ES2335751T3 - Farmacos y procedimientos para tratar la hipoxia y procedimientos de seleccion de los anteriores. - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para identificar moduladores de la prolil hidroxilasa, que comprende las etapas a)poner en contacto pVHL, una prolil hidroxilasa, un modulador putativo de la prolil hidroxilasa y una proteína de fusión que genera luz que comprende a) un resto polipéptido HIFα que tiene carácter de unión para la prolil hidroxilasa y que tiene la capacidad de unirse a una proteína VHL de tipo natural, de tal manera que la unión es capaz, en un entorno celular normóxico, de dirigir el polipéptido HIFα para su destrucción; y b) un resto polipéptido que genera luz, en el que la generación de luz de dicho resto polipéptido que genera luz cambia tras la unión de una prolil hidroxilasa a dicho resto polipéptido HIFα, bajo condiciones favorables para la unión de una prolil hidroxilasa con un HIFα para formar una muestra de ensayo; y b)determinar la capacidad de dicho modulador putativo de la prolil hidroxilasa para modular la prolil hidroxilasa midiendo la luz generada en dicha muestra de ensayo. en el que dicho resto polipéptido HIFα es un resto polipéptido HIF1α que comprende la secuencia de aminoácidos Y-X1-Leu-X2-Proh-X3-X4-X5-X6-Y'', en la que a)Proh es prolina hidroxilable; b)X1, X2, X4, X5, y X6 son de manera independiente Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, o Trp; c)X3 es Ser, Thr, o Tyr; y d)Y e Y'' están presentes o ausentes de manera independiente y, si están presentes, comprenden de manera independiente un péptido que tiene de 1 a 600 aminoácidos.

Description

Fármacos y procedimientos para tratar la hipoxia y procedimientos de selección de los anteriores.
Antecedentes de la invención
Cómo las células detectan los cambios en el oxígeno ambiental es un problema fundamental de la biología. En las células de mamíferos, la carencia de oxígeno, o hipoxia, conduce a la estabilización de un factor de transcripción de unión con el ADN específico de la secuencia denominado HIF (factor inducible por hipoxia) que activa transcripcionalmente una variedad de genes relacionados con procesos tales como la angiogénesis y el metabolismo de la glucosa.
La isquemia del tejido es una causa principal de morbilidad y mortalidad. La isquemia puede ser el resultado de la hipoxia crónica producida por la carencia de suministro de sangre al tejido que se produce por, por ejemplo, apoplejía, trombosis de las venas profundas, émbolo pulmonar, e insuficiencia renal. Se encuentra también tejido isquémico en los tumores.
El HIF se une al ADN como un heterodímero constituido por una subunidad alfa y una subunidad beta (denominada también translocador nuclear del receptor de hidrocarburo de arilo o ARNT). La subunidad alfa se poliubiquitina rápidamente y se degrada en presencia de oxígeno mientras que la subunidad beta es constitutivamente estable. La enfermedad de von Hippel-Lindau (VHL) es un síndrome de cáncer hereditario caracterizado por el desarrollo de tumores muy vasculares que sobreproducen ARNm inducible por hipoxia tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). El productor del gen supresor del tumor VHL, pVHL, es un componente del complejo multiproteína que contiene elongina B, elongina C, Cul2, y Rbx1. Este complejo soporta una similaridad estructural y funcional con las ubiquitina ligasas de SCF (Skp1/Cdc53 o Culina/Secuencia F). En presencia de oxígeno, pVHL se une directamente con las subunidades HIF\alpha y las dirige hacia la poliubiquitinación y la destrucción. Las células que carecen de pVHL funcional no pueden degradar HIF y de esta manera, sobreproducen los ARNm de los genes directores de HIF.
Este proceso es fundamental en la proliferación celular normal y está perturbado durante la proliferación celular aberrante, tal como en el cáncer.
El documento WO 00/69908 se refiere a la sugerencia de que la proteína supresora del tumor VHL regula las subunidades HIF\alpha dirigiendo HIF\alpha hacia la destrucción en células normóxicas pero no hipóxicas. Se dan a conocer ensayos para los moduladores de esta interacción y los péptidos basados en las secuencias HIF\alpha que pueden modular esta interacción.
Jaakkola y col (2001) Science 292 (5516): 468-472 sugieren que la interacción entre el pVHL y una región específica de la subunidad HIF-1\alpha está regulada mediante la hidroxilación de un resto de prolina (P564) por un enzima que se denomina HIF\alpha prolil hidroxilasa. Los inventores proponen que el requerimiento de dioxígeno como cosustrato y hierro como cofactor sugiere que la HIF\alpha prolil hidroxilasa funciona directamente como sensor del oxígeno celular.
Resumen de la invención
La invención proporciona un procedimiento para identificar moduladores de la prolil hidroxilasa tal como se define en las reivindicaciones 1-5.
La invención se refiere en parte al uso de proteínas de fusión que generan luz (o células que expresan la proteína de fusión que genera luz), en el que la proteína de fusión que genera luz caracteriza un sitio de unión a ligando y un resto polipéptido que genera luz. La proteína de fusión que genera luz ("LGP") tiene una propiedad en la que la generación de luz del resto polipéptido que genera luz cambia tras la unión de un ligando en el sitio de unión a ligando. El ligando puede ser activo en un entorno sólo bajo ciertas condiciones, por ejemplo, en un estado hipóxico, de tal manera que la proteína de fusión que genera luz se "enciende o apaga" sólo bajo ciertas condiciones.
La invención proporciona también un procedimiento para seleccionar moduladores de la propil hidroxilasa asociados con la hipoxia, tal como se define en las reivindicaciones 6-7.
Breve descripción de los dibujos
La Fig 1 es una representación esquemática de diferentes proteínas de fusión de la presente invención.
La Fig 2 es una segunda representación esquemática de diferentes proteínas de fusión de la invención.
La Fig 3 muestra la unión de pVHL con una forma modificada de HIF.
La Fig 4 muestra la unión de pVHL con un péptido derivado de HIF1\alpha si Leu562 y Pro564 están intactos.
La Fig 5 muestra la ubiquitinación y la degradación de HIF unido a Leu562 y Pro 564.
La Fig 6 representa gráficamente la hidroxilación de la prolina unida a la unión de pVHL.
La Fig 7 ilustra el pVHL que reconoce específicamente HIF\alpha con la prolina 564 hidroxilada.
Las Figs 15-18 ilustran los resultados obtenidos en el Ejemplo de Referencia 2.
La Fig 19 ilustra la secuencia de tipo natural de HIF\alpha, con Nº de Acceso Q16665 (SEC DE ID Nº: 10).
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Descripción detallada de la invención Definiciones
Por conveniencia, se recogen aquí algunos términos usados en la memoria, los ejemplos, y las reivindicaciones adjuntas.
"Resto polipéptido HIF\alpha" incluye todo o parte de las secuencias de aminoácidos de HIF1\alpha, HIF2\alpha, o HIF3\alpha.
"Resto polipéptido HIF1\alpha" incluye todo o parte de las secuencias de aminoácidos de HIF1\alpha, por ejemplo, la SEC DE ID Nº: 10, la secuencia que corresponde a los restos 1-600 N terminales de HIF1\alpha, numerada de acuerdo con el HIF1\alpha de tipo natural, o la secuencia de aminoácidos 4 a 12 que corresponde a los restos adyacentes a y/o que rodean el resto 402 y/o el resto 564, inclusive, de HIF1\alpha, siendo los restos 402 y/o 564 prolina o prolina hidroxilada. Esto comprende además la secuencia de aminoácidos especificada en las reivindicaciones.
"Sitio efector colineal" incluye las regiones del resto polipéptido que genera luz que, cuando actúan en episodios posteriores a la unión del ligando, provocan que el resto polipéptido que genera luz cambie su estado de emisión de luz actual (es decir, encendido o apagado). Estas regiones hacen que el sitio efector colineal pueda conseguir esto mediante, por ejemplo, distorsión conformacional, modificación química, por ejemplo, ubiquitinación de un resto o restos en el sitio efector colineal, o mediante rotura de una porción de todo o parte del sitio efector colineal.
"Que tiene carácter de unión para la prolil hidroxilasa" se refiere a una propiedad que tienen los restos del polipéptido HIF\alpha adecuada para, por ejemplo, procedimientos de selección de la invención, e incluye las secuencias del polipéptido HIF adecuadas o adaptadas para la unión de la propil hidroxilasa así como las secuencias HIF de tipo no elaborado o natural a las que pVHL reconoce y con las que se une.
"Que tiene carácter de unión para la ubiquitina ligasa" se refiere a una propiedad que tienen los restos del polipéptido HIF\alpha adecuada para, por ejemplo, los procedimientos de selección de la invención, que incluyen, por ejemplo, las secuencias del polipéptido HIF natural que tienen restos de prolina hidroxilada, hidroxilados por la prolina hidroxilasa, o, por ejemplo, "restos del polipéptido HIF1\alpha" tal como se define en el presente documento.
"Localización" incluye determinar la región concreta del sujeto de una entidad de interés, por ejemplo, un tumor.
"Kemptido" incluye un sustrato péptido sintético de AMPc que corresponde a la parte de la secuencia del sitio de fosforilación de la piruvato quinasa en el hígado de porcino. "Malantido" incluye el sustrato C de la proteína quinasa dependiente de AMPc y de la proteína quinasa en diversos tejidos.
"Molécula pequeña" incluye las composiciones que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 5 kD y lo más preferible de menos de aproximadamente 4 kD. Moléculas pequeñas pueden ser, por ejemplo, ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, carbohidratos, lípidos u otras moléculas orgánicas o inorgánicas. "Diseminación de la infección" incluye la diseminación y colonización por un patógeno de otros sitios de huéspedes diferentes del sitio inicial de la infección. El término puede incluir también, sin embargo, el crecimiento en tamaño y el número de patógenos en el sitio inicial de la infección.
"Ligando" incluye una molécula, una molécula pequeña, una biomolécula, un fármaco, un péptido, un polipéptido, un complejo proteico, un anticuerpo, un ácido nucleico, o una célula.
"Sitio de unión a ligando" incluye el sitio en la proteína de fusión que genera luz al cual se une un ligando, en el que el resto polipéptido que genera luz se activa o inactiva como consecuencia directa o indirecta de la unión del ligando. La unión al sitio de unión a ligando puede ser directa o indirecta, por ejemplo, mediante la dimerización de la proteína en conjunción con otras proteínas, tal como se describe a partir de ahora en el presente documento.
"Resto selector de diana" incluye los restos que permiten que la proteína de fusión que genera luz de la invención se libere selectivamente en un órgano u órganos diana. Por ejemplo, si se desea la liberación de un compuesto terapéutico en el cerebro, la molécula portadora puede incluir un resto capaz de dirigir el compuesto hacia el cerebro, tanto por transporte activo como por pasivo. Ilustrativamente, la molécula portadora puede incluir un resto redox, tal como se describe en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos N^{os} 4.540.564 y 5.389.623, ambas de Bodor. Estas patentes dan a conocer fármacos unidos a los restos de dihidropiridina que pueden entrar en el cerebro, cuando se oxidan a una especie de piridinio que se atrapa en el cerebro. De esta manera, el compuesto se acumula en el cerebro. Se conocen muchos restos de dirección, e incluyen, por ejemplo, asialoglicoproteínas (véase, por ejemplo, Wu, Patente de los Estados Unidos Nº 5.166.320) y otros ligandos que se transportan al interior de las células mediante endocitosis mediada por el receptor. Los restos de dirección se pueden unir covalente o no covalentemente a una proteína de fusión que genera luz. El resto selector de diana se puede unir también a un vector.
Moléculas o restos "bioluminiscentes" incluye las sustancias luminiscentes que utilizan energía química para producir luz.
Moléculas o restos "fluorescentes" incluye aquellas que son luminiscentes mediante un único estado de excitación electrónica, que tiene una duración muy corta tras la eliminación de la fuente de radiación. La longitud de onda de la luz fluorescente emitida es más larga que la de la iluminación de excitación (ley de Stokes), debido en parte a que la luz de excitación se convierte en calor por la molécula fluorescente.
"Entidades" incluye, sin limitación, moléculas pequeñas tales como moléculas orgánicas cíclicas; macromoléculas tales como proteínas, polímeros; proteínas; polisacáridos; ácidos nucleicos; partículas, materiales inertes; orgánulos; microorganismos tales como virus, bacterias, levaduras y hongos; células, células eucarióticas; embriones; priones; tumores; todos los tipos de patógenos y sustancias patogénicas; y partículas tales como perlas y liposomas. En otro aspecto, las entidades pueden ser todas o alguna de las células que constituyen el sujeto mamífero del que se está tomando la imagen, por ejemplo, tejido enfermo o dañado, o los compuestos o moléculas producidas por aquellas células, o por una dolencia bajo estudio. Las entidades para las cuales la invención tiene una utilidad concreta incluyen tumores, células proliferantes, patógenos, y entornos celulares que comprenden tejido hipóxico.
"Agentes infecciosos" incluye parásitos, virus, hongos, bacterias o priones.
"Episodio de inducción del promotor" incluye un episodio que da como resultado la inducción directa o indirecta de un promotor inducible seleccionado.
"Gen heterólogo" incluye un gen que se ha transfectado en un organismo huésped. Normalmente, un gen heterólogo se refiere a un gen que no se deriva originalmente del ADN genómico de las células transfectadas o transformadas.
"Medio opaco" incluye un medio que es "tradicionalmente" opaco, no necesariamente absolutamente opaco. De acuerdo con esto, un medio opaco incluye un medio que se considera comúnmente por no ser ni transparente ni translúcido, e incluye objetos tales como un tablero de madera, y la carne y la piel de un mamífero.
"Que genera luz" o "luminiscente" incluyen la propiedad de generar luz mediante una reacción química o mediante la absorción de radiación, incluyendo la fosforescencia, la fluorescencia, y la bioluminiscencia.
"Luz" incluye la radiación electromagnética que tiene una longitud de onda de entre aproximadamente 300 nm y aproximadamente 110 nm.
Procedimientos "no invasivos" para detectar el sitio en un sujeto no incluye procedimientos ampliamente invasivos tales como la cirugía convencional o la biopsia.
"Proteína de fusión que genera luz" incluye las proteínas de la invención que tienen una porción que genera luz o luminiscente, es decir, un resto polipéptido que genera luz y un sitio de unión a ligando. En general, cuando un ligando de interés se une al sitio de unión a ligando de la proteína de fusión que genera luz, cambian las propiedades de generación de luz del resto polipéptido que genera luz, yendo desde "oscuro" a "iluminado", o viceversa.
"Resto polipéptido que genera luz" incluye cualquier proteína conocida por las personas normalmente expertas en la técnica que proporciona una fuente de luz fácilmente detectable cuando está presente en forma estable. Los ejemplos no limitantes incluyen las proteínas que generan luz en las Patentes de los estados Unidos N^{os} 5.683.888, 5.958.713, y 5.650.135, por ejemplo, ferredoxina IV, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente roja, proteína fluorescente amarilla, proteína fluorescente azul, la familia de la luciferasa y la familia de la aecuorina. En una forma de realización preferida, el resto polipéptido que genera luz es una proteína tal como la proteína fluorescente verde, la proteína fluorescente roja, la proteína fluorescente amarilla y la proteína fluorescente azul.
Por "modula" se entiende que aumenta o disminuye la prolil hidroxilación de HIF.
El VHL usado en los ensayos de la invención puede ser cualquier VHL de mamífero adecuado, particularmente VHL humano. Se ha clonado el VHL humano y las personas normalmente expertas en la técnica pueden identificar fácilmente las fuentes del gen. Su secuencia está disponible como los números de acceso del Genbank AF010238 y L15409. Están disponibles también otros VHL de mamíferos, tales como VHL de murino (número de acceso U12570) y rata (números de acceso U14746 y S803445. Los homólogos no de mamíferos incluyen la proteína de tipo VHL de C. elegans, con número de acceso F08G12. Se pueden obtener también las secuencias del gen VHL mediante técnicas de clonación rutinarias, usando, por ejemplo, todo o parte de la secuencia del gen VHL humano como sonda para recuperar y determinar la secuencia del gen VHL en otras especies. Están disponibles para esto una amplia variedad de técnicas, por ejemplo, la amplificación mediante la PCR y la clonación del gen usando una fuente adecuada de ARNm (por ejemplo, de un embrión o una célula de hígado), obtención de una biblioteca de ADNc de una fuente de mamífero, vertebrado, invertebrado o fúngica, por ejemplo, una biblioteca de ADNc de una de las fuentes anteriormente mencionadas, sondeando la biblioteca con un polinucleótido de la invención bajo condiciones de restricción, y recuperando un ADNc que codifica todo o parte de la proteína VHL de este mamífero. Las condiciones de restricción adecuadas incluyen la hibridación sobre un soporte sólido (filtro), la incubación durante la noche en una solución que contiene formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), Solución de Denhardt 5x, sulfato de dextrano al 10% y 20 \mug/ml de ADN de esperma de salmón, seguido por lavado en cloruro de sodio 0,03 M y citrato de sodio 0,03 M (es decir, 0,2 x SSC) a entre aproximadamente 50ºC a aproximadamente 60ºC). Cuando se obtiene un ADNc parcial, se puede determinar la secuencia de codificación de longitud completa mediante las técnicas de extensión del cebador.
No es necesario usar la proteína VHL completa (incluyendo sus mutantes y otras variantes). Se pueden usar fragmentos de VHL, siempre que dichos fragmentos retengan la capacidad de interactuar con la región diana del resto polipéptido HIF\alpha. Se pueden generar fragmentos de VHL de cualquier manera conocida por las personas expertas en la técnica. Los medios adecuados incluyen, pero no se limitan a, la expresión recombinante de un fragmento del ADN que codifica el VHL. Se pueden generar dichos fragmentos tomando el ADN que codifica el VHL, identificando los sitios de reconocimiento adecuados del enzima de restricción, cualquier lado de la porción que se va a expresar en un sistema de expresión normalizado comercialmente disponible. Otra solución recombinante es amplificar la porción relevante del ADN con los cebadores de la PCR adecuados. Se pueden generar también pequeños fragmentos del VHL (de hasta aproximadamente 20 o 30 aminoácidos) usando procedimientos de síntesis de péptidos que se conocen bien en la técnica. Generalmente, los fragmentos tendrán al menos 40, preferiblemente al menos 50, 60, 70, 80 ó 100 aminoácidos de tamaño.
Se han clonado numerosas proteínas de la subunidad HIF\alpha. Estas incluyen HIF1\alpha, la secuencia de la cual está disponible como Genbank con número de acceso U22431, HIF2\alpha, disponible como Genbank con número de acceso U81984 y HIF3\alpha, disponible como Genbank con números de acceso AC007193 y AC079154. Estas son todas las proteínas de la subunidad HIF\alpha. Las proteínas de la subunidad HIF\alpha de otras especies, incluyen HIF1\alpha de murino (números de acceso AF003695, US9496 y X95580), HIF1\alpha de rata (número de acceso Y09507), HiF2\alpha de murino (números de acceso U81983 y D89787) y HIF3\alpha de murino (número de acceso Y09507). Se pueden obtener otros homólogos de mamíferos, vertebrados, invertebrados o fúngicos mediante técnicas similares a las descritas anteriormente para obtener homólogos de VHL.
Se puede calcular el porcentaje de homología (denominado también como identidad) de las secuencias de ADN y de aminoácidos usando algoritmos comercialmente disponibles. Se pueden usar los siguientes programas (facilitados por el National Center for Biotechnology Information) para determinar las homologías: BLAST, BLAST con intervalos y PSI-BLAST, que se pueden usar con parámetros por defecto. El algoritmo GAP (Genetics Computer Group, Madison, WI) usa el algoritmo de Needleman y Wunchs para alinear dos secuencias completas, lo que maximiza el número de correspondencias y minimiza el número de intervalos. Generalmente, se usan parámetros por defecto, con una penalización de la creación de intervalos = 12, y una penalización de la extensión de intervalos = 4. El uso de cualquiera de los términos "homología" y "homólogo" en el presente documento no implica ninguna relación evolucionaria necesaria entre las secuencias comparadas, manteniéndose por ejemplo con el uso normalizado de términos tales como "recombinación homóloga" que requiere meramente que dos secuencias de nucleótidos sean suficientemente similares para recombinar en las condiciones apropiadas.
Se puede variar el formato preciso de los ensayos de rastreo usando habilidades y conocimientos ordinarios. Se puede variar la cantidad de VHL del resto polipéptido HIF\alpha y, cuando se requiere, de componentes adicionales, dependiendo de la escala del ensayo. En general, la persona experta en la técnica seleccionará cantidades relativamente equimolares de los dos componentes nombrados desde 1:10 a 100:1, preferiblemente desde 1:1 a 10:1, como relación molar de VHL al resto polipéptido HIF\alpha. Sin embargo, existen formatos de ensayo muy concretos que se pueden practicar fuera de este intervalo.
Cuando se llevan a cabo los ensayos de la invención en el interior de las células, se pueden tratar las células para facilitar o potenciar un entorno normóxico. Por "normóxico" se entiende niveles de oxígeno similares a los encontrados en el aire normal, por ejemplo, aproximadamente un 21% de O_{2} y un 5% de CO_{2}, siendo el resto nitrógeno. Por supuesto, no se han usado estas proporciones exactas, y se pueden variar independientemente entre sí. Generalmente, se puede usar un intervalo de entre 10-30% de oxígeno, 1-10% de CO_{2} y siendo el resto nitrógeno u otro gas relativamente inerte y no tóxico. Se puede inducir o potenciar la normoxia en las células, por ejemplo, mediante el cultivo de las células en presencia de peróxido de hidrógeno tal como se describe anteriormente.
Alternativamente, o por medio de controles, las células también se pueden cultivar en condiciones hipóxicas. Por "hipóxico" se entiende un entorno con niveles de oxígeno reducidos. Los niveles más preferibles de oxígeno en el cultivo celular serán de 0,1 a 1,0% para la creación de un estado hipóxico. Se puede inducir la hipoxia en las células cultivando simplemente las células en presencia de niveles de oxígeno disminuidos. Se pueden tratar también las células con compuestos que imitan la hipoxia y producen la sobrerregulación de la expresión de la subunidad HIF\alpha. Dichos compuestos incluyen quelantes, cobalto (II), níquel (II) o manganeso (II), todos los cuales se pueden usar a una concentración de 20 a 500 \muM, tal como 100 \muM. Los quelantes de hierro incluyen desferrioxamina, O-fenantrolina o hidroxipiridinonas (por ejemplo 1,2-dietil hidroxipiridinona (CP94) o 1,2-dimetil hidroxipiridinona
(CP20)).
Las células en las que se pueden llevar a cabo los ensayos de la invención incluyen células eucarióticas, tales como células de levaduras, insectos, mamíferos, primates y seres humanos. Las células de mamíferos pueden ser células primarias o células transformadas, incluyendo líneas celulares tumorales. Se pueden modificar las células para expresar o no expresar otras proteínas que se sabe que interactuar con HIF (proteínas de la subunidad x y proteína VHL, por ejemplo, las proteínas Elongina C y Elongina B en el caso de la proteína VHL y ARNT, en el caso de la proteína de la subunidad HIF\alpha).
En sistemas libres de células, se pueden incluir proteínas adicionales, proporcionándose, por ejemplo, mediante la expresión de vectores de expresión recombinante adecuados.
En ensayos llevados a cabo en células, será deseable alcanzar la expresión suficiente de VHL para alistar suficiente resto polipéptido HIF\alpha en un complejo tal que se pueda medir el efecto de un posible compuesto modulador. Se puede variar el nivel de expresión de VHL y del resto polipéptido HIF\alpha dentro de límites verdaderamente amplios, de tal manera que los niveles intracelulares de los dos pueden variar en una amplia relación, por ejemplo, desde 1:10 a 1000:1, preferiblemente 1:1 a 100:1, relación molar de VHL al resto polipéptido HIF\alpha.
La cantidad de posible compuesto modulador que se puede añadir a un ensayo de la invención se determinará normalmente mediante ensayo y error dependiendo del tipo del compuesto usado. Normalmente, se pueden usar concentraciones desde aproximadamente 0,01 a 100 \muM del posible compuesto modulador, por ejemplo desde 0,1 a 10 \muM. Los compuestos moduladores pueden ser aquellos que bien agonizan o bien antagonizan la interacción. Son particularmente deseables los antagonistas (inhibidores) de la interacción.
Los compuestos moduladores que se pueden usar pueden ser compuestos químicos naturales o sintéticos usados en programas de selección de fármacos. Se pueden usar también extractos de plantas que contengan diversos componentes caracterizados o no caracterizados.
La invención se refiere en parte a procedimientos que usan proteínas de fusión que emiten luz, Las proteínas de fusión contienen regiones capaces de unirse mediante enzimas y otros ligandos, y de modificarse como consecuencia de esta unión. Las regiones que generan luz incluyen, sin limitación, regiones de proteínas fluorescentes y proteínas bioluminiscentes. La emisión de luz se detecta mediante procedimientos conocidos, tales como la detección con instrumentación adecuada (tal como una cámara CCD) in vivo, in vitro o in silico, tal como en una célula viva u organismo intacto, un sistema de cultivo celular, una sección de tejido, o una matriz.
Las proteínas de fusión que generan luz de la invención son capaces de tomar parte en una reacción luminiscente en la que se miden diferentes eventos biológicos, bioquímicos, químicos y físicos. La proteína de fusión que genera luz es capaz de modificarse de tal manera que emita o no emita luz u origine la emisión de luz. Las proteínas de fusión que generan luz incluyen un sitio de unión a ligando y un resto polipéptido que genera luz, en el que la bioluminiscencia del resto polipéptido cambia tras la unión de un ligando en el sitio de unión a ligando.
Sin pretender quedar unido por interpretación alguna, el sitio de unión a ligando actúa en un sentido como un "interruptor" del resto polipéptido que genera luz, es decir, cuando el ligando se une al sitio de unión a ligando, el resto polipéptido que genera luz emite luz, o alternativamente, cesa de hacerlo tras la unión del ligando. Esta "interrupción" de encendido o apagado, en la forma de realización, puede llevarse a cabo por medio de un "sitio efector colineal" que incluye regiones del resto polipéptido que genera luz que, cuando actúan en eventos posteriores a la unión del ligando, causan que el resto polipéptido que genera luz cambie su estado actual de emisión de luz (es decir, encendido o apagado). Las regiones que componen el sitio efector colineal pueden hacer esto mediante, por ejemplo, distorsión conformacional, modificación química, por ejemplo, ubiquitinación de un resto o restos en el sitio efector colineal, o mediante rotura de una porción de todo o parte del sitio efector colineal.
La selección de un resto polipéptido que genera luz de la proteína de fusión que genera luz debería llevarse a cabo de tal manera que produzca luz capaz de penetrar en el tejido animal tal que se pueda detectar externamente de una manera no invasiva. La capacidad de la luz de pasar a través de un medio tal como un tejido animal (compuesto en su mayor parte por agua) se determina principalmente por la intensidad de la luz y la longitud de onda.
Cuanto más intensa sea la luz producida en una unidad de volumen, será más fácil detectar la luz. La intensidad de la luz producida en una unidad de volumen depende de las características espectrales de los restos polipéptidos individuales que generan luz, y de la concentración de aquellos restos en la unidad de volumen. De acuerdo con esto, los esquemas que colocan una elevada concentración de restos polipéptidos que generan luz en la unidad de volumen (tales como una carga de elevada eficiencia de un liposoma o un nivel elevado de expresión de una proteína de fusión que genera luz) producen normalmente proteínas de fusión que generan luz más brillante (LGP), que son más fáciles de detectar a través de las capas profundas d tejido, que los esquemas que conjugan, por ejemplo, únicamente una LGM sobre cada entidad.
Un segundo factor que gobierna la detectabilidad a través de una capa de tejido es la longitud de onda de la luz emitida. Se puede usar agua para aproximar las características de absorción del tejido animal, debido a que la mayor parte de tejidos están compuestos principalmente por agua. Se sabe bien que el agua transmite luz de longitud de onda más larga (en el intervalo rojo) más fácilmente que la longitud de onda más corta.
De acuerdo con esto, los restos polipéptidos generadores de luz que emiten luz en el intervalo del amarillo al rojo (550-110 nm) son normalmente preferibles a aquellos que emiten a longitudes de onda más cortas. Sin embargo, se pueden conseguir excelentes resultados en la práctica de la presente invención con LGM que emitan en el intervalo de los 486 nm, a pesar del hecho de que ésta no es una longitud de onda de emisión óptima.
Restos basados en fluorescencia. Debido a que las moléculas fluorescentes requieren la entrada de luz con el fin de lucir su uso en la invención puede ser más importante que el uso de moléculas bioluminiscentes. Se toman precauciones normalmente para apantallar la luz excitadora de tal manera que no contamine la señal fotónica de fluorescencia que se está detectando procedente del sujeto. Las precauciones obvias incluyen la colocación de un filtro de excitación en la fuente de radiación. Un filtro de excitación apropiadamente seleccionado bloquea la mayoría de fotones que tienen una longitud de onda similar a la de los fotones emitidos por el resto fluorescente. Similarmente, se emplea un filtro barrera en el detector para seleccionar la mayor parte de los fotones que tienen longitudes de onda diferentes a las de los fotones de fluorescencia. Se pueden obtener filtros tales como los descritos anteriormente a partir de una variedad de fuentes comerciales, incluyendo Omega Optical, Inc. (Brattleboro, Vt.).
Se puede usar, alternativamente, un láser que produce una luz de elevada intensidad próxima a la longitud de onda de excitación apropiada, pero no próxima a la longitud de onda de la emisión de la fluorescencia, para excitar los restos fluorescentes. Se puede emplear un mecanismo de traducción x-y de tal manera que el láser pueda escanear al sujeto, por ejemplo, como en un microscopio confocal.
Como precaución adicional, se puede colocar la fuente de radiación detrás del sujeto y apantallarse, de tal manera que los únicos fotones de radiación que alcanzan el sitio del detector son los que recorren todo el camino a través del sujeto. Adicionalmente, se pueden seleccionar detectores que tengan una sensibilidad reducida a las longitudes de onda de la luz usada para excitar el resto fluorescente.
Una ventaja de las moléculas fluorescentes pequeñas es que es menos probable que interfieran con la bioactividad de la entidad a la cual están unidas de lo que lo haría un resto que genera luz más grande. Además, se pueden obtener moléculas fluorescentes comercialmente disponibles con una variedad de espectros de excitación y emisión que sea adecuada para el uso con la presente invención. Por ejemplo, Molecular Probes (Eugene, Oreg.) vende numerosos fluoróforos, incluyendo Amarillo de Lucifer (absorbe a 428 nm, y emite a 535 nm) y Rojo Nilo (absorbe a 551 nm y emite a 636 nm). Además, se pueden obtener las moléculas derivatizadas con un variedad de grupos para uso don diversos esquemas de conjugación (por ejemplo, de Molecular Probes).
Restos basados en bioluminiscencia. Los sujetos de la quimioluminiscencia (luminiscencia como resultado de una reacción química) y la bioluminiscencia (luminiscencia visible procedente de organismos vivos) han sido, en muchos aspectos, estudiados completamente.
Una ventaja de los restos bioluminiscentes sobre los restos fluorescentes es que no existe, virtualmente, fondo en la señal. La única luz detectada es la luz que se produce por el resto bioluminiscente exógeno. Por el contrario, la luz usada para excitar una molécula fluorescente da como resultado a menudo la fluorescencia de otras sustancias diferentes de la diana pretendida. Esto es particularmente verdadero cuando el "fondo" es tan complejo como el ambiente interno de un animal vivo.
Los ligandos incluyen, en una forma de realización preferida, las enzimas que son capaces de modificar un resto polipéptido que genera luz tal que este emite o deja de emitir luz cuando se modifica. En uso, esto ocurre cuando, por ejemplo, la proteína que genera luz entra en contacto con un ligando o una entidad o se produce por una entidad, y el ligando se une al sitio de unión a ligando, alterando las propiedades de generación de luz del resto polipéptido que produce luz. Los ejemplos incluyen lo siguiente.
En una forma de realización especialmente útil de la presente invención, se puede usar una proteína que genera luz que comprende un sitio de unión de una ubiquitina ligasa E3 y un resto polipéptido que genera luz capaz de modificarse por E3 en un sitio de modificación a objeto de diagnóstico y tratamiento. Las ubiquitina ligasas (por ejemplo, E3) se unen a "T" colineal (véase la Fig. 1) presente en sus sustratos. Los ejemplos incluyen las ubiquitina ligasas SCF (Skp1/Cdc53/secuencia F), la ubiquitina ligasa VBC (pVHL/elongina B/elongina C), y la ubiquitina ligasa MDM2. Está ya establecido que las proteínas que generan luz tales como GFP y la luciferasa se pueden fusionar con polipéptidos heterólogos sin pérdida de actividad. En algunas formas de realización, el resto polipéptido que produce luz se puede modificar para incluir un resto de lisina expuesto a la superficie accesible como un sitio aceptor de ubiquitina.
Tal como se muestra generalmente en la Fig. 1A, se pretende en el presente documento una proteína de fusión que contiene un sitio de unión a ligando "T", una región indicadora (por ejemplo, un resto polipéptido que genera luz) "R", y un sitio de modificación "X". La unión del enzima "E" (el ligando) con el sitio diana "T" da como resultado una modificación del sitio de modificación "X", que produce que la región indicadora "R" o bien emita o bien no emita luz.
El sitio "T" y el sitio de modificación "X" pueden estar separados y en forma cis en la proteína de fusión, tal como se muestra en la Fig. 1B. Tanto "T" como "X" pueden estar proximales o distales al termino amino de la proteína de fusión.
En otra forma de realización que se muestra en la Fig. 1C, en la que el "T" y el "X" de la proteína de fusión son congruentes en el interior de una región de la proteína de fusión. En las formas de realización relacionadas, el "T/X" puede estar en el término amino, en el término carboxi, o en ningún término de la proteína de fusión.
En otra forma de realización que se muestra en la Fig. 1D, el "T" está en una proteína asociada con la proteína de fusión que contiene el "X". En una forma de realización relacionada, el sitio diana "T" está en la proteína de fusión y el sitio de modificación "X" está en una proteína que está físicamente asociada con la proteína de fusión, en la que la modificación de la proteína asociada da como resultado en la proteína de fusión que bien emita o no emita luz. No se pretende que la reducción del sitio "T" y del sitio de modificación "X" sea limitante. "T" puede estar en el término amino, en el término carboxi, o en ningún término de la proteína de fusión, y "X" puede estar en el término amino, el término carboxi, o en ningún término de la proteína asociada.
Está también prevista una proteína de fusión en la que la secuencia "T" del sitio de unión a ligando es desconocida. En esta forma de realización, por ejemplo, tal como se muestra en la Fig. 2A, la proteína de fusión incluye una primera región de hetero u homodimerización ("HD1"). Una enzima "E" capaz de modificar el sitio de modificación "X" en la proteína de fusión se fusiona con una segunda región "HD2" de hetero u homodimerización que interactúa con "HD1". En una forma de realización relacionada, se puede generar el sitio diana "T" de una enzima "E" insertando una o más secuencias de polipéptidos derivadas de una biblioteca de péptidos aleatorios o no aleatorios en la proteína de
fusión.
En una forma de realización relacionada (Fig. 2B), una región de unión de una proteína "A" que contiene un sitio diana de la enzima "T" interactúa con una región de unión "B" de una proteína de fusión, lo que da como resultado que la enzima "E" modifica la región indicadora "R" de la proteína de fusión "B" en el sitio de modificación "X" de tal manera que la proteína de fusión emite o no emite luz o produce luz que se va a emitir. En os procedimientos de la invención, el sitio de unión a ligando comprende un polipéptido derivado del HIF1\alpha (factor 1\alpha inducible por hipoxia) que actúa como sitio de unión para VBC, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos Y-X_{1}-Leu-X_{2}-Pro_{h}-X_{3}-X_{4}-X_{5}-X_{6}-Y' (SEC DE ID Nº: 11), en la que
\quad
Pro_{h} es prolina hidroxilable;
\quad
X_{1}, X_{2}, X_{4}, X_{5}, y X_{6} son independientemente Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, o Trp, y X_{3} es Ser, Thr, o Tyr; e Y e Y' están independientemente presentes o ausentes y, si están presentes, comprenden independientemente un péptido que tiene de 1 a 600 aminoácidos.
En una forma de realización preferida, el sitio de unión a ligando es tal como se define en las reivindicaciones 3-5. "Restos adyacentes a y/o que la rodean" se entiende que incluye la secuencia relevante de HIF1\alpha tanto antes, como después, o flanqueando, el resto especificado, por ejemplo, el resto 564.
Se pueden usar dichas proteínas eficazmente como proteínas sensibles al oxígeno. Se pueden producir las proteínas de fusión mediante técnicas normalizadas de ADN recombinante. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias de polipéptidos se unen conjuntamente en marco de acuerdo con las técnicas convencionales, por ejemplo, empleando finales con extremos enromados o extremos escalonados para la ligadura, la digestión con la enzima de restricción para proporcionar los términos apropiados, el rellenado de extremos cohesivos según sea apropiado, el tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión indeseable, y la ligadura enzimática. En otra forma de realización, se puede sintetizar el gen de fusión mediante técnicas convencionales entre las que se incluyen sintetizadores automatizados de ADN. Alternativamente, se puede llevar a cabo la amplificación mediante la PCR de los fragmentos génicos usando cebadores de anclaje que proporcionan un aumento de los salientes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que se pueden hibridar y reamplificar posteriormente para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Ausubel y col. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992).
El sitio de unión a ligando señalado anteriormente se deriva de la proteína HIF1\alpha. La Patente de los Estados Unidos Nº 6.222.018, describe la proteína HIF y su preparación en forma sustancialmente pura. HIF está compuesta de subunidades HIF1\alpha y una isoforma HIF1\beta. El polipéptido HIF1\alpha comprende 826 restos de aminoácidos. Tal como se describe con más detalle a continuación, los sitios de unión a ligando de esta proteína de fusión particular comprende una única región de unión a la ubiquitina ligasa derivada de HIF1\alpha. En esta proteína de fusión, cuando está presente, Y comprende entre 1 y 600 restos de aminoácidos, que corresponden preferiblemente a la secuencia de los restos de los aminoácidos 1-555 de HIF1\alpha "N terminales". De esta manera, en una forma de realización preferida, Y puede representar cualquier secuencia de aminoácidos N terminales de HIF1\alpha, por ejemplo, los restos 554-555, 553-555, 552-555, y así sucesivamente hasta incluir los restos 1-555. Y' puede comprender también entre 1 y 600 restos de aminoácidos, que corresponden preferiblemente a la secuencia de los restos de los aminoácidos 576-826 de HIF1\alpha "C terminales". De esta manera, en una forma de realización preferida, Y' puede representar cualquier secuencia de aminoácidos C terminales de HIF1\alpha, por ejemplo 576-577, 576-578, 576-579 y así sucesivamente hasta incluir los restos 576-826. Y e Y' pueden contener también sustituciones conservativas de aminoácidos presentes en las secuencias de HIF1\alpha N terminal y C terminal descritas anteriormente. En una forma de realización preferida del sitio de unión a ligando descrito anteriormente, Y e Y' están ausentes. En una forma de realización preferida adicional, X_{1} es Met, X_{2} es Leu, X_{3} es Ala, X_{4} es Tyr, X_{5} es Pro, y X_{6} es Met. En una forma de realización particularmente preferida de la proteína de fusión, el sitio de unión a ligando tiene la secuencia de aminoácidos Asp-Leu-Asp-Leu-Glu-Met-Leu-Ala-Pro_{h}-Tyr-Ile-Pro-Met-Asp-Asp-Asp-Phe-Gln-Leu-Arg, que corresponde a los restos de los aminoácidos 556-575 de HIF1\alpha, con una prolina hidroxilable en el resto del aminoácido 564.
Se pueden obtener los compuestos de ensayo de la invención usando cualquiera de las soluciones en los procedimientos de bibliotecas combinatorias conocidos en la técnica, que incluyen: bibliotecas biológicas; bibliotecas paralelas espacialmente direccionables en fase sólida o en fase disolución; procedimientos de bibliotecas sintéticas que requieren desconvolución; el procedimiento de biblioteca de "una perla, un compuesto"; y procedimientos de biblioteca sintética que usan selección por cromatografía de afinidad. La solución de biblioteca biológica se limita a las bibliotecas de péptidos, mientras que las otras cuatro soluciones son aplicables a bibliotecas de compuestos péptidos, oligómeros no péptidos o pequeñas moléculas. Véase, por ejemplo, Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145.
Se conocen en la técnica bibliotecas de mezclas químicas y/o biológicas, tales como de extractos fúngicos, bacterianos, o de algas, y se pueden rastrear con cualquiera de los ensayos de la invención. Se pueden encontrar ejemplos de procedimientos para la síntesis de bibliotecas moleculares en la técnica, por ejemplo en: DeWitt, y col., 1993. Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 90: 6909; Erb, y col., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 11422; Zuckermann, y col., 1994. J. Med Chem. 37: 2678; Cho, y col., 1993. Science 261: 1303; Carrell, y col., 1994. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 33: 2059; Carell, y col., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; y Gallop, y col., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233.
Se pueden presentar bibliotecas de compuestos en solución (por ejemplo, Houghten, 1992. Biotechniques 13: 412-421), o en perlas (Lam, 1991. Nature 354: 82-84), en chips (Fodor, 1993. Nature 364: 555-556), bacterias (Ladner, Patente de los Estados Unidos Nº. 5.223.409), esporas (Ladner, Patente de los Estados Unidos 5.233.409), plásmidos (Cull, y col., 1992. Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 1865-1869) o en fagos (Scott y Smith, 1990. Science 249: 386-390; Devlin, 1990. Science 249: 404-406; Cwirla, y col., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382; Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301-310; Ladner, Patente de los Estados Unidos. 5.233.409.).
La invención implica entidades que se pueden haber modificado o conjugado para incluir una proteína de fusión que genera luz de la invención. Dichas entidades conjugadas o modificadas se denominan como entidades que emiten luz, o simplemente conjugados. Los conjugados por sí mismos pueden tomar la forma de, por ejemplo, moléculas, macromoléculas, partículas, microorganismos, o células. Los procedimientos usados para conjugar una proteína de fusión que genera luz con una entidad dependen de la naturaleza de la proteína de fusión que genera luz y de la entidad. Se describen procedimientos de conjugación a modo de ejemplo en el contexto de las entidades descritas a continuación.
Moléculas pequeñas. Las entidades de moléculas pequeñas que pueden ser útiles en la presente invención incluyen compuestos que interactúan específicamente con un ligando o receptor patógeno o endógeno. Los ejemplos de dichas moléculas incluyen, pero no se limitan a, fármacos o compuestos terapéuticos; toxinas, tales como las presentes en los venomas de los organismos venenosos, que incluyen algunas especies de arañas, serpientes, escorpiones, dinoflagelados, caracoles y bacterias marinos; factores de crecimiento, tales como NGF, PDGF, TGF y TNF; citocinas; y péptidos bioactivos.
Las moléculas pequeñas se conjugan preferiblemente con proteínas de fusión que generan luz de una manera de una manera en que la bioactividad de la molécula pequeña no está sustancialmente afectada. Las conjugaciones son normalmente químicas en la naturaleza, y se pueden llevar a cabo mediante cualquiera de una variedad de procedimientos conocidos por las personas expertas en la técnica.
Macromoléculas. Macromoléculas tales como polímeros y biopolímeros constituyen otro ejemplo de entidades útiles en la práctica de la presente invención. Las macromoléculas a modo de ejemplo incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, proteínas de fusión que generan luz y algunos constructos de vector.
Se pueden usar anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, adquiridos de fuentes comerciales o preparados mediante procedimientos conocidos en la técnica para localizar su antígeno en un sujeto mamífero conjugando los anticuerpos con un resto polipéptido que genera luz, administrando el conjugado a un sujeto mediante, por ejemplo, inyección, permitiendo al conjugado localizar el sitio del antígeno, y tomando la imagen del conjugado.
Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos tienen diversas ventajas para uso como entidades en la presente invención. Debido a su naturaleza, constituyen su propios restos diana. Además, su tamaño los hace adecuados para la conjugación con diversos tipos de proteínas de fusión que generan luz, incluyendo pequeñas moléculas fluorescentes y proteínas y proteínas fluorescentes y bioluminiscentes, permitiendo aún su difusión rápida en relación con, por ejemplo, células o liposomas.
Se pueden conjugar proteínas de fusión que generan luz directamente con los anticuerpos o fragmentos, o indirectamente usando, por ejemplo, un anticuerpo secundario fluorescente. Se puede llevar a cabo la conjugación directa mediante acoplamiento químico normalizado de, por ejemplo, un fluoróforo con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, o mediante ingeniería genética. Se pueden construir quimeras o proteínas de fusión que contengan un anticuerpo o fragmento de anticuerpo acoplado a una proteína fluorescente o bioluminiscente. Por ejemplo, Casadei y col, describen un procedimiento para preparar un constructo de vector capaz de expresar una proteína de fusión de aecuorina y un gen de anticuerpo en células de mamíferos.
Se pueden usar conjugados que contengan anticuerpos en numerosas aplicaciones de la presente invención. Por ejemplo, se puede usar un anticuerpo marcado dirigido contra la selección con E, que se expresa en los sitios de la inflamación, para localizar la inflamación y vigilar los efectos de posibles agentes antiinflamatorios.
Los constructos de vector por sí mismos pueden constituir también entidades macromoleculares aplicables en la presente invención.
Virus. Otra entidad útil para algunos aspectos de la invención son los virus.
Se puede marcar un virus indirectamente, tanto con un anticuerpo conjugado con una proteína de fusión que genera luz, o mediante, por ejemplo, viriones biocentelleantes según se conoce en la técnica y exponiéndolos a continuación a estreptavidina unida a un resto detectable, tal como una molécula fluorescente.
Alternativamente, se pueden marcar los viriones directamente con un fluoróforo similar a rodamina, usando procedimientos conocidos en la técnica. Se puede diseñar el virus mediante ingeniería genética para expresar una proteína de fusión que genera luz.
Partículas. Las partículas, incluyendo perlas, liposomas y similares, constituyen otra entidad útil en la práctica de la presente invención. Debido a su tamaño más grande, las partículas se pueden conjugar con un número mayor de proteínas de fusión que generan luz que pueden ser, por ejemplo, moléculas pequeñas. Esto da como resultado una concentración más alta de emisión de luz, que se puede detectar usando exposiciones más cortas o a través de capas más delgadas de tejido. Además, se pueden construir liposomas para contener un resto diana, o ligando, esencialmente puro, tal como un antígeno o un anticuerpo, en su superficie. Además, se pueden cargar los liposomas con, por ejemplo, moléculas de proteínas que generan luz, a concentraciones relativamente elevadas.
Además, se pueden dirigir dos tipos de liposomas al mismo tipo celular de tal manera que se genere luz sólo cuando ambos estén presentes. Por ejemplo, un liposoma puede llevar luciferasa, mientras que el otro lleva luciferina. Los liposomas pueden llevar restos diana, y los restos diana de los dos liposomas pueden ser iguales o diferentes. Se pueden usar proteínas víricas en las células infectadas para identificar tejidos u órganos infectados. Se pueden localizar las células del sistema inmune usando marcadores simples o múltiples de superficie celular.
Los liposomas tienen preferiblemente la superficie revestida, por ejemplo, mediante la incorporación de conjugados de fosfolípido-polietilenglicol, para alargar el tiempo de circulación en sangre y permitir un mayor direccionamiento a través del torrente sanguíneo. Son bien conocidos los liposomas de este tipo.
Células. Las células, tanto procarióticas como eucarióticas, constituyen otra entidad útil en la práctica de la presente invención. Las células se pueden cargar con concentraciones relativamente elevadas de restos que generan luz, y tienen la ventaja de que se pueden proporcionar restos que generan luz mediante, por ejemplo, un constructo genético heterólogo usado para transfectar las células. Además, se pueden seleccionar las células para expresar "restos diana", o moléculas efectivas para dirigirlas a las localizaciones deseadas en el interior del sujeto. Alternativamente, se pueden transfectar las células con un constructo de vector que expresa un resto diana apropiado.
El tipo celular usado depende de la aplicación. Las células bacterianas constituyen entidades efectivas. Por ejemplo, se pueden transfectar fácilmente para expresar niveles elevados de una proteína de fusión que genera luz, así como niveles elevados de una proteína, Además, es posible obtener bibliotecas de E. coli que contienen bacterias que expresan anticuerpos unidos a superficie que se pueden rastrear para identificar una colonia que expresa un anticuerpo contra un antígeno seleccionado (Stratagene, La Jolla, Calif.). A continuación las bacterias procedentes de esta colonia se pueden transformar con un segundo plásmido que contiene un gen de una proteína que genera luz, y se pueden utilizar transformantes en los procedimientos de la presente invención, tal como se describe anteriormente, para localizar el antígeno en un mamífero huésped.
Las células eucarióticas son también útiles como entidades en aspectos de la presente invención. Están comercialmente disponibles vectores de expresión apropiados, que contienen los elementos reguladores deseados. Los vectores se pueden usar para generar constructos capaces de expresar las proteínas que generan luz deseadas en una variedad de células eucarióticas, que incluyen células de cultivos primarios, células somáticas, células linfáticas, etc. Se pueden usar las células en estudios de expresión transitoria, o, en el caso de líneas celulares, se pueden seleccionar para transformantes estables.
Se puede regular la expresión de la proteína que genera luz en las células transformadas usando cualquiera de una variedad de promotores seleccionados. Por ejemplo, si las células van a usarse como entidades emisoras de luz dirigidas a un sitio en un sujeto mediante un ligando o receptor expresado, se puede usar un promotor constitutivamente activo, tal como el promotor de CMV o de SV40.
Alternativamente, las células transformadas se pueden administrar de tal manera que se lleguen a distribuir uniformemente en el sujeto, y expresen la proteína de fusión que genera luz sólo bajo ciertas condiciones, tales como tras la infección por un virus o la estimulación mediante una citocina. Se conocen en la técnica promotores que responden a los factores asociados con estos y otros estímulos. En un aspecto relacionado, se pueden usar promotores inducibles, tales como el sistema Tet para activar transitoriamente la expresión de la proteína que genera luz.
Transformación celular. Se conocen bien en la técnica los procedimientos de transformación de células procarióticas y células eucarióticas. Están comercialmente disponibles de manera amplia los vectores que contienen los elementos reguladores apropiados y sitios de clonación múltiple (por ejemplo, de Stratagene, La Jolla, Calif., o Clontech, Palo Alto, Calif.).
En otro aspecto, la presente invención incluye animales transgénicos que contienen un constructo de gen heterólogo que codifica una proteína o complejo de proteínas que generan luz. El constructo está impulsado por un promotor seleccionado, y puede incluir, por ejemplo, diversas proteínas accesorias requeridas para la expresión funcional de la proteína que genera luz, así como marcadores de selección y elementos potenciadores.
La activación del promotor da como resultado un aumento en la expresión de los genes que codifican las proteínas de fusión que generan luz y las proteínas accesorias. Se consigue la activación del promotor mediante la interacción de una entidad biocompatible seleccionada, o las partes de la entidad, con los elementos del promotor. Si se produce la activación sólo en parte del animal, únicamente las células en esta parte expresaran la proteína que genera luz.
Normalmente, las proteínas de fusión que generan luz se pueden localizar en el interior del sujeto, y tomar imágenes. Debido a que la imagen, o la medida de la emisión de fotones procedentes del sujeto, puede tardar hasta decenas de minutos, el sujeto se inmoviliza deseablemente durante el procedimiento de formación de imágenes. La formación de imágenes del resto polipéptido que genera luz implica el uso de, por ejemplo, un fotodetector capaz de detectar niveles extremadamente bajos de luz -normalmente, eventos individuales de fotón- e integrar la emisión de fotones hasta que se pueda construir una imagen. Los ejemplos de dichos fotodetectores sensibles incluyen dispositivos que intensifican los eventos individuales de fotón antes de que los eventos se detecten por una cámara, y las cámaras (enfriadas, por ejemplo, con nitrógeno líquido) que son capaces de detectar fotones individuales sobre el ruido de fondo inherente en un sistema de detección.
Una vez se genera una imagen de emisión de fotones, ésta se superpone normalmente sobre una imagen de luz "normal" reflejada del sujeto para proporcionar un marco de referencia de la fuente de los fotones emitidos (es decir, localizar las proteínas de fusión que generan luz con respecto al sujeto). A continuación se analiza dicha imagen "compuesta" para determinar el sitio y/o la cantidad de una diana en un sujeto.
Se pueden tomar imágenes de las proteínas de fusión que han localizado en sus lugares pretendidos de numerosas maneras. Se describen a continuación las directrices para dicha toma de imágenes, así como ejemplos específicos.
Localización de las proteínas de fusión que generan luz. En el caso de conjugados "dirigidos", esto es, conjugados que contienen un resto diana -una molécula o característica diseñada para localizar el conjugado en el interior de un sujeto o animal en un sitio o sitios concretos, el sitio se refiere a un estado en el momento en que se ha alcanzado esencialmente un equilibrio entre las entidades unidas, "localizadas", y las no unidas, "libres".
Una persona experta en la técnica puede hacer una estimación razonable del tiempo para alcanzar el sitio. Además, se puede seguir el estado de el sitio como función del tiempo tomando imágenes del conjugado emisor de luz según los procedimientos de la invención.
El "dispositivo fotodetector" usado debería tener una sensibilidad lo suficientemente elevada para permitir la toma de imágenes de la débil luz procedente del interior de un mamífero en una cantidad razonable de tiempo, y usar la señal procedente de dicho dispositivo para construir una imagen.
En los casos en los que es posible usar restos generadores de luz que sean extremadamente brillantes, y/o detectar las proteínas de fusión que generan luz localizadas cerca de la superficie del sujeto o animal del que se están tomando imágenes, se pueden usar un par de anteojos de "visión nocturna" o una cámara de vídeo de alta sensibilidad estándar, tal como la cámara Silicon Intensified Tube (SIT) (por ejemplo, de Hammamatsu Photonic Systems, Bridgewater, N.J.). Más normalmente, sin embargo, se requiere un procedimiento más sensible de detección de luz.
Con niveles de luz extremadamente bajos, el flujo de fotones por unidad de área llega a ser tan bajo que la escena de la que se están tomando imágenes ya no aparece continua. En vez de esto, está representada por fotones individuales que son temporal y espacialmente distintos entre sí. Vista en un monitor, dicha imagen aparece como puntos centelleantes de luz, representando cada uno un fotón individual detectado. Acumulando temporalmente estos fotones detectados en un procesador de imágenes digital, se puede adquirir y construir una imagen. A diferencia de las cámaras convencionales en la que a la señal en cada punto de la imagen se le asigna un valor de intensidad, en la toma de imagen por recuento de fotones la amplitud de la señal transportada no tiene significado. El objetivo es simplemente detectar la presencia de una señal (fotón) y contar la aparición de la señal con respecto a su posición en el tiempo.
Al menos dos tipos de dispositivos fotodetectores, descritos a continuación, pueden detectar fotones individuales y generar una señal que se puede analizar mediante un procesador de imágenes. Los Dispositivos de Fotodetección de Ruido Reducido consiguen sensibilidad reduciendo el ruido de fondo en el detector de fotones, en oposición a la amplificación de la señal del fotón. Se reduce el ruido principalmente enfriando la matriz del detector. Los dispositivos incluyen cámaras con dispositivos acoplados de carga (CCD) denominados como "backthinned", cámaras CCD enfriadas. En los instrumentos más sensibles, el enfriamiento se consigue usando, por ejemplo, nitrógeno líquido, que lleva la temperatura de la matriz CCD hasra aproximadamente -120ºC. "Backthinned" se refiere a una placa de soporte ultrafina que reduce el camino óptico que sigue un fotón que se va a detectar, aumentando por tanto la eficacia del cuanto. Una cámara CCD criogénica backthinned particularmente sensible es la "TECH 512" una cámara de la serie 200 disponible de Photometrics, Ltd. (Tucson, Ariz.).
Los "dispositivos de amplificación de fotones" amplifican los fotones antes de que impacten en la pantalla de detección. Este tipo incluye cámaras CCD con intensificadores, tales como intensificadores microcanal. Un intensificador microcanal contiene normalmente una matriz metálica de canales perpendiculares y coextensivos con la pantalla de detección de la cámara. La matriz de microcanales se coloca entre la muestra, el sujeto, o animal del que se van a tomar imágenes, y la cámara. La mayor parte de los fotones que entran en los canales de la matriz entran en contacto con un lado del canal antes de salir. Un voltaje aplicado a través de la matriz da como resultado la liberación de muchos electrones procedentes de cada colisión de fotón. Los electrones procedentes de dicha colisión salen de su canal de origen en un modelo de "escopeta", y son detectados por la cámara.
Se puede conseguir una sensibilidad incluso mayor colocando matrices de microcanales intensificadores en serie, de tal manera que los electrones generados en la primera etapa den a su vez como resultado una señal de electrones amplificada en la segunda etapa. Se consigue el aumento en la sensibilidad, sin embargo, a expensas de la resolución espacial, que disminuye con cada etapa adicional de la amplificación. Un dispositivo de detección de fotón único basado en intensificador de microcanales a modo de ejemplo es la serie C2400, disponible de Hamamatsu.
Los procesadores de imágenes procesan las señales generadas por los dispositivos fotodetectores que recuentan los fotones con el fin de construir una imagen que pueda ser, por ejemplo, mostrada en un monitor o impresa en una vídeo impresora. Dichos procesadores de imágenes se comercializan normalmente como parte de sistemas que incluyen las cámaras sensibles contadoras de fotones descritas anteriormente, y de acuerdo con esto, están disponibles de las mismas fuentes. Los procesadores de imágenes se conectan normalmente a un ordenador personal, tal como un PC compatible de IBM o un Apple Macintosh (Apple Computer, Cupertino, Calif.), que puede o no incluirse como parte de un sistema de imágenes adquirido. Una vez que las imágenes están en forma de ficheros digitales, se pueden manipular mediante una variedad de programas de procesamiento de imágenes (tales como "ADOBE PHOTOSHOP", Adobe Systems, Adobe Systems, Mt. Wiew, Calif.) e imprimirse.
El Campo de Detección Del Dispositivo se define como el área en la cual se pueden obtener medidas consistentes de emisión de fotones. En el caso de una cámara que usa lentes ópticas, el campo de detección es simplemente el campo de visión de acuerdo con la cámara por las lentes. Similarmente, si el dispositivo fotodetector es un par de anteojos de "visión nocturna", el campo de detección es el campo de visión de los anteojos.
Alternativamente, el campo de detección puede ser una superficie definida por los extremos de cables de fibra óptica dispuestos en una matriz estrechamente empaquetada. La matriz se construye para maximizar el área cubierta por los extremos de los cables, en oposición a anular el espacio entre cables, y se coloca en proximidad cercana al sujeto. Se puede colocar, por ejemplo, un material transparente como el plexiglás, adyacente al sujeto y disponerse la matriz firmemente adyacente al material transparente, con respecto al sujeto.
Los extremos del cable de fibra óptico opuestos a la matriz se pueden conectar directamente al dispositivo de detección o intensificación, de tal manera que el extremo de entrada de un intensificador de microcanales elimine la necesidad de lentes. Una ventaja de este procedimiento es que se reduce la dispersión y/o la pérdida de fotones eliminando una gran parte del espacio de aire entre el sujeto y el detector, y/o eliminando las lentes. Incluso las lentes de alta transmisión transmiten sólo una fracción de la luz que alcanza el elemento frontal de las lentes.
Con LGP de mayor intensidad, se pueden usar matrices de fotodiodos para medir la emisión de fotones. Se puede incorporar una matriz de fotodiodos en una lámina relativamente flexible, lo que permite al especialista "envolver" parcialmente la matriz alrededor del sujeto. Está solución también minimiza la pérdida de fotones, y además, proporciona medios para obtener imágenes tridimensionales de la bioluminiscencia. Se pueden usar otras soluciones para generar imágenes tridimensionales, que incluyen detectores múltiples colocados alrededor del sujeto o un detector o detectores de escaneo.
Se entenderá que no se necesita necesariamente que el animal o sujeto completo esté en el campo de detección del dispositivo de fotodetección. Por ejemplo, si se mide un conjugado emisor de luz conocido por localizarse en una región concreta del sujeto, sólo se necesita medir la luz de esta región, y de una zona suficientemente "oscura" que la rodea, para obtener la información deseada.
Inmovilización del sujeto. En aquellos casos en los que se desea generar una imagen bidimensional o tridimensional del sujeto, el sujeto se puede inmovilizar en el campo de detección de los dispositivos de fotodetección durante el periodo en que se está midiendo la emisión de fotones. Si la señal es suficientemente brillante para que se puede construir una imagen de la emisión de fotones medida en menos de aproximadamente 20 milisegundos, y el sujeto no se agita particularmente, no se pueden requerir precauciones especiales de inmovilización, excepto para asegurar que el sujeto está en el campo del dispositivo de detección al comienzo del periodo de medida.
Si, por otra parte, la medida de la emisión de fotones tarda más de aproximadamente 20 ms, y el sujeto se agita, es necesario tomar precauciones para asegurar la inmovilización del sujeto durante la medida de la emisión de fotones, proporcionales al grado de agitación del sujeto, para preservar la información espacial en la imagen construida. Por ejemplo, en el caso en el que el sujeto es una persona y el tiempo de medida de la emisión de fotones está en el orden de unos pocos segundos, simplemente puede pedirse al sujeto que permanezca tan inmóvil como sea posible durante la medida de la emisión de fotones (toma de imágenes). Por otra parte, si el sujeto es un animal, tal como un ratón, se puede inmovilizar el sujeto usando, por ejemplo, un anestésico, o un dispositivo mecánico de contención.
En los casos en los que se desea medir sólo la cantidad total de luz que emana de un sujeto o animal, no se necesita inmovilizar necesariamente al sujeto, incluso durante largos periodos de medidas de la emisión de fotones. Todo lo que se requiere es que el sujeto esté confinado en el campo de detección del fotodetector durante la formación de imágenes. Se apreciará, sin embargo, que inmovilizar al sujeto durante dicha medida puede mejorar la consistencia de los resultados obtenidos, debido a que el espesor del tejido a través del cual pasan los fotones detectados será más uniforme de animal a animal.
Consideraciones adicionales durante la formación de imágenes
La visualización de restos generadores de luz fluorescente requiere de una fuente luminosa de excitación, así como de un fotodetector. Además, se entenderá que la fuente luminosa de excitación se excita durante la medida de la emisión de fotones procedentes del resto que genera luz.
La apropiada selección de un fluoróforo, la colocación de la fuente luminosa y la detección y colocación de los filtros, todos los cuales facilitan la construcción de una imagen informativa, se han descrito anteriormente, en la sección de restos generadores de luz fluorescente.
Formación de imágenes de alta resolución. La dispersión de fotones en el tejido limita la resolución que se puede obtener mediante la toma de imágenes con las LGM a través de una medida de la emisión total de fotones. Se entenderá que la presente invención incluye también las formas de realización en las que la generación luminosa de las LGM está sincronizada con una fuente externa que se puede enfocar en los puntos seleccionados del interior del sujeto, pero que no se dispersa significativamente en el tejido, permitiendo la construcción de imágenes con mayor resolución. Se puede usar, por ejemplo, una señal de ultrasonidos enfocada para escanear, en tres dimensiones, al sujeto del que se están tomando imágenes. La generación luminosa procedente de áreas que están en el punto focal del ultrasonido se puede resolver desde otra emisión de fotones mediante una oscilación característica impartida a la luz por el ultrasonido.
Construcción de una imagen de emisión de fotones. En los casos en los que, debido a un resto que genera luz excepcionalmente brillante y/o el sitio de proteínas de fusión que generan luz próximas a la superficie del sujeto, se usó un par de anteojos de "visión nocturna" o una cámara de vídeo de alta sensibilidad para obtener una imagen, la imagen se ve o se muestra simplemente en un monitor de vídeo. Si se desea, se puede derivar la señal de una vídeo cámara a través de un procesador de imágenes, que puede almacenar los marcos de vídeo individuales en la memoria para el análisis o la impresión, y/o puede digitalizar las imágenes para el análisis y la impresión en un ordenador.
Alternativamente, si se usa una solución de recuento de fotones, la medida de la emisión de fotones genera una matriz de números, que representan el números de fotones detectados en cada localización de píxel, en el procesador de imágenes. Estos números se usan para generar una imagen, normalmente normalizando los recuentos de fotones (tanto como un valor fijo preseleccionado, o como el número máximo detectado en cualquier píxel) y convirtiendo el número normalizado en una luminosidad (escala de grises) o en un color (pseudocolor) que se muestra en un monitor. En una representación en pseudocolor, las asignaciones de color típicas son como sigue. Los píxeles con cero recuentos de fotones se les asigna el negro, recuentos bajos el azul, y recuentos crecientes, colores de longitud de onda creciente, hasta el rojo para los valores más altos de recuentos de fotones. El sitio de los colores en el monitor representa la distribución de la emisión de fotones, y, de acuerdo con esto, el sitio de las proteínas de fusión que generan
luz.
Con el fin de proporcionar un marco de referencia para los conjugados, se construye normalmente una imagen del sujeto en escala de los grises (aún inmovilizado) del cual se midió la emisión de fotones. Se puede construir dicha imagen, por ejemplo, abriendo una puerta en la cámara de formación de imágenes, o la caja, en una habitación con luz tenue, y midiendo los fotones reflejados (normalmente durante una fracción del tiempo que se tarda en medir la emisión de fotones). Se puede construir la imagen en la escala de grises tanto antes de medir la emisión de fotones, como después. La imagen de la emisión de fotones se superpone normalmente sobre la imagen de la escala de grises para producir una imagen compuesta de la emisión de fotones referida al sujeto.
Si se desea seguir el sitio y/o la señal de un conjugado emisor de luz en el tiempo, por ejemplo, para registrar los efectos de un tratamiento sobre la distribución y/o el sitio de un resto biocompatible seleccionado, se puede repetir la medida de la emisión de fotones, o la toma de imágenes a intervalos de tiempo seleccionados para construir una serie de imágenes. Los intervalos pueden ser tan cortos como minutos, o tan largos como días o semanas.
Análisis de imágenes por emisión de fotones. Las imágenes generadas por los procedimientos y/o las composiciones de uso de la presente invención se pueden analizar mediante una variedad de procedimientos. Oscilan desde un simple examen visual, la evaluación mental y/o la impresión de una copia impresa, hasta sofisticados análisis digitales de imágenes. La interpretación de la información obtenida de un análisis depende del fenómeno en observación y de la entidad que se está usando.
En referencia ahora a los Dibujos, la Fig 1A es una representación esquemática de diferentes proteínas de fusión. "T" indica el sitio diana de la enzima en la proteína de fusión, "E" indica la enzima, "X" indica el sitio de modificación en la proteína de fusión, y "R" indica la región indicadora de la proteína de fusión. La modificación en "X" por "E" da como resultado que la proteína de fusión se vuelva activa o inactiva "Encendido/Apagado". La Fig 1B muestra una forma de realización en la que la "T" y la "X" son regiones separadas y están en forma cis en la proteína de fusión. La Fig 1C muestra una forma de realización de la invención en la que la "T" y la "X" de la proteína de fusión son congruentes dentro de una región de la proteína de fusión. La Fig 1D muestra una forma de realización en la que la "T" está en una proteína asociada con la proteína de fusión que contiene la
"X".
La Fig 2 es una representación esquemática de diferentes proteínas de fusión. La Fig 2A es una representación esquemática de una proteína de fusión y una proteína asociada en la que una proteína de fusión y una proteína asociada "A" contienen una región de homo o heterodimerización conocida "HD" que corresponde al sitio diana de la enzima de un enzima, en la que la unión de la "A" asociada a la enzima con la HD de la proteína de fusión da como resultado la modificación de la proteína de fusión en "X". La Fig 2B es un aspecto relacionado en el que una región de unión de la proteína "A" que contiene un sitio diana de la enzima "T" interactúa con una región de unión "B" de una proteína de fusión, lo que da como resultado que el enzima "E" modifique la región indicadora "R" de la proteína de fusión "B" en el sitio de modificación "X" de tal manera que la proteína de fusión emita o no emita luz o produzca la luz que se va a emitir.
La Fig 3 muestra la unión de pVHL a una forma modificada de HIF. (A) muestra células de carcinoma renal defectivas en pVHL tratadas con cantidades crecientes de desferoxamina (2, 10, 100, 1000 \mum) o cloruro de cobalto (2, 10, 100, 1000 \mum) e inmunoprecipitadas con control (banda 1) o anticuerpo anti-HIF2\alpha. Se detectaron proteínas de unión mediante inmunotransferencia de and-HIF2a (IB) o por el análisis por transferencia far-western (FW) con complejos de pVHL/elongina B/elongina C (VBC). (B) muestra los análisis por transferencia far- western de VBC y de inmunotransferencia de anti-HIF2\alpha de células ts20 que crecen a una temperatura de restricción en condiciones hipóxicas o normóxicas. (C y D) representan gráficamente GST-HIF1\alpha (530-652), que contiene la región de degradación dependiente de oxígeno (ODD), producida en E. coli, recuperada en glutatión sefarosa, e incubada con lisado de Reticulocitos de conejo durante 90 min a 30ºC. En (D, banda 3), el lisado de Reticulocitos se inactivó térmicamente en primer lugar durante 20 min. Tras lavados de restricción, la proteína GST-ODD se sometió a los análisis por transferencia far-western de VBC y a la inmunotransferencia de anti-GST.
La Fig 4 muestra la unión de pVHL con un péptido derivado de HIF1\alpha si Leu562 y pro564 están intactos. (A) muestra la unión de las proteínas de fusión Gal4-HIF1\alpha marcadas con ^{35}S indicadas con los complejos inmovilizados de GST-PVHL elongina B, elongina C. (B) muestra la unión de pVHL marcado con ^{35}S a los péptidos HIF1\alpha(556-575) biotinilados con las sustituciones indicadas de los restos 561-568. "+" indica la preincubación del péptido con lisado de reticulocitos no programados antes de la adición de pVHL. (C y D) representan gráficamente el tipo natural (WT) marcado con ^{35}S, Pro564Ala, y Leu562Ala de las proteínas HA-HIF1\alpha (panel C) y Gal4-HA-HIF1\alpha (530-652) (panel D) de longitud completa inmunoprecipitadas con anticuerpo anti-HA o capturadas con complejos GST-VBC inmovilizados. WG = extracto de germen de trigo; Retic = lisado de Reticulocitos de
conejo.
La Fig 5 muestra la ubiquitinación y la degradación de HIF unido a Leu562 y Pro564. (A) representa gráficamente la ubiquitinación in vivo del tipo natural marcado con ^{35}S, Leu562A, y Pro564A de Gal4-HA-HIF1\alpha(530-652) en presencia de extractos de S100 preparados a partir de células de carcinoma renal defectivas en pVHL transfectadas transitoriamente con 1,5 o 3,5 \mug de plásmidos que codifican el tipo natural o P564A de HA-HIF1\alpha en ausencia o presencia de desferoxamina.
La Fig 6 representa gráficamente la hidroxilación de la prolina unida a la unión de pVHL. (A) es un análisis MALDI-TOF del tipo natural. Los péptidos HIF(556-575) biotinilados Pro564Ala, y Leu562Ala, tras la incubación con lisado de reticulocitos de conejo. (B) muestra Gal4-HA-HIF/555-575) traducido in vitro en presencia de 3H-Prolina con lisado de reticulocitos d conejo o extracto de germen de trigo y purificado en gel-banda. Los círculos rayados indican las posiciones de los marcadores de prolina e hidroxiprolina teñidos con ninhidrina.
La Fig 7 ilustra que pVHL reconoce específicamente HIF1\alpha con la prolina 564 hidroxilada. (A y B) muestran la unión de pVHL marcado con ^{35}S a los péptidos HIF1\alpha(556-575) biotinilados con las sustituciones indicadas de los restos 561-5687. (c) muestra células ts20 transfectadas de manera estable para producir HA-pVHL que crece a temperatura restrictiva (banda 1) o permisiva (bandas 2-6) e inmunoprecipitadas con anti-HIF1\alpha (banda 1 y 2) o anticuerpo anti-HA (bandas 3-7). Las proteínas de unión se eluyeron mediante ebullición en un tampón de muestra (banda 1 y 2) o tratamiento con los péptidos indicados y se inmunotransfirieron con anticuerpo anti-HIF1\alpha. (D) muestra células de carcinoma renal defectivas en pVHL transfectadas de manera estable para producir pVHL de tipo natural (WT8) o con un vector vacío (RC-) metabólicamente marcado con metionina ^{35}S, lisado, e incubado con péptidos HIF1\alpha (556-575) biotinilados inmovilizados con las sustituciones indicadas del resto 564. Se detectaron específicamente proteínas de unión mediante autorradiografía.
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Ejemplos
Ejemplo de referencia 1
Caracterización de polipéptidos responsables de hipoxia
Se examinó la interacción de pVHL y HIF. En el presente documento se da a conocer un polipéptido HIF1\alpha que es suficiente para unirse a pVHL. pVHL se une directamente a una región de HIF1\alpha denominada región de degradación dependiente de oxígeno (ODD). pVHL reconoce el HIF producido en el lisado de reticulocitos d conejo pero no el HIF producido en extractos de germen de trigo o en E. coli. Además, HIF derivado de germen de trigo o E. coli se une a pVHL tras la preincubación con extractos celulares humanos, de conejo, o xenopus a 37ºC. Por ejemplo, las proteínas de fusión glutatión S-transferasa-ODD producidas en E. coli no fueron reconocidas por VBC en los ensayos por transferencia far-western (Fig. 3C). Estas proteínas fueron reconocidas, sin embargo, tras la preincubación con un lisado de reticulocitos de conejo. Se obtuvieron resultados similares con proteínas de fusión GST-ODD de diversos tamaños, excluyendo de esta manera la posibilidad la posibilidad de que la señal de la transferencia por transferencia far-western representa una falsa interacción entre VBC y una proteína derivada de reticulocitos. VBC no reconoce las proteínas de fusión GST-ODD incubadas con un lisado de reticulocitos inactivado térmicamente (Fig. 3D). Las proteínas de fusión Gal4-HIF contienen los restos 555-575 de HIF unidos específicamente a los complejos GST-VHL, elongina B, elongina C inmovilizados (Fig. 4A): Se llevaron a cabo la transcripción/traducción de las proteínas marcadas con ^{35}S acopladas in vitro de acuerdo con las instrucciones del fabricante (TNT, Promega). También, un péptido biotinilado que corresponde a los restos 556-575 de HIF se une a pVHL tras la preincubación con el lisado de reticulocitos (Fig. 4B). Para los estudios de unión de péptidos, 1 \mug de péptido biotinilado se unió a 30 \mul de avidina Sefarosa monomérica (Pierce). Cuando se indicó, se preincubó el péptido con 50 \mul de lisado de reticulocitos de conejo durante 90 min a 30ºC. A continuación se lavó la Sefarosa 3 veces con NETN (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, P40 no idet al 0,5%) y se usó en la reacciones de unión que contenían 4 \mul de ^{35}S-HA-pVHL en 500 \mul de EBC o 500 \mul de extracto celular radiomarcado con ^{35}S (equivalente a las células de una placa de 100 mm subconfluente). Tras 1 hora de incubación a 4ºC con agitación, se lavó la Sefarosa 4 veces con NETN. Las proteínas unidas se eluyeron mediante ebullición en SDS que contenía tampón de muestra y se detectaron mediante autorradiografía. Esta región de HIF contiene un 8 mer (MLAPYIPM) muy conservado que, cuando muta a 8 alaninas consecutivas, conduce a la estabilización de HIF en las células. Un escáner de la alanina de esta región demostró que Leu562 y Pro564 eran esenciales para la unión específica con pVHL en este ensayo (Fig. 4B). En contraste, la mutación de un fosfoaceptor potencial en este péptido, Tyr565, no afecta la unión con pVHL, manteniendo junto con un estudio más inicial que una mutación en Tyr565Phe no afecta la estabilidad de HIF. Además, la unión de pVHL con GST-ODD en los ensayos descritos anteriormente no fue afectada por el tratamiento con
fosfatasa.
La unión de pVHL con HIF1\alpha es críticamente dependiente de los restos Leu562 o Pro564 de HIF1\alpha. De manera importante, la mutación de cualquiera de Leu562 o Pro564 en el contexto de una proteína de fusión HIF1\alpha o una Gal-ODD de longitud completa conduce también a una pérdida de la actividad de unión con pVHL (Fig. 4C y 4D, respectivamente). Gal4-ODD preparada con lisado de reticulocitos contuvo una banda electroforéticamente distinta en comparación con Gal4-ODD preparada con extracto de germen de trigo (Fig. 4D). Esta proteína electroforéticamente distinta se unió a VBC y no fue detectable entre los productos de la traducción de Leu562Ala y Pro564Ala. Los puntos isoeléctricos de las dos bandas con flechas en la Fig 4D fueron idénticos tras la electroforesis en gel en 2D que indica que la posible modificación no implica un cambio en la carga de la proteína.
La modificación de HIF1\alpha por pVHL tras la unión es también críticamente dependiente de los restos Leu562 o Pro564 de HIF1\alpha. Las proteínas de fusión Gal4-HIF con la mutación Leu562Ala o la mutación Pro564Ala mostraron poliubiquitinación dependiente de pVHL disminuida in vitro con respecto a la proteína de tipo natural correspondiente (Fig. 5A). Se obtuvieron resultados cualitativamente similares con la especie HIF1\alpha de longitud completa correspondiente, aunque este ensayo es menos robusto que con las proteínas de fusión Gal4-ODD. Igualmente, Pro564Ala de HIF1\alpha y Leu562Ala de HIF1\alpha fueron mucho más estables que HIF1\alpha de tipo natural en los ensayos de degradación in vitro llevados a cabo con extractos de xenopus (Fig. 5B). se prepararon extractos de huevos de xenopus ya que son bien conocidos en la técnica y se almacenaron congelados hasta el uso. Las reacciones de degradación contuvieron 8 \mul de extracto de huevos, 0,1 \mul de 100 mg/ml de ciclohexamida, 0,25 \mul de mezcla de regeneración energética, 0,25 \mul de ubiquitina bovina, y 0,4 \mul de HIF radiomarcado con ^{35}S y se llevaron a cabo a temperatura ambiente. En los puntos temporales indicados, se retiraron alícuotas de 1 \mul y se colocaron en tampón de muestra. Se resolvieron las muestras en gradientes de geles del 5-15% y se analizaron mediante autorradiografía. Los péptidos HIF biotinilados (556-575) se incubaron con lisado de reticulocitos de conejo, se lavaron, se eluyeron con biotina libre, y se analizaron mediante espectrometría de masas. Se unió 1 \mug de péptido purificado mediante HPLC a 30 \mul de avidina Sefarosa monomérica y se incubaron con 100 \mul de lisado de reticulocitos de conejo a temperatura ambiente durante 1 hora con volteo. Tras un breve centrifugación, se retiró el lisado de reticulocitos, se añadió lisado de reticulocitos reciente, y se repitió el ciclo 6 veces. A continuación se lavó la Sefarosa 4 veces con NETN y una vez con PBS. Se eluyó el péptido modificado en 50 \mul de acetato de amonio 20 mM [pH 7,0], biotina 2 mM. En estos experimentos Met561 y Met568 se convirtieron en alanina para evitar la falsa oxidación de los restos de metionina durante el análisis. Esta doble sustitución de la alanina, similar a las sustituciones únicas correspondientes no afecta la unión de pVHL. El tratamiento del péptido HIF (556-575) con lisado de reticulocitos de conejo conduce a la aparición de un segundo pico en los ensayos MALDI-TOF que representa un aumento en el peso molecular de 16 (Fig. 6A). Este pico no fue detectable antes de la incubación con el lisado de reticulocitos y no se detectó en los péptidos Leu562Ala y Pro564Ala tratados con reticulocitos correspondientes (Fig. 6A). El análisis de descomposición postfuente usando el mismo instrumento colocó la adición de +16 en Pro564. Similarmente, el análisis de espectrometría de masas mediante trampa de iones por electropulverización/espectrometría de masas (MS/MS) fue consistente con la adición de +16 en Pro 564 y excluyó la mencionada modificación de Leu 562. Finalmente, el análisis MS/MS del péptido HIF (556-575) tratado con reticulocitos produjo un modelo de iones que fue idéntico al modelo obtenido con un péptido HIF (556-575) que se sintetizó para contener hidroxiprolina en la posición 564. A continuación, se tradujo Gal4-HIF (555-575) in vitro en presencia de ^{3}H-prolina usando lisado de reticulocitos de conejo o extracto de germen de trigo, purificado en gel-banda, y se sometió a hidrólisis ácida y cromatografía en capa fina. 2 ml de gal4-HIF (555-575) marcado con ^{3}H-P in vitro traducido se inmunoprecipitaron con 50 \mug de anticuerpo anti-HA (12CA5, Roche), se resolvieron en gel de SDS-poliacrilamida al 12%, y se transfirieron a una membrana PVDF. Se visualizó Gal4-HID (555-575) mediante autorradiografía y se escindió la región correspondiente de PVDF, se hidrolizó mediante incubación en 100 \mul de HCl 10 N a 105º durante 3 horas. Se evaporaron las muestras hasta sequedad, se volvieron a suspender en 20 \mul de H_{2}O que contenía 10 \mug de prolina no marcada y 4-OH prolina (Sigma) y se resolvieron mediante cromatografía en capa fina 2-D usando fenol-H_{2}O destilada en la primera dimensión y ácido N-butanol-acético-H_{2}O en la segunda. Tras la visualización de los patrones con prolina radiomarcada con ninhidrina se detectó mediante autorradiografía. Gal4-HIF producido en lisado de reticulocitos de conejo, pero no en germen de trigo, contenía hidroxiprolina (Fig. 6B).
pVHL reconoce específicamente un determinante hidroxilado con prolina. El péptido HIF (556-575) que contiene hidroxiprolina en la posición 564 se une a pVHL con o sin pretratamiento con lisado de reticulocitos (Fig. 7A). El análisis de espectrometría de masas del péptido Leu562Ala mostró que se requería Leu562 para la modificación de HIF (Fig. 6A). En vez de esto, pVHL se une al péptido HIF (556-575) con la sustitución de Leu562Ala y la hidroxiprolina en el resto 564 (Fig. 7B). Esto sugiere que el papel principal de Leu562 es permitir la hidroxilación de Pro 564. Se usaron dos soluciones para demostrar que el péptido HIF hidroxilado interactuaría con los complejos pVHL derivados de célula. Se diseñaron mediante ingeniería genética células ts20 para producir pVHL etiquetado con HA que soporta una mutación sensible a la temperatura en la enzima que activa la ubiquitina E1. Se transfectaron células ts20 con pIRES-HA-VHL, pIRES-HA-VHL (Y98H), o pIRES-Neo (Invitrogen) y se seleccionaron en presencia de 1 mg/ml de G418. Se aislaron las colonias individuales resistentes a G418 usando cilindros de clonación y se expandieron. Se identificaron las células que producían HA-VHL o HA-VHL (Y98H) mediante un análisis de inmunotransferencia anti-HA. HIF inmunoprecipitó simultáneamente con HA-pVHL a temperatura restrictiva. HIF unido a pVHL de esta manera podría eluirse mediante el péptido HIF (556-575) hidroxilado pero no por el péptido no modificado (Fig. 7C). Para los ensayos que se muestran en la Fig. 7C, se hicieron crecer células ts20 a temperatura restrictiva o permisiva durante 14 horas, privadas de metionina durante 90 min, y a continuación se hicieron crecer en medios libres de metionina suplementados con ^{35}S-met (500 mCi/ml) durante 90 min. Se lavaron las células una vez con PBS frío, lisado en EBC, y se inmunoprecipitaron con anti-HA (12CA5; Roche o anti-HIF1\alpha (NB100-105; Novus). Tras 5 lavados con NETN se eluyeron las proteínas unidas mediante ebullición en un tampón de muestra o mediante incubación en 65 \mul de PBS que contenía 7 \mug del péptido indicado. Además, no se eluyó HIF por el péptido Pro564Ala de HIF (556-575) o por un péptido de polihidroxiprolina (Fig. 7C). Se llevó a cabo la cromatografía de afinidad con los péptidos inmovilizados y las células de carcinoma renal metabólicamente emparejadas que producen (WT8) o no (RC3) HA-pVHL. Los subclones 786- O se privaron durante 1 hora, se hicieron crecer en medios libres de metionina suplementados con ^{35}S-met (500 mCi/ml) durante 3 h, se lavaron una vez con PBS frío en hielo, y se lisaron en EBC. El péptido HIF (556-575) hidroxilado con prolina se une específicamente a pVHL así como a las proteínas con las movilidades electroforéticas esperadas de las proteínas elongina B, elongina C y Cul2 asociadas a pVHL (Fig. 7D). Se confirmó la identidad de pVHL en este experimento mediante el análisis d transferencia western. Igualmente, se detectó la unión de pVHL endógeno con el péptido hidroxilado usando células 293 de riñón embriónico. Se estabilizó un mutante HIF1\alpha en el que la Pro564 se convirtió en alanina en las células e insensible para el mimético de hipoxia desferoxamina (Fig. 5C).
La proteína HIF1\alpha se estabiliza en condiciones hipóxicas y funciona inhibiendo, disminuyendo y/o invertiendo la hipoxia en los tejidos afectados, por ejemplo, en un tumor sólido, retinopatía diabética o tejido cardíaco isquémico, modulando en parte los factores pro-angiogénicos. Una proteína de fusión que genera luz que contiene un resto HIF1 \alpha se estabilizará también en el tejido hipóxico. La destrucción de una proteína HIF1\alpha o una LGP que contiene HIF1\alpha mediante la ruta de la ubiquitina pVHL se produce, por ejemplo, durante la normoxia, cuando una prolil hidroxilasa modifica la proteína HIF1\alpha de tal manera que pVHL se une a y modifica HIF1 \alpha. Este proceso de modificación actúa como un interruptor dinámico que regula la bioluminiscencia de la proteína de fusión que genera luz que contiene HIF1\alpha tal como la primera forma de realización de la invención. Una proteína de fusión que genera luz que contiene HIF1\alpha es útil para la toma de imágenes de tejidos hipóxicos dinámicamente, por ejemplo, cáncer, in situ, y para rastrear para o ensayar la eficacia de los compuestos que modulan la hipoxia.
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Ejemplo de referencia 2
El siguiente ejemplo demuestra la eficacia de las proteínas de fusión que generan luz para formar imágenes en tejidos hipóxicos.
La Región de degradación dependiente de oxígeno (ODD) de HIF1\alpha, vuelve a HIF1\alpha inestable en presencia de oxígeno. Esta región es reconocida por pVHL. pVHL se une específica y directamente a determinantes peptídicos, correspondiendo a los restos de HIF1\alpha 555-575, localizados en la ODD. En el núcleo de dicho péptido hay un resto conservado de prolina (resto 564) que, en presencia de oxígeno, queda hidrolizado enzimáticamente. Este resto sirve como la señal para que pVHL se una. En resumen, en presencia de oxígeno, el péptido HIF queda hidroxilado y es reconocido mediante pVHL. En ausencia de oxígeno (hipoxia), la modificación no tiene lugar, y pVHL no se une con HIF.
Construcción de plásmidos ODD-LUC
En un primer conjunto de experimentos se evaluó la capacidad de un péptido HIF pequeño (555-575) para funcionar in cis para dirigir una proteína extraña para la proteólisis dependiente de pVHL. Con este fin, se amplificó mediante la PCR en ADNc de HIF que codificaba los aminoácidos 555-575 (a partir de ahora "ODD") con oligonucleótidos que introducían sitios de restricción convenientes, se digirieron y se purificaron con gel en bandas. El fragmento de la PCR se subclonó a continuación, en el marco, en dirección 3' de un ADNc de luciferasa de luciérnaga contenido en el plásmido pGL3 (Promega). El ADNc quimérico luciferasa-ODD resultante se subclonó en pcDNA3 (Invitrogen) para facilitar los estudios de traducción y expresión in vitro y en células de mamífero. En paralelo, se usaron como controles un plásmido pcDNA3 que codificaba luciferasa de luciérnaga de tipo natural y un plásmido pcDNA3 que codificaba HIF1 \alpha de tipo natural.
Demolición con VBC-GST de ODD-luciferasa
Para determinar si la proteína ODD-luciferasa podía unirse a pVHL, se produjo GST-VHL, elonguina B, y elonguina C ("GST-VBC") en E. Coli y se recuperó en forma de un complejo trimérico de glutatión sefarosa. Un trabajo anterior demostró que pVHL no se plegaba correctamente en ausencia de elonguina B y elonguina C. HIF1\alpha, ODD-luciferasa, y la luciferasa de tipo natural se tradujeron in vitro usando lisado de reticulocito de conejo (RRL) o en extracto de germen de trigo (WG) en presencia de metionina de 35S (fig. 15). Se añadieron alícuotas de las reacciones de traducción in vitro a VBC-GST recombinante preunido a la glutatión sefarosa y se incubó durante 1 hora. A continuación, se lavó la sefarosa y las proteínas unidas se resolvieron en un gel de SDS poliacrilamida al 12%. A continuación, el gel se secó y se expuso a la película. pVHL se unió a los HIF1\alpha y ODD-Luc generados en reticulocitos pero no a Luc (comparar las hileras 4, 8 y, 12). Adicionalmente, pVHL no se unió a ODD-Luc producido en germen de trigo, puesto que el germen de trigo carece de la prolil hidroxilasa de HIF (comparar las hileras 6 y 8). Así, los datos muestran que ODD-Luc era especialmente reconocido por pVHL.
Ensayo de competición de péptido
La observación de que el pVHL unido a ODD-Luc se producía en RRL, pero no en WG, sugirió fuertemente que ODD-Luc, análogamente a HIF, necesitaba experimentar una prolil hidroxilación con el fin de ser reconocida por elVHL. Para estudiar esto adicionalmente, se repitieron los experimentos de unión de GSTVBC en presencia de HIF sintético en presencia de los péptidos sintéticos (555-575) en los que Pro 564 estaba hidrolizada (P-OH) o no estaba hidrolizada (P). GST-VBC se mezcló bien con el péptido control (P) o con el péptido P-OH en concentraciones crecientes (de 0 - 5 \mug). A continuación se tradujo in vitro (en lisado de retic), se añadieron a continuación Luc, ODD-Luc, o HIF1\alpha para ver si podía competir eficientemente eliminar por competencia cualquier P-OH unido. HIF y ODD-Luc fueron capaces de eliminar por competencia el péptido P-OH eficazmente incluso a concentraciones muy altas de P-OH. Así, los resultados obtenidos con ODD-Luc recapitularon los anteriores estudios de unión realizados con HIF auténtico. (fig. 16.)
Actividad de la luciferasa en células
En experimentos piloto, se confirmó que ODD-Luc in vitro tradujo la actividad retenida de la luciferasa in vitro de forma comparable a la luciferasa de tipo natural. Para empezarse a preguntar si la ODD-Luc era sensible al oxígeno en células, se realizaron ensayos de transfección transitoria. En el primer conjunto de experimentos, 100 \mum de placas de cultivo se sembraron con 8x10^{5} células HeLa por placa. Dieciocho horas después, las células se transfección transitoriamente, usando lipofectamina (Gibco), con los plásmidos pcDNA3 que codificaban ODD-Luc o Luc de tipo natural junto con un plásmido de control interno que codificaba luciferasa de Renilla. Veintidós horas después de la transfección, las células se dividieron en placas de 6 pocillos y se dejaron adherir y crecer durante 8-12 horas. En ese momento se añadieron el mimético de hipoxia desferrioxamina (DFO) o cloruro de cobalto (CoCl_{2}) directamente al medio a concentraciones finales de 500 \muM y 200 \muM respectivamente, en pocillos duplicados. Además, algunos pocillos no se trataron para que sirvieran como controles. 12 horas después del tratamiento con DFO y CoCl_{2} las células se lisaron con tampón de lisis pasivo (Promega), se agitaron a temperatura ambiente durante 20 minutos, y se ensayaron para Luciferasa de luciérnaga y Renilla según las instrucciones de los fabricantes, Los resultados se obtuvieron por separado y se promediaron. (fig. 17).
En las células no tratadas, los valores de la luciferasa para ODD-Luc fueron aproximadamente un 30% de los valores obtenidos con la Luc de tipo natural. Reseñar que las células HeLa tienen un pVHL de tipo natural y estos experimentos se realizaron usando células que habían crecido en presencia de oxígeno. La adición de miméticos de hipoxia llevó a un marcado aumento en la actividad de la luciferasa ODD-Luc, mientras que no se detectó dicha inducción con la luciferasa de tipo natural. Los niveles inducidos de ODD-luciferasa fueron comparables con los obtenidos con la luciferasa de tipo natural. Estos resultados son consistentes con la idea de que ODD-Luc se sujeto de proteolisis dependiente de pVHL en las células mientras que la Luc de tipo natural no lo es.
Formación de imagen con ODD-Luc en tumores xenoinjertados en ratones sin pelo
Para verificar en un sistema de mamífero si el gen ODD-Luc estaba también regulado por hipoxia o miméticos de hipoxia, se llevó a cabo el siguiente experimento. Dado la facilidad con la que se trasplantan subcutáneamente tumores, y su capacidad para crecer y vascularizar, se ensayo la capacidad de tomar imágenes de la actividad de la luciferasa en tumores a nivel subcutáneo y dirigir la respuesta de ODD-Luc respecto de la hipoxia.
Se generaron células Hela policlonales transfectadas de forma estable con ODD-Luc y Luc. Los clones se suspendieron en PBS y se contaron. Se administraron 10^{6} células por punto de inyección subcutáneamente por duplicado en los costados de ratones sin pelo (fig. 18). Tras el crecimiento de tumores palpables (aproximadamente 3-4 días), se suministraron a los ratones inyecciones intraperitoneales de fenobarbital para anestesia, se inyectaron con una dosis de luciferina ajustadas según el peso, y se tomó una imagen del cuerpo completo con una cámara Xenogen. Para asegurar que la diferencia en la actividad de la luciferasa no era simplemente una función del tamaño tumoral, se realizaron medidas bidimensionales de los tumores, que fueron aproximadamente igual.
La fig. 18 muestra tres ratones diferentes inyectados con ODD-Luc (derecha) y Luc (izquierda) por duplicado. Los sitios en los que se inyectó ODD-Luc claramente tenían atenuada la señal de la luciferasa. De esta manera, los datos muestran una atenuación real de la actividad de la luciferasa, ubiquitinación secundaria y destrucción de ODD-Luc.
<110> Dana Farber Cancer Institute
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Kaelin Jr., William G 
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Ivan, Mircea 
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<120> Fármacos y procedimientos para tratar la hipoxia y procedimientos de selección de los anteriores
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<130> 20363-014-061
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<140> No asignado aún
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<150> 60/277.425
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<151> 20-03-2001
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<150> 60/277.431
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<151> 20-03-2001
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<150> 60/277.440
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<151> 20-03-2001
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<150> 60/332.493
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<151> 09-11-2001
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<150> 60/332.334
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<151> 09-11-2001
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<151> 09-11-2001
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<151> 20-12-2001
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<151> 20-12-2001
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<151> 20-12-2001
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<150> NO ASIGNADO AÚN
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<151> 19-03-2002
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<160> 11
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Diana Consenso
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<400> 1
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1 
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<210> 2
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Diana
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<400> 2
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2 
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<210> 3
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Diana
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<400> 3
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3 
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<210> 4
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Diana
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<400> 4
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4 
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Diana
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<400> 5
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5 
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<210> 6
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<211> 1210
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<212> PTR
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Diana Consenso
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<220>
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<221> VARIANTE
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<222> (1)..(600)
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<223> Un péptido de 1 a 600 aminoácidos en el que Xaa es cualquier aminoácido.
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<220>
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<221> VARIANTE
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<222> (611)..(1210)
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<223> Un péptido de 1 a 600 aminoácidos en el que Xaa es cualquier aminoácido.
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<400> 6
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6 
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7 
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8 
\hskip0,8cm
9 
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<210> 7
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<211> 78
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de la PCR
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<400> 7
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10 
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<210> 8
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cebador de la PCR
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcgcgaattc atttcttggc tttggcaga 
\hfill
29 
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<210> 9
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<211> 1206
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Diana Consenso
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<220>
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<221> VARIANTE
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<222> (1)..(600)
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<223> Un péptido de 1 a 600 aminoácidos de longitud en el que Xaa es cualquier aminoácido.
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
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<222> (602)
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<223> En el que Xaa es uno o más de cualquiera de los aminoácidos.
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<220>
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<221> VARIANTE
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<222> (605)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En el que Xaa es uno o más de cualquiera de los aminoácidos.
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
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<222> (607)..(1206)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Un péptido de 1 a 600 aminoácidos de longitud en el que Xaa es cualquier aminoácido.
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<400> 9
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11 
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12 
\hskip0,8cm
13 
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14 
\hskip0,8cm
15 
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<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 826
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido Diana Consenso
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<400> 10
\hskip0,8cm
16 
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17 
\hskip0,8cm
18 
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<210> 11
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<211> 1208
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido de unión Consenso
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<220>
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<221> VARIANTE
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<222> (1)..(600)
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<223> Un péptido de 1 a 600 aminoácidos de longitud en el que Xaa es cualquier aminoácido.
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<220>
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<221> VARIANTE
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<222> (601)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> En el que Xaa es Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, o Trp.
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<220>
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<221> VARIANTE
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<222> (603)
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<223> En el que Xaa es Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, o Trp.
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<220>
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<221> VARIANTE
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<222> (605)
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<223> En el que Xaa es Ser, Thr, o Tyr.
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<220>
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<221> VARIANTE
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<222> (606)..(608)
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<223> En el que Xaa es Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, o Trp.
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<400> 11
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\hskip0,8cm
19 
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20 
\hskip0,8cm
21 
\hskip0,8cm
22 
\hskip0,8cm
23

Claims (7)

1. Un procedimiento para identificar moduladores de la prolil hidroxilasa, que comprende las etapas
a)
poner en contacto pVHL, una prolil hidroxilasa, un modulador putativo de la prolil hidroxilasa y una proteína de fusión que genera luz que comprende a) un resto polipéptido HIF\alpha que tiene carácter de unión para la prolil hidroxilasa y que tiene la capacidad de unirse a una proteína VHL de tipo natural, de tal manera que la unión es capaz, en un entorno celular normóxico, de dirigir el polipéptido HIF\alpha para su destrucción; y b) un resto polipéptido que genera luz, en el que la generación de luz de dicho resto polipéptido que genera luz cambia tras la unión de una prolil hidroxilasa a dicho resto polipéptido HIF\alpha, bajo condiciones favorables para la unión de una prolil hidroxilasa con un HIF\alpha para formar una muestra de ensayo; y
b)
determinar la capacidad de dicho modulador putativo de la prolil hidroxilasa para modular la prolil hidroxilasa midiendo la luz generada en dicha muestra de ensayo.
en el que dicho resto polipéptido HIF\alpha es un resto polipéptido HIF1\alpha que comprende la secuencia de aminoácidos Y-X_{1}-Leu-X_{2}-Pro_{h}-X_{3}-X_{4}-X_{5}-X_{6}-Y', en la que
a)
Proh es prolina hidroxilable;
b)
X_{1}, X_{2}, X_{4}, X_{5}, y X_{6} son de manera independiente Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, o Trp;
c)
X_{3} es Ser, Thr, o Tyr; y
d)
Y e Y' están presentes o ausentes de manera independiente y, si están presentes, comprenden de manera independiente un péptido que tiene de 1 a 600 aminoácidos.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la unión de la prolil hidroxilasa a dicho resto polipéptido HIF\alpha cambia la luminiscencia de dicho resto polipéptido que genera luz sin alterar el estado de fosforilación de dicha proteína de fusión.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho resto polipéptido HIF1\alpha comprende los aminoácidos 555-575 del HIF\alpha de tipo natural, numerados de acuerdo con el HIF1\alpha humano, o sus regiones equivalentes en otras proteínas de la subunidad HIF\alpha.
4. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que dicho resto polipéptido HIF\alpha comprende la secuencia de aminoácidos que corresponde a los restos 1-600 N terminales de HIF\alpha, numerados de acuerdo con el HIF1\alpha humano, o sus regiones equivalentes en otras proteínas de la subunidad HIF\alpha, en el que o bien a) el resto 564 es prolina hidroxilable o bien b) el resto 402 es prolina hidroxilable; o bien c) ambos restos 402 y 564 son prolina hidroxilable.
5. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que dicho resto polipéptido HIF\alpha comprende o bien (a) una secuencia de 12 a 14 aminoácidos; o bien (b) una secuencia de 20 a 30 aminoácidos; o bien (c) una secuencia de 80 a 120 aminoácidos, correspondiendo dicha secuencia de aminoácidos a los restos adyacentes a y/o que rodean el resto 564, inclusive, de HIF1\alpha, numerados de acuerdo con el HIF1\alpha humano, o sus regiones equivalentes en otras proteínas de la subunidad HIF\alpha, siendo el resto 564 prolina hidroxilable.
6. Un procedimiento para seleccionar un modulador de prolil hidroxilasa asociado con la hipoxia, comprendiendo dicho procedimiento:
a)
administrar un compuesto de ensayo a un animal de ensayo no humano con un riesgo aumentado de trastorno hipóxico, expresando dicho animal de ensayo de manera recombinante una proteína de fusión que genera luz que comprende un resto polipéptido HIF\alpha tal como se define en la reivindicación 1 y un resto polipéptido que genera luz, en la que la generación de luz de dicha proteína de fusión que genera luz cambia tras la unión de una prolil hidroxilasa a dicho resto polipéptido HIF, reconociendo dicho resto polipéptido HIF\alpha la prolil hidroxilasa asociada con un trastorno hipóxico, o un producto de dicho trastorno hipóxico;
b)
permitir el sitio de dicha proteína de fusión que genera luz y la prolil hidroxilasa, en la que el contacto entre dicho resto polipéptido HIF\alpha y la prolil hidroxilasa asociada con dicho trastorno produce una modificación de un sitio del efector colineal que modifica la generación de luz de dicho resto polipéptido que genera luz,
c)
detectar la luminiscencia de dicho resto polipéptido que genera luz en dicho animal de ensayo tras administrar el compuesto de la etapa (a); y
d)
comparar la luminiscencia de dicho resto polipéptido que genera luz en dicho animal de ensayo con la luminiscencia de dicho resto polipéptido que genera luz en un animal de control al que no se le haya administrado con dicho compuesto, indicando un cambio en la actividad de dicho resto polipéptido que genera luz en dicho animal de ensayo con respecto a dicho animal de control que el compuesto de ensayo es un modulador de la latencia de o la predisposición a, un trastorno hipóxico.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el trastorno se selecciona entre el grupo constituido por cáncer, diabetes, cardiopatía y apoplejía.
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Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6123715A (en) * 1994-07-08 2000-09-26 Amplatz; Curtis Method of forming medical devices; intravascular occlusion devices
US6673554B1 (en) * 1999-06-14 2004-01-06 Trellie Bioinformatics, Inc. Protein localization assays for toxicity and antidotes thereto
US6855510B2 (en) * 2001-03-20 2005-02-15 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Pharmaceuticals and methods for treating hypoxia and screening methods therefor
US7919274B2 (en) * 2001-03-20 2011-04-05 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Light-emitting fusion proteins and diagnostic and therapeutic methods therefor
JP4590157B2 (ja) * 2001-03-21 2010-12-01 アイシス イノヴェイション リミテッド アッセイ、方法および手段
DK2298301T3 (en) 2001-12-06 2018-10-01 Fibrogen Inc MEDICINALS FOR TREATMENT OF ANEMIA ASSOCIATED WITH Kidney Disease
AU2003208684A1 (en) * 2002-03-05 2003-09-16 Angiogenetics Sweden Ab Critical hypoxia-inducible factor-1alpha residues, products and methods related thereto
JP4097485B2 (ja) * 2002-08-28 2008-06-11 独立行政法人科学技術振興機構 酸化還元酵素と基質との反応中間体を捕捉する方法
US8124582B2 (en) * 2002-12-06 2012-02-28 Fibrogen, Inc. Treatment of diabetes
WO2004108681A1 (en) 2003-06-06 2004-12-16 Fibrogen, Inc. Nitrogen-containing heteroaryl compounds and their use in increasing endogenous erythropoietin
US20060251638A1 (en) * 2003-06-06 2006-11-09 Volkmar Guenzler-Pukall Cytoprotection through the use of hif hydroxylase inhibitors
US8614204B2 (en) * 2003-06-06 2013-12-24 Fibrogen, Inc. Enhanced erythropoiesis and iron metabolism
US20050214894A1 (en) * 2004-03-26 2005-09-29 Schofield Christopher J High throughput assay
US20080213404A1 (en) * 2005-02-04 2008-09-04 Johnson Randall S Hif Modulating Compounds and Methods of Use Thereof
MX2007016160A (es) * 2005-06-15 2008-03-07 Fibrogen Inc Uso de moduladoers de hif-1 alfa para el tratamiento contra el cancer.
WO2007097929A1 (en) * 2006-02-16 2007-08-30 Fibrogen, Inc. Compounds and methods for treatment of stroke
US7588924B2 (en) * 2006-03-07 2009-09-15 Procter & Gamble Company Crystal of hypoxia inducible factor 1 alpha prolyl hydroxylase
PL3357911T3 (pl) 2006-06-26 2022-09-05 Akebia Therapeutics Inc. Inhibitory prolilohydroksylazy i sposoby ich użycia
JP2010085108A (ja) * 2008-09-29 2010-04-15 Nano Factory:Kk 生体光イメージング用プローブ
US20100196521A1 (en) * 2009-02-05 2010-08-05 Liu Yuk Kwan Formulation for the treatment of hypoxia and related disorders
RS54010B1 (sr) 2009-11-06 2015-10-30 Aerpio Therapeutics Inc. Inhibitori prolil hidroksilaze
NO2686520T3 (es) 2011-06-06 2018-03-17
AU2012340192B2 (en) 2011-11-18 2016-04-07 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center 2-hydroxyglutarate as a biomarker for chronic hypoxia
US8883823B2 (en) 2012-07-16 2014-11-11 Fibrogen, Inc. Crystalline forms of a prolyl hydroxylase inhibitor
EP3219706A1 (en) 2012-07-16 2017-09-20 Fibrogen, Inc. Process for making isoquinoline compounds
AU2013290438C1 (en) 2012-07-16 2019-01-03 Kyntra Bio, Inc. Crystalline forms of the prolyl hydroxylase inhibitor [(4-hydroxy-1-methyl-7-phenoxy-isoquinoline-3-carbonyl)-amino]-acetic acid
WO2014156958A1 (ja) * 2013-03-27 2014-10-02 国立大学法人九州大学 ナノカプセル、組成物、ポリヌクレオチド、組換えベクター及び形質転換体
JP5661148B2 (ja) * 2013-06-10 2015-01-28 オリエンタル酵母工業株式会社 生体光イメージング用プローブ
JP2016521747A (ja) 2013-06-13 2016-07-25 アケビア セラピューティクス インコーポレイテッドＡｋｅｂｉａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ． 貧血治療のための組成物及び方法
MY180626A (en) 2013-11-15 2020-12-03 Akebia Therapeutics Inc Solid forms of {[5-(3-chlorophenyl)-3-hydroxypyridine-2-carbonyl]amino}acetic acid, compositions, and uses thereof
JP2017504320A (ja) * 2013-12-20 2017-02-09 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 低剪断マイクロ流体デバイスならびにその使用および製造の方法
AU2015237241B2 (en) 2014-03-28 2021-07-29 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center L-2-hydroxyglutarate and stress induced metabolism
US20160095885A1 (en) * 2014-10-01 2016-04-07 WibiWorks Therapeutics, Inc. Induction Medium & Methods for Stem Cell Culture & Therapy
US10150734B2 (en) 2015-01-23 2018-12-11 Akebia Therapeutics, Inc. Solid forms of 2-(5-(3-fluorophenyl)-3-hydroxypicolinamido)acetic acid, compositions, and uses thereof
US11324734B2 (en) 2015-04-01 2022-05-10 Akebia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating anemia
US10543724B2 (en) * 2015-05-05 2020-01-28 Jhonatan SHEMESH Wheel rim accessory and method for assembling thereof
EP3684791A1 (en) * 2017-09-21 2020-07-29 Merck Patent GmbH Fusion protein comprising an fgf-18 moiety
US11713298B2 (en) 2018-05-09 2023-08-01 Akebia Therapeutics, Inc. Process for preparing 2-[[5-(3-chlorophenyl)-3-hydroxypyridine-2-carbonyl]amino]acetic acid
US11524939B2 (en) 2019-11-13 2022-12-13 Akebia Therapeutics, Inc. Solid forms of {[5-(3-chlorophenyl)-3-hydroxypyridine-2-carbonyl]amino} acetic acid
WO2021117767A1 (ja) 2019-12-10 2021-06-17 田辺三菱製薬株式会社 含窒素ヘテロアリールカルボキサミド酢酸誘導体の製造方法

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5087618A (en) 1982-05-18 1992-02-11 University Of Florida Redox carriers for brain-specific drug delivery
US4540564A (en) 1982-05-18 1985-09-10 University Of Florida Brain-specific drug delivery
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
EP0247193A1 (en) * 1985-12-02 1987-12-02 The Regents Of The University Of California Isolation of dna sequences encoding luciferase activity and applications of the same
US5166320A (en) 1987-04-22 1992-11-24 University Of Connecticut Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells
US5021404A (en) * 1988-04-20 1991-06-04 The Children's Medical Center Corporation Angiostatic collagen modulators
DE3818850A1 (de) * 1988-06-03 1989-12-07 Hoechst Ag Oligopeptide mit zyklischen prolin-analogen aminosaeuren
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5683888A (en) 1989-07-22 1997-11-04 University Of Wales College Of Medicine Modified bioluminescent proteins and their use
US5233409A (en) 1992-02-25 1993-08-03 Schwab Karl W Color analysis of organic constituents in sedimentary rocks for thermal maturity
US5650135A (en) 1994-07-01 1997-07-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Non-invasive localization of a light-emitting conjugate in a mammal
US6217847B1 (en) * 1994-07-01 2001-04-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Non-invasive localization of a light-emitting conjugate in a mammal
US6046219A (en) * 1995-01-20 2000-04-04 Cornell Research Foundation, Inc. Method for the treatment of conditions mediated by collagen formation together with cell proliferation by application of inhibitors of protein hydroxylation
US5958713A (en) 1995-01-31 1999-09-28 Novo Nordisk A/S Method of detecting biologically active substances by using green fluorescent protein
US5882914A (en) * 1995-06-06 1999-03-16 The Johns Hopkins University School Of Medicine Nucleic acids encoding the hypoxia inducible factor-1
GB9911047D0 (en) * 1999-05-12 1999-07-14 Isis Innovation Assay method and means
US7176345B2 (en) * 2001-03-20 2007-02-13 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Transgenic animals expressing light-emitting fusion proteins and diagnostic and therapeutic methods therefor
US6849718B2 (en) * 2001-03-20 2005-02-01 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Muteins of hypoxia inducible factor alpha and methods of use thereof
US6855510B2 (en) * 2001-03-20 2005-02-15 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Pharmaceuticals and methods for treating hypoxia and screening methods therefor
US7919274B2 (en) * 2001-03-20 2011-04-05 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Light-emitting fusion proteins and diagnostic and therapeutic methods therefor
JP4590157B2 (ja) * 2001-03-21 2010-12-01 アイシス イノヴェイション リミテッド アッセイ、方法および手段
US6566088B1 (en) * 2001-10-04 2003-05-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Prolyl-4-hydroxylases
DK2298301T3 (en) * 2001-12-06 2018-10-01 Fibrogen Inc MEDICINALS FOR TREATMENT OF ANEMIA ASSOCIATED WITH Kidney Disease
US7053046B2 (en) * 2001-12-21 2006-05-30 Mcgrath Kevin Peptide activators of VEGF
US20050214894A1 (en) * 2004-03-26 2005-09-29 Schofield Christopher J High throughput assay
US20060003961A1 (en) * 2004-06-18 2006-01-05 The John Hopkins University Negative regulation of hypoxia inducible factor 1 by OS-9
AU2006254897A1 (en) * 2005-06-06 2006-12-14 Fibrogen, Inc. Improved treatment for anemia using a HIF-alpha stabilising agent
KR100859506B1 (ko) * 2005-07-22 2008-09-22 한국과학기술연구원 프롤린 수산화반응에 의한 ｈｉｆ―1 펩타이드와 ｖｂｃ단백질과의 상호작용을 형광편광도를 이용하여 정량적으로분석하는 방법
EP1960363B1 (en) * 2005-12-09 2014-01-22 Amgen, Inc. Quinolone based compounds exhibiting prolyl hydroxylase inhibitory activity, compositions and uses thereof
WO2008040002A2 (en) * 2006-09-28 2008-04-03 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods, compositions and articles of manufacture for hif modulating compounds
US20100240069A1 (en) * 2009-03-18 2010-09-23 Boehringer Ingelheim International Gmbh Drug Discovery Assay for Modulators of HIF-Prolyl Hydroxylase Activity

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