ES2335095T3 - Deteccion de marcadores nitrados especificos. - Google Patents

Abstract

Un método para llevar a cabo un inmunoensayo cualitativo o cuantitativo para la oxidación de proteínas, que comprende detectar en una muestra una secuencia de aminoácidos que es característica de una proteína específica presente en un tejido articular y que contiene uno o más residuos de aminoácidos aromáticos en forma nitrada, donde el ensayo comprende, detectar el enlace de un asociado de enlace inmunológico que es inmunoreactivo con dicha forma nitrada de dicho residuo de aminoácido aromático.

Description

Detección de marcadores nitrados específicos.

La presente invención se relaciona con un método para llevar a cabo un ensayo cualitativo o cuantitativo que puede ser usado para detectar cuantificar o monitorizar el deterioro oxidativo especialmente en relación con una condición inflamatoria. La detección de proteínas o fragmentos de las mismas específicas nitradas contra las proteínas equivalentes o fragmentos de las mismas equivalentes no nitradas, puede servir como un índice del deterioro oxidativo por ejemplo en enfermedades inflamatorias intestinales, lupus eritematoso sistémico, artritis, cáncer, enfermedades de Parkinson o de Alzheimer.

A través de su tiempo de vida los organismos enfrentan numerosos eventos y condiciones que generan especies de oxígeno reactivas (ROS). Un incremento en la rata de los organismos de producción de los ROS o un descenso en su rata de consumo incrementarán la modificación oxidativa de las moléculas celulares, incluyendo ADN y proteínas. La oxidación puede tener efectos nocivos sobre la función y estabilidad de las proteínas. Muchas enzimas han demostrado perder su actividad biológica como consecuencia de la oxidación. Otros efectos de la oxidación son estabilidad disminuida a la temperatura y cambios en la susceptibilidad en la proteína hacia la proteólisis; esta última puede llevar a una acumulación de proteínas oxidadas incapaces de sufrir degradación. La oxidación de las proteínas puede estar implicada en la patogénesis de varias enfermedades tales como enfermedades neurodegenerativas, cánceres, arterioesclerosis, cataratogénesis, displasia, distrofia y enfermedades inflamatorias así como en el envejecimiento
normal.

Algunos de los procesos y sistemas generadores de ROS comunes conocidos por modificar las proteínas son la irradiación, la inflamación, la reacciones catalizadas por metales tales como Fe (II) o Cu (I) por reducción y diversos otros compuestos oxidantes o radicales libres, incluyendo óxido nítrico (NO), peroxi itrito, H_{2}O_{2} o hidroxilo, hidroxiperoxilo superóxido y radicales peróxilo de lípidos. Un buen número de ROS se forman por sistemas enzimáticos específicos tales como óxido nítrico sintetasa (NOS), ciclo oxigenasa y mono amino oxidasa B, algunos de los cuales son inducidos bajo condiciones inflamatorias.

Bajo condiciones normales el potencial oxidativo en el microambiente de un organismo está bajo estrecho control mediante un número de sistemas de balance que incluye antioxidantes, consumidores de radicales libres, reductasas, peroxidasas, catalasa, glutatión-S-transferasa, superóxido dismutasa y diversas proteínas enlazantes de metales. Estos sistemas pueden verse como mecanismos de protección, más que sistemas de reparación. Los mecanismos específicos de reparación corrientes para las proteínas oxidativas dañadas son raros, mientras que el daño oxidativo a los ácidos nucleicos está sujeto a sistemas de reparación altamente eficientes (Stadtman and Levine 2000).

El óxido nítrico (NO) es producido en muchos tejidos y regula diversas funciones, tales como la relajación de los músculos lisos, defensa no específica contra microorganismos, neurotransmisor y un posible modulador de la matriz de los cartílagos. La óxido nítrico sintetasa (NOS) es responsable de la producción de NO. Hay dos clases de NOS, uno constitutivo (cNOS) y uno inducible (iNOS). La actividad de los iNOS aparece en respuesta a diversas citoquinas, y produce una cantidad mucho más grande de NO que las cNOS. La actividad de las iNOS se cree que tiene un papel en los efectos proinflamatorios del NO, como se ve en condiciones tales como enfermedades inflamatorias del intestino, inflamación espontánea del estómago, inflamación cardiovascular y enfermedades artríticas (osteoartritis (OA) o artritis reumatoide (RA)).

La gran citotoxicidad del NO se debe parcialmente a su capacidad para reaccionar con el anion superoxido (O_{2}^{-}) para generar el anión peroxinitrito (ONOO-) y su ácido conjugado, el ácido peroxinitroso (ONOOH). En pH neutro el ONOO- es protonado parcialmente, generando ONOOH, el cual rápidamente se descompone a nitrato. Estos fuertes oxidantes pueden comprometer seriamente la regulación celular, y son capaces de nitrar los compuestos aromáticos tales como fenilalanina libre, tirosina y triptófano, así como cadenas de péptidos que contengan estos aminoácidos. Esto resulta en nitrofenilalanina, nitrotiptófano y nitrotirosina, pudiendo la última ser generada a través de la hidroxilación y nitración combinada del residuo de fenilalanina (Lin et al 2000). La nitración es irreversible e inhibe la fosforilación de los residuos de tirosina y triptófano, interfiriendo así con los caminos de transducción de la señal.

En OA y RA, el NO es producido en grandes cantidades por los condrocitos, macrófagos y el sinovio inflamado. Se ha encontrado un alto nivel de nitrito/nitrato en el fluido sinovial, suero y orina de pacientes con OA y RA (Lotz 1999). Sin embargo, los niveles elevados de NO no pueden considerarse como un marcador específico para cualquier enfermedad o condición dada, puesto que diferentes procesos y tejidos pueden dar lugar a niveles sistémicos de NO elevados.

La principal manifestación clínica de RA así como de OA es un cartílago anormal y degradado. Sin embargo, hasta ahora ha sido difícil establecer directamente la destrucción en marcha de cartílagos en pacientes con artritis, porque los marcadores específicos para este proceso no han estado disponibles en la práctica clínica. En el diagnóstico clínico de OA y RA, el daño al cartílago en las articulaciones es registrado por rayos X, los cuales revelan una pérdida del espacio articular a medida que el cartílago es destruido y perdido. Adicionalmente los pacientes son clasificados de acuerdo con el dolor y problemas de movilidad causados por la destrucción de las articulaciones, pero aunque se han introducido un buen número de sistemas de clasificación estandarizados, es difícil cuantificar estos parámetros. Otros marcadores utilizados para la definición de los pacientes de RA, tales como la proteína C-reactiva y los factores reumatoides están asociados con los procesos inflamatorios involucrados en la enfermedad, pero probablemente no están relacionados directamente con el nivel de destrucción de cartílago y nos son específicos para RA.

La detección de los metabolitos, tales como la proteína de matriz oligomérica del cartílago (COMP), hialuronatos, agrecan y colágeno tipo II o III en forma de fragmentos que surgen de la destrucción de las articulaciones afectadas por la enfermedad inflamatoria han sido reportados (Moller 1998, Wolheim 1996, patente de los Estados Unidos No. 5919634, patente de los Estados Unidos No. 6132976 y solicitud PCT WO 01/38872). La inutilidad médica de estos marcadores, sin embargo, aún debe ser probada.

La detección de aminoácidos modificados por NO_{2} es conocida de acuerdo con las solicitudes de patente PCT WO 96/04311 y WO 98/29452. Estas solicitudes de patente divulgan la detección independiente de secuencias de un residuo de nitrotirosina o nitrotiptófano en una proteína o en su forma libre utilizando un anticuerpo, el cual específicamente reconoce el grupo nitro. Tal anticuerpo puede ser utilizado para establecer una condición patológica relacionada con un nivel anormal de nitrotirosina. Sin embargo el anticuerpo no será capaz de establecer el problema en relación con un tejido o proteína específica puesto que reconoce la nitrotirosina independientemente de la secuencia de aminoácido circundante.

D.C.Paik in Connective Tissue Research vol 42 (2) p 111 (2001) describe un método para establecer el nivel de daño de colágeno inducido por óxido nítrico/ion nitrito con base en la detección de la cantidad de nitrotirosina en colágeno por HPLC.

La WO 01/84160 A2 describe un método para identificar la modificación oxidativa de una proteína determinando la nitrotirosina por espectrometría de masas.

WO 01/49558 A1 dibuja un método para detectar anticuerpos endógenos contra MAG producido por pacientes que sufren de enfermedades Autoinmunes.

La presente invención se relaciona con métodos para cuantificar los aminoácidos modificados por NO_{2} dentro del contexto específico de una proteína o fragmentos de la misma. La determinación de tales proteínas nitradas específicas o fragmentos de las mismas permite un establecimiento del daño oxidativo y del estado metabólico de una proteína dada. Esto proporciona pruebas diagnósticas, las cuales asocian cambios metabólicos y daños oxidativos en enfermedades específicas.

De acuerdo con la presente invención se proporciona un método para llevar a cabo un inmunoensayo cualitativo o cuantitativo para la oxidación de proteínas, que comprende detectar en una muestra una secuencia de aminoácidos que es característica de una proteína específica presente en un tejido articular y que contiene uno o más residuos de aminoácidos aromáticos en forma nitrada donde el ensayo comprende, la detección del enlace de un patrón de enlace inmunológico que es inmunoreactivo con dicha forma nitrada de dicho residuo de aminoácido aromático.

Esto incluye un método para detectar el daño oxidativo en un mamífero. El método puede comprender monitorizar el daño oxidativo detectando uno o más residuos aromáticos nitrados en combinación con una secuencia de aminoácidos específica para una proteína o péptido, preferiblemente específico para cierto tejido en una muestra biológica. Los residuos de aminoácidos aromáticos preferidos son la nitrotirosina y/o el nitrotriptófano.

El método de la presente invención puede ser aplicado para monitorizar un proceso patológico que involucra un daño oxidativo correlativo con enfermedades no inflamatorias tales como arterioesclerosis, cáncer, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson o enfermedades inflamatorias tales como asma, inflamación cardiovascular, diabetes, enfermedades inflamatorias del intestino, psoriasis, lupus sistémico eritematoso, artritis.

El método de la presente invención permite monitorizar un proceso catabólico de un tejido articular midiendo una proteína o péptido derivado de la matriz extracelular del cartílago, del sinovio articular o del hueso subcondral. Tal proteína puede ser colágeno de los tipos I, II, III, VI, IX u XI, agrecan, biglicano, condromodulina, proteína de enlace del cartílago, proteína de la matriz oligomérica del cartílago, proteína de la capa intermedia del cartílago o un fragmento de las mismas, donde se localiza un residuo de nitrotirosina y/o nitrotriptófano.

La detección llevada a cabo en el método de la presente invención puede ejecutarse utilizando un anticuerpo, el cual se enlaza específicamente a un epítopo nitrado que comprende al menos un residuo de aminoácido aromático nitrado en conjunción con una secuencia de aminoácidos específica.

La detección llevada a cabo en el método de la presente invención también puede ejecutarse utilizando dos anticuerpos, uno de los cuales es específico para el residuo de aminoácidos aromático nitrado en una manera independiente de contexto y el otro reconoce la secuencia de aminoácidos específica.

Los métodos de detección de la presente invención pueden llevarse a cabo de una manera tal que genere un índice de daño/inflamación oxidativa, utilizando un segundo anticuerpo, el cual específicamente se enlaza a una secuencia de aminoácidos no nitrados equivalente a la secuencia nitrada enlazada por el anticuerpo que reconoce el epítopo nitrado descrito más arriba, generando por lo tanto una relación entre una proteína o péptido nitrada y no nitrada específica.

Alternativamente, las cantidades relativas de proteína o péptidos nitrados o no nitrados puede ser expresada de manera diferente, por ejemplo como una diferencia o como la relación del contenido nitrado frente al contenido total nitrado y no nitrado.

El índice de daño/inflamación oxidativos generados por la aplicación de la presente invención a una muestra de un mamífero, puede ser utilizado para proveer medios de diagnóstico o establecimiento de la severidad de una enfermedad que involucra daño oxidativo, especialmente enfermedades del tejido articular. Para estos propósitos se provee un kit que utiliza un anticuerpo, el cual reconoce un epítopo nitrado y un segundo anticuerpo que reconoce el epítopo no nitrado similar, junto con los marcadores adecuados. Un suplemento para tal kit es un péptido, que contiene una sucesión de aminoácidos equivalente al epítopo de enlace para uno de los anticuerpos mencionados, para ensayos de competición. Los kit de la presente invención pueden ser aplicados a muestras tales como fluidos corporales de mamíferos, extractos de células o tejidos o sobrenadantes de células o tejidos cultivados in vitro.

La presente invención se relaciona especialmente con la detección de proteína de colágeno nitrada tipo II, donde el aminoácido nitrado es la tirosina de una de las secuencias His-Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Leu-Asp-Gly o Leu-Gln-Tyr-Met-Arg-Ala. Los péptidos nitrados sintéticos que incluyen estas secuencias pueden ser utilizados para elevar los anticuerpos policlonales y/o monoclonales, así como las líneas celulares que producen tales anticuerpos mono-
clonales.

La presente invención se basa en una nueva modalidad de diagnóstico y pruebas prognósticas para monitorizar las condiciones patológicas en tejidos de mamíferos, combinando los marcadores específicos de tejidos metabólicos con el estado de una condición oxidativa/inflamatoria. Uno de los efectos claves del daño oxidativo es la nitración de residuos de aminoácidos aromáticos tales como fenilalanina, tirosina o triptófano. La presencia de uno o más residuos de aminoácidos aromáticos nitrados en o cerca de un marcador específico de un cierto tejido o enfermedad, proporciona información acerca del estado metabólico de un tejido del cual se origina un marcador así como de la condición oxidativa del mismo tejido.

Tal como se usa aquí, "patrón de enlazamiento inmunológico" incluye anticuerpos policlonales, monoclonales o humanizados, incluyendo fragmentos Fc, fragmentos Fab, anticuerpos quiméricos u otros fragmentos de anticuerpos específicos para antígenos.

Tal como se usa aquí "marcador bioquímico" o solamente "marcador", incluye una proteína, fragmento de proteína, polipéptido, estructura de dominio, péptido o cualquier otra proteína procesada proteolíticamente, que presenta cambios dentro de un tejido específico, los cuales se hacen detectables en relación con tales cambios.

Tal como se usa aquí "epítopo nitrado", incluye un sitio dentro de un antígeno que contiene un residuo de nitrofenilalanina, nitrotirosina o nitrotriptófano, donde el epítopo reconocido por un anticuerpo constituye el residuo nitrado y residuos de aminoácidos adyacentes suficientes para ganar especificidad a la proteína para el anticuerpo.

Tal como se usa aquí "dos epítopos independientes" significa dos sitios con la misma proteína, polipéptido o péptido reconocido por dos anticuerpos diferentes que preferiblemente pueden enlazar sus epítopos respectivos simultáneamente. Preferiblemente uno de los sitios es o contiene un residuo de aminoácido aromático nitrado individual.

Tal como se usa aquí, "residuo de aminoácido aromático nitrado" significa un residuo de fenilalanina, tirosina o triptófano situado en una proteína o péptido, donde el anillo aromático del residuo de aminoácido ha sido modificado por enlace covalente (sustitución) de un grupo NO_{2}.

Tal como se usa aquí, "nitrofenilalanina" significa un residuo de fenilalanina situado en una proteína o péptido, donde el anillo aromático del residuo de fenilalanina ha sido modificado por enlace covalente de un grupo NO_{2}.

Tal como se usa aquí, "nitrotriptófano", significa un residuo de triptófano situado en una proteína o péptido, donde el anillo aromático del residuo de triptófano ha sido modificado por enlace covalente de un grupo NO_{2}.

Como se usa aquí "nitrotirosina" significa un residuo de tirosina o fenilalanina situado en una proteína o péptido, donde el anillo aromático de la tirosina ha sido modificado por enlace covalente de un grupo NO_{2} o el anillo aromático del residuo de fenilalanina ha sido modificado por enlace covalente combinado de un grupo OH en la posición 4 y un grupo NO_{2} en una de las posiciones restantes.

Tal como se usa aquí "Tyr:NO_{2}", significa nitrotirosina. La posición preferida del grupo nitro es adyacente al grupo hidroxilo, por ejemplo como se muestra en la formula I.

1

En una realización de la presente invención una proteína, péptido o fragmento de los mismos que contiene un residuo de aminoácidos aromáticos nitrados se detecta por medio de identificación, en la cual la identificación se basa en la detección del residuo aromático nitrado, en combinación con una secuencia de aminoácidos específica. La nitración del aminoácido aromático ha surgido como resultado del daño oxidativo, preferiblemente en relación con una condición inflamatoria.

En una realización preferida de la presente invención los aminoácidos aromáticos nitrados que se van a medir son residuos de nitrotirosina y/o nitrotriptófano. Los más preferidos son residuos de nitrotirosina, los cuales pueden ser generados bien a través de la nitración de un residuo de tirosina, o a través de la hidroxilación y nitración combinadas de un residuo de fenilalanina.

En procesos patológicos que involucran el daño oxidativo, el grado de proteínas nitradas puede ser utilizado para establecer la severidad de este daño.

En una realización de la presente invención esto se establece generando un índice de daño oxidativo midiendo un residuo nitrado en conjunción con su secuencia circundante de una proteína, péptido o fragmentos de los mismos que contienen un residuo de aminoácido aromático nitrado versus la proteína, péptido o fragmentos de los mismos no nitrados, con la excepción de que una nitrotirosina puede ser una fenilalanina en el péptido no nitrado.

Otra realización de la presente invención incluye su aplicación para diagnóstico o establecimiento in vitro de la severidad de una enfermedad en relación con una patología y/o condición inflamatoria oxidativas. Tales enfermedades podrían ser, pero no estar limitadas a, arteriosclerosis, enfermedad de Alzheimer, asma, enfermedad de Chrons, enfermedad de Parkinson, cáncer, cataratogénesis, diabetes, displasia broncopulmonar, esclerosis múltiple, distrofia muscular, enfermedades inflamatorias del intestino, psoriasis, lupus eritematoso sistémico, osteoartritis o artritis reumatoide.

La inflamación de tejidos articulares se ve en conjunción con la enfermedades artríticas tales como RA y OA o como resultado de una lesión articular aguda. Esta condición inflamatoria está relacionada muy frecuentemente con un proceso catabólico dentro del tejido, que lleva a su degradación gradual. Tales proceso catabólicos dentro de un tejido, liberan proteínas, péptidos o fragmentos de los mismos a numerosos fluidos corporales, tales como el fluido sinovial, sangre, suero u orina. Tales moléculas pueden ser utilizadas como marcadores bioquímicos para la degradación/catabolismo del tejido articular. Las proteínas o fragmentos de proteínas derivados de la matriz de cartílago o del hueso subcondral, que contienen al menos un residuo de tirosina, fenilalanina o triptófano son más probablemente nitrados bajo el incremento inflamatorio en la producción de NO tal como se ve en OA y RA. La medición de los marcadores catabólicos nitrados versus los no nitrados permite la correlación entre la degradación y la inflamación. Este principio también puede ser aplicado a marcadores para enfermedades inflamatorias estomacales u otras enfermedades donde ocurren modificaciones oxidativas por NO_{2}, tales como arteriosclerosis, cáncer, enfermedad de Alzheimer o de Parkinson.

En una realización de la presente invención los residuos aromáticos nitrados que han surgido como resultado de una condición inflamatoria en un tejido articular se sitúan en una proteína, péptido o fragmento de los mismos derivado de la matriz o cartílago extracelular, sinovio de la articulación o hueso subcondral, que puede medirse con el fin de monitorizar el proceso catabólico en el tejido.

En una realización preferida, la proteína o fragmento de la misma, que se monitoriza, constituye un marcador de la degradación del cartílago asociado con una enfermedad articular inflamatoria. La forma nitrada versus la forma no nitrada de tal marcador derivado de la matriz del cartílago se mide generando un índice de inflamación.

Las proteínas o fragmentos de las mismas, que pueden ser nitradas y actúan como marcadores de interés incluyen, pero no se limitan, a colágenos tipos I, II, III, VI, IX u XI, agrecan, proteína de enlace de cartílago, proteína de matriz oligomérica de cartílago, proteína de la capa intermedia de cartílago.

Una proteína marcadora preferida es colágeno tipo II. El colágeno tipo II contiene dos tirosinas, las cuales pueden ser nitradas por daño oxidativo. La primera secuencia HRGYPGLDG (His-Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Leu-Asp-Gly) está localizada en la región helicoidal triple mientras que la segunda secuencia LQYMRA (Leu-Gln-Tyr-Met-Arg-Ala) está localizada en el dominio no helicoidal y en el telopéptido C. Las secuencias de aminoácidos que incluyen los residuos de tirosina son específicas para el colágeno de tipo II y pueden ser empleadas como marcadores bioquímicos específicos de los procesos catabólicos en el tejido del cartílago.

Una realización preferida es la detección de los marcadores de colágeno tipo II nitrados versus los marcadores de colágeno del tipo II no nitrados proporcionando un índice del daño oxidativo y/o la condición inflamatoria del tejido del cartílago en asociación con la condición metabólica del mismo tejido. El principio de este método también se aplica a otros marcadores específicos de tejidos que se originan de tejidos dañados oxidativamente que sufren cambios metabólicos al mismo tiempo.

Especialmente para monitorizar los resultados de un tratamiento esto es de importancia, puesto que algunas formas de tratamiento podrían influir en el proceso catabólico mientras que otras podrían influir el estado inflamatorio. Este establecimiento más diferenciado de la enfermedad obtenido por la aplicación de la presente invención permitirá que las intervenciones terapéuticas puedan apuntar a pacientes individuales.

La detección de un residuo de aminoácido aromático nitrado en combinación con una secuencia localizada dentro de una proteína, péptido o fragmento de los mismos específicos puede por lo tanto llevarse a cabo de numerosas maneras, tales como, pero no limitándose a, HPLC, espectroscopía de masa, enfoque isoeléctrico, secuenciamiento, o inmunoensayos.

Un método preferido de detección es el uso de un inmunoensayo, utilizando un anticuerpo, el cual específicamente se enlaza al menos a un residuo de aminoácido aromático nitrado en conjunción con la secuencia de aminoácido circundante de una proteína específica (epítopo nitrado). Las formas de ensayo en las cuales tal anticuerpo puede ser aplicado, incluyen, pero no se limitan a, ELISA, microarreglo, RIA, FACS, siembra Western, cromatografía de inmunoafinidad, e inmunohistoquímica.

Otro método de detección es un inmunoensayo con intermedio, utilizando un anticuerpo, el cual específicamente reconoce un residuo de aminoácido aromático nitrado independiente de la secuencia circundante y un segundo anticuerpo, el cual reconoce una secuencia de aminoácidos específica localizada dentro de la misma proteína, péptido o fragmento de los mismos como residuo de aminoácido nitrado. El segundo anticuerpo puede muy bien ser un anticuerpo policlonal con especificidad hacia una proteína específica por ejemplo, colágeno tipo II, donde el epítopo real no ha sido identificado.

El método más preferido para monitorizar un proceso patológico que involucra un daño oxidativo y/o una condición inflamatoria en asociación con un cambio metabólico utiliza la generación de un índice como se describió más arriba. Más específico tal índice se genera poniendo en contacto un anticuerpo, el cual se enlaza específicamente con un epítopo nitrado, con una muestra biológica. Al reaccionar con el primer anticuerpo, el conjugado anticuerpo-péptido puede ser detectado por diferentes métodos de afinidad/visualización o aislamiento. Si es apropiado, un segundo anticuerpo, el cual se enlaza específicamente con una secuencia de aminoácidos equivalente no nitrosilada como el primer anticuerpo, se pone en contacto con un alícuota de la misma muestra biológica como el primer anticuerpo, o los remanentes (sobrenadantes) resultantes de un aislamiento del primer conjugado anticuerpo-péptido. La relación entre el péptido y/o proteína nitrados y no nitrados de la muestra bilógica se determina de esta manera. Los métodos de determinación son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, ELISA, microarreglo, RIA, FACS, cromatografía de inmunoafinidad, e inmunohistoquímica. Si se aplican otros métodos diferentes a la cromatografía, es importante que los dos anticuerpos estén marcados de una manera tal que permita la diferenciación entre ellos. Esto podría ser una fluorescencia diferente (por ejemplo rojo, verde, amarillo), marcación enzimática versus marcación radioactiva y así sucesivamente. Un índice de daño oxidativo y/o inflamación en asociación con la condición metabólica del tejido desde el cual se origina la proteína específica puede proveerse evaluando proporciones de un paciente en relación con proporciones de individuos saludables.

En situaciones donde se utiliza una muestra de tejido para monitorizar los procesos patológicos en el tejido articular, existe una fuerte probabilidad de que los dominios de colágeno helicoidal desnaturalizados, que resultan de los procesos catabólicos dentro del tejido, puedan ser retenidos en el tejido por entrecruzamiento y empaque fibrilar. Para apuntar hacia este problema, la muestra bilógica se pone en contacto primero con una enzima que tiene la capacidad de romper selectivamente colágenos no enrollados (no helicoidales) sin romper los epítopos (His-Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Leu-Asp-Gly y/o Leu-Gln-Tyr-Met-Arg-Ala. Tales enzimas podrían ser, pero no limitarse a, tripsina o quimotripsina, que son incapaces de romper colágeno enrollado (nativo) dentro de la hélice \alpha. Los fragmentos de colágeno no enrollados son extraídos entonces desde la muestra biológica para producir un extracto de fragmentos de colágeno no enrollado. Este extracto puede ser ensayado tal como me menciono más arriba.

Los anticuerpos con las propiedades descritas más arriba emergen contra un péptido constituyendo un epítopo nitrado. El péptido es usado como un antígeno para inmunización. El péptido es emulsificado en un medio adyuvante, preferiblemente el adyuvante incompleto de Freund, e inyectado de manera subcutánea o en la cavidad peritoneal de un huésped mamífero, preferiblemente un roedor más preferiblemente conejos, aún más preferibles los ratones BalbC. Con el fin de potenciar las propiedades inmunogénicas del péptido antigénico puede acoplarse a una proteína portadora antes de emulsificarse en un medio adyuvante. Los vehículos útiles son proteínas tales como hemocianina de lapa cerradura (KLH), edestina, tiroglobolina, albuminas, tales como albumina de suero bovino o humano (BSA o HSA), toxoides del tétano y toxoide de cólera, poliaminoácidos, tales como poli-(ácido D-lisina-D-glutámico). Las inyecciones potenciadoras pueden ser dadas a intervalos regulares hasta que se obtenga una respuesta inmune, pudiendo ser dada la última inyección de manera intravenosa para asegurar una máxima estimulación de las células B.

Los antisueros serán seleccionados por su capacidad para enlazarse con el epítopo deseado y su cantidad de reactividad cruzada al epítopo no nitrado. Los antisueros de los huéspedes más prometedores pueden ser usados en su forma cruda o purificada. Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados a partir de los ratones inmunizados con el título de anticuerpo más alto, fusionando los linfocitos aislados del bazo de esos ratones con una línea celular de mieloma. Los clones hibridoma generados son seleccionados por su capacidad para producir anticuerpos, los cuales reconocen el epítopo deseado. Pueden establecerse líneas celulares para la producción y purificación de anticuerpos monoclonales.

Los métodos para la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales son bien conocidos en la técnica y también pueden utilizarse otros métodos diferentes a los descritos.

En un aspecto de la presente invención el péptido sintético para anticuerpos y generación de líneas celulares tal como se describió arriba es, (X_{aa})_{m}-His-Arg-Gly-Tyr:NO_{2}-Pro-Gly-(X_{aa})_{n}, donde X_{aa} denota cualquier aminoácido o derivados de los mismos y m y n son enteros independientes por ejemplo, de 0 a 10.

En una realización preferida de la presente invención el péptido sintético para la generación de anticuerpos y la línea celular como se describe arriba es (X_{aa})_{m}-His-Arg-Gly-Tyr:NO_{2}-Pro-Gly-Leu-Asp-Gly-(X_{aa})_{n} donde X_{aa} denota cualquier aminoácido o derivados del mismo y m y n son enteros independientes por ejemplo de 0 a 10.

En otra realización preferida los péptidos sintéticos para la generación de anticuerpos y la línea celular como se describió más arriba tiene la forma (X_{aa})_{m}-Leu-Gln-Tyr:NO_{2}-Met-Arg-Ala-(X_{aa})_{n} donde X_{aa} denota cualquier aminoácido o derivados del mismo y m y n son enteros independientes por ejemplo, de 0 a 10.

Con la excepción de que una nitrotirosina puede ser derivada de una fenilalanina del péptido no nitrado, los segundos anticuerpos utilizados en la presente invención se generan utilizando las mismas técnicas o similares que para la preparación de los anticuerpos enlazantes de nitrosilo.

Una realización de la presente invención constituye el desarrollo de un kit de diagnóstico de acuerdo con las reivindicaciones 16-19 para su uso en la detección y monitorización de daño oxidativo y/o una condición inflamatoria. Esto incluye un anticuerpo que reconoce un epítopo nitrado, preferiblemente utilizando un anticuerpo de la presente invención, bien solo o en combinación con un segundo anticuerpo con especificidad hacia la secuencia equivalente no nitrada, permitiendo un establecimiento simultáneo del metabolismo del tejido y del daño oxidativo. El kit puede ser aplicado sobre fluidos corporales de mamíferos o extractos de células o tejidos, preferiblemente derivados de humanos. Para las detecciones de competición, podría suministrarse un péptido de 6 a 20 aminoácidos, en el cual una sucesión de aminoácidos es equivalente al epítopo enlazante para uno de dichos anticuerpos, bien en forma marcada o no marcada. Los anticuerpos pueden ser marcados uniéndolos, de manera covalente o no covalente, con una molécula informadora. Las moléculas informadoras adecuadas o marcadoras, que pueden ser utilizadas para facilitar la detección, incluyen radioisótopos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares. Uno de los anticuerpos no marcados o un péptido del kit puede ser inmovilizado, preferiblemente sobre una superficie sólida tal como una placa de microtitulación, posiblemente por conjugación con un portador proteínico adecuado tal como BSA.

En una realización preferida el primer anticuerpo en el kit descrito más arriba reconoce las secuencias nitrosiladas de colágeno tipo II descritas previamente, y el segundo anticuerpo describe la secuencia no nitrada equivalente.

La invención será descrita e ilustrada adicionalmente con referencia a los dibujos acompañantes, en los cuales:

La Figura 1 muestra una curva estándar para el inmunoensayo con colágeno nitrado tipo II en una gráfica semilogaritmica. La concentración del antígeno libre está en nM. B/Bo representa la relación entre el anticuerpo enlazado al antígeno recubierto en presencia del antígeno libre (B) o en la ausencia del antígeno libre (Bo) y se da en porcentaje;

La Figura 2 muestra la inhibición competitiva del antisuero D37 que se enlaza a His-Arg-Gly-Tyr:NO_{2}-Pro-Gly-Leu-Asp-Gly sobre placas recubiertas utilizando His-Arg-Gly-Tyr:NO_{2}-Pro-Gly-Leu-Asp-Gly(O), His-Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Leu-Asp-Gly(\bullet), colágeno tipo II nativo (\blacklozenge), colágeno tipo II nitrado (\lozenge), colágeno tipo I (\blacktriangle), (BSA (\blacktriangledown) y BSA nitrado (V) como competidores. B/Bo representa la relación entre el anticuerpo enlazado al antígeno recubierto en presencia del antígeno competidor (B) o en la ausencia del antígeno competidor (Bo) y se da en porcentaje.

La Figura 3 muestra los resultados del ejemplo 3 y da el nivel de CoII2-1 (NO_{2}) como fragmentos en suero de las ratas Lewis inmunizadas con colágeno bovino tipo II. Los gráficos representan los niveles de los marcadores en los animales que no desarrollaron la enfermedad (CIA saludables) y los animales que desarrollaron artritis inflamatoria (CIA enfermos);

La Figura 4 muestra los resultados del ejemplo 4 demostrando que los explantes del cartílago articular humano producen CoII2-1(NO_{2}) in vitro. De izquierda a derecha las barras muestran los resultados de un control, de estimulación con IL1, oncostatina y plasminógeno, y por estimulación con IL1, oncostatina, plasminógeno y el activador de plasminógeno acetato aminofenil mercúrico (APMA);

La Figura 5 muestra resultados obtenidos en el ejemplo 5 dando la variación fisiológica de los niveles de fragmentos de CoII2-1(NO_{2}) en suero de acuerdo con el rango de edad y sexo (para hombres diamantes rellenos en negro, y para mujeres diamantes en blanco);

La Figura 6 muestra los resultados obtenidos en el ejemplo 5 dando la variación fisiológica de los niveles de fragmentos de CoII2-1(NO_{2}) en el suero en hombres y mujeres subdivididos en dos grupos de edad grandes;

La Figura 7 muestra los resultados obtenidos en el ejemplo 6 demostrando que los pacientes RA tienen niveles de CoII2-1(NO_{2}) más elevados que los pacientes OA; y

La Figura 8 proporciona los resultados obtenidos en el ejemplo 7 mostrando los niveles de reactividad cruzada del anticuerpo anti-CoII2-2 (NO_{2}) (antisuero D33).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos Ejemplo 1 Inmunoensayo con colágeno tipo II Antisueros

Una secuencia de nueve aminoácidos (His-Arg-Gly-Tyr:NO_{2}-Pro-Gly-Leu-Asp-Gly) derivada de la región helicoidal triple del colágeno tipo II [(\alpha1) II] y una segunda secuencia de seis aminoácidos Leu-Gln-Tyr:NO_{2}-Met-Arg-Ala derivados a partir del telopéptido C del colágeno tipo II fueron sintetizados utilizando síntesis de péptidos en fase sólida Fmoc estándar (protocolo HBTU/HOBt) (Chan, W.C. y White, P.D., 2000).

La secuencia de aminoácidos fue conjugada a tiroglobulina mediante un procedimiento con carbodiimida (Soinila et al 1992).

Se inyectaron por vía intraperitoneal conejos con 1 ml de conjugado emulsificado en adyuvante completo de Freund. El conjugado y el adyuvante fueron mezclados en volúmenes iguales. Se repitieron las inyecciones cuatro veces cada mes con una cantidad similar de conjugado en adyuvante de Freund incompleto. Diez días después de la última inyección, los conejos fueron sacrificados mediante un sangrado final. La sangre fue recolectada y centrifugada durante 10 minutos a 1500 x g a 4ºC. Los sobrenadantes fueron almacenados a -20ºC.

Los siguientes ejemplos se concentraran sobre antisueros obtenidos por inmunización con el péptido His-Arg-Gly-Tyr:NO_{2}-Pro-Gly-Leu-Asp-Gly. Todos los ejemplos fueron llevados a cabo de forma similares para el péptido Leu-Gln-Tyr:NO_{2}-Met-Arg-Ala.

Se obtuvieron seis antisueros, identificados como CoII2-1:NO_{2} D35, D36, D37, D38, D39 y D40 y sus especificidades fueron probadas con las inhibiciones competitivas His-Arg-Gly-Tyr(NO_{2})-Pro-Gly-Leu-Asp-Gly, His-Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Leu-Asp-Gly, con colágeno nitrado tipo II, colágeno nativo tipo II, colágeno nitrado tipo I, colágeno tipo I, BSA nitrado y BSA.

ELISA competitivo

Se desarrolló un inmunoensayo competitivo para cuantificar los productos de ruptura del colágeno nitrado tipo II que contenía la siguiente secuencia His-Arg-Gly-Tyr:NO_{2}-Pro-Gly-Leu-Asp-Gly. Los péptidos sintéticos His-Arg-Gly-Tyr:NO_{2}-Pro-Gly-Leu-Asp-Gly fueron biotinilados e incubados a 1.25 ng/ml sobre placas recubiertas de streptavidie (Nunc, Dinamarca) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadieron cincuenta \mul de calibradores (para generar una curva estándar) o muestras desconocidas, diluidos en Ultroser G (Gibco) a pozos separados. Se añadieron cien \mul de antisuero (véase más arriba) diluido 1/125000 a cada pozo. Las muestras fueron mezcladas haciendo rotar las placas e incubando 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados sucesivos con regulador de lavado (Tris 25 mM, NaCl 50 mM pH 7.3), se añadieron 100 \mul de anticuerpos para IgG de conejo de cabra conjugados con peroxidasa de rábano (Biosource, Bélgica) a cada pozo y se incubaron 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadieron 100 \mul de sustrato de enzima recién preparado (TMB, Biosource, Bélgica) a cada pozo. Después de 15 minutos de incubación, la reacción fue detenida con 100 \mul de H_{3}PO_{4}, 4M. La coloración fue leída en un lector de microplacas (Labsystem iEMS Reader MF, Finlandia) a 450 nm y se corrigió por absorbancia a 620 nm. Se construyó una curva estándar sobre una gráfica logarítmica-lineal representando el B/Bo de 6 calibradores (10 a 0.01 nM) (figura 1). La concentración de HIS-ARG-GLY-TYR:NO_{2}-PRO-GLY-LEU-ASP-GLY que contenían péptidos en las muestras fueron determinadas por interpolación en la curva de calibración.

Límite de detección

El límite de detección del ensayo descrito en el ejemplo 1, se calcula como el valor Bo medio (M) de 21 determinaciones del estándar A menos 3 veces la desviación estándar (SD) del Bo (M_{A}-3*SD_{A}). Para CoII2-1:NO_{2} D37 el límite de detección fue 25 pM.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Caracterización de los antisueros CoII2-1:NO_{2} D37-40 Especificidad

Los antisueros producidos fueron probados en cuanto a su especificidad para His-Arg-Gly-Tyr:NO_{2}-Pro-Gly-Leu-Asp-Gly, mediante el uso del inmunoensayo descrito en el ejemplo 1. Para probar la especificidad el péptido His-Arg-Gly-Tyr:NO_{2}-Pro-Gly-Leu-Asp-Gly, His-Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Leu-Asp-Gly, colágeno nitrado tipo II, colágeno nativo tipo II, colágeno nitrado tipo I, colágeno tipo I, BSA nitrado y BSA.

El colágeno nativo tipo II, colágeno tipo I, colágeno nitrado tipo I, BSA nitrado y BSA no fueron capaces de competir con el péptido recubierto His-Arg-Gly-Tyr:NO_{2}-Pro-Gly-Leu-Asp-Gly, en las concentraciones aplicadas, mientras que el antisuero mostró una afinidad débil hacia la secuencia no nitrada His-Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Leu-Asp-Gly y el colágeno nitrado tipo II y una fuerte afinidad a la secuencia His-Arg-Gly-Tyr:NO_{2}-Pro-Gly-Leu-Asp-Gly. También se demostró una falta de afinidad al enlazamiento con L-nitrotirosina.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Los niveles de CoII2-1 (NO_{2}) son elevados en modelos animales de artritis inflamatoria

Se ha establecido un cierto número de modelos animales para estudiar la artritis inflamatoria. Estos modelos en general reflejan la enfermedad humana, teniendo la inflamación articular y la destrucción de tejidos. Se ha detectado una regulación significativamente alta de las citoquinas inflamatorias y de los niveles de NO. Así la nitrosilación de residuos de tirosina probablemente ocurra en estas situaciones. Mediante este ejemplo, se demostró que las muestras de suero de ratas y ratones normales podían ser medidas en el ensayo de CoI2-1 (NO_{2}) descrito en el ejemplo 1.

Uno de los modelos animales más comúnmente empleados de RA es la Artritis Inducida por Colágeno (CIA) en ratas Lewis como modelo animal. En este modelo, la inflamación de las articulaciones es inducida por inmunización con colágeno tipo II lo cual provoca una respuesta inflamatoria severa del cartílago articular evidente como una hinchazón de las articulaciones de las patas y la subsecuente destrucción de las articulaciones cuando se lleva a cabo el análisis histológico. La artritis fue monitorizada por marcación macroscópica del hinchamiento y enrojecimiento de las patas. La erosión de los cartílagos y los huesos fue monitorizada cuantificando los niveles urinarios de CartiLaps y los niveles de suero de RatLaps, dos marcadores bioquímicos de la resorción de cartílagos y huesos. Estos ensayos fueron ejecutados tal como se especifica por parte del fabricante (Nordic Bioscience Diagnostics, Herlev, Dinamarca).

El estudio cohorte comprendió 21 ratas Lewis hembra las cuales fueron ovarectomizadas (OVX). En la línea base el peso fue determinado y los animales fueron anestesiados para el procedimiento OVX. Después de la inducción de anestesia general con Hypnorm-Dormicum (1 parte de Hypnorm® + 1 parte Dormicum® + 2 partes de agua desionizada estéril, dosis 0.15-0.2 ml/100 g de peso corporal), se llevó a cabo una OVX estándar. El peso de los animales fue determinado semanalmente a través del periodo de estudio. Para las mediciones de los marcadores de cartílago y hueso se obtuvieron muestras de orina colocando los animales en una caja metabólica durante 30 - 60 minutos y esperando la orina espontánea o frotando suavemente el vientre del animal, esto es orina forzada, y obteniendo muestras de sangre como sangre del ojo. En la terminación del estudio, se aislaron las rodillas y el cartílago articular fue analizado histológicamente en cuanto a la erosión. La ratas fueron inmunizadas con colágeno tipo II una semana después del OVX para inducir la artritis inflamatoria. Cada rata fue inmunizada con 150 \mug de colágeno tipo II bovino emulsificado en adyuvante de Freund incompleto. Las patas de las ratas fueron registradas diariamente a partir del día 11 por observación visual sobre las patas. Cada pata es registrada en una escala de 0 - 4 y los registros para las cuatro patas son sumados. Si los marcadores de artritis combinados alcanzaron un marcador de 10 para un animal dado o si el animal desarrollo artritis muy severa en una pata o tuvo CIA durante más de 16 días, el animal fue sacrificado por consideraciones éticas, puesto que la artritis más severa está asociada con un dolor e incomodidad significativos. El resto de los animales fueron mantenidos durante 27 días después de que se terminó la OVX.

El nivel de CoII2-1 (NO_{2}) en el suero y la presencia de signos externos de artritis tuvieron una muy buena correlación (Fig.3). Los niveles de CoII2-1(NO_{2}) fueron significativamente elevados en las ratas que desarrollaron artritis inflamatoria (enfermas) mientras que los animales que no desarrollaron la enfermedad mostraron niveles significativamente más bajos de CoI2-1(NO_{2}) además, el nivel de fragmentos de colágeno se incrementó después de la aparición de síntomas severos de artritis implicando que CoII2-1(NO_{2}) es un biomarcador predictivo de la erosión del cartílago inducida por inflamación.

Ejemplo 4 Explantes de cartílago articular humano producen CoII2-1(NO_{2}) in vitro

Los explantes de cartílago articular son utilizados comúnmente como sistemas in vitro para establecer el metabolismo del cartílago. El cartílago articular fue obtenido de pacientes humanos adultos que sufren cirugía de reemplazo de articulaciones y el cartílago fue cortado bien como tacos cilíndricos (5-30 mg) o como láminas (20-30 mg). Los explantes fueron cultivados en placas de 96 pozos en 200 ml de medio DMEM libre de suero en presencia de 5 ng/ml de IL-1\alpha humana recombinante (Sigma, St. Louis, Estados Unidos), Oncostatina M 50 ng/ml (Sigma, St. Louis, Estados Unidos) y plasminógeno humano 10 \mug/ml (Sigma, St. Louis, Estados Unidos). El plasminógeno es un activador MMP fisiológico que induce la degradación del colágeno tipo II. Adicionalmente el activador de MMP APMA (acetato aminofenil mercúrico, SIGMA, St. Louis, Estados Unidos) fue añadido como se indica en la Fig. 4. El medio acondicionado fue recolectado en varios puntos del tiempo para medición de CoII2-1 (NO_{2}). Este ejemplo muestra como las citoquinas IL 1 y la oncostatina (OSM) influyen en la liberación de CoII2-1 (NO_{2}) en el medio acondicionado a partir de explantes de cartílago.

Se demostró que la adición de IL1, oncostatina y plasminógeno no tenían influencia en la degradación del cartílago. Sin embargo pudo ser detectado un nivel significativo de CoII2-1 (NO_{2}) en el medio acondicionado de explantes de cartílago cuando el activador de plasminogeno APMA fue añadido también al medio (Fig.4). Esta observación se enlaza con la liberación del marcador CoI2-1 (NO_{2}) a partir de cartílago articular con la actividad colagenolítica en la matriz, y demostró que el marcador refleja los procesos catabólicos en el tejido.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Niveles fisiológicos de CoII 2-1(NO_{2}) en hombres y mujeres saludables

Con el fin de establecer los valores de referencia para CoII2-1 (NO_{2}), se recolectaron sueros a partir de 242 sujetos saludables ambulatorios que atendía un centro de donadores de sangre en Lieja, Bélgica. Ninguno de los sujetos de estudio tenía evidencia de artritis u otras enfermedades inflamatorias. Ninguno estaba tomando corrientemente medicación alguna conocida que medicase la enfermedad artrítica o tuviera influencia sobre el metabolismo articular. Este grupo estaba compuesto de 170 hombres y 72 mujeres, con edades entre 20 y 65 años (media: 42.8 \pm 1.4 años). La edad promedio de las mujeres era 42.7 \pm 1.0 años y la edad media de los hombres era 42.8 \pm 1.4 años.

Cuando la población fue estratificada por edad en 5 fracciones de años, los niveles en suero de CoII2-1 (NO_{2}) no variaron significativamente en el intervalo de edad investigado (20 - 65 años) (Fig. 5). La comparación de los niveles de péptidos por sexo mostraron que hasta los 45 años de edad la concentración de CoII2-1 (NO_{2}) era más alta en mujeres que en hombres pero la diferencia era solamente significativa para subclases de 20 - 25 y 26 - 31 años (Fig.X+3). Sin embargo, cuando los sujetos con edades de 46 a 55 años correspondientes a las mujeres postmenopáusicas tempranas fueron eliminados, el nivel de CoII2-1 (NO_{2}) fue más alto en las mujeres premenopáusicas que en las mujeres postmenopáusicas.

El nivel de CoII2-1 (NO_{2}) es más alto en individuos jóvenes (premenopáusicos) que en individuos mayores (Fig.6). El nivel de estos fragmentos es idéntico tanto para hombres como mujeres en el rango de 56 - 65 años de edad mientras que las mujeres premenopáusicas mostraron niveles significativamente más altos del marcador en comparación con los hombres y con las mujeres postmenopáusicas. Esta observación corresponde bien con la relación establecida entre los niveles de estrógeno y el óxido nítrico. El estrógeno regula la producción de la óxido nítrico sintetasa (iNOS) y así los niveles de óxido nítrico, el cual a su vez es responsable de la generación de las proteínas modificadas por nitrotirosina tal como se cuantifica en la prueba de CoI2-1 (NO_{2}). Por lo tanto los niveles elevados de este marcador medidos en las mujeres premenopáusicas establecen una unión entre los niveles de estrógeno y la nitrosilación.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 Los pacientes Ra tienen niveles de CoII2-1 (NO_{2}) más elevados que los pacientes OA

Un hecho clínico importante es si los niveles del marcador CoI2-1(NO_{2}) son elevados en la artritis y están asociados con los procesos inflamatorios vistos en RA. Para estudiar esto, se obtuvieron muestras de suero a partir de un panel cruzado de pacientes con artritis que comprendía 10 pacientes de OA (4 mujeres y 6 hombres con edades por encima de 45 años) que eran candidatos para artroscopia. La artroscopia fue llevada a cabo para diagnóstico y/o para limpieza del menisco y de lesiones del cartílago. Los sueros fueron recolectados 24 horas antes de la cirugía. Estos sujetos no tenían señales radiológicas de OA pero todos tenían lesiones del cartílago identificadas por artroscopia. Todos los sujetos tenían leucocitosis normal y un nivel de proteína C-reactiva (CRP) inferior a 5 mg/L. Además, estos pacientes no tomaron ningún fármaco antiinflamatorio no esteroidal durante el año anterior a la intervención.

La concentración de CoII2-1(NO_{2}) también fue medida en muestras de suero de 14 pacientes con RA temprana. En el momento de la toma de muestra, estos pacientes no habían recibido medicación alguna, y todos tenían un nivel de proteína C-reactiva por encima de 5 mg/L.

Cuando se comparan los niveles de CoII2-1 (NO_{2}) en estas cohortes fue evidente que los pacientes RA donde la inflamación del tejido articular es un elemento significativo de la enfermedad tenían niveles significativamente más altos del marcador que los pacientes OA o los controles (Fig.7). Esta observación asocio la producción de CoII2-1 (NO_{2}) directamente con la degradación del cartílago asociada a la inflamación en la artritis inflamatoria.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7 Desarrollo de una prueba específica para un epítopo de colágeno tipo II nitrosilado derivado de la región C-telopéptido (CoII2-2(NO_{2}) ELISA) Reactivos y reguladores para los inmunoensayos

El regulador de recubrimiento fue NaHCO_{3} 0.08 M pH 9.6. El regulador de saturación estaba compuesto de KH_{2}PO_{4} 1.5 mM, Na_{2}HPO_{4} 8 mM, KCl 2 mM, NaCl 138 mM, albumina de suero bovino 5 g/L (BSA), monohidrato de lactosa 53 g/L pH 7.2. La solución reguladora de lavado fue una solución de Tris 25 mM, NaCl 50 mM pH 7.3. La curva estándar y la dilución de las muestras cuando fue necesario se realizó en Tris 50 mM, NaCl 138 mM, BSA 7 g/L, Tween 20 1 ml/L pH 8.0.

Las diluciones de los antisueros (1/80.000) y del segundo anticuerpo (1/5.000) fueron hechas en Na_{2}HPO_{4} 10 mM, KH_{2}PO_{4} 1.5 mM, KCl 2 mM, NaCl 150 mM, EDTA 25 mM, BSA al 1% en Tween 0.1% pH 7.4.

\vskip1.000000\baselineskip

Inmunización

Los conejos fueron inyectados por vía intraperitoneal con 1 ml de los péptidos conjugados (0.5 mg/ml) emulsificados en adyuvante de Freund completo. El conjugado y el adyuvante fueron mezclados en volúmenes iguales. Las inyecciones fueron repetidas cuatro veces cada mes utilizando la misma concentración de péptidos que para la primera inyección en adyuvante incompleto de Freund. Diez días después de la última inyección, los conejos fueron sacrificados. La sangre fue recolectada y centrifugada durante 10 minutos a 2.500 rpm a 4ºC. El sobrenadante fue mantenido y almacenado a -20ºC. En cada sangrado, los antisueros fueron seleccionados por experimentos de titulación en cuanto a la presencia del anticuerpo anti GGGLQY(NO_{2})MRA. Los antisueros con los títulos más altos fueron seleccionados para los siguientes experimentos.

\vskip1.000000\baselineskip

Especificidad

El anticuerpo D33 es altamente específico para el fragmento CoII2-2 nitrosilado y no reacciona con el mismo fragmento CoII2-2 no nitrosilado o con cualquier otro fragmento ligeramente similar en la secuencia (CoII2-1) o secuencias completamente diferente (BSA NO_{2}). La figura muestra también que la secuencia escogida de CoII2-2 contra la cual el D33 fue elevado no podría ser reconocida cuando está aún "incluida" en la longitud completa de la proteína (CoII II (NO_{2})). La secuencia nitrosilada es reconocida solamente en la forma de fragmentos libres (Fig. 8).

\vskip1.000000\baselineskip

Rendimiento del ensayo técnico

Intraensayo CV: Con el fin de abordar la cuestión de los resultados correctos y reproducibles medidos en esta prueba se evaluó un intraensayo CV midiendo las mismas muestras de orina en diferentes emplazamientos en la misma placa.

TABLA 1 Evaluación de intraensayo CV (%) de 2 CoII2-2 (NO_{2}) como ensayo

2

El intraensayo mostró que las muestras podrían ser medidas de una buena manera reproducible (la buena variación estándar de la concentración media de las muestras de los fragmentos de CoII2-2 (NO_{2})). La CV sobre la medición de las muestras para ambas muestras utilizadas aquí estuvo por debajo del 10% testificando también en cuanto a la precisión de la prueba.

\newpage

- Recuperación: la certeza de la medición de CoII2-2 es establecida por dilución sucesiva de las muestras. La dilución de las muestras nos permite evaluar la recuperación (expresada en %), la tabla más abajo resume las recuperaciones evaluadas para dos muestras de orina. El ensayo se comportó correctamente (véase tabla más abajo).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Recuperación de fragmentos de CoII2-2(NO_{2}) en dos muestras de orina después de dilución respectivamente 1/2; 1/4 y 1/8

3

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias

Chan, W.C., White, P.D., 2000 Fmoc solid-phase peptide synthesis: A practical approach, Oxford University Press, Oxford 2000.

Lin, J.K., Chen, K.J., Liu, G.Y., Chu, Y.R., Lin-Shiau, S.Y., 2000. Nitration and hydroxylation of aromatic amino acid and guanine by the air pollutant peroxyacetyl nitrate. Chem Biol Interact. 127, 219-236.

Lotz, M., 1999. The role of nitric oxide in articular cartilage damage. Rheum Dis Clin North Am 25, 269-282.

Moller, H.J., 1998. Connective tissue markers of rheumatoid arthritis. Scand J Clin Lab Invest 58, 269-278.

PCT patent application WO 96/04311, Ye Y.Z, Beckman J.S., Monoclonal Antibody to Nitrotyrosine, Methods for Diagnosis and Methods for Treatment of Disease, University Alabama Res Found (Us), 1996.

PCT patent application WO 98/29452, Chagnaud J.L., Vincendeau P., Geffard M., Veyret B., Antibodies Specifically Recognizing a Nitrated Protein, Method of Preparation, Therapeutic and Diagnostic use, Centre Nat Rech Scient (Fr), 1998

PCT patent application WO 01/38872, Christgau S., Henriksen D.B., Cloos P., Assay of Isomerised and/or Optically Inverted Proteins and Protein Fragments, Osteometer Biotech A/S (DK), 2001.

Soinila, S., Mpitsos, G.J., Soinila, J., 1992. Immunohistochemistry of enkephalins: model studies on hapten-carrier conjugates and fixation methods. J Histochem. Cytochem. 40, 231-239.

Stadtman, E.R., Levine, R.L., 2000. Protein oxidation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 899, 191-208.

US patent 5919634, Eyre D. R., Methods of detecting collagen type II degradation in vivo, Washington Research Foundation (Seattle, WA), 1999.

US patent 6132976 Poole A.R., Hollander A.P., Billinghurst R.C., Immunoassay For the Measurement of Collagen Denaturation and Cleavage in Cartilage, Shriners Hospital for Children (Tampa, Fla), 2000.

Wollheim, F.A., 1996. Predictors of joint damage in rheumatoid arthritis. APMIS 104, 81-93.

Claims (19)

1. \global\parskip0.930000\baselineskip

   1. Un método para llevar a cabo un inmunoensayo cualitativo o cuantitativo para la oxidación de proteínas, que comprende detectar en una muestra una secuencia de aminoácidos que es característica de una proteína específica presente en un tejido articular y que contiene uno o más residuos de aminoácidos aromáticos en forma nitrada, donde el ensayo comprende, detectar el enlace de un asociado de enlace inmunológico que es inmunoreactivo con dicha forma nitrada de dicho residuo de aminoácido aromático.
2. 2. Un método como el reivindicado en la reivindicación 1, donde dicho asociado de enlace inmunológico es especialmente reactivo con dicha forma nitrada de dicho residuo de aminoácido aromático en el contexto de dicha secuencia de aminoácidos que es característica de una proteína específica.
3. 3. Un método como el reivindicado en la reivindicación 1, donde dicho asociado de enlace inmunológico es reactivo con dicha forma nitrada de dicho residuo de aminoácido aromático en un contexto de manera independiente y dicho ensayo comprende detectar el enlazamiento de dicho asociado de enlace inmunológico y dicho segundo asociado de enlace inmunológico a las secuencias de aminoácidos nitrados en formato de intermediación, donde dicho segundo asociado de enlace inmunológico tiene especificidad de enlace para una secuencia de aminoácidos que es característica de dicha proteína específica.
4. 4. Un método como el reivindicado en la reivindicación precedente donde dicha proteína es colágeno de tipo I, II, III, VI, IX u XI, agrecan, proteína de enlace de cartílago, proteína oligomérica de cartílago, o proteína de capa intermedia de cartílago.
5. 5. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho residuo o residuos de aminoácidos aromáticos nitrados es/son nitrotirosina o nitrotriptófano.
6. 6. Un método como el reivindicado en la reivindicación 5, donde la secuencia de aminoácidos que es detectada comprende la secuencia HRGYPLDG en la cual el residuo de aminoácidos Y es tirosina nitrada o está comprendido dentro de dicha secuencia e incluye dicha tirosina nitrada.
7. 7. Un método como el reivindicado en la reivindicación 5, donde la secuencia de aminoácidos que es detectada comprende la secuencia LQYMRA en la cual el residuo de aminoácido Y es tirosina nitrada o está comprendido dentro de dicha secuencia e incluye dicha tirosina nitrada.
8. 8. Un asociado de enlace inmunológico específicamente reactivo con la forma nitrada de un residuo de aminoácido aromático en el contexto de una secuencia de aminoácidos que es característica de una proteína específica que tiene especificidad de enlace para un epítopo contenido en la secuencia de aminoácidos HRGY:NO_{2}PGLDG epítopo que contiene el residuo de aminoácido Y:NO_{2} y es característico del colágeno tipo II.
9. 9. Un asociado de enlace inmunológico como se reivindica en la reivindicación 8, el cual es un anticuerpo que surge contra un péptido que tiene la secuencia (Xaa)_{m} HRGY:NO_{2}PGLDG (Xaa)_{n}, donde X denota cualquier aminoácido o derivado del mismo y m y n son enteros independientes de 1 a 10.
10. 10. Un asociado de enlace inmunológico específicamente reactivo con la forma nitrada de un residuo de aminoácido aromático en el contexto de una secuencia de aminoácidos que es característica de una proteína específica, que tiene especificidad de enlace para un epítopo contenido en la secuencia de aminoácidos LQY:NO_{2}MRA epítopo que contiene el residuo de aminoácido Y:NO_{2} y es característico del colágeno tipo II.
11. 11. Un asociado de enlace inmunológico como se reivindica en la reivindicación 10, que es un anticuerpo que surge contra un péptido que tiene la secuencia (Xaa)_{m} LQY: NO_{2}MRA(Xaa)_{n}, donde X denota cualquier aminoácido derivado del mismo y n y m son enteros independientes de 1 a 10.
12. 12. Un asociado de enlace inmunológico como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, el cual es un anticuerpo monoclonal.
13. 13. Una línea celular que produce un anticuerpo monoclonal como se reivindica en la reivindicación 12.
14. 14. Un método para la investigación de la existencia o alcance del daño oxidativo que comprende medir en una muestra biológica las cantidades relativas de formas nitradas y no nitradas de una secuencia de aminoácidos que es característica de una proteína específica derivada de la matriz de cartílago y que contiene uno o más residuos de aminoácidos aromáticos nitrables, poniendo en contacto una muestra biológica de un individuo o una porción de tal muestra con un primer asociado de enlace inmunológico el cual se enlaza a dicha forme nitrada de dicha secuencia de aminoácidos y determinar cuantitativamente dicho enlace; poner en contacto la muestra biológica o una porción de la misma con un segundo asociado de enlace inmunológico el cual se enlaza con dicha forma no nitrada de dicha secuencia de aminoácidos y determinar cuantitativamente dicho enlace; determinar una proporción entre dichas determinaciones para proveer una relación de las cantidades relativas de dichas formas nitradas y no nitradas de dicha secuencia presentes en la muestra; y comparar el valor medido con valores característicos de individuos saludables o individuos de patología conocida.

    \global\parskip1.000000\baselineskip

15. 15. Un método como el reivindicado en la reivindicación 14, donde dicho primer asociado de enlace inmunológico es como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12.
16. 16. Un kit para uso en la ejecución de un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 14 y 15 y que comprende: un asociado de enlace inmunológico que se enlaza específicamente con la forma nitrada de un residuo de aminoácido aromático en el contexto de una secuencia de aminoácidos que es característica de una proteína específica presente en el tejido articular; y medios para detectar el enlace de dicho asociado de enlace con dicha forma nitrada de dicho residuo de aminoácido aromático.
17. 17. Un kit como el reivindicado en la reivindicación 16, donde el asociado de enlace inmunológico es como se reivindicó en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12.
18. 18. Un kit como el reivindicado en la reivindicación 16 o reivindicación 17, que incluye un asociado de enlace inmunológico que es reactivo con la dicha secuencia de aminoácidos en la forma no nitrada.
19. 19. Un kit como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, que comprende un péptido reactivo con un dicho asociado de enlace inmunológico.