogos de PKSRP. Se pueden utilizar sondas con base en las secuencias de nucleótidos para PKSRP para detectar transcriptos o secuencias genómicas que codifican polipéptidos iguales o sustancialmente idénticos. En modalidades preferidas, la sonda incluye además un grupo marcador unido a ellas, por ejemplo el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor enzimático. Se pueden utilizar tales sondas como parte de un kit para análisis con marcador genómico para identificación de células que expresan un PKSRP, tal como por medio de la medición del nivel de ácido nucleico que codifica PKSRP, en una muestra de células, por ejemplo, detectando los niveles de ARNm para PKSRP o determinando si un gen para PKSRP genómico ha sido mutado o suprimido.

En particular, un método útil para determinar el nivel de transcripción del gen (un indicador de la cantidad de ARNm disponible para traducción al producto génico) es para llevar a cabo una transferencia tipo Northern. Para referencia, ver, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, 1988, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York. La información de una transferencia tipo Northern demuestra al menos parcialmente el grado de transcripción del gen transformado. Se puede preparar ARN celular total a partir de células, tejidos u órganos por medio de diferentes métodos, todos bien conocidos en el arte, tal como aquel descrito en Bormann, E. R. y colaboradores, 1992, Mol. Microbiol. 6: 317 - 326. Para evaluar la presencia o la cantidad relativa de polipéptido traducido a partir de este ARN, se pueden emplear técnicas estándar, tal como una transferencia tipo Western. Estas técnicas son bien conocidas por alguien ordinariamente capacitado en el arte. Ver, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, 1988, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York.

La invención proporciona además un vector aislado de expresión recombinante que incluye un ácido nucleico que codifica para PKSRP como se describió anteriormente en donde la expresión del vector en una célula hospedera resulta en una mayor tolerancia al estrés ambiental comparado con una variedad de tipo silvestre de la célula hospedera. Como se lo utiliza aquí, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual está enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular dentro del cual se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde se pueden ligar segmentos adicionales de ADN dentro del genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en la célula hospedera dentro de la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamíferos) son integrados en el genoma de una célula hospedera después de la introducción en la célula hospedera, y por lo tanto son replicados junto con el genoma hospedero. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes con los cuales están operativamente enlazados. Tales vectores son denominados aquí como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en la forma de plásmidos. En la presente descripción, "plásmido" y "vector" pueden ser utilizados en forma intercambiable ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir tales otras formas de vectores de expresión, tales como los vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus, y virus adenoasociados), que cumplen funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinante de la invención incluyen un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para expresión del ácido nucleico en una célula hospedera, lo cual significa que los vectores de expresión recombinante incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas con base en las células hospederas que son utilizadas para expresión, las cuales están operativamente enlazadas a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. Como se lo utiliza aquí con respecto a un vector de expresión recombinante, "operativamente enlazado" pretende significar que la secuencia de nucleótidos de interés está enlazada a la(s) secuencia(s) reguladora(s) en una forma que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción o en una célula hospedera cuando se introduce el vector en la célula hospedera). El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, reforzadores, y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras están descritas, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) y Gruber y Crosby, en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, eds. Glick y Thompson, Capítulo 7, 89 - 108, CRC Press: Boca Raton, Florida, incluidas las referencias citadas allí. Las secuencias reguladoras incluyen a aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospederas y aquellos que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos únicamente en ciertas células hospederas o bajo ciertas condiciones. Aquellos capacitados en el arte se darán cuenta que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la escogencia de la célula hospedera que va a ser transformada, el nivel de expresión del polipéptido deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en células hospederas para producir así polipéptidos o péptidos, incluyendo polipéptidos o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleico como se describe aquí (por ejemplo, los PKSRP, formas mutantes de los PKSRP, polipéptidos de fusión, etc.).

Los vectores de expresión recombinante de la invención se pueden diseñar para la expresión de los PKSRP en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, los genes que codifican PKSRP se pueden expresar en células bacterianas tales como C. glutamicum, células de insectos (utilizando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura y otras células de hongos (Ver Romanos, M. A. y colaboradores, 1992, Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8: 423 - 488; van den Hondel, C. A. M. J. J. y colaboradores, 1991, Heterologous gene expression in filamentous fungi, en: More Gene Manipulations in Fungi, J. W. Bennet & L. L. Lasure, eds., páginas 396 - 428: Academic Press: San Diego; y van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J., 1991, Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F. y colaboradores, eds., páginas
1 - 28, Cambridge University Press: Cambridge), algas (Falciatore y colaboradores, 1999, Marine Biotechnology 1(3):
239 - 251), ciliados de los tipos: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella, y Stylonychia, especialmente del genero Stylonychia lemnae con vectores siguiendo métodos de transformación como los descritos en la Solicitud PCT No. WO 98/01572, y células de plantas multicelulares (Ver Schmidt, R. y Willmitzer, L., 1988, High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants, Plant Cell Rep. 583 - 586; Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, capítulo 6/7, S. 71 - 119 (1993); F. F. White, B. Jenes y colaboradores, Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. Kung und R. Wu, 128 - 43, Academic Press: 1993; Potrykus, 1991, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42: 205 - 225 y las referencias citadas allí) o células de mamífero. Las células hospederas adecuadas son discutidas adicionalmente en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, CA (1990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede ser transcrito y traducido in vitro, utilizando por ejemplo secuencias reguladoras de promotor T7 y polimerasa T7.

La expresión de polipéptidos en procariotas se lleva a cabo más a menudo con vectores que contienen promotores inducibles o constitutivos que dirigen la expresión ya sea de polipéptidos de fusión o que no son de fusión. Los vectores de fusión añaden una cantidad de aminoácidos a un polipéptido codificado allí, usualmente al terminal amino del polipéptido recombinante pero también al terminal C o fusionados dentro de regiones adecuadas en los polipéptidos. Tales vectores de fusión sirven típicamente tres propósitos: 1) para incrementar la expresión de un polipéptido recombinante; 2) para incrementar la solubilidad de un polipéptido recombinante; y 3) para ayudar en la purificación de un polipéptido recombinante actuando como un ligando en purificación por afinidad. A menudo, en vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión de la fracción de fusión y el polipéptido recombinante para permitir la separación del polipéptido recombinante de la fracción de fusión después de la purificación del polipéptido de fusión. Tales enzimas y sus secuencias de reconocimiento de cognatos, incluido el Factor Xa, trombina, y enteroquinasa.

Los vectores típicos de expresión por fusión incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. y Johnson, K. S., 1988, Gene 67: 31 - 40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutationa S-transferasa (GST), al polipéptido de enlazamiento de maltosa E, o polipéptido A, respectivamente, al polipéptido recombinante objetivo. En una modalidad, la secuencia de codificación del PKSRP se clona dentro de un vector de expresión pGEX para crear un vector que codifica un polipéptido de fusión que contiene, desde el terminal N hasta el terminal C, un polipéptido X en el sitio de escisión de trombina GST. Se puede purificar el polipéptido de fusión por medio de cromatografía de afinidad utilizando resina de glutationa - agarosa. Se puede recuperar PKSRP recombinante no fusionado a GST por medio de escisión del polipéptido de fusión con trombina.

Ejemplos de vectores de expresión de E. coli inducibles adecuados que no son proteínas de fusión incluyen pTrc (Amann y colaboradores, 1988, Gene 69: 301 - 315) y pET 11d (Studier y colaboradores, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60 - 89). La expresión de un gen objetivo por el vector pTrc está basada en la transcripción por la ARN polimerasa del hospedador a partir de un promotor de fusión híbrido trp-lac. La expresión del gen objetivo por el vector pET 11d está basada en la transcripción de un promotor de fusión T7 gn10-lac mediada por una ARN polimerasa viral coexpresada (T7 gn1). Esta polimerasa viral es suministrada por las cepas hospedadoras BL21(DE3) o HMS174(DE3) de un profago \lambda residente que alberga un gen T7 gn1 bajo el control de transcripción del promotor lacUV 5.

Una estrategia para maximizar la expresión de polipéptidos recombinantes es expresar el polipéptido en una bacteria hospedera con una capacidad deteriorada para escindir proteolíticamente el polipéptido recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press San Diego, California (1990) 119 - 128). Otra estrategia consiste en alterar la secuencia del ácido nucleico que va a ser insertado en un vector de expresión de tal modo que los codones individuales para cada aminoácido sean los utilizados preferentemente en la bacteria elegida para expresión, tal como C. glutamicum (Wada y colaboradores, 1992, Nucleic Acids Res. 20: 2111 - 218). Una alteración de este tipo de las secuencias de ácido nucleico de la invención puede llevarse a cabo por técnicas estándar de síntesis de ADN.

En otra modalidad, el vector de expresión de PPSRP es un vector de expresión de levadura. Ejemplo de vectores para expresión en la levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari, y colaboradores, 1987, Embo J. 6: 229 - 234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, 1982, Cell 30: 933 - 943), pJRY88 (Schultz y colaboradores, 1987, Gene 54: 113 - 123), y pYES2 (Invitrogen Corporation, San diego, CA). Vectores y métodos para la construcción de vectores apropiados para uso en otros hongos, tales como los hongos filamentosos, incluyen los detallados en: van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi", en: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy, y colaboradores, eds., páginas 1 - 28, Cambridge University Press, Cambridge.

Alternativamente, las PKSRP de la invención pueden expresarse en células de insecto utilizando vectores de expresión de baculovirus. Vectores de baculovirus disponibles para expresión de polipéptidos en células de insecto cultivadas (por ejemplo, células Sf 9) incluyen la serie pAc (Smith y colaboradores, 1983 Mol. Cell Biol. 3: 2156 - 2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers, 1989, Virology 170: 31 - 39).

En otra modalidad adicional, un ácido nucleico para PKSRP de la invención se expresa en células de mamífero utilizando un vector de expresión de mamífero. Ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, B., 1987, Nature 329 - 840) y pMT2PC (Kaufman y colaboradores, 1987, EMBO J. 6:187 - 195). Cuando se utilizan en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión son proporcionadas a menudo por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores utilizados comúnmente se derivan de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y Virus 40 de los Simios. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como para células eucariotas, véanse los capítulos 16 y 17 de Sambrook, J., Fritsh, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

En otra modalidad, el vector de expresión recombinante de mamífero es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula particular (por ejemplo, se utilizan elementos reguladores específicos de tejidos para expresar el ácido nucleico). Se conocen en el arte elementos reguladores específicos de tejidos. Los ejemplos no limitantes de promotores específicos de tejidos adecuados incluyen el promotor albúmina (específico del hígado; Pinkert y colaboradores, 1987, Genes Dev. 1: 268 - 277), promotores linfoideos específicos (Calame y Eaton, 1988 Adv. Immunol. 43: 235 - 275), en particular promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimore, 1989, EMBO J. 8: 729 - 733) e inmunoglobulinas (Bane\etai y colaboradores, 1983, Cell 33: 729 - 740; Queen y Baltimore, 1983, Cell 33: 741 - 748), promotores específicos de neuronas (por ejemplo, el promotor de neurofilamentos; Birne y Ruddle, 1989, PNAS 86: 5473 - 5477), promotores específicos de páncreas (Edlund y colaboradores, 1985, Science 230: 212 - 216), y promotores específicos de las glándulas mamarias (por ejemplo, promotor de suero de leche; patente estadounidense No. 4.873.316 y la Publicación de Solicitud de Patente Europea No. 264.166). Están abarcados también promotores regulados por desarrollo, por ejemplo los promotores hox de múrido (Kessel y Gruss, 1990, Science 249: 374 - 379) y el promotor de fetopolipéptido (Campes y Tilghman, 1989, Genes Dev. 3: 537 - 546).

Para la transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y de la técnica de transfección utilizada, únicamente una pequeña fracción de células puede integrar el ADN foráneo dentro de su genoma. Con el propósito de identificar y seleccionar estos integrantes, se introduce generalmente un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a los antibióticos) en las células hospederas junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen a aquellos que confieren resistencia a los medicamentos, tales como G418, higromicina, y metotrexato, o en plantas que confieren resistencia a herbicidas tales como glifosato o glufosinato. Se pueden introducir moléculas de ácido nucleico que codifican un marcador seleccionable en una célula hospedera sobre el mismo vector como aquel que codifica un PKSRP o se pueden introducir sobre un vector separado. Las células transfectadas en forma estable con la molécula introducida de ácido nucleico se pueden identificar, por ejemplo, por selección del medicamento (por ejemplo, las células que han incorporado al gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).

En una modalidad preferida de la presente invención, los PKSRP se expresan en plantas y células de plantas tales como células de plantas unicelulares (por ejemplo algas) (Ver Falciatore y colaboradores, 1999, Marine Biotechnology 1(3): 239 - 251 y las referencias citadas allí) y células de plantas de plantas superiores (por ejemplo, los espermatofitos, tales como plantas de cultivo). Se puede "introducir" un PKSRP en una célula de planta por cualquier medio, incluyendo transfección, transformación o transducción, electroporación, bombardeo de partículas, agroinfección, y similares. Un método de transformación conocido por aquellos capacitados en el arte es sumergir una planta en floración en una solución de Agrobacteria, en donde el Agrobacteria contiene al ácido nucleico que codifica para PKSRP, seguido por reproducción de los gametos transformados.

Se pueden encontrar otros métodos adecuados para transformación o transfección de células hospederas que incluyen células de plantas en Sambrook, y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, y en otros manuales de laboratorio tales como Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, ed: Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Como la tolerancia al estrés biótico y abiótico es una característica general que se desea que sea heredada en una gran variedad de plantas como maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, soja, cacahuete, algodón, semilla de colza y canola, yuca, pimiento, girasol y tagetes, plantas solanáceas como la patata, tabaco, berenjena, y tomate, especie Vicia, arveja, alfalfa, plantas de arbusto (café, cacao, té), especies de sauce, árboles (palma aceitera, coco), pastos perennes, y cultivos forrajeros, estas plantas de cultivo son también plantas objetivo preferidas pata modificación por ingeniería genética como una modalidad adicional de la presente invención. Las planta forrajeras incluyen, pero no se limitan a, Wheatgrass, Canarygrass, Bromegrass, Wildrye Grass, Bluegrass, Orchardgrass, Alfalfa, Salfoin, Birdsfoot Trefoil, Alsike Clover, Red Clover, y Sweet Clover.

En una modalidad de la presente invención, la transfección de un PKSRP en una planta se logra por medio de transferencia génica mediada por Agrobacterium. La transformación de la planta mediada por Agrobacterium puede realizarse utilizando por ejemplo la cepa GV3101 (pMP90) (Koncz y Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 383 - 396) o la cepa LBA4404 (Clontech) de Agrobacterium tumefaciens. Se puede lograr la transformación por medio de técnicas estándar de transformación y regeneración (Deblaere y colaboradores, 1994, Nucl. Acids Res. 13: 4777 - 4788; Gelvin, Stanton B. y Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2^{nd} Ed. - Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. - en Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R.; Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Por ejemplo, se puede transformar la colza por medio de la transformación del cotiledón o el hipocotiledón (Moloney y colaboradores, 1989, Plant Cell Report 8: 238 - 242; De Block y colaboradores, 1989, Plant Physiol. 91: 694 - 701). El uso de antibióticos para selección de plantas y Agrobacterium depende del vector binario y de la cepa de Agrobacterium utilizada para la transformación. La selección de la semilla de colza se realiza normalmente utilizando kanamicina como marcador seleccionable de plantas. La transferencia de genes al lino mediada por Agrobacterium puede realizarse utilizando, por ejemplo, una técnica descrita por Mlynarovay colaboradores, 1994, Plant Cell Report 13: 282 - 285. Adicionalmente, la transformación de la soja puede realizarse utilizando por ejemplo una técnica descrita en la patente europea No. 0 424 047, la patente estadounidense No. 5.322.783, en la patente europea No. 0397 687, en la patente estadounidense No. 5.376.543, y en la patente estadounidense No. 5.169.770. La transformación de maíz se puede lograr por medio de bombardeo de partículas, incorporación de ADN mediada por polietilén glicol o a través de la técnica de la fibra de carburo de silicio (Ver, por ejemplo, Freeling y Walbot "The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Un ejemplo específico de transformación de maíz se encuentra en la patente estadounidense No. 5.990.387, y un ejemplo específico de transformación de trigo se puede encontrar en la solicitud PCT No. WO 93/07256.

De acuerdo con la presente invención, se puede mantener en forma estable el PKSRP introducido en la célula de la planta si se lo incorpora dentro de un replicón autónomo no cromosómico o integrado en los cromosomas de la planta. Alternativamente, el PKSRP introducido puede estar presente sobre un vector extracromosómico no replicante y ser expresado en forma transitoria o transitoriamente activa.

En una modalidad, se puede crear un microorganismo recombinante homólogo en donde el PKSRP se integra dentro de un cromosoma, se prepara un vector que contiene al menos una porción de un gen que codifica para PKSRP dentro del cual se ha introducido una supresión, adición, o sustitución para alterar así, por ejemplo, romper funcionalmente, al gen que codifica para PKSRP. Preferiblemente, el gen que codifica para PKSRP es un gen que codifica para PKSRP de Physcomitrella patens, pero puede ser un homólogo de una planta relacionada o incluso de una fuente de mamífero, levadura, o insecto. En una modalidad, se diseña el vector de tal manera que, por recombinación homóloga, el gen endógeno que codifica para PKSRP es roto funcionalmente (es decir, no codifica más un polipéptido funcional; también conocido como un vector desactivado). Alternativamente, se puede diseñar el vector de tal manera que, por recombinación homóloga, se muta o se altera el gen endógeno que codifica para PKSRP pero que aún codifica un polipéptido funcional (por ejemplo, se puede alterar la región reguladora secuencia arriba para alterar así la expresión del PKSRP endógeno). Para crear una mutación puntual a través de recombinación homóloga, se pueden utilizar híbridos de ADN-ARN en una técnica conocida como quimeroplastia (Cole-Strauss y colaboradores, 1999, Nucleic Acids Research 27(5): 1323 - 1330 y Kmiec, 1999 Gene therapy American Scientist. 87 (3): 240 - 247). Se conocen también en el arte procedimientos de recombinación homóloga en Physcomitrella patens y están contemplados para uso aquí.

Mientras que en el vector de recombinación homóloga, la porción alterada del gen que codifica para PKSRP está flanqueada en sus extremos 5' y 3' por medio de una molécula adicional de ácido nucleico del gen que codifica para PKSRP para permitir que ocurra la recombinación homóloga entre el gen exógeno que codifica para PKSRP transportado por el vector y un gen endógeno que codifica para PKSRP, en un microorganismo o planta. La molécula adicional de flanqueo de ácido nucleico que codifica para PKSRP es de longitud suficiente para recombinación homóloga exitosa con el gen endógeno. Típicamente, varios cientos de pares de bases hasta kilobases de ADN de flanqueo (tanto en los extremos 5' como 3') están incluidos en el vector. Ver, por ejemplo, Thomas, K. R., y Capecchi, M. R., 1987, Cell 51: 503 para una descripción de vectores de recombinación homóloga o Strepp y colaboradores, 1998, PNAS, 95 (8): 4368 - 4373 para recombinación con base en ADNc en Physcomitrella patens). Se introduce el vector en un microorganismo o célula de una planta (por ejemplo, a través de ADN mediado por polietilén glicol), y se seleccionan células en las cuales el gen introducido que codifica para PKSRP se ha recombinado en forma homóloga con el gen endógeno que codifica para PKSRP utilizando técnicas conocidas en el arte.

En otra modalidad, se pueden producir microorganismos recombinantes que contengan sistemas seleccionados que permitan la expresión regulada del gen introducido. Por ejemplo, la inclusión de un gen para PKSRP sobre un vector colocándolo bajo el control del operón lac permite la expresión del gen para PKSRP únicamente en presencia de IPTG. Tales sistemas reguladores son bien conocidos en el arte.

Ya sea que se encuentre presente en un vector extracromosómico no replicante o en un vector que está integrado dentro de un cromosoma, el polinucleótido para PKSRP preferiblemente reside en un casete de expresión de la planta. Un casete de expresión de la planta contiene preferiblemente secuencias reguladoras capaces de dirigir la expresión génica en células de plantas que están operativamente enlazadas de tal manera que cada secuencia pueda cumplir su función, por ejemplo, terminación de la transcripción por medio de señales de poliadenilación. Las señales preferidas de poliadenilación son aquellas que se originan a partir del t-AND de Agrobacterium tumefaciens tales como el gen 3 conocido como octopina-sintasa del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen y colaboradores, 1984, EMBO J. 3:835) o equivalentes funcionales del mismo pero también son adecuados todos los otros terminadores funcionalmente activos en planta. Dado que en muchos casos la expresión de genes vegetales no está limitada a los niveles de la transcripción, un casete de expresión en plantas contiene preferiblemente otras secuencias enlazadas operativamente como intensificadores de la traducción, tales como la secuencia multiplicadora de la velocidad que contiene la secuencia líder 5' no traducida del virus del mosaico del tabaco que refuerza la proporción de polipéptido por ARN (Gallie y colaboradores, 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693 - 8711). Los ejemplos de vectores de expresión de plantas incluyen aquellos detallados en: Becker, D. y colaboradores, 1992, New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20: 1195 - 1197; y Bevan, M. W., 1984, Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12: 8711 - 8721; y Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, eds.: Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15 - 38.

La expresión génica de la planta debe estar operativamente enlazada a un promotor apropiado que confiere expresión génica en una forma oportuna, específica para la célula o el tejido. Los promotores útiles en los casetes de expresión de la invención incluyen a cualquier promotor que sea capaz de iniciar la transcripción en una célula de una planta. Tales promotores incluyen, pero no se limitan a, aquellos que pueden ser obtenidos de plantas, virus de plantas, y bacterias que contienen genes que se expresan en plantas, tales como Agrobacterium y Rhizobium.

El promotor puede ser constitutivo, inducible, de desarrollo preferiblemente de una etapa, preferiblemente de un tipo de célula, preferiblemente de un tejido o preferiblemente de un órgano. Los promotores constitutivos son activos bajo la mayoría de las condiciones. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen a los promotores 19S y 35S de CaMV (Odell y colaboradores, 1985, Nature 313: 810 - 812), al promotor 35S de sX CaMV (Kay y colaboradores, 1987, Science 236: 1299 - 1302) al promotor Sep1, al promotor de actina del arroz (McElroy y colaboradores, 1990, Plant Cell 2: 163 - 171), al promotor de actina de Arabidopsis, al promotor de ubiquitina (Christensen y colaboradores, 1989, Plant Molec Biol 18: 675 - 689); pEmu (Last y colaboradores, 1991, Theor Appl Genet 81: 581 - 588), al promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia, al promotor Smas (Velten y colaboradores, 1984, EMBO J 3: 2723 - 2730), al promotor GRP1-8, al promotor de la cinamil alcohol deshidrogenasa (patente estadounidense No. 5.683.439), promotores del T-ADN de Agrobacterium, tales como la manopina sintasa, nopalina sintasa, y octopina sintasa, la pequeña subunidad del promotor de la ribulosa bifosfato carboxilasa (ssuRUBISCO), y similares.

Los promotores inducibles son activos bajo ciertas condiciones ambientales, tales como la presencia o la ausencia de un nutriente o metabolito, calor o frío, luz, ataque de patógenos, condiciones anaerobias, y similares. Por ejemplo, el promotor hsp80 de Brassica es inducido por choque térmico; el promotor PPDK es inducido por luz; el promotor PR-1 del tabaco, Arabidopsis, y maíz son inducibles por infección con un patógeno; y el promotor Adh1 es inducido por hipoxia y estrés por frío. La expresión del gen de la planta puede ser facilitada también por un promotor inducible (para revisión, véase Gatz, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89 - 108). Son especialmente adecuados los promotores químicamente inducibles si se desea que la expresión génica tenga lugar de una manera específica en el tiempo. Los ejemplos de tales promotores son un promotor inducible por ácido salicílico (solicitud PCT No. WO 95/19443), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz y colaboradores, 1992, Plant J. 2: 397 - 404) y un promotor inducible por etanol (WO 93/21334).

En una modalidad preferida de la presente invención, el promotor inducible es un promotor inducible por estrés. Los promotores inducibles por estrés incluyen, pero no se limitan a, Cor78 (Chak y colaboradores, 2000, Planta 210: 875 - 883; Hovath y colaboradores, 1993, Plant Physiol. 103: 1047 - 1053), Cor15a (Artus y colaboradores, 1996, PNAS 93(23): 13404 - 09), Rci2A (Medina y colaboradores, 2001, Plant Physiol. 125: 1655 - 66; Nylander y colaboradores, 2001, Plant Mol. Biol. 45: 341 - 52; Navarre y Goffeau, 2000, EMBO J. 19: 2515 - 24; Capel y colaboradores, 1997, Plant Physiol. 115: 569 - 76), Rd22 (Xiong y colaboradores, 2001, Plant Cell 13: 2063 - 83; Abe y colaboradores, 1997, Plant Cell 9: 1859 - 68; Iwasaki y colaboradores, 1995, Mol. Gen. Genet. 247: 391 - 8), cDet6 (Lang y Palve, 1992, Plant Mol. Biol. 20: 951 - 62), ADH1 (Hoeren y colaboradores, 1998, Genetics 149:
479 - 90), KAT1 (Nakamura y colaboradores, 1995, Plant Physiol. 109: 371 - 4), KST1 (Müller-Rober y colaboradores, 1995, EMBO14: 2409 - 16), Rha1 (Terryn y colaboradores, 1993, Plant Cell 5: 1761 - 9; Terryn y colaboradores, 1992, FEBS Lett. 299(3): 287 - 90), ARSK1 (Atkinson y colaboradores, 1997, GenBank Accession # L22302, y la solicitud PCT No. WO 97/20057), PtxA (Plesch y colaboradores, GenBank Accession # X67427), SbHRGP3 (Ahn y colaboradores, 1996, Plant Cell 8: 1477 - 90), GH3 (Liu y colaboradores, 1994, Plant Cell 6: 645 - 57), el promotor génico de PRP1 inducible por patógenos (Ward y colaboradores, 1993, Plant. Mol. Biol. 22: 361 - 366), el promotor de hsp80 del tomate inducible por calor (patente estadounidense No. 5187267), el promotor de alfa amilasa inducible por frío de la patata (solicitud PCT No. WO 96/12814), o el promotor de pinII inducible por lesiones (patente europea No. 375091). Para otros ejemplos de promotores inducibles por sequía, frío, y sal, tales como el promotor RD29A, ver Yamaguchi-Shinozalei y colaboradores, 1993, Mol. Gen. Genet. 236: 331 - 340.

Los promotores preferidos de etapas de desarrollo se expresan preferencialmente en ciertas etapas de desarrollo. Los promotores preferidos de órganos y tejidos incluyen a aquellos que se expresan preferencialmente en ciertos tejidos u órganos, tales como hojas, raíces, semillas, o xilema. Los ejemplos de promotores preferidos de tejidos y preferidos de órganos incluyen, pero no se limitan a preferidos de la fruta, preferidos del óvulo, preferidos del tejido masculino, preferidos de la semilla, preferidos del integumento, preferidos de tubérculos, preferidos del tallo, preferidos del pericarpio, y preferidos de las hojas, preferidos del estigma, preferidos del polen, preferidos de la antera, preferidos de los pétalos, preferidos del sépalo, preferidos del pedicelo, preferidos de la silicua, preferidos del tronco, promotores preferidos de la raíz, y similares. Los promotores preferidos de la semilla se expresan preferencialmente durante el desarrollo de la semilla y/o la germinación. Por ejemplo, los promotores preferidos de la semilla pueden ser preferidos del embrión, preferidos del endospermo, y preferidos del recubrimiento de la semilla. Ver Thompson y colaboradores, 1989, BioEssays 10: 108. Los ejemplos de promotores preferidos de la semilla incluyen, pero no se limitan a, celulosa sintasa (celA), Cim1, gamma-zeína, globulina-1, zeína del maíz de 19 kD (cZ19B1), y similares.

Otros promotores adecuados preferidos de tejidos o preferidos de órganos incluyen al promotor del gen de la napina de semilla de colza (patente estadounidense No. 5.608.152), al promotor de USP de Vicia faba (Baeumlein y colaboradores, 1991, Mol Gen Genet. 225 (3): 459 - 67), al promotor de oleosina de Arabidopsis (solicitud PCT No. WO 98/45461), el promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (patente estadounidense No. 5.504.200), el promotor de Bce4 de Brassica (solicitud PCT No. WO 91/13980), o el promotor B4 de leguminosa (LeB4; Baeumlein y colaboradores, 1992, Plant Journal, 2(2): 233 - 9) así como promotores que confieren expresión específica de semilla en plantas monocotiledóneas como el maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etc. Los promotores adecuados para señalar son el promotor del gen 1pt1 o 1pt2 de cebada (solicitud PCT No. WO 95/15389 y solicitud PCT No. WO 95/23230) o aquellos descritos en la solicitud PCT No. WO 99/16890 (promotores del gen de la hordeína de la cebada, el gen de la glutelina del arroz, el gen de la orizina del arroz, el gen de la prolamina del arroz, el gen de la gliadina del trigo, el gen de la glutelina del trigo, el gen de la glutelina de la avena, el gen de la kasirina del Sorgo, y el gen de la secalina del centeno).

Otros promotores útiles en los casetes de expresión de la invención incluyen, pero no se limitan a, el promotor principal de proteína de enlazamiento de clorofila a/b, los promotores de histona, el promotor Ap3, el promotor de \beta-conglicina, el promotor de napina, el promotor de lectina de soja, el promotor de zeína de maíz de 15 kD, el promotor de zeína de 22 kD, el promotor de zeína de 27 kD, el promotor de zeína g, los promotores cerosos encogido 1, encogido 2 y bronce, el promotor Zm13 (patente estadounidense No. 5.086.169), los promotores de poligalacturonasa del maíz (PG) (patentes estadounidenses Nos. 5.412.085 y 5.545.546), y el promotor SGB6 (patente estadounidense No. 5.470.359), así como promotores naturales o sintéticos.

Se puede obtener flexibilidad adicional en el control de la expresión de genes heterólogos en plantas por medio del uso de dominios de enlazamiento de ADN y elementos de respuesta de fuentes heterólogas fes decir, dominios de enlazamiento de ADN de fuentes diferentes a plantas). Un ejemplo de tal dominio heterólogo de enlazamiento de ADN es el dominio de enlazamiento del ADN de LexA (Brent y Ptashne, 1985, Cell 43: 729 - 736).

La invención proporciona adicionalmente un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de DNA que codifica para PKSRP de la invención clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Es decir, la molécula de ADN está enlazada operativamente a una secuencia reguladora de tal manera que permite la expresión (por transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es antisentido a un ARNm que codifica para PKSRP. Pueden escogerse secuencias reguladoras enlazadas operativamente a una molécula de ácido nucleico clonada en la orientación antisentido, que dirigen la expresión continua de la molécula de ARN antisentido en una diversidad de tipos de célula. Por ejemplo, pueden seleccionarse promotores virales y/o reforzadores, o secuencias reguladoras que dirigen la expresión constitutiva, específica del tejido, o de un tipo específico de célula de ARN antisentido. El vector de expresión antisentido puede encontrarse en la forma de un plásmido recombinante, fagémido, o virus atenuado en donde se producen los ácidos nucleicos antisentido bajo el control de una región reguladora de alta eficiencia. Se puede determinar la actividad de la región reguladora por medio del tipo de célula en el que se introduce el vector. Para una exposición de la regulación de la expresión génica utilizando genes antisentido véase Weintraub H. y colaboradores, 1986, Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986 y Mol y colaboradores, 1990, FEBS Letters 268: 427 - 430.

Otro aspecto de la invención se refiere a células hospedadoras en las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos "célula hospedadora" y "célula hospedadora recombinante" se utilizan en forma intercambiable aquí. Debe entenderse que dichos términos se refieren no sólo a la célula particular de que se trata, sino que se aplican también a la progenie o a la progenie potencial de dicha célula. Dado que pueden producirse ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula originaria, pero está incluida todavía dentro del alcance del término tal como se lo utiliza en esta memoria. Una célula hospedadora puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, un PKSRP puede expresarse en células bacterianas tales como C. glutamicum, células de insecto, células de hongos o células de mamífero (tal como las células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS), algas, ciliados, células de plantas, hongos u otros microorganismos tales como C. glutamicum. Otras células hospedadoras adecuadas son conocidas por aquellos capacitados en la técnica.

Se puede utilizar una célula hospedera de la invención, tal como una célula hospedera procariota o eucariota en cultivo, para producir (es decir, expresar) un PKSRP. Por lo tanto, la invención proporciona además métodos para producir los PKSRP utilizando las células hospederas de la invención. En una modalidad, el método comprende cultivar las células hospederas de la invención (en las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica un PKSRP, o en cuyo genoma se ha introducido un gen que codifica un tipo silvestre o alterado de PKSRP) en un medio adecuado hasta que se produce PKSRP. En otra modalidad, el método comprende además el aislamiento de los PKSRP del medio o de la célula hospedera.

Otro aspecto de la invención se relaciona con los PKSRP aislados, y las porciones biológicamente activas de los mismos. Un polipéptido "aislado" o "purificado" o una porción biológicamente activa del mismo están libres de algo del material celular cuando se los produce por medio de técnicas de ADN recombinante, o precursores químicos u otros químicos cuando se los sintetiza químicamente. La expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de PKSRP en las cuales el polipéptido está separado de algunos de los componentes celulares de las células en los cuales es producido naturalmente o en forma recombinante. En una modalidad, la expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de un PKSRP que tiene aproximadamente menos de 30% (en peso seco) de material que no es PKSRP (también denominado aquí como un "polipéptido contaminante"), más preferiblemente aproximadamente menos de 20% de material que no es PKSRP, aún más preferiblemente aproximadamente menos de 10% de material que no es PKSRP, y lo más preferible aproximadamente menos de 5% de material que no es PKSRP.

Cuando se produce en forma recombinante el PKSRP o una porción biológicamente activa del mismo, está también preferiblemente sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa aproximadamente menos del 20%, más preferiblemente aproximadamente menos del 10%, y lo más preferible aproximadamente menos del 5% del volumen de la preparación del polipéptido. La expresión "sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos" incluye preparaciones del PKSRP en las cuales el polipéptido es separado de precursores químicos o de otros químicos que están involucrados en la síntesis del polipéptido. En una modalidad, la expresión "sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos" incluye preparaciones de un PKSRP que tiene aproximadamente menos de 30% (en peso seco) de precursores químicos o de químicos que no son PKSRP, más preferible aproximadamente menos del 20% de precursores químicos o de químicos que no son PKSRP, aún más preferible aproximadamente menos del 10% de precursores químicos o de químicos que no son PKSRP, y lo más preferible aproximadamente menos del 5% de precursores químicos o de químicos que no son PKSRP. En modalidades preferidas, los polipéptidos aislados, o las porciones biológicamente activas de los mimos, carecen de polipéptidos contaminantes del mismo organismo del cual se deriva el PKSRP. Típicamente, tales polipéptidos son producidos por expresión recombinante, por ejemplo, de un PKSRP de Physcomitrella patens, Brassica napus, Glycine max, u Oryza sativa en plantas diferentes a Physcomitrella patens, Brassica napus, Glycine max, u Oryza sativa, o microorganismos tales como C. glutamicum, ciliados, algas u hongos.

Las moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, homólogos de polipéptido, polipéptidos de fusión, iniciadores, vectores, y las células hospederas descritas aquí pueden ser utilizadas enuno o más de los siguientes métodos: identificación de Physcomitrella patens, Brassica napus, Glycine max, o Oryza sativa y organismos relacionados; mapeo de genomas de organismos relacionados con Physcomitrella patens, Brassica napus, Glycine max, u Oryza sativa; identificación y localización de secuencias de Physcomitrella patens, Brassica napus, Glycine max, u Oryza sativa de interés; estudios de evolución; determinación de regiones de PKSRP requeridas para funcionamiento; modulación de una actividad de PKSRP; modulación del metabolismo de una o más funciones celulares; modulación del transporte transmembrana de uno o más compuestos; modulación de la resistencia al estrés; y modulación de la expresión de ácidos nucleicos para PKSRP.

El moho Physcomitrella patens representa uno de los miembros de la familia del musgo. Está relacionado con otros hongos tales como Ceratodon purpureus que es capaz de crecer en ausencia de luz. Hongos como Ceratodon y Physcomitrella comparten un alto grado de identidad de secuencia sobre la secuencia del ADN y el nivel de polipéptido permitiendo el uso de selección heteróloga de moléculas de ADN con sondas que evolucionan de otros hongos u organismos, permitiendo así la derivación de una secuencia de consenso adecuada para selección heteróloga o anotación funcional y predicción de las funciones génicas en otras especies. La habilidad para identificar tales funciones puede tener por lo tanto una relevancia significativa, por ejemplo, predicción de la especificidad del sustrato de las enzimas. Además, estas moléculas de ácido nucleico pueden server como puntos de referencia para el mapeo de genomas de mohos, o de genomas de organismos relacionados.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican para PKSRP de la invención tienen una variedad de usos. Más importante aún, las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de la presente invención pueden ser utilizadas para transformar plantas, induciendo así la tolerancia a los estreses tales como sequía, salinidad alta y frío o doblamiento. La presente invención proporciona por lo tanto una planta transgénica transformada por medio de un ácido nucleico para PKSRP, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta resulta en mayor tolerancia al estrés ambiental o mayor resistencia al doblamiento comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta. La planta transgénica puede ser una monocotiledónea o una dicotiledónea. La invención permite además que la planta transgénica pueda ser seleccionada entre maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, soja, cacahuete, algodón, semillas de colza, canola, yuca, pimiento, girasol, tagetes, plantas solanáceas, patatas, tabaco, berenjena, tomate, especie Vicia, guisantes, alfalfa, café, cacao, te, especies de sauce, palma aceitera, coco, hierba perenne, y cultivos forrajeros, por ejemplo.

En particular, la presente invención describe el uso de la expresión de PK-11 de Physcomitrella patens; la modificación genética para tolerancia a la sequía; tolerancia a la sal, tolerancia al frío, y/o plantas resistentes al doblamiento. Esta estrategia ha sido demostrada aquí para Arabidopsis thaliana, Semilla de canola/Canola, sojas, maíz, y trigo, pero su aplicación no está restringida a estas plantas. Por lo tanto, la invención proporciona plantas transgénicas que contienen un PKSRP tal como PK-11 como se define en la SEQ ID NO: 12, en donde la planta tiene una mayor tolerancia al estrés ambiental seleccionado entre sequía, mayor contenido de sal, mayor o menor temperatura. En modalidades preferidas, el estrés ambiental es sequía o temperaturas bajas.

Por lo tanto, la invención proporciona un método para producir una planta transgénica con un ácido nucleico que codifica para PKSRP, en donde la expresión del ácido nucleico en la planta resulta en una mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta comprendiendo el método: (a) la introducción en una célula de una planta de un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica para PKSRP, y (b) la generación a partir de la célula de la planta de una planta transgénica con una mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta. También están incluidos dentro de la presente invención métodos para incrementar la resistencia de una planta al doblamiento, los cuales comprenden la transformación de una célula de una planta con un casete de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica un PKSRP y la generación de la célula transformada de una planta. La célula de la planta incluye, pero no se limita a, un protoplasto, una célula productora de gametos, y una célula que se regenera en una planta completa. Como se lo utiliza aquí, el término "transgénico" se refiera a cualquier planta, célula de planta, callo, tejido de planta, o parte de una planta, que contiene todo o parte de al menos un polinucleótido recombinante. En muchos casos, todo o parte del polinucleótido recombinante es integrado en forma estable dentro de un cromosoma o elemento extracromosómico estable, de modo que pase a sucesivas generaciones. En modalidades preferidas, el ácido nucleico que codifica para PKSRP, codifica una proteína que incluye la SEQ ID NO: 12.

La presente invención también proporciona un método para la modulación de la tolerancia de una planta a un estrés ambiental que comprende, la modificación de la expresión de un ácido nucleico que codifica para PKSRP en la planta. La tolerancia de la planta al estrés ambiental se puede incrementar o disminuir, incrementando o disminuyendo la expresión de un PKSRP, respectivamente. Preferiblemente, la tolerancia de la planta al estrés ambiental se incrementa incrementando la expresión de un PKSRP. La expresión de un PKSRP se puede modificar por medio de cualquier método conocido por aquellos entrenados en la técnica. Los métodos para incrementar la expresión de los PKSRP se pueden utilizar en donde la planta es o bien transgénica o no transgénica. En los casos en donde la planta es transgénica, se puede transformar la planta con un vector que contiene a cualquiera de los ácidos nucleicos anteriormente descritos que codifican para PKSRP, o se puede transformar la planta con un promotor que dirija la expresión de PKSRP nativo en la planta, por ejemplo. La invención permite que tal promotor pueda ser específico del tejido, regulado por desarrollo, o inducido por estrés. Alternativamente, las plantas no transgénicas pueden tener expresión nativa de PKSRP modificada por inducción de un promotor nativo. La expresión de PK-1 como se define en la SEQ ID NO: 11, en plantas objetivo, se puede lograr por medio de, pero sin limitarse a, uno de los siguientes ejemplos: (a) un promotor constitutivo, (b) un promotor inducible por estrés, (c) un promotor inducido químicamente, y (d) la sobreexpresión del promotor modificado por ingeniería genética, por ejemplo, con factores de transcripción derivados de un dedo de cinc (Greisman y Pabo, 1997, Science 275: 657).

En una modalidad preferida, la transcripción del PKSRP es modulada utilizando factores de transcripción derivados de un dedo de cinc (ZFP) como se describe en Greisman y Pabo, 1997, Science 275: 657 y fabricado por Sangamo Biosciences, Inc. Estos ZFP incluyen tanto un dominio de reconocimiento de ADN como un dominio funcional que causa la activación o represión de un ácido nucleico objetivo tal como un ácido nucleico que codifica para PKSRP. Por lo tanto, se pueden crear ZFP de activación y represión, que reconozcan específicamente los promotores del PKSRP descritos anteriormente y utilizados para incrementar o disminuir la expresión del PKSRP en una planta, modulando así la tolerancia al estrés de la planta. También se describe aquí la identificación de los homólogos de PK-11 como se define en la SEQ ID NO: 11, en una planta objetivo así como el promotor del homólogo. La invención también proporciona un método para incrementar la expresión de un gen de interés dentro de una célula hospedera comparada con una variedad de tipo silvestre de la célula hospedera, en donde se transcribe el gen de interés en respuesta a un PKSRP, que comprende: (a) la transformación de la célula hospedera con un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica para PKSRP, y (b) que expresa al PKSRP dentro de la célula hospedera, incrementando así la expresión del gen transcrito en respuesta al PKSRP, comparado con una variedad de tipo silvestre de la célula hospedera.

Además de la introducción de las secuencias de ácido nucleico que codifican para PKSRP en plantas transgénicas, también se pueden utilizar estas secuencias para identificar que un organismo es Physcomitrella patens, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, o un pariente cercano de los mismos. También, se las puede utilizar para identificar la presencia de Physcomitrella patens, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, o un pariente cercano de los mismos en una población mezclada de microorganismos. La invención proporciona las secuencias de ácido nucleico de una cantidad de genes de Physcomitrella patens, Brassica napus, Glycine max, y Oryza sativa; sondeando al ADN genómico extraído de un cultivo de una población única o mezclada de microorganismos bajo condiciones estrictas con una sonda que abarca una región de un gen de Physcomitrella patens, Brassica napus, Glycine max, u Oryza sativa que es única para este organismo, se puede determinar si este organismo está presente.

Además, las moléculas de ácido nucleico y de polipéptido de la invención pueden servir como marcadores para regiones específicas del genoma. Esto tiene utilidad no solamente en el mapeo del genoma, sino también en estudios funcionales de polipéptidos de Physcomitrella patens, Brassica napus, Glycine max, y Oryza sativa. Por ejemplo, para identificar la región del genoma a la cual se enlaza un polipéptido particular de enlazamiento al ADN de Physcomitrella patens, se podría digerir el genoma de Physcomitrella patens, e incubar los fragmentos con el polipéptido para enlazamiento de ADN. Esos fragmentos que enlazan al polipéptido pueden ser adicionalmente sondeados con las moléculas de ácido nucleico de la invención, preferiblemente con etiquetas fácilmente detectables. El enlazamiento de dicha molécula de ácido nucleico con el fragmento de genoma permite la localización del fragmento con el mapa del genoma de Physcomitrella patens, y, cuando se lo lleva a cabo múltiples veces con diferentes enzimas, se facilita una rápida determinación de la secuencia de ácido nucleico a la cual se enlaza el polipéptido. Además, las moléculas de ácido nucleico de la invención puede ser suficientemente idénticas a las secuencias de especies relacionadas de tal manera que estas moléculas de ácido nucleico pueden servir como marcadores para la construcción de un mapa genómico en musgos relacionados.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican para PKSRP de la invención son también útiles para estudios evolutivos y estructurales de los péptidos. Los procesos metabólicos y de transporte en los cuales participan las moléculas de la invención son utilizados por una gran variedad de células procariotas y eucariotas; comparando las secuencias de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención con aquellas que codifican enzimas similares de otros organismos, se puede evaluar la relación de la evolución de los organismos. En forma similar, tal comparación permite una evaluación de cuáles regiones de la secuencia son conservadas y cuáles no, lo que puede ayudar a determinar aquellas regiones del polipéptido que son esenciales para el funcionamiento de la enzima. Este tipo de determinación es valiosa para estudios de ingeniería genética de polipéptidos y puede proporcionar una indicación de lo que el polipéptido puede tolerar en términos de mutagénesis sin perder su función.

La manipulación de la moléculas de ácido nucleico que codifican para PKSRP de la invención puede resultar en la producción de los PKSRP que tienen diferencias funcionales con los PKSRP de tipo silvestre. Estos polipéptidos pueden ser mejorados en eficiencia o en actividad, pueden estar presentes en mayor número en la célula que lo usual, o pueden disminuir en eficiencia o en actividad.

Existen varios mecanismos por medio de los cuales la alteración de un PKSRP de la invención puede afectar directamente la respuesta al estrés y/o la tolerancia al estrés. En el caso de plantas que expresan a los PKSRP, un mayor transporte puede conducir a una mejor repartición de la sal y/o del soluto dentro del tejido y de los órganos de la planta. Incrementando ya sea el número o la actividad de las moléculas transportadoras que exportan moléculas iónicas de la célula, puede ser posible afectar la tolerancia a la sal por parte de la célula.

El efecto de la modificación genética en plantas, C. glutamicum, hongos, algas, o ciliados sobre la tolerancia al estrés puede ser evaluado cultivando el microorganismo modificado o la planta bajo condiciones inferiores a las apropiadas y luego analizando las características de crecimiento y/o el metabolismo de la planta. Tales técnicas de análisis son conocidas por alguien entrenado en el arte, e incluyen peso seco, peso húmedo, síntesis de polipéptidos, síntesis de carbohidratos, síntesis de lípidos, tasas de evapotranspiración, rendimiento general de la planta y/o del cultivo, floració, reproducción, composición de semillas, crecimeitno de la raíz, tasas de respiración, tasas de fotosíntesis, etc (Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm y colaboradores, 1993 Biotechnology, vol. 3, Capítulo III: Product recovery and purification, páginas 469 - 714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. y colaboradores, 1988, Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J. F. y Cabral, J. M. S., 1992, Recovery processes for biological materials, John Wiley y Sons; Shaeiwitz, J. A. and Henry, J. D., 1988, Biochemical separations, en: Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, Capítulo 11, páginas 1 - 27, VCH: Weinheim; y Dechow, F. J., 1989, Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).

Por ejemplo, se pueden construir vectores de expresión de levadura que contienen a los ácidos nucleicos divulgados aquí, o fragmentos de los mismos y transformarlos en Saccharomyces cerevisiae utilizando protocolos estándar. Las células trangénicas resultantes pueden ser analizadas luego con respecto al fracaso o alteración de su tolerancia al estrés por sequía, sal, y temperatura. En forma similar, se pueden construir vectores de expresión de la planta que contengan a los ácidos nucleicos divulgados aquí, o fragmentos de los mismos, y transformarlos dentro de una célula apropiada de una planta tal como Arabidopsis, soja, colza, maíz, trigo, Medicago truncatula, etc., utilizando protocolos estándar. Las células y/o plantas transgénicas resultantes derivadas de allí pueden ser analizadas luego con respecto al fracaso o alteración de su tolerancia al estrés por sequía, sal, temperatura, y doblamiento.

La modificación por ingeniería genética de uno o más genes que codifican para PKSRP de la invención puede resultar también en los PKSRP que tienen actividad alterada que impactan indirectamente la respuesta al estrés y/o la tolerancia al estrés de algas, plantas, ciliados, u hongos, u otros microorganismos como C. glutamicum. Por ejemplo, los procesos bioquímicos normales del metabolismo resultan en la producción de una variedad de productos (por ejemplo, peróxido de hidrógeno y otras especies de oxígeno reactivo) que pueden interferir activamente con estos mismos procesos metabólicos. Por ejemplo, se sabe que el peroxinitrito nitra cadenas laterales de tirosina, inactivando de esta manera algunas enzimas que tienen tirosina en el sitio activo (Groves, J. T., 1999, Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2): 226 - 235). Aunque estos productos son típicamente excretados, se puede alterar genéticamente las células para transportar más productos de lo que es típico para una células de tipo silvestre. Optimizando la actividad de uno o más PKSRP de la invención que están involucrados en la exportación de moléculas específicas, tal como las moléculas de sal, puede ser posible mejorar la tolerancia al estrés de la célula.

Adicionalmente, las secuencias divulgadas aquí, o fragmentos de las mismas, pueden ser utilizados para generar mutaciones desactivadas en los genomas de diferentes organismos, tales como bacterias, células de mamífero, células de levadura, y células de plantas (Girke, T., 1998, The Plant Journal 15: 39 - 48). Las células desactivadas resultantes pueden ser luego evaluadas por su habilidad o capacidad para tolerar diferentes condiciones de estrés, su respuesta a diferentes condiciones de estrés, y el efecto sobre el fenotipo y/o el genotipo de la mutación. Para otros métodos de inactivación genética, ver la patente estadounidense No. 6.004.804 "Non-Chimeric Mutational Vectors" y Puttaraju y colaboradores, 1999, Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy, Nature Biotechnology 17: 246 - 252.

Las estrategias de mutagénesis anteriormente mencionadas para los PKSRP que resultan en una mayor resistencia al estrés no pretenden ser limitantes; las variaciones de estas estrategias serán evidentes para alguien capacitado en el arte. Utilizando tales estrategias, e incorporando los mecanismos divulgados aquí, se pueden utilizar las moléculas de ácido nucleico y de polipéptido de la invención para generar algas, ciliados, plantas, hongos, u otros microorganismos como C. glutamicum que expresan moléculas mutadas de ácido nucleico que codifica para PKRSP y polipéptido de tal manera que se mejore la tolerancia al estrés.

La presente invención también proporciona anticuerpos que se enlazan específicamente a un PKSRP, o a una porción del mismo teniendo cada uno al menos 70% de identidad de secuencia con un polipéptido como el definido en la SEQ ID NO: 12, como el codificado por un ácido nucleico descrito aquí. Se pueden elaborar los anticuerpos por medio de muchos métodos conocidos (ver, por ejemplo, Harlow y Lane, "Antibodies; A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1988)). En resumen, se puede inyectar el antígeno purificado en un animal en una cantidad y en intervalos suficientes para provocar una respuesta inmune. Los anticuerpos pueden ser o bien purificados directamente, o se pueden obtener células de bazo del animal. Se pueden fusionar luego las células con una línea de células inmortales y seleccionadas para secreción del anticuerpo. Se pueden utilizar los anticuerpos para seleccionar bibliotecas de clones de ácido nucleico para células que secretan al antígeno. Se pueden secuenciar luego los aquellos clones positivos. Ver, por ejemplo, Kelly y colaboradores, 1992, Bio/Technology 10: 163 -1 67; Bebbington y colaboradores, 1992, Bio/Technology 10: 169 - 175.

Las frases "que se enlazan selectivamente" y "que se enlazan específicamente" con el polipéptido se refieren a una reacción de enlazamiento que es determinante de la presencia del plipéptido en una población heterogénea de polipéptidos y de otros compuestos biológicos. De este modo, bajo las condiciones diseñadas del inmunoensayo, los anticuerpos especificados enlazados a un polipéptido particular no se enlazan en una cantidad significativa con otros polipéptidos presentes en la muestra. El enlazamiento selectivo de un anticuerpo bajo tales condiciones puede requerir de un anticuerpo que es seleccionado por su especificidad por un polipéptido particular. Se pueden utilizar una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos que se enlacen selectivamente con un polipéptido particular. Por ejemplo, se utilizan rutinariamente inmunoensayos d ELISA en fase sólida para seleccionar anticuerpos selectivamente inmunoreactivos con un polipéptido. Ver Harlow y Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988), para una descripción de los formatos de inmunoensayo y de las condiciones que se podrían utilizar para determinar el enlazamiento selectivo.

En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales de diferentes huéspedes. Una descripción de técnicas para la preparación de tales anticuerpos monoclonales puede ser encontrada en Stites y colaboradores, eds., "Basic and Clinical Immunology", (Lange Medical Publications, Los Altos, Calif., Cuarta Edición) y las referencias citadas allí, y en Harlow y Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988).

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Ejemplos Ejemplo 1 Crecimiento de cultivos de Physcomitrella patens

Para este estudio, se utilizaron plantas de la especie Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. de la colección de la sección de estudios genéticos de la Universidad de Hamburgo. Las mismas proceden de la variedad 16/14 recogida por H.L.K. Whitehouse en GrandsdenWood, Huntingdonshire (Inglaterra), que fue subcultivada a partir de una espora por Engel (1968, Am. J. Bot. 55, 438 - 446). La proliferación de las plantas se llevó a cabo por medio de esporas y por medio de regeneración de los gametofitos. El protonema desarrollado a partir de la espora haploide es un cloronema rico en cloroplastos y caulonema pobre en cloroplastos, sobre el cual se formarón yemas después de aproximadamente 12 días. éstas crecieron para dar gametóforos que llevaban anteridios y arquegonios. Después de la fertilización, resultó el esporofito diploide con una pequeña seta y la cápsula de esporas, en donde maduraron las meiosporas.

El cultivo se llevó a cabo en una cámara climatizada a una temperatura del aire de 25ºC y con una intensidad de luz de 55 micromol^{-lm2} (luz blanca; tubo fluorescente Philips TL 65W/25) y un cambio luz/oscuridad de 16/8 horas. El musgo se modificó en cultivo líquido utilizando medio de Knop de acuerdo con Reski y Abel (1985, Planta 165:
354 - 358) o se cultivó sobre medio sólido de Knop utilizando agar oxoide al 1% (Unipath, Basingstoke, Inglaterra). Los protonemas utilizados para aislamiento de ARN y ADN se cultivaron en cultivos líquidos aireados. Los protonemas se trituraron cada 9 días y se transfirieron a medio de cultivo nuevo.

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Ejemplo 2 Aislamiento de ADN total a partir de las plantas

Los detalles para el aislamiento de ADN total se refieren al tratamiento de un gramo de peso fresco de material vegetal. Los materiales utilizados incluyen los amortiguadores siguientes: amortiguador CTAB: bromuro de N-cetil-N,N,N-trimetilamonio (CTAB) al 2% (p/v); Tris HCl 100 mM de pH 8,0; NaCl 1,4 M; EDTA 20 mM; amortiguador de N-laurilsarcosina: N-laurilsarcosina al 10% (p/v); Tris HCl 100 mM de pH 8,0; EDTA 20 mM.

El material vegetal se trituró bajo nitrógeno líquido en un mortero para dar un polvo fino y se transfirió a vasos Eppendorf de 2 ml. El material vegetal congelado se cubrió luego con una capa de 1 ml de amortiguador de descomposición (1 ml de amortiguador CTAB, 100 \mul de amortiguador de N- laurilsarcosina; 20 \mul de \beta-mercaptoetanol y 10 \mul de solución de proteinasa K, 10 mg/ml) y se incubó a 60ºC durante una hora con agitación continua. El homogenizado obtenido se distribuyó en dos vasos Eppendorf (2 ml) y se extrajo dos veces por agitación con el mismo volumen de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Para la separación de fases, se llevó a cabo la centrifugación a 8000 x g y a temperatura ambiente durante 15 minutos en cada caso. El ADN se precipitó luego a -70ºC durante 30 minutos utilizando isopropanol enfriado con hielo. El ADN precipitado se sedimentó a 4ºC y 10.000 x g durante 30 minutos y se resuspendió en 180 \mul de amortiguador TE (Sambrook y colaboradores, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6). Para purificación adicional, el ADN se trató con NaCl (concentración final 1,2 M) y se precipitó de nuevo a -70ºC durante 30 minutos utilizando dos veces su volumen de etanol absoluto. Después de una etapa de lavado con etanol al 70%, se secó el ADN y se lo recogió posteriormente en 50 \mul de H_{2}O + ARNasa (concentración final 50 mg/ml). Se disolvió el ADN durante una noche a 4ºC y se llevó a cabo posteriormente la digestión con ARNasa a 37ºC durante 1 hora. Se realizó el almacenamiento del ADN a 4ºC.

Ejemplo 3 Aislamiento de ARN total y ARNpoli(A)^{+} y construcción de una genoteca de ADNc de Physcomitrella patens

Para la investigación de transcritos, se aislaron tanto ARN total como ARN poli-(A)^{+}. El ARN total se obtuvo a partir de protonemas de tipo silvestre de 9 días siguiendo el método GTC (Reski y colaboradores, 1994, Mol. Gen. Genet., 244: 352 - 359). Se aisló el ARN poli(A)^{+} utilizando Dyna Beads^{R} (Dynal, Oslo, Noruega) siguiendo las instrucciones del protocolo del fabricante. Después de determinación de la concentración del ARN o del ARN poli(A)^{+},
se precipitó el ARN por adición de 1/10 volúmenes de acetato de sodio 3 M de pH 4,6 y 2 volúmenes de etanol y se almacenó a -70ºC.

Para la construcción de la genoteca de ADNc, se realizó la síntesis de la primera cadena utilizando transcriptasa inversa del Virus de Leucemia de Múrido (Roche, Mannheim, Alemania) e iniciadores oligo-d(T), y la síntesis de la segunda cadena por incubación con ADN-polimerasa I, enzima Klenow y digestión con ARNasaH a 12ºC (2 horas), 16ºC (1 hora) y 22ºC (1 hora). Se detuvó la reacción por incubación a 65ºC (10 minutos) y se transfirió posteriormente a hielo. Las moléculas de ADN bicatenario se hicieron romas en los extremos con T4-ADN-polimerasa (Roche, Mannheim, Alemania) a 37ºC (30 minutos). Se removierón los nucleótidos por extracción con fenol-cloroformo y columnas de giro Sephadex G50. Se ligaron adaptadores EcoRI (Pharmacia, Freiburg, Alemania) a los extremos del ADNc por medio de T4-ADN-ligasa (Roche, 12ºC, durante una noche) y se fosforilaron por incubación con polinucleótido-quinasa (Roche, 37ºC, 30 minutos). Se sometió esta mezcla a separación en un gel de agarosa de bajo punto de fusión. Las moléculas de ADN mayores a 300 pares de bases fueron eluidas del gel, se extrajeron con fenol, y se concentraron en columnas Elutip-D (Schleicher y Schuell, Dassel, Alemania) y se ligaron a los brazos del vector y se empacaron en fagos lambda ZAPII o fagos lambda ZAP-Express utilizando el Kit Gold GigaPack (Stratagene, Amsterdam, Países Bajos) utilizando material y siguiendo las instrucciones del fabricante.

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Ejemplo 4 Secuenciación y anotación de la función de los EST de Physcomitrella patens

Se utilizaron genotecas de ADNc como se describe en el Ejemplo 3 para secuenciación de ADN de acuerdo con métodos estándar, y en particular, por el método de terminación de cadenas utilizando el Kit de Reacción Rápida de Secuenciación de Ciclo Terminador Big Dye ABI PRISM (Perkin-Elmer, Weiterstadt, Alemania). Se llevó a cabo una secuenciación aleatoria posteriormente a la recuperación preparativa de plásmido a partir de genotecas de ADNc a través de escisión de masa in vivo, retransformación, y posterior siembra en placa de DH10B en placas de agar (los detalles del material y del protocolo fueron tomados de Stratagene, Amsterdam, Países Bajos). Se preparó ADN plasmídico a partir de cultivos de E. coli que se habían dejado crecer durante la noche, producidos en medio de Caldo Luria que contenía ampicilina (ver, Sambrook y colaboradores, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) sobre un robot de preparación de ADN de Qiagene (Qiagen, Hilden) de acuerdo a los protocolos del fabricante. Se utilizaron iniciadores de secuenciación con las siguientes secuencias de nucleótidos:

5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3': SEQ ID No: 31

5'-CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3': SEQ ID No: 32

5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3': SEQ ID No: 33

Las secuencias se procesaron y anotaron utilizando el paquete de software EST-MAX proporcionado comercialmente por Bio-Max (Munich, Alemania). El programa incorpora prácticamente todos los métodos bioinformáticos importantes para caracterización funcional y estructural de secuencias de polipéptidos. Los algoritmos más importantes incorporados en EST-MAX son: FASTA (Very sensitive sequence database searches with estimates of statistical significance; Pearson W.R., 1990, Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA, Methods Enzymol. 183:63-98); BLAST (Very sensitive sequence database searches with estimates of statistical significance; Altschul S.F. et al., Basic local alignmentsearch tool, Journal of Molecular Biology 215:403-10); PREDATOR (High-accuracy secondary structure prediction from single and multiple sequences, Frishman, D. and Argos; P., 1997, 75% accuracy in polypeptide secondary structure prediction, Polypeptides, 27:329-335); CLUSTALW (Multiple sequence alignment; Thompson, J.D. et al., 1994, CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positionsspecific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22:4673-4680);TMAP(Transmembrane region prediction from multiply aligned sequences; Persson, B. and Argos, P., 1994, Prediction of transmembrane segments in polypeptides utilizing multiple sequence alignments, J. Mol. Biol. 237:182-192); ALOM2 (Transmembrane region prediction from single sequences; Klein, P. et al., Prediction of polypeptide function from sequence properties: A discriminate analysis of a database. Biochim. Biophys. Acta 787:221-226 (1984). Version 2 by Dr. K. Nakai); PROSEARCH (Detection of PROSITE polypeptide sequence patterns; Kolakowski L.F. Jr., et al., 1992, ProSearch: fast searching of polypeptide sequences with regular expression patterns related to polypeptide structure and function, Biotechniques 13:919-921); BLIMPS (Similarity searches against a database of ungapped blocks; J.C. Wallace and Henikoff S., 1992); y PATMAT: A searching and extraction program for sequence, pattern and block queries and databases, CABIOS 8: 249-254. Escrito por Bill Alford.

Ejemplo 5 Identificación de los ORF de Physcomitrella patens correspondiente a PK-11

El ADNc parcial de Physcomitrella patens (EST^{-}) para PK-11 parcial (SEQ ID NO: 10) fue identificado en el programa de secuenciación de EST de Physcomitrella patens utilizando el programa EST-MAX a través del análisis BLAST. Este clon particular, que se encontró que codifica una Proteína Quinasa, fue escogido para análisis adicionales.

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Ejemplo 6 Clonación del ADNc de Physcomitrella patens de longitud completa que codifica para PK-11

Para aislar el clon que codifica para PK-11 (SEQ ID NO: 11) de Physcomitrella patens, se crearon genotecas de ADNc con un kit de Amplificación de ADNc SMART RACE (Clontech Laboratories) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizó el ARN total aislado descrito en el Ejemplo 3 como molde. Se trató el cultivo antes del aislamiento del ARN de la siguiente manera: Estrés por Salinidad: 2, 6, 12, 24, 48 horas con medio suplementado con NaCl 1 M; Estrés por Frío: 4ºC durante los mismos períodos de tiempo que para la salinidad; Estrés por Sequía: se incubaron los cultivos sobre papel de filtro seco durante los mismos períodos de tiempo que para la salinidad.

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Protocolo para 5' RACE

La secuencia EST de 11 (SEQ ID NO: 10) identificada a partir de la búsqueda en la base de datos como se describe en el Ejemplo 5 fue utilizada para diseñar oligos para RACE (Ver Tabla 1). Se obtuvo la secuencia extendida para este gen llevando a cabo una Amplificación Rápida de los Extremos del ADNc por reacción en cadena de la polimerasa (RACE PCR) utilizando el kit de PCR Advantage 2 (Clontech Laboratories) y el kit de Amplificación del ADNc SMART RACE (Clontech Laboratories) utilizando un Termociclador Biometra T3 siguiendo las especificaciones del fabricante. La secuencia obtenida a partir de la reacción RACE correspondió a la región de codificación de longitud completa de oligos diseñados para clonación de longitud completa del gen respectivo (Ver la Amplificación de Longitud Completa más abajo).

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Amplificación de Longitud Completa

Se aisló el clon de longitud completa para PK-11 (SEQ ID NO: 11) repitiendo el método RACE pero utilizando los iniciadores específicos del gen como se muestra en la Tabla 1.

Se extrajo el fragmento amplificado del gel de agarosa con un QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) y se lo ligó dentro del vector TOPOpCR2.1 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se transformó el vector recombinante dentro de células Top10 (Invitrogen) utilizando condiciones estándar (Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Se seleccionaron células transformadas sobre agar LB que contenía 100 mg/ml de carbenicilina, 0,8 mg de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-(3-D-galactósido), y 0,8 mg de IPTG (isopropiltio-[3-D-galactosido) cultivadas durante la noche a 37ºC. Se seleccionaron las colonias blancas y se las utilizó para inocular 3 ml de LB líquido que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y cultivadas durante la noche 37ºC. Se extrajo en ADN del plásmido utilizando el Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se llevaron a cabo análisis de los clones posteriores y mapeo de restricción de acuerdo con técnicas estándar de biología molecular (Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 2da Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

TABLA 1

1

Después de completar las hibridaciones, se generó un perfil para cada mancha (que representa un inserto de ADNc), en cuanto a cuáles de los 288 oligonucleótidos de 7 mer marcados en forma radioactiva con ^{33}P estaban enlazados a esa mancha particular (inserto de ADNc), y hasta que grado. Este perfil está definido como la firma generada a partir para ese clon. Se comparó la firma de cada clon con todas las otras firmas generadas a partir del mismo organismo para identificar grupos de firmas relacionadas. Este proceso "ordena" todos los clones de un organismo dentro de los grupos antes de la secuenciación.

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Aislamiento del Gen

Se ordenaron lo clones en diferentes grupos con base en sus firmas de hibridación idénticas o similares. Un grupo debe ser indicativo de la expresión de un gen individual o familia de genes. Un subproducto de este análisis es un perfil de expresión para la abundancia de cada gen en una genoteca particular. Se utilizó una ruta de secuenciación desde el extremo 5' para predecir la función de los clones particulares por medio de búsqueda de motivos y de similitudes en las bases de datos de las secuencias.

La secuencia de ADN de longitud completa de PK-3 de Physcomitrella patens (SEQ ID NO: 8) o PK-10 (SEQ ID NO: 11) fue dispersada contra las bases de datos propietarias contiguas de canola, arroz, y soja con un valor de E de E-10. (Altschul, Stephen y colaboradores, Gapped BLAST and PSI_BLAST: a new generation of protein database search program. Nucleic Acids Res. 25: 3389 - 3402).

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Ejemplo 7 Modificación por ingeniería genética de plantas de Arabidopsis tolerantes al estrés por sobreexpresión del gen que codifica para PKSRP Construcción del vector binario: pBPS-JH001

Se digirió el constructo del plásmido pLMNC53 (Mankin, 2000, tesis de PhD, University of North Carolina) con HindIII (Roche) y se rellenó de extremos romos con la enzima Klenow y los dNTP 0,1 mM de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se purificó este fragmento a través de de un gel de agarosa y se extrajo a través del Kit de Extracción en Gel de QIAquick (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento purificado se digirió luego con EcoRI (Roche) purificado por medio de gel de agarosa, y se extrajo a través del Kit de Extracción en Gel de QIAquick (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento resultante de 1,4 kilobases, el casete de gentamicina, incluido el promotor nos, el gen aacCI y el terminador g7.

El vector pBlueScript se digirió con EcoRI y SmaI (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y el fragmento resultante se extrajo del gel de agarosa con un Kit de Extracción en Gel de QIAquick (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El vector pBlueScript digerido y los fragmentos del casete de gentamicina se ligaron con ADN-ligasa T4 (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, uniendo los dos sitios EcoRI respectivos y uniendo el sitio HindIII de extremos romos con el sitio SmaI.

Se transformó el vector recombinante (pGMBS) en células Top10 (Invitrogen) utilizando condiciones estándar. Las células transformadas se seleccionaron en agar LB que contenía 100 \mug/ml de carbenicilina, 0,8 mg de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosido) y 0,8 mg de IPTG (isopropiltio-\beta-D-galactosido), cultivadas durante la noche a 37ºC. Se seleccionaron las colonias blancas y se utilizaron para inocular 3 ml de LB líquido que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y se dejaron crecer durante la noche a 37ºC. Se extrajo el ADN plasmídico utilizando el Kit Miniprep Spin de QIAprep (QIAgen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El análisis de los clones posteriores y el mapeado de restricción se llevaron a cabo de acuerdo con técnicas estándar de biología molecular (Sambrook y colaboradores, 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2da edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Se digirieron tanto el vector pGMBS como el vector p1bxSuperGUS con XbaI y Kpnl (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, cortando el casete de gentamicina de pGMBS y produciéndola columna vertebral del vector p1bxSuperGUS. Se extrajeron los fragmentos resultantes del gel de agarosa con un Kit de Extracción en Gel QIAquick (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se ligaron estos dos fragmentos con la ADN ligasa T4 (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se transformó el vector recombinante resultante (pBPS-JH001) en células Top10 (Invitrogen) utilizando condiciones estándar. Las células transformadas se seleccionaron en agar LB que contenía 100 \mug/ml de carbenicilina, 0,8 mg de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosido) y 0,8 mg de IPTG (isopropiltio-\beta-D-galactosido), cultivadas durante la noche a 37ºC. Se seleccionaron las colonias blancas y se utilizaron para inocular 3 ml de LB líquido que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y se dejaron crecer durante la noche a 37ºC. Se extrajo el ADN plasmídico utilizando el Kit Miniprep Spin de QIAprep (QIAgen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El análisis de los clones posteriores y el mapeado de restricción se llevaron a cabo de acuerdo con técnicas estándar de biología molecular (Sambrook y colaboradores, 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2da edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Construcción del vector binario: pBPS-SC022

Se digirió la construcción plasmídica pACGH101 con PstI (Roche) y FseI (NEB) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se purificó el fragmento por medio de gel de agarosa y se extrajo a través del kit de Extracción de ADN Qiaex II (Qiagen). Esto produjo un fragmento de vector con el promotor Actin2 de Arabidopsis con intrón interno y el teminador OCS3.

Se digirieron los iniciadores para la amplificación por PCR del gen NPTII[5'NPT-Pst: GCG-CTG-CAG-ATT-TCA-TTTGGA-GAG-GAC-ACG (SEQ ID NO:39); 3'NPT-Fse: CGC-GGC-CGG-CCT-CAG-AAG-AAC-TCG-
TCA-AGA-AGG-CG (SEQ ID NO:40)]. Se amplificó el gen NPTII de 0,9 kilobases a través de PCR a partir del ADN del plásmido pCambia 2301 utilizando los siguientes parámetros: 94ºC durante 60 s, {94ºC durante 60 s, 61ºC (-0,1ºC por ciclo) durante 60 s, 72ºC durante 2 min} x 25 ciclos, 72ºC durante 10 min sobre un equipo Biometra T-Gradient. Se purificó el producto amplificado a través del kit de Extracción por PCR Qiaquick (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Posteriormente se subclonó el ADN por PCR dentro del vector pCR-BluntII TOPO (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante (construcción NPT-Topo). Se transformaron estas ligaciones en células Top10 (Invitrogen) y se desarrollaron sobre placas LB con 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina durante la noche a 37ºC. Se utilizaron luego las colonias para inocular 2 ml del medio LB con 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se desarrollaron durante la noche a 37ºC. Se recuperó el ADN del plásmido utilizando el kit Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen) y se secuenció tanto en las direcciones 5' como 3' utilizando condiciones estándar. El análisis posterior de los datos de la secuencia utilizando el software VectorNTI reveló que no había errores por la PCR introducidos en la secuencia del gen NPTII.

Se digirió luego la construcción NPT-Topo con PstI (Roche) y Fsel (NEB) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se purificó el fragmento de 0,9 kilobases sobre gel de agarosa y se extrajo por medio del kit de Extracción de ADN Qiaex II (Qiagen). Se ligaron luego el fragmento del inserto Pst/Fse de NPT-Topo el fragmento del vector Pst/Fse de pACGH101 utilizando la ADN ligasa T4 (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se transformó luego la reacción de ligación en células Top10 (Invitrogen) bajo condiciones estándar, creando una construcción pBPS-sc019. Se seleccionaron las colonias sobre placas LB con 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se desarrollaron durante la noche a 37ºC. Se utilizaron luego estas colonias para inocular 2 ml del medio LB 50 \mug/ml sulfato de kanamicina y se desarrollaron durante la noche a 37ºC. Se recuperó el ADN del plásmido utilizando el kit Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se digirió la construcción pBPS-SC019 con KpnI y BsaI (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se purificó el fragmento sobre gel de agarosa y se extrajo por medio del kit de Extracción de ADN Qiaex II (Qiagen) de acuerdo a las instrucciones, resultando en un casete Act-NPT de 3 kilobases, que incluyó al promotor Actin2 de Arabidopsis con intrón interno, al gen NPTII, y al terminador OCS3.

Se digirió el vector pBPS-JH001 con SpeI y ApaI (Roche) y se rellenó el extremo romo con enzima Klenow y los dNTP 0,1 mM (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esto produjo un fragmento de vector de 10,1 kilobases menos el casete de Gentamicina, que fue recircularizado por ligación propia con la ADN ligasa T4 (Roche), y transformado en células Top10 (Invitrogen) a través de condiciones estándar. Se seleccionaron las células transformadas sobre agar LB que contenía 50 \mug/ml sulfato de kanamicina y se desarrollaron durante la noche a 37ºC. Se utilizaron luego las colonias para inocular 2 ml de LB líquido que contenía 50 \mug/ml sulfato de kanamicina y se desarrollaron durante la noche a 37ºC. Se extrajo el ADN del plásmido utilizando el Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se digirió luego el plásmido recircularizado con KpnI (Roche) y se extrajo del gel de agarosa a través del kit de Extracción de ADN Qiaex II (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se ligaron luego el inserto Act-NPT Kpn-cut y el vector recircularizado Kpn-cut pBPS-JH001 utilizando ADN ligasa T4 (Roche) y transformados en células Top10 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La construcción resultante, pBPS-SC022, contenía ahora al Súper Promotor, al gen GUS, al terminador NOS, y al casete Act-NPT. Se seleccionaron las células transformadas sobre agar LB que contenía 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se desarrollaron durante la noche a 37ºC. Se utilizaron luego las colonias para inocular 2 ml de LB líquido que contenía 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se desarrollaron durante la noche a 37ºC. Se extrajo el ADN del plásmido utilizando el Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la confirmación del éxito de la ligación a través de digestiones de restricción, se propagó adicionalmente el ADN del plásmido pBPS-sc022 y se recuperó utilizando el Plasmid Midiprep Kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se llevó a cabo el análisis de los clones por medio de mapeo de restricción de acuerdo a técnicas estándar de biología molecular (Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory).

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Subclonación de PK-11 dentro del vector binario

Se subclonó el fragmento que contenía al polipéptido quinasa de Physcomitrella patens a partir de los vectores recombinantes PCR2.1 TOPO por medio de digestión doble con enzimas de restricción (Ver Tabla 2) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se cortó el fragmento posterior del gel de agarosa con un kit de Extracción en Gel QIAquick (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se ligó dentro del vector binario pBPS-SC022 que fue escindido con enzimas apropiadas (Ver Tabla 2) y se desfosforiló antes de la ligación. El vector recombinante resultante (Ver Tabla 2) contenía la correspondiente Polipéptido Quinasa en la orientación sentido bajo el súper promotor constitutivo.

A continuación se enlistan los nombres de las diferentes construcciones de las Polipéptido Quinasas de Physcomitrella patens utilizadas para la transformación de la planta.

TABLA 2

2

Transformación de Agrobacterium

Se transformó el vector recombinante dentro de C58C1 y PMP90 de Agrobacterium tumefaciens de acuerdo a condiciones estándar (Hoefgen y Willmitzer, 1990).

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Transformación de la Planta

Se cultivaron y transformaron ecotipos C24 de Arabidopsis thaliana de acuerdo a condiciones estándar (Bechtold, 1993, Acad. Sci. Paris. 316: 1194 - 1199; Bent y colaboradores, 1994, Science 265: 1856 - 1860).

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Selección de Plantas Transformadas

Se esterilizaron semillas T1 de acuerdo a protocolos estándar (Xiong y colaboradores, 1999, Plant Molecular Biology Reporter 17: 159 - 170). Se sembraron en placas las semillas sobre medio de Murashige y Skoog (MS) pH 5,7 con KOH (Sigma-Aldrich), agar al 0,6% y suplementado con sacarosa al 1%, 2 \mug/ml de benomilo (Sigma-Aldrich), y 150 \mug/ml de gentamicina (Sigma-Aldrich) (transformantes pBPS-JH001) ó 50 \mug/ml de kanamicina (transformantes pBPS-SC022). Se vernalizaron las semillas sembradas sobre las placas durante cuatro días a 4ºC. Se germinaron las semillas en una cámara climática a temperatura ambiente de 22ºC una intensidad de luz de 40 micromols^{-1m-2} (luz blanca; tubo fluorescente Philips TL 65W/25) y un ciclo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Se seleccionaron las semillas transformadas después de 14 días y se las transfirió a placas con medio MS pH 5,7 con KOH, agar al 0,6% y suplementado con sacarosa al 1%, 0,5 g/L de MES (Sigma-Aldrich), y 2 \mug/ml de benomilo (Sigma-Aldrich) y se perimitió la recuperación durante cinco a siete días.

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Selección de la Tolerancia a la Sequía

Se transfirieron las plántulas T1 a papel de filtro estéril seco, en una caja de Petri y se permitió la desecación durante dos horas con una RH del 80% (humedad relativa) en una Cabina de Crecimiento de Sanyo MLR-350H, micromols^{-1m2} (luz blanca; tubo fluorescente Philips TL 65W/25). Se disminuyó luego la RH hasta 60%, y se desecaron las plántulas durante ocho horas más. Se removieron luego las plántulas y se las colocó sobre placas de agar al 0,6% con medio MS suplementado con 2 \mug/ml de benomilo (Sigma-Aldrich) y 0,5 g/L de MES (Sigma-Aldrich) y se calificó después de cinco días.

Se seleccionaron las plantas transgénicas que sobreexpresan al PKSRP por su tolerancia mejorada a la sequía, demostrando que la expresión transgénica confiere tolerancia a la sequía.

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"In-Soil" Drought Tolerance Screening

Se esterilizaron semillas T1 en lejía al 100%, TritonX al 0,01% durante cinco minutos dos veces y se lavó cinco veces con ddH_{2}O estéril. Se sembraron en placa las semillas estériles sobre placas de selección (1/2 MS, fitagar al 0,6%, 0,5 g/L de MES, sacarosa al 1%, 2 \mug/ml de benomilo, 50 \mug/ml de kanamicina, agar al 0,6%). Se incubaron las placas a 4ºC durante 4 días en la oscuridad.

Se movieron luego las placas a 22ºC bajo luz continua durante 10 días para la terminación y selección concomitante de las plantas transgénicas. Se transplantaron las plántulas en la etapa de 4 - 5 hojas en macetas de 5,5 cm de diámetro rellenas con suelo empacado en forma suelta (Metromix 360, Scotts) humedecido con 1 g/L de fertilizante 20-20-20 (Peters Professional, Scotts). Se colocaron las macetas en forma aleatoria sobre bandejas con 5 plantas de control (líneas transformadas con vector vacío) en cada bandeja. Se colocaron las bandejas en forma aleatoria en la cámara de crecimiento.

Las plantas crecieron (22ºC, luz continua) aproximadamente durante siete días, recibiendo agua según se requería. Se detuvo el suministro de agua cuando la mayoría de las plantas estaba a punto de desbocarse, y este punto fue denominado como el día "0" del ensayo. Después de este día, se rotaron las bandejas 180º cada dos días para minimizar los patrones locales de sequía. Se detuvo el ensayo aproximadamente el día 12 - 19, dependiendo de la velocidad de secado de las macetas que contenían los controles. Se les suministró luego agua a las macetas y se determinó la tasa de supervivencia después de 5 días.

Las plantas de Arabidopsis thaliana que sobreexpresan PK 11 mostraron una tasa de supervivencia del 65% (11 sobrevivientes de 17 plantas sometidas a estrés) para la selección por estrés. Esta tasa de supervivencia es significativamente mayor, intervalo de confianza del 99%, a aquel del control. Es de notarse que estos análisis fueron llevados a cabo con plantas T11. Los resultados deben ser mejores cuando se encuentra un expresador homocigoto fuerte.

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TABLA 3

3

Selección por Tolerancia al Congelamiento

Se transfieren las plántulas a cajas de Petri que contenían % MS, agar al 0,6% suplementado con sacarosa al 2% y 2 \mug/ml de benomilo. Después de cuatro días, se incuban las plántulas a 4ºC durante 1 hora y luego se cubren con hielo raspado. Se colocan luego las plántulas en una Cámara Climática Environmental Specialist ES2000 y se incuba durante 3,5 horas comenzando a -1,0ºC, disminuyendo -1ºC cada hora. Se incuban luego las plántulas a -5,0ºC durante 24 horas y luego se les permite descongelarse a 5ºC durante 12 horas. Se retira el agua y se evalúan las plántulas después de 5 días.

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Selección por Tolerancia a la Sal

Se transfieren las plántulas a papel filtro humedecido en medio MS y se las coloca sobre medio MS, agar al 0,6% suplementado con 2 \mug/ml de benomilo la noche antes de la selección por tolerancia a la sal. Para la selección por tolerancia a la sal, se transfiere el papel filtro con las plántulas a arrumes de papel filtro estéril, humedecido en NaCl 50 mM, en una caja de Petri. Después de dos horas, se transfiere el papel filtro con las plantas a arrumes de papel filtro estéril, humedecido con NaCl 200 mM, en una caja de Petri. Después de dos horas, Se transfiere el papel filtro con las plántulas a arrumes de papel filtro estéril, humedecido en NaCl 600 mM, en una caja de Petri. Después de 10 horas se transfieren las plántulas a cajas de Petri que contienen medio MS, agar al 0,6% suplementado con 2 \mug/ml de benomilo. Las plántulas se evalúan después de 5 días. Se seleccionan las plantas transgénicas por su mayor tolerancia a la sal demostrando que la expresión transgénica confiere tolerancia a la sal.

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Ejemplo 8 Modificación por ingeniería genética de plantas de soja tolerantes al estrés por sobreexpresión del gen PK-11

Se utilizó la construcción nRPS-LVM230 para transformar soja como se describe a continuación.

Se esterilizaron superficialmente semillas de soja con etanol al 70% durante 4 minutos a temperatura ambiente con agitación continua, seguido por Clorox al 20% (v/v) suplementado con Tween al 0,05% (v/v) durante 20 minutos con agitación continua. A continuación, las semillas se lavaron cuatro veces con agua destilada y se pusieron sobre papel filtro estéril humedecido en una caja de Petri a temperatura ambiente durante 6 a 39 horas. Se desprendieron las cubiertas de las semillas, y se separaron los cotiledones del eje del embrión. Se examinó el eje del embrión para asegurarse de que la región meristemática no estaba deteriorada. Los ejes del embrión escindidos se recogieron en una caja de Petri estéril entreabierta y se secaron al aire hasta un contenido de humedad menor al 20% (peso en fresco) en una caja de Petri sellada hasta su uso ulterior.

Se preparó un cultivo de Agrobacterium tumefaciens a partir de una sola colonia en medio sólido LB más antibióticos apropiados (por ejemplo, 100 mg/l de estreptomicina, 50 mg/l de kanamicina) seguido por crecimiento de la única colonia en medio LB líquido hasta una densidad óptica de 0,8 a 600 nm. A continuación, se centrifuga el cultivo de bacterias a 7000 rpm durante 7 minutos a temperatura ambiente, y se resuspende en medio MS (Murashige y Skoog, 1962), suplementado con acetosiringona 100 \muM. Se incuban los cultivos de bacterias en este medio de pre- inducción durante 2 horas a temperatura ambiente antes de su utilización. Los ejes de los embriones de las semillas cigóticas de soja a aproximadamente 15% de contenido de humedad se impregnaron durante 2 horas a temperatura ambiente con el cultivo en suspensión de Agrobacterium pre-inducido. Se retiraron los embriones del cultivo de impregnación y se transfirieron a cajas de Petri que contenían medio MS sólido suplementado con sacarosa al 2% y se incubaron durante 2 días, en la oscuridad a temperatura ambiente.

Alternativamente, se colocaron los embriones sobre papel filtro estéril humedecido (medio MS líquido) en una caja de Petri y se incubaron en las mismas condiciones descritas anteriormente. Después de este período, los embriones se transfirieron a medio MS sólido o líquido suplementado con 500 mg/l de carbenicilina o 300 mg/l de cefotaxima para matar las agrobacterias. El medio líquido se utilizó para humedecer el papel de filtro estéril. Los embriones se incubaron durante 4 semanas a 25ºC, bajo 150 \mumol m^{-2}s^{-1} y un período de 12 horas de luz. Una vez que las plántulas produjeron raíces, se transfirieron las mismas a tierra estéril Metromix. El medio de las plantas in vitro se eliminó por lavado antes de transferir las plantas al suelo. Las plantas se mantuvieron bajo una cubierta de plástico durante una semana para ofrecer el proceso de aclimatación. Se transfirieron luego las plantas a una sala de crecimiento en la que se incubaron a 25ºC, bajo 150 \mumol m^{-2}s^{-1} de intensidad de luz y un período de 12 horas de luz aproximadamente durante 80 días.

Las plantas transgénicas se evaluaron luego respecto a su tolerancia mejorada a la sequía, la sal y/o el frío de acuerdo con el método de evaluación descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la expresión del transgén confiere tolerancia al estrés.

Ejemplo 9 Modificación por ingeniería genética de plantas de colza/canola tolerantes al estrés por sobreexpresión del gen PK-11

Se utilizó la construcción pBPS-LVM230 para transformar colza/canola como se describe a continuación.

El método de transformación de plantas descrito aquí es aplicable a Brassica y a otros cultivos. Las semillas de canola se esterilizan superficialmente con etanol al 70% durante 4 minutos a temperatura ambiente con agitación continua, seguido por Clorox al 20% (v/v) suplementado con Tween al 0,05% (v/v) durante 20 minutos, a temperatura ambiente con agitación continua. A continuación, las semillas se lavan 4 veces con agua destilada y se ponen sobre papel de filtro estéril humedecido en una caja de Petri a temperatura ambiente durante 18 horas. Se retiran luego las cubiertas de las semillas y las semillas se secan al aire durante una noche en una caja de Petri estéril entreabierta. Durante este período, las semillas pierden aproximadamente 85% de su contenido de agua. Se guardan luego las semillas a temperatura ambiente en una caja de Petri sellada hasta su uso ulterior. Los constructos de ADN y la impregnación de los embriones son como se describe en el Ejemplo 10. Las muestras de las plantas transgénicas primarias (TO) se analizan por PCT para confirmar la presencia de T-ADN. Estos resultados se confirman por medio de hibridación tipo Southern en la cual el ADN se somete a electroforesis sobre un gel de agarosa al 1% y se transfiere a una membrana de nylon cargada positivamente (Roche Diagnostics). Se utiliza el Kit de Síntesis de Sonda PCR DIG (Roche Diagnostics) para preparar una sonda marcada con digoxigenina por PCR, y se utiliza de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Las plantas transgénicas se investigan luego respecto a su tolerancia mejorada al estrés de acuerdo con el método de investigación descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la expresión del transgén confiere tolerancia a la sequía.

Ejemplo 10 Modificación por ingeniería genética de plantas de maíz tolerantes al estrés por sobreexpresión del gen PK-11

Se utilizó la construcción pBPS-LVM230 para transformar maíz como se describe a continuación.

La transformación de maíz (Zea Mays L.) se realiza con el método descrito por Ishida y colaboradores, 1996. Nature Biotch 14745 - 50. Los embriones inmaduros se cocultivan con Agrobacterium tumefaciens que llevan vectores "súper binarios", y las plantas transgénicas se recuperan por organogénesis. Este procedimiento proporciona una eficiencia de transformación comprendida entre 2,5% y 20%. Las plantas transgénicas se investigan luego en cuanto a su tolerancia mejorada a la sequía, la sal y/o el frío de acuerdo con el método de investigación descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la expresión del transgén confiere tolerancia al estrés.

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Ejemplo 11 Modificación por ingeniería genética de plantas de trigo tolerantes al estrés por sobreexpresión del gen PK-11

Se utilizó la construcción pBPS-LVM230 para transformar trigo como se describe a continuación.

La transformación del trigo se realiza con el método descrito por Ishida y colaboradores, 1996 Nature Biotch. 14745 - 50. Los embriones inmaduros se cocultivan con Agrobacterium tumefaciens que llevan vectores "súper binarios", y las plantas transgénicas se recuperan por organogénesis. Este procedimiento proporciona una eficiencia de transformación comprendida entre 2,5% y 20%. Las plantas transgénicas se investigan luego en cuanto a su tolerancia mejorada al estrés de acuerdo con el método de investigación descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la expresión del transgén confiere tolerancia al estrés.

Ejemplo 12 Identificación de Genes Idénticos y Heterólogos

Pueden utilizarse secuencias génicas para identificar genes idénticos o heterólogos a partir de genotecas de ADNc o genómicas. Los genes idénticos (por ejemplo, los clones de ADNc de longitud total) pueden aislarse por hibridación de ácido nucleico utilizando por ejemplo genotecas de ADNc. Dependiendo de la abundancia del gen de interés, se siembran en placa 100.000 hasta 1.000.000 de bacteriófagos recombinantes y se transfieren a membranas de nylon. Después de desnaturalización con álcali, se inmoviliza el ADN sobre la membrana, por ejemplo, mediante entrecruzamiento W. La hibridación se lleva a cabo en condiciones de alta rigurosidad. En solución acuosa, la hibridación y el lavado se realizan con una fuerza iónica de NaCl 1 M y una temperatura de 68ºC. Se generan sondas de hibridación, por ejemplo, mediante marcación radiactiva de transcripción por mella (^{32}P) (High Prime, Roche, Mannheim, Alemania). Las señales se detectan por autorradiografía.

Los genes parcialmente idénticos o heterólogos que son afines pero no idénticos pueden identificarse de una manera análoga con el procedimiento descrito más arriba utilizando condiciones de hibridación y lavado de baja rigurosidad. Para hibridación acuosa, la fuerza iónica se mantiene normalmente a NaCl 1 M, mientras que la temperatura se hace descender progresivamente desde 68 a 42ºC.

El aislamiento de secuencias génicas únicamente con homología (o identidad/semejanza de secuencia) en un dominio distinto de (por ejemplo 10 - 20 aminoácidos) puede realizarse por utilización de sondas de oligonucleótidos sintéticos marcados en forma radioactiva. Los oligonucleótidos marcados en forma radioactiva se preparan por fosforilación del extremo 5-prima de dos oligonucleótidos complementarios con polinucleótido quinasa T4. Los oligonucleótidos complementarios se aparean y ligan para formar concatémeros. Los concatémeros bicatenarios se someten luego a marcación en forma radioactiva, por ejemplo, mediante transcripción de la mella. La hibridación se realiza normalmente en condiciones de baja rigurosidad utilizando concentraciones altas de oligonucleótidos. Solución de hibridación de oligonucleótidos:

6 x SSC

fosfato de sodio 0,01

M EDTA 1 mM (pH 8)

SDS al 0,5%

100 \mug/ml de ADN desnaturalizado de esperma de salmón

0,1% de leche desecada desnatada.

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Durante la hibridación, la temperatura se hace descender gradualmente hasta 5 - 10ºC por debajo del valor T_{m} estimado del oligonucleótido o hasta temperatura ambiente, seguido por etapas de lavado y autorradiografía. El lavado se realiza con baja rigurosidad tal como 3 etapas de lavado utilizando 4 x SSC. Detalles adicionales han sido descritos por Sambrook, J. y colaboradores, (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, o Ausubel, F. M. y colaboradores (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons.

Ejemplo 13 Identificación de Genes Idénticos por Evaluación de Genotecas de Expresión con Anticuerpos

Pueden utilizarse clones de ADNc para producir polipéptido recombinante, por ejemplo en E. coli (por ejemplo, el sistema pQE QIAexpress de Qiagen). Los polipéptidos recombinantes se purifican luego normalmente por afinidad mediante cromatografía de afinidad Ni-NTA (Qiagen). Los polipéptidos recombinantes se utilizan luego para producir anticuerpos específicos, por ejemplo utilizando técnicas estándar para inmunización de conejos. Los anticuerpos se purifican por afinidad utilizando una columna Ni-NTA saturada con el antígeno recombinante como ha sido descrito por Gu y colaboradores, 1994 BioTechniques 17: 257 - 262. El anticuerpo puede utilizarse luego para investigar genotecas de expresión de ADNc a fin de identificar genes idénticos o heterólogos por la vía de una investigación inmunológica (Sambrook, J. y colaboradores (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press o Ausubel, F. M. y colaboradores, (1994) "Current Protocolos in Molecular Biology", John Wiley & Sons).

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Ejemplo 14 Mutagénesis in vivo

La mutagénesis in vivo de microorganismos puede realizarse por paso de ADN plasmídico (u otro vector) a través de E. coli u otros microorganismos (por ejemplo, Bacillus spp. o levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae) que están deterioradas en sus capacidades para mantener la integridad de su información genética. Las cepas mutantes típicas tienen mutaciones en los genes para el sistema de reparación del ADN (por ejemplo, mutHLS, mutD, mutT, etc.; para referencia véase Rupp, W. D. (1996) DNA repair mechanisms, en: Escherichia coli y Salmonella, p. 2227 - 2294, ASM: Washington). Cepas de este tipo son bien conocidas por los expertos en la técnica. El uso de tales cepas se ilustra, por ejemplo, en Greener, A. y Callahan, M. (1994) Strategies 7: 32 - 34. La transferencia de moléculas de ADN mutado en plantas se realiza preferiblemente después de selección y ensayo en microorganismos. Se generan plantas transgénicas de acuerdo con diversos ejemplos dentro de la ilustración de este documento.

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Ejemplo 15 Análisis in vitro de la Función de los Genes de Physcomitrella en Organismos Transgénicos

La determinación de las actividades y los parámetros cinéticos de las enzimas está bien establecida en la técnica. Los experimentos para determinar la actividad de cualquier enzima alterada tienen que adaptarse a la actividad específica de la enzima de tipo silvestre, lo cual está plenamente dentro de la capacidad de un experto en la técnica. Pueden encontrarse revisiones acerca de enzimas en general, así como detalles específicos concernientes a la estructura, cinética, principios, métodos, aplicaciones y ejemplos para la determinación de muchas actividades enzimáticas, por ejemplo, en las referencias siguientes: Dixon, M., y Webb, E. C., (1979) Enzymes. Longmans: Londres; Fersht, 1985) Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: Nueva York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, N. C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P. D., ed., (1983) The Enzymes, 3rd ed. Academic Press: Nueva York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, 2nd ed. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H, U., Bergmeyer, J., Gra I, M., ed., (1983 - 1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3rd ed., vol. I - XII, Verlag Chemie:Weinheim; y Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistiy (1987) vol. A9 Enzymes. VCH: Weinheim, p. 352 - 363.

La actividad de las proteínas que se enlazan al ADN pueden medirse por varios métodos bien establecidos, tales como ensayos de desplazamiento de bandas de ADN (denominados también ensayos de retardo en gel). El efecto de tales proteínas sobre la expresión de otras moléculas puede medirse utilizando ensayos de genes reporteros (tales como el descrito en Kolmar, H. y colaboradores, (1995) EMBO J. 14: 3895 - 3904 y las referencias citadas allí). Sistemas de ensayo DE genes reporteros son bien conocidos y están establecidos para aplicaciones en células tanto procariotas como eucariotas, utilizando enzimas tales como \beta-galactosidasa, proteína fluorescente verde, y varias otras. La determinación de la actividad de proteínas de transporte de membrana puede realizarse de acuerdo con técnicas tales como las descritas en Gennis, R. B. Pores, Channels and Transporters, en Biomembranes, Molecular Structure and Function, páginas 85 - 137, 199 - 234 y 270 - 322, Springer: Heidelberg (1989).

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Ejemplo 16 Purificación del Producto Deseado a partir de Organismos Transformados

La recuperación del producto deseado a partir de material vegetal (a saber, Physcomitrella patens o Arabidopsis thaliana), hongos, algas, ciliados, células de C. glutamicum, u otras células bacterianas transformadas con las secuencias de ácido nucleico descritas aquí, o el sobrenadante de los cultivos descritos anteriormente, puede realizarse por diversos métodos bien conocidos en la técnica. Si el producto deseado no es secretado por las células, se pueden cosechar las células del cultivo por centrifugación a baja velocidad, y las células pueden lisarse por medio de técnicas estándar tales como fuerza mecánica o sonicación. Los órganos de las plantas pueden separarse mecánicamente de otros tejidos u órganos. Después de la homogeneización, los residuos celulares se separan por centrifugación, y la fracción sobrenadante que contiene las proteínas solubles se retiene para purificación ulterior del compuesto deseado. Si el producto es secretado por las células deseadas, entonces las células se separan del cultivo por centrifugación a baja velocidad, y la porción sobrenadante se retiene para purificación ulterior. La fracción sobrenadante de cualquier método de purificación se somete a cromatografía con una resina adecuada, en donde la molécula deseada queda o bien retenida sobre una resina cromatográfica mientras que muchas de las impurezas contenidas en la muestra no lo son, o en donde las impurezas son retenidas por la resina mientras que la muestra no lo es. Tales etapas cromatográficas pueden repetirse en caso necesario, utilizando la misma o diferentes resinas cromatográficas. Un experto en la técnica estaría capacitado para seleccionar resinas cromatográficas apropiadas y en su aplicación más eficaz para la purificación de una molécula particular. El producto purificado puede concentrarse por filtración o ultrafiltración, y almacenarse a una temperatura a la cual se maximiza la estabilidad del producto.

Existe una serie amplia de métodos de purificación conocidos en la técnica y el método de purificación precedente no debe considerarse limitante. Tales métodos de purificación se describen, por ejemplo, en Bailey, J. E. & Ollis, D. F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: Nueva York (1986). Adicionalmente, la identidad y pureza de los compuestos aislados puede evaluarse por medio de técnicas estándar. Estos incluyen cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), métodos espectroscópicos, métodos de tinción, cromatografía en capa delgada, NIRS, ensayo enzimático, o microbiológicamente. Dichos métodos de análisis se revisan en: Patek y colaboradores, 1994 Appl. Environ. Microbiol. 60: 133 - 140; Malakhova y colaboradores, 1996 Biotekhnologiya 11: 27 - 32; y Schmidt y colaboradores, 1998 Bioprocess Engineer. 19: 67 - 70. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996), vol. A27, VCH: Weinheim, p. 89 - 90, p. 521 - 540, p. 540 - 547, p. 559 - 566, 575 - 581 y p. 581 - 587; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. y colaboradores, (1987) Applications of HPLC in Biochemistry en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17.

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Apéndice

Secuencia de nucleótidos del PK-11 parcial de Physcomitrella patens (SEQ ID NO: 10)

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4

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Secuencia de nucleótidos del PK-11 de longitud completa de Physcomitrella patens (SEQ ID NO: 11)

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5

50

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Secuencia deducida de aminoácidos de PK-11 de Physcomitrella patens (SEQ ID NO: 12)

6

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Referencias citadas en la descripción

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación. no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

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Documentos de patente citados en la descripción

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\bullet US 5116742 A, Cech [0073]: \bullet WO 9321334 A [0103]

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\bullet US 5773260 A [0073]: \bullet US 5187267 A [0104]

\bullet US 5496698 A [0073]: \bullet WO 9612814 A [0104]

\bullet US 4130641 A [0075]: \bullet EP 375091 A [0104]

\bullet US 4024222 A [0075]: \bullet US 5608152 A [0106]

\bullet US 4283393 A [0075]: \bullet WO 9845461 A [0106]

\bullet US 5795715 A [0075]: \bullet US 5504200 A [0106]

\bullet US 4801340 A [0076]: \bullet WO 9113980 A [0106]

\bullet US 5034323 A [0076]: \bullet WO 9515389 A [0106]

\bullet US 5231020 A [0076]: \bullet WO 9523230 A [0106]

\bullet US 5283184 A [0076]: \bullet WO 9916890 A [01061

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\bullet US 4873316 A [0091]: \bullet US 5412085 A [0107]

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\bullet EP 0424047 A [0095]: \bullet US 5470359 A [0107]

\bullet US 5322783 A [0095]: \bullet US 6004804 A [0129]

\bullet EP 0397687 A [0095]

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Claims

1. Un ácido nucleico aislado, en donde el ácido nucleico incluye un polinucleótido que codifica a un polipéptido que tiene al menos una identidad de secuencia del 70% con un polipéptido como el definido en la SEQ ID NO: 12, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que funciona como un modulador de una respuesta al estrés por parte de una planta y en donde el estrés se selecciona de uno o más entre el grupo que consiste de alta salinidad, sequía, y baja temperatura.

2. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico incluye un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de:

a): el polinucleótido como se define en la SEQ ID NO: 11,

b): un polinucleótido que codifica al polipéptido como se define en la SEQ ID NO: 12, y

c): un polinucleótido complementario a un polinucleótido de cualquiera de a) o b) anteriores.

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3. Un vector que contiene un ácido nucleico de la Reivindicación 1 ó 2.

4. Una célula de una planta transgénica que es transformada con y/o que contiene al vector de la reivindicación 3.

5. Una planta transgénica que contiene una célula de una planta de la Reivindicación 4.

6. La planta de la Reivindicación 5, en donde la planta es una monocotiledónea, o una dicotiledónea.

7. La planta de la Reivindicación 5, en donde el ácido nucleico codifica a un polipéptido que funciona como un modulador de la respuesta al estrés de una planta, y en donde el estrés se selecciona entre uno o más del grupo que consiste de alta salinidad, sequía y baja temperatura.

8. Una semilla de una planta producida por la planta de la Reivindicación 5, en donde la semilla de la planta contiene al ácido nucleico que codifica para PKSRP como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3.

9. La semilla de la Reivindicación 8, en donde la semilla es una reproducción verdadera para una mayor tolerancia al estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la semilla, y en donde el estrés se selecciona entre uno o más del grupo que consiste de alta salinidad, sequía, y baja temperatura.

10. La semilla de la Reivindicación 8, en donde el ácido nucleico codifica a un polipéptido que funciona como un modulador de una respuesta al estrés por parte de una planta, y en donde el estrés se selecciona entre uno o más del grupo que consiste de alta salinidad, sequía, y baja temperatura.

11. Un método para producir una planta transgénica que contiene un ácido nucleico en donde la planta tiene una mayor tolerancia a un estrés ambiental comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta, que comprende, transformar una célula de una planta con un vector de expresión que contiene al ácido nucleico y generar a partir de la célula de la planta la planta transgénica, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que funciona como un modulador de una respuesta al estrés por parte de la planta, y en donde el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste de:

a): el polinucleótido como se define en la SEQ ID NO: 11,

b): un polinucleótido que codifica al polipéptido como se define en la SEQ ID NO: 12,

c): un polinucleótido que codifica a un polipéptido que tiene al menos una identidad de secuencia del 70% con un polipéptido como se define en la SEQ ID NO: 12,

d): un polinucleótido complementario a un polinucleótido de cualquiera de a) hasta c) anteriores, y en donde el estrés ambiental se selecciona de uno o más del grupo que consiste de alta salinidad, sequía, y baja temperatura.

\vskip1.000000\baselineskip

12. El método de la Reivindicación 11, en donde el ácido nucleico incluye un polinucleótido que codifica a un polipéptido que tiene al menos una identidad de secuencia del 99% con el polipéptido como el definido en la SEQ ID NO: 12, en donde el ácido nucleico codifica a un polipéptido que funciona como un modulador de una respuesta al estrés por parte de una planta, y en donde el estrés se selecciona de uno o más del grupo que consiste de alta salinidad, sequía, y baja temperatura.

13. El método de la Reivindicación 11, en donde la planta es una monocotiledónea o una dicotiledónea.

14. El método de la Reivindicación 11, en donde la planta se selecciona del grupo que consiste de maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, soja, cacahuete, algodón, semilla de colza y canola, yuca, pimiento, girasol, tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate, especie Vicia, arveja, alfalfa, café, cacao, té, especies de sauce, palma aceitera, coco, pastos perennes, y un cultivo forrajero.

15. El método de la Reivindicación 11, en donde la tolerancia al estrés por parte de la planta se incrementa, incrementando la expresión del ácido nucleico en la planta.

16. El método de la Reivindicación 11, en donde el ácido nucleico codifica a un polipéptido que funciona como una proteína quinasa.

17. El método de la Reivindicación 11, en donde el vector de expresión incluye un promotor operativamente enlazado al ácido nucleico.

18. El método de la Reivindicación 17, en donde el promotor es un tejido específico o regulado por desarrollo, o inducible por estrés.