ES2335852A1 - Utilizacion de nanoparticulas de metales nobles como inmunoduladores y composicion inmunomoduladora. - Google Patents
Utilizacion de nanoparticulas de metales nobles como inmunoduladores y composicion inmunomoduladora. Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención tiene por objeto la utilización de los efectos inmunomoduladores de nanopartículas metálicas de plata funcionalizadas con tiopronina [N-(2-mercaptopropionil)glicina]. Un segundo aspecto objeto de la invención es una composición inmunomoduladora que incluye nanopartículas de plata funcionalizadas con tiopronina.
Description
Utilización de nanopartículas de metales nobles
como inmunomoduladores y composición inmunomoduladora.
Sector químico, bioquímico, inmunológico.
Producto para aplicaciones biomédicas. Inmunoterapia.
Un aspecto de la presente invención lo
constituye la utilización de los efectos inmunomoduladores de
nanopartículas metálicas de plata funcionalizadas con tiopronina
[N-(2-mercaptopropionil)glicina]. Un
segundo aspecto es una composición inmunomoduladora que incluye
nanopartículas de plata funcionalizadas con tiopronina.
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Durante los últimos años se ha ido incrementando
el interés por la síntesis y caracterización de diferentes tipos de
nanopartículas metálicas, en especial aquellas que pueden ser
acopladas a biomoléculas. Este interés ha sido potenciado por las
expectativas derivadas de estos nano-bioconjugados
en un amplio rango de aplicaciones en el diseño de nuevos
medicamentos, biomarcadores, construcción de nanodispositivos, o
para el empleo como elementos analíticos de especial sensibilidad
[Blow, N. Nanotechnology in biology: big collaborations for a small
world. Nat Methods 5, 569-74 (2008) y Kogan,
M.J. et al. Peptides and metallic nanoparticles for
biomedical applications. Nanomed 2, 287-306
(2007)].
Entre los diferentes tipos de nanopartículas,
aquellas que poseen un núcleo formado por un metal noble son
especialmente interesantes, debido, fundamentalmente a sus
propiedades plasmónicas, que le permiten actuar como marcadores
moleculares [Gong, J.L. et al. Ag/SiO_{2}
core-shell nanoparticle-based
surface-enhanced Raman probes for immunoassay of
cáncer marker using silica-coated magnetic
nanoparticles as separation tools. Biosens Bioelectron 22,
1501-7 (2007)], junto a sus efectos de amplificación
de señales en espectroscopia RAMAN y SEIR. También se usan como
elementos de contraste en microscopía electrónica [Murphy, C.J.
et al. Anisotropic metal nanoparticles: Synthesis, assembly,
and optical applications. J Phys Chem B 109,
13857-70 (2005)]. Hay por otra parte un creciente
interés en su uso como "nanocarriers" de agentes
quimioterapeúticos o como nanopartículas desnudas como potenciales
agentes citostáticos o anti-angiogénicos [Jain, K.K.
Nanomedicine: application of nanobiotechnology in medical practice.
Med Princ Pract 17, 89-101 (2008)]. Existe
también una preocupación debido al desconocimiento sistemático de
sus potenciales efectos tóxicos o aquellos relacionados con
problemas medioambientales [Linkov, I., Satterstrom, F.K. &
Corey, L.M. Nanotoxicology and nanomedicine: making hard decisions.
Nanomedicine 4, 167-171 (2008)].
Recientemente están cobrando un auge importante
aquellos trabajos que exploran los efectos biológicos de las
nanopartículas, no ya aquellas que han sido funcionalizadas para un
propósito concreto, sino de aquellas denominadas "naked"
o desnudas. Un ejemplo de funcionalización básica, usada como
plataforma de funcionalizaciones más complejas son las
nanopartículas de plata funcionalizadas con tiopronina (Figura 1).
La funcionalización con tiopronina es una técnica estandarizada ya
que la misma sirve de plataforma a futuras funcionalizaciones debido
al grupo carboxilo libre y a que solubiliza las nanopartículas de
plata que previamente se han reducido de Ag^{+} a Ag en presencia
de NaBH_{4}. La unión de la tiopronina a la plata se produce por
su grupo -SH, estando su síntesis y caracterización muy
estandarizada [Song, Y., Huang, T. & Murray, R.W. Heterophase
ligand exchange and metal transfer between monolayer protected
clusters. J Am Chem Soc 125, 11694-701 y
Huang, L.W. & Murray, R.W. Luminescence of tiopronin
monolayer-protected silver clusters changes to that
of gold clusters upon galvanic core metal exchange. J. Phys.
Chem. B 107, 7434-7440 (2003)].
En este contexto se plantea el estudio de los
efectos de estas nanopartículas funcionalizadas con tiopronina (Ag@)
en el sistema inmune. En particular, los efectos de las mismas sobre
el principal sistema de detección de patógenos, aquel constituido
por los receptores Toll (TLR). Los receptores Toll reconocen lo que
se conoce como patrones asociados a patógenos o PAMPs (de
pathogen-associated molecular patterns
[Akira, S., Uematsu, S. & Takeuchi, O. Pathogen recognition and
innate immunity. Cell 124, 783-801 (2006)].
Estos TLRs forman pues el principal sistema de detección de lo que
se conoce como inmunidad innata y en este sentido son fundamentales
para reconocer lo propio de lo ajeno en el organismo humano. Por
esta razón, la modulación de las respuestas inducidas por la
activación de los TLRs se sugiere como una diana terapéutica en
enfermedades infecciosas, sepsis, enfermedades inflamatorias y/o
autoinmunitarias o en el desarrollo de vacunas [Romagne, F. Current
and future drugs targeting one class of innate immunity receptors:
the Toll-like receptors. Drug Discov Today
12, 80-7 (2007)].
En cualquier caso, la caracterización de los
efectos sobre respuestas críticas en el sistema inmune es
fundamental en materiales que van a formar parte de aplicaciones
biomédicas.
Dentro de los componentes celulares responsables
de la inmunidad innata, el macrófago es un tipo celular fundamental
y por ello es el tipo celular de elección en numerosos estudios
conducentes a la identificación de nuevas moléculas
inmunomoduladoras [Trinchieri, G. & Sher, A. Cooperation of
Toll-like receptor signáis in innate immune defence.
Nat Rev Immunol 7,179-90 (2007)].
Teniendo en cuenta estos antecedentes, se
estudiaron los efectos que tienen las Ag@ sobre la señalización
mediada por los TLRs en la línea celular macrofágica Raw 264.7 con
el objetivo de identificar potenciales actividades inmunoduladoras.
Hasta la fecha, tan sólo hay un estudio previo sobre los efectos de
las nanopartículas en la señalización mediada por la estimulación de
TLRs [Lucarelli, M. et al. Innate defence functions of
macrophages can be biased by nano-sized ceramic and
metallic particles. Eur Cytokine Netw 15,
339-46 (2004)]. Sin embargo estos estudios están
realizados con nanopartículas de cerámica (silica, SiO_{2};
titanio, TiO_{2}; zirconio, ZrO_{2}), o nanopartículas de
cobalto. El inconveniente que presentan estas nanopartículas
metálicas o cerámicas es que producen un incremento en la secreción
de citocinas pro-inflamatorias. Por otra parte,
estas nanopartículas poseen un tamaño relativamente heterogéneo. En
la presente invención se ha tomado especial cuidado en caracterizar
los efectos inmunomoduladores con un material de elevada
homogeneidad de tamaño (aproximadamente 5 nm).
Como resultado se ha identificado un potencial
efecto inmunomodulador de las nanopartículas de Ag@, específico y
diferencial sobre determinados TLRs.
Constituye un primer aspecto de la presente
invención la utilización de nanopartículas de metales nobles en la
preparación de una composición inmunomoduladora. Dichas
nanopartículas tienen un núcleo de plata de tamaño comprendido entre
1 y 100 nm recubierto con una monocapa de tiopronina.
Preferentemente, las nanopartículas tienen un
núcleo de plata de tamaño comprendido entre 2 y 10 nm y aún más
preferentemente las nanopartículas tienen un núcleo de plata de 5
nm.
La composición inmunomoduladora actúa sobre los
receptores TLR2, TLR2/6, TLR3 y TLR9 y se emplea para el tratamiento
de patologías inflamatorias producidas por:
- infecciones bacterianas, particularmente la
meningitis.
- una sobreproducción de partículas víricas.
La composición inmunomoduladora puede utilizarse
ex vivo en terapias celulares de carácter inmune donde se
produce una transferencia de células y también como coadyuvantes en
protocolos de vacunación.
Constituye otro aspecto de la presente invención
una composición inmunomoduladora para el tratamiento de patologías
mediadas por los receptores TLR2, TLR2/6, TLR3 y TLR9. Dicha
composición comprende nanopartículas con núcleo de plata de tamaño
comprendido entre 1 y 100 nm recubiertas con una monocapa de
tiopronina. Preferentemente, las nanopartículas tienen un núcleo de
plata de tamaño comprendido entre 2 y 10 nm y aún más
preferentemente las nanopartículas tienen un núcleo de plata de 5
nm.
Figura 1: A. Imágenes de microscopía electrónica
de las nanopartículas Ag@ obtenidas con el microscopio CM200
Philips-FEI. B. Esquema de una molécula de
tiopronina adsorbida a una nanopartícula de Ag (no a escala)
indicando los átomos de la molécula de tiopronina utilizados en la
interpretación de los espectros de NMR.
Figura 2: Efecto de las Ag@ sobre la viabilidad
de las Raw 256.7 medida como liberación de LDH (integridad de
membrana) o función mitocondrial (reducción de MTT) tras 24 horas de
cultivo a las condiciones indicadas. El MG-32 es un
inhibidor del proteasoma de elevada toxicidad que utilizamos como
control positivo.
Figura 3: Regulación diferencial de la
producción de IL-6 estimulada por diferentes
ligandos de TLRs en Raw 264.7 en ausencia o en presencia de Ag@. A.
Muestra los TLRs de localización en la superficie de la célula. B.
Muestra los TLRs localizados en el compartimento endocítico.
Figura 4: La exposición previa de Ag@ modula la
respuesta posterior de producción de IL-6 tras
estimulación con ligandos de TLRs en Raw 264.7 A. Muestra los TLRs
de localización en la superficie de la célula. B. Muestra los TLRs
localizados en el compartimento endocítico.
Los TLRs se pueden dividir en dos grupos de
acuerdo a su localización celular: TLRs 1, 2, 4, 5, 6 se localizan
principalmente sobre la superficie celular y reconocen primariamente
componentes de la pared bacteriana, por el contrario los TLRs 3, 7,
8, y 9 se encuentran en compartimentos endocíticos y reconocen
principalmente productos víricos. Hay 13 parálogos identificados
hasta la fecha en los genomas de ratón y humanos, sin embargo los
ligandos de algunos de ellos no son conocidos por ahora. La unión
del ligando a TLR produce una secreción de citocinas pro-
inflamatorias como la IL-6 elegida en la presenta
invención [Akira, S., Uematsu, S. & Takeuchi, O. Pathogen
recognition and innate immunity. Cell 124,
783-801 (2006)].
\newpage
Se han realizado dos tipos de
aproximaciones:
- 1)
- Estudios donde se trata a las células con Ag@ en presencia y/o ausencia de los diferentes ligandos de TLRs, y se monitoriza la secreción de IL-6 mediante ELISA en los sobrenadantes obtenidos tras 24 horas.
- 2)
- Estudios en los que se tratan las células en presencia o ausencia de Ag@ durante 24 h, se lavan las mismas, y posteriormente se tratan las mismas con diferentes TLRs por otras 24 horas. Al final de este periodo se monitoriza la secreción de IL-6 mediante ELISA en los sobrenadantes obtenidos. Esta aproximación es interesante porque proporciona información acerca del estado de hipo- o hiper- sensibilidad en la que quedarían las células cuando se les somete a una exposición de Ag@ y posteriormente a un estímulo inmunológico.
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Nitrato de plata (AgNO_{3}, 99.8%, Panreac,
Lyon, Francia),
N-(2-mercaptopropionyl)glycina
(tiopronin, >98%) y NaBFL, 98% proceden de
Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA. Agua grado
Milli-Q, Millipore, Billerica, MA, USA.
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Ag@tiopronina (Ag@) se preparan por reducción de
AgNO_{3} utilizando NaBH_{4} como agente reductor, en una
disolución acuosa que contiene tiopronina (relación molar
tiopronina/Ag de 3:1), de acuerdo a procedimientos descritos
anteriormente [Song, Y., Huang, T. & Murray, R.W. Heterophase
ligand exchange and metal transfer between monolayer protected
clusters. J Am Chem Soc 125, 11694-701 (2003)
y Huang, L.W. & Murray, R.W. Luminescence of tiopronin
monolayer-protected silver clusters changes to that
of gold clusters upon galvanic core metal exchange. J. Phys.
Chem. B 107, 7434-7440 (2003)].
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Los espectros de NMR se obtienen a 500 MHz en un
espectrómetro Bruker AMX-500 a temperatura ambiente
en agua deuterada. Los estudios de HMBC (Heteronuclear Múltiple Bond
Coherence) se optimizan para un J_{H,C} = 8 Hz y los estudios
TOCSY (Total Correlation Spectroscopy) se llevan a cabo con una
secuencia DPFGSE, pulsos selectivos de 50 ms y un tiempo de mezcla
de 120 ms.
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Se utilizó un microscopio de alta resolución
CM200 Philips-FEI (Hillsboro, OR, USA).
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Se utilizó un espectrómetro Bruker IFS 66/s con
detector DTGS (Billerica, MA, USA. Se adquirieron 150 barridos con
una frecuencia de 2.5 Hz y resolución de 1 cm^{-1}. Todos los
espectros se obtienen en pastillas de KBr con 10 mg de
nanopartículas.
Se utilizó un espectrofotómetro Ocean optics
(Dunedin, FL, USA) con detector HR4000.
La caracterización de las Ag@ se resume en las
dos tablas siguientes:
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La línea celular procede de la European
Collection (ECACC, Porton Down, Wiltshire, UK). Las condiciones de
cultivo son las estándares y utilizadas previamente. Los cultivos se
llevan a cabo en placas de 12 pocillos en un volumen final de 2 mL.
Los macrófagos se tratan durante 24 horas con los ligandos
específicos de TLRs a la concentración previamente optimizada en
ausencia o en presencia de 10 ppm de Ag@. La lista de ligandos y
concentraciones finales utilizadas se indican a continuación:
Lipopolisacárido (1 \mug/mL LPS. E. coli serotype 0127:B8,
Sigma, St. Louis, MO, USA), Oligodeoxinucleótidos con motivos CpG no
metilados (1 \mug/mL CpG+. CpG-DNA 1668:
5'-TCCAT
GACGTTCCTGATGCT-3TIB MolBiol, Berlin, Germany), ácido poliinosínico:policitidílico (50 \mug/mL poly I:C), ácido lipoteicoico (10 \mug/mL LTA), lipopéptido sintético bacteriano Pam_{3}CSK4 (300 ng/mL), ADN bacteriano (10 \mug/mL DNA), lipoproteína sintética de micoplasma (1 \mug/mL FSL-1), peptidoglicano (10 \mug/mL PGN), imiquimod (10 \mug/mL IMQ) y ssRNA40 (0.25 \mug/mL) se obtuvieron de InvivoGen, San Diego, CA, USA. Los sobrenadantes se guardan tras 24 horas de tratamiento y se mide la producción de IL-6 mediante ELISA convencional según las instrucciones del fabricante (OptEIA Mouse IL-6 set, BD Pharmingen, San Diego, CA, USA).
GACGTTCCTGATGCT-3TIB MolBiol, Berlin, Germany), ácido poliinosínico:policitidílico (50 \mug/mL poly I:C), ácido lipoteicoico (10 \mug/mL LTA), lipopéptido sintético bacteriano Pam_{3}CSK4 (300 ng/mL), ADN bacteriano (10 \mug/mL DNA), lipoproteína sintética de micoplasma (1 \mug/mL FSL-1), peptidoglicano (10 \mug/mL PGN), imiquimod (10 \mug/mL IMQ) y ssRNA40 (0.25 \mug/mL) se obtuvieron de InvivoGen, San Diego, CA, USA. Los sobrenadantes se guardan tras 24 horas de tratamiento y se mide la producción de IL-6 mediante ELISA convencional según las instrucciones del fabricante (OptEIA Mouse IL-6 set, BD Pharmingen, San Diego, CA, USA).
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Se ha usado el sistema de detección de la enzima
lactate deshidrogenasa (LDH) denominado Cytotoxicity Detection kit
(Roche Basel, Switzerland). La proliferación se mide mediante la
cuantificación de la reducción del
3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl
tetrazolium bromide (MTT) mediante el sistema provisto por Roche
Basel, Suiza.
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Se caracterizaron los efectos citotóxicos
mediante la cuantificación de la liberación de LDH en el medio y la
cuantificación de la capacidad reductora de MTT. Ambos parámetros
miden, respectivamente, la integridad de la membrana celular y la
capacidad metabólica de las células y se ven comprometidos cuando la
viabilidad celular se reduce. La Figura 2 muestra que las Ag@
(1-100 ppm) no tienen efectos citotóxicos sobre las
células Raw 264.7, por tanto los efectos observados por las Ag@ no
se deben a un compromiso de la viabilidad de las células Raw 264.7,
sino a una alteración específica de las mismas en el sistema de
señalización de los TLRs.
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Cuando se realizan estudios de
co-tratamiento, se observa que las Ag@ no son
agentes pro-inflamatorios ya que los niveles basales
de producción de IL-6 no se vieron afectados (Figura
3). Es interesantes insistir en que las Ag@ son una mejor opción
comparada con otras nanopartículas metálicas o cerámicas que sí
producen un incremento en la secreción de citocinas
pro-inflamatorias [Lucarelli, M. et al.
Innate defence functions of macrophages can be biased by
nano-sized ceramic and metallic particles. Eur
Cytokine Netw 15, 339-46 (2004)].
Sin embargo, las Ag@ inhiben de forma diferente
la secreción de IL-6 mediada por los TLRs
localizados en la superficie celular (Figura 3A) o en los
compartimentos endocíticos (Figura 3B). La presencia de Ag@ (10 ppm
= 20 \mug/106 cells) inhibió significativamente la secreción de
IL-6 mediada por TLR2 (peptidoglicano) en un 55% o
de TLR2/6 (ácido lipoteicoico) en un 77% si se compara con los
valores obtenidos en presencia de los ligandos específicos de TLRs
en ausencia de Ag@. El efecto inhibidor es patente en el caso de los
TLRs situados en el compartimento endocítico, aunque de una forma
menos acentuada (Figura 3B). La inhibición fue de un 22.5% en el
caso del ligando de TLR3 (ácido poli[I:C]) o de un 31% en el
caso de ligando para TLR9.
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Cuando los macrófagos se exponen, en un caso a
Ag@ durante 24 h (10 ppm = 20 \mug/106 cells) o en ausencia de las
mismas como control, y posteriormente se estimulan con los
diferentes ligandos de TLRs, el pretratamiento con Ag@ incrementó la
producción de IL-6 en respuesta al ligando Pam3CSK4
(estimulación de TLR2/1) y al ligando FSL-1
(TLR2/6), en un 40% y un 31%, respectivamente (Figura 4A). Es decir,
que el pretratamiento con nanopartículas produce un estado de
susceptibilidad aumentada ante el mismo estímulo inmunológico.
Asimismo, la estimulación con ligandos de TLR2 produce tras el
pretratamiento con Ag@ una disminución del 37% en comparación con
los controles no tratados (Figura 4A). Es de destacar que los
pretratamientos producen una respuesta disminuida en el caso de
ligandos de TLR3 o TLR9 (Figura 4B).
Claims (11)
1. Utilización de nanopartículas de metales
nobles en la preparación de una composición inmunomoduladora,
caracterizada porque las nanopartículas tienen un núcleo de
plata de tamaño comprendido entre 1 y 100 nm recubierto con una
monocapa de tiopronina.
2. Utilización de nanopartículas de metales
nobles en la preparación de una composición inmunomoduladora según
la reivindicación 1, caracterizada porque las nanopartículas
tienen un núcleo de plata de tamaño comprendido entre 2 y 10 nm.
3. Utilización de nanopartículas de metales
nobles en la preparación de una composición inmunomoduladora según
la reivindicación 2, caracterizada porque las nanopartículas
tienen un núcleo de plata de 5 nm.
4. Utilización de nanopartículas de metales
nobles en la preparación de una composición inmunomoduladora según
las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la
composición inmunomoduladora actúa sobre los receptores TLR2,
TLR2/6, TLR3 y TLR9.
5. Utilización de nanopartículas de metales
nobles en la preparación de una composición inmunomoduladora según
la reivindicación 4, para el tratamiento de patologías inflamatorias
producidas por infecciones bacterianas, particularmente la
meningitis.
6. Utilización de nanopartículas de metales
nobles en la preparación de una composición inmunomoduladora según
la reivindicación 4, para el tratamiento de patologías inflamatorias
producidas por una sobreproducción de partículas víricas.
7. Utilización de nanopartículas de metales
nobles en la preparación de una composición inmunomoduladora según
las reivindicaciones 1 a 3 como moduladoras ex vivo en
terapias celulares de carácter inmune donde se produce una
transferencia de células.
8. Utilización de nanopartículas de metales
nobles en la preparación de una composición inmunomoduladora según
las reivindicaciones 1 a 3 como coadyuvantes en protocolos de
vacunación.
9. Composición inmunomoduladora para el
tratamiento de patologías mediadas por los receptores TLR2, TLR2/6,
TLR3 y TLR9, caracterizado porque dicha composición comprende
nanopartículas con núcleo de plata de tamaño comprendido entre 1 y
100 nm recubiertas con una monocapa de tiopronina.
10. Composición inmunomoduladora para el
tratamiento de patologías mediadas por los receptores TLR2, TLR2/6,
TLR3 y TLR9 según la reivindicación 9, caracterizado porque
las nanopartículas con núcleo de plata recubiertas con una monocapa
de tiopronina tienen un tamaño comprendido entre 2 y 10 nm.
11. Composición inmunomoduladora para el
tratamiento de patologías mediadas por los receptores TLR2, TLR2/6,
TLR3 y TLR9 según la reivindicación 9, caracterizado porque
las nanopartículas con núcleo de plata recubiertas con una monocapa
de tiopronina tienen un tamaño de 5 nm.
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| ES200802831A ES2335852B1 (es) | 2008-10-02 | 2008-10-02 | Utilizacion de nanoparticulas de metales nobles como inmunomoduladores y composicion inmunomoduladora. |
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| ES200802831A ES2335852B1 (es) | 2008-10-02 | 2008-10-02 | Utilizacion de nanoparticulas de metales nobles como inmunomoduladores y composicion inmunomoduladora. |
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| Publication Number | Publication Date |
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| Zheng M. et al. "Nanoparticles comprising a mixed monolayer for specific bindings with biomolecules". Journal of the American Chemical Society. 29.09.2004. Vol. 126, Nº. 38, páginas 12047 - 12054. ISSN 0002-7863 (print) * |
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