ES2336173B2 - Metodo para mejorar la tolerancia a la salinidad. - Google Patents
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Abstract
Método para mejorar la tolerancia a la
salinidad.
La presente invención se refiere a un método
específico para mejorar la tolerancia a la salinidad de organismos
vivos y eliminar el sodio (Na^{+}) de aguas, suelos, lodos y
cualquier otro medio que contenga este elemento, basado en el empleo
de la secuencia aislada de un ácido nucleico que codifica para la
fitoquelatina sintasa de Nicotiana glauca.
Description
Método para mejorar la tolerancia a la
salinidad.
El campo de la presente invención se encuentra
dentro del área de la biología molecular, y en particular en la
implicación de genes de plantas en los procesos de detoxificación
de sodio, el uso de organismos transformados expresando de forma
constitutiva o inducida estos genes, y métodos de biorremediación
para la recuperación de medios. Así, la presente invención se
refiere a la puesta a punto de una herramienta y un método
específico para mejorar la tolerancia a la salinidad de organismos
vivos y eliminar el sodio (Na^{+}) de aguas, suelos, lodos y
cualquier otro medio que contenga este elemento, basado en el
empleo del gen de la fitoquelatina sintasa de Nicotiana
glauca.
La salinización del suelo es uno de los
problemas más importantes que tiene la agricultura para su
desarrollo. El cambio climático global produce un incremento en el
estrés hídrico, factor cosustancial del estrés salino, ya que el
déficit hídrico es también la causa del incremento de las
concentraciones de sal en los suelos.
Es sabido que la concentración de sal en el
interior de la célula de muchos organismos se mantiene alrededor de
50-150 mM, lo que beneficia a la estructura
proteica, por ejemplo, debido a las fuerzas electrostáticas. Sin
embargo, una concentración de 300-500 mM inhibe las
reacciones metabólicas alterando el balance entre las fuerzas
electrostáticas e hidrofóbicas (Serrano R (1996) Int Rev of Cyt
165:1-52.).
La respuesta de las células al cloruro sódico
(NaCl) se articula por un grupo de diversos mecanismos:
El Na^{+} puede entrar en la célula a través
de varios tipos de canales, "voltage-dependent
cation channels" y "voltage-independent
cation channels" (VIC). Los VIC son la principal ruta de
entrada de Na^{+} a las células de las plantas (Xiong L. et al.
(2002) in Salt Tolerance. The Arabidopsis Book (American Society of
Plant Biologists, pp 1-22). Debido a la
similitud entre Na^{+} y K^{+}, los transportadores de K^{+}
dependientes de voltaje pueden facilitar la entrada de Na^{+};
Por ejemplo, AtHKT1 de Arabidopsis (transportador de sodio con
homología de secuencia a los transportadores de potasio de la
familia HKT), está implicado en la conducción de Na+ de tallos a
raíces. Esta recirculación parece jugar un importante papel en la
tolerancia de las plantas al estrés salino (Berthomieu P et al.
(2003) EMBO journal 22:2004-2014).
La variación en el potencial de membrana
(valores \leq 130 mV) facilita la entrada de Na^{+}. La
hiperpolarización en la membrana plasmática de levadura es producida
por la ausencia del gen PMP3 (SNA1). Los homólogos en
A. thaliana son RCI2A y RCI2B (BLT101
en trigo). La sobreexpresión de RCI2A puede aliviar la
supresión del crecimiento y los daños
foto-oxidativos reduciendo la entrada de Na^{+} en
las raíces (Mitsuya S. et al. (2006) Physiologia Plantarum
128:95-102).
El papel que el Ca^{2+} juega en el intrincado
grupo de respuestas a NaCl ha sido clarificado recientemente en
varios aspectos. La sobre-expresión de ACA4
(Ca^{2+} ATPasa vacuolar de Arabidopsis thaliana) en
levadura aumenta la tolerancia a sal (Geisler M. et al. (2000)
Plant Physiol 124:1814-1827).
El Na^{+} es evacuado fuera de la células por
medio de antiportadores Na^{+}/H^{+}, localizados en la
membrana plasmática. De acuerdo con esto, la
sobre-expresión del gen SOS1 de A.
thaliana, que codifica para el antiportador de Na^{+}/H^{+}
de membrana plasmática SOS1, mejora la tolerancia a salinidad
(Shi H. et al. (2003) Nat biotechnol
21:81-85). Además de la extrusión de iones
Na^{+}, una de las causas más importantes de la tolerancia a
salinidad es su compartimentalización en la vacuola. El gradiente de
protones que facilita el antiporte se produce por
H^{+}-ATPasas y
H^{+}-pirofosfatasas (PPasas) vacuolares. Las
plantas transgénicas que sobreexpresan AVP1,
H^{+}-PPasa vacuolar, muestran una tolerancia
salina que está correlacionada con el aumento del contenido fónico
dentro de las plantas (Yamaguchi T. et al. (2005) Trends Plant
Sci 10:615-620). Asimismo, plantas que
sobreexpresan AtNHX1 (antiportador vacuolar Na^{+}/H^{+} de
Arabidopsis thaliana) fueron capaces de crecer, florecer y
producir semillas en presencia de 200 mM NaCl en plantas
transgénicas de Brassica napus (Zhang H-X.
Et al. (2001) Proc Nat/ Acad Sci USA
98:12832-12836) y tomate transgénico (Zhang
H-X. et al. (2001) Nat biotechnol
19:765-768). La sobreexpresión de AgNHX1
(procedente de la planta halófita Atriplex gmelini), BnNHX1
(Brassica napus), HbNHX1 (Hordeum brevisubculatum) y
GhNHX1 (Gossipyum hirsutum) también juegan el mismo papel
(Yamaguchi T. et al. (2005) Trends Plant Sci
10:615-620). La expresión heteróloga de TsVP
(H^{+}-PPasa clonada de Thellungiella
halophila) en la levadura mutante ena1 (bomba que
elimina Na^{+} fuera de la célula) suprime la hipersensibilidad a
Na^{+}. La planta de Tabaco transgénica que
sobre-expresa TsVP consigue un 60% más de peso seco
que el tipo salvaje cuando se expone a 300 mM NaCl (Gao F. et al.
(2006) J Exp Bot 57:3259-3270).
Los osmolitos también juegan un papel relevante
en la tolerancia a salinidad. Protegen contra la pérdida de agua y
cambios en la estructura de la membrana plasmática como
consecuencia de eliminar los efectos tóxicos de los ROS ("Reactive
Oxygen Species") generados por el estrés salino. Prolina,
glicina, betaina, trehalosa, manitol y sorbitol, producidos de
manera abundante y acumulados en células tratadas con sal,
representan un componente importante en las respuestas a estrés
salino (Sahia C. et al. (2006) Physiol Plant
127:1-9). La sobreexpresión de enzimas
implicadas en la ruta de detoxificación de ROS (SOD, CAT, GST, APX,
GPX) resulta en un incremento de la tolerancia a estrés salino
(Xiong L, Zhu J-K (2002)). Semillas de tabaco
transgénico que sobre-expresan un cDNA que codifica
para un enzima con actividad glutatión S-transferasa
(GST) y glutatión peroxidasa (GPX), crecen más rápido que las
semillas control cuando son expuestas a bajas temperaturas y estrés
salino (Roxas V-P, Smith R-K,
Jr, Allen E-R, Allen R-D (1997) Nat
biotechnol 15:988-991). Las enzimas glioxalasa
I (gly I) y glioxalasa II (gly II) son necesarias para la
detoxificación de metilglioxal y confieren tolerancia a salinidad
en plantas transgénicas de tabaco (Singla-Pareek
S-L, Reddy M-K, Sopory
S-K (2003) Proc Natl Acad Sci USA
100:14672-14677).
Hay una clara conexión entre el estrés oxidativo
y el osmótico a través de las llamadas
"Mitogen-Activated Protein Kinase"
(MAPK). El gen EhHOG, que codifica una MAPK que tiene un
papel esencial en la ruta de osmoregulación de levadura y otros
eucariotas, fue aislado de Eurotium herbariorum del mar
muerto. Cuando EhHOG fue sobreexpresado en el mutante hog1
de S. cerevisiae, el crecimiento y la morfología aberrante
de hog1 fueron restaurados en condiciones de alto estrés
osmótico (Jin Y, Weining S, Nevo E (2005) Proc Natl Acad Sci USA
102:18992-18997).
Varios genes inducidos por estrés salino
pertenecen a la familia LEA. Son conocidos diversos tipos de LEA de
Arabidopsis; RD ("Responsive to Dehydration"), COR
("COld-Regulated"), LTI ("Low
Temperature-Induced"), KIN ("cold
induced"). Todos estos tipos son inducidos por estrés
salino, hídrico, bajas temperaturas y ABA. El arroz transgénico que
sobre-expresa SNAC1
("STRESS-RESPONSIVE NAC 1") es más
sensible a ABA y pierde agua más lentamente por el cierre de los
estomas, SNAC1 puede mejorar la tolerancia a la sequía y a la
salinidad en arroz. (Hu H. et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA
103:12987-12992).
La sensibilidad de las plantas a la presencia de
sodio no es, por tanto, una característica inherente a las mismas,
ya que se conocen diversas adaptaciones, tanto en tierra como en
mar, a altas concentraciones salinas, como es el caso de las plantas
halófitas. Esto indica que la tolerancia puede ser resuelta por
transferencia génica. Hasta la fecha, los genes descritos en la
defensa contra el estrés salino estaban implicados en transporte,
extrusión, osmoprotección, antiportadores vacuolares, factores de
transcripción, etc.
En las últimas décadas se han desarrollado
plantas que contienen diversos grupos de moléculas que sirven para
aliviar los efectos de la salinidad. Por ejemplo, los
osmoprotectantes, que son solutos compatibles como prolina
(aminoácidos), glicina-betaina, dehidrina y
azúcares (manitol, trehalosa, etc) que funcionan como osmolitos y
protegen las células de la deshidratación, y por tanto de la pérdida
de turgor, mejoran el mantenimiento de las raíces y se disparan en
respuesta al déficit de agua.
En Agosto de 1999 Eduardo Blumwald, científico
argentino que trabajaba en Toronto, publica la utilización de un
antiportador vacuolar de Arabidopsis thaliana que expulsa
H^{+} al citoplasma mientras acepta iones Na^{+} (patente nº
CA2323756 y posteriormente patente US6936750). Esto permite que las
plantas que lo sobreexpresan puedan vivir en ambientes salinos
altos.
En Agosto de 2001 el mismo investigador, ahora
en Davis, Universidad de California, hace pública la obtención de
una planta de tomate genéticamente modificada que crece y se
desarrolla en agua de irrigación salada. Es importante subrayar que
aunque a lo largo del siglo pasado un buen número de investigadores
ha estado tratando de desarrollar variedades de cosecha tolerantes a
sal usando técnicas de mejora clásica, ninguno de los esfuerzos dio
los resultados esperados.
En 2001 se hace pública la demostración de que
AtHKT1 es un transportador de Na^{+} al interior de la raíz de
Arabidopsis thaliana (Rus et al., Plant Physiology
136:2500-2511 (2001). Por tanto, teóricamente,
la sobre-expresión de este gen en una planta
permitiría una mayor entrada de Na^{+} por las raíces de los
individuos modificados con dicho gen.
En la solicitud de patente española nº 2173019,
publicada en 2002, se define el empleo del gen de la ATPasa de
sodio de Neurospora crassa en la mejora de la tolerancia a
la salinidad.
Ahora, los autores de la presente invención han
desarrollado un método para mejorar la tolerancia a la salinidad
basado, por primera vez, en el empleo de moléculas capaces de
unirse directamente al sodio para bloquear su acción tóxica dentro
de la célula.
Estas moléculas son las fitoquelatinas (PCs).
Las PCs son péptidos ricos en cisteína que no están codificados
genéticamente. Su síntesis se inicia o induce por la presencia de
metales pesados, como el cadmio, con el concurso de la enzima
fitoquelatina sintasa (PCS) que utiliza GSH como sustrato para
formar el péptido
[\gamma-Glu-Cys]n=2-11-Gly
(PCs) (Steffens, J.C. (1990) The heavy
metal-binding peptides of plants. Ann. Rev. Plant
Physiol. Plant Mol. Biol. 41,533-575).
El gen de la PCS de diferentes especies ha sido
utilizado para mejorar la tolerancia y acumulación de metales
pesados en diversas especies vegetales como solución al problema de
contaminación de suelos por estos contaminantes, es decir, se ha
dotado a las plantas elegidas de una mayor capacidad de tolerar y,
lo que es más interesante, acumular, mediante fitoextracción,
metales pesados. Así, la PCS parece desempeñar un papel esencial en
la regulación del equilibrio celular de iones de metales pesados
"libres" y complejados mediante un mecanismo sencillo y eficaz
(Erwin G. et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA
86:6838-6842). Además, muchos autores sugirieron
anteriormente que las PC pueden desempeñar un papel en la
detoxificación de metales pesados (Cobbett C (2002) Annu Rev
Plant Biol 53: 159-182). Esto ha dado como
resultado patentes de genes que codifican para fitoquelatinas
sintasas (US6489537 y US 6844485), pero, en ningún caso se han
empleado para combatir la salinidad, de modo que la propuesta que
aquí se plantea genera un nuevo método para afrontar la
contaminación por sales o salinización.
Por otro lado, existen en el estado de la
técnica métodos no biológicos empleados para la restauración de
suelos salino-sódicos que suelen consistir en la
adición de sulfato de calcio (yeso) para facilitar el intercambio
catiónico y esperar diversos lavados por la lluvia de los cationes
sustituidos. Sin embargo, la migración a horizontes más profundos
de las sales no es la solución al problema puesto que podría
ascender de nuevo por capilaridad o contaminar acuíferos.
A este respecto, la presente invención también
proporciona un procedimiento para reducir o eliminar sodio de un
medio cualquiera (sólido, líquido o gaseoso) que contiene dicho
metal alcalino, que consiste en utilizar PCSs en un organismo vivo
cuya capacidad de combatir los efectos de la salinidad es limitada,
y sustraerlo de un medio concreto por medio de su acumulación en
éste.
Además de emplear en este método secuencias ya
conocidas que codifican para PCSs de diferentes especies, los
autores de la presente invención han secuenciado por primera vez el
gen de la PCS de Nicotiana glauca, el cual puede expresarse
de forma constitutiva o inducida en N. glauca o en cualquier
otro organismo vivo con tolerancia a la salinidad limitada.
El método objeto de la presente invención
presenta ventajas significativas respecto a los procedimientos
desarrollados en el estado de la técnica para combatir la salinidad.
Por una parte, es un método de aplicación sencilla y de gran
utilidad, ya que permite la aplicación directa al medio
contaminado, lo que supone, en el caso de suelos salinizados,
evitar la pérdida de suelo por lavado superficial de las aguas de
escorrentía de aquellos suelos que no permiten el crecimiento de
plantas silvestres. Además, presenta ventajas de tipo económico ya
que aprovecha la capacidad de los organismos vivos para disminuir
la erosión y/o acumular las sales.
Figura 1. Comparación entre NgPCS1 y PCSs
conocidas. A. Alineamientos CLUSTAL W de la secuencia de
aminoácidos de PCS1 de Nicotiana glauca (NgPCS1), N.
Tabacum (NtPCS1), A. thaliana (AtPCS1) y T.
aestivum (TaPCS1). Los aminoácidos idénticos están
encuadrados en fondo negro. La tríada catalítica formada por Cys56,
Hys162 y Asp180 similar a papaína (papain-like)
indispensable para la catálisis está encuadrada en fondo gris. B.
Perfil de hidropatía de Kyte-doolittle de
NgPCS1. Los valores próximos a 2 indican aquellas zonas de la
enzima que están probablemente insertas en la membrana. C.
Análisis filogenético de PCSs de diferentes especies. Árbol
sin raíz construido con el método neighbour-joining
(Clustal W). Las barras representan la distancia genética (0.1
sustituciones por sitio). A continuación se detallan las secuencias
codificantes de genes PCS, las especies y el número de
acceso están entre paréntesis: AhPCS1 (Arabidopsis
hallen, AAS45236.1), AtPCS1 (Arabidopsis
thaliana, AAD16046.1), AtPCS2 (Arabidopsis
thaliana, AAK94671.1), AsPCS (Allium sativum,
AA013809.1), AyPCS (Athyrium yokoscense, BAB64932.1),
BjPCS1 (Brassica juncea, BAB85602.1), BnPCS
(Brassica napus, CAK24968.1), CdPCS (Cyonodon
dactylon, AAO13810.2), CePCS (Caenorhabditis
elegans, NP_4964575.3), GmhPCS
(homo-phytochelatin synthase, Glycin max,
AAL78384.1), NgPCS1 (Nicotiana glauca), NtPCS1
(Nicotiana tabacum, AA074500.1), LsPCS1 (Lactuca
sativa, AAU93349.1), LjPCS1 (Lotus japonicus,
AAQ01752.1), LjPCS2 (Lotus japonicus AAT80341.1),
LjPCS3 (Lotus japonicus, AAY81940), OsPCS
(Oriza sativa, AAO13349.2), PvPCS (Pteris
vittata, AAT11885.1), SpPCS (Schizosaccharomyces
pombe, Q10075), SrPCS (Sesbania rostrata,
AAY83876.1), StPCS (Solanum tuberosum, CAD68109.1),
TcPCS1 (Thlaspi caerulescens, AAT07467.1),
TIPCS (Thlaspi japonicum, BAB93119.1), TaPCS
(Triticum aestivum, AAD50592.1) and TIPCS (Thypha
latifolia, AAG22095.3).
Figura 2. Crecimiento comparativo en
Cd^{2+} y NaCl. A. Expresión de NgPCS1 en levadura
en un medio que contiene Cd^{2+} y Na^{+}. Test de goteo.
Células (DO a 600 nm de aproximadamente 1.4) en fase de crecimiento
estacionaria se depositaron en diluciones seriadas en un medio
mínimo SD (1% de sacarosa/1% de galactosa) suplementado con los
aminoácidos. apropiados y NaCl 0, 0.6, 0.7, 1 M y CdCl_{2} 100
\muM, respectivamente. Las figuras muestran el crecimiento de
diluciones 1:20 tras 3 días (4 días para la concentración 1 M). B.
Crecimiento de células de levadura expresando NgPCS1 en
un medio con NaCl 0.6 y 0.7 M. La figura muestra la comparación
de ratios de crecimiento vector pYES2NgPCS1/vector
pYES2 vacío en células sin NaCl y en células con NaCl frente
a tiempo de incubación (en horas). Las células fueron crecidas a
una DO de 1 a 600 nm, e inoculadas a una concentración de 10^{6}
células por ml en un medio líquido sin NaCl o con NaCl 0.6 M, 0.7
M, y 1.4 M. C. Comparación de ratios de crecimiento vector
pYES2NgPCS1/vector pYES2 vacío en células sin NaCl y
con NaCl 1.4 M. Los ratios han sido empleados para minimizar
aquellas diferencias de crecimiento que no son debidas a los tipos
de estrés específicamente estudiados ya que la sola presencia del
vector pYES2NgPCS1 en levaduras produce diferencias. D.
Comparación de la densidad óptica entre células sin NaCl y con
NaCl 1.4 M. Modelo de crecimiento en medio mínimo representado
por DO frente al tiempo en horas medido durante un periodo de 4 días
de crecimiento. Las diferencias en valor absoluto de crecimiento se
observan para los 4 tiempos elegidos. E. Contenido relativo de
concentración intracelular de Na+. La comparación de la
concentración intracelular de Na+ en células que contienen el
vector pYES2 vacío y células que contienen
pYES2/NgPCS1. Las células de levadura fueron crecidas
a una DO de 0.6 a 600 nm. El NaCl fue añadido a una concentración
final de 1.4 M. Los valores en células con pYES2 vacío fueron
tomados como el 100%.
\newpage
Figura 3. Expresión de TaPCS1 en
medios hidropónicos y suelos. A. Crecimiento de la planta en
condiciones hidropónicas. WT: fenotipo salvaje (wild type),
TaPCS1: plantas que sobreexpresan TaPCS1. B.
Crecimiento en macetas. L1, L2, y L3 son tres líneas
diferentes que contienen TaPCS1 sobreexpresado. C.
Microscopía confocal de tejidos radiculares. Se empleó DHE
como informador de estrés oxidativo. Control: sin NaCl. Las líneas
modificadas L1 y L3 fueron elegidas como representantes de 4
repeticiones.
Figura 4: Esquema del ADN de transferencia
(tDNA). LB: extremo izquierdo, LR: extremo
derecho, P: promotor, G: gen de interés; T:
terminador; GRA: gen de resistencia a antibiótico.
En primer lugar, es objeto de la invención el
gen NgPCS1 que codifica la fitoquelatina sintasa de
Nicotiana glauca con secuencia SEQ ID NO 1.
Es también objeto de la invención el empleo del
gen NgPCS1 en un método para mejorar la tolerancia a
salinidad y acumulación de sodio de cualquier organismo vivo.
Otro objeto de la invención es el empleo del gen
NgPCS1 en un método para recuperar un medio salinizado
mediante organismos modificados que expresen una fitoquelatina
sintasa codificada por SEQ ID NO 1 o secuencias que tengan al menos
un 35% de similaridad con SEQ ID NO 1.
Finalmente, es objeto de la invención el empleo
de las fitoquelatinas obtenidas in vivo o in vitro
por reacción enzimática mediada por la fitoquelatina sintasa
codificada por la SEQ ID NO 1, o secuencias con al menos un 35% de
similaridad, como quelantes de sodio.
En un aspecto principal, la invención se refiere
a una secuencia aislada de un ácido nucleico que codifica para la
fitoquelatina sintasa de Nicotiana glauca (NgPCS1),
caracterizada por la SEQ ID NO 1.
El término "codifica" se refiere a la
propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un
polinucleótido tal como gen, cDNA o mRNA que sirve como molde para
la síntesis de polímeros y macromoléculas en procesos biológicos o
en procesos llevados a cabo in vitro.
En otra realización principal de la invención se
contempla un vector que comprende la SEQ ID NO 1. De forma
preferida, dicho vector es un plásmido.
Otra realización principal de la invención, se
refiere a un organismo transgénico estable (célula u organismo
modificado genéticamente) que comprende la secuencia SEQ ID NO
1.
La fitoquelatina sintasa de Nicotiana
glauca (NgPCS1), localizada en el citoplasma, es el enzima que
media la producción de fitoquelatinas (PCs), utilizando glutatión
(GSH) como sustrato. La sobreexpresión de NgPCS1 tiene como
resultado un aumento de la tolerancia a Na^{+}, además de la
tolerancia a metales pesados ya observada en otras PCSs. El
mecanismo por el cual se produce una mejora de la tolerancia es la
quelación, por medio de las PCs, de iones Na^{+} y la posterior
reclusión en vacuolas de los complejos
PC-Na^{+}.
Así pues, otro aspecto principal de la invención
se refiere al empleo de la secuencia SEQ ID NO 1 para mejorar la
tolerancia a salinidad y/o acumulación de sodio (Na^{+}) en un
organismo vivo (animal, vegetal o microorganismo).
Esto ha permitido a los autores de la presente
invención el desarrollo de un método para mejorar la tolerancia a
la salinidad y/o acumulación de Na^{+} en un organismo vivo que
comprende las siguientes etapas:
- -
- transformación del organismo vivo con la SEQ ID NO 1, o una secuencia con al menos un 35% de similaridad con la SEQ ID NO 1; y
- -
- expresión de la secuencia (SEQ ID NO 1, o la secuencia con al menos un 35% de similaridad con la SEQ ID NO 1), controlada por secuencias regulatorias funcionales en el organismo vivo.
Las secuencias con al menos un 35% de
similaridad de la SEQ ID NO 1 abarcan aquellos genes que tengan
función fitoquelatina sintasa, es decir, desde eucariotas como el
gusano Caenorhabditis elegans y bacterias hasta plantas (que
tienen una similaridad más alta).
La fase de transformación se lleva a cabo por
cualquiera de los métodos conocidos en el estado de la técnica. En
una realización particular, en una primera etapa se lleva a cabo la
construcción de un vector que comprenda la SEQ ID NO 1, o una
secuencia con al menos un 35% de similaridad con la SEQ ID NO 1 y,
posteriormente, se introduce dicho vector en el organismo vivo.
\newpage
Para mejorar la tolerancia a sodio en un
organismo vivo es necesario que éste exprese el gen de la secuencia
introducida bajo el control transcripcional de una secuencia
regulatoria que puede ser constitutiva (siempre facilitando la
expresión) o inducida (facilitando la expresión sólo si hay
sodio).
En la presente invención, el término
"funcionales" hace referencia a que las secuencias
regulatorias tengan efecto sobre la funcionalidad del gen en lo que
se refiere a la transcripción (comienzo y terminación) y traducción
(inicio y terminación) del RNA mensajero y otras no descritas.
Entre las secuencias regulatorias contempladas
en la presente invención están los promotores y otras menos comunes
como determinados intrones, las secuencias de término de la
transcripción y las secuencias de inicio y término para la
traducción posterior del RNA mensajero.
La fitoquelatina sintasa de la especie
Nicotiana glauca puede expresarse por tanto de forma
constitutiva o inducida en N. glauca o en cualquier otro
organismo vivo cuya capacidad de combatir los efectos de la
salinidad es limitada.
La expresión constitutiva de la PCS produce una
mejora en el crecimiento de levaduras y plantas de modo que puede
utilizarse para resolver varios problemas: (a) el cultivo de
numerosas plantas en suelos salinizados o en aguas con contaminación
salina, que puede generar dos beneficios directos, la
revalorización de tierras abandonadas por la salinización gracias a
la producción de biomasa así como la restauración de las mismas
para volver a ser cultivadas y (b) el cultivo de microorganismos
modificados en medios con contaminación salina para reducir el
contenido en sales de dichos medios.
En una realización particular, el organismo vivo
empleado en el método de la presente invención es una levadura, de
forma preferida Saccharomyces carevisiae.
En otra realización particular, el organismo
vivo es una planta, preferiblemente Nicotiana glauca.
En otro aspecto principal de la invención, se
contempla el empleo de la secuencia SEQ ID No1 para reducir o
eliminar sodio de un medio líquido, sólido o gaseoso.
Esta aplicación ha permitido el desarrollo de un
método para reducir o eliminar Na^{+} de un medio liquido, sólido
o gaseoso basado en las siguientes etapas:
- i.
- transformar organismos vivos con la SEQ ID NO 1 o una secuencia con al menos un 35% de similaridad con la SEQ ID NO 1;
- ii.
- identificar los organismos transformados en i) mediante selección con antibiótico,
- iii.
- sembrar el medio salinizado con los organismos identificados en ii),
- iv.
- cultivar los organismos durante un periodo de tiempo adecuado, y
- v.
- recolectar los organismos.
De forma preferida, el proceso de transformación
genética se lleva a cabo por electroporación. Con ello se consiguen
células huésped de Escherichia coli o Agrobacterium
tumefaciens que portan un vector con el inserto deseado (después
de ser seleccionadas con el antibiótico correspondiente). Como se
ha aclarado anteriormente, estas células también se consideran en
la presente invención como organismos transgénicos aunque no se
empleen directamente en la unión de sodio en un medio salinizado
sino que sirven como medio amplificador en el caso de E. coli
y como instrumento de infección en el caso de A.
tumefaciens.
Para llevar a cabo el proceso de eliminación de
sodio es necesario tener la seguridad de que los organismos
empleados contienen el transgén insertado en su genoma o bien lo
expresen por mediación de vectores. Así, para conseguir organismos
que expresen la secuencia SEQ ID NO 1, o una secuencia similar en
al menos un 35%, es necesario llevar a cabo una fase de selección.
La selección se lleva a cabo con antibióticos, ya que el organismo
transgénico incorpora a través del vector un gen de resistencia a
antibióticos (GRA). Éste se encuentra localizado junto al gen de SEQ
ID NO 1, entre los bordes izquierdo (LB) y derecho (RB) que definen
las regiones flanqueantes del ADN de transferencia (tDNA) (figura
4).
En el caso de emplear microorganismos que
expresen el gen para eliminar las sales de un medio salinizado, la
recolección de los organismos se hará por floculación,
precipitación, centrifugación o cualquier otro método que permita
separar los microorganismos que han acumulado las sales del
medio.
En el caso de emplear plantas que expresen el
gen para eliminar las sales de un medio salinizado, se recolectará
la planta, se triturará antes o después de ser secada y los restos
serán vertidos a un vertedero de residuos conforme a la
legislación.
\newpage
Finalmente, en otra realización principal de la
invención, se contempla el uso de fitoquelatinas (PCs), obtenidas
in vivo o in vitro por reacción enzimática mediada por
la fitoquelatina sintasa codificada por la SEQ ID NO 1, o
secuencias con al menos un 35% de similaridad, como quelantes de
sodio.
El diseño de cebadores en zonas conservadas de
la región codificante del gen de PCS de N. tabacum condujo a
la amplificación de un fragmento de PCR de un tamaño esperado (1,5
Kb). El marco de lectura abierto codificó una proteína (NgPCS1) con
una masa molecular de 55,14 kD; 501 residuos de aminoácidos y un pl
de 6,32. El perfil de hidropatía se correlacionó con una proteína
citoplasmática (figura 1B). La nueva proteína se comparó con la PCS
de A. thaliana (número de acceso AAD16046.1), N.
tabacum (número de acceso AY235426) y T. aestivum (número
de acceso AAD50592.1), dando como resultado el siguiente porcentaje
de identidad: el 96% en relación con NtPCS1, el 64% en comparación
con AtPCS1 y el 59% con TaPCS1. Esta alta identidad entre las
secuencias de PCSs de plantas que pertenecen a diferentes familias,
tales como Brassicaceae, Poaceae y Solanaceae,
indicó una elevada conservación y, por tanto, un importante papel
de estas proteínas en el reino vegetal. El porcentaje de identidad
entre las secuencias de proteínas de la PCS más investigada de
T. aestivum (TaPCS1) y la PCS de A. thaliana (AtPCS1)
fue de un 58%, similar al porcentaje encontrado para la nueva PCS
notificada de N. glauca y la PCS de T. aestivum
(59%). De manera coherente, Cys^{56}, Hys^{162} y Asp^{180}
descritas como una tríada catalítica similar a papaína
(papain-like) indispensable para la catálisis
(Rea P-A (2006) Proc Natl Acad Sci USA
103:507-508), también estaban conservadas en
NgPCS1 (figura 1A). Se obtuvo un árbol sin raíz con 24 secuencias
de PCSs relacionadas con la estructura primaria prevista de NgPCS1
(Blastp de la base de datos NCBI; figura 1C). Se identificaron las
siguientes entre las agrupaciones ("clusters") separadas: la
familia de la agrupación de Brassicaceae formada por los
géneros Arabidopsis, Brassica y Thlaspi, y los
géneros Nicotiana y Solanum que pertenecen a la
familia de la agrupación de Solanaceae.
\vskip1.000000\baselineskip
La clonación e investigación de diferentes PCSs
condujo a la conclusión de que estos genes pueden conferir
acumulación y tolerancia al Cd^{2+} (Clemens S. et al. (1999)
EMBO J 18: 3325-3333. 27). Tal como se esperaba,
NgPCS1 también puede conferir tolerancia al Cd^{2+}. Esto
es especialmente evidente en este trabajo a partir de los
experimentos llevados a cabo a una concentración de 100 \muM
(figura 2A). Este hecho está completamente de acuerdo con los
resultados anteriores obtenidos en los que se producía la
sobreexpresión de TaPCS1 en levaduras en condiciones
similares de concentración de Cd^{2+} y usando el mismo vector
(Clemens S. et al. (1999)), lo que establece una función
homóloga de ambos genes TaPCS1 y NgPCS1 junto con una
similitud estructural.
NgPCS1 confirió tolerancia al Na^{+}
cuando se sobreexpresó en levaduras a concentraciones de NaCl que
oscilaban desde 0,6 hasta 1 M (figura 2A), lo que indicó una
función relevante para este tipo de enzima en la tolerancia al
estrés salino más allá del papel bien conocido desempeñado en la
acumulación de metales pesados. También se investigó el crecimiento
mediado por NgPCS1 con tratamiento de estrés salino
analizando la cinética de las proporciones de crecimiento a
concentraciones de NaCl de 0,6 y 0,7 M (figura 2B). A ambas
concentraciones, las células que contenían pYES2NgPCS1
mostraron una clara desventaja de crecimiento inicial en comparación
con el vector vacío pYES2. Sin embargo, tras 22 horas de
tratamiento, las células expuestas a una concentración 0,6 M
primero y a 0,7 M después, demostraron un mejor crecimiento que las
células control. Finalmente, la concentración 0,7 M produjo una
mayor diferencia de crecimiento que 0,6 M, y por tanto
concentraciones más elevadas de NaCl produjeron una mejora superior
del crecimiento mediado por NgPCS1. En consecuencia, con
NaCl 1,4 M se mejoró el crecimiento de células de levadura mediante
la presencia de NgPCS1 en dichas células (figura 2C). Tal
como se observó a concentraciones 0,6 M y 0,7 M, aunque no hubo una
diferencia perceptible en las proporciones de crecimiento durante
las primeras 22 horas, el efecto producido por pYES2NgPCS1
aumentó con el tiempo, lo que condujo a una mayor diferencia al
final de las mediciones, lo que constató una respuesta tardía
mediada por NgPCS1 en la tolerancia al Na^{+}. Las
condiciones de crecimiento experimental llevadas a cabo en este
trabajo, que favorecen el crecimiento lento (medio mínimo sintético,
sin glucosa libre), permitieron una mejor evaluación de los
factores que estimulan el crecimiento en condiciones de estrés
salino. Hubo un aumento en la diferencia de DO600 a favor de las
células que contenían pYES2NgPCS1, que se apreció claramente
tras 39 horas de tratamiento y que aumentó espectacularmente a las
97 horas (figura 2D), lo que indicó que NgPCS1 mejoraba
drásticamente la tolerancia a la salinidad. Sin embargo, la
toxicidad del NaCl puede dividirse en dos componentes: estrés
hídrico y daño por Na^{+}. Por tanto, surgió la siguiente
pregunta: ¿NgPCS1 mejora la tolerancia al NaCl, por ejemplo,
aumentando sólo la retención de agua, pero no la acumulación de
NaCl? ¿O mejora la tolerancia y la acumulación? Con el fin de
responder a esta pregunta, se analizó la acumulación de Na^{+} en
el citoplasma de células de levaduras con o sin NgPCS1,
demostrándose que NgPCS1 conduce a una mayor acumulación de
Na^{+} dentro de las células de levadura que contienen el vector
pYES2NgPCS1 (figura 2E).
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de probar la capacidad de la PCS para
mejorar la tolerancia al Na^{+} en plantas, se hicieron crecer
especímenes de N. glauca que sobreexpresaban una PCS de
trigo (TaPCS1) probada previamente para determinar la
acumulación de metales pesados (Gisbert C. et al. (2003) Biochem
Biophys Res Commun 303:440-445) (Martínez M.
et al. J (2006) Chemosphere 64:478-48524).
El vector binario pBI121 (Clontech) fue usado
para la transformación. El gen GUS del vector binario fue
sustituido por el DNA codificante de la fitoquelatina sintasa de
trigo TaPCS1 mediante los sitios de restricción BamHI
y ECL136II. A continuación, se llevó a cabo la introducción del
plásmido obtenido, conteniendo el cDNA TaPCS1, en
Agrobacterium tumefaciens C58C1RifR y posteriormente se
realizó la transferencia mediante infección a plantas de N.
glauca. La nueva construcción fue electroporada en células de
Agrobacterium tumefaciens. Los transformantes se
seleccionaron en placas de LB con kanamicina y se pusieron en
contacto con discos de 1 cm de diámetro durante 10 minutos con una
suspensión de A. tumefaciens conteniendo la construcción
deseada. Tras generar plantas adultas por medio del programa de
regeneración in vitro de explantes de N. glauca
resistentes a kanamicina, se recolectaron las semillas de las
diferentes líneas transgénicas conseguidas y se seleccionaron
aquellas que contenían una o varias integraciones en el genoma de la
planta, recuperando aquellas que eran capaces de crecer en
presencia del antibiótico kanamicina. El último paso consistió en
comprobar si la integración del cDNA de TaPCS1 al genoma de
Nicotiana glauca mejoraba apreciablemente la tolerancia a
Na^{+} de la planta. El estudio de la tolerancia a Na^{+} fue
llevado a cabo germinando las semillas transgénicas en un sustrato
con vermiculita y dolomita así como en condiciones hidropónicas,
aplicando a las 7 y 2 semanas respectivamente NaCl, hasta una
concentración final de 200, 300 y
500 mM.
500 mM.
Se hicieron evidentes dos aspectos. En primer
lugar, ambos tipos de especímenes, los de tipo silvestre y los que
sobreexpresaban PCS, siguieron exactamente el mismo patrón de
crecimiento en relación con las concentraciones de NaCl probadas, lo
que indicó un efecto neto de PCS en la tolerancia al NaCl (figura
3A). En segundo lugar, los especímenes de N. glauca
necesitaban NaCl para mejorar el crecimiento, al menos en las
condiciones hidropónicas probadas en este trabajo. Ambos tipos de
plantas siguieron el mismo patrón, pero las OMG (Organismo
Modificado Genéticamente) mostraron un mejor crecimiento en todos
los casos. Esta similitud en los patrones de crecimiento sólo
difirió en un factor de mejora, indicando que la sobreexpresión de
TaPCS1 en N. glauca con NaCl es transparente en el
sentido de que el gen no cambia el equilibrio interno dentro de la
célula y sólo mejora la cantidad de sal metabolizada. Cuando se
analizó la halotolerancia en medios sólidos, las plantas también
mostraron el patrón típico observado en las condiciones
hidropónicas (figura 3B). Tal como se determinó en los cultivos
hidropónicos, la presencia de NaCl mejoró el crecimiento y confirmó
que 200 mM es la concentración de NaCl óptima para todas las plantas
utilizadas en el experimento, incluso mejor que en ausencia de
NaCl. Sin embargo, el crecimiento a 350 mM y 500 mM fue
anómalamente alto considerando la magnitud de la superficie foliar.
En relación con el papel desempeñado por la PCS, la tolerancia
observada en NaCl 500 mM fue especialmente evidente puesto que los
especímenes de tipo silvestre no pudieron sobrevivir.
El estrés oxidativo resultó atenuado por la PCS
(L1 y L3; figura 3C). La PCS sólo aumentó la tendencia natural de
N. glauca cuantitativamente para lograr un crecimiento
mejorado con NaCl.
En este estudio se utilizó la cepa de
Saccharomyces cerevisiae, YPH499 (MATa
ura3-52 leu2\Deltal lys2-801
Ade2-101 trp1\Delta63,
his3-D200). Para los ensayos de crecimiento en medios
sólidos y líquidos, se hicieron crecer las células de S.
cerevisiae en medio mínimo sintético (SD) con o sin un 2% de
agar bacto, respectivamente, que contenía un 1% de sacarosa, un 1%
de galactosa, un 0,7% de base nitrogenada para levaduras sin
aminoácidos y con sulfato amónico (Pronadisa) y
MES-Tris 50 mM (pH 6,0). El medio SD se complementó
con adenina (30 \mug/ml), histidina (30 \mug/ml), leucina (100
\mug/ml), lisina (100 \mug/ml) y triptófano (80 \mug/ml). La
transformación mediante el procedimiento con acetato de litio y la
selección de los transformantes en levaduras se llevó a cabo tal
como se ha descrito (Ito H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A (1983) J
Bacteriol 153:163-168), y utilizando el
marcador URA3 para la selección en levaduras. Las células de
levaduras que llevan el vector vacío pYES2 se utilizaron como
control negativo. Para investigar la cinética del estrés salino, se
hicieron crecer las células hasta una DO a 600 nm de 1,
aproximadamente, y se inocularon a una concentración de 10^{6}
células por ml en medio líquido sin NaCl o conteniendo 0,6 M, 0,7 M
y 1,4 M de NaCl. Para los ensayos de goteo, se hicieron crecer las
células hasta la saturación en SD diluido con agua (1/2, 1/5, 1/10,
1/20, 1/100, 1/1.000 y 1/10.000), y se distribuyeron mediante
réplica plater 8 x 6 array (Sigma-Aldrich) en placas
que contenían 0,6 M, 0,7 M y 1 M de NaCl y CdCl_{2} 100
\muM.
Para el experimento en invernadero, se
esterilizaron semillas de N. glauca (tipo silvestre) y tres
líneas transgénicas de F3 diferentes (TaP12, TaP17 y TaP18, líneas
L1, L2 y L3, respectivamente) de la siguiente forma: se sumergieron
las semillas en lejía comercial al 30%, más un 0,01% de detergente
Triton X-100 durante 7 minutos para evitar el
crecimiento fúngico y bacteriano, después se llevó a cabo un segundo
lavado utilizando una disolución de etanol al 70% en agua con un
0,01% de Triton X-100. Finalmente, se lavaron las
semillas durante cinco repeticiones consecutivas con agua
desionizada durando cada una 5 minutos para eliminar cualquier resto
de disolución desinfectante. Las semillas sumergidas se colocaron
en placas Petri con un medio preparado con agar 6 g/litro, sales de
MS (Murashige T, Skoog F (1962) Physiol Plant
15:473-497), y sacarosa 10 g/litro a pH 5,7
tamponado con MES (ácido
2-[N-morfolino]etanosulfónico) 0,25 g/litro.
A los diez días (cuando se habían desarrollado las primeras hojas),
se transplantaron tres plántulas por línea y tratamiento a macetas
que contenían vermiculita y dolomita en las mismas proporciones y se
cubrieron con película durante algunos días para obtener mejores
condiciones aclimatadas. Las plantas de seis semanas se colocaron
en una bandeja diferente para cada tratamiento y se regaron una vez
a la semana con o sin NaCl 200, 350 o 500 mM durante 2 semanas.
Para el experimento in vitro, se colocaron tres plántulas
para WT (tipo silvestre) y cada línea de N. glauca, que
crecían en condiciones estériles tal como se describió en
(Gisbert C. et al. (2003) Biochem Biophys Res Commun
303:440-445), en tubos Falcon de 50 ml que
contenían agua MilliQ con o sin NaCl 200, 350 y 500 mM a
temperatura ambiente en un agitador suave (25 rpm en un agitador
ELMI S4) durante
7 días.
7 días.
El ADN codificante fue sintetizado a partir de 2
\mug del ARN total aislado de hojas de N. glauca mediante
la transcriptasa reversa de M-MuLV (virus de la
leucemia murina de Moloney) con cebador de
oligo(dT)_{18} (kit Fermentas de síntesis del ADN
codificante de la primera hebra) según los procedimientos
recomendados en el kit. Un microlitro del ADN codificante producido
se utilizó como molde en una reacción de PCR convencional de 50
\muL. Diseño de los cebadores para la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR): se observó el dominio conservado en el extremo
N-terminal para NtPCS1, AtPCS1,
TaPCS1, BjPCS1 y OsPCS1. Se diseñaron dos
cebadores diferentes en el extremo 5', FW1 (SEQ ID NO 2) y FW2 (SEQ
ID NO 3). Las secuencias codificantes en la región
C-terminal analizadas para este gen están menos
conservadas que las del extremo N-terminal. Por
tanto, se usó la secuencia de ARN mensajero de NtPCS1 y se
diseñaron tres cebadores diferentes RV1 (SEQ ID NO 4), RV2 (SEQ ID
NO 5) y RV3
(SEQ ID NO 6).
(SEQ ID NO 6).
Tras llevar a cabo los experimentos de PCR
usando diferentes combinaciones, sólo se obtuvieron dos bandas con
el tamaño esperado de 1,5 Kb, correspondiendo en ambos casos a los
cebadores FW1/RV1 y FW2/RV2. Utilizando un gel de agarosa con
tampón TAE al 1%, se llevaron a cabo las reacciones de PCR y se
extrajeron mediante congelación-presión de la banda
cortada y precipitación del ADN mediante 1/50 volúmenes de NaCl 5 M
y 2 volúmenes de EtOH absoluto. Tras medir la concentración de ADN
en un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000, los
fragmentos amplificados se clonaron en el vector
pGEM-T Easy (Promega, Southampton, RU).
Se utilizó E. coli DH5\alpha como
huésped. Tras seleccionar los transformantes correctos y aislar el
ADN plasmídico (Marligen bioscience, sistema rápido de aislamiento
de plásmidos), se secuenciaron los fragmentos clonados en un
secuenciador de ADN ABI Prism (Perkin-Elmer) usando
los sitios T7 y SP6 localizados en el vector. Ambas secuencias
completas de los fragmentos de 1,5 Kb se alinearon con NtPCS1
usando el programa LALIGN de William Pearson y se observó una
identidad del 93% en la secuencia del fragmento FW1/RV1. La
secuencia del segundo fragmento, FW2/RV2, reveló una identidad del
91% entre los nucleótidos 592 y 1501 de la secuencia codificante de
NtPCS1. La alineación de ambos fragmentos de secuencia dio
como resultado la misma composición de nucleótidos entre la
posición 592 y el codón de terminación. La secuencia
C-terminal correcta que corresponde al cebador RV1
se probó utilizando el segundo fragmento secuenciado. NgPCS1
se subclonó direccionalmente en los sitios KpnI/BamHI
del vector de expresión pYES2 mediante una nueva
amplificación por PCR con los cebadores FW2 y RV2 y con las
secuencias adicionales KpnI y BamHI, respectivamente.
pYES2 incluye el gen Amp^{r} de E. coli, el
marcador de levaduras seleccionable URA3 y el promotor
inducible GAL1 para la expresión en células de levaduras. E.
coli se transformó mediante electroporación y los
transformantes se seleccionaron para Amp^{r}. El ADN plasmídico
del clon correcto que contenía NgPCS1 en pYES2 se
transformó en la cepa de levadura YPH499 y se seleccionó tal como
se describió anteriormente. Las secuencias de NgPCS1,
NtPCS1, AtPCS1 y TaPCS1 se alinearon con el
programa CLUSTAL W (Thompson J-D, Higgins
D-G, Gibson T-J (1994) Nucleic Acids
Res 22: 4673-4680). Se construyó un perfil de
hidropatía de Kyte-Doolittle para conocer el
carácter hidropático de NgPCS1 (Kyte J, Doolittle R (1982) J Mol
Biol 157:105-132).
Se crecieron células de levadura en 20 ml de SD
con los aminoácidos apropiados a una absorbancia a 600 nm de 0,6.
Entonces, se añadió NaCl hasta una concentración final de NaCl 1,4
M y se incubó a 28ºC con agitación (150 rpm) durante 3 horas, se
centrifugó durante 5 minutos a 7.000 rpm (rotor Beckman
JA-20, 4ºC), y se lavó cuatro veces con 10 ml de
una disolución que contenía MgCl_{2} 20 mM y sorbitol 1,5 M.
Finalmente, se extrajo el contenido intracelular mediante incubación
con 0,5 ml de MgCl_{2} 20 mM durante 12 minutos a 95ºC. Tras la
centrifugación durante 2 minutos ala velocidad máxima, se
analizaron alícuotas del sobrenadante con un espectrómetro de
absorción atómica (Varian) en el modo de emisión de llama.
Se detectó el anión superóxido O_{2}^{-},
tal como describe Yamamoto Y. et al. (2002) Plant Physiol
128:63-72, usando dihidroetidio (DHE), una forma
reducida de bromuro de etidio, que no es fluorescente y puede
atravesar pasivamente la membrana de las células vivas. Una vez en
la célula, se oxida para dar un colorante fluorescente que se une
al ADN cercano. Se observó producción de O_{2}^{-} en las raíces
de N. glauca tras la tinción de las raíces con DHE 10 \muM
en CaCl_{2} 100 \muM, a pH 4,75 durante 13:30 h. Se obtuvieron
imágenes de fluorescencia con un microscopio confocal invertido
Leica TCS SL. Para la detección del DHE, se excitaron muestras a
488 nm usando un láser de argón y se recogió la emisión entre 550 y
620 nm. Se repitieron los experimentos con microscopía confocal y
fluorescencia al menos cinco veces con resultados similares. Se
hicieron crecer semillas de N. glauca durante un periodo de
seis semanas en medio MS tal como se describió en los materiales
vegetales. El DHE se suministró tras nueve días de adaptación a las
condiciones hidropónicas.
<110> Universidad Politécnica de
Valencia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para mejorar la tolerancia a
la salinidad
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 222/07
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1506
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nicotiana glauca
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador FW1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggcgatgg cgggtttata tc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador FW2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggatgccatg aacacgactg atgaagc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador RV1
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagaaggga ggtgcagcta aa
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador RV2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaccctccta gttctttatt cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador RV3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttgcgactt tgaccgtgta tc
\hfill22
Claims (13)
1. Secuencia aislada de un ácido nucleico que
codifica para la fitoquelatina sintasa de Nicotiana glauca
caracterizada por la SEQ ID NO 1.
2. Vector que comprende la secuencia de la
reivindicación 1.
3. Vector, según la reivindicación 2, donde
dicho vector es un plásmido.
4. Organismo modificado genéticamente con la
secuencia de la reivindicación 1.
5. Empleo de la secuencia de la reivindicación 1
para mejorar la tolerancia a salinidad y/o acumulación de sodio en
organismos vivos.
6. Método para mejorar la tolerancia a la
salinidad y/o acumulación de sodio en un organismo vivo que
comprende las siguientes etapas:
- a.
- transformación del organismo vivo con una secuencia con función fitoquelatina sintasa con al menos un 35% de similaridad con la SEQ ID NO 1; y
- b.
- expresión de la secuencia controlada por secuencias regulatorias funcionales en el organismo vivo.
7. Método, según la reivindicación 6, donde el
organismo vivo es una planta.
8. Método, según la reivindicación 7, donde la
planta es Nicotiana glauca.
9. Método según la reivindicación 6 donde la
transformación del organismo vivo se lleva a cabo con la SEQ ID NO
1.
10. Método, según la reivindicación 9, donde el
organismo vivo es una levadura.
11. Método, según la reivindicación 10, donde la
levadura es Saccharomyces cerevisiae.
12. Empleo de la secuencia de la reivindicación
1 para reducir o eliminar sodio de un medio líquido, sólido o
gaseoso.
13. Método según reivindicaciones anteriores,
para reducir o eliminar sodio de un medio líquido, sólido o gaseoso
basado en las siguientes etapas:
- a.
- transformar organismos vivos con la SEQ ID NO 1 o una secuencia con función fitoquelatina sintasa con al menos un 35% de similaridad con la SEQ ID NO 1;
- b.
- identificar los organismos transformados en a) mediante selección con antibiótico,
- c.
- sembrar el medio salinizado con los organismos identificados en b),
- d.
- cultivar los organismos durante un periodo adecuado, y
- e.
- recolectar los organismos.
Priority Applications (5)
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|---|---|---|---|
| ES200702926A ES2336173B2 (es) | 2007-10-24 | 2007-10-24 | Metodo para mejorar la tolerancia a la salinidad. |
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- 2008-10-24 US US12/738,866 patent/US20110126312A1/en not_active Abandoned
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