ES2336069T3 - Celula huesped que comprende un virus recombinante que expresa un antigeno y un virus recombinante que expresa una molecula inmunoestimuladora. - Google Patents

Abstract

Una célula huésped infectada con a) un primer virus recombinante que ha incorporado en un genoma vírico o porción del mismo uno o más genes o porciones de los mismos que codifican un antígeno de un estado de enfermedad, y b) un segundo virus recombinante que ha incorporado en un genoma vírico o porción del mismo uno o más genes o porciones de los mismos que codifican un B7.1, B7.2 o B7.1 y B7.2.

Description

Célula huésped que comprende un virus recombinante que expresa un antígeno y un virus recombinante que expresa una molécula inmunoestimuladora.

La presente invención se refiere a una composición de vacunas de vectores víricos recombinantes para la prevención o el tratamiento de enfermedades patogénicas y cáncer. Más particularmente, se refiere a una composición de vectores víricos recombinantes que comprenden genes que codifican un(os) antígeno(s) y vectores víricos recombinantes que comprenden un(os) genes que codifica(n) alguna(s) molécula(s) inmunoestimuladora(s). Estos genes se pueden insertar en un vector recombinante o vectores víricos separados. Otros aspecto de la presente invención es el potenciamiento de la respuesta inmune frente a las células enfermas (tales como células tumorales) en un mamífero mediante la infección de estas células con un vector recombinante que contiene un(os) gen(es) inmunoestimulador(es) tanto in situ, como in vitro y la reintroducción de las células infectadas en el huésped.

Hasta la fecha, los intentos para estimular respuestas inmunes activas en pacientes con cáncer se pueden clasificar como "no específicas" (es decir, el uso de BCG) o "específicas", es decir, el uso de células tumorales, extractos de células tumorales, mezclas de antígenos de fluidos sobrenadantes de cultivos celulares u oncolisados de células tumorales. La inmensa mayoría de estos esfuerzos se han desarrollado en pacientes con melanoma metastásico. El desarrollo de una vacuna recombinante implica el uso de productos génicos específicos y definidos o epitopos de una molécula inmunógena o una estimuladora. Se pueden usar también vacunas recombinantes para "terapia génica" en las que la última solución requiere usar células de un paciente dado y la inserción de un gen de una molécula inmunoestimuladora tal como B7.1, B7.2, IL-2 o GM-CSF en dichas células, tanto in situ como para devolver las células cultivadas al paciente.

Las vacunas recombinantes pueden tomar muchas formas. Se pueden sintetizar proteínas recombinantes mediante vectores tales como baculovirus (un vector de insecto) o en células eucarióticas. Los péptidos sintéticos pueden servir también como inmunógenos. Las vacunas de péptidos constituidas por entre de 9 a diversas docenas de aminoácidos pueden tomar dos formas. Se pueden mezclar con adyuvantes o se pueden usar para pulsar células de la sangre periférica como células que presentan antígenos (APC) para la reinfusión al paciente. Se pueden construir también vacunas recombinantes insertando el gen que codifica un antígeno asociado a un tumor dado en un vector. Algunos de los vectores comunes usados son el virus vaccinia, los virus de la viruela aviar tales como la difteroviruela aviar o la viruela del canario, BCG, adenovirus y Salmonella. Estos vectores, cada uno con sus ventajas y desventajas se emplean normalmente debido a la inmunogenicidad de sus proteínas constitutivas, volviendo de esta manera la proteína o el epitopo del gen insertado más inmunogénicos. Las vacunas recombinantes pueden también tomar la forma de un anticuerpo anti-idiotipo que se dirige contra un anticuerpo monoclonal preparado contra un antígeno asociado con un tumor dado. Más recientemente, se han preparado vacunas de polinucleótidos que están constituidas por ADN desnudo de un gen asociado con un tumor en un plásmido que contiene un promotor. Mientras que todas las anteriores se han analizado en modelos animales, muy pocos estudios han comparado las eficacias relativas de una solución frente a la otra. Los ensayos clínicos han comenzado ahora usando algunas de estos enfoques en pacientes con cáncer de mama y otros carcinomas y otros que comenzarán más probablemente en el futuro próximo.

Existen diversos antígenos que se han identificado en la actualidad para uso potencial en vacunas recombinantes para terapia del cáncer. La primera de éstas es el oncogen c-erbB72 que se encuentra que se sobreexpresa en aproximadamente el 20-30% de los tumores de mama (Pietras RJ y col. Oncogene 9: 1829-1838, 1994). Se ha demostrado (Bernards R y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6854-6858, 1987) que el oncogen c-erbB/2 mutado puntualmente en ratas, cuando se inserta en el virus vaccinia, es inmunogénico y puede conducir a efectos antitumorales. El c-erbB/2 humano, sin embargo, no está mutado. Se ha demostrado recientemente (Disis ML y col., Cancer Res. 54: 1071-1076, 1994), que este gen codifica diversos epitopos que parecen generar respuestas de las células T humanas in vitro. El oncogen p53 mutado puntualmente, encontrado también en muchos tumores de mama humanos, ha demostrado ser una diana potencial de las células T citotóxicas (Yanuck M y col. Cancer Res. 53: 3257-3261, 1993). Se están iniciando en la actualidad estudios clínicos en los que se están pulsando péptidos que reflejan mutaciones puntuales específicas con linfocitos de sangre periférica humana (PBL) y readministrarse a pacientes. La mucina de cáncer de mama, MUC-1 o DF3, representa un antígeno de diferenciación de la mama (Abe M y Kufe D, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 282-286, 1993). Aunque MUC-1 se expresa en una gama de tejidos epiteliales normales, parece estar glicosilada únicamente en el tejido del cáncer de mama. Se ha informado de que la repetición en tándem de la proteína del núcleo de la mucina MUC-1 es inmunogénica en seres humanos (Barnd DL y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7159-7163, 1989) porque los nódulos linfáticos de pacientes con cáncer de mama que contienen células T se pueden activar por los péptidos MUC-1 de una manera no restringida a MHC. Se ha demostrado también (Rughetti A y col., Cancer Res. 53: 2457-2459, 1993) que los pacientes con cáncer de ovario pueden tener respuestas de anticuerpos en esta región. Se ha informado de modelos animales en los que se ha insertado el gen MUC-1 en el virus vaccinia (Hareuveni M y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9498-9502, 1990; Hareuveni y col., Vaccine 9: 618-626, 1991). Se está poniendo en marcha actualmente un ensayo clínico en el que se está pulsando el péptido MUC-1 con PBL humanos en pacientes con cáncer de mama. Otra mucina que representa una diana potencial de la terapia cancerosa es TAG-72 que se encuentra en aproximadamente el 70-80% de los cánceres de mama humanos (Thor A y col., Cancer Res. 46: 3118-3124, 1986).

La mayor parte de los intentos de inmunización activa contra los antígenos cancerosos han implicado células tumorales completas o fragmentos de células tumorales, aunque sería más deseable inmunizar específicamente contra antígenos tumorales únicos que distinguir las células malignas de las normales. Se comprende poco la naturaleza molecular de los antígenos asociados a tumores reconocidos por las células T. A diferencia de los anticuerpos que reconocen los epitopos o las proteínas intactas, las células T reconocen fragmentos cortos de péptidos (8-18 aminoácidos) que se presentan en la superficie celular mediante las moléculas de histocompatibilidad mayor de tipo I ó II (MHC) y es probable que los antígenos asociados a tumores sean presentados y reconocidos por las células T de esta manera.

Se han identificado numerosos genes que codifican antígenos del tumor de melanoma reconocidos por TIL en el contexto de la molécula HLA-A2 de tipo I (Kawakami Y. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3515-3519, 1994; Kawakami Y. y col. J. Exp. Med 180: 347-352, 1994; Kawakami Y. y col. Cancer Res. 54: 3124-3126, 1994).

El antígeno carcinoembriónico humano (CEA) representa también una molécula diana potencial para la inmunoterapia de una gama de carcinomas humanos entre los que se incluyen los carcinomas colorrectal, gástrico, pancreático, de mama, y de células no pequeñas (Robbins PF y col., Int. J. Cancer 53: 892-897, 1993; Esteban JM y col., Cancer 74: 1575-1583, 1994). Los estudios experimentales han demostrado que los anticuerpos anti-idiotipo dirigidos contra los anticuerpos monoclonales anti-CEA pueden estimular respuestas inmunes en ratones (Bhattacharya-Chatterjee M y col., Int. Rev. Immuno. 7: 289-302, 1991). Están actualmente en marcha estudios clínicos que usan este anticuerpo anti-idiotipo. Se ha desarrollado también una vacuna recombinante en la que el gen CEA se ha insertado en el virus vaccinia (Kantor J. y col., J. Natl. Cancer Inst. 84: 1084-1091, 1992). Se acaba de completar un estudio clínico en Fase I que implica esta vacuna.

La identificación de un péptido inmunodominante que representa un antígeno tumoral único ha abierto nuevas posibilidades para la inmunización contra el cáncer. Existen evidencias sustanciales en modelos animales de que la inmunización con péptidos víricos inmunodominantes puede inducir CTL específicos de virus que pueden conferir protección contra la infección vírica. Aunque el péptido puro solo no es eficaz en la estimulación de las respuestas de las células T, péptidos emulsificados en adyuvantes o complejados con lípidos han demostrado cebado de ratones contra el estímulo con virus preparados recientemente y pueden inducir CTL específicos de virus que protejan a los ratones contra inóculos víricos letales (Kast, W.M. y col Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 88: 2283-2287, 1991; Deres, K. y col Nature 342: 561-564, 1989; Gao, X.M. y col J. Immunol. 147: 3268-3273, 1991; Aichele, P. J. Exp. Med. 171: 1815-1820, 1990; Collins, D.S. y col J. Immunol. 148: 3336-3341, 1992). La inmunización de ratones contra esplenocitos recubiertos con epitopos de péptidos de Listeria monocytogenes da también como resultado la generación de CTL específicos de Listeria que se pueden expandir mediante cultivo. La transferencia adoptiva de estos CTL puede proteger a los ratones contra el estímulo bacteriano letal (Harty, J.T. y col J. Exp. Med. 175: 1531-1538, 1992). Los péptidos que representan los epitopos antigénicos gp120 y gp160 de VIH emulsificados en adyuvante de Freund completo pueden desencadenar respuestas CTL específicas (Takahashi, H. y col Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 85: 3105-3109, 1988; Hart, M.K. y col Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 88: 9448-9452, 1991).

Aunque la inmunización con péptidos en adyuvantes o complejados con lípidos proporciona un aumento en las respuestas de las células T en ratones, las reacciones son rara vez lo suficientemente fuertes para inducir células T reactivas en esplenocitos primarios. La detección de linfocitos sensibilizados requiere casi invariablemente la estimulación in vitro secundaria.

La expresión de la familia del gen B7 ha demostrado ser un importante mecanismo de respuestas antitumorales en ratones y seres humanos. En la actualidad resulta evidente que se requieren al menos dos señales para la activación de las células T simples por las células diana que soportan el antígeno: una señal específica del antígeno, liberada a través del receptor de la célula T, y una señal independiente o coestimuladora del antígeno que conduce a los productos de la linfoquina (Hellstrom, K.E. y col. Annals NY Acad. Sci. 690: 225-230, 1993). Dos importantes moléculas coestimuladoras son B7-1, que es el ligando de los antígenos superficiales de las células T CD28 y CTLA4 (Schwartz, R.H. Cell 71: 1065-1068, 1992; Chen, L. y col. Cell 71: 1093-1102, 1992; Freeman, G.J. y col. J. Immunol 143: 2714-2722, 1989; Freeman, G.J. y col. J. Exp. Med. 174: 625-631, 1991), y B7-2, un ligando alternativo de CTLA4 (Freeman, G.J. y col. Science 262: 907-909, 1993). Hasta la fecha, se han descrito B7-1 y B7-2 de murino (Freeman, G.J. y col. J. Exp. Med. 174: 625-631, 1991; Freeman, G.J. y col. Science 262: 907-909, 1993) y B7-1 y B7-2 humanos (Freeman, G.J. y col. J. Immunol 143: 2714-2722, 1989; Freeman, G.J. y col Science 262: 909-911, 1993). No está claro en este momento si las señales coestimuladoras proporcionadas por B7-1 y B7-2 son mecanismos funcionalmente distintos o redundantes para la activación de las células T (Hathcock, K.S. y col. J. Exp. Med. 180: 631-640, 1994). La mayor parte de los tumores de murino y ser humano no expresa B7-1 o B7-2, implicando que incluso cuando un tumor expresa un potencial rechazo al antígeno, es improbable que active las respuestas de las células T antitumorales (Hellstrom, K.E. y col Annals. N.Y. Acad. Sci. 690: 225-230, 1993); Hellstrom, I. Annals. N.Y. Acad. Sci. 690: 24-31, 1993). En esencia, la sinergia puede ser el resultado de sólo una señal que se está recibiendo por la célula T (Hellstrom, K.e. y col. Annals. N.Y. Acad. Sci. 690: 225-230, 1993). Se encontró que la transfección de B7 en células de melanoma induce el rechazo de un melanoma de murino in vivo (Townsend, S.E. y col Science 259: 368-370, 1993).

Se han usado extensivamente los virus vaccinia en seres humanos y el uso de una vacuna basada en vaccinia contra la viruela ha conducido a la erradicación a nivel mundial de esta enfermedad (revisado en la referencia Moss, B. Science 252: 1662-1667, 1991). Los virus vaccinia tienen las ventajas de bajo coste, estabilidad térmica y un procedimiento simple de administración. Se han llevado a cabo intentos para desarrollar vectores víricos de vaccinia para la prevención de otras enfermedades.

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El virus vaccinia es un miembro de la familia del virus de la viruela de los virus de ADN citoplásmico. La recombinación del ADN se produce durante la replicación de los virus de la viruela y éste se ha usado para insertar ADN en el genoma vírico. Los vectores de expresión del virus vaccinia recombinante se han descrito extensivamente. Estos vectores pueden conferir inmunidad celular contra una variedad de productos génicos extraños y pueden proteger contra enfermedades infecciosas en diversos modelos animales. Se han usado los virus vaccinia recombinantes en ensayos clínicos humanos. Cooney y col inmunizaron 35 varones VIH seronegativos sanos con un virus vaccinia recombinante que expresaba el gen de la envoltura de gp160 de VIH (Cooney, E. y col. The Lancet 337: 567-572, 1991). Graham y col aleatorizaron 36 voluntarios para recibir tanto virus vaccinia recombinante que contenía la proteína de la envoltura de gp160 de VIH o virus vaccinia control (Graham, B.S. y col J. Infect. Dis. 166: 244-252, 1992). Se han iniciado estudios en Fase I usando virus vaccinia recombinante en pacientes con melanoma metastásico usando un virus recombinante que expresa el antígeno del melanoma p97 (Estin, C.D. y col Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 1052-1056, 1988) y se acaba de completar un ensayo en Fase I usando virus vaccinia recombinante que expresaba el antígeno carcinoembriónico humano en pacientes con carcinoma de mama, pulmón o colorrectal avanzado. En estos ensayos, se administró el virus vaccinia mediante escarificación intradérmica, y los efectos secundarios han sido mínimos incluyendo irritación local de la piel, linfadenopatía y síntomas transitorios parecidos a la gripe. Cell. Mol. Biol. (1994) 40, p. 49-59 da a conocer un virus vaccinia recombinante que ha incorporado en su genoma, la secuencia de codificación de un antígeno asociado a cáncer (Muc-1) y un gen que codifica una citoquina Repr. Fert. Develop. 6 (Sept. 1994), p. 339-392 da a conocer un virus vaccinia recombinante adicional que comprende el gen que codifica la glicoproteína hemaglutinina del virus de la gripe y el gen que codifica IL-5 o IL-6 de murino.

El documento WO 91/02805 da a conocer retrovirus recombinantes que comprenden un gen que codifica un antígeno y un gen que codifica una proteína MHC que es responsable de una respuesta inmune correcta.

El documento WO 92/19266 da a conocer un CEA recombinante/virus vaccinia que estimula una respuesta inmune in vivo contra CEA o las células que expresan CEA y su uso con una molécula inmunoestimuladora exógena.

Los virus de la difteroviruela aviar y de la viruela del canario son miembros de la familia del virus de la viruela (genes del virus avipox). Estos virus se replicarán únicamente en células de aves y no se pueden replicar en células humanas. Son virus citoplásmicos que no se integran en el genoma del huésped pero que son capaces de expresión en un gran número de genes recombinantes en células eucarióticas.

Se ha usado el virus recombinante de la viruela aviar que expresa la glicoproteína de la rabia para proteger ratones, gatos y perros contra el estímulo del virus vivo de la rabia. La inmunización de pollos y pavos con un virus recombinante de la viruela aviar que expresa el antígeno HA de la gripe protegió contra un estímulo letal con el virus de la gripe (Taylor y col., Vaccine 6: 504-508, 1988). Voluntarios para la viruela del canario recibieron dosis de hasta 10^{5,5} unidades infecciosas (Cadoz M., y col., The Lancet 339: 1429-1432, 1992). En un reciente ensayo subvencionado por NIAID (Protocolo 012-: Un ensayo de seguridad e inmunogenicidad en Fase I de viruela de canario recombinante-gp 160 MN (ALVAC VCP125 VIH-1gp160MN0 en adultos no infectados con VIH-1) los pacientes recibieron virus recombinante de la viruela del canario que contenía el gen gp160 de VIH mediante inyección intramuscular a dosis de hasta 10^{5,5} ufp con poca o ninguna toxicidad (comunicación personal, P. Fast, NIAID).

Los virus de la viruela aviar representan de esta manera vehículos atractivos para la inmunización debido a que pueden estimular la inmunidad humoral y celular, se pueden reproducir económicamente con un título elevado (10^{9} ufp/ml) y adicionalmente su incapacidad para infectar productivamente las células humanas aumenta sustancialmente la seguridad de su uso.

Otra ventaja considerable del virus de la viruela aviar es que hay muy poca o ninguna reactividad cruzada con el virus vaccinia y de esta manera, los seres humanos vacunados anteriormente pueden no tener reactividad inmune preexistente hacia las proteínas del virus de la difteroviruela aviar.

Resumen de la invención

La presente invención es una célula huésped tal como se define en la reivindicación 1. Más particularmente, se refiere a una célula huésped que comprende vectores víricos recombinantes que comprenden genes que codifican un(os)
antígeno(s) y los vectores víricos recombinantes que comprenden un(os) gen(es) que codifica(n) una(s) molécula(s) inmunoestimuladora(s). Se pueden insertar estos genes en un vector recombinante o vectores víricos separados.

Breve descripción de los dibujos

Estos y otros objetos, características y muchas de las ventajas relacionadas de la invención se comprenderán mejor cuando se consideran tras una lectura de la descripción detallada de la invención.

Las Figuras 1A-1D muestran el Análisis Fluorescente de células BSC-1 que expresan las proteínas rV-B7. Las células BSC-1 se tiñeron tanto para las proteínas superficiales B7-1 como B7-2 antes de la infección (Fig. 1A), después de la infección, tanto con una MOI de 10 V-Wyeth (Fig. 1B), rV-B7-1 (Fig. 1C), o rV-B7-2 (Fig. 1D). Las Figuras 1A y 1B son representativas de la tinción de B7 en células BSC-1 normales o células infectadas, usándose la cepa parental de vaccinia para construir rV-B7-1 y rV-B7-2, mientras que las Figuras 1C y 1D ilustran la fuerte expresión de las proteínas B7 recombinantes tras la infección con rV-B7-1 o rV-B7-2, usando anticuerpos monoclonales específicos de esta moléculas, respectivamente.

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Las Figuras 2A-2D muestran el crecimiento de células trasplantadas de adenocarcinoma de ratón que expresan proteínas rV-B7. Se inyectaron 5 ratones C57BL/6 por grupo con 3 x 10^{5} células MC38 que no estaban infectadas (Fig. 2A), infectadas con una MOI de 0,25 V-Wyeth (Figura 2B), rV-B7-1 (Fig. 2C), o rV-B7-2 (Fig. 2D). Las Figuras 2A y 2B ilustran velocidades de crecimiento normales de las células MC38. Las Figuras 2C y 2D ilustran velocidades de crecimiento de células MC38 que expresan proteínas B7 recombinantes. Se midieron los tumores en dos dimensiones. Se repitieron estos experimentos 3 veces más con resultados similares. * En el interior del animal creció un tumor intraperitoneal que no se pudo medir.

Figuras 3A-3C. La Figura 3A muestra el crecimiento de tumores MC38 no infectados en crías de ratones C57BL/6. La Figura 3B muestra el crecimiento de tumores MC38 en ratones a los que se les había administrado previamente (día 40) células MC38 infectadas con rV-B7-1 y estimuladas con 3 x 10^{5} células MC38. La Figura 3C muestra el crecimiento de tumores MC38 en ratones a los que se les había administrado previamente (día 40) con células MC38 infectadas con rV-B7-2 y estimuladas con 3 x 10^{5} células MC38.

La Figura 4 muestra cada grupo de tratamiento de 5 ratones C57BL/6 inmunizados con virus vaccinia recombinante que comprenden los genes que codifican tanto del gen del antígeno carcinoembriónico humano (rV-CEA), B7-2 de murino (rV-B7), como la cepa de tipo natural del virus vaccinia (V-Wyeth). Se administraron a cada ratón 1 x 10^{7} unidades formadoras de placas mediante escarificación de la cola en las siguientes relaciones: 1:1 de rV-CEA/rV-B7 (5 x 10^{6} ufp de rV-CEA + 5 x 10^{6} ufp de rV-B7); 1:1 de V-Wyeth/rV-B7 (5 x 10^{6} ufp de V-Wyeth + 5 x 10^{6} ufp de rV-B7); o 1:1 de rV-CEA/V-Wyeth (5 x 10^{6} ufp de rV-CEA + 5 x 10^{6} ufp de V-Wyeth). Se retiraron y combinaron tres bazos procedentes de cada grupo de tratamiento 14 días después de la inmunización y se llevó a cabo un ensayo linfoproliferarivo normalizado a los 5 días tal como se ha descrito anteriormente (Kantor, y col. JNCI, 84: 1084, 1992). Se ensayaron células T purificadas para su capacidad proliferativa frente a Baculovirus que producía CEA recombinante a
100 \mug/ml. Se calculó el índice de estimulación en relación con la reactividad de las células a los medios (fondo).

La Figura 5 muestra cada grupo de tratamiento de 5 ratones C57BL/6 inmunizados con virus vaccinia recombinante que codificaban los genes tanto del gen del antígeno carcinoembriónico humano (rV-CEA), B7-2 de murino (rV-B7), como de la cepa de tipo natural del virus vaccinia (V-Wyeth). Se administraron a cada ratón 1 x 10' unidades formadoras de placas mediante escarificación de la cola en las siguientes relaciones: 1:3 de rV-CEA/rV-B7 (2,5 x 10^{6} ufp de rV-CEA + 7,5 x 10^{6} ufp de rV-B7); 1:3 de V-Wyeth/rV-B7 (2,5 x 10^{6} ufp de V-Wyeth + 7,5 x 10^{6} ufp de rV-B7); o 1:3 rV-CEA/V-Wyeth (2,5 x 10^{6} ufp de rV-CEA + 7,5 x 10^{6} ufp de V-Wyeth). Se retiraron y combinaron tres bazos procedentes de cada grupo de tratamiento 14 días después de la inmunización y se llevó a cabo un ensayo linfoproliferarivo normalizado a los 5 días tal como se ha descrito anteriormente (Kantor, y col. JNCI, 84: 1084, 1992). Se ensayaron células T purificadas para su capacidad proliferativa frente a Baculovirus que producía CEA recombinante a
100 \mug/ml. Se calculó el índice de estimulación en relación con la reactividad de las células a los medios (fondo).

Las Figuras 6A-6D muestran el análisis fluorescente de células BSC-1 infectadas simultáneamente con rV-CEA y rV-B7. Se infectaron simultáneamente células BSC-1 con el virus a una MOI de 5 en relaciones de tanto: 6A) V-Wyeth; 6B) rV-CEA:V-Wyeth (3:1); 6C) Wyeth:rVB7 (3:1); como de 6D) rV-CEA:rV-B7 (3:1) y se tiñeron con MAbs PE-B7-1 y FITC-COL-1. Los ejes X e Y representan la fluorescencia de CEA y B7.1 respectivamente, mientras que el eje Z representa el número de células. Los porcentajes de células positivas en cada cuadrante se representan gráficamente en paneles insertos. La Fig. 6A representa gráficamente la tinción en células BSC-1 normales infectadas con la tinción de vaccinia parental. Las Figs. 6B y 6C representan gráficamente la expresión de CEA o B7-1 durante las infecciones únicas, mientras que la Fig. 6D ilustra la expresión simultánea de ambas moléculas recombinantes tras la infección con rV-CEA y rV-B7.

La Figura 7 muestra el potenciamiento de la actividad CTL primaria tras la inmunización con rV-CEA y/o rV-B7. Se analizó la actividad citotóxica específica de CEA 10 días después de la inmunización con un total de 1 x 10^{7} ufp tanto de rV-CEA: V-Wyeth (3:1; triángulos) o rV-CEA:rV-B7 (3:1; círculos). Se incubaron células T esplénicas de cada grupo tanto con células MC38 (CEA negativo; símbolos cerrados) como con células MC-38-CEA-2 (CEA positivo; símbolos abiertos) en un ensayo citotóxico de 16 horas. La actividad CTL de anti-V-Wyeth fue > 50% en todas las muestras (no se muestran los datos).

Las Figuras 8A-8D muestran el crecimiento de células trasplantadas de adenocarcinoma de ratón que expresan CEA en ratones inmunizados con rV-CEA y rV-B7. Se inmunizaron 10 ratones C57BL/6 por grupo una vez con un total de 10^{7} UFP tanto de 8A) V-Wyeth; 8B) rV-CEA:V-Wyeth (3:1); 8C) V-Wyeth:rV-B7 (3:1); como de 8D rV-CEA:rV-B7 (3:1), y se inyectaron 14 días después con 3 x 10^{5} células MC-38-CEA-2 subcutáneamente.

Las Figuras 9A-9B muestran la inmunidad antitumoral en ratones que recibieron anteriormente una mezcla de rV-B7 y rV-CEA. La Fig. 9A muestra el crecimiento de tumores MC-38-CEA-2 en crías de ratones C57Bl/6, y el crecimiento tumoral en ratones que sobrevivieron a un estímulo tumoral anterior (Fig. 9B). Se inmunizaron los ratones con rV-CEA:rV-B7 (3:1), y se estimularon con el tumor 14 días después. Los ratones que permanecieron libres de tumor después de 60 días (Figura 8D), se volvieron a estimular en el flanco opuesto (Fig. 9B).

La Figura 10 muestra el potenciamiento de la actividad CTL primaria tras la inmunización con rV-PSA y rV-B7-1. Se analizó la actividad citotóxica específica d PSA 10 días después de la inmunización con un total de 1 x 10^{7} OFP de rV-PSA, rV-PSA:rV-B7-1 o rV-CEA:rV B7-1. Se incubaron las células T esplénicas de cada grupo tanto con células MC38 como con células MC38-PSA en un ensayo citotóxico de 16 horas.

Descripción detallada de la invención

La presente invención es una célula huésped tal como se define en la reivindicación 1. Las células huéspedes comprenden un virus recombinante que expresa un(os) antígeno(s) de un agente que produce una enfermedad o estado de enfermedad y un virus recombinante que expresa alguna(s) molécula(s) inmunoestimuladora(s) o genes que codifican ambas moléculas insertadas en el mismo vector. La composición es capaz de estimular y/o sobrerregular una respuesta inmune en un mamífero de antígenos o anticuerpos dependientes de T a objeto de prevenir o tratar una enfermedad. La célula huésped de la presente invención es particularmente importante en la sobrerregulación de la inmunidad medida por células así como con los anticuerpos.

La inmunidad mediada por células es crucial para enfermedades resistentes producidas por cáncer y microorganismos patogénicos, particularmente virus y otros microorganismos intracelulares. La célula huésped de la presente invención tiene un primer virus recombinante que ha incorporado la célula huésped A infectada con ambos virus recombinantes que expresan el(los) antígeno(s) de un agente que produce una enfermedad y expresan la(s) molécula(s)
inmunoestimuladora(s). Se puede expresar el antígeno en la superficie celular de la célula huésped infectadas. Se puede expresar la molécula inmunoestimuladora en la superficie celular o se puede segregar activamente por la célula huésped.

La expresión tanto del antígeno como de la molécula inmunoestimuladora proporciona el péptido restringido a MHC necesario para las células T específicas y la señal apropiada para la célula T para ayudar en el reconocimiento del antígeno y la proliferación o expansión clonal de las células T específicas del antígeno. El resultado global es una sobrerregulación del sistema inmune. En una forma de realización preferida, la sobrerregulación de la respuesta inmune es un aumento de los linfocitos T auxiliares específicos del antígeno y/o los linfocitos citotóxicos, que son capaces de matar o inhibir el crecimiento de un agente que produce una enfermedad o una célula infectada con un agente que produce una enfermedad.

En una forma de realización, la célula huésped comprende un virus recombinante que comprende el genoma del virus o porciones del mismo y una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno de un microorganismo patogénico y un virus recombinante que comprende una o más secuencias de ácido nucleico que codifican una o más de las anteriores moléculas inmunoestimuladoras.

En otra forma de realización, la célula huésped comprende un virus recombinante que comprende el genoma del virus o porciones del mismo y la secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno asociado a tumor, y un virus recombinante que comprende una o más secuencias de ácido nucleico que codifican una o más de las anteriores moléculas inmunoestimuladoras.

En formas de realización adicionales se han construido los virus recombinantes para expresar citoquinas (TNF-\alpha, IL-6, GM-CSF, e IL-2), y moléculas coestimuladoras y accesorias (B7-1, B7-2) solas y en una variedad de combinaciones. La producción simultánea de una molécula inmunoestimuladora y el modelo TAA en el emplazamiento de replicación/infección del virus (en cualquier caso, el emplazamiento de producción de TAA) potencia la generación de efectores específicos. Dependientes de moléculas inmunoestimuladoras específicas, diferentes mecanismos pueden ser responsables de la inmunogenicidad potenciada: el aumento de la señal de auxilio (IL-2), el alistamiento del APC profesional (GM-CSF), el aumento de la frecuencia de CTL (IL-2), el efecto sobre la ruta que procesa el antígeno y la expresión de MHC (IFN\gamma y TNF\alpha) y similares. La expresión simultánea de un modelo de antígeno junto con al menos una molécula inmunoestimuladora es efectiva en un modelo animal para mostrar efectos antitumorales.

En algunos casos, puede ser beneficioso preparar un virus recombinante que comprenda más de un antígeno de interés con el objeto de tener una vacuna multivalente. Por ejemplo, el virus recombinante puede comprender el genoma del virus o porciones del mismo, la secuencia del ácido nucleico que codifica gp120 (de VIH) y la secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno superficial Hep B.

En una forma de realización, la célula huésped comprende un virus recombinante que comprende un genoma del virus vaccinia o porciones del mismo, la secuencia de ácido nucleico que codifica CEA y un virus recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la molécula inmunoestimuladora, B 7.1 sola o en combinación con la secuencia de ácido nucleico que codifica la molécula inmunoestimuladora, B7.2, o un virus recombinante que contiene los genes de un antígeno tumoral y una molécula inmunoestimuladora.

Se da a conocer también un virus recombinante que comprende el genoma del virus o una porción del mismo, y una o más secuencias de ácido nucleico que codifican una o más moléculas B7, preferiblemente un virus vaccinia recombinante que expresa B7-1 y/o B7-2. La rápida infección de las células tumorales con estos virus recombinantes demuestra que vaccinia puede expresar auténticamente estas proteínas y que son moléculas funcionales. Los tumores singénicos débilmente inmunogénicos que expresan estas moléculas recombinantes son rechazados por los huéspedes inmunocompetentes.

El virus recombinante puede ser un virus vaccinia recombinante que contiene B7.1 o un virus vaccinia recombinante que contiene B7.2 (designados rV-B7-1 y rV-B7-2, respectivamente).

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En una forma de realización la célula huésped comprende rV-B7-1 y/o rV-B7.2 en combinación con rV-CEA. La molécula B7 incluye, pero no se limita a B7-1, B7-2. Se puede clonar el gen B7 a partir de fuentes de mamíferos, que incluyen, pero no se limitan a tejidos de mamíferos, bibliotecas genómicas o bibliotecas de ADNc, preferiblemente de fuentes de murino o humanas.

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Vectores víricos

Los virus que se pueden usar en la presente invención son aquellos en los que se puede borrar una porción del genoma para introducir nuevos genes sin destruir la infectividad del virus. El vector vírico de la presente invención es un virus no patogénico. En una forma de realización el vector vírico tiene un tropismo para un tipo de célula específico en el mamífero. En otra forma de realización, el vector vírico de la presente invención es capaz de infectar las células que presentan antígenos profesionales tales como las células dendríticas y los macrófagos. En otra forma adicional de realización de la presente invención, el vector vírico es capaz de infectar cualquier célula en el mamífero. El vector vírico puede infectar también células tumorales.

El virus usado en la presente invención incluye, pero no se limita a virus de la viruela tales como el virus vaccinia, el virus de la difteroviruela aviar y un virus vaccinia muy atenuado (MVA), adenovirus, baculovirus y similares.

Se conoce en la técnica el genoma del virus vaccinia. Está compuesto por una región HIND F13L, la región TK, y una región HA. Se ha usado el virus vaccinia recombinante en la técnica para incorporar un gen exógeno en la expresión del producto génico exógeno (Perkus y col. Science 229: 981-984, 1985; Kaufman y col. Int. J. Cancer 48: 900-907, 1991; Moss Science 252: 1662, 1991).

Se puede incorporar un gen que codifica un antígeno de un agente que produce un estado de enfermedad o enfermedad en la región HIND F13L o incorporarse alternativamente en la región TK del vector vírico de vaccinia recombinante u otras regiones no esenciales del genoma del virus vaccinia. De igual manera, se puede incorporar un gen que codifica una molécula inmunoestimuladora en la región HIND F13L o la región TK del vector vírico de vaccinia recombinante.

Sutter y Moss (Proc. Nat'l. Acad. Sci U.S.A. 89: 10847-10851, 1992) y Sutter y col. (Virology 1994) dan a conocer la construcción y uso como un vector, el virus Ankara recombinante no replicante (MVA, vaccinia modificado con Ankara) que se puede usar como un vector vírico en la presente invención.

Baxby y Paoletti (Vaccine 10: 8-9, 1992) dan a conocer la construcción y uso como un vector del virus de la viruela no replicante, que incluye el virus de la viruela del canario, el virus de la difteroviruela aviar y otras especies de aves que se puede usar como un vector vírico en la presente invención.

Los vectores de expresión adecuados para el uso en la presente invención comprenden al menos un elemento control de la expresión unido operacionalmente a la secuencia de ácido nucleico. Los elementos control de la expresión se insertan en el vector para controlar y regular la expresión de la secuencia de ácido nucleico. Los ejemplos de elementos control de la expresión incluyen, pero no se limitan a, sistema lac, regiones operadoras y promotoras del fago lambda, promotores de levaduras y promotores derivados de polioma, adenovirus, retrovirus o SV40. Los elementos operacionales preferidos o requeridos adicionales incluyen, pero no se limitan a, secuencia líder, codones de terminación, señales de poliadenilación y cualquier otra secuencia necesaria o preferida para la transcripción apropiada y posterior traducción de la secuencia de ácido nucleico en el sistema huésped. Una persona experta en la técnica comprenderá que la correcta combinación de los elementos control de la expresión requeridos o preferidos dependerá del sistema huésped escogido. Se entenderá adicionalmente que el vector de expresión debería contener los elementos adicionales necesarios para la transferencia y posterior replicación del vector de expresión que contiene la secuencia de ácido nucleico en el sistema huésped. Los ejemplos de dichos elementos incluyen, pero no se limitan a, los orígenes de la replicación y los marcadores seleccionables. Una persona experta en la técnica comprenderá adicionalmente que dichos vectores se construyen fácilmente usando procedimientos convencionales (Ausubel y col., (1987) in "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Nueva York, Nueva York) o se encuentran comercialmente disponibles.

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Agentes que producen la enfermedad

La célula huésped de la presente invención es eficaz en el tratamiento o prevención de la enfermedad producida por los agentes que producen la enfermedad. Cada agente que produce la enfermedad o estado de enfermedad tiene asociado al mismo un antígeno o epitopo inmunodominante en el antígeno, que es crucial en el reconocimiento inmune y en la eliminación o control en último término del agente que produce la enfermedad o estado de enfermedad en un huésped, al que se denomina algunas veces en la técnica como antígeno protector. El sistema inmune del huésped debe entrar en contacto con el antígeno o epitopo inmunodominante en el antígeno para articular una respuesta inmune humoral y/o celular contra el agente que produce la enfermedad asociada.

La célula huésped de la presente invención comprende un virus recombinante que comprende una o más secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más antígenos o epitopos inmunodominantes aislados y un segundo virus recombinante que comprende una o más secuencias de ácido nucleico que codifican una o más moléculas inmunoestimuladoras.

Dichos agentes que producen la enfermedad incluyen, pero no se limitan a cáncer y microorganismos patogénicos. Los cánceres que se pueden tratar usando el virus recombinante de la presente invención incluyen, pero no se limitan a melanoma primario o metastásico, timoma, linfoma, sarcoma, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, linfoma no de Hodgkins, linfoma de Hodgkins, leucemias, cáncer de útero, y adenocarcinomas tales como cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovarios, cáncer de páncreas y similares.

Se pueden evaluar o tratar los cánceres anteriormente mencionados mediante los procedimientos descritos en la presente solicitud. En el caso de cáncer, se incorpora un gen que codifica un antígeno asociado en el genoma del virus recombinante o porción del mismo junto con un(os) gen(es) que codifica(n) una o más moléculas inmunoestimuladoras. Alternativamente, el gen que codifica un antígeno asociado con el cáncer y el(los) gen(es) que codifica(n) una o más moléculas inmunoestimuladoras se incorporan en los virus recombinantes separados. Se puede expresar el antígeno asociado con el cáncer sobre la superficie de una célula cancerosa o puede ser un antígeno interno. En una forma de realización, el antígeno asociado con el cáncer es un antígeno asociado al tumor (TAA) o porción del mismo. Los ejemplos de TAA que se pueden usar en la presente invención incluyen, pero no se limitan a TAA asociados a melanoma, que incluyen, pero no se limitan a MART-1 (Kawakami y col. J. Exp. Med. 180: 347-352, 1994), MAGE-1, MAGE-3, GP-100, (Kawakami y col. Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 91: 6458-6462, 1994), CEA y tirosinasa (Brichard y col. J. Exp. Med. 178: 489, 1993).

En otra forma de realización, los TAA son MUC-1, MUC-2, el oncogen ras mutado puntualmente, los oncogenes p53 mutados puntualmente (cáncer de páncreas), CA-125 (cáncer de ovarios), PSA (cáncer de próstata), c-erb/B2 (cáncer de mama) y similares (Boon y col., Ann. Rev. Immunol. 12: 337, 1994).

La presente invención no está limitada de ninguna manera a los genes que codifican los TAA anteriormente relacionados. Se pueden identificar, aislar y clonar otros TAA mediante procedimientos conocidos en la técnica tales como los que se dan a conocer en la Patente de los Estados Unidos Nº 4.514.506.

Los genes que codifican un antígeno de un agente que produce una enfermedad en la que el agente es un microorganismo patogénico incluyen virus tales como VIH (antígenos gp-120, p17, gp-160), virus de la gripe (antígeno NP, HA), virus del herpes simple (antígeno HSVdD), virus del papiloma humano, virus de la encefalitis equina, virus de la hepatitis (antígeno superficial Hep B) y similares. Las bacterias patogénicas incluyen, pero no se limitan a las que causan malaria, Babesia, Esquistosomiasis y similares. Las levaduras patogénicas incluyen Aspergillus, Candida invasiva, y similares. En una forma de realización preferida, el microorganismo patogénico es un organismo intracelular.

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Moléculas inmunoestimuladoras: Moléculas de coestimulación/accesorias y citoquinas

El gen procedente de la molécula de coestimulación/accesoria y/o el gen que codifica una citoquina se incorpora en el genoma de un virus recombinante. Los ejemplos de moléculas de coestimulación incluyen, pero no se limitan a B7-1, B7-2, ICAM-1, LFA-3, CD72 y similares. Los ejemplos de citoquinas abarcadas por la presente invención incluyen, pero no se limitan a IL-2, GM-CSF, TNF\alpha, IFN\gamma, IL-12, RANTES, y similares.

Constructo IL-2

El gen IL-2 usado en la presente invención se prepara tal como se da a conocer por Taniguchi y col (Nature 302: 305, 1983).

Constructo B7

Las moléculas coestimuladoras de la familia B7 (concretamente B7.1, B7.2, y posiblemente B7.3) representan un importante grupo de moléculas, pero descubierto más recientemente. B7.1 y B7.2 son ambas miembros de la superfamilia del gen Ig. Estas moléculas están presentes en los macrófagos, células dendríticas, monocitos, es decir, células que presentan antígenos (APC). Si un linfocito encuentra sólo un antígeno, con coestimulación externa mediante B7.1, responderá tanto con energía, como con apoptosis (muerte celular programada); si se proporciona la señal coestimuladora, responderá con la expansión clonal contra el antígeno diana. No se produce amplificación significativa de la respuesta inmune contra un antígeno dado sin coestimulación (June et al. Immunology Today 15: 321-331, 1994; Chen y col. (Immunology Today 14: 483-486); Townsend y col. (Science 259: 368-370)). Freeman y col. (J. Immunol. 143:2714-2722, 1989) informan de la clonación y secuenciación del gen B7.1. Azuma y col. (Nature 366: 76-79, 1993) informan de la clonación y secuenciación del gen B7.2.

En una forma de realización se insertaron el gen B7.1 o el gen B7.2 en el virus vaccinia. En otra forma de realización, se insertaron el gen CEA y el gen IL-2 en un virus vaccinia único. Se depositaron el rV-CEA/_{s}IL-2 (Designación de la ATCC VR2480), rV-CEA-T108 (Nº de Designación de la ATCC VR 2481), rV-_{=}B7-2 (Designación de la ATCC VR 2482); y rV-_{m}B7-1 (Designación de la ATCC VR 2483) en la American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland el 3 de octubre de 1994 bajo los términos del Tratado de Budapest.

La presente invención abarca también las composiciones farmacéuticas para el tratamiento o la prevención de una enfermedad producida por agentes que producen la enfermedad o los estados de enfermedad que se dan a conocer aquí.

En el tratamiento, la administración de la célula huésped de la invención o la composición de virus recombinante puede ser a objeto tanto "profiláctico" como "terapéutico". Cuando se proporciona profilácticamente, el virus recombinante o la composición de virus recombinante sirve para evitar o mejorar cualquier infección o enfermedad posterior. Cuando se proporciona terapéuticamente, el virus recombinante o la composición de más de un virus recombinante se proporciona al (o poco después del) comienzo de un síntoma de la infección o enfermedad. De esta manera, dichas formas de realización de la presente invención se pueden proporcionar tanto antes de la exposición anticipada a un agente que produce una enfermedad o estado de enfermedad como después del inicio de la infección o la enfermedad.

La definición genética de antígenos específicos de tumor permite el desarrollo de vacunas específicas de antígeno dirigidas a la terapia del cáncer. La inserción de un gen de antígeno tumoral en el genoma de los virus en combinación con un virus recombinante que comprende una molécula inmunoestimuladora es un poderoso sistema para estimular una respuesta inmune específica en términos de prevención en un paciente con un riesgo aumentado de desarrollo de cáncer (inmunización preventiva), prevención de la recurrencia de la enfermedad tras cirugía primaria (vacunación antimetastásica), o como una herramienta para expandir el número de CTL in vivo, mejorando de esta manera su efectividad en la erradicación de los tumores difusos (tratamiento de una enfermedad establecida). Finalmente, los virus recombinantes o la composición de la presente invención pueden estimular una respuesta inmune en un paciente que está potenciada ex vivo antes de transferirse hacia el tumor portador (inmunoterapia adoptiva).

El término "dosis unitaria" tal como pertenece al inóculo se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para mamíferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de virus recombinante calculada para producir el efecto inmunogénico deseado en asociación con el diluyente requerido. Las especificaciones de la novedosa dosis unitaria de un inóculo de esta invención están dictadas por y son dependientes de las características únicas del virus recombinante y el efecto inmunológico particular que se va a conseguir.

El inóculo se prepara normalmente en forma de solución en un diluyente tolerable (aceptable) tal como solución salina, solución salina tamponada con fosfato u otro diluyente fisiológicamente tolerable y similar para formar una composición farmacéutica acuosa.

La ruta de inoculación puede ser intravenosa (I.V.), intramuscular (I.M.), subcutánea (S.C.), intradérmica (I.D.) y similar, lo que da como resultado la estimulación de una respuesta protectora contra el agente que produce la enfermedad. La dosis se administra al menos una vez. Se pueden administrar dosis posteriores tal como se indica.

Al proporcionar a un mamífero el virus recombinante de la presente invención, preferiblemente un ser humano, la dosificación del virus recombinante administrado variará dependiendo de dichos factores tales como la edad del mamífero, el peso, la altura, el sexo, el estado clínico general, el historial médico previo, la progresión de la enfermedad, el peso del tumor y similares.

En general, es deseable proporcionar al receptor una dosificación de cada virus recombinante en la composición en el intervalo de entre aproximadamente 10^{5} y aproximadamente 10^{10} unidades formadoras de placa/mg por mamífero, aunque se puede administrar una dosis más baja o más alta.

Se puede introducir la célula huésped que comprende los vectores víricos recombinantes en un mamífero tanto antes de cualquier evidencia de cánceres tales como melanoma como para mediar la regresión de la enfermedad en un mamífero que padece un cáncer tal como melanoma. Los ejemplos de procedimientos para administrar la composición en los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, exposición de las células al virus recombinante ex vivo, o inyección de la composición en el tejido afectado o administración intravenosa, S.C., I.D. o I.M. del virus. Alternativamente, las células huéspedes se pueden administrar localmente mediante inyección directa en la lesión cancerosa o aplicación tópica en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La cantidad de vector vírico recombinante, que trasporta la secuencia de ácido nucleico de uno o más TAA que se va a administrar se basa en el título de las partículas de virus. Un intervalo preferido del inmunógeno que se va a administrar es de 10^{5} a 10^{10} partículas de virus por mamífero, preferiblemente un ser humano.

En el caso de usar una combinación de un primer vector vírico recombinante que trasporta una secuencia de ácido nucleico de uno o más TAA y un segundo vector vírico recombinante que trasporta la secuencia de ácido nucleico de una o más moléculas inmunoestimuladoras, se puede inmunizar el mamífero con diferentes relaciones del primer y el segundo vector vírico recombinante. En una forma de realización, la relación del primer vector al segundo vector es aproximadamente de 1:1, o aproximadamente de 1:3, o aproximadamente de 1:5. Se pueden titular fácilmente las relaciones óptimas del primer vector al segundo vector usando los procedimientos descritos en el presente documento.

Tras la inmunización, se puede evaluar la eficacia de la vacuna por la producción de anticuerpos o células inmunes que reconozcan el antígeno, tal como se evaluó mediante la actividad lítica específica o producción específica de citoquina o mediante regresión del tumor. Una persona experta en la técnica sabrá los procedimientos convencionales para evaluar los parámetros anteriormente mencionados. Si el mamífero que se va a inmunizar padece ya cáncer o cáncer metastásico, se puede administrar la vacuna en conjunción con otros tratamientos terapéuticos.

En un procedimiento de tratamiento, se pueden obtener linfocitos citotóxicos autólogos o linfocitos que se infiltran en el tumor de un paciente con cáncer. Se hacen crecer los linfocitos en el cultivo y se expanden los linfocitos específicos de antígeno cultivándolos en presencia de antígeno específico y citoquina. A continuación se vuelven a infundir los linfocitos específicos de antígeno devolviéndolos al paciente.

La presente invención abarca los procedimientos para potenciar las respuestas de las células T específicas de antígeno mediante la administración de una cantidad efectiva de células huéspedes que comprenden un antígeno en un virus recombinante en combinación con una molécula inmunoestimuladora tal como B7 en un virus recombinante en un mamífero. Esta hipótesis de inmunización aumenta o potencia las respuestas inmunes generadas por el antígeno con estimulación simultánea mediante la molécula coestimuladora B7. La administración de un antígeno que contiene virus recombinante y un virus recombinante que contiene B7 da como resultado un aumento de la linfoproliferación específica de antígeno, actividad citolítica potenciada y una inmunidad de larga duración del antígeno en comparación con el uso de cualquier virus recombinante solo. En una forma de realización del procedimiento para potenciar respuestas de células T específicas de antígeno, se inmunizan mamíferos, preferiblemente seres humanos con rV-TAA y rV-B7. Se puede variar la relación de rV-TAA a rV-B7 para maximizar la respuesta de la célula T específica de antígeno. Las relaciones de rV-TAA a rV-B7 incluyen, pero no se limitan a 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, y similares. Se puede vigilar la eficacia del tratamiento in vitro y/o in vivo determinando la linfoproliferación específica de antígeno, la respuesta citolítica específica de antígeno, la regresión del tumor y similares.

La adición de cualquier cantidad de rV-B7 a un antígeno sin tener en cuenta la relación da como resultado una inmunidad celular mejorada. Sin embargo, se puede determinar una relación óptima de antígeno a rV-B7 para cada antígeno de interés. En una forma de realización, usar una relación rV-CEA a rV-B7 dio como resultado un aumento más fuerte en las respuestas linfoproliferativas, citotóxicas y antitumorales específicas de antígeno específicas para CEA que fue de 3:1.

Se puede usar el procedimiento para potenciar las respuestas de las células T específicas de antígeno para cualquier antígeno. De particular interés son los antígenos asociados a tumores y los antígenos de agentes infecciosos. En un procedimiento para potenciar las respuestas de las células T específicas de antígeno, rV-CEA y rV-B7-1 humano se administran a un paciente que alberga un carcinoma CEA positivo en una relación óptima para estimular las respuestas de las células T específicas de CEA dando como resultado la reducción o eliminación del carcinoma CEA positivo. En otro procedimiento para potenciar las respuestas de las células T específicas de antígeno, se administran rV-gp120 o porciones del mismo y rV-B7-1 humano a un paciente que alberga células gp120 positivas en una relación para estimular las respuestas de las células T específicas de gp120 dando como resultado la reducción o eliminación de las células gp120 positivas.

La presente invención abarca también la terapia de combinación. Por terapia de combinación se entiende que la composición de una célula huésped que comprende un virus recombinante que comprende uno o más genes que codifican uno o más antígenos asociados con uno o más agentes de la enfermedad y un virus recombinante que comprende uno o más genes que codifican una o más de las moléculas inmunoestimuladoras o ambos tipos de genes incorporados en el mismo vector se administran al paciente en combinación con otros inmunomoduladores o moléculas inmunoestimuladoras exógenas, fármacos quimioterapéuticos, antibióticos, fármacos antifúngicos, fármacos antivíricos y similares solos o en combinación de los mismos. Los ejemplos de otros agentes añadidos exógenamente incluyen IL-2, IL-6,
interferón, factor de necrosis tumoral, ciclofosfamida, y cisplatino, ganciclovir, anfotericina B exógenos y similares.

Otro aspecto de la presente invención es una composición para uso en el tratamiento del cáncer en la que las células cancerosas se infectan con el virus recombinante o combinación de virus recombinantes in situ o in vitro. Las células tumorales que expresan el antígeno asociado al tumor junto con una molécula inmunoestimuladora se administran a un mamífero en una cantidad efectiva para dar como resultado la reducción o eliminación del tumor en el mamífero que padece el cáncer.

Los anticuerpos anti-idiotípicos surgen normalmente durante el curso de las respuestas inmunes, y una porción del anticuerpo anti-idiotipo se parece al epitopo que indujo la respuesta inmune original. En la presente invención, el gen de la inmunoglobulina o porción del mismo de un anticuerpo cuyo emplazamiento de unión refleja un antígeno de un estado de enfermedad se incorpora en el genoma o porción del mismo de un virus, solo o en combinación con un gen o porción del mismo de una molécula inmunoestimuladora, el virus recombinante resultante es capaz de estimular la respuesta inmune celular y humoral en el antígeno.

Ejemplo 1 Construcción y caracterización de la construcción de rV-B7-1 y rV-B7-2 Materiales y procedimientos Virus Vaccinia recombinante

Un fragmento de ADN de 1.125 pb que codificaba el marco de lectura abierto completo de B7-1 de murino y un fragmento de ADN de 942 pb que codificaba el marco de lectura abierto completo de B7-2 de murino se amplificaron mediante la PCR de la transcriptasa inversa (Geneamp RNA PCR Kit, Perkin Elmer, Norwalk, CT) a partir del ARN total extraído de la línea de células B de murino, A20 (TIB 208, ATCC, Rockville, MD). Las secuencias de los insertos de B7 mostraron ser idénticas a las secuencias publicadas (Freeman, G.J. y col. J. Exp. Med. 174: 625-631, 1991; Freeman, G.J. y col. Science 262: 907-909, 1993). Los fragmentos de ADN se ligaron separadamente en los emplazamientos de los enzimas de restricción Kpn-1/Xho-1 del vector de transferencia PT116 del virus vaccinia, proporcionado por Therion Biologics (Cambridge, MA) que contiene el gen Lac Z de Escherichia coli para la selección de los virus recombinantes. Los virus recombinantes se derivaron tal como se ha descrito anteriormente (Kaufman, H. y col. Int. J. of Cancer 48: 900-907, 1991). Se seleccionaron los clones recombinantes mediante crecimiento en células BSC-1 (CC126, ATCC) en presencia de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta D galactosidasa (X-Gal). Los clones recombinantes azules apropiados se purificaron mediante 5 rondas de purificación en placa y se hicieron crecer en un lisado de mayor título. El virus para inoculación se hizo crecer en cultivos celulares con agitación centrífuga de células HeLa, aglomerados directamente mediante centrifugación, y se purificaron en gradientes de sacarosa al 20%-40% (Moss, B. Current Protocols in Molecular Biology 2.16.15.1-16. 18. 9, 1993).

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Caracterización de virus recombinante Análisis por transferencia Southern de la recombinación de ADN

Se analizaron los genomas de vaccinia recombinante mediante la extracción del ADN vírico, la digestión de la endonucleasa de restricción con HindIII, y el análisis por transferencia Southern tal como se ha descrito anteriormente (Kaufman, H. y col. Int. J. Cancer 48: 900-907, 1991).

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Análisis por transferencia Western de la expresión de la proteína

Se infectaron células BSC-1 confluentes tanto con virus vaccinia de tipo natural como con virus vaccinia recombinantes que contenían los genes B7-1 o B7-2 de murino (designados V-Wyeth, rV-B7-1 o rV-B7-2) a una MOI de 10 durante 4 horas. Se extrajo la proteína y se analizó tal como se ha descrito anteriormente (Kantor, J. y col. J. Nat'l Cancer Inst. 84: 1084-1091, 1992). Se detectó la proteína B7-1 p B7-2 recombinante incubando las transferencias western con anti-B7-1 (B7/BB1 de Rata-Anti ratón purificado) o anticuerpos monoclonales anti-B7-2 (B7-2 de Rata-anti-ratón (GL-1)) (Pharmingen, San Diego, CA), seguido por incubación de anticuerpos de Cabra-anti-rata conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP, Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) y desarrollado según las instrucciones del fabricante.

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Análisis fluorescente de la expresión de la proteína

Se infectaron células BSC-1 confluentes tanto con V-Wyeth, rV-B7-1 como con rV-B7-2 a una MOI de 10 durante 2 horas. Se cosecharon las células 3-6 horas después de la infección y se inmunotiñeron con anticuerpos monoclonales B7/BB1-FITC de Rata-Anti-ratón o B7-2 (GL-1)-FITC de Rata-anti-ratón. Se analizaron las células mediante citometría de flujo (FACSCAN, Becton Dickinson, San Jose, CA).

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Experimentos in vivo

El laboratorio del Dr. Steve Rosenberg (National Cancer Institute, Bethesda, MD) suministró la línea celular MC38 de adenocarcinoma colónico de murino (Fox, B.A. y col. J. Biol. Response Modifiers 9: 499-511, 1990). Se infectaron las células MC38 tanto con V-Wyeth, rV-B7-1 como con rV-B7-2 a una MOI de 0,25 durante 1 hora, se lavaron, y se suspendieron en HBSS a una concentración de 3 x 10^{6} células/ml. Se obtuvieron ratones C57BL/6 hembras de Taconic Farms (Germantown, NY). Se proporcionó a los animales de seis a 8 semanas de edad una inyección subcutánea de 100 \mul (3 x 10^{5} células infectadas) en el flanco derecho. Se inyectaron ratones control con células MC38 no infectadas. Los ratones que permanecieron libres de tumor durante al menos 40 días se estimularon en el flanco opuesto con 3 x 10^{5} células no infectadas. En un experimento paralelo, se irradiaron con radiación gamma ratones C57BL/6 (500 rad) y se inyectaron 24 horas después tanto con células MC38 no infectadas, como con células infectadas con una MOI de 0,25 de V-Wyeth, rV-B7-1 o rVB7-2. Se midieron los tumores mediante calibre en dos dimensiones, y se calcularon los volúmenes tal como se ha descrito anteriormente (Kantor, J. y col. J. Nat'l Cancer Instit. 84: 1084-1091, 1992).

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Ejemplo 2 Generación y caracterización de virus recombinante

Se obtuvieron los fragmentos de ADNc que codificaban los marcos de lectura abiertos de B7-1 y B7-2 de murino mediante PCR de la transcriptasa inversa usando los cebadores de oligonucleótidos 5' GGTACCATGGCTTG
CAATTGTCAGTTG 3' (SEC DE ID Nº: 1), 5' CTCGAGCTAAAGGAAGACGGTCTG 3' (SEC DE ID N.: 2), específicos de B7-1 y los cebadores 5' GGTACCGAAGCACCCACGATGGAC 3' (SEC DE ID Nº: 3), 5' CTCGAGT
CACTCTGCATTTGGTTTTGC 3' (SEC DE ID Nº: 4) específicos de B7-2 y se ligaron en el vector de transferencia PT116 del virus vaccinia. Este vector contiene un promotor temprano inmediato fuerte del virus vaccinia (designado P40) en la dirección 5' del emplazamiento de clonación múltiple para impulsar la síntesis del producto génico insertado. La ligadura y la orientación de los fragmentos de ADN de B7, así como la posición del promotor se verificaron mediante la PCR y la secuenciación. El constructo de vector quimérico se insertó en el emplazamiento HindIII M genómico del virus vaccinia mediante recombinación homóloga tal como se ha informado anteriormente (Kaufman H. y col. Int. J. Cancer 48: 900-907, 1991), y se confirmó mediante análisis de transferencia Southern con ADN de B7-1 o B7-2 radiomarcado con ^{32}P como una sonda (no se muestran los datos). Las secuencias de ADNc completo de B7-1 y B7-2 en los clones del virus vaccinia mostraron ser idénticas a las secuencias publicadas (Freeman, G.J. y col. J. Exp. Med. 174: 625-631, 1991; Freeman, G.J. y col. Science 262: 909-911, 1993).

Se confirmó la expresión de la proteína recombinante mediante el análisis de transferencia western de los extractos de proteínas de las células BSC-1 infectadas con rV-B7-1 o rV-B7-2. Estas células se usaron de manera rutinaria para la evaluación de los productos de vaccinia recombinantes (Moss, B. Current Protocols in Molecular Biology 2.16.15.1-16.18.9, 1993). La incubación de las transferencias de los extractos de proteínas de las células infectadas con rV-B7-1 con el anticuerpo monoclonal B7-BB1 de rata anti-ratón reveló una amplia banda de 50-90 kD. Similarmente, la incubación de las transferencias de los extractos de proteínas de las células infectadas con rV-B7-2 con el anticuerpo monoclonal B7-2 (GL-1) de rata anti-ratón reveló una banda que oscilaba desde 65-100 kD (no se muestran los datos). Esto es consistente con los informes que indican la masa molecular aparente de estas moléculas, que aparece como glicoproteínas que son heterogéneas como resultado de la glicosilación unida a N (Schwartz, R.H. Cell 71: 1065-1068, 1992; Freeman, G.J. y col. J. Exp. Med. 174: 625-631, 1991; Freeman, G.J. y col. Science 262: 907-909, 1993). Las células no infectadas o infectadas con V-Wyeth fueron negativas para la expresión de B7-1 y B7-2.

Se examinó la expresión superficial celular de las proteínas recombinantes B7-1 o B7-2 mediante citometría de flujo. La Figura 1A ilustra que las células BSC-1 no infectadas (Figura 1A) no reaccionan tanto con los anticuerpos B7(BB1) como con los B7-2 (G1-1) (el 98,5% de las células son negativas con una fluorescencia promedio de 5,22). Similarmente, las células infectadas con vaccinia de tipo natural (V-Wyeth, Figura 1B), fracasaron en reaccionar con cualquiera de estos dos anticuerpos (el 97,7% de las células son negativas con una fluorescencia promedio de 5,43). Las células BSC-1 infectadas con rV-B7-1 (Figura 1C) reaccionan fuertemente con el anticuerpo B7/BB1 (el 97,5% de las células son positivas con una fluorescencia promedio de 2153,68). Las células infectadas con rV-B7-2 (Figura 1D) reaccionan fuertemente con el anticuerpo B7-2 (G1-1) (el 98,8% de las células son positivas con una fluorescencia promedio de 1802,30). No hubo reactividad entre el anticuerpo B7/BB1 y las células infectadas con rV-B7-2, y no hubo reactividad del anticuerpo GL-1 con las células infectadas con rV-B7-1. Estos estudios demuestran de esta manera que un virus vaccinia recombinante puede expresar las moléculas B7-1 y B7-2 sobre la superficie celular a las 3-6 horas después de la infección. No se produce normalmente la lisis de las células infectadas durante 24-48 horas (Moss, B. Current Protocols in Molecular Biology 2.16.15.1-16.18.9, 1993).

Se ha demostrado anteriormente que la inyección de 3 x 10^{5} células MC38 de adenocarcinoma de murino subcutáneamente en ratones C57BL/6 singénicos proporciona un aumento de los tumores palpables en los 7 a 14 días seguido por un rápido crecimiento que es fatal en último extremo (Kantor, J. y col. J. Nat'l Cancer Inst. 84:1084-1091, 1992). Estas células tumorales han demostrado también ser negativas para la expresión funcional de B7, (Chen, L. y col. J. Exp. Med. 179:523-532, 1992). Para ensayar los constructos de vaccinia recombinantes para la expresión funcional de B7, se comparó el crecimiento de las células tumorales MC38 con el de las células MC38 infectadas con rV-B7-1, rV-B7-2, y V-Wyeth de tipo natural (Figuras 2A-2D). La inyección de células MC38 no infectadas (Figura 2A) dio como resultado tumores palpables en todos los animales en 7 días. El crecimiento tumoral fue progresivo a lo largo de la duración de este experimento. Se sacrificó a los animales en todos los experimentos cuando cualquier medida del tumor (longitud o anchura) excedió de 20 mm. La inyección de células MC38 infectadas durante 1 hora con una MOI de 0,25 de V-Wyeth (Figura 2B) dio como resultado un ligero retraso del comienzo del tumor palpable, y todos los animales eventualmente se volvieron positivos para el tumor (en un animal en la Figura 2B creció un tumor intraperitoneal que no se pudo medir). Se escogió la MOI de 0,25 para todos los grupos debido a que las infecciones con más de esta cantidad dieron como resultado niveles mayores de muerte celular no específica dando como resultado un crecimiento más lento del tumor. La inyección de células MC38 infectadas con una MOI de 0,25 de rV-B7-1 (Figura 2C) o rV-B7-2 (Figura 2D) fracasó en inducir tumores en cualquier ratón, que permaneció libre de tumor durante la duración de este experimento.

La expresión de la proteína recombinante de las células infectadas a esta MOI se confirmó mediante citometría de flujo. Tras la infección con una MOI de 0,25 de virus recombinante, aproximadamente un 35% de células MC38 fueron positivas para cualquier B7-1 o B7-2 recombinante con una fluorescencia media promedio que oscilaba entre 417-585. Las células MC38 tanto no infectadas como infectadas con una MOI de 0,25 de V-Wyeth permanecieron negativas para la expresión de B7-1 o B7-2. Estas células MC38 fueron positivas para la expresión del antígeno MHC de tipo I antes y después de la infección. No se observaron efectos tóxicos brutos en cualquiera de estos animales durante el día 40 del panel de observación. Los pesos de los animales permanecieron comprendidos dentro de una desviación estándar de ratones normales emparejados por edad. Estos experimentos se repitieron 3 veces más con resultados similares.

Se llevaron a cabo estudios para determinar si el rechazo al tumor es dependiente en un sistema inmune intacto. En estos estudios, se inmunosuprimieron los ratones mediante radiación (véase los materiales y procedimientos del Ejemplo 1) y se administraron células tumorales infectadas con MC38 (Tabla 1). Los tumores en ratones irradiados infectados con V-Wyeth, rV-B7-1 o rV-B7-2 fueron medibles 14 días después del trasplante del tumor y no se observaron diferencias en los volúmenes de tumor, indicando que es necesario un sistema inmune intacto para responder a las moléculas B7 recombinantes.

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TABLA 1 Crecimiento de tumor infectado con MC38 en ratones irradiados (14 días después del trasplante del tumor)

1

En sistemas que usan vectores retrovíricos para la introducción de genes B7, se ha demostrado que la administración concurrente a ratones de células tumorales que expresan B7 en un flanco y la administración de células tumorales B7 negativas en el flanco opuesto podrían evitar el crecimiento de ambas poblaciones de tumores (Chen, L. y col. Cell 71: 1093-1102, 1992). En otros estudios, se demostró la actividad antitumoral en células B7 negativas mediante múltiples inyecciones intraperitoneales de células tumorales que expresaban B7 diez días después de la administración subcutánea de un tumor primario B7 negativo (Li, Y. y col. J. Immunol 153: 421-428, 1994). El estudio descrito aquí se diseñó para determinar si se podría inducir una inmunidad de larga duración en células tumorales mediante inmunización con células tumorales infectadas con rV-B7. Ratones a los que se habían administrado células MC38 infectadas con rV-B7-1 o rB-B7-2 permanecieron libres de tumores durante al menos 40 días (Figuras 2C y 2D) y a continuación se estimularon en el flanco opuesto con 3 x 10^{5} células MC38 no infectadas (B7 negativas) (Figuras 3B y 3C). La inyección de estas células MC38 en crías de ratón (Figura 3A) dio como resultado la formación de tumor palpable en todos los animales a los 7 días, con crecimiento progresivo del tumor a lo largo de la duración de este experimento. El volumen promedio del tumor en este grupo control a los 21 días después del trasplante del tumor fue de 2436 \pm 858 mm^{3}. Los ratones a los que se había administrado anteriormente de los 40 días tumor infectado con rV-B7-1 se estimularon también con células MC38 no infectadas (Figura 3B). La formación de estos tumores se retrasó, y la velocidad de crecimiento se redujo sustancialmente, con un volumen promedio del tumor de 372 \pm 106 mm' en el día 21. Similarmente, los ratones a los que se habían administrado tumores infectados con rV-B7-2, cuando se estimularon con células MC38, mostraron una reducción sustancial en el crecimiento de las células tumorales. El volumen promedio del tumor en este grupo fue de 197 \pm 161 mm' en el día 21. El crecimiento del tumor se redujo de esta manera en > 90% en los animales que recibieron anteriormente tumores que expresaban B7-1 o B7-2 mediante infección con virus vaccinia recombinante. Esto fue de interés a la luz del hecho de que únicamente se administró una inmunización 40 días antes del estímulo del tumor y de que los ratones se estimularon con un peso relativamente grande de tumor. Esto implica que se está induciendo una memoria de la respuesta inmune contra un rechazo del antígeno en células tumorales MC38 mediante la inyección de células tumorales infectadas con rV-B7. Se puede modificar el procedimiento anterior de tratamiento para incluir múltiples inoculaciones con células tumorales que expresan B7, y el potenciamiento
de la activación de las células T con moléculas inmunoestimuladoras que incluyen citoquinas tales como IL-2.

Estudios anteriores han demostrado que la introducción de B7 en células tumorales mediante transducción con vectores retrovíricos tales como PLNSX, PLNCX o PLXSN puede conferir inmunogenicidad a aquellos tumores (Chen, L. y col. J. Exp. Med. 179: 523-532, 1994; Dohring, C. y col. Int. J. Cancer 57: 754-759, 1994). Estos procedimientos de introducción de B7 tienen una limitación potencial para las aplicaciones clínicas debido a una eficiencia relativamente baja de infección de los vectores retrovíricos y a la consiguiente cantidad prolongada de tiempo requerido para seleccionar el fármaco y expandir las células tumorales B7 positivas. Como alternativa, los estudios informados aquí han demostrado el desarrollo de virus vaccinia recombinantes que expresan los genes de las moléculas coestimuladoras B7-1 y B7-2. Estos constructos de vaccinia recombinantes infectan las células tumorales rápidamente (1-4 horas) y expresan la proteína recombinante con elevada eficiencia (un 97% de células, Figuras 1C y 1D, respectivamente). Las células infectadas mostraron sintetizar auténticamente las proteínas recombinantes, conduciendo a efectos antitumorales. Estos estudios presentan de esta manera datos en un sistema experimental para la inserción de genes B7 en los vectores del virus vaccinia con implicaciones para las potenciales aplicaciones inmunoterapéuticas.

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Ejemplo 3 Inducción de respuesta inmune potenciada de las células T en un antígeno asociado a tumor humano mezclando un virus vaccinia recombinante que expresa el antígeno asociado al tumor con un virus vaccinia recombinante que expresa la molécula B7 coestimuladora

La presente invención comprende una composición de rV-B7 en combinación con un virus vaccinia recombinante que expresa un antígeno asociado a tumor humano. La composición de la presente invención cuando se inocula simultáneamente en un huésped potencia la respuesta inmune sistémica de las células T en la del antígeno asociado al tumor humano.

Se han identificado ahora diversos antígenos asociados a tumor humano. Uno de estos es el antígeno carcinoembriónico humano (CEA) que se expresa en una gama de carcinomas humanos que incluyen los cánceres colorrectal, gástrico, de páncreas, de mama y de pulmón de células no pequeñas. Se ha demostrado anteriormente que se puede administrar un constructo CEA de vaccinia recombinante designado rV-CEA a ratones y monos Rhesus e inducir respuestas de las células T específicas de CEA en ambos sistemas modelo (Kantor J. y col., J. Natl. Cancer Inst. 84: 1084-1091, 1992; Kantor J. y col., Cancer Res. 52: 6917-6925, 1992). Más aún, no se observó toxicidad en ninguno de los sistemas. Recientemente, se ha completado un ensayo clínico en el que se administró rV-CEA a pacientes con carcinoma gastrointestinal, de mama o de pulmón metastásicos. En este estudio en Fase I no se observó más toxicidad de la que se observaría con la administración de la vacuna antivariólica.

Una forma de realización es la inserción de los genes B7 y CEA en el mismo constructo de vaccinia recombinante debido a que ambas moléculas necesitan expresarse en la misma célula en el mismo momento. Otra forma de realización es la mezcla de un rV-CEA con un rV-B7 para potenciar específicamente la respuesta inmune de las células T en CEA. Las ventajas de este último enfoque son de varios tipos: (a) se pueden ensayar diferentes relaciones de rV-CEA y rV-B7 para determinar la relación para una respuesta inmune óptima, (b) se puede alterar la pauta de administración de rV-CEA y rV-B7, (c) sólo se necesita fabricar un constructo de rV-B7, es decir, se puede usar también el rV-B7 empleado con rV-CEA con un constructo de rV que codifica otros antígenos asociados a tumor y en vez de cualquier otro antígeno asociado con un agente de la enfermedad para el potenciamiento de una respuesta inmune.

En una forma de realización, se demostró que la simple mezcla de rV-CEA con rV-B7 y la administración simultánea en el huésped condujo a una respuesta inmune potenciada de las células T específica de CEA. Además, las relaciones de rV-CEA y rV-B7 fueron importantes factores en la magnitud de la respuesta inmune.

En el primer estudio, se mezclaron rV-CEA y rV-B7 en relaciones uno a uno, es decir 5 x 10^{6} ufp de rV-B7 y 5 x 10^{6} ufp de rV-CEA se mezclaron y administraron simultáneamente a grupos de tres ratones mediante escarificación de la cola. Se retiraron los bazos 14 días después de la inmunización como una fuente de linfocitos. Como controles, se usaron otros tres grupos de ratones: (a) ratones no vacunados, (b) ratones que recibieron 5 x 10^{6} ufp de rV-CEA y 5 x 10^{6} ufp de vaccinia de tipo natural (designada V-Wyeth), y (c) ratones que recibieron 5 x 10^{6} ufp de V-Wyeth y 5 x 10^{6} ufp de rV-B7. De esta manera, todos los ratones vacunados recibieron un total de 10^{7} ufp de virus vaccinia y en los tres grupos, las relaciones de los virus vaccinia fueron de 1 a 1. Como se puede observar en la Figura 4, tras una administración de rV-CEA más V-Wyeth, los ratones organizan una respuesta inmune específica de CEA, aunque pequeña. El ensayo inmune empleado fue un ensayo linfoproliferativo que se había descrito anteriormente (Kantor y col., J. Natl. Cancer Inst., 84: 1084-1092, 1992) y el antígeno diana usado fue CEA recombinante derivado de baculovirus. Tal como se puede observar en la Figura 4, la adición de rV-B7 a rV-CEA potenció la respuesta inmune específica varias veces. Por el contrario, la adición de rV-B7 al V-Wyeth control no tuvo efecto sobre el potenciamiento de la respuesta inmune específica de CEA.

En el siguiente estudio se modificó la relación de rV-CEA a rV-B7 hasta 1 a 3. Tal como se muestra en la Figura 5, la administración de rV-CEA más rV-B7 en la relación 1:3 potenció la respuesta de las células T específicas de CEA en comparación con rV-CEA más V-Wyeth, y en una extensión mayor que cuando se mezclaron los dos constructos (rV-B7 más rV-CEA) en una relación 1:1. De nuevo, los dos grupos control, es decir, sin vacunación y rV-B7 mezclado con V-Wyeth no mostraron respuesta inmune a CEA.

Estos resultados indican que mezclar simplemente un rV que contiene un gen asociado a ser humano con rV-B7 puede conducir a la infección simultánea y a la expresión simultánea en las células que presentan antígenos de tal manera que se potencian las respuestas específicas de las células T para el antígeno asociado a tumor humano. Además, parece que las relaciones de rV-B7 y el gen asociado a ser humano que contiene rV usadas pueden ser un importante factor en la optimización de la activación de las células T en un producto génico asociado a tumor humano o en vez de cualquier otro producto génico que se desea que induzca o potencie la inmunidad.

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Ejemplo 4 Respuestas linfoproliferativas de las células T de ratón en CEA tras la inmunización con rV-CEA+rV-B7 Respuestas linfoproliferativas

Se inmunizaron ratones C57BL/6 con 1 x 10^{7} ufp de virus total con diversas relaciones tanto de: V-Wyeth; rV-CEA:V-Wyeth; V-Wyeth:rV-B7; como de rV-CEA:rV-B7, y se analizó la linfoproliferación específica de CEA tal como se ha descrito anteriormente (Kantor, J. y col J. Nat'l Cancer Inst. 84: 1084-1091, 1992). De manera breve, se retiraron los bazos 14 días después de la inmunización y se dispersaron mecánicamente a través de filtros celulares de 70 \mum (Falcon, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) para aislar suspensiones celulares únicas. Se eliminaron los eritrocitos y las células muertas mediante centrifugación en un gradiente Ficoll-Hypaque (densidad = 1,119 g/ml) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Se obtuvieron poblaciones constituidas por aproximadamente 95% de células T mediante el paso de células mononucleares esplénicas por columnas de lana de nylon (Robbins Scientific Corp., Sunnyvale, CA). Para evaluar la linfoproliferación específica de CEA, se añadieron células T a 10^{5}/pocillo en placas de fondo plano de 96 pocillos (Costar, Cambridge, MA). Se añadieron células que presentaban antígenos constituidos por esplenocitos singénicos de crías irradiadas (2000 rads) a 5 x 10^{5}/pocillo. Los pocillos estimulados recibieron CEA humano (100-12,5 \mug/ml) (Vitro Diagnostics, Denver, CO); ovoalbúmina como control negativo (100 \mug/ml); V-Wyeth inactivado por UV (2 x 10^{7} ufp/ml) así como antígeno de recuerdo o Con-A (2 \mug/ml) así como células T como control positivo. Los pocillos control recibieron células T, APC y únicamente medios. Se cultivaron las células en los pocillos en un volumen total de 200 \mul de medios completos (CM), [RPMI 1640 con suero de ternera fetal (10%); glutamina (2 mM), piruvato de sodio (1 mM), Hepes (7 mM), gentamicina (50 \mug/ml), 2-mercaptoetanol (50 \muM), y aminoácidos no esenciales (0,1 mM), (Biofluids, Rockville, MD)] durante 5 días. Se marcaron las células para las 12-18 h finales de la incubación con 1 \muCi/pocillo de [^{3}H]timidina (New England Nuclear, Wilmington, DE) y se cosecharon con un cosechador celular PHD (Cambridge Technology, Cambridge, MA). Se midió la radioactividad incorporada mediante recuento por centelleo líquido (LS 6000IC; Beckman, Duarte, CA). Se promediaron los resultados de los pocillos por triplicado y se informaron como índice de estimulación (SI) que se calculó: SI = [CPM (pocillos estimulados)]/[CPM (pocillos control)].

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Análisis linfoproliferativo

Para determinar si la inmunización con una premezcla de rV-CEA y rV-B7 podría dar como resultado respuestas linfoproliferativas potenciadas específicas de CEA, se inmunizaron ratones C57BL/6 una vez con un total de 10^{7} ufp de rV-CEA:V-Wyeth, V-Wyeth: rV-B7, o rV-CEA:rV-B7, a cualquiera de las relaciones 1:1, 1:3, o 3:1 (véase la Tabla 2) y se analizaron las respuestas linfoproliferativas tras 14 días. La Tabla 2 muestra que las células T de ratones que no recibieron inmunización fracasaron en responder al CEA modificado, mientras que las células T de ratones inmunizados con rV-CEA:V-Wyeth respondieron débilmente (índice de estimulación [SI] de 1,9-2,5). Pareció que la respuesta a CEA estaba relacionada con la dosis de rV-CEA proporcionada durante la inmunización. Las células T de los ratones inmunizados con todas las relaciones de V-Wyeth:rV-B7 fracasaron en responder a CEA. En contraste, las células T de ratones inmunizados con cualquier relación de rV-CEA:rV-B7 parecieron tener una respuesta aumentada a CEA en comparación con las cohortes que no recibieron rV-B7 con su inmunización (Tabla 2). La inmunización de rV-CEA:rV-B7 (3:1) fue óptima para la inducción de la linfoproliferación en este experimento (SI de 12,3). Los experimentos en los que se alteraron las relaciones de Rv-CEA:rV-B7 (3:1, 1:1, 1:3) se llevaron a cabo 4 veces, y en cada caso, la relación 3:1 proporcionó el mayor aumento en las respuestas de las células T específicas de CEA. Para examinar adicionalmente la extensión de la respuesta inmune celular específica de CEA, se inmunizaron los ratones 1 vez con rV-CEA:V-Wyeth (3:1); V-Wyeth:rV-B7 (3:1); o rV-CEA:rV-B7 (3:1) y se analizaron las respuestas linfoproliferativas como anteriormente.

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TABLA 2 Respuestas linfoproliferativas de células T de ratón a CEA tras la inmunización con diversas relaciones de rV-CEA + rV-B7

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TABLA 2 (continuación)

3

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La Tabla 3 muestra que las células T procedentes de ratones que no recibieron inmunización fracasaron en responder a CEA purificado a cualquier concentración, o a V-Wyeth inactivado con UV. Las células T procedentes de ratones inmunizados con V-Wyeth respondieron a UV-V-Wyeth con un fuerte índice de estimulación (31,7), fracasando a la vez en proliferar en respuesta a CEA. Por el contrario, las células T procedentes de ratones inmunizados con rV-CEA:V-Wyeth (3:1) proliferaron cuando se cultivaron con CEA de una manera dependiente de la dosis (índice de estimulación de 4,5-1,6). Las células T procedentes de ratones inmunizados sólo con rV-B7 (V-Wyeth:rV-B7) fracasaron en responder a CEA. Finalmente, las células T procedentes de ratones inmunizados con la combinación de rV-CEA y rV-B7 (3:1) proliferaron en respuesta al antígeno CEA de una manera dependiente de la dosis (SI = 18,6-3,0). Este índice de estimulación representa un aumento mayor de 4 veces en las respuestas proliferativas específicas de CEA tras la adición de rV-B7. Las células T de cada grupo respondieron al Con A control mitógeno del linfocito, y fracasaron en reaccionar con el control negativo del antígeno de ovoalbúmina.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Respuestas linfoproliferativas de las células T de ratón a CEA tras la inmunización con una relación 3:1 de rV-CEA + rV-B7

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Ejemplo 5 Expresión doble de CEA y B7-1 en células infectadas con rV-CEA y rV-B7 Procedimientos de citometría de flujo

Se usó citometría de flujo bicolor para demostrar la doble infección de las células in vitro con rV-CEA y rV-B7. Se infectaron células BSC-1 confluentes (CCI 26, ATCC, Rockville, MD) durante 2 horas con una mezcla 3:1 de cualquiera de rV-CEA:rVB7, rV-CEA:V-Wyeth, V-Wyeth:rV-B7, o V-Wyeth sólo, a una MOI total de 5. Se cosecharon las células 18 h después de la infección y se tiñeron con una combinación de mAb de B7-1 de rata anti-ratón conjugado con PE (Pharmingen, San Diego, CA) y mAb COL-1 de anti-CEA conjugado con FITC (36) y mAb control emparejado por isotipo conjugado con PE (Pharmingen). El mAb de COL-1 se conjugó con FITC usando un procedimiento normalizado (37). Se analizó la fluorescencia celular usando un FACSCAN (Becton Dickinson, Mountain View, CA) con el software Lysis II.

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Análisis citrométrico de flujo: expresión doble de CEA y B7 recombinante

Debido a que se ha propuesto que el antígeno y B7-1 deben expresarse en estrecha proximidad entre sí para encastrar simultáneamente los receptores de las células T y CD28 (Jenkins, M.K. y col Current Opinion in Immunol. 5: 361-367, 1993; Hathcock, K.S. y col J. Exp. Med. 180: 631-640, 1994; Hellstrom, K.E. y col Ann. NY Acad. Sci. 690: 225-230, 1993; Harding, F.A. y col J. Exp. Med. 177: 1791-1796, 1993), se determinó si la infección de las células con una mezcla de rV-CEA y rV-B7 podría conducir a la expresión doble de CEA y B7-1 en la superficie celular. Para determinar la expresión doble, se infectaron células BSC-1 con una mezcla 3:1 de rV-CEA:V-Wyeth, V-Wyeth:rV-B7, o rV-CEA:rV-B7 o V-Wyeth solo, y se analizaron mediante citometría de flujo bicolor. Las células infectadas con V-Wyeth; demostraron sólo niveles de fondo de la tinción (Figura 6A); mientras que las células infectadas con rV-CEA:V-Wyeth fueron positivas principalmente para CEA (Figura 6B). Similarmente, las células infectadas con la mezcla de V-Wyeth:rV-B7 fueron positivas principalmente para B7-1 (Figura 6C). Las células infectadas simultáneamente con rV-CEA:rV-B7, sin embargo, fueron positivas para CEA y B7-1 (Figura 6D).

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Ejemplo 6 Aumento de citotoxicidad específica de CEA tras la inmunización con rV-CEA:rV-B7 Procedimientos de respuesta citolítica

Se inmunizaron ratones tal como se describe en el Ejemplo 4 y se analizó la actividad citolítica específica de CEA tal como se ha descrito anteriormente (Kantor, J. y col J. Nat'l Cancer Inst. 84:1084-1091, 1992). De manera breve, se retiraron los bazos 14 días después de la inmunización, se dispersaron en suspensiones celulares únicas, y se llevaron sobre gradientes Ficoll-Hypaque. El laboratorio del Dr Steve Rosenberg (National Cancer Institute, Bethesda, MD) suministró la línea celular MC38 de adenocarcinoma colónico de murino (Fox, B.A. y col J. Bio. Resp. Modifiers 9:499-511, 1990). Se ha descrito la línea celular derivada que expresa CEA humano, MC-38-CEA-2 (Robbins, P.F. y col Cancer Res. 51: 3657-3662, 1991). Se prepararon estas células tumorales para uso como dianas en un ensayo citolítico normalizado (Wunderlich, J. y col Current Protocols in Immunology, Colligan, J.E. y col (eds) 3.11.1-3.11.14, 1994) utilizando ^{111}In. De manera breve, las células tumorales (1-2 X 10^{6}) se radiomarcaron con 50 \muCi de solución de oxiquinolina marcada con ^{111}In (Amersham, Arlington Heights, IL) durante 20 min a 37ºC seguido por un lavado vigoroso para eliminar el radionucleido incorporado. Los linfocitos esplénicos y las dianas (5 x 10^{3} células/pocillo) se suspendieron en medio CTL (medio completo con RPMI-1640:EHAA 50:50, Biowhittaker, Walkersville, MD, sustituido para el RPMI-1640) y se combinaron en relaciones de efector a diana de 100:1 a 12,5:1 en placas de fondo en U de 96 pocillos (Costar) y se incubaron durante 16 horas a 37ºC con CO_{2} al 5%. Tras la incubación, se recogieron los sobrenadantes usando un Sistema de Recogida del Sobrenadante (Skantron, Sterling, VA) y se cuantificó la radioactividad usando un contador gamma (Cobra Autogamma, Packard, Downers Grove, IL). Se determinó el porcentaje de liberación específica de ^{111}In mediante la ecuación normalizada: % de lisis específica = [(experimental-espontánea)/(máxima-espontánea)] x 100.

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Análisis de células T citotóxicas: Aumento de la citotoxicidad específica de CEA tras la inmunización con rV-CEA:rV-B7

Para analizar el efecto de la adición de rV-B7 y rV-CEA sobre la actividad citotóxica de CEA, se ensayaron los linfocitos esplénicos de ratones inmunizados con la mezcla de rV-B7 y rV-CEA para la actividad lítica con células de adenocarcinoma de murino que fueron negativas para CEA (MC38) o las mismas células transducidas con CEA usando un vector retrovírico para expresar CEA humano (MC-38-CEA-2). La Figura 7 demuestra que las células T de ratones inmunizados una vez con rV-CEA:V-Wyeth (3:1) no lisan las dianas MC38 CEA negativas, (triángulos cerrados), pero lisan las dianas MC-38-CEA-2 CEA positivas (triángulos abiertos) aunque a un nivel bajo. Esta lisis específica de CEA fue dependiente de la relación E:T, disminuyendo la lisis hasta un 10% a la relación E:T de 12,5:1. La adición de rV-B7 al rV-CEA inmunógeno (rV-CEA:rV-B7; 3:1) no tuvo efecto sobre la lisis de las células MC38 (círculos cerrados), pero tuvo un sustancial efecto sobre la lisis específica de CEA de las dianas MC-38-CEA-2. Basándose en la conversión de los datos a unidades líticas, la actividad CTL de los ratones inmunizados con rV-CEA:rV-B7 (3:1) presentó un aumento de 2,8 veces cuando se la comparó con los ratones inmunizados sólo con rV-CEA.

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Ejemplo 7 Efectos antitumorales de rV-B7 premezclado con rV-CEA Procedimiento

Se inmunizaron diez ratones C57BL/6 con 1 x 10^{7} ufp de virus total. Catorce días después de la inmunización, se proporcionó a los ratones una inyección subcutánea de 3 x 10^{5} de células MC-38-CEA-2 en el flanco derecho. Los ratones procedentes del grupo rV-CEA:rV-B7 (3:1) que permanecieron libres de tumor durante al menos 60 días se estimularon en el flanco opuesto con 3 x 10^{5} células MC-38-CEA-2. Se midieron los tumores mediante calibre en dos dimensiones, y se calcularon los volúmenes tal como se ha descrito anteriormente (Kantor, J. y col J. Nat'l Cancer Inst. 84: 1084-1091, 1992). Se sacrificaron los animales en todos los experimentos cuando cualquier medida del tumor (longitud o anchura) excedió de 20 mm.

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Efectos antitumorales de rV-B7 premezclado con rV-CEA

Se ha demostrado anteriormente que la administración de 3 x 10^{5} células MC-38-CEA-2 de adenocarcinoma de murino subcutáneamente en ratones C57BL/6 singénicos proporciona un aumento de los tumores palpables en los 7-14 días tras el crecimiento rápido del tumor que es fatal en último extremo (Kantor, J. y col J. Nat'l Cancer Inst. 84: 1084-1091, 1992). Se ha mostrado también que se requieren 3 inmunizaciones con 1 x 10^{7} ufp de rV-CEA para proteger al 100% de los ratones de este estímulo tumoral (Kantor, J. y col J. Nat'l Cancer Inst. 84: 1084-1091, 1992). Para determinar si la inmunización con la relación 3:1 de rV-CEA y rV-B7 podría proteger los animales del estímulo tumoral, los autores compararon el crecimiento de células tumorales MC-38-CEA-2 en ratones C57BL/6 inmunizados sólo una vez con un total de 10^{7} ufp de cualquiera de V-Wyeth, rV-CEA:V-Wyeth (3:1); V-Wyeth:rV-B7 (3:1); o rV-CEA:rV-B7 (3:1). La inyección de células MC-38-CEA-2 (Figura 8A) dio como resultado tumores palpables en los diez animales inmunizados con V-Wyeth en los 14 días. El crecimiento del tumor fue progresivo a lo largo de la duración de este experimento. La inyección de células MC-38-CEA-2 en los animales inmunizados con rV-CEA:V-Wyeth (3:1; Figura 8B) dio como resultado un ligero retraso del comienzo del tumor palpable, y el 70% de los animales se volvió positivo para el tumor. La inyección de células MC-38-CEA-2 en los animales inmunizados con V-Wyeth:rV-B7 (3:1; Figura 8C) dio como resultado tumores palpables en 14 días con un crecimiento del tumor asemejándose estrechamente con el grupo control inmunizado con V-Wyeth (Figura 8A). Por el contrario, un 80% de ratones inmunizados una vez con rV-CEA:rV-B7 (3:1; Figura 8D) fracasó en el desarrollo de tumores. Los ratones negativos al tumor (n = 8) permanecieron libres de tumor durante la duración de este experimento (60 días). No se observaron efectos tóxicos brutos en ninguno de estos animales durante el periodo de observación. Los pesos de los animales permanecieron comprendidos dentro de una desviación estándar de ratones normales emparejados por edad. Estos experimentos se repitieron 3 veces más con resultados similares.

Para determinar si se podría inducir una inmunidad de larga duración en las células tumorales mediante la inmunización con esta combinación de rV-CEA:rV-B7 (3:1), ratones inmunizados con esta relación de virus recombinantes, que permanecieron libres de tumor durante al menos 60 días (Figura 8D), se volvieron a estimular a continuación en el flanco opuesto con 3 x 10^{5} células MC-38-CEA-2 (Figura 9B). La inyección de células MC-38-CEA-2 en crías de ratón control (Figura 9A) dio como resultado la formación de tumores palpables en todos los animales en los 14 días, con crecimiento progresivo del tumor a lo largo de la duración de este experimento, mientras que los ratones administrados anteriormente con rV-CEA:rV-B7 (3:1) no desarrollaron tumores a lo largo del periodo de observación de 49 días más (Figura 9B).

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Ejemplo 8 Construcción y caracterización de rV-PSA Virus vaccinia recombinante

Se amplificó un fragmento de ADN de 786 pb que codificaba el marco de lectura abierto completo del antígeno específico de la próstata humana mediante PCR de la transcriptasa inversa (GeneAmp RNA PCR Kit, Perkin Elmer, Norwalk, CT) a partir del ARN total extraído de la línea celular de adenocarcinoma de próstata metastásico humano LNCaPFGC (CRL 1740, American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD).La secuencia de aminoácidos predicha derivada de la secuencia de codificación de PSA mostró ser casi idéntica a la secuencia publicada (Lundwall y col, FEBS Letters 214: 317-322, 1987) difiriendo sólo en un cambio de asparagina a tirosina en la posición 220. El fragmento de ADN de PSA, que contenía la secuencia de codificación completa de PSA, 41 nucleótidos de la región 5' no traducida, y 520 nucleótidos de la región 3' no traducida, se unieron en el emplazamiento de restricción XbaI del vector de transferencia pT116 del virus vaccinia. El plásmido resultante, designado pT1001, contenía el gen PSA bajo el control del promotor 40K del virus vaccinia (Gritz y col, J. Virology 64: 5948-5957, 1990) y el gen Lac Z de Escherichia coli bajo el control del promotor C1 del virus de la difteroviruela aviar (Jenkins y col, AIDS Research and Human Retroviruses 7: 991-998, 1991). Los genes extraños estaban flanqueados por secuencias de ADN procedentes de la región HindIII M del genoma de vaccinia. Se usó un aislado purificado de placa procedente de la cepa Wyeth (New York City Board of Health) de vaccinia como virus parental en la construcción del virus vaccinia recombinante. La generación del virus recombinante se llevó a cabo mediante recombinación homóloga entre las secuencias de vaccinia en el genoma de Wyeth de vaccinia y las secuencias correspondientes en pT1001 en células RK13 infectadas con vaccinia (CCL 37, ATCC) transfectadas con PT1001. Se identificaron los clones recombinantes y se seleccionaron mediante el crecimiento de células RK13 (CCL 37, ATCC) en presencia de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranósido (X-Gal) tal como se ha descrito anteriormente (Panicali y col, Gene 47: 193-199, 1986; Kaufman y col, Int. J. Cancer 48: 900-907, 1991). Se purificaron los clones recombinantes azules apropiados mediante cuatro rondas de purificación en placa. Se prepararon almacenamientos víricos clarificando lisados de células RK13 infectadas seguido por centrifugación a través de una almohadilla d sacarosa al 36%.

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Análisis por transferencia Southern de la recombinación de ADN

Se analizó el genoma de vaccinia recombinante mediante la extracción del ADN vírico, digestión mediante endonucleasa de restricción con HindIII y ClaI, y transferencia Southern tal como se ha descrito anteriormente (Kaufman y col, Int. J. Cancer 48: 900-907, 1991).

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Análisis por transferencia Western de la expresión de la proteína PSA

Se infectaron células BSC-40 confluentes tanto con virus vaccinia de tipo natural parental (designado V-Wyeth) como con vaccinia-PSA recombinante (designado rV-PSA) a una MOI de 1 en Medio Eagle Modificado por Dulbecco que contenía suero bovino fetal al 2%. Tras infección durante la noche, se separó el medio de las células, y se precipitó una alícuota con metanol para ensayar la presencia de PSA segregado. Se lisaron las células infectadas en tampón de lisis hipotónico (NaCl 150 mM, EDTA al 0,05%, KCl 10 mM, PMSF 1 mM) y a continuación se sonicaron. Los lisados celulares y los medios de cultivo se sometieron a electroforesis en un gel de SDS-acrilamida al 10%. Las proteínas se transinmunotransfirieron con nitrocelulosa, y se incubó la transferencia con un anticuerpo de conejo específico de PSA (PO798, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) durante 4 horas a temperatura ambiente, se lavaron, y a continuación se incubaron con anticuerpo secundario marcado con fosfatasa de cabra anti-conejo (AP, Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) y se desarrollaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

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Caracterización de virus recombinante (rV-PSA)

Se obtuvo el fragmento de ADNc que codificaba el marco de lectura abierto de PSA humano mediante PCR de la transcriptasa inversa usando los cebadores de oligonucleótidos 5' TCTAGAAGCCCCAAGCTTACCACCTGCA 3' (SEC DE. ID Nº: 5), 5'TCTAGATCAGGGGTTGGCCACGATGGTGTCCTTGATCCACT 3', (SEC DE. ID Nº: 6) específicos de PSA, y se unieron en el vector de transferencia pT116 del virus vaccinia. Este vector contiene un promotor temprano/tardío fuerte del virus vaccinia (designado 40K) en la dirección 5' del emplazamiento de clonación múltiple para impulsar la síntesis del producto génico insertado. Se verificaron la ligadura y la orientación del fragmento de ADN de PSA, así como la posición del promotor mediante PCR y secuenciación. Se insertó el constructo de vector quimérico en el emplazamiento HindIII M del genoma del virus vaccinia mediante recombinación homóloga tal como se ha informado anteriormente (Kaufman y col, Int, J. Cancer, 48: 900-907, 1991) y se confirmó mediante análisis por transferencia Southern sondeando con ADN radiomarcado con ^{32}P que correspondía a las secuencias de PSA y a las secuencias de vaccinia en la región HindIII M (no se muestran los datos).

Se confirmó la expresión de la proteína PSA recombinante mediante análisis por transferencia western de los fluidos sobrenadantes y los extractos de proteínas procedentes de las células BSC 40 infectadas con rV-PSA. Se usaron rutinariamente estas células para la evaluación de los productos de vaccinia recombinante (Earl y col, Current Protocols in Molecular Biol., 2.16.15.1-16.18.9, 1993). La incubación de las transferencias de los sobrenadantes celulares procedentes de las células infectadas con rV-PSA con anticuerpo anti-PSA de conejo desveló un polipéptido inmunoreactivo único de aproximadamente 33.000 daltons (no se muestran los datos). Similarmente, la incubación de las transferencias de los extractos de proteínas procedentes de las células infectadas con rV-PSA desveló una banda única del mismo peso molecular (no se muestras los datos). Esto es consistente con el tamaño predicho de la molécula de PSA (Armbruster y col, Clin. Chem. 39: 181-195, 1993; Wang y col Methods in Cancer Research, 19: 179-197, 1982). Las transferencias de los sobrenadantes celulares o las transferencias de los extractos de proteínas procedentes de las células infectadas con la cepa V-Wyeth parental permanecieron negativas para la expresión de PSA. Estos resultados demuestran de esta manera que un virus vaccinia recombinante puede expresar fielmente el producto del gen PSA humano.

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Ejemplo 9 Aumento de la citotoxicidad específica de PSA tras la inmunización con rV-PSA:rV-B7 Líneas celulares

Se obtuvo MC-38 una línea celular de adenocarcinoma colónico de murino (Fox, B.A. y col J. Biol. Response Mod. 9: 499-511, 1990) del Dr. Bernard Fox (National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Se obtuvo la línea celular LNCaP de adenocarcinoma de próstata humano (Horoszewicz, J.S. y col En: Murphy, G.P. (ed.) Models for Prostate Cancer, pp. 115-132, Nueva York: A.R. Liss, 1980) de la American Type Culture Collection (Rockville, MD). Se obtuvo el vector retrovírico pLNSC del virus del sarcoma murino de Moloney (Miller, A.D. y col Biotechniques 7: 980-990, 1989) del Dr. A. Dusty Miller (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA). La línea celular GP+E-86 de empaquetamiento ecotrópico de murino (Hesdorffer, C. Hematol. Oncol. Clin. North Am. 5(3): 423-432, 1991), MC-38, PSA/MC-38 y pLNSX/MC-38 se mantuvieron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) con suero bovino fetal al 10% (FBS) (Gibco BRL). Las líneas celulares PSA/MC-38 y pLNSX/MC-38 se mantuvieron a presión selectiva continua en 1 mg de sulfato de G418 (Gibco BRL). LNCaP se mantuvo en medio RPMI-1640 (Gibco BRL) que contenía FBS al 10%.

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Clonación de ADNc de PSA

Se sintetizó ADN complementario (ADNc) a partir del ARN total procedente de la línea celular LNCaP de adenocarcinoma de próstata humano usando el Kit de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del ARN GeneAmp (Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT). Se seleccionaron cebadores de oligonucleótidos específicos de PSA basados en la secuencia del ARNm humano (número de acceso del GenBank X07730) usando el programa informático MacVector 4.1.4 (Kodak Co., Rochester, NY). Se usaron los cebadores 5'(5' AGA GAG AGC CTC AAG CTT CAG CCC CAA GCT TAC CAC CTG CA 3') (SEC. DE ID Nº: 7) y 3'(5' AGA GAG AGC AAG CTT AGT CCC TCT CCT TAC TTC AT 3') (SEC. DE ID Nº: 8), que contenían los emplazamientos del enzima de restricción HindIII, para sintetizar el ADNc de PSA de longitud completa mediante la PCR. Se unió el gen PSA de 1,5 kb al ADN de pLNSX digerido con la endonucleasa de restricción HindIII y se usó para transformar de manera competente células CH5\alpha de Escherichia coli (Gibco BRL). Se ensayaron las colonias resistentes a la ampicilina para la orientación del inserto de ADNc mediante la PCR usando un cebador de oligonucleótido 5' específico del vector (5' TTT GGA GGC CTA GGC TTT TGC AAA 3') (SEC. DE ID Nº: 9) y el cebador 3' específico de PSA descrito anteriormente. Se seleccionaron los transformantes con ADNc de PSA en la orientación de sentido directo, caracterizada mediante la digestión de la endonucleasa de restricción, y se secuenciaron mediante el procedimiento dideoxi usando Sequenase (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH). El análisis de la secuencia del gene recuperado mediante la PCR confirmó que el gen era idéntico a la secuencia del gen PSA humano en el GenBank.

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Transfección y transducción del ADN en células diana, MC-38

Se transfectó el plásmido PSA/pLNSX 85 g) en células MC-38 usando reactivo de Transfección (DOTAP) (Boehringer Mannheim Biochemica, Indianapolis, IN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A las 24 h, se añadió medio de selección que contenía 100 \mug/ml (p/v) de G418 a las células. Se mantuvo la presión selectiva mediante cultivo continuo en DMEM que contenía FBS al 10% y aumentando las concentraciones de G418 (hasta 1 mg/ml). Se clonaron células resistentes al fármaco mediante dilución limitante. Se ensayó el medio acondicionado a partir de los pocillos de clonación usando el ensayo inmunoradiómetrico en tándem R PSA determinante doble en fase sólida (Hybritech Inc., San Diego, CA). Los mayores productores de PSA segregado se clonaron dos veces mediante dilución limitante. Un clon, designado PSA/MC-38, produjo aproximadamente 10 ng de PSA/ml.

Se desarrollaron células MC-38 PSA negativas transducidas con el vector como sigue. Se transfectaron células GP+E+86, una línea celular de empaquetamiento ecotrópico de murino, se transfectaron con 2 \mug de ADN del vector pLNSX usando el reactivo de transfección DOTAP, tal como se ha descrito anteriormente. A las 24 h las células transfectadas se volvieron a plaquear y se hicieron crecer en medio de selección (1,0 mg de G418/ml). La selección de células que sobrevivieron a G418 y que contenían pLNSX se hizo crecer en medio con G418, y se añadió este medio a células MC-38 en presencia de 8 g/ml de polibreno (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Las células MC-38 transducidas se hicieron crecer en presencia de G418 durante 3 semanas. Se aislaron las colonias individuales resistentes al fármaco mediante anillos de clonación estériles y se caracterizaron mediante la PCR para la presencia de pLNSX. Un clon, pLNSX/MC-38, se usó para un estudio adicional.

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Procedimientos de respuesta citolítica

Se inmunizaron ratones con rV-PSA usando el protocolo básico tal como se ha descrito en el Ejemplo 6. La fuente de rV-PSA, preparado tal como se ha descrito en el Ejemplo 8, fue Therion Biologics Corporation, Cambridge, MA. Se usó la línea celular MC38 de adenocarcinoma colónico de murino que expresaba PSA (MC38-PSA) tal como se ha descrito anteriormente en Karr, J.F. y col (Cancer Research, en prensa) como el antígeno diana específico.

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Análisis de células T citotóxicas: Aumento de la citotoxicidad específica de PSA tras la inmunización con rV-PSA:rV-B7

Para analizar el efecto de la adición de rV-B7 y rV-PSA sobre la actividad citotóxica específica de PSA, se ensayaron linfocitos esplénicos procedentes de ratones inmunizados con la mezcla de rV-B7 y rV-PSA para la actividad lítica con células de adenocarcinoma de murino que fueron negativas para PSA (MC38) o las mismas células transducidas con PSA (MC38-PSA). La Figura 10 demuestra que las células T procedentes de ratones inmunizados una vez con rV-PSA no lisan las dianas MC38 PSA negativas, pero lisan las dianas MC38-PSA PSA positivas. La adición de rV-B7 al rV-PSA inmunógeno no tuvo efecto sobre la lisis de las células MC38 pero tuvo un sustancial efecto sobre la lisis específica de PSA de las dianas MC38-PSA (Figura 10). Se demostró adicionalmente la especificidad de la lisis ya que las células T procedentes de ratones inmunizados con un antígeno diferente, rV-CEA:B7-1 no lisan las dianas MC38-PSA.

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Ejemplo 10 Uso de linfocitos sensibilizados con péptidos inmunogénicos derivados de antígenos CEA para tratar terapéuticamente mamíferos que padecen cáncer

Los linfocitos T presensibilizados con el antígeno CEA pueden ser efectivos para tratar terapéuticamente mamíferos que padecen cáncer. Se cultivaron in vitro linfocitos T procedentes de sangre periférica o suspensiones tumorales (Kawakami, Y. y col. (1988) J. Exp. Med. 168: 2183-2191). Se expusieron los linfocitos T a células infectadas con el virus recombinante que expresaba un antígeno asociado a CEA y/o el virus recombinante que expresaba B7.1 y/o B7.2 durante un periodo de aproximadamente de 1-16 horas a una concentración de una MOI de 1-10. Los linfocitos T expuestos al antígeno se administrarán al mamífero, preferiblemente un ser humano a aproximadamente 10^{7}-10^{12} linfocitos. Se pueden administrar los linfocitos tanto por vía intravenosa, intraperitoneal o intralesional. Se puede administrar este tratamiento concurrentemente von otros tratamientos terapéuticos tales como usando citoquinas, radioterapia, excisión quirúrgica de lesiones tumorales y fármacos quimioterapéuticos, terapia de linfocitos T adoptivos.

Aunque la invención se ha descrito anteriormente en relación a algunas formas de realización específicas, se entenderá que son posibles muchas variaciones, y que se pueden usar materiales y reactivos alternativos sin apartarse de la invención.

La descripción anterior de las formas de realización específicas desvelará completamente de esta manera la naturaleza general de la invención que otros pueden, aplicando el conocimiento actual, modificar y/o adaptar fácilmente para diversas aplicaciones tales como las formas de realización específicas sin apartarse del concepto genérico.

Claims (25)

1. Una célula huésped infectada con

a) un primer virus recombinante que ha incorporado en un genoma vírico o porción del mismo uno o más genes o porciones de los mismos que codifican un antígeno de un estado de enfermedad, y

b) un segundo virus recombinante que ha incorporado en un genoma vírico o porción del mismo uno o más genes o porciones de los mismos que codifican un B7.1, B7.2 o B7.1 y B7.2.

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2. La célula huésped de la reivindicación 1 infectada con

a) un primer virus recombinante que ha incorporado en un genoma vírico o porción del mismo, uno o más genes o porciones de los mismos que codifican un anticuerpo cuyo emplazamiento de unión al antígeno asemeja un antígeno de un estado de enfermedad y

b) un segundo virus recombinante que ha incorporado en un genoma vírico o porción del mismo uno o más genes o porciones de los mismos que codifican un B7.1, B7.2, o B7.1 y B7.2.

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3. La célula huésped de la reivindicación 1 ó 2, en la que el primer virus recombinante, el segundo virus recombinante o el primer y el segundo virus recombinantes se seleccionan entre el grupo constituido por retrovirus, difteroviruela aviar, viruela del canario, viruela porcina, adenovirus, virus vaccinia, y poliovirus.

4. La célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el segundo virus recombinante comprende además uno o más genes o porciones de los mismos que codifican una molécula inmunoestimuladora, la molécula inmunoestimuladora se selecciona entre el grupo constituido por IL-2, ICAM-1, LFA-3, CD72, GM-CSF, TNF\alpha, INF\gamma, IL-12, IL-6 y las combinaciones de los mismos.

5. Una célula huésped infectada con un virus recombinante que ha incorporado en un genoma vírico o porción del mismo uno o más genes o porciones de los mismos que codifican un antígeno de un estado de enfermedad y un gen o porción del mismo que codifica B7.1, B7.2, o B7.1 y B7.2.

6. Una célula huésped infectada con un virus recombinante que ha incorporado en un genoma vírico o porción del mismo uno o más genes o porciones de los mismos que codifican un anticuerpo cuyo emplazamiento de unión al antígeno asemeja un antígeno de un estado de enfermedad y uno o más genes o porciones de los mismos que codifican B7.1, B7.2, o B7.1 y B7.2.

7. La célula huésped de las reivindicaciones 5 ó 6, en la que el virus recombinante comprende además uno o más genes o porciones de los mismos que codifican una molécula inmunoestimuladora seleccionada entre el grupo constituido por IL-2, ICAM-1, LFA-3, CD72, GM-CSF, TNF-\alpha, IFN-\gamma, IL-12, IL-6 y sus combinaciones.

8. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la célula huésped es una célula presentadora de antígeno, una célula tumoral, una célula infectada con un microorganismo patogénico, o una célula genéticamente deficiente.

9. La célula huésped de la reivindicación 8, en la que la célula presentadora de antígeno es una célula dendrítica o macrófago.

10. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el estado de enfermedad es un cáncer o microorganismo patogénico.

11. La célula huésped de la reivindicación 10, en la que el cáncer es un cáncer primario o metastásico.

12. La célula huésped de la reivindicación 11, en la que el cáncer se selecciona entre el grupo constituido por Linfoma no de Hodgkin, leucemia, linfoma de Hodgkin, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, melanoma, adenocarcinoma, timoma, y sarcoma.

13. La célula huésped de la reivindicación 11, en la que el antígeno es un antígeno asociado a tumor.

14. La célula huésped de la reivindicación 13, en la que el antígeno asociado a tumor se selecciona entre el grupo constituido por antígenos oncofetales, MART-1, Mage-1, Mage-3, gp100, tirosinasa, CEA, PSA, CA-125, erb-2, Muc-1, Muc-2, oncogenes ras mutados puntualmente, oncogenes p53 mutados puntualmente, y TAG-72.

15. La célula huésped de la reivindicación 10, en la que el microorganismo patogénico es virus, bacteria, protozoo, o levadura.

16. La célula huésped de la reivindicación 15, en la que el virus patogénico es VIH, virus de la hepatitis, virus del papiloma humano, virus de la encefalitis equina, virus del herpes simple o virus de la gripe.

17. La célula huésped de la reivindicación 16, en la que el antígeno del estado de enfermedad se selecciona entre el grupo constituido por antígeno de VIH, antígeno del virus de la hepatitis, antígeno del virus del papiloma humano, antígeno de la encefalitis equina, antígeno del virus del herpes simple, y antígeno del virus de la gripe.

18. Una composición farmacéutica que comprende la célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. La composición farmacéutica de la reivindicación 18, que comprende además una molécula inmunoestimuladora exógena, fármaco quimioterapéutico, antibiótico, fármaco antivírico, o fármaco antifúngico.

20. Uso de la célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de una enfermedad patogénica o cáncer, en la que la composición farmacéutica comprende además opcionalmente una molécula inmunoestimuladora exógena, fármaco quimioterapéutico, antibiótico, fármaco antivírico, o fármaco antifúngico.

21. El uso de la reivindicación 20, para potenciar una respuesta inmune contra un estado de enfermedad en un mamífero.

22. El uso de la reivindicación 20 ó 21, para el tratamiento de linfoma no de Hodgkin, leucemia, linfoma de Hodgkin, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, melanoma, adenocarcinoma, timoma y sarcoma.

23. Una célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, junto opcionalmente con una molécula inmunoestimuladora exógena, fármaco quimioterapéutico, antibiótico, fármaco antivírico, o fármaco antifúngico, para el uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad patogénica o cáncer.

24. La célula huésped de la reivindicación 23, para el uso en el potenciamiento de una respuesta inmune contra un estado de enfermedad en un mamífero

25. La célula huésped de la reivindicación 23 ó 24, para el uso en el tratamiento de linfoma no de Hodgkin, leucemia, linfoma de Hodgkin, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, melanoma, adenocarcinoma, timoma y sarcoma.